JPH07280769A - 電気化学用電極及び該電極を使用するセンサー - Google Patents

電気化学用電極及び該電極を使用するセンサー

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JPH07280769A
JPH07280769A JP6093655A JP9365594A JPH07280769A JP H07280769 A JPH07280769 A JP H07280769A JP 6093655 A JP6093655 A JP 6093655A JP 9365594 A JP9365594 A JP 9365594A JP H07280769 A JPH07280769 A JP H07280769A
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phenosafranine
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electrochemical
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武男 大坂
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 従来の生体用センサーは検出可能電位が貴で
あるため、生体内反応を可逆的に進行させることができ
ず、しかも前記貴な電位では他の反応も進行するため、
前記生体内反応を定量することはできなかった。本発明
は卑な電位で生体内反応の逆反応を進行させて前記生体
内反応を定量できる電極及び該電極を使用する生体用セ
ンサーを提供することを目的とする。 【構成】 フェノサフラニン及び/又はその誘導体をモ
ノマー又はポリマーとして導電性基体上に担持した電気
化学用電極及び該電極を使用する生体用センサー。フェ
ノサフラニンは生体内反応により生成した物質特に還元
型NADHやNADPHを卑な電位でNAD+ やNAD
+ に酸化でき、この酸化時に生ずる電流を測定するこ
とにより前記生成した物質を定量できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、卑な電位から生体内反
応を触媒できる電気化学用電極及び該電極を使用するセ
ンサーに関する。
【0002】
【従来技術とその問題点】生命活動を円滑に機能させる
ために酵素は不可欠な物質である。最近では酵素の特異
的な作用に注目したバイオセンサーや発酵プロセスの開
発が盛んに行われている〔鈴木周一編:バイオセンサ
ー、講談社(1984),A.P.F.Turner, I.Karube and G.
S.Wilson(Eds.): Biosensors-Fundamentals and Applic
ations; Oxford University Press (1987)]。酸化還元
酵素の1種であるデヒドロゲナーゼ(脱水素酵素)は、
生体内の代謝過程で有機化合物の酸化を行う酵素である
が、このとき補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド(NAD+ )及びニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸(NADP+ )が還元されることに
よって反応が進行することが知られている。従って代謝
によって生成した還元型のニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド(NADH)及びニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸(NADPH)を検出することによ
り酵素反応の定量化が可能となる。
【0003】生体内ではNADH及びNADPHはフラ
ビン酵素、チトクロム系を経て再酸化されリサイクルさ
れるが、工業的にはより簡易的かつ迅速に測定する必要
があり、電気化学センサーはこれを可能にする手法とし
て注目されている。反応式は下記の式及びにより表
され、ここでSH2 及びSはそれぞれ基質の還元体及び
酸化体であり、式は酵素により又式は電極により進
行する。 SH2 + NAD+ (又はNADP+ ) → S +
NADH(又はNADPH)+H+ NADH(又はNADPH) → NAD+ (又はNA
DP+ ) + H++ 2e-
【0004】しかしながらNADH及びNADPHの酸
化反応に対して可逆的に応答しうる電極は未だ開発され
ていない。例えば該電極としてカーボン電極を用いると
前記酸化反応は1V以上の過電圧が必要となり、酸素発
生などの副反応との区別ができなくなるためカーボン電
極を前記酸化反応の検出用として使用することはできな
い。又白金電極は共存する有機化合物を吸着するため前
記NADH等の定量に使用できない。またこれらの未修
飾電極では高い過電圧のために、より容易に酸化される
共存する生体物質(尿酸、アスコルビン酸、ドーパミン
など)の酸化反応とNADHやNADPHとの区別がで
きない。
【0005】一方最近になって単分子、高分子化合物を
担持させた修飾電極が従来の無機的電極表面では得られ
ない優れた特性を有することが報告されている(L. Gor
don,B. Persson, P.D. Hale, L.I. Bogulavsky, H.I. K
aran, H.S. Lee, T.A. Skotheim, H.L. Lan and Y. Oka
moto, Am. Chem. Soc. Symp. Ser., 487, 56 (1992))
。しかしながら単分子修飾電極では検出電流が小さく
感度が悪いため、現在では高分子修飾電極の応用が鋭意
検討されている。ポリチオニン修飾電極を用いて式の
反応を行い、カーボン電極に比して0.4 V以上もの過電
圧低下を達成できたことが報告されている(T. Ohsaka,
K. Tanaka, and K. Tokuda, J. Chem. Soc.Chem. Comm
un., 222 (1993)) 。
【0006】GortonらはN−メチルフェナンジニウムサ
ルフェイトを用いて作製した修飾電極上で0.55Vの過電
圧低下を達成できたと報告している(A. Torstensson a
nd L. Gorton, J. Electroanal. Chem., 130, 199 (198
1)) 。またAlberyらはフェナジウム環を有する化合物が
優れた触媒活性を示すことを見出している(W.J. Alber
y, P.N. Bartlett and A.E.G. Cass, Phil. Trans, R.
Soc. Lond.B, 316, 107 (1987)) 。更にPersson とGort
onはヘテロ環芳香族構造の化合物が式に対して優れた
触媒活性を示すことを見出しているが、電気化学センサ
ーとしての報告はない(B. Persson and L. Gorton, J.
Electroanal. Chem., 292, 115 (1990)) 。
【0007】
【発明の目的】このように従来技術では、十分な感度で
酵素反応の定量を行い得る電極及び該電極を使用する電
気化学センサーは存在していない。その原因が主として
電極触媒に起因していることは明らかであり、本発明者
は鋭意検討の結果、特にNADH及びNADPHの酸化
に対して非常に活性の高い電極触媒を担持した電極を開
発し、かつこれを用いた電気化学センサーを見出したも
のであり、本発明は該電極及び該電極を使用する電気化
学センサーを提供することを目的とする。
【0008】
【問題点を解決するための手段】本発明は、フェノサフ
ラニン及び/又はその誘導体をモノマー又はポリマーと
して導電性基体上に担持した電気化学用電極及び該電極
を利用する電気化学センサーである。
【0009】以下本発明を詳細に説明する。前述の通
り、本発明者は水素移行反応を主とする酵素反応つまり
生体内反応を卑な電位で定量的に検出できる電極触媒を
各種検討した結果、本発明に到達したものである。本発
明では(化1)に示すフェノサフラニン及び/又はその
誘導体を触媒物質として使用し、式中Rは水素又は低級
アルキルである。このフェノサフラニンやその誘導体は
モノマーとして導電性基体上に担持して電極を構成して
も良いが、好ましくはポリマーの状態でつまり(化2)
に示す物質として導電性基体上に担持することが望まし
い(n=2〜100 )。
【0010】
【化1】
【化2】
【0011】(化1)や(化2)で示したフェノサフラ
ニンやその誘導体を担持した電極は従来使用されている
カーボン電極等と比較してかなり卑な電位から例えば前
述の式で示した生体内で生成するNADH及びNAD
PHの酸化反応(水素移行反応)を進行せることがで
き、このときに発生する微少電流を検出すると、貴な電
位でのみ生ずる他の反応で発生する電流と識別すること
ができる。これにより前記微少電流量を測定することに
より生体内反応で生成したNADHやNADPHを定量
することができる。
【0012】本発明の電極により卑な電位から電流検出
ができる理由は明確ではないが、前記電極表面が導電性
の三次元構造であり、表面に到達したNADHやNAD
PH等を取り込むべき親和性の優れた立体配置の反応場
を形成しているからと推測できる。本発明の電極の基体
としては、白金や金等の金属又は金属酸化物あるいはカ
ーボン等の導電性物質を使用する。この導電性金属表面
に前記フェノサフラニン及び/又はその誘導体を担持す
るが、該フェノサフラニンのモノマーやポリマーの粉末
をバインダーを使用して前記基体上に担持しても、前記
基体をフェノサフラニンを溶解した電解浴中に浸漬し該
フェノサフラニンを電解重合して前記基体表面にポリマ
ーとして担持してもよい。重合したフェノサフラニンは
溶媒に対する溶解性が低く耐性にも優れているため、ポ
リマーとして特に電解重合により担持して安定な電極触
媒とすることが望ましい。
【0013】フェノサフラニンの担持量は特に限定され
ないが、電位走査の回数や電解重合時の溶媒に応じて導
電性基体表面に10-11 〜10-7モル/cm2 の範囲で担持
させることが好ましく、担持量はフェノサフラニン濃度
や温度を調節することにより適宜設定できる。本発明の
電極はこのように生体内反応とは逆方向の反応を可逆的
に進行させることができるため、発生する電流の測定手
段を装着することにより生体内反応を検出し定量するセ
ンサーとして使用することができ、従来技術では不可能
であった生体内反応系センサーを実現でき、特にフロー
インジェクション型のセンサーとすると応答性及び感度
が上昇する。又本発明のセンサーは発酵の進行状況の検
出用等として生体内反応以外のセンサーにも適用でき
る。
【0014】
【実施例】次に本発明に係わる電気化学用電極及び該電
極を使用するセンサーの実施例を記載するが、該実施例
は本発明を限定するものではない。
【実施例1】フェノサフラニン(和光純薬工業株式会社
製)を1mM溶解した0.1 Mの過塩素酸水溶液を図1の
セル1に満たした。導電性基体である直径2mmで先端
のみを露出させたユニオン・カーバイド社のBPG(ba
sal-plane pyrolytic graphite) カーボンを作用極2と
して、更に対極3として大面積の白金板を又参照極4と
して銀−塩化銀極をそれぞれ用い、これらを前記セル中
の過塩素酸水溶液5中に浸漬した。次に作用極を参照極
に対し−0.65Vから1.25Vの間で電位走査を繰り返すこ
とによりフェノサフラニンが作用極上で電解重合し、該
作用極上に赤紫色の皮膜を生成させた。該電極を沸騰水
中で洗浄してフェノサフラニンモノマーを除去した。こ
の作用極上のフェノサフラニンの担持量は1.1 ×10-8
ル/cm2 であった。
【0015】この高分子修飾電極をそのまま作用極とし
て使用し、前記過塩素酸水溶液の代わりにNADHを0.
5 mM含むpH7の水溶液(リン酸緩衝液)を図1のセ
ルに満たし、電位を走査した際の結果を図2中にaで示
した。−0.2 V付近からNADHの酸化波が観察され
た。なお図中bはNADHを含まないpH7のリン酸緩
衝液を使用した電位走査の結果である。
【0016】
【比較例1】実施例1のBPGカーボン電極をそのまま
作用極として実施例1のセル中に浸漬して電位を走査し
た。その結果を図2中にcで示した。この比較例では実
施例1より1V以上貴な電位で初めて酸化電流が観察さ
れ、実施例1の電極が高い活性つまり低電位での検出能
を有することが分かる。
【0017】
【実施例2】BPGカーボンの代わりにグラッシーカー
ボンを使用したこと以外は実施例1と同様にして作製し
た電極をフロー型のセルに組み込み、フロー速度を1ミ
リリットル/分としてpH7の水溶液(リン酸緩衝液)
を流した。微量のNADH20マイクロリットルを注入し
たところ、−0.5 Vでは応答電流は得られなかったもの
の、−0.4 Vより貴な電位に保持したところ図3に示す
電流ピークが検出された〔aは−0.50V、bは−0.40
V、cは−0.35V、dは−0.30V(vs.Ag/AgCl)]。式
の標準酸化還元電位は−0.515 Vでありほぼ準可逆的反
応が進行していることが分かる。
【0018】
【実施例3】メチルフェノサフラニン(R=CH3 )を
使用して実施例1と同様にして高分子修飾電極を製造し
かつ−0.3 Vで電流ピークが検出された。
【0019】
【発明の効果】本発明は、フェノサフラニン及び/又は
その誘導体を導電性基体上に担持した電気化学用電極で
ある。フェノサフラニンやその誘導体を触媒物質とする
電極は生体内反応の逆反応を卑な電位でほぼ可逆的に進
行させることができる。更に前記フェノサフラニン及び
/又はその誘導体を重合状態で担持すると、溶解性及び
耐久性が向上し電極特性を著しく改良でき、安定な固体
電極として提供できる。
【0020】更に前述の生体内反応の逆反応を可逆的に
進行させることができるため、前記電極をセンサーとし
て使用すると、貴な電位で進行する他の各種反応に影響
されることなく、従って不要な物質を生成することなく
前記生体内反応の生成物を選択的に出発物質に転化し、
この際に生ずる電流を検出することにより前記生体内反
応の生成物を定量できる。これにより従来技術では不可
能であった簡便かつ迅速に特定物質を検出できる生体内
反応用センサーを提供できる。
【0021】該センサーは生体内の代謝過程での主要な
補酵素である還元型NADH及びNADPHを酸化する
際の電流検出に最も良好に適用でき、該電流により生体
内反応に伴うNAD+ 及びNADP+ の還元反応の進行
状況を把握することにより前記生体内反応自体を定量化
することができる。又本発明のセンサーは生体内反応用
としてだけでなく、発酵工業におけるセンサー等の他の
用途においても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例1の電解重合及び電位走査に使用するセ
ルの概略断面図。
【図2】実施例1及び比較例1における電位走査の結果
を示すグラフ。
【図3】実施例2における電流ピークを示す図。
【符号の説明】
1・・・セル 2・・・作用極 3・・・対極 4・・
・参照極 5・・・過塩素酸水溶液
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 27/46 336 N

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 フェノサフラニン及び/又はその誘導体
    を導電性基体上に担持した電気化学用電極。
  2. 【請求項2】 フェノサフラニン及び/又はその誘導体
    のポリマーを導電性基体上に担持した電気化学用電極。
  3. 【請求項3】 フェノサフラニン及び/又はその誘導体
    をモノマー又はポリマーとして導電性基体上に担持した
    電気化学用電極を使用する電気化学センサー。
  4. 【請求項4】 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
    オチド及び/又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
    レオチドリン酸の電気化学的検出用である請求項3に記
    載の電気化学センサー。
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