JPH07284392A - 鶏ロイコチトゾーン免疫原性蛋白質を発現する遺伝子クローン及び鶏ロイコチトゾーン症に対する遺伝子組換えワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 鶏、ヌカカを用いずロイコチトゾーン症を予
防するために、遺伝子組換え技術を応用して作出した組
換え体により発現させた蛋白質でワクチンを作製し得る
ようにして安価で安定した大量供給が可能なワクチンを
提供するものである。 【構成】 鶏ロイコチトゾーン由来の免疫原性蛋白質を
認識する単クローン抗体を用いることにより、イムノス
クリーニングにより選別することからなる免疫原性蛋白
質遺伝子クローンである。 【効果】 本組換え微生物は病原性、有毒物質産生性及
び伝達性がないことから本ワクチンもそのような性質は
なく、しかも感染性もなく安全であるとともに環境への
病原体汚染の問題がない。原虫採取のためヌカカ、鶏に
要する費用を全て省くことができるので経済的で、組換
え微生物の宿主菌は大腸菌であるため、容易に大量培養
が可能で、発現蛋白質の精製の操作を必要としないので
生産性が高く、均一なワクチンを提供できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、鶏のロイコチトゾーン
症に対する遺伝子工学的手法により製造されたワクチン
に関する。更に詳しくは本発明は、真コクシジウム目、
住血胞子虫類（亜目）に分類され、鶏のロイコチトゾー
ン症を引き起こすロイコチトゾイダエ科、ロイコチトゾ
ーン属に属するロイコチトゾーン・カウレリーの免疫原
生蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子を挿入した発現
ベクターを移入した宿主細胞により発現された蛋白質を
有効成分として用いた、鶏のロイコチトゾーン症に対す
るワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】鶏のロイコチトゾーン症は、住血胞子虫
類であるロイコチトゾーン・カウレリー（Ｌｅｕｃｏｃ
ｙｔｏｚｏｎ ｃａｕｌｌｅｒｙｉ）の感染によって引
き起こされる疾病である。Ｌ．ｃａｕｌｌｅｒｙｉは、
最初、１９０９年ベトナムにおいて、鶏の血液中にマラ
リア顆粒を持たない円形のガメトサイト（生殖母体）と
して認められ、ロイコチトゾーン属の原虫としてそのよ
うに命名がなされたものである。

【０００３】わが国における鶏のロイコチトゾーン症
は、１９５４年に兵庫県下で初めて確認され、その病原
体は、Ｌ．ｃａｕｌｌｅｒｙｉと同定され、その後、本
原虫は吸血昆虫の一種である双翅目Ｄｉｐｔｅｒａのヌ
カカ科Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅに属するニワト
リヌカカＣｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ａｒａｋａｗａｅ（以
下ヌカカと略称する）によって生物学的に伝播されるこ
とが実験的に証明され、その生活環がほぼ明らかにされ
た。ロイコチトゾーン・カウレリーは、宿主の鶏の体内
でのジゾゴニー（増員生殖）とガメトゴニー（生殖体形
成生殖）、伝播者であるヌカカの体内でのスポロゴニー
（胞子形成生殖）の３つの発育期を持っている。

【０００４】本原中に感染したヌカカの吸血の際にその
唾液と共に鶏の体内に侵入したスポロゾイト（種虫）
は、種として肺、肝、脾、腎などの血管内皮系の細胞に
寄生して第１代シゾント（分裂体）を形成する。感染後
５〜７日目にはそれより第１代メロゾイト（分裂小体）
が血液中に放出され、そらは全身に分布する血管内皮系
細胞に再び侵入して第２代シゾントとして増殖し、後記
には宿主細胞から離れて細胞間隙でさらに発育する。１
４日目にはこれらシゾントから第２代メロゾイトが血液
中に放出され、次いでそれらは赤血球細胞に侵入して発
育、１８〜１９日目には宿主細胞から遊離してそれぞれ
マクロガメトサイト（雌性生殖母体）、ミクロガメトサ
イト（雄性生殖母体）として成熟する。

【０００５】両ガメトサイトはヌカカの吸血時に鶏の血
液と共にその中腸内に取り込まれ、マクロガメート（雌
性生殖体）とミクロガメート（雄性生殖体）を形成して
融合（受精）し、チゴート（融合体）を経てオオキネー
ト（虫葉体）となり、虫腸壁の細胞間隙に侵入し、次い
でその外膜下に移行してオオシスト（胞のう体）に発育
する。オオシストの内部には数十個のスポロゾイトが形
成され、それらはオオシスト壁のふおかいに伴ってヌカ
カの対腔に出た後の唾液腺に移動してその発育環を完了
する。

【０００６】本原虫感染による鶏の症状と病変は、主と
して第２代シゾントが発育するシゾゴニーの末期と第２
代メロゾイトが赤血球系細胞に寄生してガメトサイトに
発育する過程のガメトゴニーの時期に認められる。本症
の最も特徴的な各臓器及び組織の出血病変と貧血症状
は、第２代シゾントによる血管栓塞に伴う出血とガメト
ゴニーの原虫の寄生によって赤血球が破壊されるために
引き起こされるものと考えれている。

【０００７】本原虫の媒介体であるヌカカは、水田など
に生息するため水田を有する東南アジア、中国、北朝
鮮、韓国が流行地と認められている。わが国においても
初めてロイコチトゾーン症が確認されて以来、毎年夏期
にその流行が繰り返され、鶏の生産性に対して多くの損
失を与えてきたが、１９６４年以降にはピリメタミン
が、１９６８年からはピリメタミンとサルファ剤の合剤
が本症の予防薬として試料に添加されるようになってか
らはその発生は激減した。しかしその後、原虫のこのよ
うな薬剤に対する耐性の獲得や薬剤の残留性の問題か
ら、有効薬剤の使用期間が限定されたこと、また一部有
効薬剤が安全性の問題により、その使用が禁止になった
こと等によりその防圧は困難なものとなってきており、
被害も恒常的なものになってきている。

【０００８】鶏ロイコチトゾーン症に対し従来試作され
ていたワクチンには、スポロゾイトを用いた生ワクチン
と虫体由来物質を抗原とする不活化ワクチン、さらには
原虫感染した鶏の臓器乳剤を材料とした不活化ワクチン
がある。スポロゾイトを用いた生ワクチンはヌカカの唾
液腺よりスポロゾイトを分離し、その少数で鶏を免疫す
るものである〔椎原ら、静岡県養鶏試験場研究報告、１
３：２５−２７（１９７８）〕。また虫体由来物質を抗
原とした不活化ワクチンは次のようなものである。

【０００９】虫体由来抗原には鶏体及び発育鶏卵由来の
第１代シゾント、第１代メロゾイト、第２代シゾント、
第２代メロゾイトならびに可溶性抗原などがあるが、こ
の中スポロゾイト接種後１０〜１５日目に感染鶏の血清
中に検出される可溶性の抗原は第２代シゾントと抗原性
状がほぼ同じで、それと同様に比較的強い免疫原生が認
められている。そこで、この血清抗原材料をホルマリン
で不活化して試作したワクチンで、その有用性が認めら
れている〔Ｉｓｏｂｅ ａｎｄ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｊｐ
ｎ，Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，３７：２１４−２１９
（１９８８）〕。

【００１０】更に臓器乳剤不活化ワクチンは、上述のよ
うな原虫抗原を大量に得る困難さを改善するためになさ
れたもので、スポロゾイト接種後１３日目の感染鶏より
胸腺、肺、肝、脾、腎、Ｆ嚢を採取して臓器乳剤とし、
これをホルマリンで不活化した材料でワクチンを試作す
るものであり、やはりその効果が認められている〔Ｍｏ
ｒｉｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．
Ｒｅｓ．，７６：６３０−６３２（１９９０）〕。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】このように、ワクチン
の有効性は一応確かめられているものの、前記したよう
に量産が難しく供給に問題があること、抗原材料として
血清、臓器などを使用することによる品質の一定性、安
全性などに問題があることにより、依然として、合成薬
剤に依存しなければならないのが現状であり、従って、
前記したような問題が生じている。これに対処するため
には、新たな医薬品に開発が必要とされるが、産卵鶏に
使用することから残留性の問題が生じないワクチンが望
まれる。しかし、原虫は最近やウイルスと比較して生活
環が複雑であること、その培養が困難であることから有
効でかつ安全性の高い、安価な量産供給可能なワクチン
に開発は未だなされていないのが現状である。

【００１２】しかしながら一方で、本原虫の生活環が明
らかにされたことからヌカカの人工飼育技術が確立さ
れ、スポロゾイトの確保が可能となり、鶏に対する原虫
感染実験を計画的に行うことができるようになったと同
時に、鶏体内での原虫発育環の各ステージでの原虫の採
取も可能となった。これらの成果によりロイコチトゾー
ン症の免疫学的研究も可能となり、感染鶏の血中抗体価
の測定が可能となり、血清中への特異抗原の出現及びそ
れに対する抗体の産生も確かめられている。更に、原虫
の第２代シゾントには、免疫原性の存在を示唆する成績
も得られている。そこで、このような基礎的試験研究に
基づいた本疾病に対する予防法で、養鶏業界の損失を可
及的に少なくするために、効果的で安価なワクチンの安
定した量産供給が切望されている。

【００１３】鶏ロイコチトゾーン症に対処するには前記
したような予防法では一般的な実用化にはかなりの制約
がある。即ち、スポロゾイトによる免疫ではヌカカから
スポロゾイトを得るため、大量供給、スポロゾイトの保
存方法に難点があり、また、ヌカカは本症以外の伝染病
の媒介昆虫でもあることが知られていることから、ヌカ
カに潜む可能性のある他の病原体をも鶏に移入してしま
うおそれがある。また血清抗原を得るにも、臓器乳剤を
得るにも常に実験感染した鶏を材料とせねばならず、こ
れらによるワクチンは生産効率が低いため、大量供給や
低価化には限界がある。

【００１４】このようなことから、本発明の目的は鶏、
ヌカカを用いずロイコチトゾーン症を予防するために、
遺伝子工学的手法により作出した組換え体により発現さ
せた蛋白質でワクチンを作製し、それによって安価で安
定した大量供給が可能な鶏ロイコチトゾーン免疫原性蛋
白質を発現する遺伝子クローン及び鶏ロイコチトゾーン
症に対する遺伝子組換えワクチンを提供するものであ
る。

【００１５】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに本発明は、ロイコチトゾーン・カウレリーの発育期
のシゾゴニーで形成され、感染防御に重要な抗原を含む
とされる第２代シゾント（２ＧＳ）を分離、精製し、こ
れよりｍＲＮＡを抽出、精製し、これに対するｃＤＮＡ
を作成後、ラムダファージλｇｔ１１を用いてインビト
ロパッケージングによってｃＤＮＡライブラリーを調製
した。次に、このｃＤＮＡライブラリーで大腸菌Ｙ１０
９０株を形質転換し、２ＧＳ抗原に対する単クローン抗
体を用いたイムノスクリーニングで免疫原性蛋白質遺伝
子クローンを選別した。

【００１６】このクローン由来遺伝子を発現ベクターｐ
ＭＡＬ−ｃＲ１に挿入し、挿入発現プラスミドを大腸菌
ＴＢ１株に移入した組換え微生物の免疫原性蛋白質遺伝
子（Ｒ７遺伝子、Ｒ７：クローン番号に由来する）の蛋
白質（グルタミン酸４５．１％を含む酸性蛋白質）をマ
ルトース結合蛋白質との融合蛋白質として発現させ、こ
の蛋白質を含む菌体の超音波抽出液を製剤化した。

【００１７】クローンの選別は、２ＧＳの超音波抽出液
を出発材料として作製した単クローン抗体を用いたイム
ノスクリーニングで行ったが、この単クローン抗体はあ
らかじめ、単クローン抗体結合アフィニティーカラムで
精製した２ＧＳ抗原が免疫賦与能を有することを認め、
２ＧＳの免疫原性蛋白質遺伝子の選別に有効であること
を確認したものである。Ｒ７遺伝子によつて発現される
蛋白質はＥＬＩＳＡにより、クローンの選別に用いた単
クローン抗体ともロイコチトゾーン原虫に感染した鶏血
清とも反応し、かつ蛋白質で免疫された鶏はロイコチト
ゾーン感染に対して抵抗性を獲得することが認められ
た。このような知見に基づいて本発明は完成されたもの
である。

【００１８】本発明において、ベクターに挿入されるｃ
ＤＮＡは、ロイコチトゾーン・カウレリーに分類される
原虫由来ならば株には特に限定されない。本発明におい
て、免疫原性蛋白質遺伝子クローンとは、特にロイコチ
トゾーン原虫の第２代シゾントが有している蛋白質をコ
ードしているｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡライブラ
リーから、免疫原性蛋白質を認識する単クローン抗体に
よって認識されて得られる一部のクローンをいい、又、
サザーンハイブリダイゼーションによってその一部と反
応が示されるクローンをいい、実質的には下記に塩基配
列を示す。

【００１９】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

【００２０】本発明において使用可能なベクターとして
は、大腸菌発現ベクター、大腸菌フアージ系ベクター、
大腸菌−培養細胞シヤトルベクター、ウイルスベクター
等であって、宿主細胞、特に大腸菌内で蛋白質を発現で
きるものであれば特に限定されない。本発明における発
現蛋白質によりロイコチトゾーン症のワクチンを調製す
る場合、特に精製の操作なしに感染細胞の抽出液をその
まま使用しても防御効果が認められる。濃縮は例えば大
腸菌体内での発現の場合であるが、培養液の遠心沈澱菌
体の超音波処理時の浮遊液量で、または超音波抽出液の
硫安濃縮沈澱の溶解液量でその度合が加減できる。鶏に
はアジュバンドとしては例えば水酸化アルミニウムゲル
と混合して、公知の方法により免疫ができる。

【００２１】本発明に用いられる原材料と好ましい組合
せについて以下に述べる。 （１）組換え微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７ マスターセルストック及びワーキングシードストックと
して−２０℃で保存されていて、ワクチンを作出する出
発材料となる保存株である。 （２）アンピシリン 宿主大腸菌ＴＢ１株に移入された発現ベクターｐＭＡＬ
−ｃＲ１−Ｒ７はアンピシリン耐性遺伝子を有し、これ
が宿主菌の培養に一つの選択性を与える。 （３）Ｌ−ブロス寒天培地 ワーキングシードから一次元培養を行うための培地で、
１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト及び
１％塩化ナトリウムを主成分とし、１％細菌用寒天末お
よび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む。

【００２２】（４）Ｌ−ブロス培地、ｐＨ７．０ 一次元培養から二次元培養を行うための培地で、上記Ｌ
−ブロス寒天培地で寒天末を除いたもの。 （５）Ｌ−ブロス発現培養培地、ｐＨ７．０ 組換え微生物の発現培養を行うための培地で、上記のＬ
−ブロス培地でさらに０．２％グルコースを含む。 （６）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド 発現培養時の対数増殖期に培養液に添加する発現誘発
剤。 （７）リシスバッファー、ｐＨ７．０ 培養菌体を超音波処理する際に、菌体を浮遊させる緩衝
液で、１０ｍＭリン酸塩、３０ｍＭ塩化ナトリウム、
０．２５％ツイーン２０、１０ｍＭ ２−メルカプトエ
タノール、１０ｍＭＥＤＴＡ、及び１０ｍＭＥＧＴＡを
含む。

【００２３】（８）飽和硫酸アンモニウム 菌体の超音波抽出液の有効成分を沈澱させる。 （９）生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．０ 飽和硫酸アンモニウムによる有効成分の沈澱物を溶解さ
せる。 （１０）ホルマリン ワクチンの不活化及び防腐を目的として終濃度０．２％
に添加する。 （１１）水酸化アルミニウム ワクチンのアジュバントとして、終濃度５００μｇＡ１
／ｍｌに添加する。

【００２４】本発明に用いられる原材料の一般的使用
量、好ましい使用量の範囲 （１）組換え微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７の
ワーキングシードストツクス：１回にエーゼルのループ
フル量または数μ１ （２）アンピシリン：１００μｇ／ｍｌ （３）Ｌ−ブロス寒天培地、ｐＨ７．０：１回に２０ｍ
ｌ／プレートの１プレート 以下は組換え微生物１００l 培養トその処理に対する使
用量である。 （４）Ｌ−ブロス培地、ｐＨ７．０：２l （５）Ｌ−ブロス発現培養培地、ｐＨ７．０：１００l （６）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド：１Ｍ溶液、１００ml

【００２５】（７）リシスバッファー、ｐＨ７．０：
６．７l （発現培養液の約1/15量） （８）飽和硫酸アンモニウム：６．７l （リシスバッフ
ァーと同量） （９）ＰＢＳ、ｐＨ７．０：５l （１０）ホルマリン：１０％、１００ｍｌ×２（下記の
水酸化アルミニウムゲル添加後の添加量を含む） （１１）水酸化アルミニウムゲル：１０００μｇＡ１／
ｍｌ、５l

【００２６】

【作用及び効果】

（１）作用 本発明によるワクチンは形質転換微生物による生産物で
あることから、次の点で鶏で生産される原虫抗原採取法
より優れている。 １）安全性：本ワクチンに使用される組換え微生物は病
原性、有毒物質産生性、及び伝達性はないことから本ワ
クチンもそのような性質はない。また本ワクチンは組換
え微生物の超音波処理による抽出液で、しかもホルマリ
ンで不活化したものであるので、感染性のおそれもな
い。 ２）経済性：原虫採取のためのヌカカ、鶏及びそれらに
要する飼育設備、施設、人手などの全てを省くことがで
きるので、経済性に優れている。 ３）生産性：組換え微生物の宿主菌は大腸菌であるた
め、容易に大量培養が可能となり、また発現蛋白質の精
製の操作を必要としないので、生産性が高い。

【００２７】（２）効果 １）本ワクチンは実施例４に記載したように免疫後、ス
ポロゾイトを鶏あたり１３０００〜１５０００匹を静脈
内に接種して実験感染させても、非免疫群に比較して明
らかに原虫の発育を抑えることから、本目的を適えるも
のである。 ２）前記の安全性の点から環境への病原体汚染の問題は
ない。 ３）発現培養による各標品のＥＬＩＳＡ抗原価はほぼ一
定していることから、抗原の量的変動が少なく、均一な
ワクチンを提供できる。

【００２８】

【実施例】以下に本発明の実施例を具体的に説明する
が、本発明はこれにより制限されるものでないことはい
うまでもまない。 実施例 ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾントの免疫原
性蛋白質遺伝子のクローニング、ワクチンクローンの選
定、及び遺伝子組換えワクチンの感染防御機能試験 （１）ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント由
来ｃＤＮＡライブラリーの調製 ヌカカより調製したロイコチトゾーン・カウレリーのス
ポロゾイトを約５週令の鶏１羽当たり約１００００匹静
脈内に接種して実験感染させた。感染後第２代シゾント
（２ＧＳ）が出現する時期の１３日目に鶏を解剖し、胸
腺、肺、肝、腎、脾、Ｆ嚢の各臓器を採取し、それらの
臓器乳剤から２ＧＳを分離、精製した。

【００２９】これよりＲＮＡをグアニジウムイソチオシ
アネート法により抽出し、塩化リチウムによる分別沈澱
を行い、さらにエタノール沈澱を行って総ＲＮＡを得た
後、ｍＲＮＡをオリゴテックス−ｄＴ３０（宝酒造社
製）を用いて、２回精製を繰り返して得た。次に、市販
のキット（アマーシャム社製）を用いｍＲＮＡを鋳型と
して、オリゴ（ｄＴ）ヌクレオチドまたはランダムヘキ
サヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素でギュブ
ラーとホフマンの方法に準じてｃＤＮＡを合成した。

【００３０】得られた１本鎖ｃＤＮＡにＲＮａｓｅＨと
ＤＮＡポリメラーゼとを作用させて２本鎖ｃＤＮＡにし
た後、ＥｃｏＲＩアダプター（宝酒造社製）を付加した
ものをラムダファージλｇｔ１１（アマーシャム社製）
の両アームとライゲーションさせ、インビトロパッケー
ジングキット（ストラタジーン社製）を用いてラムダフ
ァージのパッケージングを行ってｃＤＮＡライブラリー
を調製した。ｃＤＮＡライブラリーを調製するにあた
り、ＥｃｏＲＩアダプター付加ｃＤＮＡをアガロース電
気泳動で４つにサイズ分画した。これらについてのライ
ゲーション操作後にインビトロパッケージングを行っ
た。従って、ｃＤＮＡライブラリーは２種のプライマー
のｃＤＮＡライブラリーは２種のプライマーのｃＤＮＡ
についてそれぞれ４種が調製された。

【００３１】（２）ｃＤＮＡライブラリーのプラークイ
ムノスクリーニング及びクローンの選定 ２種のプライマーに基づいた画ｃＤＮＡライブラリー
で、その調製前のサイズ分画に由来する各サイズの小さ
い方の２種（＜５００ｂｐ）は省き、大きい方の２種
（＞５００ｂｐ）について、それぞれ大腸菌Ｙ１０９０
株に感染させ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
Ｌ−ブロス寒天培地上で常法にしたがってプラークの生
成を行った。常法にしたがって、１ａｃプロモーターの
誘発剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）を含浸させたニトロセルロースフィ
ルターに写し取り、イムノスクリーニングを行った。ス
クリーニングに用いた１次抗体には、２ＧＳ抗原の６７
ｋＤａ付近を認識するＭ５と１００〜２００ｋＤａを認
識するＲ１の２種の単クローン抗体の等量混合物を用い
た。２次抗体にはＨＲＰ標識家兎抗マウスＩｇＧ＋Ｉｇ
Ｍ＋ＩｇＡを、発色反応の基質にはジアミノベンチジン
を用いた。

【００３２】単クローン抗体は、予めそれぞれの単クロ
ーン抗体結合アフィニティーカラムで精製した各２ＧＳ
抗原の混合物での試験であるが、感染防御製が認めら
れ、本スクリーニングに適していると判断されたもので
ある。スクリーニングの見落としを防止することから
も、両者の混合物を用いて行った。尚、両者共それによ
って認識される抗原は分子量的に単一ではなく、それぞ
れ上述したようなある範囲のものが認識されることか
ら、本原虫抗原は同一エピトープの繰り返し構造を有し
ているものと推察される。

【００３３】クローニングの結果、オリゴ（ｄＴ）ヌク
レオチドプライマーに基づいたｃＤＮＡの場合で３３種
（Ｔ番号を付す）の、ランダムヘキサヌクレオチドプラ
イマーに基づいたｃＤＮＡの場合で４４種（Ｒ番号を付
す）の組換えＤＮＡが得られた。それらを再クリーニン
グした後、クローンの選定を行った。

【００３４】即ち、再スクリーニングした際にも発色が
比較的強い陽性反応を示したファージを増殖後、大腸菌
Ｙ１０８９株に感染させて溶原菌を調製した後、誘発剤
にＩＰＴＧを用いた発現培養を行い、細胞ライセートを
調製して同単クローン抗体の混合物を用いてイムノドッ
トブロットテストを行って抗原の発現を再確認すると共
に、一方、陽性ファージを増殖、精製後ＥｃｏＲＩ−切
断フラグメント生成の確認を行い、その結果Ｒ１ａ、Ｒ
１ｂ、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１３、
Ｒ１５、Ｒ１８、Ｒ２９、Ｒ３５、Ｒ４２、Ｔ３、Ｔ
４、Ｔ９、Ｔ１０の１７種を免疫原性蛋白質遺伝子の有
力なクローンとして選定した。以上の工程の要約を図
１、図２及び図３に示した。

【００３５】このようにして得られたクローンが、実際
に免疫原性を賦与し得るものかをみるために、この段階
でＲ１５、Ｔ１０の任意の２種の細胞ライセートについ
て、アジュバントとして水酸化アルミニウムゲルを５０
０μｇＡｌ／ｍｌに添加して感染防御試験を試みた。感
染防御試験の方法と効果判定の方法の概略については実
施例の（４）に述べるが、Ｒ１５及びＴ１０λｇｔ１１
クローンの発現蛋白質の感染防御試験の結果は表１に示
すように未接種対照群も含めて全例に発症、死亡が認め
られなかったが、免疫鶏にスポロゾイト１９５００匹／
羽で攻撃を行った後、１３日目に血清中に出現する原虫
の発育過程に由来する血清可溶性抗原（ＳＳＡ）の量的
値（ＳＳＡ価）では、その値の低い羽数が免疫群は未接
種対照群を上回ったことから、Ｒ１５、Ｔ１０には弱い
ながらも免疫性が認められたと判断した。

【００３６】また攻撃直前の血清の２ＧＳ抗原に対する
ワクチン抗体価（ＥＬＩＳＡ抗体価）も免疫群では全例
未接種対照群に比較して上昇していることが認められ
た。このことから本スクリーニングによって得られたク
ローンは本目的に適うものと判断した。

【００３７】

【表１】 ¹⁾陽性を示した血清の最高希釈倍数²⁾ 沈降線の見られた血清の最高希釈倍数

【００３８】（３）発現ベクターｐＭＡＬ−ｃＲＩサブ
クローン及びワクチンクローンの選定 ワクチン実用化の発現培養のために、上記１７種のクロ
ーンの当該遺伝子をそれぞれ発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ
ＲＩ（バイオラブス社製）に挿入し、上述と同様のイム
ノスクリーニングでｐＭＡＬ−ｃＲＩサブクローンを得
て、大腸菌ＴＢ１株に移入した。これらのサブクローン
について２種の単クローン抗体それぞれに対するＥＬＩ
ＳＡ抗原価測定とサザーンハイブリダイゼーションによ
りクローンの群別を試みてワクチンクローンの選定を行
った。ＥＬＩＳＡには発現培養を行って調製した試料
を、サザーンハイブリダイゼーションには、一方で当該
遺伝子をｐＵＣ１９にもサブクローンして調製したプラ
スミドを用いた。

【００３９】製剤の作製方法でもある発現培養による試
料の調製方法は次の通りである。宿主菌のＬ−ブロス液
体培地を用いた３７℃での振とう培養で対数増殖期にＩ
ＰＴＧを終濃度１ｍＭに添加して、さらに３７℃で４〜
６時間培養して蛋白質をマルトース結合蛋白質との融合
蛋白質として発現させた後、遠心分離して得られた菌体
をリシスバッファーに浮遊、超音波処理し、再び遠心分
離して超音波抽出液を得た。さらにこの抽出液を飽和硫
酸アンモニウムで処理して得られた沈澱をＰＢＳに溶解
し、ホルマリンを終濃度０．２％に添加し、４℃で１晩
以上静置後試料とした。

【００４０】ＥＬＩＳＡ抗原価の測定結果では、単クロ
ーン抗体Ｍ５及びＲ１のいずれかと明らかな反応性を示
したクローンは１７種の中８種であり、その中、単クロ
ーン抗体Ｍ５反応群はＲ１、Ｒ４ａ、Ｒ１３及びＴ３
で、単クローン抗体Ｒ１反応群はＲ７、Ｒ１５、Ｒ３５
及びＴ１０でいずれも４種ずつであった。なお、単クロ
ーン抗体Ｒ１と強い反応性を示したＲ７、Ｒ１５は、培
養によっては単クローン抗体Ｍ５とも反応性を示した。

【００４１】ｐＭＡＬ−ｃＲＩサブクローンの発現蛋白
質（粗物質）のＥＬＩＳＡ抗体価及びサザーンハイブリ
ダイゼーションによる群別とクローンのサイズ、並びに
ＥＬＩＳＡ抗原価：単クローン抗体Ｍ５及びＲ１それぞ
れに対する反応性、サザーンハイブリダイゼーション：
プローブＲ４ａ、Ｒ７及びＲ１５に対する反応性の測定
結果を表２に示した。

【００４２】一方、プローブとしてＲ４ａ、Ｒ７及びＲ
１５の各プラスミド由来精製フラグメントを用いたサザ
ーンハイブリダイゼーションの結果では図３に示すよう
にプローブＲ４に対してＲ４ａ、Ｔ３が、プローブＲ７
とＲ１５に対してはいずれの場合もＲ７、Ｒ１５、Ｒ３
５及びＴ１０が反応性を示した。これらについて各クロ
ーンのＤＮＡサイズ（近似値）とともに表２に示した。

【００４３】

【表２】

【００４４】サザーンハイブリダイゼーションで、プロ
ーブＲ４ａと反応したものはＲ４ａとＴ３で、ＥＬＩＳ
Ａ抗原価による単クローン抗体Ｍ５反応群としては同一
群であるＲ１ａ、Ｒ１３との反応性は認められなかった
が、ＥＬＩＳＡ抗原価による２種の単クローン抗体を認
識するクローンの群別と、サザーンハイブリダイゼーシ
ョンによる遺伝子の相互類似性を示すクローンの群別と
は一致するものと判断した。

【００４５】そこで、単クローン抗体Ｒ１認識群とＭ５
認識群の各４種のクローンの発現試料の混合物を用いた
感染防御試験の比較を試みた。その結果は表３に示し
た。スポロゾイト攻撃時の血清の２ＧＳ抗原に対するＥ
ＬＩＳＡ抗体価では明らかにＲ１群はＭ５群を上回り、
また攻撃後１３日目のＳＳＡの抑制程度もＲ１群はＰＢ
Ｓ対照群を有意に上回っていた。さらに８種の個々のク
ローンを任意に選んで行った感染防御成績からは、単ク
ローン抗体Ｍ５と反応する代表的なクローンＲ４ａによ
る免疫抗体は、ＥＬＩＳＡで同じＲ４ａの抗原とは反応
するが２ＧＳ抗原とは常に反応性を示さず、これに対し
て単クローン抗体Ｒ１と反応するクローンによる免疫抗
体は、同法で同じ抗原ともまた２ＧＳ抗原とも反応性を
示すことがわかった。

【００４６】一方、また８種のウエスタンブロットの成
績からも、単クローン抗体Ｍ５は、当該遺伝子を挿入し
ないベクターを移入した宿主菌由来の抽出液（発現の陰
性対照）の数多くの蛋白質をも認識するが、これに対し
単クローン抗体Ｒ１はそのような現象を示さず、常に発
現によって生じた蛋白質を主として認識するものである
ことがわかった。

【００４７】

【表３】

【００４８】以上のことから、ワクチンクローンには２
ＧＳ抗原に対して特異性を示すＲ１単クローン抗体認識
クローンから選定することが適切であると判断した。こ
れらのクローンについてさらに感染防御試験で検討した
結果、Ｒ７、Ｒ１５の両クローンがワクチンクローンの
候補に挙げられたが、効果を示す回数が上回ったＲ７が
最終的にワクチンクローンとして決定された。このよう
にして得られたＲ７クローンの組換え微生物をＴＢ１／
ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７と命名し、これを発現させて作
製したワクチンをロイコチトゾーン症遺伝子組換えワク
チン（Ｒ７ワクチンと略称）した。なお、本組換え微生
物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７は工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成６年３月２２日、受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４２４０として寄託されている。

【００４９】次に、本微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１
−Ｒ７について以下の成績を説明する。 ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７切断Ｒ７フラグメントの電気泳
動像：組換え微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７の
増殖培養菌から精製したｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７プラス
ミドとこれのＥｃｏＲＩ−切断ＤＮＡについて、１．２
％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイ
ドで染色した。図４は当該組換え微生物からｐＭＡＬ−
ｃＲ１−Ｒ７プラスミドが得られ、このプラスミドから
ＥｃｏＲＩ−切断により、約６．１ｋｂｐのベクターと
約２．０ｋｂｐのＲ７フラグメントが生じることを示
す。

【００５０】本微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７
の発現材料の電気泳動像及びウエスタンブロット像：発
現培養液の液量に対し１／１０量の菌体浮遊液の超音波
破砕抽出液を、さらに飽和硫酸アンモニウムで処理して
１／４０量とした発現材料に、等量の泳動用試料緩衝液
を加え、これの２０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル（８％濃度のゲル）にアプライして泳動を行った
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ウエスタンブロットの１次抗体
には単クローン抗体Ｒ１を用いた。このときのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ像を図６（ａ）、（ｂ）に、ウエスタンブロッ
ト像を図７のそれぞれ示した。

【００５１】図６（ａ）、（ｂ）に示すように発現材料
では２００ｋＤａ近くに２本のバンドが出現したが、一
方、発現の誘発をかけない非発現材料ではそれらのバン
ドはみられなかった。また、図７に示すように発現材料
ではそれらのバンドに反応性がみられたが、一方、非発
現材料では反応性はみられなかった。なお、発現材料の
２０倍希釈での反応性は２本のバンドの中、一方だけに
なったとみられる。

【００５２】このように２００ｋＤａ近くにバンドがみ
られる材料は、後述の単クローン抗体Ｒ１との反応でＥ
ＬＩＳＡ抗原価が示されるが、さらにそれらの関連性を
みるために、発現材料についてセファクリルＳ２００に
よるカラムクロマトグラフイー行い、その画分Ｆ１、Ｆ
２及びＦ３のカラムアプライ量に対して各４倍濃縮材料
について、同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ像およびウエス
タンブロット像を調べた。このときのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
像およびウエスタンブロット像をそれぞれ図８及び図９
に示した。

【００５３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２００ｋＤａ近くに２
本のバンドがＦ１では、やはりウエスタンブロット反応
性がみられるが、それらのバンドがみられないＦ２およ
びＦ３では反応性はみられなかった。なお、Ｆ１の２０
倍希釈での反応性はやはり２本のバンドの中、一方だけ
になったとみられる。また、これらの画分についてのＥ
ＬＩＳＡ抗原価はＦ１では認められたが、Ｆ２には認め
られなかった。

【００５４】発現材料及びその濾過画分のＥＬＩＳＡ抗
原価（１００倍に希釈した単クローン抗体Ｒ１を用いた
ときのＥＬＩＳＡ抗体価）はつぎの通りである。

【００５５】このように、発現材料ではＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにおいて２００ｋＤａ近くにバンドが出現し、それら
がウエスタンブロット反応を示すのに対し、同様の非発
現材料ではそれらのバンドは出現せず、ウエスタンブロ
ットでも反応性がみられないこと、またＥＬＩＳＡ抗原
価はそれらのバンドが出現する材料にのみ認められるこ
とから、それらの物質が発現融合蛋白質と判断された。
Ｒ７遺伝子の塩基配列は以下の通りで、その両末端の下
線部分はＥｃｏＲＩアダプター領域を示す。

【００５６】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【００５７】本微生物ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ１−Ｒ７
の発現融合蛋白質領域 融合蛋白質領域は、

【００５８】

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【化２０】 で示すように、マルトース結合蛋白質遺伝子の最初の開
始コドンＡＴＧから１ａｃＺａ遺伝子の最後の終止コド
ンＴＧＡまでの３３９９ｂｐ（１１３２個のアミノ酸）
である。その中に２０１９ｂｐのＲ７遺伝子がＥｃｏＲ
Ｉアダプターを介して挿入されている。ＥｃｏＲＩアダ
プター領域は破線で、Ｒ７領域は実線で示した。Ｒ７遺
伝子の両末端のＥｃｏＲＩアダプターを含めた領域の蛋
白質は６８９個のアミノ酸から成り、その組成は次の通
りである。

【００５９】 Ａｌａ ３（０．４） Ｌｅｕ ２（０．３） Ａｒｇ ２（０．３） Ｌｙｓ ６８（９．９） Ａｓｎ ２５（３．６） Ｍｅｔ ５（０．７） Ａｓｐ １２（１．７） Ｐｈｅ ２（０．３） Ｃｙｓ １（０．１） Ｐｒｏ ５（０．７） Ｇｌｎ １４（２．０） Ｓｅｒ ６（０．９） Ｇｌｕ ３１１（４５．１） Ｔｈｒ ５４（７．８） Ｇｌｙ ９（１．３） Ｔｒｐ ０（０．０） Ｈｉｓ ６８（９．９ Ｔｙｒ ８（１．２） Ｉｌｅ ３５（５．１） Ｖａｌ ５９（８．６） Ｅｎｄ ０（０．０）

【００６０】 酸性アミノ酸 （Ａｓｐ＋Ｇｌｕ） ３２３（４６．９） 塩基性アミノ酸 （Ａｒｇ＋Ｌｙｓ） ７０（１０．２） 芳香族アミノ酸 （Ｐｈｅ＋Ｔｒｐ＋Ｔｙｒ） １０（１．５） 疏水性アミノ酸 （芳香族アミノ酸＋Ile ＋Leu ＋Met ＋Val ） 111 (16.1) 分子量＝８４１４４

【００６１】（４）本Ｒ７ワクチンの感染防御試験 本原虫症ワクチンの感染防御試験による効果判定には、
免疫鶏にスポロゾイトで攻撃後、主として１３日目の血
清の可溶性抗原（ＳＳＡ）価の測定、２１日目までの発
症、生・死判定を含む臨床症状の観察、及び２１日目の
血液中のガメトサイト数の測定等の評価の結果がその評
価の対象となり、その他ワクチン抗体価（攻撃直前の血
清抗体価）の測定及び攻撃後２１日目の血液中の赤血球
数の測定等の結果も評価の参考とした。

【００６２】ＳＳＡ価またはガメトサイト数の測定は、
スポロゾイトで攻撃後２１日目を経ても発症、生・死で
は効果判定不能の場合にも評価の対象になるものであ
る。ＳＳＡ価の測定は、攻撃スポロゾイトにより血清中
に出現する原虫の発育過程に由来するＳＳＡ価の量を、
感染耐過鶏血清を用いたゲル内沈降反応で調べ、陽性反
応の程度が低いもの程、スポロゾイトの発育が抑えられ
たことになり、したがってその反応が少ない羽数が非免
疫対照群の羽数に比較して多いもの程、防御効果が認め
られたことになる。同様にガメトサイト数の測定はやは
りスポロゾイトがガメトサイトにまで発育するその数を
測定するもので、血液中いその数が少ない羽数が非免疫
対照群の羽数に比較して多いもの程、防御効果が認めら
れたことになる。

【００６３】ワクチンは前述の実施例の（３）に記載し
た通りに調製し、最終的に水酸化アルミニウムゲルを加
えた時点でその量は培養液量に対して１／１０とした。
以下３ロットの試作品についてそれぞれ試験−１、試験
−２及び試験−３として行った。鶏は試験−１、試験−
２及び試験−３ではそれぞれ３６日令、２３日令および
２１日令のいずれもＳＰＦ鶏由来ひなを用い、ワクチン
を左右大腿部筋肉内に０．５ｍｌずつ計１ｍｌを２週間
隔で２回注射した。試験−３ではさらに１．５ｍｌずつ
の計３ｍｌでも試みた。ワクチン２回注射２週間後に血
清を採取した後、攻撃はロイコ原虫静岡株のスポロゾイ
トを１羽あたり、試験−１では１３６００匹、試験−２
では１２５００匹、試験−３では１５０００匹を静脈内
接種して行った。

【００６４】攻撃直前に採血し、攻撃後２１日間臨床症
状の観察を行い、この間１３日目に採血し、また観察終
了時に血液サンプルを採取した。さらに攻撃時及び試験
終了時の体重を測定した。それらによる試験−１、試験
−２及び試験−３における主として、ワクチン抗体価
（攻撃直前のＥＬＩＳＡによる血清抗体価）、攻撃後１
３日目のＳＳＡ価、攻撃後２１日目までの臨床症状観
察、試験終了時のガメトサイト数等及び増体重の結果を
それぞれ表４、表５及び表６に示した。

【００６５】試験−１

【００６６】

【表４】 １）陽性を示した血清の最高希釈倍数 ２）沈降線のみられた血清の最高希釈倍数 ３）攻撃後日数 ４）死亡のための検査できず ５）血液凝固のため検査できず

【００６７】表４の結果から明らかように、ＥＬＩＳＡ
抗体価はワクチン群では＜１００〜１６０００倍で、対
照群の全例＜１００倍に比較して上昇が認められた。Ｓ
ＳＡ価は、ワクチン群では認められた抗原は２〜３２倍
（平均１４．５倍）であったのに対し、対照群では８〜
＞５１２倍（平均６４．０倍）の抗原が認められ、両者
の間には明らか差が認められた。

【００６８】臨床症状観察結果では、ワクチン群では８
例中３例が発症、その中２例が死亡したのに対し、対照
群では８例中全例が発症し、その中４例が死亡した。ガ
メトサイト数は、ワクチン群では平均２０４万匹／ｍｌ
で、対照群の平均１１０万匹／ｍｌより多かったが、む
しろ差はないとみるのが適切と思われる。ヘマトクリッ
ト値（試験終了時）は、ワクチン群では平均２０．６で
あったのに対し、対照群では１６．３で、ワクチン群に
おけるヘマトクリット値の回復が対照群より早い傾向が
見られた。更に、増体重はワクチン群では平均６０ｇで
あったのに対し、対照群では−４５ｇであった。以上の
試験結果から、特にＳＳＡ価の測定及び臨床症状の観察
の結果から効果が認められると判定された。

【００６９】試験−２

【００７０】

【表５】 表５の結果から明らかなように、ＥＬＩＳＡ抗体価は、
ワクチン群では１００〜１２８００倍で、対照群の全例
＜１００倍に比較して上昇が認められた。ＳＳＡ価は、
ワクチン群では７例中３例に４〜３２倍の抗原が認めら
れたが、残る４例には抗原は認められなかった。これに
対し対照群では全例に３２〜２５６倍の抗原が認められ
た。

【００７１】臨床症状観察結果では、ワクチン群では全
例に死亡する例は認められなかったが、発症は全例に認
められ、その程度はワクチン群では７例中１例が＋＋＋
の重度の発症を示した他は１例が＋＋の中等度であり、
５例は＋の軽度であった。これに対し対照群では７例中
１例が＋＋の中等度以外は、残り６例が＋＋＋の重度で
あった（肉冠褪色、元気なくうずくまり、嗜眠状態の何
れか１つの症状を示した場合は＋、２つの症状を示した
場合は＋＋、全ての症状を示した場合は＋＋＋とし
た）。

【００７２】ガメトサイト数は、ワクチン群では１６３
万匹／ｍｌで、対照群の６０１万匹／ｍｌに比較して少
なかった。赤血球数は、ワクチン群では３１１万個／ｍ
ｍ³であったのに対し、対照群では２２４万個／ｍｍ³
であった。更に増体重は、ワクチン群では平均１４０ｇ
であり、対照群の平均４３ｇを上回った。以上の結果か
ら、特にＳＳＡ価の測定および臨床症状の観察結果から
効果が認められると判定された。

【００７３】試験−３

【００７４】

【表６】 表６の結果から明らかなように、ＥＬＩＳＡ抗体価は、
ワクチン群では１００〜８００倍で、対照群の全例＜１
００倍に比較して上昇が認められた。ＳＳＡ価は、ワク
チン群と対照群と共に臨床的に特に所見は認められなか
った。臨床症状観察結果では、ワクチン群と対照群と共
に、臨床的に特に所見は認められなかった（表中の＋
は、肉冠に軽度の白色化がみられたことを示す）。

【００７５】ガメトサイト数は、ワクチン群では全例ガ
メトサイトは認められるず、これに対し対照群では平均
６１２万個／ｍｍ³ で、両者には明らかな差が認められ
た。増体重は、両者間に差は認められなかった。なお、
こお試験ではワクチンの１回に１ｍｌ接種でも効果に差
は認められなかった。以上３例の試験成績より、本ワク
チンはロイコチトゾーン症ワクチンとして効果が認めら
れると判定された。

【００７６】

【配列表】

【００７７】配列番号：１ 配列の長さ：２０１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：塩基配列 起源 生物名：ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント 株名：静岡株 配列

【００７８】

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【００７９】配列番号：２ 配列の長さ：３３９９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：塩基配列 起源 生物名：ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント
及び大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来発現プラスミド
ｐＫＫ２３３−２由来ｐＭＡＬ−ｃＲＩ 株名：静岡株 配列

【００８０】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント
の免疫原性蛋白質遺伝子のクローニング及びワクチンク
ローンの選定の工程図である。

【図２】ロイコチトゾーン・カウレリー第２代シゾント
免疫原性蛋白質遺伝子のクローニングを示すものであ
る。

【図３】クローン化第２代シゾント免疫原生蛋白質遺伝
子の発現ベクターｐＭＡＬ−ｃＲＩへの挿入を示すもの
である。

【図４】Ｒ７及びＲ１５及びＲ４ａプローブをそれぞれ
に対するｐＵＣ１９−クローンプラスミド反応のハイブ
リダイゼーションを示すものである。

【図５】ｐＭＡＬ−ｃＲＩ−Ｒ７切断Ｒ７フラグメント
のアガロース電気泳動像を示すものである。

【図６】（ａ）および（ｂ）はＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ
Ｉ−Ｒ７発現材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示すものであ
る。

【図７】ＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲＩ−Ｒ７発現材料のウ
エスタンブロット像を示すものである。

【図８】発現材料のカラムクロマト画分のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ像を示すものである。

【図９】発現材料のカラムクロマト画分のウエスタンブ
ロット像を示すものである。

【手続補正書】

【提出日】平成６年１１月２８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】（ａ）および（ｂ）はＴＢ１／ｐＭＡＬ−ｃＲ
Ｉ−Ｒ７発現材料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を顕微鏡写真に
よって示すものである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】ＴＢＩ／ｐＭＡＬ−ｃＲＩ−Ｒ７発現材料のウ
エスタンブロット像を顕微鏡写真によって示すものであ
る。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】発現材料のカラムクロマト画分のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ像を顕微鏡写真によって示すものである。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図９】発現材料のカラムクロマト画分のウエスタンブ
ロット像を顕微鏡写真によって示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤崎 優次郎 東京都武蔵野市吉祥寺南町１−６−18− 904

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 鶏ロイコチトゾーン由来の免疫原生蛋白
   質を認識する単クローン抗体を用いることにより、イム
   ノスクリーニングにより選別されることを特徴とする免
   疫原生蛋白質遺伝子クローン。
2. 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子クローンが発現す
   る免疫原生蛋白質、及びアジュバントを含むことを特徴
   とする鶏ロイコチトゾーン症に対するワクチン。
3. 【請求項３】 請求項１記載の遺伝子クローンの全てま
   たは一部を含むことを特徴とする下記の配列に示す組換
   えＤＮＡ分子。 【化１】 【化２】 【化３】
4. 【請求項４】 発現制御配列に操作的に結合された請求
   項３記載の組換えＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えＤＮＡ分子が挿入
   されたベクター。
6. 【請求項６】 下記の配列 【化４】 【化５】 【化６】 に示す組換えＤＮＡ分子によ発現された下記の配列に示
   すポリペプチド。 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】
7. 【請求項７】 請求項６記載のポリペプチドにより調製
   されたロイコチトゾーン症ワクチン。