JPH07285885A - 免疫グロブリンの製造法 - Google Patents
免疫グロブリンの製造法Info
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- JPH07285885A JPH07285885A JP10499194A JP10499194A JPH07285885A JP H07285885 A JPH07285885 A JP H07285885A JP 10499194 A JP10499194 A JP 10499194A JP 10499194 A JP10499194 A JP 10499194A JP H07285885 A JPH07285885 A JP H07285885A
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫グロブリン及びこれによつて得られた免
疫グロブリン（抗原）による免疫グロブリン単量体の製
造法に関する。 【構成】 カゼインの等電点（ｐＨ４．５−４．６）沈
殿又はレンニン等の酵素処理で得た乳清に、エチレンジ
アミン四酢酸の濃度０．５−１０ｍＭ、又はグリシンの
濃度が５０−５００ｍＭになるように加え、クエン酸ナ
トリウム溶液で乳清のｐＨを６．０−６．５に調整し、
これに陽イオン交換樹脂を接触させ、５０，０００又は
１００，０００ダルトンの分離限界を有する限外濾過モ
ジユールを用いて、目的とする免疫グロブリンを得る。
疫グロブリン（抗原）による免疫グロブリン単量体の製
造法に関する。 【構成】 カゼインの等電点（ｐＨ４．５−４．６）沈
殿又はレンニン等の酵素処理で得た乳清に、エチレンジ
アミン四酢酸の濃度０．５−１０ｍＭ、又はグリシンの
濃度が５０−５００ｍＭになるように加え、クエン酸ナ
トリウム溶液で乳清のｐＨを６．０−６．５に調整し、
これに陽イオン交換樹脂を接触させ、５０，０００又は
１００，０００ダルトンの分離限界を有する限外濾過モ
ジユールを用いて、目的とする免疫グロブリンを得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は免疫グロブリン及びこ
れによつて得られた免疫グロブリンによる免疫グロブリ
ン単量体の製造法に関する。
れによつて得られた免疫グロブリンによる免疫グロブリ
ン単量体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウシ初乳には１ml当たりIgGl 64.9、IgG
2 2.2、IgA 3.5、IgM 8.7mgの免疫グロブリン(Ig)が含
まれており(Butler, J.E., ed. Butler, J.E., “The R
uminantImmune System", pp3-55, Plenum Press, New Y
ork, 1981)、このIgを分取し、積極的に用いようとの試
みが多方面で検討されている。
2 2.2、IgA 3.5、IgM 8.7mgの免疫グロブリン(Ig)が含
まれており(Butler, J.E., ed. Butler, J.E., “The R
uminantImmune System", pp3-55, Plenum Press, New Y
ork, 1981)、このIgを分取し、積極的に用いようとの試
みが多方面で検討されている。
【０００３】Igの中でもメインタ−ゲツトにされている
のは、最も量の多いIgG画分であり、これの一般的な調
製法は、塩析、ゲル濾過、イオン交換法等の組み合わせ
であり、特異性が要求される場合にはプロテインＡをリ
ガンドにしたアフイニテイ−クロマトグラフイ−を用い
ている。特殊な抗原に対する抗体を得、研究又は医薬品
とするのであれば、これらの調製法によるコストの上昇
を吸収し得るが、食品又はそれに類する物に用いるので
あれば、それら調製法による製品のコストは非現実的で
ある。
のは、最も量の多いIgG画分であり、これの一般的な調
製法は、塩析、ゲル濾過、イオン交換法等の組み合わせ
であり、特異性が要求される場合にはプロテインＡをリ
ガンドにしたアフイニテイ−クロマトグラフイ−を用い
ている。特殊な抗原に対する抗体を得、研究又は医薬品
とするのであれば、これらの調製法によるコストの上昇
を吸収し得るが、食品又はそれに類する物に用いるので
あれば、それら調製法による製品のコストは非現実的で
ある。
【０００４】したがつて、既述の調製法以外にもFeCl
3(Kuwata, T. et. al., Eliminationof β-lactoglobul
in from whey to stimulate human milk protein. j. F
oodSci., 50, 605-609, 1985)、NaCl（Mailliart, P. e
t. al., J. Food Sci., 53(3), 743, 1988)、限外濾過
（桐原 修、ウシ免疫グロブリンの分離と利用、酪農科
学、食品の研究、39、A-301-A-305、1990)等による調製
法も報告されている。
3(Kuwata, T. et. al., Eliminationof β-lactoglobul
in from whey to stimulate human milk protein. j. F
oodSci., 50, 605-609, 1985)、NaCl（Mailliart, P. e
t. al., J. Food Sci., 53(3), 743, 1988)、限外濾過
（桐原 修、ウシ免疫グロブリンの分離と利用、酪農科
学、食品の研究、39、A-301-A-305、1990)等による調製
法も報告されている。
【０００５】これらの各方法は非常に簡便であり、製造
コストを低く抑えられる利点を有するものの、特異性に
欠け、特に限外濾過(UF)法以外の方法は抗体価の著しい
低下を来す。またUF法は基本的に分子量差による分画で
あり有効な方法であるが、牛乳ホエ−にはβ-ラクトグ
ロブリン、α-ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン
等に代表されるように種々の物質と結合しやすいタンパ
ク質が存在する。
コストを低く抑えられる利点を有するものの、特異性に
欠け、特に限外濾過(UF)法以外の方法は抗体価の著しい
低下を来す。またUF法は基本的に分子量差による分画で
あり有効な方法であるが、牛乳ホエ−にはβ-ラクトグ
ロブリン、α-ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン
等に代表されるように種々の物質と結合しやすいタンパ
ク質が存在する。
【０００６】とくに既述タンパク質は脂質類と非常に結
合しやすく、またβ-ラクトグロブリンはホエ-中に存在
するラクトフエリンとも強く結合する（Ena, J.M. et.
al.,Isolation of human lactoferrin by affinity chr
omatography using insolubilized bovine β-lactoglo
bulin. J. Chromato., 525, 442-446, 1990)ことから、
ホエ-中でのこれらのタンパク質の見かけ上の分子量は
非常に大きく、UF処理による分画の障害となつている。
合しやすく、またβ-ラクトグロブリンはホエ-中に存在
するラクトフエリンとも強く結合する（Ena, J.M. et.
al.,Isolation of human lactoferrin by affinity chr
omatography using insolubilized bovine β-lactoglo
bulin. J. Chromato., 525, 442-446, 1990)ことから、
ホエ-中でのこれらのタンパク質の見かけ上の分子量は
非常に大きく、UF処理による分画の障害となつている。
【０００７】したがつて、UF法によりIgを製造した場
合、その純度は70-80%程度(南 善行らの「牛乳中の免疫
グロブリンの濃縮方法」（特開昭60-75433号公報)、ノ
ベルトコ-テらの「乳および/または初乳免疫グロブリン
溶液の製造方法」（特開昭61-68429号公報)であり、種
々の夾雑物を含み純度的に満足できるものではなかつ
た。また従来の方法ではIgGが重合体として存在してい
る場合が多く、その力価を安定にすることは殆んど不可
能に近い状態でもあつた。
合、その純度は70-80%程度(南 善行らの「牛乳中の免疫
グロブリンの濃縮方法」（特開昭60-75433号公報)、ノ
ベルトコ-テらの「乳および/または初乳免疫グロブリン
溶液の製造方法」（特開昭61-68429号公報)であり、種
々の夾雑物を含み純度的に満足できるものではなかつ
た。また従来の方法ではIgGが重合体として存在してい
る場合が多く、その力価を安定にすることは殆んど不可
能に近い状態でもあつた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】この発明は従来の技術
における種々の障害及び問題点を改善しようとするもの
である。
における種々の障害及び問題点を改善しようとするもの
である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】ここにおいてこの発明
は、カゼインの等電点(pH4.5-4.6)沈殿又はレンニン等
の酵素処理で得た乳清に、エチレンジアミン四酢酸の濃
度0.5-10mM、又はグリシンの濃度が50-500mMになるよう
に加え、クエン酸ナトリウム溶液で乳清のpHを6.0-6.5
に調整し、これに陽イオン交換樹脂を接触させ、50,000
又は100,000ダルトンの分離限界を有する限外濾過モジ
ユ−ルを用いて、目的とする免疫グロブリンを得ること
を特徴とする免疫グロブリンの製造法を提案し、更にこ
れにもとづいて、上記方法で得た乳清を100,000ダルト
ンの分離限界を有する限外濾過モジユ−ルで得た免疫グ
ロブリン画分に陽イオン交換樹脂を接触させ、免疫グロ
ブリンの重合体を除去することを特徴とする免疫グロブ
リン単量体の製造法並びに上記方法で得た免疫グロブリ
ンと、陽イオン交換樹脂とを接触させ、免疫グロブリン
重合体を除去することを特徴とする免疫グロブリン単量
体の製造法を提案するものである。
は、カゼインの等電点(pH4.5-4.6)沈殿又はレンニン等
の酵素処理で得た乳清に、エチレンジアミン四酢酸の濃
度0.5-10mM、又はグリシンの濃度が50-500mMになるよう
に加え、クエン酸ナトリウム溶液で乳清のpHを6.0-6.5
に調整し、これに陽イオン交換樹脂を接触させ、50,000
又は100,000ダルトンの分離限界を有する限外濾過モジ
ユ−ルを用いて、目的とする免疫グロブリンを得ること
を特徴とする免疫グロブリンの製造法を提案し、更にこ
れにもとづいて、上記方法で得た乳清を100,000ダルト
ンの分離限界を有する限外濾過モジユ−ルで得た免疫グ
ロブリン画分に陽イオン交換樹脂を接触させ、免疫グロ
ブリンの重合体を除去することを特徴とする免疫グロブ
リン単量体の製造法並びに上記方法で得た免疫グロブリ
ンと、陽イオン交換樹脂とを接触させ、免疫グロブリン
重合体を除去することを特徴とする免疫グロブリン単量
体の製造法を提案するものである。
【００１０】
【作用】上記方法によつて免疫グロブリンを得、これに
もとづいて免疫グロブリン単量体を製造する。
もとづいて免疫グロブリン単量体を製造する。
【００１１】
【実施例】 (1)ウシ初乳乳清の調製:分娩3週間前からヒトIgEを常法
で感作したウシから、分娩後0-3日目までの初乳を採取
した。クリ-ムセパレ-タで脂肪を除去し、脱脂乳を得
た。これに等量の脱イオン水を加え、EDTAを0.5-10mM
(好ましくは1mM)又はグリシン濃度が50-500mM(好ましく
は100mM)になるように加えた後、クエン酸でpHは4.5-4.
6に調整した。生じた沈殿物を遠心分離で除去し、乳清
を得た。この乳清のpHを水酸化ナトリウムで6.0-6.5に
調整し、実験に用いた。この時、感作する抗原(ヒトIg
E)はこの発明を説明するためだけのものである。
で感作したウシから、分娩後0-3日目までの初乳を採取
した。クリ-ムセパレ-タで脂肪を除去し、脱脂乳を得
た。これに等量の脱イオン水を加え、EDTAを0.5-10mM
(好ましくは1mM)又はグリシン濃度が50-500mM(好ましく
は100mM)になるように加えた後、クエン酸でpHは4.5-4.
6に調整した。生じた沈殿物を遠心分離で除去し、乳清
を得た。この乳清のpHを水酸化ナトリウムで6.0-6.5に
調整し、実験に用いた。この時、感作する抗原(ヒトIg
E)はこの発明を説明するためだけのものである。
【００１２】(2)IgG単量体の調製:上記(1)で得た乳清30
0mlに、DEAE-セルロフアイン（生化学工業社製）20gを
加え、穏やかに攪拌した後、ブフナ-漏斗で濾過し、非
吸着画分を集め、50K又は100Kダルトンの分離限界を有
する限外濾過モジユ-ル(旭化成社製)を用いて限外濾過
を行なつた。濃縮されたリテンテイトを1mMEDTA又は100
mMグリシンを含む10mMクエン酸緩衝液(pH6.0-6.5)で希
釈し、限外濾過を繰り返した。この操作により低分子物
質を除去した後、リテンテイトを凍結乾燥した。
0mlに、DEAE-セルロフアイン（生化学工業社製）20gを
加え、穏やかに攪拌した後、ブフナ-漏斗で濾過し、非
吸着画分を集め、50K又は100Kダルトンの分離限界を有
する限外濾過モジユ-ル(旭化成社製)を用いて限外濾過
を行なつた。濃縮されたリテンテイトを1mMEDTA又は100
mMグリシンを含む10mMクエン酸緩衝液(pH6.0-6.5)で希
釈し、限外濾過を繰り返した。この操作により低分子物
質を除去した後、リテンテイトを凍結乾燥した。
【００１３】(3)上記(1)で得た乳清を(2)で用いた限外
濾過モジユ-ル及び1mMEDTA又は100mMグリシンを含む緩
衝液存在下で濾過し、得られたリテンテイトとDEAE-セ
ルロフアインを接触させ、非吸着画分を集め、これを凍
結乾燥した。
濾過モジユ-ル及び1mMEDTA又は100mMグリシンを含む緩
衝液存在下で濾過し、得られたリテンテイトとDEAE-セ
ルロフアインを接触させ、非吸着画分を集め、これを凍
結乾燥した。
【００１４】(4)上記(2)に記載の手法でIgG単量体を製
造する場合、限外濾過中のポンプに起因する加圧や剪断
力等の物理的力により、IgGが重合体を形成するのが散
見される。このIgG重合体を(3)に記載の手法のように、
DEAE-セルロフアインを接触させることにより除去し、
凍結乾燥した。
造する場合、限外濾過中のポンプに起因する加圧や剪断
力等の物理的力により、IgGが重合体を形成するのが散
見される。このIgG重合体を(3)に記載の手法のように、
DEAE-セルロフアインを接触させることにより除去し、
凍結乾燥した。
【００１５】次に(2),(3)及び(4)に記載の方法により得
たIgG調整物の収率、純度及び力価をまとめて表１に示
す。
たIgG調整物の収率、純度及び力価をまとめて表１に示
す。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【発明の効果】上記方法によれば、乳清にエチレンジア
ミン四酢酸及びグリシンを加え、pH6.0-6.5において、
陽イオン交換樹脂及び限外濾過モジユ-ルを用いて免疫
グロブリンを得ることができるものである。
ミン四酢酸及びグリシンを加え、pH6.0-6.5において、
陽イオン交換樹脂及び限外濾過モジユ-ルを用いて免疫
グロブリンを得ることができるものである。
Claims (3)
- 【請求項１】 カゼインの等電点(pH4.5-4.6)沈殿又は
レンニン等の酵素処理で得た乳清に、エチレンジアミン
四酢酸の濃度0.5-10mM、又はグリシンの濃度が50-500mM
になるように加え、クエン酸ナトリウム溶液で乳清のpH
を6.0-6.5に調整し、これに陽イオン交換樹脂を接触さ
せ、50,000又は100,000ダルトンの分離限界を有する限
外濾過モジユ−ルを用いて、目的とする免疫グロブリン
を得ることを特徴とする免疫グロブリンの製造法。 - 【請求項２】 請求項１で得た乳清を100,000ダルトン
の分離限界を有する限外濾過モジユ−ルで得た免疫グロ
ブリン画分に陽イオン交換樹脂を接触させ、免疫グロブ
リンの重合体を除去することを特徴とする免疫グロブリ
ン単量体の製造法。 - 【請求項３】 請求項１で得た免疫グロブリンと、陽イ
オン交換樹脂とを接触させ、免疫グロブリン重合体を除
去することを特徴とする免疫グロブリン単量体の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10499194A JPH07285885A (ja) | 1994-04-21 | 1994-04-21 | 免疫グロブリンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10499194A JPH07285885A (ja) | 1994-04-21 | 1994-04-21 | 免疫グロブリンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07285885A true JPH07285885A (ja) | 1995-10-31 |
Family
ID=14395570
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10499194A Pending JPH07285885A (ja) | 1994-04-21 | 1994-04-21 | 免疫グロブリンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07285885A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999062936A1 (en) * | 1998-06-01 | 1999-12-09 | Genentech, Inc. | Separation of protein monomers from aggregates by use of ion-exchange chromatography |
| CN1090030C (zh) * | 1997-08-06 | 2002-09-04 | 上海科星生物技术有限公司 | 复方牛乳丙种球蛋白及其制作方法 |
| US9055752B2 (en) | 2008-11-06 | 2015-06-16 | Intercontinental Great Brands Llc | Shelf-stable concentrated dairy liquids and methods of forming thereof |
| US11490629B2 (en) | 2010-09-08 | 2022-11-08 | Koninklijke Douwe Egberts B.V. | High solids concentrated dairy liquids |
| CN115417929A (zh) * | 2022-10-09 | 2022-12-02 | 江苏天美健大自然生物工程有限公司 | 一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法 |
-
1994
- 1994-04-21 JP JP10499194A patent/JPH07285885A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1090030C (zh) * | 1997-08-06 | 2002-09-04 | 上海科星生物技术有限公司 | 复方牛乳丙种球蛋白及其制作方法 |
| WO1999062936A1 (en) * | 1998-06-01 | 1999-12-09 | Genentech, Inc. | Separation of protein monomers from aggregates by use of ion-exchange chromatography |
| US6620918B2 (en) | 1998-06-01 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | Separation of polypeptide monomers |
| EP1500661A1 (en) * | 1998-06-01 | 2005-01-26 | Genetech, Inc. | Separation of protein monomers from aggregates by use of ion-exchange chromatography |
| US9055752B2 (en) | 2008-11-06 | 2015-06-16 | Intercontinental Great Brands Llc | Shelf-stable concentrated dairy liquids and methods of forming thereof |
| US11490629B2 (en) | 2010-09-08 | 2022-11-08 | Koninklijke Douwe Egberts B.V. | High solids concentrated dairy liquids |
| CN115417929A (zh) * | 2022-10-09 | 2022-12-02 | 江苏天美健大自然生物工程有限公司 | 一种牛初乳免疫球蛋白的提取方法 |
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