JPH0728757B2 - 制癌剤感受性試験方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、制癌剤感受性試験方法に関し、詳しくは、
制癌剤に対する癌細胞の感受性を、生体外で癌細胞を培
養して試験する方法に関するものである。

〔従来の技術〕 制癌剤の効果すなわち感受性を試験するには、癌患者に
制癌剤を投与して癌組織の変化を診断検査する臨床的試
験法、ヒト癌組織を移植した動物に制癌剤を投与する動
物実験法、および、癌患者から取り出した癌細胞に制癌
剤を接触させた後、癌細胞を適当な基質を用いて培養す
るか、あるいは培養時に制癌剤を接触させるかして、一
定期間経過後の癌細胞の増殖度を測定する細胞培養試験
法等がある。

制癌剤の開発当初の段階では、いきなり臨床的試験法を
適用することは出来ないため、まず、細胞培養試験法や
動物実験法で制癌剤の癌細胞に対する制癌効果すなわち
制癌剤感受性を充分に確認した後、臨床試験法で最終的
な効果の確認を行うのが普通である。動物実験法は、ヌ
ードマウス等の実験動物の管理が難しく、ヒト癌細胞の
移植成功率も低く、実験結果を確認するまでに長期間を
要する等の問題があるのに対し、細胞培養試験法は、比
較的簡単な装置および作業で実施でき、結果も迅速に得
られるという利点がある。したがって、制癌剤の開発に
おいて、細胞培養試験法による制癌剤感受性試験は極め
て重要な役割を果たしている。

従来、細胞培養試験法としては、代表的なものとして、
HTCA（Human Tumor Clonogenic Assay）法と呼ばれる方
法がある。この方法は、生体から取り出した癌組織から
単一細胞分散液を作製し、これに制癌剤を接触させた
後、軟寒天培地内で癌細胞を培養し、一定期間経過後に
形成された癌細胞のコロニー数を測定して、制癌剤によ
るコロニー形成阻止率を評価することによって制癌剤の
感受性を試験する。コロニー数の算定は、目視またはコ
ロニーカウンターを用いて行われる。その他、単層培養
法を用いて培養を行い、アイソトープ法やDNA測定法を
用いて制癌剤の癌細胞への影響をみる方法等がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところが、細胞培養試験法における代表的な制癌剤感受
性試験方法である前記HTCA法には、以下に述べるような
問題点があった。

まず、軟寒天培地を用いた培養方法には、線維芽細胞の
増殖を抑制するという長所があるが、癌細胞のコロニー
形成率が低い為、数多くの細胞が必要であり、その結
果、一定量の採取細胞で行える試験の数が少なくなる。
しかも、培養できる癌細胞の種類が限定されるという問
題がある。すなわち、癌細胞は、患部組織の違い等によ
り、その種類および性質は様々に異なり、これらの多種
類の癌細胞のうち、寒天培地で培養できるものは、かな
り少なく限定される。

そこで、本発明者らは、ヒト癌細胞を用いた初代培養の
系において、軟寒天培地をコラーゲンゲル基質にかえた
新しい制癌剤感受性試験について検討した結果、コラー
ゲンゲル培養法は、軟寒天培地では増殖しないヒト癌細
胞でも、安定に増殖させ得ることを見出した（肥塚他６
名による、「組織培養研究」Vol.6,No.1,1987参照）。
その結果、細胞培養試験法の適用範囲を大幅に広げるこ
とができた。また、コラーゲンゲルは軟寒天培地等に比
べて癌細胞の培養が効率良く行われるため、細胞の必要
数が少なく、短時間で能率的に試験結果が得られるとい
う利点もあることも判った。

なお、コラーゲンゲルを基質に用いた場合、増殖度の測
定には、コラーゲンゲル内で増殖した細胞のDNA量を測
定し、癌細胞の増殖度を算定する方法が一般に行われて
いる。

ところが、コラーゲンゲル基質で癌細胞を培養すると、
癌組織の種類によって、癌細胞と同時に癌組織に含まれ
る線維芽細胞も増殖してしまうという問題が発生する。
線維芽細胞には癌細胞と同様にDNAが含まれているた
め、前記したDNAの定量によって癌細胞の増殖を測定す
る方法を適用することができない。従って、この場合に
は、目視やコロニーカウンターを用いて、形成されたコ
ロニーを計測することになる。しかし、実体顕微鏡を用
いて目視によって計測を行う場合、癌細胞のみを拾い出
して計測するには多大の苦労を要し、かつ、測定者によ
るバラツキが生じ、正確な計測が困難である。また、通
常のコロニーカウンターでは、癌細胞と線維芽細胞とを
明確に識別して計測することは実質上不可能である。臨
床材料から得られたヒト癌組織のうち、多くのものは、
癌細胞と同時に線維芽細胞の増殖が起こるので、癌細胞
と線維芽細胞とを分離しない限り、コラーゲンゲル基質
で培養された癌細胞に対して制癌剤の感受性を経験する
ことは極めて困難であった。なお、従来、癌細胞の増殖
を抑制することなく、線維芽細胞の増殖を抑制する方法
として、シス−オキシプロリン法、Ｄ−バリン法、シト
ルリン法等があるが、いずれもごく限られた種類の線維
芽細胞にしか適用することが出来ず、実用は困難であ
る。

そこで、この発明は、癌細胞を良好に培養することので
きるコラーゲンゲル基質の利点を生かすとともに、コラ
ーゲンゲル基質の欠点である線維芽細胞の増殖が起きて
も、癌細胞のみの増殖の変化を簡単かつ確実に測定する
ことのできる制癌剤感受性試験方法を提供することを課
題とする。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題を解決するために、この発明は、基質としてコ
ラーゲンゲルを用いて癌細胞を増殖させ、癌細胞の増殖
度を測定する手段として画像解析装置を用い、撮像によ
り得られた試料の画像信号から癌細胞およびそのコロニ
ーの画像信号を選択的に抽出し、得られた癌細胞および
コロニーの画像情報から癌細胞の増殖度を測定すること
により、制癌剤の感受性を試験する制癌剤感受性試験方
法を提供する。

この発明の１つの態様によれば、癌細胞の増殖度の測定
を、撮像により得られた試料の画像信号から癌細胞およ
びそのコロニーの画像信号を選択的に抽出して、この選
択的に抽出された癌細胞およびそのコロニーの画像信号
から癌細胞およびそのコロニーの推定体積値を算出する
ことにより行う。

この発明の別の１つの態様によれば、癌細胞の増殖度の
測定を、撮像により得られた試料の画像信号から対象物
の持つ濃度的特徴を理論的な演算によって強調しておい
て得られた強調画像から濃度に関する一定の基準値にし
たがって対象物の画像だけを抽出すると言う手法により
癌細胞およびそのコロニーの画像信号を選択的に抽出し
て、この選択的に抽出された癌細胞およびそのコロニー
の画像信号から癌細胞およびそのコロニーの数を算出す
ることにより行う。

基質となるコラーゲンは、ゲル化能のあるコラーゲンで
あればよいが、好ましくは、ゲル強度の高いタイプＩコ
ラーゲンが適当である。また、光学的測定を行うので、
ゲル化した状態で、測定に用いる波長の光に対して充分
な透過度を有し、かつ、光学的に均質なものが好まし
い。さらに、培養中に、経時的に光学的な変質を起こさ
ないものが望ましい。

また、癌細胞をコラーゲンゲルからなる基質で培養する
工程は、従来のコラーゲンゲルによる各種組織培養法に
準じて行われる。制癌剤を癌細胞に接触させる時期は、
たとえば、患者から採取した癌細胞（初代のもの）をコ
ラーゲンゲル基質に播種する前、初代癌細胞を継代培養
してからコラーゲンゲル基質に播種する前、あるいは、
コラーゲンゲル基質に播種してから直ちにあるいは数日
間培養後、など適宜設定すればよく、特に限定はない。

癌細胞の増殖変化を測定する手段として、画像解析装置
を用いる。画像解析装置は、顕微鏡等の光学機器に接続
し、そこから得られる画像信号を数値的な画像情報に変
換した後、演算処理を施すことによって、対象物につい
ての情報を明確にしようとする目的で用いる。そのため
に、画像解析装置には、マイクロコンピュータ等の画像
処理機構、固定ディスク装置等の画像の記憶機構、解析
された画像情報を出力するモニタテレビやビデオプリン
タ等の出力機構等を備えている。

顕微鏡としては、従来の目視による癌細胞測定用の顕微
鏡と同様のものが使用できる。顕微鏡の倍率すなわち視
野の大きさや、焦点深度、被写体距離、培養容器の装着
構造、照明装置等の条件を適当に選択することによっ
て、測定能力もしくは測定精度を向上させることができ
る。顕微鏡には、画像解析装置に試料画像信号を入力す
るために、TVカメラ等の入力装置が取り付けられる。

顕微鏡の観察位置に培養試料をセットするのは、手動で
行うこともできるが、培養試料を連続的に観察位置に送
り込んだり取り出したりできる連続搬送機構を備えてい
れば、測定の能率化を図ることができる。

この発明では、画像解析装置のTVカメラで培養試料の濃
淡画像を撮像する。撮像された試料画像は、癌細胞およ
びそのコロニー（以下、癌細胞と総称する）の画像のみ
の場合と、それらの画像と前記した線維芽細胞の画像と
が混在している場合がある。画像解析装置では、試料画
像から癌細胞以外の線維芽細胞等の不要な画像を除去処
理する。癌細胞の画像とそれ以外の不要な画像を分離し
て除去するには、画像解析装置における濃淡および形状
分離機能を利用する。すなわち、癌細胞は、多数の細胞
が集まってある程度の大きさ、濃淡および輪郭を有する
固まり、すなわちコロニーを形成しているのに対し、例
えば、線維芽細胞は、名前のとおり、細い線維状もしく
は枝状になっており、癌細胞と線維芽細胞は形状的およ
び画像の濃淡の違いによって明確に区別できる。そこ
で、画像解析装置では、形、面積、濃度および色差等が
一定の条件を満たす画像のみを癌細胞として認識し、上
記条件を満たさない画像は線維芽細胞等の不要な画像で
あると認識することによって、癌細胞画像以外の画像を
除去し、残った癌細胞画像のみを取り出すことができ
る。この癌細胞の画像に示される個々の画像の形状を演
算処理して評価すれば、癌細胞の増殖の変化、すなわち
増殖度が測定できる。

制癌剤の感受性を評価するには、たとえば、１の制癌剤
にまたは２以上の異なる制癌剤に別々に接触させた癌細
胞と、制癌剤に接触させなったコントロールの癌細胞
を、同じ条件で培養し、前記した画像解析装置で測定し
た癌細胞の増殖の変化を比較すればよい。

上記のように選択的に抽出された癌細胞画像から癌細胞
の増殖度を測定するためには、たとえば、つぎの２つの
やり方がある。第１は、癌細胞画像からコロニーの数を
計測することであり、第２は、癌細胞画像からのコロニ
ーの体積を計測することである。

前記第１のやり方によれば、たとえば、制癌剤に接触さ
せた癌細胞の培養によるコロニー数と、制癌剤に接触さ
せなかったコントロールの癌細胞の培養によるコロニー
数とを、自動計測により計測し、対比するのである。

また、前記第２のやり方によれば、たとえば、制癌剤に
接触させた癌細胞の培養によるコロニーの体積と、制癌
剤に接触させなかったコントロールの癌細胞の培養によ
るコロニーの体積とを算出し、対比するのである。ここ
で、コロニーの体積の算出は、たとえば、後述のように
して行われるが、それに限定されない。

〔作用〕

癌細胞をコラーゲンゲル基質で培養することによって、
培養できる癌細胞の種類が増え、細胞培養試験法の適用
範囲が拡がるとともに、癌細胞の増殖が良好に行われる
ので、確実かつ迅速に試験結果が得られる。

癌細胞のコロニー形成量を画像解析装置で解析して測定
することによって、癌細胞と同時に増殖する線維芽細胞
の影響を無くすことができる。すなわち、培養された試
料の画像において、癌細胞画像は塊状でしかも濃い画像
をなし、線維芽細胞は細い線維状で淡い画像をなすとい
うように、癌細胞と線維芽細胞とは形状的および濃度的
に明確な違いを有している。画像解析装置では、入力さ
れた画像から、一定の条件にしたがう形状・濃度の画像
のみを取り出すことができるので、癌細胞画像と線維芽
細胞画像とを分離して、癌細胞画像のみを取り出すこと
ができる。また、線維芽細胞以外にも、癌細胞と異なる
濃淡あるいは輪郭を有する不要物の画像は、癌細胞画像
と分離することができる。取り出された癌細胞画像から
癌細胞のコロニー形成量を測定すれば、線維芽細胞を含
まない癌細胞のみの増殖変化を測定することができる。

画像解析装置による測定は、たとえば、顕微鏡下で肉眼
的に測定する方法に比べて、はるかに短時間で能率的
に、しかも精密に複雑な量が測定できるとともに、測定
者の熟練度等による測定結果のバラツキや誤測定の可能
性を回避して、一定の条件で測定できるので、試験結果
が安定する。

しかも、非破壊的測定法であるから、同一試料を経時的
に測定でき、対象物すなわち癌細胞の変化量を測定する
場合には、破壊的測定法では得られない測定精度を容易
に実現できる。さらに、解析に必要な工程は、画像解析
装置内で自動化することができ、また、連続測定機構と
も連動させれば、測定の時間と手間を省いて合理化する
ことができる。

癌細胞の増殖度の測定を、選択的に抽出された癌細胞画
像からコロニーの数を計測することにより行うと、コロ
ニー同士の接触がない場合、安価な画像解析装置で精度
良く測定できる。

また、癌細胞の増殖度の測定を、選択的に抽出された癌
細胞画像からコロニーの体積を計測することにより行う
と、コロニー同士が接触していたり重なり合ったりして
いても、コロニー数の計測に比べてより正確な計測がで
きる。

〔実 施 例〕

ついで、この発明の具体的な実施例について詳しく説明
するが、この発明は下記実施例に限定されない。

（実験１） −コラーゲンゲル培養と他の培養法との比較− まず、この発明で用いるコラーゲンゲル基質が、従来の
軟寒天培地よりも、ヒト癌細胞の培養に適していること
を実験により確かめた。

下記第１表は、コラーゲンゲル気質内と従来の軟寒天培
地内で種々のヒト癌細胞を培養した結果を示している。

表中、軟寒天培地は、従来のHTCA法で用いられている培
養法を採用した。培養後に、培養試料を観察して、癌細
胞のコロニーが20個を超えたものを培養成功と評価し
た。各欄の数値は、成功数／試験数を示している。な
お、播種細胞数は、コラーゲンゲル基質が５×10⁴個/m
l、軟寒天培地が５×10⁵個/mlであった。

上記結果から判るように、コラーゲンゲル基質を用いる
ことによって、従来の軟寒天培地等に比べて、はるかに
多くの種類の癌細胞を培養できることが実証された。

（実施例１） 以下の手順により、この発明の制癌剤感受性試験を行
い、複数の制癌剤の効果を対比した。

−癌細胞の培養− まず、画像解析に供する癌細胞の培養を行った。

癌細胞は、ヌードマウス移植系ヒト結腸癌から、コラゲ
ナーゼおよびプロナーゼを用いた段階的酵素処理法によ
って分離したヒト癌細胞を用い、これをコラーゲンゲル
内に包埋し、培養した。

包埋方法は、セルマトリックス・タイプＩ−Ａ（0.3％
酸可溶性コラーゲン溶液：新田ゼラチン（株）製）８容
量に対し、10倍濃度のハムF12培地（NaHCO₃不含）１容
量、再構成用緩衝液（260mM−NaHCO₃および200mM−HEPE
Sを含む50mM−NaOH溶液）１容量およびFBS（ウシ胎児血
清）１容量を加え、ここに、前記酵素処理によって得ら
れたヒト癌細胞を加えてよく混合し、氷中に保存した。
このコラーゲン混合液を口径35mmのペトリ皿に1mlずつ
分注した。なお、細胞数は５×10⁴個/mlであった。これ
をCO₂インキュベータ中で37℃に加温することによっ
て、ヒト癌細胞を含むコラーゲンゲル基質が作製され
た。

得られたコラーゲンゲル基質に、制癌剤を含む培養液1m
lを重層し、CO₂インキュベータ内で37℃で24時間放置す
ることによって、ヒト癌細胞と制癌剤を接触させた。そ
の後、制癌剤を含む培養液を吸引除去し、ついで、制癌
剤を含まない培養液を2ml加え、CO₂インキュベータ内で
振とうさせてコラーゲンゲル基質を洗浄した。この操作
を10分ごとに計10回行うことによってコラーゲンゲル基
質から制癌剤を洗浄除去した。なお、コントロールで
は、制癌剤を含まない培養液を用い、ヒト癌細胞と制癌
剤との接触は行わなかった。

ついで、培養液2mlを加え、CO₂イキュベータ内で37℃で
10日間培養を行った。なお、培地交換は１〜２日ごとに
行った。培養後、10％ホルマリンを用いて細胞を含むコ
ラーゲンゲル基質を固定し、試料を作製した。

なお、上記で用いた培養液は、DME＋10％FBS＋Insulin
（１μg/ml）＋EGF培地（10ng/ml）であった。ここで、 DME:ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco′s Modifi
ed Eagle′s medium、日水製薬社製） FBS:牛胎児血清（Fetal Bovine Serum、ギブコ社製） Insulin:インシュリン（シグマ社製） EGF:上皮成長因子（Epidermal Growth Factor、コラボ
レーティブ社製） をそれぞれ用いた。

また、制癌剤としては、マイトマイシン（MMC:協和醗酵
工業（株）製）、フルオロウラシル（５−FU:協和醗酵
工業（株）製）、硫酸ビンデシン（VDS:塩野義製薬
（株）製）、エトポシド（VP−16:日本化薬（株）製）
およびシスプラチン（CDDP:ブリストルマイヤーズ社
製）の５種を用いた。

制癌剤の細胞に対する接触濃度は、各薬剤の臨床使用濃
度の最高血中濃度の1/10（腫瘍組織内濃度）を使用し
た。すなわち、MMC＝0.1μg/ml、５−FU＝1.0μg/ml、V
DS＝0.005μg/ml、VP−16＝0.1μg/ml、CDDP＝0.2μg/m
lであった。

−画像解析処理− 上記のようにして得られた固定試料のコラーゲンゲル基
質内で増殖したヒト癌細胞のコロニーおよび同時に増殖
した線維芽細胞の形態を実体顕微鏡を通してTVカメラで
撮影し、得られた画像を画像解析装置（LUZEX III U、
（株）ニコン製）に画像信号として入力した。

画像解析装置の諸元は以下の通りである。

制御プロセッサ： インテル80386/7 32ビット・プロセッサ 記憶装置： 40メガバイト 固定ディスク装置 画像処理回路： 画像容量 最大1024×1024ピクセル×（８＋１）ビット イメージ・アレイ・プロセッサ 画像入力装置： TVカメラ カルニコン撮像管 光学顕微鏡 画像出力装置： デジタル／アナログRGBモニタ ビデオ・プリンタ 画像解析装置に入力された画像信号は、画素に分解さ
れ、画像の各画素に対応した濃淡をそれぞれ数値化し、
癌細胞のコロニーと線維芽細胞の画像を対象として原画
像から分離するための処理が施された。対象物画像分離
の処理は、まず、対象物の持つ濃度的特徴を論理的な演
算によって強調した。演算には、高周波成分抽出演算、
濃度階級分画演算およびノイズ除去を組み合わせて用い
た。得られた強調画像から、濃度に関する一定の基準値
にしたがって対象物の画像だけを抽出した。この段階
で、濃淡差もしくは濃淡の変化率の差によって、ヒト癌
細胞のみのコロニー数を計数した。画像処理された後の
画像には、目的とする癌細胞のコロニーのみが強調され
ていて、線維芽細胞等の不要な画像は除去されているの
で、コロニー数の計測は容易である。

−画像処理による測定結果の検証− 上記のようにして、画像処理された後の画像から、ヒト
癌細胞のみのコロニーを測定した結果と、画像処理を行
わずに同様の測定を行った結果を比較する。

制癌剤を接触させなかったホルマリン固定試料を実体顕
微鏡でみると、球状をなす癌細胞のコロニーと、二極性
の線状をなす線維芽細胞とが混在している。

この状態で、肉眼により、注意深く時間をかけて、球状
のコロニー、すなわち癌細胞のコロニーのみを計測した
ところ、52個/1.4mm×1.4mm（１視野）であった。な
お、計測は、実体顕微鏡の強拡大下で行った。

同じ試料の撮影画像に対して、画像処理を行う前の段階
で、通常用いられているコロニーカウンターで計測した
ところ、コロニー数は1024個/1.4mm×1.4mmになり、線
維芽細胞の影響で癌細胞の正確なコロニー数が計測でき
なかった。

つぎに、前記した画像処理（高周波成分抽出演算および
濃度階級分画演算）を行った後の画像に対するコロニー
数の計測結果は、51個/1.4mm×1.4mmであり、前記肉眼
による計測結果とほぼ同じ結果が得られている。したが
って、画像処理によるコロニー数の計測結果が、充分な
精度を有していることが実証された。また、画像処理を
行った後の画像に対する癌細胞のコロニー数の計測は、
顕微鏡を目視して、線維芽細胞等が混在する中から癌細
胞のコロニー数のみを計測するよりも、はるかに簡単で
あった。

−画像解析後のコロニー数計測結果− 下記第２表は、各制癌剤を接触させた試料について、前
記のような画像解析およびコロニー数の計測を行った結
果を示している。ただし、コロニー数の計測は、測定精
度を上げるために、弱拡大下（１視野2.8mm×2.8mm）で
行った。

上記表において、（−）は、制癌剤を全く使用しなかっ
た場合（コントロール）であり、このコントロールに比
べて、コロニー数の少ない試料、すなわち癌細胞の増殖
が抑制された試料の制癌剤ほど、感受性が高いことにな
る。

（実験２） −従来法との比較− 上記した、この発明の実施例の試験方法が、制癌剤の感
受性を良好に示すことを確認するため、現在、抗腫瘍効
果において臨床相関性に最も優れているとされているヌ
ードマウス法による測定結果との対比を行った。

まず、前記実施例で得られたコロニー数の計測結果か
ら、制癌剤処理を行わなかった場合（コントロール）の
コロニー数に対する、制癌剤処理を行った場合のコロニ
ー数の百分率を、パーセント・オブ・コントロール（pe
rcent of control）として算出した。その結果を、第１
図にグラフで示している。

つぎに、ヌードマウスを用いた制癌剤感受性試験（比較
例１）は、以下のように行った。前記「癌細胞の培養」
に用いたヌードマウス移植系ヒト結腸癌を約2mm角に細
断してヌードマウスの皮下に移植した。その後、腫瘍推
定重量が約100mgに達した時点で、前記MMC＝3mg/kg、５
−FU＝50mg/kg、VP−16＝25mg/kg、CDDP＝5mg/kgまたは
VDS＝3mg/kgを、それぞれ１群５匹のヌードマウスに対
して、腹腔内に１週間ごとに計４回注射した。また、別
の１群を制癌剤を投与しないコントロールとした。腫瘍
推定重量は、腫瘍の長径（Lmm）と短径（Wmm）を測定し
てＬ×W²/2より算出した。そして、最終投与１週間後
に、再び腫瘍推定重量を測定して、制癌剤処理を行わな
かった場合（コントロール）の平均腫瘍重量に対する、
各制癌剤処理を行った場合の平均腫瘍重量の百分率を、
前記同様のパーセント・オブ・コントロールとして算出
した。その結果を、第２図にグラフで示している。

コラーゲンゲルおよび画像処理を組み合わせた、この発
明の実施例の測定結果を示す第１図と、ヌードマウス法
による測定結果を示す第２図を比べれば、いずれの制癌
剤に対しても、極めてよい相関性が得られており、この
発明の方法が、生体内すなわちインビボで行うヌードマ
ウス法の、生体外すなわちインビトロで行う代替法とし
て、実用性の高いものであることが実証された。しか
も、ヌードマウス法では、試験期間が１か月以上もかか
っているのに対し、実施例では約10日間程度という短期
間で、精度の高い試験が行えることも実証できた。

癌細胞の増殖度をコロニー数の計測により測定する場
合、細胞の増殖の仕方によっては、正確な増殖度から外
れることがある。たとえば、第３図にみるように、６個
の単一の癌細胞１をコラーゲンゲル５で培養したとき
に、矢印Ａで示すように細胞の増殖度が均一で小さい場
合には、ほぼ同様の大きさの６つのコロニー２を形成
し、コロニーが互いに重なり合わない。この場合、コロ
ニー数を自動計測すると６という結果が得られる。とこ
ろが、増殖度が不均一な場合（第３図に矢印Ｂで示す）
または増殖度が大きい場合（第３図に矢印Ｃで示す）に
は、隣り同士の複数個のコロニー２が重なり合うため、
本来複数個のコロニーが自動計測で１個と判断される。
たとえば、矢印Ｂで示される増殖の場合、自動計測では
コロニー数４となり、矢印Ｃで示される増殖の場合、自
動計測ではコロニー数２となる（いずれの場合も、正確
なコロニー数は６である）。このような誤りを解決する
ためには、 播種する細胞数（細胞密度）を低くする（たとえ
ば、１×10⁴cells/ml以下）方法、あるいは、 コロニーが重なり合うまでに測定を終了する方法、 などが考えられる。しかしながら、多くの初代癌細胞に
おいては細胞密度５×10⁴cells/ml以上の高密度培養で
ないとコロニーが観察されないので、上記の方法で
は、制癌剤の効果を正確に判定することが出来ない。ま
た、癌細胞の増殖度は個々の癌細胞によって異なるの
で、上記の方法では、コントロールとの差および異な
る制癌剤の効果の差が十分に得られないうちに測定して
しまい、これまた制癌剤の効果を正確に把握できなくな
る。

以上のように、癌細胞の増殖度を正確に測定できない
と、実際の制癌剤感受性試験において不都合が生じる。
たとえば、第４図にみるように、６個の単一の癌細胞１
をコラーゲンゲル５で培養したときに、矢印Ｄで示すよ
うに制癌剤で処理しなかった場合には、６つの大きなコ
ロニー２が形成されるが、これらのうちの３ずつが互い
に重なり合ったり接触したりしていると、自動計測では
コロニー数２と測定される。これに対して、矢印Ｅで示
すように制癌剤で処理した場合には、６つの小さなコロ
ニー２が形成されていて互いに離れていると、自動計測
によりコロニー数６と測定される。一般に、制癌剤の効
果（増殖抑制度）は、 の比率で算定され、制癌剤が有効であるならば、その比
率は100％よりも小さくなければならない。しかし、第
４図の例では、その比率が300％〔（6/2）×100％〕で
ある。

コロニー数により癌細胞の増殖度を測定する場合に、こ
のような不合理な結果をもたらすのは、コロニー同士の
接触および／または重なり合いである。

そこで、この発明では、コロニー体積を計測することに
より癌細胞の増殖度を測定することが好ましい。この場
合には、制癌剤の効果（増殖抑制度）は、 の比率で算定され、制癌剤が有効であるならば、その比
率は100％より小さい。第５図にもみるように、隣り合
うコロニー（たとえば、２つのコロニー）２および２が
互いに接していると、これらのコロニーの体積は（２つ
の）分離したコロニーの合計体積と同じである。言い換
えると、接触の場合には、複数のコロニーの合計体積に
ほとんどあるいは全く影響を与えないのである。また、
重なり合いの場合においても、重なり合っている部分
は、その体積が非常に小さいので、全体の体積にあまり
影響を与えないのである。従って、細胞増殖の正確な測
定は、コロニー体積によれば常に可能であるが、自動計
測によるコロニー数によってはいつもできるとは限らな
いのである。

以上に述べたように、癌細胞の増殖度を画像解析によっ
て測定するにあたり、コロニー数の計測によって細胞増
殖度を測定することができない場合でも、コロニーの推
定体積値を計測することにより増殖度が正確に測定でき
る。このことを次の実験によりDNA量の測定値との比較
によって確かめた。この実験では、前記実施例とは異な
り、線維芽細胞を含まないヒト癌細胞株を用いた。この
ため、ヒト癌細胞株の増殖度の測定がDNA量の測定によ
って正確に検証することができる。

（実験３） −癌細胞の培養− ヒト肺癌細胞株を用い、前記実施例１のコントロールと
同様にして、制癌剤処理せずに、コラーゲンゲル包埋培
養を行った。

−画像解析処理− コラーゲンゲル包埋培養された上記ヒト癌細胞株を、上
記と同様にして、撮影し画像解析装置に画像信号として
入力した。入力した原画像を前記と同様にして画像解析
処理し、癌細胞コロニーの画像だけを抽出した（ただ
し、この場合、線維芽細胞が含まれていないので、その
除去処理は必要ない）。次に、この画像の中から前記と
同様にコロニー数を計測し、同時にコロニー画像から推
定される立体の体積の積算値を算出した。推定体積値の
算出は次の手順により行った。

1. コロニーの投影像（projected image）である２値
画像（binary image）を元画像（original image）と
して定義する。

2. 別に濃淡を表現できる画面を蓄積画面（storageima
ge plane）として定義する。

3. 元画像を蓄積画面に濃度値１として複写する。

4. 元画像から投影像の輪郭線を構成する画素を取り除
く。

5. 輪郭線を構成する画素を取り除いた後の縮小した投
影像を新たに元画像として定義する。

6. 蓄積画面に元画像を複写し、濃度値１を加算する。

7. 投影像が消失するまで、4.〜6.の処理を繰り返す。
これにより、最初の投影像の輪郭線で囲まれた面を底面
とする山状の立体像（実像である必要はない）が得られ
る。

8. 蓄積画面の各画素に蓄積された濃度値と画素の一辺
の長さとの積を高さと定義する。

9. 蓄積画面の各画素の高さを積分する。これにより、
前記山状の立体像の体積が得られる。

10. コロニーの実体が、投影像について表裏対称であ
ると仮定し、前記積分した値を２倍したものをコロニー
の体積とする。このように仮定したのは、三次元培養で
は、横に広がった形態と同じ形が上下にも広がっていく
であろうと考えられるからである。

11. 必要に応じて、出力を行う。

以上の画像解析から得られた、コロニー数およびコロニ
ーの体積、ならびに、DNA量測定結果を第３表および第
６図にまとめた。

第３表および第６図に示す結果から、DNA値が示すよう
に、細胞は培養日数にしたがい増殖している。計測され
たコロニー数は培養５日目まではDNA量の変化とよく一
致しているが、培養５〜７日をピークとして、それ以
後、減少している。これは、細胞が増殖した結果、細胞
密度が高くなり、細胞が重なり合った状態になるため、
正確なコロニー数を計測していないと思われる。これに
対し、コロニー体積は、培養初期から長期培養にいたる
までのDNA値の変化とよく相関しており、体積測定法が
細胞の増殖度の測定、特に長期にわたる増殖度の測定に
適していることがわかる。

しかも、コロニー数の測定には、つぎのような問題もあ
る。すなわち、一般に癌細胞の増殖度は個々の細胞によ
って異なる（第３図、矢印Ｂで示されるものを参照）。
コロニー21、22、23はそれぞれ大きさが異なるので当然
含まれる細胞数も異なるが、コロニー数の計測では、コ
ロニー21、22および23はそれぞれ１個と判断される。こ
れに対して、コロニー体積では、コロニー21、22および
23は異なった体積として算出される。

（実施例２） 実施例１の「癌細胞の培養」において、ヌードマウス移
植系ヒト結腸癌の代わりにヌードマウス移植系ヒト肺癌
を用いたこと以外は、実施例１と同様にして癌細胞の培
養を行った。得られた試料について実施例１と同様にし
て画像解析処理し、コロニーの画像のみを抽出した。

得られた画像から、実施例１と同様にしてコロニー数を
計測し、上記実験３と同様にしてコロニーの体積の積算
値を計測した。

（比較例２） また、実施例２の結果を検証するために、実施例２で用
いたのと同じ細胞を用いて、上記比較例１と同様にして
ヌードマウス法による制癌剤感受性試験も同時に行っ
た。

それぞれの結果について、前記と同様にパーセント・オ
ブ・コントロールとして算出し、第７図にグラフで示し
た。

第７図に示す結果にみるように、ヌードマウス法の結果
Ｎと、コロニー体積計測法による結果Ｖとはいずれの制
癌剤に対しても極めてよい相関性が得られている。一
方、コロニー数計測法による結果Ｃは異常値を示してい
る。これは、ここで用いた細胞は増殖度が高く、特に制
癌剤処理しなかった場合（コントロール）に、上で説明
したように増殖した細胞が重なり合うために、コロニー
数の計測値が正確な増殖度を表していないが、コロニー
の体積測定値は、このような場合でも増殖度を正確に計
測していることを示している。

すなわち、増殖の活発な細胞や、培養時に細胞密度を高
くした場合には、増殖度の測定として、増殖後のコロニ
ーの体積の測定が有効な方法であることが実証された。

〔発明の効果〕

以上に述べた、この発明にかかる制癌剤感受性試験方法
によれば、癌細胞を培養する基質としてコラーゲンゲル
を用いていることによって、従来の軟寒天培地等では培
養出来なかった多くの癌細胞を培養することが可能にな
る。

画像解析で癌細胞の増殖度を測定することによって、癌
細胞をコラーゲンゲル基質で培養した場合に癌細胞とと
もに増殖する線維芽細胞等の影響を無くすことができ、
正確かつ迅速に試験結果を得ることができる。

癌細胞の増殖度を画像解析する場合、コロニーの体積を
計測すると、コロニー数の計測によるよりも、一層正確
に、かつ、長期にわたって増殖度を測定することができ
る。

以上の結果、従来の試験方法に比べて、癌細胞の種類に
対する適用範囲がはるかに広く、操作が簡単で迅速かつ
正確に試験結果を得ることのできる、制癌剤の開発に適
した感受性試験方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明にかかる実施例において各制癌剤の
感受性測定結果を示すグラフ、第２図は、比較例におい
て各制癌剤の感受性測定結果を示すグラフ、第３図は、
癌細胞の培養において増殖度の３つの例を示す説明図、
第４図は、癌細胞の培養において、制癌剤処理を行わな
かった場合（コントロール群）と行った場合との１例を
示す説明図、第５図は、第４図中のＸ−Ｘ断面図であ
り、癌細胞の培養においてコロニー同士が接触した場合
の１例を示す説明図、第６図は、コロニー数およびコロ
ニー体積とDNA量との相関を示すグラフ、第７図は、実
施例２および比較例２において各制癌剤の感受性測定結
果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−164159（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−226638（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−248183（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−50606（ＪＰ，Ａ) 実開 昭62−53792（ＪＰ，Ｕ) 実開 昭62−50608（ＪＰ，Ｕ) 日本耳鼻咽喉科学会会報，94（１）， Ｐ．16−21，1991 コラーゲン研究会抄録，35ｔｈ （1987）， Ｐ．61−65，1988 月刊組織培養，13（２）， Ｐ．64− 68，1987 Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，Ｎｏ. Ｓｕｐｐｌ ３， Ｐ．105−116，1984

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】基質の存在する環境下で癌細胞を増殖させ
   て、その増殖度を測定することにより、制癌剤の感受性
   を試験する方法において、基質としてコラーゲンゲルを
   用いるとともに癌細胞の増殖度を測定する手段として画
   像解析装置を用いることとし、かつ、撮像により得られ
   た試料の画像信号から癌細胞およびそのコロニーの画像
   信号を選択的に抽出して、この選択的に抽出された癌細
   胞およびそのコロニーの画像信号から癌細胞およびその
   コロニーの推定体積値を算出することにより癌細胞の増
   殖度を測定する制癌剤感受性試験方法。
2. 【請求項２】基質の存在する環境下で癌細胞を増殖させ
   て、その増殖度を測定することにより、制癌剤の感受性
   を試験する方法において、基質としてコラーゲンゲルを
   用いるとともに癌細胞の増殖度を測定する手段として画
   像解析装置を用いることとし、かつ、撮像により得られ
   た試料の画像信号から対象物の持つ濃度的特徴を論理的
   な演算によって強調しておいて得られた強調画像から濃
   度に関する一定の基準値にしたがって対象物の画像だけ
   を抽出すると言う手法により癌細胞およびそのコロニー
   の画像信号を選択的に抽出して、この選択的に抽出され
   た癌細胞およびそのコロニーの画像信号から癌細胞およ
   びそのコロニーの数を算出することにより癌細胞の増殖
   度を測定する制癌剤感受性試験方法。