JPH0728760B2 - Ｄｎａの塩基配列決定 - Google Patents
Ｄｎａの塩基配列決定Info
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- JPH0728760B2 JPH0728760B2 JP61502315A JP50231586A JPH0728760B2 JP H0728760 B2 JPH0728760 B2 JP H0728760B2 JP 61502315 A JP61502315 A JP 61502315A JP 50231586 A JP50231586 A JP 50231586A JP H0728760 B2 JPH0728760 B2 JP H0728760B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 比較的最近まで、DNAの塩基配列決定は時間のかかる退
屈な仕事であつた。そのDNA塩基配列決定を大いに単純
化する技術が報告され、例えばサンガー（Sanger,F.）
らのProc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463〜5467（1977）；
マクサム（Maxam,A.M.）＆ギルバート（Gilbert,W.）の
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,560〜564（1977）；および
マート（J.Maat）＆スミス（A.J.Smith）のNucleic Aci
d Res.５,4537〜4545（1978）に記載の方法などがあ
る。
屈な仕事であつた。そのDNA塩基配列決定を大いに単純
化する技術が報告され、例えばサンガー（Sanger,F.）
らのProc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463〜5467（1977）；
マクサム（Maxam,A.M.）＆ギルバート（Gilbert,W.）の
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,560〜564（1977）；および
マート（J.Maat）＆スミス（A.J.Smith）のNucleic Aci
d Res.５,4537〜4545（1978）に記載の方法などがあ
る。
サンガーらの上記文献に記載の方法は、プライマーとし
て直接近傍にアニールされた制限フラグメント鎖を用い
て、DNAポリメラーゼにより一本鎖標的配列の放射性相
補鎖のコピーを合成することを伴う。異なるジデオキシ
ヌクレオシド三リン酸（ddNTP）ターミネーターと、さ
らに４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）
（そのうちの１種以上はα位を32Pで標識される）を含
む４つの別個の反応混合物を使用して、伸長反応の放射
性標識生成物中へ上記のターミネーターを部分的に取り
込ませる。１つの反応において、すべてが共通の５′末
端をもつが、ヌクレオチド配列の全体を通して様々な位
置（その位置のヌクレオチドとターミネーターddNTPと
が類似する）で終わる３′末端をもつ異なる鎖長の標識
オリゴヌクレオチドが合成される。４つの別個の反応
（それぞれ４種類のddNTPチエインターミネーターのう
ちの１種を含む）の生成物を変性ポリアクリルアミドゲ
ルによる電気泳動にかけて平行分画化することにより、
異なる鎖長のオリゴヌクレオチドを分離する。これらは
それぞれの塩基の位置を順序正しく示し、それにより塩
基配列が決定される。
て直接近傍にアニールされた制限フラグメント鎖を用い
て、DNAポリメラーゼにより一本鎖標的配列の放射性相
補鎖のコピーを合成することを伴う。異なるジデオキシ
ヌクレオシド三リン酸（ddNTP）ターミネーターと、さ
らに４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）
（そのうちの１種以上はα位を32Pで標識される）を含
む４つの別個の反応混合物を使用して、伸長反応の放射
性標識生成物中へ上記のターミネーターを部分的に取り
込ませる。１つの反応において、すべてが共通の５′末
端をもつが、ヌクレオチド配列の全体を通して様々な位
置（その位置のヌクレオチドとターミネーターddNTPと
が類似する）で終わる３′末端をもつ異なる鎖長の標識
オリゴヌクレオチドが合成される。４つの別個の反応
（それぞれ４種類のddNTPチエインターミネーターのう
ちの１種を含む）の生成物を変性ポリアクリルアミドゲ
ルによる電気泳動にかけて平行分画化することにより、
異なる鎖長のオリゴヌクレオチドを分離する。これらは
それぞれの塩基の位置を順序正しく示し、それにより塩
基配列が決定される。
マートらの上記文献に記載の方法では、４つの別々の反
応において５′32P−標識フラグメントがDNAポリメラー
ゼＩおよび膵臓DNAase Iの存在下でインキユベートされ
る。それぞれの反応は４種類すべてのdNTPと、異なる１
種類のddNTPを順に含む。膵臓DNAase Iはニツクを導入
し、その３′ヒドロキシル基はDNAポリメラーゼＩのDNA
合成開始点として役立つ。その後鎖伸長反応があらゆる
ニツクの３′末端から進行し、そして各反応において塩
基特異的鎖伸長停止へと導かれる。反応生成物は変性ポ
リアクリルアミドゲル板上で分画化されて、共通の標識
５′末端をもつオリゴヌクレオチドが分離される。
応において５′32P−標識フラグメントがDNAポリメラー
ゼＩおよび膵臓DNAase Iの存在下でインキユベートされ
る。それぞれの反応は４種類すべてのdNTPと、異なる１
種類のddNTPを順に含む。膵臓DNAase Iはニツクを導入
し、その３′ヒドロキシル基はDNAポリメラーゼＩのDNA
合成開始点として役立つ。その後鎖伸長反応があらゆる
ニツクの３′末端から進行し、そして各反応において塩
基特異的鎖伸長停止へと導かれる。反応生成物は変性ポ
リアクリルアミドゲル板上で分画化されて、共通の標識
５′末端をもつオリゴヌクレオチドが分離される。
ニツキングおよびその後の鎖伸長反応は両鎖に対して起
こるが、一方のみが標識されるので、放射性バンドのパ
ターンはその鎖のみに現われ、それによりその塩基配列
を推定することが可能である。DNAase Iによるフラグメ
ントのニツキングはその長さに沿つたあらゆる残基で起
こるわけではないが、各反応混合物中にデオキシ−およ
びジデオキシ−NTPの両方が存在するという事実は、鎖
伸長がニツク部位から同一塩基の数個の残基にわたつて
連続することを確実にする、それ故にその塩基配列中の
あらゆる残基がバンドを生じさせる。
こるが、一方のみが標識されるので、放射性バンドのパ
ターンはその鎖のみに現われ、それによりその塩基配列
を推定することが可能である。DNAase Iによるフラグメ
ントのニツキングはその長さに沿つたあらゆる残基で起
こるわけではないが、各反応混合物中にデオキシ−およ
びジデオキシ−NTPの両方が存在するという事実は、鎖
伸長がニツク部位から同一塩基の数個の残基にわたつて
連続することを確実にする、それ故にその塩基配列中の
あらゆる残基がバンドを生じさせる。
サンガーらおよびマートらのターミネーターを用いる鎖
伸長反応の変法では、両方とも、ヌクレオチド配列を推
定するのに４つのレーンが必要となる。各レーンは４種
類のヌクレオチドのうちの１種類の位置を定め、その位
置は他の３つのレーンのそれぞれにおけるバンドと比較
して決定される。４つのレーンはすべて一度に比較され
ねばならず、また往々にして４つのレーンのパターンを
横切つて解読するときに精神的誤りをおかす。４レーン
パターンの解読はゲルが曲がつたり（このような事例が
しばしばおこる）、あるいは他のゲル人工産物が生ずる
場合に相当困難である。
伸長反応の変法では、両方とも、ヌクレオチド配列を推
定するのに４つのレーンが必要となる。各レーンは４種
類のヌクレオチドのうちの１種類の位置を定め、その位
置は他の３つのレーンのそれぞれにおけるバンドと比較
して決定される。４つのレーンはすべて一度に比較され
ねばならず、また往々にして４つのレーンのパターンを
横切つて解読するときに精神的誤りをおかす。４レーン
パターンの解読はゲルが曲がつたり（このような事例が
しばしばおこる）、あるいは他のゲル人工産物が生ずる
場合に相当困難である。
マクサムおよびギルバートの上記文献に記載の方法は、
ヌクレオチドの特定塩基に特異的な部位で一本鎖DNAを
切断する化学反応に基づいており、また異なる長さの切
断ヌクレオチド鎖がポリアクリルアミドゲル上を異なる
速度で泳動するという事実に基づいている。一本鎖DNA
配列はその一端を例えば放射性同位体で標識される。そ
の後、標識鎖の種々のアリコートを、平均してDNA鎖の
単一切断を１種またはそれ以上（例えば４種のうち２
種）の特定ヌクレオチド部位で生じさせる別々の反応混
合物に加える。次いで、断片化したDNA鎖のアリコート
をポリアクリルアミドゲルにのせて並列レーンで泳動さ
せる。“ｎ個”のヌクレオチド（ｎは一般に200より小
さい）の場合は、数個のレーンが一緒になつて原点から
ｎ個の隔たりでバンドを与える。しかしながら、マクサ
ムおよびギルバートの上記文献に記載されるように、各
レーンは１種またはそれ以上の特定切断部位に対応する
バンドのみを含む。原点からの各バンドの隔たりに対応
するヌクレオチドはゲルを横切つて、すなわち泳動方向
に対して直角の方向に、バンドパターンから推論され
る。
ヌクレオチドの特定塩基に特異的な部位で一本鎖DNAを
切断する化学反応に基づいており、また異なる長さの切
断ヌクレオチド鎖がポリアクリルアミドゲル上を異なる
速度で泳動するという事実に基づいている。一本鎖DNA
配列はその一端を例えば放射性同位体で標識される。そ
の後、標識鎖の種々のアリコートを、平均してDNA鎖の
単一切断を１種またはそれ以上（例えば４種のうち２
種）の特定ヌクレオチド部位で生じさせる別々の反応混
合物に加える。次いで、断片化したDNA鎖のアリコート
をポリアクリルアミドゲルにのせて並列レーンで泳動さ
せる。“ｎ個”のヌクレオチド（ｎは一般に200より小
さい）の場合は、数個のレーンが一緒になつて原点から
ｎ個の隔たりでバンドを与える。しかしながら、マクサ
ムおよびギルバートの上記文献に記載されるように、各
レーンは１種またはそれ以上の特定切断部位に対応する
バンドのみを含む。原点からの各バンドの隔たりに対応
するヌクレオチドはゲルを横切つて、すなわち泳動方向
に対して直角の方向に、バンドパターンから推論され
る。
マクサムおよびギルバートは、各レーンが１種または２
種の特定ヌクレオチド部位での断片化を表わす４レーン
系を提案した。マクサム−ギルバート法の１つの好適な
具体例では、４つのレーンが１）Ａ（アデニン）＋Ｇ
（グアニン）,2）G,3）Ｃ（シトシン）および４）Ｃ＋
Ｔ（チミン）を表わす。この系において、レーン１の単
一バンドはその切断部位にＡを結論づけ、レーン１およ
び２の並列バンドはその切断部位にＧを結論づけ、レー
ン４の単一バンドはその位置にＴを結論づけ、そしてレ
ーン３および４の並列バンドはその切断部位にＣを結論
づける。
種の特定ヌクレオチド部位での断片化を表わす４レーン
系を提案した。マクサム−ギルバート法の１つの好適な
具体例では、４つのレーンが１）Ａ（アデニン）＋Ｇ
（グアニン）,2）G,3）Ｃ（シトシン）および４）Ｃ＋
Ｔ（チミン）を表わす。この系において、レーン１の単
一バンドはその切断部位にＡを結論づけ、レーン１およ
び２の並列バンドはその切断部位にＧを結論づけ、レー
ン４の単一バンドはその位置にＴを結論づけ、そしてレ
ーン３および４の並列バンドはその切断部位にＣを結論
づける。
これらの結果は、ゲルが十分に鮮明であるという条件な
らば疑う余地がない。しかしながら、当業者ならよく知
つているように、ゲル分離能はしばしば希望する品質の
ものではない。鮮明度に伴う諸問題には圧縮、人工産
物、堆積およびゴーストバンドが含まれる。さらに、異
なるレーンのバンドは一般に希望するほどまつすぐに横
切つて整列せず、むしろ曲がつてしまうことがよくあ
る。このために、ゲルの解読は若干の経験を必要とし、
まだなお誤りをおかしやすい。
らば疑う余地がない。しかしながら、当業者ならよく知
つているように、ゲル分離能はしばしば希望する品質の
ものではない。鮮明度に伴う諸問題には圧縮、人工産
物、堆積およびゴーストバンドが含まれる。さらに、異
なるレーンのバンドは一般に希望するほどまつすぐに横
切つて整列せず、むしろ曲がつてしまうことがよくあ
る。このために、ゲルの解読は若干の経験を必要とし、
まだなお誤りをおかしやすい。
いくつかの技法が誤りをなくすために採用される。これ
らの技法の１つは重複である。マクサムおよびギルバー
トは彼等の４レーン系が塩基配列を推定するのに必要と
されるよりも多くの情報を含み、各レーンが単一ヌクレ
オチド切断を表わす３レーン系が塩基配列を推定するの
に十分な情報を提供するであろうと認めている。しかし
ながら、彼等はこのような重複が信頼できる結果を得る
ために必要であることを強く示唆している。それぞれが
単一部位での切断を示す３レーンの解読（または上記の
鎖伸長法においてはそれぞれが単一部位での鎖伸長停止
を示す３レーンの解読）は第４番目のヌクレオチドの位
置を推定するのに隔たりの判断を必要とし、このことは
バンド間の隔たりが末端ヌクレオチドに応じて変化する
という事実により複雑になつてくる。誤りを減らす別の
方法は、コード鎖とその相補鎖の両方の塩基配列を決定
することである。
らの技法の１つは重複である。マクサムおよびギルバー
トは彼等の４レーン系が塩基配列を推定するのに必要と
されるよりも多くの情報を含み、各レーンが単一ヌクレ
オチド切断を表わす３レーン系が塩基配列を推定するの
に十分な情報を提供するであろうと認めている。しかし
ながら、彼等はこのような重複が信頼できる結果を得る
ために必要であることを強く示唆している。それぞれが
単一部位での切断を示す３レーンの解読（または上記の
鎖伸長法においてはそれぞれが単一部位での鎖伸長停止
を示す３レーンの解読）は第４番目のヌクレオチドの位
置を推定するのに隔たりの判断を必要とし、このことは
バンド間の隔たりが末端ヌクレオチドに応じて変化する
という事実により複雑になつてくる。誤りを減らす別の
方法は、コード鎖とその相補鎖の両方の塩基配列を決定
することである。
上記方法は比較的よく進行してヌクレオチドの塩基配列
決定に要する時間をかなり減縮するが、より一層正確で
しかも迅速な塩基配列決定法が求められている。遺伝暗
号は４種のヌクレオチドの配列から成り、且つ電気泳動
ゲル系を横切る対応のバンドパターンは原理的にその判
読が簡単であるので、この方法はコンピユータやマイク
ロプロセツサーによる判読を含めた塩基配列の自動決定
に適している。マイクロプロセツサーによる解読は、時
間の節約に加えて、広範囲の塩基配列を解読するという
退屈な仕事の性質ゆえにしばしばおこる精神上の誤り、
すなわち各バンドを各レーンに誤つて割り当てることが
原因でおこる部類の技術者の精神的な誤りを減らすこと
が期待できる。
決定に要する時間をかなり減縮するが、より一層正確で
しかも迅速な塩基配列決定法が求められている。遺伝暗
号は４種のヌクレオチドの配列から成り、且つ電気泳動
ゲル系を横切る対応のバンドパターンは原理的にその判
読が簡単であるので、この方法はコンピユータやマイク
ロプロセツサーによる判読を含めた塩基配列の自動決定
に適している。マイクロプロセツサーによる解読は、時
間の節約に加えて、広範囲の塩基配列を解読するという
退屈な仕事の性質ゆえにしばしばおこる精神上の誤り、
すなわち各バンドを各レーンに誤つて割り当てることが
原因でおこる部類の技術者の精神的な誤りを減らすこと
が期待できる。
コンピユータを用いる方法は各バンドをそれぞれの適切
なレーンに割り当てることに関する誤りやその他のこの
ような精神上の誤りを実質的に排除しうるが、自動装置
は多くの場合に、どのバンドがゲルを横切つて実際に共
直線性であるのかを正しく判断する際に、技術者ほどに
有効でない。往々にしてバンドはかなり曲がるので、ど
のバンドが原点から等距離を泳動したと見なすべきか正
しく同定することは光学走査装置にとつて非常に難しい
ことである。この仕事は特定のゲルパターンの曲がりぐ
あいを認識することができ且つそれに応じて適宜にその
解読を調整し得る熟練技術者によつて比較的よく成し遂
げられる。
なレーンに割り当てることに関する誤りやその他のこの
ような精神上の誤りを実質的に排除しうるが、自動装置
は多くの場合に、どのバンドがゲルを横切つて実際に共
直線性であるのかを正しく判断する際に、技術者ほどに
有効でない。往々にしてバンドはかなり曲がるので、ど
のバンドが原点から等距離を泳動したと見なすべきか正
しく同定することは光学走査装置にとつて非常に難しい
ことである。この仕事は特定のゲルパターンの曲がりぐ
あいを認識することができ且つそれに応じて適宜にその
解読を調整し得る熟練技術者によつて比較的よく成し遂
げられる。
ロジヤー・スターデン（Rodger Staden）のNucleic Aci
ds Research,12,499〜503（1984）はコンピユータを使
用するDNA塩基配列解析法を開示している。この方法で
は、技術者が各レーンに沿つて彼の検出用ペンを動か
し、それを各バンドの位置に下ろしてそれをコンピユー
タに記録する。コンピユータはそのデータの記録を取つ
て、ヌクレオチドの塩基配列を解析する。このシステム
でさえ、特に不確実なコードが入力されるときには、相
当に不確実である。
ds Research,12,499〜503（1984）はコンピユータを使
用するDNA塩基配列解析法を開示している。この方法で
は、技術者が各レーンに沿つて彼の検出用ペンを動か
し、それを各バンドの位置に下ろしてそれをコンピユー
タに記録する。コンピユータはそのデータの記録を取つ
て、ヌクレオチドの塩基配列を解析する。このシステム
でさえ、特に不確実なコードが入力されるときには、相
当に不確実である。
ゲルの曲がりが原因で起こりうる誤りを減らすDNAの塩
基配列決定法を開発することが望まれるだろう。これは
マイクロプロセツサーのようなコンピユータ手段を用い
る光学走査装置による完全自動塩基配列決定を可能にす
るだろう。
基配列決定法を開発することが望まれるだろう。これは
マイクロプロセツサーのようなコンピユータ手段を用い
る光学走査装置による完全自動塩基配列決定を可能にす
るだろう。
発明の要約 ゲルパターンを横切つて解読する際の誤り（例えばゲル
が曲がることによりおこる）を実質的に排除する改良さ
れたDNAの塩基配列決定法が提供される。これは光学走
査手段とそれに関連したコンピユータ手段を含む自動装
置を用いることにより、ゲルを簡単に解読せしめる。本
発明方法は数種の反応混合物（DNA鎖全体に分布する特
定ヌクレオチドで鎖伸長の停止をおこすような手法で鎖
伸長反応中にそのDNA鎖を停止させる反応混合物、また
はDNA鎖全体に分布する１種またはそれ以上の特定ヌク
レオチドでの切断をおこすような手法でそのDNA鎖を選
択的に切断する反応混合物）を使用するいくつかの上記
方法の改良法である。これらの方法の各々において、上
述したように、一連の反応混合物はヌクレオチド鎖の伸
長および停止または切断のために配合され、そしてその
反応混合物はゲル塗布用混合物を形成するために適当に
組み合わされる。塗布用混合物は鎖長に応じて鎖フラグ
メントを分離するゲル上で並列に泳動され、４種のヌク
レオチドのそれぞれに対して別個のバンドパターンが、
そのヌクレオチドが存在する鎖中のそれぞれの位置に関
連するゲル上の位置に現われる。上記の塩基配列決定法
では、それぞれのゲル塗布用混合物は１種または２種の
ヌクレオチドに特異的であつて、疑う余地のない確読や
必要とされる重複のために４つのレーンを必要とした
が、本発明の改良点はあらゆる長さのヌクレオチド鎖フ
ラグメントを含む第１混合物（そのゲル塗布用第１混合
物は中央レーンとして泳動する）、第１および第２ヌク
レオチドの位置で終わるヌクレオチド鎖フラグメントを
含むゲル塗布用第２混合物（その第２混合物は２つの隣
接レーンの一方として泳動する）、および第１および第
３ヌクレオチドの位置で終わるヌクレオチド鎖フラグメ
ントを含むゲル塗布用第３混合物（その第３混合物は隣
接レーンの他方として泳動する）を提供する。ゲルパタ
ーンの疑う余地のない解読は、直接隣接するレーンのみ
を比較することによつて可能である。
が曲がることによりおこる）を実質的に排除する改良さ
れたDNAの塩基配列決定法が提供される。これは光学走
査手段とそれに関連したコンピユータ手段を含む自動装
置を用いることにより、ゲルを簡単に解読せしめる。本
発明方法は数種の反応混合物（DNA鎖全体に分布する特
定ヌクレオチドで鎖伸長の停止をおこすような手法で鎖
伸長反応中にそのDNA鎖を停止させる反応混合物、また
はDNA鎖全体に分布する１種またはそれ以上の特定ヌク
レオチドでの切断をおこすような手法でそのDNA鎖を選
択的に切断する反応混合物）を使用するいくつかの上記
方法の改良法である。これらの方法の各々において、上
述したように、一連の反応混合物はヌクレオチド鎖の伸
長および停止または切断のために配合され、そしてその
反応混合物はゲル塗布用混合物を形成するために適当に
組み合わされる。塗布用混合物は鎖長に応じて鎖フラグ
メントを分離するゲル上で並列に泳動され、４種のヌク
レオチドのそれぞれに対して別個のバンドパターンが、
そのヌクレオチドが存在する鎖中のそれぞれの位置に関
連するゲル上の位置に現われる。上記の塩基配列決定法
では、それぞれのゲル塗布用混合物は１種または２種の
ヌクレオチドに特異的であつて、疑う余地のない確読や
必要とされる重複のために４つのレーンを必要とした
が、本発明の改良点はあらゆる長さのヌクレオチド鎖フ
ラグメントを含む第１混合物（そのゲル塗布用第１混合
物は中央レーンとして泳動する）、第１および第２ヌク
レオチドの位置で終わるヌクレオチド鎖フラグメントを
含むゲル塗布用第２混合物（その第２混合物は２つの隣
接レーンの一方として泳動する）、および第１および第
３ヌクレオチドの位置で終わるヌクレオチド鎖フラグメ
ントを含むゲル塗布用第３混合物（その第３混合物は隣
接レーンの他方として泳動する）を提供する。ゲルパタ
ーンの疑う余地のない解読は、直接隣接するレーンのみ
を比較することによつて可能である。
好適な実施態様の詳細な説明 本発明によれば、ゲルの３つのレーンで泳動したときに
中央レーンと各隣接レーンとを直接比較することによつ
て、４種のヌクレオチドのそれぞれの位置の正確な解読
が可能になるバンドパターンを示す３つのヌクレオチド
鎖フラグメント混合物を用いることによつて、ヌクレオ
チド配列が決定される。第１混合物は一端から測定して
それぞれの鎖長に対応する（すなわち４種のヌクレオチ
ド部位のそれぞれの各位置で終わる）ランダムに生成さ
れた鎖フラグメントを含む。第２混合物は第１または第
２ヌクレオチド部位のそれぞれの各位置で特異的に終わ
るランダムに生成された鎖フラグメントを含む。第３混
合物は第１または第３ヌクレオチド部位の各位置で特異
的に終わるランダムに生成された鎖フラグメントを含
む。鎖フラグメントの３つの混合物はヌクレオチド鎖フ
ラグメントをそれらの大きさ（長さ）に応じて分離する
ポリアクリルアミドゲルのような電気泳動用ゲルの並列
レーン（第１ヌクレオチド鎖混合物は中央レーンに置か
れ、第２および第３ヌクレオチド鎖混合物は左側レーン
と右側レーンに置かれる）で泳動される。
中央レーンと各隣接レーンとを直接比較することによつ
て、４種のヌクレオチドのそれぞれの位置の正確な解読
が可能になるバンドパターンを示す３つのヌクレオチド
鎖フラグメント混合物を用いることによつて、ヌクレオ
チド配列が決定される。第１混合物は一端から測定して
それぞれの鎖長に対応する（すなわち４種のヌクレオチ
ド部位のそれぞれの各位置で終わる）ランダムに生成さ
れた鎖フラグメントを含む。第２混合物は第１または第
２ヌクレオチド部位のそれぞれの各位置で特異的に終わ
るランダムに生成された鎖フラグメントを含む。第３混
合物は第１または第３ヌクレオチド部位の各位置で特異
的に終わるランダムに生成された鎖フラグメントを含
む。鎖フラグメントの３つの混合物はヌクレオチド鎖フ
ラグメントをそれらの大きさ（長さ）に応じて分離する
ポリアクリルアミドゲルのような電気泳動用ゲルの並列
レーン（第１ヌクレオチド鎖混合物は中央レーンに置か
れ、第２および第３ヌクレオチド鎖混合物は左側レーン
と右側レーンに置かれる）で泳動される。
ｎ個の連続したヌクレオチド鎖では、中央レーンがｎ個
のすべての位置（原点からの隔たり）にバンドを示す。
隣接レーンは特定のヌクレオチド停止部位に対応する位
置にのみバンドを示す。鎖中の４種のヌクレオチドのそ
れぞれの位置は、特異なバンドパターンをレーンを横切
つて（すなわちバンド泳動の方向に対して直角の方向
に）解読することにより同定される。第１ヌクレオチド
は３つの隣接レーンのそれぞれに現われるバンドによつ
て認識される。第２ヌクレオチドは左側レーンと中央レ
ーンだけに現われるバンドによつて認識される。第３ヌ
クレオチドは中央レーンと右側レーンだけに現われるバ
ンドによつて認識される。（左側レーンと右側レーンは
相互に交換可能であり、ここでは説明を簡略化する目的
でのみ使用されることをもちろん理解すべきである。）
第４のヌクレオチドは中央レーンだけに現われるバンド
によつて認識される。
のすべての位置（原点からの隔たり）にバンドを示す。
隣接レーンは特定のヌクレオチド停止部位に対応する位
置にのみバンドを示す。鎖中の４種のヌクレオチドのそ
れぞれの位置は、特異なバンドパターンをレーンを横切
つて（すなわちバンド泳動の方向に対して直角の方向
に）解読することにより同定される。第１ヌクレオチド
は３つの隣接レーンのそれぞれに現われるバンドによつ
て認識される。第２ヌクレオチドは左側レーンと中央レ
ーンだけに現われるバンドによつて認識される。第３ヌ
クレオチドは中央レーンと右側レーンだけに現われるバ
ンドによつて認識される。（左側レーンと右側レーンは
相互に交換可能であり、ここでは説明を簡略化する目的
でのみ使用されることをもちろん理解すべきである。）
第４のヌクレオチドは中央レーンだけに現われるバンド
によつて認識される。
ゲルの好適な解読方法は、最初に中央レーンと比較して
左側レーンを読み取り、次に中央レーンと比較して右側
レーンを読み取り、その後そのデータをアセンブルして
３つのバンドパターンを識別することである。すなわ
ち、中央レーンによつて定められるヌクレオチド鎖のは
しご状の各位置で、他の２つのレーンのそれぞれの読み
取りを＋または−に分類する。データをアセンブルする
際に、＋，＋は第１ヌクレオチドとして解釈され；＋，
−は第２ヌクレオチドとして解釈され；−，＋は第３ヌ
クレオチドとして解釈され；そして−，−は第４ヌクレ
オチドとして解釈される。
左側レーンを読み取り、次に中央レーンと比較して右側
レーンを読み取り、その後そのデータをアセンブルして
３つのバンドパターンを識別することである。すなわ
ち、中央レーンによつて定められるヌクレオチド鎖のは
しご状の各位置で、他の２つのレーンのそれぞれの読み
取りを＋または−に分類する。データをアセンブルする
際に、＋，＋は第１ヌクレオチドとして解釈され；＋，
−は第２ヌクレオチドとして解釈され；−，＋は第３ヌ
クレオチドとして解釈され；そして−，−は第４ヌクレ
オチドとして解釈される。
ゲルの手動解読のために、このシステムは少なくとも２
つの利点を提供する。まず第一に、ゲルの解読者は彼が
読み取つてそのデータを表にするまで評価するのを待つ
て、彼の観察を単に記録するだけでよい。たとえバンド
パターン系が４つであつてその解読が単純であるとして
も、恐らくは多数のバンドパターンを読み取ることの退
屈さゆえに、しばしば誤りをおかすことが分かつてい
る。この性質の誤りは、読み取りながら判読する必要が
ないときに実質的に減少する。第二に、読み取りが非常
に簡単であつて、技術者は完全にバンド列の段が付けら
れた中央レーンのバンドに隣接するレーンにバンドが存
在するかどうかを調べるだけでよい。数個のレーン（そ
のうちのいくつかはブランクであるだろう）を横切つて
記録する必要がなく、また数個のバンドが確かに横方向
に一直線に並んでいると判断する必要もない。このこと
はバンドパターンに相当の曲がりが生じたときに特に重
要である。
つの利点を提供する。まず第一に、ゲルの解読者は彼が
読み取つてそのデータを表にするまで評価するのを待つ
て、彼の観察を単に記録するだけでよい。たとえバンド
パターン系が４つであつてその解読が単純であるとして
も、恐らくは多数のバンドパターンを読み取ることの退
屈さゆえに、しばしば誤りをおかすことが分かつてい
る。この性質の誤りは、読み取りながら判読する必要が
ないときに実質的に減少する。第二に、読み取りが非常
に簡単であつて、技術者は完全にバンド列の段が付けら
れた中央レーンのバンドに隣接するレーンにバンドが存
在するかどうかを調べるだけでよい。数個のレーン（そ
のうちのいくつかはブランクであるだろう）を横切つて
記録する必要がなく、また数個のバンドが確かに横方向
に一直線に並んでいると判断する必要もない。このこと
はバンドパターンに相当の曲がりが生じたときに特に重
要である。
塩基配列の自動決定法にとつて、このシステムの主な利
点はバンドが曲がる影響を実質的に無視できるというこ
とである。たとえ相当の曲がりが生じたとしても、隣接
バンドの末端同士は実質的に整列されるはずであり、光
学走査装置によつて整列していると容易に認識されるは
ずである。この走査装置はそれぞれの次の段について中
央レーンを走査し、次にバンドの有無について隣接レー
ンを走査し、そしてバンドの有無を＋または−として記
録するだけでよい。この方法を繰り返して他の隣接バン
ドを中央バンドと比較し、そしてその結果を＋または−
として記録する。このシステムの場合は左側レーンと右
側レーンを直接比較する必要がなく、従つて、たとえゲ
ルの曲がりが左側レーンと右側レーンとを一直線に整列
させなくとも、走査装置は隣接ゲルの末端の位置だけを
比較するように調整できるのでゲルを読み違えることは
ないだろう。
点はバンドが曲がる影響を実質的に無視できるというこ
とである。たとえ相当の曲がりが生じたとしても、隣接
バンドの末端同士は実質的に整列されるはずであり、光
学走査装置によつて整列していると容易に認識されるは
ずである。この走査装置はそれぞれの次の段について中
央レーンを走査し、次にバンドの有無について隣接レー
ンを走査し、そしてバンドの有無を＋または−として記
録するだけでよい。この方法を繰り返して他の隣接バン
ドを中央バンドと比較し、そしてその結果を＋または−
として記録する。このシステムの場合は左側レーンと右
側レーンを直接比較する必要がなく、従つて、たとえゲ
ルの曲がりが左側レーンと右側レーンとを一直線に整列
させなくとも、走査装置は隣接ゲルの末端の位置だけを
比較するように調整できるのでゲルを読み違えることは
ないだろう。
提案された３レーン系はヌクレオチド鎖の塩基配列を決
定する唯一の３レーン系ではないことに気がつくかも知
れない。先に述べたように、マクサムおよびギルバート
は３レーン（各レーンは４種のヌクレオチド部位の第
１、第２または第３の切断部位を含む）が必要な情報を
捐供するであろうと認めた。同様に、３組の２種の停止
部位または３組の３種の停止部位はそれぞれ各ヌクレオ
チド部位についてゲルを横切る特異なバンドパターンを
与えるだろう。しかしながら、本発明の主題である独特
のバンドパターンは唯一無比のバンドパターンであつ
て、３レーンのうちの１つ（すなわち中央レーン）は隣
接レーンのバンドの有無が直接対比されるはしご状のそ
れぞれの段を含む。
定する唯一の３レーン系ではないことに気がつくかも知
れない。先に述べたように、マクサムおよびギルバート
は３レーン（各レーンは４種のヌクレオチド部位の第
１、第２または第３の切断部位を含む）が必要な情報を
捐供するであろうと認めた。同様に、３組の２種の停止
部位または３組の３種の停止部位はそれぞれ各ヌクレオ
チド部位についてゲルを横切る特異なバンドパターンを
与えるだろう。しかしながら、本発明の主題である独特
のバンドパターンは唯一無比のバンドパターンであつ
て、３レーンのうちの１つ（すなわち中央レーン）は隣
接レーンのバンドの有無が直接対比されるはしご状のそ
れぞれの段を含む。
また、このシステムはどのヌクレオチドを第１、第２、
第３および第４ヌクレオチドと考えるかにかかわりなく
塩基配列の決定を与える。それ故に、鎖伸長法では３バ
ンドパターンを与えるゲル塗布用ヌクレオチド鎖混合物
をどのように組合せてもよい。
第３および第４ヌクレオチドと考えるかにかかわりなく
塩基配列の決定を与える。それ故に、鎖伸長法では３バ
ンドパターンを与えるゲル塗布用ヌクレオチド鎖混合物
をどのように組合せてもよい。
本発明の好適な面によれば、電気泳動ゲル上を並列レー
ンで泳動する３つのヌクレオチド鎖混合物は、別々の反
応（各反応は異なる特定のヌクレオチド位置で終わる鎖
フラグメントを生成する）から得られる４つのヌクレオ
チド鎖試料のアリコートを適切に混合することによつて
用意される。中央レーンとして泳動される混合物は４つ
の試料（各試料は異なるヌクレオチド位置で終止したヌ
クレオチド鎖を含む）の各々のアリコートを混合するこ
とにより得られる。隣接レーンとして泳動される混合物
は選択された第１試料と第２試料からのアリコートを混
合するか、または選択された第１試料と第３試料からの
アリコートを混合することにより得られる。
ンで泳動する３つのヌクレオチド鎖混合物は、別々の反
応（各反応は異なる特定のヌクレオチド位置で終わる鎖
フラグメントを生成する）から得られる４つのヌクレオ
チド鎖試料のアリコートを適切に混合することによつて
用意される。中央レーンとして泳動される混合物は４つ
の試料（各試料は異なるヌクレオチド位置で終止したヌ
クレオチド鎖を含む）の各々のアリコートを混合するこ
とにより得られる。隣接レーンとして泳動される混合物
は選択された第１試料と第２試料からのアリコートを混
合するか、または選択された第１試料と第３試料からの
アリコートを混合することにより得られる。
４つの別個の反応試料（それぞれは異なる特定のヌクレ
オチド位置を表わす）を混合してゲル塗布用混合物を調
製することの重要な利点は、それぞれのゲル塗布用混合
物に反応試料の類似したアリコートを加える（そしてそ
の混合物を適当に希釈して等しい容量となす）ことによ
つて、それぞれの隣接レーンのバンドの強さが中央レー
ンのバンドの強さと実質的に同じになるということであ
る。しばしばヌクレオチド鎖の電気泳動ゲルはゲルを見
分けずらい状態にして誤読の原因となり得る“ゴース
ト”バンドによつて悩まされる。真のバンドの強さが３
つのレーンのどの位置においても実質的に同じになるよ
うに各試料のアリコートを混合することによつて、ゴー
ストバンドは考慮すべき対象から一般に排除される。例
えば、ゴーストバンドが真のバンドの強さの約20％以下
であると仮定すると、走査装置は中央レーンのバンドの
強さの80％以上の強さをもつ隣接レーンバンドを受け入
れ、中央レーンの対応バンドの強さの20％以下の強さを
もつ隣接レーンバンドを無視し、そして中央レーンの対
応バンドの強さの20％〜80％の範囲にある強さをもつバ
ンドの決定をどれも保留するようにプログラミングされ
る。
オチド位置を表わす）を混合してゲル塗布用混合物を調
製することの重要な利点は、それぞれのゲル塗布用混合
物に反応試料の類似したアリコートを加える（そしてそ
の混合物を適当に希釈して等しい容量となす）ことによ
つて、それぞれの隣接レーンのバンドの強さが中央レー
ンのバンドの強さと実質的に同じになるということであ
る。しばしばヌクレオチド鎖の電気泳動ゲルはゲルを見
分けずらい状態にして誤読の原因となり得る“ゴース
ト”バンドによつて悩まされる。真のバンドの強さが３
つのレーンのどの位置においても実質的に同じになるよ
うに各試料のアリコートを混合することによつて、ゴー
ストバンドは考慮すべき対象から一般に排除される。例
えば、ゴーストバンドが真のバンドの強さの約20％以下
であると仮定すると、走査装置は中央レーンのバンドの
強さの80％以上の強さをもつ隣接レーンバンドを受け入
れ、中央レーンの対応バンドの強さの20％以下の強さを
もつ隣接レーンバンドを無視し、そして中央レーンの対
応バンドの強さの20％〜80％の範囲にある強さをもつバ
ンドの決定をどれも保留するようにプログラミングされ
る。
特定のヌクレオチド位置で終わるヌクレオチド鎖を含む
４つの別々の試料の混合物を用意することが望ましいの
で、鎖切断法または鎖断片化法よりも鎖伸長停止法の方
が好適である。今日の方法による鎖切断法に対する実際
上の制限は、４つのそれぞれのヌクレオチド位置で効率
よくしかも選択的に切断するための反応混合物の全必要
量が存在しないということである。むしろ、現在知られ
ている切断塩基配列決定法は、４種のヌクレオチド位置
のあるヌクレオチドでまたは４種のヌクレオチド位置の
ある１対のヌクレオチドで選択的に切断する反応の組合
せに基づいている。さらに、１対のヌクレオチド位置で
切断するそれらの反応は一般にその対の各ヌクレオチド
の位置で等しく切断しない。それにもかかわらず、既知
の反応試料を適切に混合することによつて、鎖切断法は
３レーンパターンで泳動するように適切させることがで
き、完全に段差のついた中央レーンと隣接レーンとを直
接比較するという利点を与える。４つの位置のそれぞれ
で選択的に切断する反応方法が開発されるとき、等しい
バンド強度の利点が４つの別々の切断反応からのアリコ
ートの混合物を使用することによつて３バンドパターン
ゲルに与えられるであろう。
４つの別々の試料の混合物を用意することが望ましいの
で、鎖切断法または鎖断片化法よりも鎖伸長停止法の方
が好適である。今日の方法による鎖切断法に対する実際
上の制限は、４つのそれぞれのヌクレオチド位置で効率
よくしかも選択的に切断するための反応混合物の全必要
量が存在しないということである。むしろ、現在知られ
ている切断塩基配列決定法は、４種のヌクレオチド位置
のあるヌクレオチドでまたは４種のヌクレオチド位置の
ある１対のヌクレオチドで選択的に切断する反応の組合
せに基づいている。さらに、１対のヌクレオチド位置で
切断するそれらの反応は一般にその対の各ヌクレオチド
の位置で等しく切断しない。それにもかかわらず、既知
の反応試料を適切に混合することによつて、鎖切断法は
３レーンパターンで泳動するように適切させることがで
き、完全に段差のついた中央レーンと隣接レーンとを直
接比較するという利点を与える。４つの位置のそれぞれ
で選択的に切断する反応方法が開発されるとき、等しい
バンド強度の利点が４つの別々の切断反応からのアリコ
ートの混合物を使用することによつて３バンドパターン
ゲルに与えられるであろう。
本発明の改良点は一般に特定のヌクレオチドで終わる鎖
フラグメントの生成に基づくDNA塩基配列決定法に応用
される。本発明の改良点は主として上記のサンガーら、
マートとスミスおよびマクサムとギルバートの方法に改
良点に関してここで説明される。しかしながら、その改
良点は対応する３バンドパターンが生ずる他の技術また
は上記方法の変法にも応用できると理解されるべきであ
る。
フラグメントの生成に基づくDNA塩基配列決定法に応用
される。本発明の改良点は主として上記のサンガーら、
マートとスミスおよびマクサムとギルバートの方法に改
良点に関してここで説明される。しかしながら、その改
良点は対応する３バンドパターンが生ずる他の技術また
は上記方法の変法にも応用できると理解されるべきであ
る。
本発明の１つの実施態様は、プライマーとして直接近傍
にアニールされた制限フラグメント鎖を用いて、DNAポ
リメラーゼにより一本鎖標的配列の放射性相補コピーを
合成することを伴う。４つの別個の反応混合物はそれぞ
れ４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）（その
うちの少なくとも１種はα位が32Pまたは35Sで標識され
ている）を含有し、そして各混合物はポリメラーゼの基
質として役立つがその後の鎖伸長を停止させる４種類の
対応するddNTPまたは他のヌクレオチド類似体のうちの
１種をさらに含有する。これらの反応混合物はそれぞ
れ、全てが共通の５′末端をもつが、特定のヌクレオチ
ド（それとddNTPとが対応する）が存在するそれぞれの
位置で終わる３′末端をもつオリゴヌクレオチドの混合
物を生成する。電気泳動用の混合物は適当な反応試料の
等しいアリコートを混合することによつて調製される。
中央レーンの混合物は４つの反応試料のそれぞれからの
等しいアリコートを混合することにより、ゲル塗布用に
調製される。隣接レーンの混合物は選択された第１およ
び第２反応試料、ならびに選択された第１および第３反
応試料の等しいアリコートを希釈剤の２倍アリコートと
混合して中央レーンの混合物の容量と等しくすることに
より調製される。これらの３つのヌクレオチド鎖混合物
のそれぞれの等しいアリコートはゲル電気泳動上で並列
に泳動され、本発明の３バンドパターンが見られる。
にアニールされた制限フラグメント鎖を用いて、DNAポ
リメラーゼにより一本鎖標的配列の放射性相補コピーを
合成することを伴う。４つの別個の反応混合物はそれぞ
れ４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）（その
うちの少なくとも１種はα位が32Pまたは35Sで標識され
ている）を含有し、そして各混合物はポリメラーゼの基
質として役立つがその後の鎖伸長を停止させる４種類の
対応するddNTPまたは他のヌクレオチド類似体のうちの
１種をさらに含有する。これらの反応混合物はそれぞ
れ、全てが共通の５′末端をもつが、特定のヌクレオチ
ド（それとddNTPとが対応する）が存在するそれぞれの
位置で終わる３′末端をもつオリゴヌクレオチドの混合
物を生成する。電気泳動用の混合物は適当な反応試料の
等しいアリコートを混合することによつて調製される。
中央レーンの混合物は４つの反応試料のそれぞれからの
等しいアリコートを混合することにより、ゲル塗布用に
調製される。隣接レーンの混合物は選択された第１およ
び第２反応試料、ならびに選択された第１および第３反
応試料の等しいアリコートを希釈剤の２倍アリコートと
混合して中央レーンの混合物の容量と等しくすることに
より調製される。これらの３つのヌクレオチド鎖混合物
のそれぞれの等しいアリコートはゲル電気泳動上で並列
に泳動され、本発明の３バンドパターンが見られる。
本発明の別の実施態様では、４つの別個の反応において
５′32P−標識二本鎖DNAフラグメントがDNAポリメラー
ゼＩおよび膵臓DNAase Iの存在下でインキユベートされ
る。各反応混合物は４種類すべてのdNTPと４種類の対応
するddNTPのうち１種（または他の鎖伸長停止用ヌクレ
オチド類似体）とを含有する。
５′32P−標識二本鎖DNAフラグメントがDNAポリメラー
ゼＩおよび膵臓DNAase Iの存在下でインキユベートされ
る。各反応混合物は４種類すべてのdNTPと４種類の対応
するddNTPのうち１種（または他の鎖伸長停止用ヌクレ
オチド類似体）とを含有する。
膵臓DNAase Iはニツクを導入し、その３′ヒドロキシル
基はDNAポリメラーゼＩの開始点として役立つ。その
後、鎖伸長反応があらゆるニツクの３′末端から進行
し、そしてそれぞれの反応において塩基特異的鎖伸長停
止へと導かれる。この反応の生成物は３レーンの変性ポ
リアクリルアミドゲル板上で分画化され、共通の標識
５′末端をもつオリゴヌクレオチドを分離する。
基はDNAポリメラーゼＩの開始点として役立つ。その
後、鎖伸長反応があらゆるニツクの３′末端から進行
し、そしてそれぞれの反応において塩基特異的鎖伸長停
止へと導かれる。この反応の生成物は３レーンの変性ポ
リアクリルアミドゲル板上で分画化され、共通の標識
５′末端をもつオリゴヌクレオチドを分離する。
ニツキングおよびその後の鎖伸長は両鎖において起こる
が、一方だけが標識されるのでその鎖のみに放射性バン
ドパターンが現われ、それによりその塩基配列を推定す
ることが可能である。DNAase Iによるフラグメントのニ
ツキングはその長さに沿つてあらゆる残基で起こるわけ
ではないが、デオキシ−およびジデオキシ−NTPの両方
がそれぞれの反応に存在するという事実は、鎖伸長がニ
ツクの部位から同一塩基の数個の残基にわたつて連続す
るということを確実にする。それ故にその配列のあらゆ
る残基はバンドを生じさせる。上記のように混合された
４つの反応試料のアリコートを用いることにより、本発
明の３バンドパターンがゲル電気泳動上で見られる。
が、一方だけが標識されるのでその鎖のみに放射性バン
ドパターンが現われ、それによりその塩基配列を推定す
ることが可能である。DNAase Iによるフラグメントのニ
ツキングはその長さに沿つてあらゆる残基で起こるわけ
ではないが、デオキシ−およびジデオキシ−NTPの両方
がそれぞれの反応に存在するという事実は、鎖伸長がニ
ツクの部位から同一塩基の数個の残基にわたつて連続す
るということを確実にする。それ故にその配列のあらゆ
る残基はバンドを生じさせる。上記のように混合された
４つの反応試料のアリコートを用いることにより、本発
明の３バンドパターンがゲル電気泳動上で見られる。
上記の鎖伸長法のそれぞれにおいて、３レーン用のフラ
グメント混合物は別法で調製されるということが理解さ
れる。例えばどちらの場合にも、３つの反応混合物（１
つは４種類すべてのddNTPを含み、他の２つは第１およ
び第２のddNTP、ならびに第１および第３のddNTPを含
む）は直接ゲル上で電気泳動される。この方法の変法は
反応混合物の数を減らすが、レーンからレーンに均一の
バンド強度が得られないので好ましくない。
グメント混合物は別法で調製されるということが理解さ
れる。例えばどちらの場合にも、３つの反応混合物（１
つは４種類すべてのddNTPを含み、他の２つは第１およ
び第２のddNTP、ならびに第１および第３のddNTPを含
む）は直接ゲル上で電気泳動される。この方法の変法は
反応混合物の数を減らすが、レーンからレーンに均一の
バンド強度が得られないので好ましくない。
本発明の別の実施態様では、フラグメントが鎖伸長法で
はなく鎖切断法によつて作られる。この塩基配列決定法
は次の通りである。二本鎖DNAは一般にそれより長いDNA
鎖を制限酵素で切断することにより得られる。塩基配列
決定のために、その鎖は約500ヌクレオチドまたはそれ
以下の長さに切断されるべきである。次に、切断鎖はそ
の３′末端または５′未満を、一般には32Pを含むリン
酸基のような放射性標識で標識する。これは二重標識さ
れた二本鎖DNAをもたらす。この時点で、この分子は変
性され、そしてその後の塩基配列決定のためにヘイワー
ド（Hayward,G.S.）,Virology,49,342〜344（1972）に
記載の方法に従つてゲル上で分離される。この技術は２
本の相補的な標識一本鎖をもたらすので、両方の塩基配
列を決定して他方の塩基配列決定について確かめること
ができる。
はなく鎖切断法によつて作られる。この塩基配列決定法
は次の通りである。二本鎖DNAは一般にそれより長いDNA
鎖を制限酵素で切断することにより得られる。塩基配列
決定のために、その鎖は約500ヌクレオチドまたはそれ
以下の長さに切断されるべきである。次に、切断鎖はそ
の３′末端または５′未満を、一般には32Pを含むリン
酸基のような放射性標識で標識する。これは二重標識さ
れた二本鎖DNAをもたらす。この時点で、この分子は変
性され、そしてその後の塩基配列決定のためにヘイワー
ド（Hayward,G.S.）,Virology,49,342〜344（1972）に
記載の方法に従つてゲル上で分離される。この技術は２
本の相補的な標識一本鎖をもたらすので、両方の塩基配
列を決定して他方の塩基配列決定について確かめること
ができる。
また、その鎖を単一部位で切断する制限酵素によりさら
に切断して異なる大きさのフラグメントを生成させ、こ
の２つのフラグメントをポリアクリルアミドゲル上で分
離し、それぞれのフラグメントをその後の塩基配列決定
のために変性する。この手法は非標識相補鎖部分のフラ
グメントが検出されないので、変性された一本鎖の分離
を必要としない。
に切断して異なる大きさのフラグメントを生成させ、こ
の２つのフラグメントをポリアクリルアミドゲル上で分
離し、それぞれのフラグメントをその後の塩基配列決定
のために変性する。この手法は非標識相補鎖部分のフラ
グメントが検出されないので、変性された一本鎖の分離
を必要としない。
その後、標識された一本鎖DNAは断片化反応のためのア
リコートに分けられる。断片化反応の条件は、その鎖が
平均して、それぞれの反応混合物が特異的に反応する塩
基を含むヌクレオチド位置で１回ランダムに断片化され
るように調製される。いくつかの好適な反応はマクサム
とギルバートの上記文献に記載されている。
リコートに分けられる。断片化反応の条件は、その鎖が
平均して、それぞれの反応混合物が特異的に反応する塩
基を含むヌクレオチド位置で１回ランダムに断片化され
るように調製される。いくつかの好適な反応はマクサム
とギルバートの上記文献に記載されている。
グアニンおよびアデニン位置はこれらのプリンをジメチ
ル硫酸でメチル化し、次いで加熱することによつて特異
的に切断される。ＡおよびＧ位置での相対的な切断の程
度は反応混合物の酸性度のような反応条件に関係し、反
応条件はＡおよびＧ位置の切断を一般に等しくするよう
に適切に調整される。ジエトキシピロカルボネートを用
いるＡおよびＧの別の切断法はクレイエフ（Krayev,A.
S.）,FEBS Letters 130,19〜22に記載されている。
ル硫酸でメチル化し、次いで加熱することによつて特異
的に切断される。ＡおよびＧ位置での相対的な切断の程
度は反応混合物の酸性度のような反応条件に関係し、反
応条件はＡおよびＧ位置の切断を一般に等しくするよう
に適切に調整される。ジエトキシピロカルボネートを用
いるＡおよびＧの別の切断法はクレイエフ（Krayev,A.
S.）,FEBS Letters 130,19〜22に記載されている。
ＣおよびＴの特異的切断はヒドラジンとの反応によつて
その塩基を切断し、その後ピペリジンでそのDNA鎖を切
断することにより行われる。
その塩基を切断し、その後ピペリジンでそのDNA鎖を切
断することにより行われる。
ＡおよびＣ位置に特異的な切断はこれらの塩基を強アル
カリで破壊し、次にピペリジンでそのDNA鎖を切断する
ことにより行われる。
カリで破壊し、次にピペリジンでそのDNA鎖を切断する
ことにより行われる。
ゲル混合物を調製するために、異なる塩基対、例えば
Ｉ）Ａ＋G,II）Ａ＋C,およびIII）Ｃ＋Ｔを切断する３
つの反応混合物が使用される。鎖切断の後、混合物Ｉお
よびIIIの切断生成物の一部を一緒に混合して完全に段
差がついた中央レーンとして泳動させ、一方ＩおよびII
Iの切断生成物は左側および右側レーンとして泳動させ
る。この方法は現在利用可能な、よく解明された反応手
法の修飾を何ら必要としない。
Ｉ）Ａ＋G,II）Ａ＋C,およびIII）Ｃ＋Ｔを切断する３
つの反応混合物が使用される。鎖切断の後、混合物Ｉお
よびIIIの切断生成物の一部を一緒に混合して完全に段
差がついた中央レーンとして泳動させ、一方ＩおよびII
Iの切断生成物は左側および右側レーンとして泳動させ
る。この方法は現在利用可能な、よく解明された反応手
法の修飾を何ら必要としない。
ヌクレオチド鎖フラグメントが上記方法のいずれかによ
つて生成された後、適切に混合された反応試料を電気泳
動ゲルの別々のウエル（凹部）（中央ウエルはすべての
断片化段階を表わすヌクレオチド鎖フラグメントを含
む）に適用し、そして慣用方法でゲル泳動させる。続い
て、そのゲルはバンドの線状整列を維持しやすい方法で
凍結または乾燥させる。もしも標識が慣例通りに放射性
標識である場合に、そのバンドはオートラジオグラフイ
ーによつて視覚化される。末端ヌクレオチドが他の手段
で標識される場合には、バンドはそれにふさわしい手法
で視覚化されるだろう。
つて生成された後、適切に混合された反応試料を電気泳
動ゲルの別々のウエル（凹部）（中央ウエルはすべての
断片化段階を表わすヌクレオチド鎖フラグメントを含
む）に適用し、そして慣用方法でゲル泳動させる。続い
て、そのゲルはバンドの線状整列を維持しやすい方法で
凍結または乾燥させる。もしも標識が慣例通りに放射性
標識である場合に、そのバンドはオートラジオグラフイ
ーによつて視覚化される。末端ヌクレオチドが他の手段
で標識される場合には、バンドはそれにふさわしい手法
で視覚化されるだろう。
上記の塩基配列決定法のすべては、決定され得るヌクレ
オチド鎖の部分に関して制限を有する。それぞれの方法
は１つの共通の末端をもつが、鎖伸長停止または鎖切断
の位置に応じて、その共通末端からいろいろな隔たりで
終わる標識鎖フラグメントを利用する。一般に、塩基配
列は共通の末端からすぐに出発して解読されず、むしろ
それに近接したヌクレオチドから出発して解読される
（第１の解読可能なヌクレオチドは議論のために“１番
目”のヌクレオチドであると見なされるだろう）。そこ
からｎ番目までのヌクレオチド（ｎは１番目のヌクレオ
チドから数える）がゲル上に現われて読み取り可能であ
る。使用される技術に応じてｎは最大約500である。長
いヌクレオチド鎖の塩基配列はいくつかの個々の塩基配
列決定実験の複合体として決定されねばならない。
オチド鎖の部分に関して制限を有する。それぞれの方法
は１つの共通の末端をもつが、鎖伸長停止または鎖切断
の位置に応じて、その共通末端からいろいろな隔たりで
終わる標識鎖フラグメントを利用する。一般に、塩基配
列は共通の末端からすぐに出発して解読されず、むしろ
それに近接したヌクレオチドから出発して解読される
（第１の解読可能なヌクレオチドは議論のために“１番
目”のヌクレオチドであると見なされるだろう）。そこ
からｎ番目までのヌクレオチド（ｎは１番目のヌクレオ
チドから数える）がゲル上に現われて読み取り可能であ
る。使用される技術に応じてｎは最大約500である。長
いヌクレオチド鎖の塩基配列はいくつかの個々の塩基配
列決定実験の複合体として決定されねばならない。
本発明は３レーンバンドパターンとして説明されるが、
かなりの鎖長のヌクレオチドの塩基配列決定は一般に１
群３レーンの電気泳動ゲルを多数使用することにより達
成される。一般的にゲル上のバンドの間隔は変化し、最
初に泳動する比較的短いフラグメントはその間隔が遠く
に離れており、そして最後に泳動する長いフラグメント
はその間隔がともに接近している。より均一な間隔でも
つてゲルのすべての部分をはつきりと読み取るために、
３つの混合物は時間をずらして各群のレールのゲルに塗
布される。初めに塗布された組の３レーンは今やその間
隔が十分遠くに離れた長いフラグメントの塩基配列を読
み取るのに有用であり、一方後から塗布された組の３レ
ーンは速やかに離れて泳動する短いフラグメントの塩基
配列を読み取るために使用される。
かなりの鎖長のヌクレオチドの塩基配列決定は一般に１
群３レーンの電気泳動ゲルを多数使用することにより達
成される。一般的にゲル上のバンドの間隔は変化し、最
初に泳動する比較的短いフラグメントはその間隔が遠く
に離れており、そして最後に泳動する長いフラグメント
はその間隔がともに接近している。より均一な間隔でも
つてゲルのすべての部分をはつきりと読み取るために、
３つの混合物は時間をずらして各群のレールのゲルに塗
布される。初めに塗布された組の３レーンは今やその間
隔が十分遠くに離れた長いフラグメントの塩基配列を読
み取るのに有用であり、一方後から塗布された組の３レ
ーンは速やかに離れて泳動する短いフラグメントの塩基
配列を読み取るために使用される。
内部チエツクを講じる手段として、本発明はまた５レー
ンバンドパターン（それによつて２つの独立した３レー
ンバンドパターンの評価がなされる）の使用を包含す
る。５レーンバンドパターンでは、２番目と４番目のレ
ーンが完全に段差をつけられる。残りの３つのレーンは
それぞれ異なる対のヌクレオチド位置での鎖伸長停止を
示す。例えばレーン１はＡとＧでの鎖伸長停止を示し、
レーン３はＡとＣでの鎖伸長停止を示し、そしてレーン
５はＣとＴでの停止を示す。電気泳動および視覚化の
後、ヌクレオチド配列は初めにレーン１および３をレー
ン２と比較することによつて解読され、次に独立してレ
ーン３および５をレーン４と比較することによつて解読
される。
ンバンドパターン（それによつて２つの独立した３レー
ンバンドパターンの評価がなされる）の使用を包含す
る。５レーンバンドパターンでは、２番目と４番目のレ
ーンが完全に段差をつけられる。残りの３つのレーンは
それぞれ異なる対のヌクレオチド位置での鎖伸長停止を
示す。例えばレーン１はＡとＧでの鎖伸長停止を示し、
レーン３はＡとＣでの鎖伸長停止を示し、そしてレーン
５はＣとＴでの停止を示す。電気泳動および視覚化の
後、ヌクレオチド配列は初めにレーン１および３をレー
ン２と比較することによつて解読され、次に独立してレ
ーン３および５をレーン４と比較することによつて解読
される。
このバンドパターンは先に述べたように手動で解読さ
れ、しかもバンドパターンは誤りを減らすように解読や
判読が単純化されている。しかしながら、このシステム
の主な利点は自動コンピユータを備えた走査装置を使つ
てオートラジオグラフを解読するときに生じる。走査装
置はバンドの中央を調べて中央レーンのそれぞれの連続
する段状バンドを検出するようにプログラミングされ
る。その装置がバンドを検出した後、それはバンドのヘ
リ、すなわち左側のヘリを走査し、次に同じ方向で所定
の横方向距離へ走査し始める。それは隣接レーンにバン
ドが検出されるかどうかを認識し、その後コンピユータ
によつて指示されたように、中央レーンバンドの中心に
戻り、そして次の中央レーンバンドについて検索し始め
る。この方法によつて中央レーンの片側に沿つたレーン
のバンドの有無が検出され、記録される。片側の読み取
りを完了した後、この方法は反対側すなわち右側に対し
て繰り返される。両方の隣接レーンからのデータを解読
および記録した後、関連コンピユータ装置がデータを判
読し、そしてヌクレオチド配列を送り出す。
れ、しかもバンドパターンは誤りを減らすように解読や
判読が単純化されている。しかしながら、このシステム
の主な利点は自動コンピユータを備えた走査装置を使つ
てオートラジオグラフを解読するときに生じる。走査装
置はバンドの中央を調べて中央レーンのそれぞれの連続
する段状バンドを検出するようにプログラミングされ
る。その装置がバンドを検出した後、それはバンドのヘ
リ、すなわち左側のヘリを走査し、次に同じ方向で所定
の横方向距離へ走査し始める。それは隣接レーンにバン
ドが検出されるかどうかを認識し、その後コンピユータ
によつて指示されたように、中央レーンバンドの中心に
戻り、そして次の中央レーンバンドについて検索し始め
る。この方法によつて中央レーンの片側に沿つたレーン
のバンドの有無が検出され、記録される。片側の読み取
りを完了した後、この方法は反対側すなわち右側に対し
て繰り返される。両方の隣接レーンからのデータを解読
および記録した後、関連コンピユータ装置がデータを判
読し、そしてヌクレオチド配列を送り出す。
ゲル解読用のコンピユータを備えた走査装置は、明らか
な人工産物を排除するのに十分な技術の複雑化を備えて
いるべきである。例えば、バンド間のレーンの間隔は一
般にバツクグラウンド（例えばレーン間の、レーンに沿
つた横方向領域）よりも暗いであろう。このようなレー
ンのわずかなぼけは、レーンの暗さに応じてバンドの有
無を決定し得る走査コンピユータ装置により排除される
べきである。また、それはいろいろなバツクグラウンド
の暗さに調整可能であるべきである。例えば、もしもそ
れがいずれか一方の隣接レーンの実質的に全部の位置で
“バンド”を検出したならば、暗いバツクグラウンドを
適当に調整してそのレーンを再度解読すべきである。
な人工産物を排除するのに十分な技術の複雑化を備えて
いるべきである。例えば、バンド間のレーンの間隔は一
般にバツクグラウンド（例えばレーン間の、レーンに沿
つた横方向領域）よりも暗いであろう。このようなレー
ンのわずかなぼけは、レーンの暗さに応じてバンドの有
無を決定し得る走査コンピユータ装置により排除される
べきである。また、それはいろいろなバツクグラウンド
の暗さに調整可能であるべきである。例えば、もしもそ
れがいずれか一方の隣接レーンの実質的に全部の位置で
“バンド”を検出したならば、暗いバツクグラウンドを
適当に調整してそのレーンを再度解読すべきである。
本発明は今や特定の実施例によりさらに詳しく説明され
るであろう。
るであろう。
実 施 例 本発明方法を試験するために、塩基配列がすでに知られ
ている一本鎖DNAフアージM13mp19の塩基配列を決定し
た。一本鎖DNAは共通のプライマー（バイオラブズ社,m1
3プライマー17mer）にアニールされ、そしてそのプライ
マーはジデオキシヌクレオシド三リン酸の存在に関して
のみ異なる４つの別々の条件下でDNAポリメラーゼＩの
クレノウ断片により伸長させた。それぞれの場合におい
て、dATPはα35S誘導体として使用された。塩基特異的
反応混合物の組成は下記の表Ｉに示す。
ている一本鎖DNAフアージM13mp19の塩基配列を決定し
た。一本鎖DNAは共通のプライマー（バイオラブズ社,m1
3プライマー17mer）にアニールされ、そしてそのプライ
マーはジデオキシヌクレオシド三リン酸の存在に関して
のみ異なる４つの別々の条件下でDNAポリメラーゼＩの
クレノウ断片により伸長させた。それぞれの場合におい
て、dATPはα35S誘導体として使用された。塩基特異的
反応混合物の組成は下記の表Ｉに示す。
各混合物はまた7mMトリス・HCl（pH＝7.5）、7mM MgC
l2、50mM NaCl、6mMジチオテントールを含んでいた。
l2、50mM NaCl、6mMジチオテントールを含んでいた。
37℃で15分間インキユベーシヨン後、100μＭずつのdA,
dG,dC,dTを含むチエース溶液１μを加え、インキユベ
ーシヨンを室温でさらに15分間続けた。この反応は10％
XCFFを含む脱イオン化ホルムアミド５μを加えること
により停止した。
dG,dC,dTを含むチエース溶液１μを加え、インキユベ
ーシヨンを室温でさらに15分間続けた。この反応は10％
XCFFを含む脱イオン化ホルムアミド５μを加えること
により停止した。
各混合物からのアリコートは表IIに示すように５つの並
列ウエルに装填するために調製された。
列ウエルに装填するために調製された。
この混合物は100℃で２分間熱変性し、電気泳動用の６
％アクリルアミドゲルにそれぞれ１μずつ塗布した。
％アクリルアミドゲルにそれぞれ１μずつ塗布した。
ゲルは0.3mmワツトマン3mmクロマトグラフイーペーパー
によつて分離された30cmおよび50cmのガラス板の間でゲ
ル化した。装填用ウエルは幅が5mmであり、シヤークト
ウース・コーム（Sharktooth comb）によつて形成され
た。アクリルアミドゲル溶液は６％アクリルアミド（ア
クリルアミド：ビスアクリルアミド19:1）および460g/
の尿素を含んでいた。アクリルアミドゲル混合物は0.
5×および2.5×TBE（10×TBEは１当たり108gトリス、
55gホウ酸および9.3gEDTAである）を用いて作つた。2.5
×ゲル混合物はまた10％シヨ糖および50mg/のブロモ
フエノールブルーを含んでいた。ゲル混合物はガス抜き
をしなかつた。
によつて分離された30cmおよび50cmのガラス板の間でゲ
ル化した。装填用ウエルは幅が5mmであり、シヤークト
ウース・コーム（Sharktooth comb）によつて形成され
た。アクリルアミドゲル溶液は６％アクリルアミド（ア
クリルアミド：ビスアクリルアミド19:1）および460g/
の尿素を含んでいた。アクリルアミドゲル混合物は0.
5×および2.5×TBE（10×TBEは１当たり108gトリス、
55gホウ酸および9.3gEDTAである）を用いて作つた。2.5
×ゲル混合物はまた10％シヨ糖および50mg/のブロモ
フエノールブルーを含んでいた。ゲル混合物はガス抜き
をしなかつた。
アクリルアミドの重合はゲル混合物1ml当たり25％過硫
酸アンモニウム１μおよびN,N,N′,N′−テトラメチ
ルエチレンジアミン１μを加えることにより開始され
た。重合剤の添加の直後に勾配ゲルを流し込んだ。電極
タンクの緩衝液は0.5×TBEであつた。ゲルは色素の前面
が30cm泳動するまで1500Vで泳動した。ガラス板の分離
後、ゲルを３の５％メタノールおよび５％酢酸（容量
／容量）中で15分間固定した。その後ゲルをワットマン
3mmクロマトグラフイーペーパーに移し、サランラツプ
で被覆し、頂部10cmを切り取つた。ゲルはゲル乾燥器に
て80℃で25分間乾かし、サランラツプを除き、増感スク
リーンを使わずに室温で一晩オートラジオグラフイーを
とつた。
酸アンモニウム１μおよびN,N,N′,N′−テトラメチ
ルエチレンジアミン１μを加えることにより開始され
た。重合剤の添加の直後に勾配ゲルを流し込んだ。電極
タンクの緩衝液は0.5×TBEであつた。ゲルは色素の前面
が30cm泳動するまで1500Vで泳動した。ガラス板の分離
後、ゲルを３の５％メタノールおよび５％酢酸（容量
／容量）中で15分間固定した。その後ゲルをワットマン
3mmクロマトグラフイーペーパーに移し、サランラツプ
で被覆し、頂部10cmを切り取つた。ゲルはゲル乾燥器に
て80℃で25分間乾かし、サランラツプを除き、増感スク
リーンを使わずに室温で一晩オートラジオグラフイーを
とつた。
その後ゲルは次の方法で解読した。それぞれのはしご状
のバンドの位置で、レーン1,3および５のバンドの強さ
を初めにレーン２および４のバンドの強さと比較した。
レーン1,3または５のどれかに現われたバンドはいつ
も、レーン２および４のバンドとほぼ同じ強さをもつて
いた。
のバンドの位置で、レーン1,3および５のバンドの強さ
を初めにレーン２および４のバンドの強さと比較した。
レーン1,3または５のどれかに現われたバンドはいつ
も、レーン２および４のバンドとほぼ同じ強さをもつて
いた。
次にバンド１〜３のパターンを比較することによつて塩
基配列を解読し、ヌクレオチド位置の解釈を表III Aに
従つて行つた。
基配列を解読し、ヌクレオチド位置の解釈を表III Aに
従つて行つた。
その後バンド３〜５のパターンからその塩基配列を再解
読し、ヌクレオチド位置の独立した解釈を表III Bに従
つて行つた。
読し、ヌクレオチド位置の独立した解釈を表III Bに従
つて行つた。
この方法を続けて行うことにより、DNAのヌクレオチド
配列は初めにバンド１〜３から、次にバンド３〜５から
得られた。それぞれの組のバンドから得られた塩基配列
は互いに完全に一致し、また発表された塩基配列とも一
致した。解読は簡単であつて、しかも疑う余地がなかつ
た。
配列は初めにバンド１〜３から、次にバンド３〜５から
得られた。それぞれの組のバンドから得られた塩基配列
は互いに完全に一致し、また発表された塩基配列とも一
致した。解読は簡単であつて、しかも疑う余地がなかつ
た。
本発明はある特定の好ましい実施態様について説明して
きたが、当分野で通常の知識を有する者にとつて明らか
な修飾が本発明の範囲を逸脱することなくなし得るであ
ろう。例えば、本発明はDNAヌクレオチド配列の解読に
関して説明され例示されたが、ここに記載の３バンドパ
ターンはRNAの塩基配列決定にも同様に応用できる。ダ
レツシオ（J.M.D′Alessio），核酸のゲル電気泳動（Ge
l Electrophoresis of Nucleic Acids），リツクウツド
（R.Rickwood）＆ホームズ（B.D.Hames）編集,IRLプレ
ス，オツクスフオード（1982）,p.173〜197に記載され
るような方法によるRNAの塩基配列決定の明らかな修飾
は、完全に段（バンド列）を付けられた中央レーン、第
１および第２ヌクレオチド停止を含む左側レーン、なら
びに第１および第３ヌクレオチド停止を含む右側レーン
を生じさせる。
きたが、当分野で通常の知識を有する者にとつて明らか
な修飾が本発明の範囲を逸脱することなくなし得るであ
ろう。例えば、本発明はDNAヌクレオチド配列の解読に
関して説明され例示されたが、ここに記載の３バンドパ
ターンはRNAの塩基配列決定にも同様に応用できる。ダ
レツシオ（J.M.D′Alessio），核酸のゲル電気泳動（Ge
l Electrophoresis of Nucleic Acids），リツクウツド
（R.Rickwood）＆ホームズ（B.D.Hames）編集,IRLプレ
ス，オツクスフオード（1982）,p.173〜197に記載され
るような方法によるRNAの塩基配列決定の明らかな修飾
は、完全に段（バンド列）を付けられた中央レーン、第
１および第２ヌクレオチド停止を含む左側レーン、なら
びに第１および第３ヌクレオチド停止を含む右側レーン
を生じさせる。
中央レーンとして電気泳動ゲルを泳動する鎖フラグメン
ト混合物は試験しようとする塩基配列のフラグメントを
含む。しかしながら、完全に段を付けられた中央レーン
は適当の長さのヌクレオチド鎖の鎖フラグメントである
か、またはいろいろな長さの合成ポリヌクレオチド鎖の
混合物でさえもあり得るだろう。従つて、中央レーンは
予め製造された（例えば商業的に）標準鎖フラグメント
混合物であり得る。
ト混合物は試験しようとする塩基配列のフラグメントを
含む。しかしながら、完全に段を付けられた中央レーン
は適当の長さのヌクレオチド鎖の鎖フラグメントである
か、またはいろいろな長さの合成ポリヌクレオチド鎖の
混合物でさえもあり得るだろう。従つて、中央レーンは
予め製造された（例えば商業的に）標準鎖フラグメント
混合物であり得る。
本発明の様々な特徴は次の請求の範囲において説明され
る。
る。
Claims (9)
- 【請求項１】１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレ
オチドまでのヌクレオチド鎖の一部の塩基配列決定法で
あつて、 標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第１混合物を調製
し、ここで該標識鎖はそれぞれ上記の１番目のヌクレオ
チドに近接した共通の末端から伸長して、上記の１番目
のヌクレオチドから上記のｎ番目のヌクレオチドまでの
範囲にある１つのヌクレオチド位置まで伸長しており、
そして上記の第１混合物は１番目のヌクレオチドで終わ
るものからｎ番目のヌクレオチドで終わるものまでのあ
らゆる鎖長の標識フラグメントを含み； 標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第２混合物を調製
し、ここで該標識鎖フラグメントは上記の共通末端から
伸長して、４種のヌクレオチドのうち第１のものが存在
するところおよび４種のヌクレオチドのうち第２のもの
が存在するところの１番目のヌクレオチドからｎ番目の
ヌクレオチドまでのそれぞれの位置で終わり； 標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第３混合物を調製
し、ここで該標識鎖フラグメントは上記の共通末端から
伸長して、上記の第１ヌクレオチドが存在するところお
よび４種のヌクレオチドのうち第３のものが存在すると
ころの１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチド
までのそれぞれの位置で終わり； 上記のフラグメント混合物をそれらの鎖長に応じてフラ
グメントを分離するゲル上で電気泳動にかけ、その際上
記フラグメントをゲルに塗布して並列レーンで泳動さ
せ； 上記ゲル上の標識ヌクレオチドフラグメントのバンドを
視覚化し；そして レーンに対して直角の方向でバンドパターンに従つてヌ
クレオチド配列を解読する； ことから成る塩基配列決定法。 - 【請求項２】上記のヌクレオチド鎖フラグメントは、鋳
型として使用される一本鎖ヌクレオチドを得；該一本鎖
鋳型ヌクレオチドを二本鎖プライマーにアニールし；そ
してポリメラーゼ、４種のヌクレオチド、および４種の
ヌクレオチドの１種に対応して上記ポリメラーゼの基質
として作用するが取り込まれた位置で鎖伸長を停止させ
る選択された類似体を含む混合物により上記鋳型ヌクレ
オチドの相補的コピーを作製する；ことによつて複数の
反応で作られる、請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】上記混合物はそれぞれ視覚化のために標識
された少なくとも１種のヌクレオチドを含む、請求の範
囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】上記のヌクレオチド鎖フラグメントは、二
本鎖ヌクレオチドを得；該二本鎖ヌクレオチドの一方の
５′末端を標識し；そして該標識ヌクレオチド鎖を複数
の反応混合物中でニツクトランスレーシヨンに付す；こ
とによつて作り、それぞれの反応混合物がニツクトラン
スレーシヨン用酵素、４種のヌクレオチド、および４種
のヌクレオチドの１種に対応して上記ポリメラーゼの基
質として作用するが取り込まれた位置で鎖伸長を停止さ
せる選択された類似体を含有する、請求の範囲第１項記
載の方法。 - 【請求項５】鎖フラグメントの上記混合物は、一本鎖ヌ
クレオチドを一端で標識し、そして複数の反応混合物中
で該標識値のアリコートを４種のヌクレオチドのうち特
定のヌクレオチドで各鎖あたり平均して１回断片化する
条件下に該標識鎖を断片化することによつて得られる、
請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】上記の第１混合物は中央レーンとして泳動
させる、請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】４種のヌクレオチドの相異なる１種の位置
で終わる標識ヌクレオチド鎖フラグメントを含む４つの
試料を作り、その４つの試料のアリコートから上記の第
１、第２および第３混合物を調製する、請求の範囲第１
項記載の方法。 - 【請求項８】１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレ
オチドまでのヌクレオチド鎖の塩基配列決定システムで
あつて、 標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第１混合物を調製す
る手段であつて、各標識鎖が１番目のヌクレオチドに近
接した共通の末端から伸長して、１番目のヌクレオチド
からｎ番目のヌクレオチドまでの範囲の１つのヌクレオ
チド位置まで伸長しており、そして上記の第１混合物が
１番目のヌクレオチドで終わるものからｎ番目のヌクレ
オチドで終わるものまでのあらゆる鎖長の標識フラグメ
ントを含む上記の手段； 標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第２混合物を調製す
る手段であつて、該標識鎖フラグメントが上記の共通末
端から伸長して、４種のヌクレオチドのうち第１のもの
が存在するところおよび４種のヌクレオチドのうち第２
のものが存在するところの１番目のヌクレオチドからｎ
番目のヌクレオチドまでのそれぞれの位置で終わる上記
の手段； 標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第３混合物を調製す
る手段であつて、該標識鎖フラグメントが上記の共通末
端から伸長して、上記の第１ヌクレオチドが存在すると
ころおよび４種のヌクレオチドのうち第３のものが存在
するところの１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレ
オチドまでのそれぞれの位置で終わる上記の手段； 上記のヌクレオチド鎖フラグメントをそれらの鎖長に応
じてレーンごとに分離するゲル電気泳動手段； 上記の鎖フラグメントの３つの混合物を３つの並列レー
ンで上記のゲル電気泳動手段に塗布するアプリケーター
手段； 標識フラグメントの存在により上記レーンのそれぞれの
バンドを視覚化するリポーター手段； 上記レーンのそれぞれにおいて視覚化されたバンドの位
置を検出する光学走査手段；および 走査されたバンドパターンに従つてヌクレオチド鎖配列
を判読するコンピユータ手段； から成る塩基配列決定システム。 - 【請求項９】上記の走査手段はプログラミング可能な関
連手段を有し、それにより走査手段は初めに第１混合物
を含むレーンの各バンドの位置で第２混合物を含むレー
ンのバンドの有無を検出して、この情報を上記のコンピ
ユータ手段に送り、次いで走査手段は第１混合物を含む
レーンの各バンドの位置で第３混合物を含むレーンのバ
ンドの有無を検出して、この情報を上記のコンピユータ
手段に送り、上記のコンピユータ手段はその情報を相互
に関連づけてヌクレオチド配列を判読すべくプログラミ
ングされる、請求の範囲第８項記載のシステム。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/718,724 US4865968A (en) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | DNA sequencing |
| PCT/US1986/000653 WO1986005817A1 (en) | 1985-04-01 | 1986-03-31 | Dna sequencing |
| US718724 | 1991-06-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62502423A JPS62502423A (ja) | 1987-09-17 |
| JPH0728760B2 true JPH0728760B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=24887238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61502315A Expired - Lifetime JPH0728760B2 (ja) | 1985-04-01 | 1986-03-31 | Ｄｎａの塩基配列決定 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4865968A (ja) |
| EP (1) | EP0216905A4 (ja) |
| JP (1) | JPH0728760B2 (ja) |
| CA (1) | CA1288069C (ja) |
| WO (1) | WO1986005817A1 (ja) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0199327B1 (en) * | 1985-04-19 | 1992-03-04 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Signal processing method for determining base sequence of nucleic acids |
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| US5525464A (en) * | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
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