JPH07298885A - ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼのゲノムＤＮＡおよびその使用法 - Google Patents

ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼのゲノムＤＮＡおよびその使用法

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JPH07298885A
JPH07298885A JP6274529A JP27452994A JPH07298885A JP H07298885 A JPH07298885 A JP H07298885A JP 6274529 A JP6274529 A JP 6274529A JP 27452994 A JP27452994 A JP 27452994A JP H07298885 A JPH07298885 A JP H07298885A
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cholesterol
cyp7
hydroxylase
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John Young Ling Chiang
ジョン、ヤング、リン、チアン
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Northeast Ohio Medical University
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 コレステロール７α−ヒドロキシラーゼのゲ
ノムＤＮＡおよびミニ遺伝子並びにトランスジェニック
動物の提供。 【構成】 ミニ遺伝子を用いて、機能的に活性なコレス
テロール７α−ヒドロキシラーゼを産生し、病態モデル
として機能するトランスジェニック動物を作成する。コ
レステロール７α−ヒドロキシラーゼプロモーター領域
およびレポーター遺伝子構築物を導入することによりプ
ロモーター／レポーター遺伝子を発現するトランスジェ
ニック動物が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】血清コレステロールが高くなると、心臓
発作、アテローム性動脈硬化症および循環器障害の危険
性が高くなるのが普通である。また、胆石、アテローム
性動脈硬化症、高脂質血症およびある種の脂質貯蔵疾患
等の様々な疾患がコレステロール異化作用の異常によっ
て引き起こされる。
【０００２】体内でのコレステロール代謝の主要経路
は、コレステロールおよび胆汁酸の消化管への分泌によ
るものである。胆汁は遊離のコレステロールと胆汁酸を
含んでいる。コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
（ＣＹＰ７）という酵素は、コレステロールを胆汁酸の
合成に付し、肝臓での胆汁酸合成の最初の律速段階を触
媒する。従って、胆汁酸合成の亢進により、この酵素は
肝臓の貯蔵コレステロールを消費し、ＬＤＬの取り込み
を増加させ、血清コレステロール濃度を低下させるとい
う肝臓中で重要な役割を果たす。
【０００３】胆汁酸は脂溶性ビタミン、ステロールおよ
び生体異物の可溶化に重要な生理学的薬剤である。胆汁
酸は専ら肝臓で合成されて腸管へ分泌され、そこで修飾
されて、二次的胆汁酸となる。ほとんどの胆汁酸は回腸
で再吸収され、門脈を通って肝細胞へと再循環する。胆
汁が肝臓中へフィードバックされることによりコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼが阻害され、従って胆汁
酸合成の全般的速度が阻害されることが知られている。
それ故、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼは、肝
臓における胆汁酸合成の制御機構を解明するための重要
な研究課題となってきた。胆汁隔離剤（Sequestrant
）、コレスチラミンまたは胆汁フィステルによって引
き起こされるような胆汁酸の再吸収が中断されると、肝
臓における胆汁酸合成の速度およびコレステロール７α
−ヒドロキシラーゼ活性が大きくなることが知られてい
る。肝臓におけるコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼ活性は、主として胆汁酸、コレステロール、ホルモ
ン、日周リズムおよび他の因子によって遺伝子転写レベ
ルで調節される。
【０００４】一般的には、真核細胞の遺伝子は、転写開
始部位の上流に位置するプロモーター配列、このプロモ
ーターの上流に位置するエンハンサーまたはリプレッサ
ー配列、エキソンまたはコード配列の間に位置する非コ
ード配列であるイントロン配列内、およびコード領域の
下流に位置する３′配列等を含む数カ所で制御されるも
のと考えられている。プロモーター配列はそれぞれの遺
伝子に独特のものであり、遺伝子転写を正確かつ効率的
に開始させるために必要である。エンハンサーおよび／
またはリプレッサーはプロモーター活性を調節し、特定
の組織の発生および分化の際の遺伝子転写の水準を決定
する。
【０００５】ほとんどの真核細胞の遺伝子のプロモータ
ーは、ＴＦＩＩＤ ＴＡＴＡボックス結合タンパク質と
結合する標準的なＴＡＴＡボックスを有する。ＴＦＩＩ
Ｄ複合体および会合した転写活性化因子は基礎開始因子
およびＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用して、プロモ
ーターを活性化する。転写複合体の組み立てと開始と
は、プロモーターおよび遺伝子の他の領域に位置するエ
ンハンサーに結合した転写因子によって調節される(Pug
h and Tjian, J. Biol. Chem., 267, 679-682, 1992)。
組織特異的転写因子および核ステロイドホルモンレセプ
ターは、発生および分化の際に様々な組織での遺伝子発
現の調節に重要な役割を果たしている。しかしながら、
分子レベルでのコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
遺伝子の発現の基となっている機構は理解されていな
い。ＣＹＰ７遺伝子発現の調節が理解されれば、変更し
た（不十分なまたは過度の）遺伝子発現により胆汁酸合
成およびコレステロール代謝に欠陥を有する患者を治療
する治療薬を開発することができるであろう。
【０００６】
【発明の概要】従って、分子レベルでのヒトコレステロ
ール７α−ヒドロキシラーゼの調節の機構を検討するた
めには、正確なコード、非コードおよびプロモーター遺
伝子配列を決定することが重要である。酵素の遺伝子構
造の解明、プロモーターおよびエンハンサー／リプレッ
サー活性の分析法、およびヒトコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼを検討するためのトランスジェニック動
物モデルが望まれている。組換えＣＹＰ７を発現するト
ランスジェニック動物を提供する試みは、ＣＹＰ７のｃ
ＤＮＡを用いては成功していない。従って、ＣＹＰ７遺
伝子に関する重要な発見、およびＣＹＰ７酵素の生理学
を検討するための系であって、それぞれが胆汁酸合成お
よびコレステロール代謝に障害を有する患者の治療薬の
設計および治療を目的としたものであるものが強く望ま
れている。
【０００７】従って、本発明の一つの態様では、コレス
テロール７α−ヒドロキシラーゼのゲノムＤＮＡ、特に
第２、３および４表のＤＮＡ配列、クローンλＨＧ７α
２６（ＡＴＣＣ ７５５３４）およびλＨＧ７α５（Ａ
ＴＣＣ ７５５３５）、およびそれらのフラグメントが
提供される。
【０００８】もう一つの態様では、コレステロール７α
−ヒドロキシラーゼのゲノムＤＮＡを含む発現ベクター
およびこのベクターを有する宿主細胞が提供される。更
に、発現ベクターは、レポーター遺伝子に作動可能に連
結したコレステロール７α−ヒドロキシラーゼプロモー
ター領域の構築物を含むことができる。このような構築
物を胎児段階の哺乳動物に導入して、ヒト以外のトラン
スジェニック哺乳動物を提供することができる。従っ
て、この哺乳動物の胚細胞および体細胞は、ヒトコレス
テロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子のヒトゲノムＣ
ＹＰ７ ５′フランキング配列からのプロモーター領域
を含でなり、そしてこのプロモーター領域がレポーター
遺伝子に作動可能に連結しているということが有利であ
る。
【０００９】レポーター構築物を含む前記のトランスジ
ェニック哺乳動物を用いて、ヒトコレステロール７α−
ヒドロキシラーゼのプロモーター領域をアップレギュレ
ーションまたはダウンレギュレーションする薬剤をスク
リーニングまたは決定することができる。これは、哺乳
動物に試験薬剤を投与し、薬剤を投与していないコント
ロールと比較して哺乳動物におけるレポーター遺伝子の
発現の効果を検出することによって行われる。例えば、
哺乳動物にヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
のプロモーター領域をアップレギュレートする薬剤を投
与すると、レポーター遺伝子の発現が増加し、これによ
りこの薬剤がヒトの血清コレステロールを減少させる能
力を有するものであることが確認出来る。
【００１０】本発明のもう一つの態様では、組換えヒト
コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子であって
その遺伝子の発現を制御するシス−作用性の調節要素に
作動可能に連結されているものを含み、ここでこの組換
えヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子配
列がヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子
のコード配列と実質的に同一である、形質転換細胞が提
供される。
【００１１】もう一つの態様では、組換えヒトコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写が内因性ヒ
トコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写
を制御する配列と同一のシス−作用性の調節要素／プロ
モーターによって制御され、ここでこの遺伝子の転写を
制御するシス−作用性調節要素が誘導性のものである細
胞が提供される。
【００１２】本発明のもう一つの目的は、動物を形質転
換するためのコレステロール７α−ヒドロキシラーゼミ
ニ遺伝子を提供すること、例えば第１表に示される機能
的に活性なコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを生
成することである。
【００１３】
【表１】
【表２】
【００１４】分子量が５７６５８で長さが５０４アミノ
酸のミニ遺伝子を有する、トランスジェニック動物で発
現されるヒトＣＹＰ７アミノ酸配列を示す表である。こ
こで、ＣＹＰ７のミニ遺伝子は、エキソンＩ〜VIと、少
なくとも２種の、ＩおよびII、ならびにＩ、IIおよびII
I からなる群から選択されるイントロンとを含むことが
できる。場合によっては、ミニ遺伝子は、更にＣＹＰ７
プロモーター領域を含むことができる。
【００１５】本発明によれば、もう一つのヒト以外のト
ランスジェニック哺乳動物であって、この哺乳動物は組
換えヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子
を含む胚細胞と体細胞を有し、この遺伝子は哺乳動物に
おいてこの遺伝子の発現を制御するシス−作用性の調節
要素に作動可能に連結されており、これによってこの哺
乳動物における末梢血コレステロール濃度および胆汁酸
の生産に影響を与えるようにされたトランスジェニック
哺乳動物が提供される。この遺伝子は、ヒト以外の哺乳
動物または胎児段階のヒト以外の哺乳動物の原種（ance
stor）に導入され、前記哺乳動物の染色体はヒトコレス
テロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子のコード配列と
実質的に同一の内因性のコード配列を含む。また、トラ
ンスジェニック哺乳動物であって、組換えヒトコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子が内因性のヒトコ
レステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を制
御するシス−作用性の調節要素／プロモーター配列によ
って制御され、ここでこの遺伝子の転写を制御するシス
−作用性の調節要素が誘導性であるものが提供される。
【００１６】
【発明の具体的説明】本発明は、イントロンおよびエキ
ソン配列、並びに５′上流配列を含むヒトゲノムＣＹＰ
７遺伝子の単離および配列決定に関する。ゲノムＣＹＰ
７ ＤＮＡを含む２個のクローンは、図１（Ｂ）および
図１（Ｃ）に示されるように配列決定される。本発明
は、ゲノムＣＹＰ７遺伝子の少なくとも１個のフラグメ
ントを含む組換えベクター、およびこのベクターを含む
E. coli のような宿主細胞も包含する。本発明は、ＣＹ
Ｐ７遺伝子のエキソンまたはイントロンであるＤＮＡフ
ラグメントによって表わされるＣＹＰ７ゲノムＤＮＡの
「フラグメント」も包含する。第２表において、エキソ
ンＩはヌクレオチド２２３６〜２３１９であり、イント
ロンＩは２３２０〜３９２８であり、エキソンIIは３９
２９〜４１６９であり、イントロンIIは４１７０〜５２
１０であり、エキソンIII は５２１１〜５５３７であ
る。第４表において、部分エキソンIVは１〜４５６であ
り、エキソンＶは４５７〜６３２であり、イントロンＶ
は６３３〜１２２０であり、エキソンVIは第４表の１２
２１から始まる。本発明による「フラグメント」の範疇
には、本発明により開示されたＤＮＡを任意の制限エン
ドヌクレアーゼで、好ましくは図１に示した制限部位で
消化することによって得られる任意のフラグメントも包
含する。他の制限フラグメントも、当該技術分野の通常
の技術を用いて同様に得ることができる。
【００１７】本発明には、ストリンジェント（stringen
t ）な条件下でハイブリダイズし、好ましくは極めてス
トリンジェントな条件下で前記ＤＮＡ配列またはフラグ
メントのいずれかとハイブリダイズするＤＮＡ配列も包
含される。本発明においては、「ストリンジェントな条
件」という用語は６２〜６６℃における塩濃度４×ＳＳ
Ｃ（ＮａＣｌ−クエン酸緩衝液）の条件を意味し、「極
めてストリンジェントな条件」とは、６８℃における塩
濃度０．１×ＳＳＣを意味する。ヒトＣＹＰ７の決定さ
れた遺伝子配列から、遺伝子のプロモーター領域も同定
される。クローンλＨＧ７α２６は、５′−上流フラン
キング配列の約８．０ｋｂに拡がるインサートを含む。
本発明によれば、この配列情報により、レポーター遺伝
子に作動可能に連結したヒトＣＹＰ７プロモーターを構
築することができる。この「プロモーター／レポータ
ー」遺伝子構築物を用いて、宿主細胞および動物の形質
転換を行う。例えば、プロモーター／レポーター遺伝子
を用いて、E.coli ＪＭ１０１株または哺乳動物の肝細
胞の形質転換を行い、またはトランスジェニックマウス
またはハムスターの形質転換を行う。
【００１８】本発明のもう一つの態様では、本発明によ
るプロモーター／レポーター遺伝子を含む形質転換され
た細胞系、またはトランスジェニック動物が提供され
る。このような形質転換体により、ＣＹＰ７遺伝子の発
現を増減する薬剤を容易に検出することができる。これ
は、薬剤とＣＹＰ７プロモーター領域との相互作用によ
り対応するレポータータンパク質の発現パターンを生
じ、これが容易に検出されるものであるからである。例
えば、ホタル由来のタンパク質であるルシフェラーゼを
レポーター遺伝子として用いる場合には、ルシフェラー
ゼの発現はその生物発光によって定量的に測定される。
ＣＹＰ７プロモーター領域またはそこから励起されたあ
る種の調節要素を用いて、ＣＹＰ７遺伝子、または阻害
薬もしくは亢進薬の存在下にて遺伝子発現を定量的に決
定することができる各種のレポーター若しくはインディ
ケーター遺伝子の発現を制御することができる。レポー
ター遺伝子としては、E. coli β−ガラクトシダーゼ、
ガラクトキナーゼ、インターロイキン２、チミジンキナ
ーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ルシフェラーゼおよ
びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。従
って、また、このような発現系を用いて、化合物の構造
遺伝子の発現を阻害しまたは亢進する能力をスクリーニ
ングすることもできる。
【００１９】もう一つの態様では、ミニ遺伝子が提供さ
れ、これは新たに発見された遺伝子情報のフラグメン
ト、特にクローンλＨＧ７α２６から得られた遺伝子配
列、をｃＤＮＡに拡がっているエキソン３〜６と連結す
ることによって提供される。本発明によれば、ミニ遺伝
子が提供され、これを用いて動物の形質転換を行って、
ヒトＣＹＰ７をイン・ビボで産生させる。
【００２０】本発明によるミニ遺伝子の作成では、プロ
モーター領域およびエキソンＩ〜VIが、ゲノムＣＹＰ７
ＤＮＡのイントロンＩおよびIIまたはイントロンＩ、II
およびIII とともに用いられる。しかしながら、イント
ロンIII 、IVまたはＶのいずれかを省いてもよい。例え
ばＣＹＰ７遺伝子のイントロンIII 、IVおよびＶ、また
はイントロンIVおよびＶを省くことができる。従って、
本発明による好ましいミニ遺伝子は、ＣＹＰ７エキソン
とイントロンＩおよびIIとを総て含んでいる。本発明の
もう一つのミニ遺伝子は、総てのエキソンとイントロン
Ｉ、IIおよびIII とを含んでいる。従って、図２に示さ
れるミニ遺伝子のようなミニ遺伝子で形質転換されたト
ランスジェニック動物で、ＣＹＰ７遺伝子を発現させる
方法が提供される。場合によっては、ミニ遺伝子は、Ｃ
ＹＰ７のプロモーター領域を有することができる。ある
いは、ＣＹＰ７のプロモーター領域の代わりに他の既知
のプロモーター領域を用いて、動物においてプロモータ
ーによって誘導される発現を実験的に制御することがで
きる。例えば、ＣＹＰ７ミニ遺伝子がメタロチオナイン
プロモーターによって誘導されるトランスジェニックマ
ウスを作成することができる。このプロモーターをトラ
ンスジェニックマウスで用いると、トランスジェニック
動物でのＣＹＰ７の過剰発現のモデルが得られる。
【００２１】本発明のもう一つの態様では、ヒトＣＹＰ
７ミニ遺伝子によりトランスジェニック動物、好ましく
は生殖細胞等の総ての組織に新たな遺伝情報を有する動
物、を産生することができる。ミニ遺伝子がトランスジ
ェニック動物に導入されると、第１表に示されるアミノ
酸配列を有するＣＹＰ７タンパク質が発現される。この
動物は、実施例３に更に記載されている、ＣＹＰ７の発
現を調節するのにイン・ビボで有効な薬剤をスクリーニ
ングするための有用な病態モデルである。様々な方法を
用いて、異種遺伝子を動物に導入する。これらの方法と
しては、単細胞胚へのＤＮＡのマイクロインジェクショ
ン、胚のレトロウイルスの感染、および胚幹細胞による
カルシウムホスファターゼを介するＤＮＡ吸収が挙げら
れる（Hogan et al., MANIPULATING THE MOUSE EMBRY
O; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laborat
ory, 1986); Leder et al.,米国特許第４，７３６，８
６６号明細書；Leder et al., 米国特許第５，１７５，
３８３号明細書；Krimpenfort et al., 米国特許第５，
１７５，３８４号明細書）。
【００２２】最も有効で、最も好ましい手法はＤＮＡの
マイクロインジェクションである（Hammer et al., J.
Anim. Sci., 63: 269 (1986)；Gordon et al., Science
214: 1244 (1981); Brinster et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 82: 4438 (1985)）。マイクロインジェク
ションは、単細胞段階での胚の単離を含む。目的とする
遺伝子をコードするＤＮＡを、単離した胚にイン・ビト
ロでマイクロインジェクションし、処理した胚を偽妊娠
した雌性動物に移植する。尾などの組織フラグメントか
ら得たＤＮＡをインサートした遺伝子に特異的なプロー
ブを用いて分析することによって、トランスジェニック
動物を誕生後短期間で確認することができる。組込み
は、単一ゲノム部位にhead-to-tailの鎖状体状で生じる
ことが一般的に判っている。１細胞段階で異種遺伝子を
取り込むことによりトランスジェニック動物が得られる
が、組込みが多細胞段階で起こると、モザイクが生じ
る。２種類の異なる胚幹細胞を組込むことによって、キ
メラ動物を作成することができる。マイクロインジェク
ションだけが、メンデルの方式で遺伝情報を子孫に伝達
することができる動物を生産することができる。これら
のトランスジェニック動物を永続的な動物モデルとして
用いるには、生殖細胞系の組込みが重要である。
【００２３】受精した卵母細胞段階で組換えヒトコレス
テロール７α−ヒドロキシラーゼを導入して、トランス
ジェニックな「創始(founder) 」動物の胚細胞および体
細胞の総てに遺伝子配列が含まれるようにする。トラン
スジェニック創始動物の胚細胞に組換え遺伝子配列が含
まれていることは、創始動物の子孫の約半数がその胚細
胞および体細胞の総てに活性化された組換え遺伝子配列
を有することを意味している。数種の因子によって、新
たなタンパク質が発現するレベルおよびその一時的で組
織特異的な発現の状態が決定される。最も重要な因子
は、インサートされたＤＮＡによってコードされるタン
パク質の発現を制御するのに用いられるプロモーターお
よびエンハンサーである。組織特異的な制御要素により
特定の組織に有意な発現が指示されるが、遍在するプロ
モーターは動物の様々な組織での発現を行うことができ
る。
【００２４】修飾されていない器官以上のレベルでヒト
遺伝子を発現させるには、５′上流領域以外の重要なシ
ス−作用性制御要素が必要である。ヒト遺伝子の第一の
イントロンおよび第二のイントロン、場合によって第三
のイントロンが、タンパク質発現の制御に重要であるこ
とが知られている。更に、トランス遺伝子にイントロン
配列が含まれていれば、ゲノム中へのＤＮＡ組込み部位
の阻害効果を除去し、または少なくとも低下させること
が示されている（Behringer et al., Science 245: 971
(1989); Lang et al., EMBO J., 7: 1675 (1988) ）。
例えば、発現レベルで組込みの位置効果を克服するた
め、先行技術では１０〜５０ｋｂ上流のエンハンサー領
域、イントロンまたはトランスジェニック動物の生産の
ためのＤＮＡ構築物におけるスプライス部位の近傍のイ
ントロンの部分を配置した（Brinster et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA.,85: 836 (1988); Buchman et a
l., Mol. Cell Biol., 8: 4395 (1988) ）。従って、本
発明のＤＮＡ配列が与えられれば、当業者は、ヒトコレ
ステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子のシス−作用
性制御要素の様々な組合せを構築して、どの領域が未修
飾器官以上のレベルでのヒト遺伝子の発現に必要なのか
試験することができる。このような構築物に用いられる
ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子のシ
ス−作用性の制御要素は、ヒト遺伝子の５′上流領域、
第一のイントロン、第二のイントロンおよび第三のイン
トロンから選択される。
【００２５】通常は、本発明は、ヒト以外のトランスジ
ェニック脊椎動物、好ましくは例えばマウスまたはハム
スターのような齧歯類などの哺乳動物、であって、この
動物はコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを発現す
ることができるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
類において、脊椎動物遺伝子と実質的に相同である組換
え遺伝子を含む胚細胞および体細胞を有するものを特徴
とする。組換え遺伝子を、胚段階、好ましくは１細胞ま
たは受精した卵母細胞段階、通常は約８細胞段階以前、
の動物またはその動物の原種に導入する。組換え遺伝子
は、好ましくはヒトコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼと実質的に相同である（すなわち、コードされたア
ミノ酸配列に関して５０％以上相同、好ましくは８０％
以上相同）。
【００２６】好ましくは、ヒトコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼをコードするＤＮＡの転写は、内因性コ
ード配列の転写を制御するプロモーター配列と同一のプ
ロモーター配列によって制御され、発現タンパク質が同
様にヒトで発現するように制御される。内因性シス−作
用性制御要素という用語は、イン・ビボでヒトコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼの発現を制御する核酸配
列を指す。
【００２７】本発明による動物は、ヒトコレステロール
７α−ヒドロキシラーゼの発現を行う可能性のある薬剤
を試験するためのモデルとして用いることができる。
(1) コレステロール代謝に関与する各種の酵素の発現、
および(2) アテローム性動脈硬化症に影響を与える薬剤
を試験するためにトランスジェニック動物を用いること
は、Breslow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8314
(1993)に記載されているように当業者に周知であり、こ
の文献の全内容は、引用することにより本命最初の開示
の一部される。ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼは、末梢血中のコレステロール濃度を制御する律速
酵素であるので、ヒトの高コレステロール血症の発症
は、この酵素が発現するレベルによって変わる。高コレ
ステロール血症（hypercholesterolemia) （hyperchole
steremiaまたはhypercholesterinemia）は、循環血の細
胞および血漿中に含まれるコレステロールの量が異常に
高い臨床的症状である。高コレステロール血症は、アテ
ローム性動脈硬化症、じゅく状斑、小動脈硬化性斑形
成、高血圧および心臓病を誘発する重大な医学的症状で
ある。本発明によるトランスジェニック動物を用いて高
コレステロール血症を治療し、若しくはその症状を緩和
することができる薬剤を試験し、または高コレステロー
ル血症を促進することが出来る薬剤を試験することがで
きる。
【００２８】被験薬剤を本発明による動物に投与するこ
とができ、動物の末梢血中のコレステロールおよび胆汁
酸を観察する。末梢血中コレステロールは、ほとんどの
臨床検査室で用いられる通常の検査によって測定され
る。胆汁酸の産生は、逆相高圧液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）を用いて観察される。
【００２９】本発明によるトランスジェニック動物は、
ＣＹＰ７の過剰発現または不十分な発現を促進しまたは
抑制する薬剤および方法を試験するための動物モデルと
して極めて有用である。過剰発現ではコレステロールか
らの胆汁酸の合成が増加し、一方不十分発現ではコレス
テロールからの胆汁酸の合成が減少して高コレステロー
ル血症を生じる。従って、本発明によるトランスジェニ
ック動物を用いて胆汁酸合成の制御および高コレステロ
ール血症を研究することができる。特に、高コレステロ
ール食餌を施したトランスジェニックマウスまたはハム
スターを用いて、マウスにおけるＣＹＰ７の過剰発現に
よって高コレステロール血症を予防することができるか
どうかを知ることが出来る。胆汁酸およびコレステロー
ルの両方を高濃度で含む食餌を投与したトランスジェニ
ックマウスを用いて、高胆汁酸食餌が７α−ヒドロキシ
ラーゼの発現を抑制し、高コレステロール血症を誘発す
るかどうかを決定するのである。
【００３０】本発明による構築物を用いて、イン・ビト
ロでの遺伝子発現並びにイン・ビボでの遺伝子の制御を
評価することができる。例えば、図２の構築物を用い
て、肝細胞および他の哺乳動物細胞をトランスフェクシ
ョンし、ＣＰＹ７遺伝子の組織特異性発現を試験するこ
とができる。また、図３の構築物を用いて、肝細胞およ
び他の哺乳動物細胞をトランスフェクションし、ＣＰＹ
７遺伝子の制御を評価することができる。一般的には、
本発明は形質転換した哺乳類細胞、好ましくはコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼを発現することができる
コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ類において、脊
椎動物遺伝子と実質的に相同である組換えコレステロー
ル７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含む肝細胞を特徴と
するものである。組換え遺伝子は、当該技術分野で周知
の各種のトランスフェクション手段によって細胞中に導
入される。組換え遺伝子は、好ましくはヒトコレステロ
ール７α−ヒドロキシラーゼと実質的に相同である（す
なわち、コードされたアミノ酸配列に関して５０％以上
相同、好ましくは８０％以上相同）。好ましくは、ヒト
コレステロール７α−ヒドロキシラーゼをコードするＤ
ＮＡの転写は、内因性ヒトコード配列の転写を制御する
プロモーター配列と同一のプロモーター配列によって制
御され、発現されたタンパク質が同様にヒトで発現する
ように制御される。
【００３１】本発明による細胞は、ヒトコレステロール
７α−ヒドロキシラーゼの発現を行う可能性のある薬剤
を試験するためのモデルとして用いることができる。被
験薬剤を細胞に投与して、ヒトコレステロール７α−ヒ
ドロキシラーゼの発現を分析することができる。このよ
うな形質転換した細胞は、ＣＹＰ７の過剰発現または不
十分な発現を促進または抑制する薬剤を試験するのに有
用である。
【００３２】ＣＹＰ７の分析は、下流の組換えＣＹＰ７
ミニ遺伝子またはレポーター構築物を用いて細胞培養物
中で行うことができる。ＣＹＰ７制御要素を用いて、Ｃ
ＹＰ７遺伝子、または阻害薬もしくは亢進薬の存在下に
て遺伝子発現を定量的に決定することができる各種のレ
ポーター若しくはインディケーター遺伝子の発現を制御
することができる。レポーター遺伝子および系は、本明
細書に既に記載されている。
【００３３】下記の実施例により本発明を説明するが、
これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される発明を
制限するものではない。
【実施例】実施例１ ＣＹＰ７ヒトコレステロール７α−ヒドロキ
シラーゼのゲノムＤＮＡ ＥＭＢＬ−３ Ｓｐ６／Ｔ７ファージベクター(Clontec
h, Palo Alto, CA) のＢａｍＨＩ部位に連結したＳａｕ
３ＡＩで部分的に消化したヒト胎盤性ＤＮＡで構築した
ヒトゲノムライブラリーを、予め単離したヒトコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡの１．６ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント(Keram and Chiang,
Biochem. Biophys. Res. Comm., 185, 588-595, 1992)
をハイブリダイゼーションプローブとして用いてスクリ
ーニングした。ハイブリダイゼーションは６８℃、１％
ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣの極めてストリンジェント
な条件で行った。８００，０００ｐｆｕのファージをス
クリーニングした。スクリーニングを４回繰り返した
後、７個の陽性クローンをプラーク精製した。最大のイ
ンサートを含む３個のクローン（λＨＧ７α２６、λＨ
Ｇ７α５およびλＨＧ７α５２）を単離し、制限マッピ
ングによって分析した。図１（Ｂ）は、約８．０ｋｂの
５′上流フランキング配列およびエキソンＩ〜III （第
２表および第３表）に拡がる１５ｋｂのインサートを含
むクローンλＨＧ７α２６のクローンの遺伝子地図を示
す。クローンλＨＧ７α５（図１（Ｃ））は、イントロ
ンIV、エキソンＶ、イントロンＶおよび部分的エキソン
VI（第４表）を含む。８．０ｋｂの３′フランキング配
列は、λＨＧ７α５の配列決定領域を越えて伸びている
（第４表）。
【００３４】
【表３】
【表４】
【表５】 ヒトＣＹＰ７のエキソンＩ、イントロンＩ、エキソンI
I、イントロンIIおよびエキソンIII を含むヌクレオチ
ド配列を示した表である。
【００３５】
【表６】
【表７】 ５′上流ＥｃｏＲＩフラグメントを含むヌクレオチド配
列を示した表である。
【００３６】
【表８】
【表９】 ヒトＣＹＰ７のイントロンIV、エキソンＶ、イントロン
ＶおよびエキソンVIを含むヌクレオチド配列を示した表
である。
【００３７】バクテリオファージクローンλＨＧ７α２
６およびλＨＧ７α５は、それぞれＡＴＣＣ７５５３４
およびＡＴＣＣ７５５３５の受託番号で、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Cul
ture Collection)、ＡＴＣＣ、１２３０１パークローン
・ドライブ、ロックビル、メリーランド ２０８５２、
米国に１９９３年８月２５日に寄託された。
【００３８】クローンλＨＧ２６の５種類のＥｃｏＲＩ
フラグメントを、制限消化によってファージＤＮＡイン
サートから切り取り、ファージミド(phagemid)ベクター
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ＋(Stratagene, La
Jolla, CA)中にショットガンサブクローニングを行っ
た。クローンのサイズを選択し、ＥｃｏＲＩフラグメン
トをＣｓＣｌで精製したプラスミドから単離し、配列決
定に用いた。３７℃で１分間インキュベーションする条
件を用いて製造業者の指示（Stratagene, CA) に従って
ＥｘｏＩＩＩ／ヤエナリヌクレアーゼにより消化する
と、一群の欠失を生じた。この条件では、平均して約２
００〜２５０ｂｐ／分の欠失を生じた。一群の欠失のＤ
ＮＡ配列決定は、Ｔ７シクエナーゼバージョン２．０
(USB, Cleveland, OH) および35Ｓ−ｄＡＴＰを用いて
ジデオキシチェインターミネーション法によって行っ
た。配列データーは鎖およびオーバーラップしている欠
失クローンの両方から得られ、ＤＮＡＳＩＳソフトウェ
ア(Hitachi America, CA) を用いて分析した。
【００３９】５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントおよび
２．６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントのヌクレオチド配
列を決定した。５ｋｂフラグメントは５′−上流領域の
−１８８６から部分エキソン３（第２表）までの配列を
含んでいる。第２表には、この５ｋｂフラグメントの直
ぐ上流に配置された３．５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメン
トの３４７ｂｐの３′−末端配列と、５ｋｂフラグメン
トの直ぐ下流の２．６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントの
２３３ｂｐの５′末端配列とが含まれている。図１
（Ｂ）に示されるように、２．６ｋｂフラグメント（第
３表）は３．５ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントの５′に
も配置されている。このようにして、遺伝子の５′−上
流フランク領域の配列を決定した。
【００４０】本発明による配列をオーバーラップ領域
（１６０４ｂｐ）におけるMolowa etal. (1992)の配列
と比較したところ、転写開始部位から約−４６０までの
配列は同一であったが、上流の配列は著しく変化してい
ることが判った。全部で５２個の不一致が見られたが、
これらの総てがヒト遺伝子における多型性 (polymorphi
sms)の存在によるものではなかった。Cohen et al. (Ge
nomics, 14, 153-161, 1992)は、７２３ｂｐの上流配列
を報告した。Cohen の配列の＋１から−７２３までに７
個の不適合が認められた。ヌクレオチド−４６９での
「Ｔ」の「Ｃ」への転換は、ＭａｅＩＩ多型性であると
確認された(Thompson et al., Biochem. Biophys. Act
a., 1168, 239-242, 1993) 。本発明による５′フラン
キング配列は、オーバーラップ領域＋１〜ヌクレオチド
−２２３５で見られたヌクレオチド−１１９７における
不適合を除き、Thompson et al.(1993) によって報告さ
れた配列と同じであった。イントロン配列は、他の研究
室では全く報告されていない。クローンλＨＧ７α５
も、遺伝子の５′末端から配列決定した。第４表は、ヒ
トＣＹＰ７遺伝子の部分イントロンIV、エキソンＶ、イ
ントロンＶおよびエキソンVIを含む２３１６塩基対の配
列である。
【００４１】実施例２ プロモーター／レポータートラ
ンスジェニック動物 ルシフェラーゼレポーター系を用いるトランスジェニッ
ク動物の遺伝子制御の評価は、当業者には周知である。
（DiLelia et al., Nucl. Acids. Res., 16: 4159 (198
8)）。この文献の内容を引用することによって本明細書
の開示の一部とする。このようなレポーター構築物を産
生するベクターは、Promega Corporation (2800 Woods
Hollow Road, Madison Wisconsin 53711-5399)から市販
されている。例えば、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃルシフェラ
ーゼベクター(Promega) を用いて、ヒトゲノムコレステ
ロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子からのＣＹＰ７の
５′配列において重要なシス−作用性要素をレポートす
るカセットを構築することができる。図３に示されてい
るように、第２表のヌクレオチド２２３６〜４１３９に
同等なヒトゲノムクローンＨＧ７ａ２６の−１８７９〜
＋２４までの１．９ｋｂのプロモーター領域は、ＰＣＲ
増幅によって得た。ＫｐｎＩ部位はＨＬＵ−１プライマ
ー（ＨＬＵ−１プライマー＝５′ＴＡＣＣＧＣＴＣＧＡ
ＧＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＴ３′）を用
いて５′末端に導入され、ＸｈｏＩ部位はＨＬＵ−２プ
ライマー（ＨＬＵ−２プライマー＝５′ＣＡＡＧＡＡＴ
ＧＡＴＡＧＡＴＡＡＡＡＴ３′）を用いて３′末端に導
入された。ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
プロモーター領域を含むこの組換えＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ
フラグメントを、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏで切断
したルシフェラーゼベクターｐＧＬ−２−Ｂａｓｉｃ(P
romega) に連結した。生成するプロモーター−ルシフェ
ラーゼレポーターのキメラ構築物を精製し、E. coli Ｊ
Ｍ１０１株のような宿主細胞を形質転換するのに用い
た。
【００４２】ポリ（Ａ）シグナルを含む全１．９ｋｂの
ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼプロモータ
ー領域およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を、ユニ
ークなＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位によって
フランク（flank ）する。ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩフ
ラグメントは、４．６ｋｂであり、トランスジェニック
動物の産生で受精した卵母細胞へのマイクロインジェク
ションに用いられる。次に、サザンブロット法を用いて
分析したこの構築物を含むトランスジェニック動物を、
アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション
することができる各種の薬剤について試験する。あるい
は、本発明のＤＮＡ配列であれば、当業者は、ヒトコレ
ステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子のシス−作用
性の制御要素の各種組合せを構築して、未修飾器官以上
のレベルでヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
を発現するのに要する特異的領域および位置の影響を試
験することができる。このような構築物で用いられるヒ
トコレステロール７α−ヒドロキシラーゼのシス作用性
の制御要素は、ヒト遺伝子の５′上流領域、第一のイン
トロン、第二のイントロンおよび第三のイントロンから
選択される。
【００４３】肝臓などの組織試料を、当該技術分野で公
知の方法によってルシフェラーゼ活性について試験する
（Promega Technical Bulletin (Promega Corporation,
September 1993); Wood, BIOILLUMINESCENCE AND CHEM
ILUMINES- CENCE (John Wiley and Sons, 1991) ）。簡
単に説明すれば、ホモゲナイズした組織上澄液を、ＡＴ
Ｐを含む緩衝液中でルシフェリンおよび補酵素Ａと混合
する。ルシフェリン発光は、発光計を用いて検出したと
ころ、トランスジェニック組織で発現される組換えルシ
フェラーゼが存在するときだけ起こる。
【００４４】実施例３ ヒトゲノムコレステロール７α
−ヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡを含むトランス
ジェニックマウスの生産および分析 ｐＨ７ａＭＧベクターに含まれる組換えＣＹＰ７ミニ遺
伝子を、下記のようにしてマウスの胚細胞に組込む。ｐ
Ｈ７ａＭＧの構築は、図２に模式的に示されている。ｐ
Ｈ７ａＭＧの全７．２ｋｂのインサートは、ＢａｍＨＩ
およびＫｐｎＩを用いる制限酵素開裂によって除去する
ことができる。ＣＹＰ７ミニ遺伝子ＤＮＡは、ＤＮＡ１
μｇ当たり３７℃で１時間当たりＢａｍＨＩおよびＫｐ
ｎＩをそれぞれ４単位ずつで消化することによって注入
用に作成し、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、Si
nn et al., Cell, 49: 465 (1987) に記載された方法で
精製した。単離した７．２ｋｂのＤＮＡフラグメント
を、ＦＶＢ／ＮＨｄ同系交配株由来の受精した１細胞マ
ウスまたはハムスターの前核に注入した（Taconic labo
ratory, Germantown, NJ) 。線形化したプラスミド約１
００〜１０００個のコピーを前核１個に組込む。マイク
ロインジェクションの後、成長力のある卵を、Wagner e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 5016 (1981)
に記載の方法によって、偽妊娠Swiss Webster マウス(T
aconic Farms) の卵管に移す。マウスを、１０時間暗
所：１４時間明所のサイクルで保持された環境を制御し
た設備に収容する。乳母雌性動物の卵を、一定期間発生
させる。プロモーター領域、エキソンＩ、IIおよび部分
エキソンIII 並びにイントロンＩおよびIIを含む５．５
キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグメント（第２表）を、部分
エキソンIII 、エキソンIV、Ｖおよび部分エキソンVIを
含むｃＤＮＡＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントに融合
させた。エキソンIII の内部ＥｃｏＲＩ部位によって遺
伝子フラグメントをｃＤＮＡへ結合させ、実施例３のミ
ニ遺伝子を構築した。
【００４５】２〜６週齢の間で、それぞれの誕生した子
供のＤＮＡを、その尾から採取したＤＮＡを用いてサザ
ンハイブリダイゼーションによって分析する。ＤＮＡを
１．５ｃｍの尾の断片から抽出する（Davis et al., Me
th. Enzym., 65: 405 (1980)）。核酸ペレットを、１０
ｍＭ トリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ２００μｌに再懸濁し、１０μｇをＫｐｎＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化し、１．０％アガロース上で電気泳動
し、ニトロセルロースに移す（Southern, J. Mol. Bio
l., 98: 503 (1975) ）。フィルターを１０％デキスト
ランスルフェートの存在下にてＣＹＰ７トランスジェニ
ック特異性プローブに対して一晩ハイブリダイゼーショ
ンして、６４℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗
浄する。ＣＹＰ７トランス遺伝子特異性プローブは、宿
主ゲノム中で関連配列にハイブリダイゼーションしない
ＣＰＹＰ７ミニ遺伝子のフラグメントである。このフラ
グメントは、反復配列を持たない。ＣＹＰ７トランス遺
伝子特異性プローブに、ニックトランスレーションによ
り３２ＰｄＣＴＰを標識する（Rigby et al., J. Mol.B
iol., 113: 237 (1977)）。サザンハイブリダイゼーシ
ョンから、創始マウスがＣＹＰ７ミニ遺伝子構築物を保
持していることが示される。
【００４６】（１） トランスジェニックマウスにおけ
るヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼミニ遺伝
子の転写 組織において新たに獲得された遺伝子の転写は、この組
織からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡをノザンブロット分
析法によって分析することによって決定した。切り取っ
た組織を５．０ｍｌの冷ハンク緩衝食塩水で洗浄し、総
ＲＮＡをＣｓＣｌグラディエントを用いる方法によって
単離する（CHirgwin et al., Biochem.,18: 5294 (197
9)）ＲＮＡペレットをエタノール中で再沈澱によって２
回洗浄し、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによっ
て定量する。一本鎖の均一に標識されたＲＮＡプローブ
をトランスジーンに特異的なプローブを用いて作成す
る。このようなトランスジーンに特異的なプローブはＣ
ＹＰ７ミニ遺伝子のフラグメントであり、宿主ゲノムに
おける関連配列にハイブリダイゼーションしない。この
フラグメントは反復配列を持たない。ヒトコレステロー
ル７α−ヒドロキシラーゼｍＲＮＡは３ｋｂであり、内
因性のマウスコレステロール７α−ヒドロキシラーゼｍ
ＲＮＡは４ｋｂであるので、ｐＨ７１ＭＧから切断され
る全ＣＹＰ７ミニ遺伝子構築物を用いることによって、
転写された外因性のヒトコレステロール７α−ヒドロキ
シラーゼ遺伝子の存在を確認することができる（Melton
et al.,Nucl. Acids Res., 12: 7035 (1984)）。
【００４７】ＣＹＰ７ミニ遺伝子の転写を試験するた
め、８Ｍ尿素５％アクリルアミドゲル上で標識した一本
鎖プローブフラグメントを単離し、電気溶出し、そして
総ＲＮＡにハイブリダイゼーションさせる（Berk et a
l., Cell, 12: 721 (1977) ）。ハイブリダイゼーショ
ン混合物は、プローブ５０，０００ｃｐｍ〜１００，０
００ｃｐｍ（比活性：１０８ｃｐｍ／μｇ）、１０μｇ
の総細胞性ＲＮＡ、５０％ホルムアミド、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴ
Ａを含んでいる（Melton et al (1984) 、上記文献）。
ハイブリダイゼーション温度はＧＣ含量によって変化す
る。ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡアーゼＡおよび
ＲＮＡアーゼＴ１(Sigma, St. Louis, Mo)１５００単位
を加えることによって停止する。ＲＮＡアーゼによる消
化は、３７℃で１５分間行う。次いで、試料をエタノー
ルにより沈澱させ、８Ｍ尿素５％アクリルアミドゲル上
で電気泳動を行う。
【００４８】分析を行った組織は、肝臓、筋肉、膵臓、
胃、脳、腸、目、大動脈、唾液腺、および腎臓である。
これらの組織のそれぞれからの総ＲＮＡ１０μｇをトラ
ンス遺伝子に特異的なプローブを用いて分析する。ＣＹ
Ｐ７ミニ遺伝子を転写する組織学的部位のトランス遺伝
子に特異的なプローブを用いるin situ ハイブリダイゼ
ーションから、転写組織における外因性のコレステロー
ル７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の存在が確かめられ
る。
【００４９】（２） トランス遺伝子発現の局在化 ｃＤＮＡへ転換し、ＰＣＲ増幅し、サザンハイブリダイ
ゼーション分析の後に、ｍＲＮＡ転写体を肝ＲＮＡ（前
記と同様にして調製）で評価する（Rosenfeldet al.、
上記文献）。ＣＹＰ７トランス遺伝子を具体的に評価
し、ｍＲＮＡ転写体の５′および３′部分が含まれてい
るようにするため、２個の別々のプライマー対、すなわ
ち組換え構築物のｍＲＮＡ転写体の５′末端を検出する
ための５′プライマー対およびＣＹＰ７特異性のアンチ
センスプライマー、および組換えｍＲＮＡ転写体の３′
末端を評価するための３′プライマー対を用いる（Fier
s etal., Nature, 273: 113 (1978) ）。
【００５０】ＲＣＲ増幅生成物を、アガロースゲル電気
泳動の後に、32Ｐを標識したヒトＣＹＰ７プローブを用
いるサザンハイブリダイゼーションによって評価する。
トランスジェニック動物由来の肝ＲＮＡのノーザン分析
では、培養細胞中の構築物によって指示されるものと同
じサイズのＣＹＰ７指示ヒトｍＲＮＡ転写体を示す。β
−アクチンまたはグリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼなどの本質的に発現したタンパク質
転写体のレベルは、正のコントロールとして働き、通常
はトランスジェニックおよび非トランスジェニック組織
試料について同じである。
【００５１】（３） トランスジェニック動物の組織に
おける組換えヒトコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼの発現 ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼトランス遺
伝子の発現をウェスターンブロットまたは免疫組織化学
によって評価する。あるいは、ルシフェラーゼまたはＬ
ＡＣ−Ｚなどの結合させたレポーター遺伝子の発現を用
いて、トランス遺伝子を発現する組織または細胞を定量
することができる。トランスジェニックに発現したタン
パク質をウェスタンブロットまたは免疫組織化学により
検出するため、ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼに特異的な抗体を用いて、各種の組織断片または各
種組織由来のタンパク質調製物におけるこの酵素の存在
を検出する。ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼに特異的な抗体は、J. Chiang により記載されてい
る。簡単に説明すれば、精製したＣＹＰ７酵素１ｍｇ
を、等容量のフロイントのアジュバントおよび５ｍｇ／
ｍｌの熱滅菌したマイクロバクテリアと混合する。乳化
した抗原混合物を、ニュージランド白ウサギの背中に、
複数の部位に皮内注射によって投与した。６週間後、精
製したヒト酵素０．５ｍｇを不完全アジュバントと混合
し、同じウサギに対するブースター注射に用いた。６週
間後、耳静脈から血液試料を採取し、オクタロニー（Ou
chterlony）二重拡散法およびChiang, et al., J. Bio
l. Chem., 265, 3889-3897 (1990)が以前に報告した免
疫ブロット法により抗体の存在を試験した。前記文献の
内容を引用することにより本明細書の開示の一部とす
る。免疫ブロット分析は、精製したヒトＣＹＰ７酵素１
μｇを７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載
せ、分離したポリペプチドを以前に報告された改質法(C
hiang et al., 上記文献(1990) ）によってImmobilon P
膜に電気泳動により移すことによって行った。希釈し
た抗血清を膜と反応させた後、第二の抗体であるアルカ
リ性ホスファターゼで包合された抗ウサギＩｇＧと反応
させ、次いで以前に報告された方法により、ニトロブル
ーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルホスフェート（ＤＣＩＰ）で染色
した。組織におけるヒト７α−ヒドロキシラーゼの発現
の存在は、ヒト７α−ヒドロキシラーゼに特異的な抗体
を用いて免疫組織化学によって評価する。アルカリ性ホ
スファターゼのモノクローナル抗−アルカリ性ホスファ
ターゼ法を用いて、各種組織断片に対する特異交替の結
合を検出する。
【００５２】実施例４ 動物試験 本発明のトランスジェニック動物は、ＣＹＰ７の過剰発
現または不十分な発現を促進または抑制する薬剤および
方法を試験するための動物モデルとして極めて有用であ
る。ＣＹＰ７発現動物を、高コレステロール血症を促進
または抑制することが考えられる材料について試験す
る。動物に既知の薬剤を各種の投与量で投与し、末梢血
中コレステロールおよび胆汁酸産生について試験する。
次いで、末梢血中コレステロール濃度が増減した動物お
よびその子孫を、ＣＹＰ７の発現に対する薬剤の効果に
ついて試験する。
【００５３】ＣＹＰ７の過剰発現を引き起こす薬剤で処
理したトランスジェニック動物を用いて、このような処
理した動物に高コレステロール食餌を与えるとき、前記
の過剰発現が高コレステロール血症を予防するかどうか
を検討する。また、胆汁酸およびコレステロールを両方
とも高濃度で含む食餌を与えたトランスジェニックマウ
スを用いて、高胆汁酸食餌が７α−ヒドロキシラーゼを
抑制し、従って高コレステロール血症を誘発するかどう
かを決定する。
【００５４】実施例５ トランスジェニック細胞系の組
織培養 本発明によるトランスジェニック動物を、細胞培養の細
胞源として用いることができる。活性化した組換え遺伝
子を含むトランスジェニック動物の組織の細胞を、標準
的な組織培養法を用いて培養し、例えば細胞および組織
レベルでの高コレステロール血症の原因を検討するのに
用いることができる。
【００５５】実施例６ 形質転換細胞の産生：プロモー
ター／レポーター遺伝子構築物 ルシフェラーゼレポーター系を用いる形質転換した哺乳
類細胞における遺伝子制御の評価は、当業者に周知であ
る（deWet et al., Mol. Cell. Biol., 7: 725(1987)
）。トランスジェニック動物に対して報告された同じ
ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼベクター(Promeg
a) 構築物をイン・ビトロで用いることができる。ま
た、細胞培養物におけるルシフェラーゼ活性は、当該技
術分野で公知の方法によって行われる（Promega Notes
28:1 (1990); Promega Technical Bulletin (Promega C
orporation, September 1993) ）。簡単に説明すれば、
溶解した細胞の上清をルシフェリンおよび補酵素Ａと共
にＡＴＰを含む緩衝液中で混合する。発光計を用いて検
出されるルシフェリン発光は、形質転換細胞中で発現さ
れる組換えルシフェラーゼの存在下でしか起こらない。
本発明による形質転換したプロモーター−レポーター細
胞を、ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの発
現に影響を与えうる薬剤を試験するモデルとして用いる
ことができる。
【００５６】コレステロール７α−ヒドロキシラーゼの
制御に関与するプロモーター配列を決定するため、ヒト
ＣＹＰ７シス−作用性の要素の欠失をルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子（Ｌｕｃ）の上流に連結させる。プロモ
ーターフラグメントは、プライマーおよびヒトＣＹＰ７
ゲノムクローンを鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反
応によって生成した。フラグメントを、ＤＮＡポリメラ
ーゼのクレノウフラグメントを用いて満たすことによっ
て平滑化した後、ＸｈｏＩで消化した。次に、フラグメ
ントを、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化して、E. coli
ＨＢ１０１細胞に形質転換したｐＧＬ２−ｂａｓｉｃベ
クター（Promega)に連結した。ヒトＣＹＰ７プロモータ
ーによって制御されるヒトルシフェラーゼ遺伝子の発現
を研究するために、生成するプラスミドを用いて、主要
な肝細胞または肝癌細胞をトランスフェクションするこ
とができた。
【００５７】クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子構築物をポリメラ
ーゼ連鎖反応並びにヒトＣＹＰ７遺伝子の５′フランク
領域およびイントロン１、２および３を増幅するための
プライマーを用いて作成した。フラグメントをプロモー
ターなしのｐＣＡＴ塩基性ベクター(Promega) に連結さ
せる。次に、このプラスミドを用いて、５′フランクＤ
ＮＡ、イントロン１、イントロン２および／またはイン
トロン３の各種切片を含む一群の欠失を生成させる。
【００５８】実施例７ 形質転換細胞の産生：ミニ遺伝
子構築物 それぞれの構築物由来のそれぞれの形質転換した細胞系
のＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションによって分析
する。ＤＮＡを細胞培養物から抽出し、核酸ペレットを
１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ２００μｌに再懸濁させ、１０μｇをＫｐｎＩおよ
びＢａｍＨＩで消化し、１．０％アガロース中で電気泳
動を行い、ニトロセルロースに移す（Southern, J. Mo
l. Biol.,98: 503 (1975) ）。フィルターを１０％デキ
ストランスルフェートの存在下、ＣＹＰ７トランスジェ
ニック特異性プローブに対して一晩ハイブリダイゼーシ
ョンして、６４℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回
洗浄する。ＣＹＰ７トランス遺伝子特異性プローブは、
宿主ゲノム中で関連配列にハイブリダイゼーションしな
いＣＰＹＰ７ミニ遺伝子のフラグメントである。このフ
ラグメントは、反復配列を持たない。ＣＹＰ７トランス
遺伝子特異性プローブに、ニックトランスレーションに
より３２ＰｄＣＴＰを標識する（Rigby et al., J. Mo
l. Biol., 113: 237 (1977)）。サザンハイブリダイゼ
ーションから、細胞系がＣＹＰ７ミニ遺伝子構築物を含
むことが示される。培養細胞中の新たに獲得した遺伝子
の転写は、細胞からＲＮＡを抽出し、前記と同様にノザ
ンブロット分析によってＲＮＡ分析を行うことによって
決定する。
【００５９】細胞培養物中の組換えヒトコレステロール
７α−ヒドロキシラーゼの発現をウェスターンブロット
または免疫組織化学によって評価する。あるいは、ルシ
フェラーゼまたはＬＡＣ−Ｚなどの結合させたレポータ
ー遺伝子の発現を用いて、トランス遺伝子を発現する組
織または細胞を定量することができる。組換えタンパク
質をウェスターンブロットまたは免疫組織化学により検
出するため、ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラー
ゼに特異的な抗体を用いて、各種の形質転換細胞中のこ
の酵素の存在を検出する。
【００６０】イン・ビトロでの薬剤の試験 本発明の形質転換細胞系は、ＣＹＰ７の過剰発現または
不十分な発現を促進または抑制する薬剤および方法を試
験するためのイン・ビトロモデルとして極めて有用であ
る。ＣＹＰ７を発現する細胞系を、高コレステロール血
症を促進または抑制することが考えられる材料について
試験する。細胞に既知の薬剤を各種の投与量で投与し、
ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの存在につ
いて試験する。
【００６１】配列表 配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＹＥＳ 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：ヒト胎盤 直接の起源 ゲノムライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..３０ 他の情報：ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ 配列
【表１０】
【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＹＥＳ 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：ヒト胎盤 直接の起源 ゲノムライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１９ 他の情報：ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ 配列
【表１１】
【００６３】配列番号：３ 配列の長さ：５０４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：ヒト胎盤 直接の起源 ゲノムクローン 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ 存在位置：１..５０４ 他の情報：ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ 配列
【表１２】
【表１３】
【００６４】配列番号：４ 配列の長さ：５５３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＹＥＳ 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：ヒト胎盤 直接の起源 ゲノムライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..５５３７ 他の情報：(1) ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼ (2) exonＩ，intronＩ，exon II ，intron II ，exon I
IIを含む 配列
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【００６５】配列番号：５ 配列の長さ：２５７５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＹＥＳ 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：ヒト胎盤 直接の起源 ゲノムライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２５７５ 他の情報：(1) ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼ (2) 非コード５′上流ＥｃｏＲＩ断片 配列
【表１７】
【表１８】
【００６６】配列番号：６ 配列の長さ：２３１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＹＥＳ 起源： 生物名：ヒト 組織の種類：ヒト胎盤 直接の起源 ゲノムライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２３１６ 他の情報：(1) ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼ (2) intron IV ，exonＶ，intronＶ，exon IV を含む 配列
【表１９】
【表２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ：ヒトＣＹＰ７遺伝子の遺伝子地図を示した
図である。 Ｂ：クローンλＨＧ７α２６の遺伝子地図を示した図で
ある。 Ｃ：クローンλＨＧ７α５の遺伝子地図を示した図であ
る。 エキソンＩ、IIおよびIII は黒塗りのボックスで示す。
矢印は（図２、３および４で示される）配列が決定され
た領域を示す。
【図２】プラスミドｐＨ７ａＭＧを含むヒトコレステロ
ール７α−ヒドロキシラーゼの構築を模式的に表わした
図である。黒塗りの薄いボックスはアミノ酸コードエキ
ソンを表わし、ベクターは黒塗りの厚いボックスで表わ
される。制限酵素開裂部位は次の通りである。 Ｂａ＝ＢａｍＨＩ、Ｅｃ＝ＥｃｏＲＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲ
Ｖ、Ｓｃ＝ＳｃａＩ、Ｂ＝ＢｇｌII、Ｘｂ＝ＸｂａＩ、
Ｈ＝ＨｉｎｄIII 、Ｃ＝ＣｌａＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｘｈ
＝ＸｈｏＩ、Ｓ＝ＳｍａＩ、Ｋ＝ＫｐｎＩ。
【図３】ヒトゲノムコレステロール７α−ヒドロキシラ
ーゼ遺伝子由来の５′配列を有するルシフェラーゼレポ
ーター遺伝子ベクターおよび実施例２に記載のレポータ
ールシフェラーゼ遺伝子の構築を模式的に表わした図で
ある。制限酵素開裂部位は次の通りである。 Ｋ＝ＫｐｎＩ、Ｅ＝ＥｃｏＲＩ、Ｓｃ＝ＳｃａＩ、Ｂｇ
＝ＢｇｌII、Ｘｂ＝Ｘ０ａＩ、Ｈ＝ＨｉｎｄIII 、Ｘ＝
ＸｈｏＩ、Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｓａ＝ＳａｌＩ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/47 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 9/04 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 6807−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第２表、第３表、第４表のヌクレオチド、
    および前記ヌクレオチド配列のいずれかとストリンジェ
    ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列からなる
    群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、ヒト
    コレステロール７α−ヒドロキシラーゼのゲノムフラグ
    メント。
  2. 【請求項２】λＨＧ７α２６（ＡＴＣＣ７５５３４）お
    よびλＨＧ７α５（ＡＴＣＣ７５５３５）からなる群か
    ら選択されるクローンを含んでなる、ヒトコレステロー
    ル７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７）のゲノムフラグ
    メント。
  3. 【請求項３】プロモーター領域と、エキソンＩ〜VIと、
    少なくとも２個の、イントロンＩおよびII、ならびに
    Ｉ、IIおよびIII からなる群から選択されるイントロン
    とを含んでなる、ミニ遺伝子。
  4. 【請求項４】請求項３に記載のミニ遺伝子でヒト以外の
    哺乳動物を形質転換し、この哺乳動物においてＣＹＰ７
    を発現させることを含んでなる、ＣＹＰ７遺伝子を発現
    するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の作成法。
  5. 【請求項５】前記ミニ遺伝子がエキソンＩ〜VIおよびイ
    ントロンＩおよびIIを含んでなるものである、請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物で
    あって、その胚細胞および体細胞が組換えヒトコレステ
    ロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含み、該遺伝子
    は前記哺乳動物おいて該遺伝子の発現を制御するシス作
    用性の制御要素に作動可能に結合されており、これによ
    り前記哺乳動物における末梢血中コレステロール濃度お
    よび胆汁酸の産生に影響を与えるようにされた、ヒト以
    外のトランスジェニック哺乳動物。
  7. 【請求項７】前記のヒト以外の哺乳動物の染色体が、前
    記ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の
    コード配列と実質的に同一の内因性のコード配列を有す
    る、請求項６に記載の哺乳動物。
  8. 【請求項８】前記組換えヒトコレステロール７α−ヒド
    ロキシラーゼ遺伝子の転写が、内因性のヒトコレステロ
    ール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を制御する配
    列と同一の前記シス作用性の制御要素／プロモーターに
    よって制御される、請求項７に記載の哺乳動物。
  9. 【請求項９】前記遺伝子の転写を制御する前記シス作用
    性の制御要素が誘導性である、請求項７または８に記載
    の哺乳動物。
  10. 【請求項１０】その胚細胞および体細胞がヒトコレステ
    ロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子のヒトゲノムＣＹ
    Ｐ７の５′フランキング配列由来のプロモーター領域を
    含み、前記プロモーター領域がレポーター遺伝子に作動
    可能に結合されたものであり、前記プロモーター領域お
    よび前記レポーター遺伝子が胚段階の前記哺乳動物に導
    入されたものである、ヒト以外のトランスジェニック哺
    乳動物。
  11. 【請求項１１】ＣＹＰ７発現の制御に対する効果を検出
    するための薬剤のスクリーニング法であって、(a) 請
    求項１０に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動
    物を薬剤と接触させ、(b) 前記のヒト以外のトランス
    ジェニック哺乳動物におけるレポーター遺伝子の発現に
    対する効果をコントロールと比較して検出することを含
    んでなる、スクリーニング法。
  12. 【請求項１２】組換えコレステロール７α−ヒドロキシ
    ラーゼ遺伝子を含んでなる形質転換細胞であって、前記
    組換え遺伝子がこの遺伝子の発現を制御するシス作用性
    の制御要素に作動可能に結合されたものである、形質転
    換細胞。
  13. 【請求項１３】前記組換えコレステロール７α−ヒドロ
    キシラーゼ遺伝子配列が、ヒトコレステロール７α−ヒ
    ドロキシラーゼ遺伝子と実質的に相同である、請求項１
    ２に記載の細胞。
  14. 【請求項１４】前記組換えコレステロール７α−ヒドロ
    キシラーゼ遺伝子の転写が、内因性のヒトコレステロー
    ル７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写を制御する配列
    と同一の前記シス作用性の制御要素／プロモーターによ
    って制御される、請求項１２または１３に記載の細胞。
  15. 【請求項１５】前記遺伝子の転写を制御する前記シス作
    用性の制御要素が誘導性である、請求項１２〜１４のい
    ずれか一項記載の細胞。
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EP1235915B1 (en) * 1999-11-18 2009-05-27 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Transgenic mammals into which a period 1 promoter that confers rhythmical expression has been introduced
CN101591653B (zh) * 2008-05-27 2013-07-31 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 低表达cyp7a1的肝细胞及其构建方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1991015213A1 (en) * 1990-04-02 1991-10-17 The University Of Colorado Foundation, Inc. Side-chain hydroxylated cholesterol derivatives, agents for dissolution of cholesterol gallstones
JPH04144680A (ja) * 1990-10-05 1992-05-19 Asahi Chem Ind Co Ltd コレステロール７α―ヒドロキシラーゼ遺伝子およびその用途

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