JPH07298897A - ２つの標識プライマーを用いた標的核酸の生成、増幅及び検出方法並びにそれらを含有するｐｃｒキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び２つの
標識プライマーを用いた標的核酸の生成、増幅及び検出
方法、並びにこのような方法に有用な試験キット、標識
プライマー及びＰＣＲに必要とされる別の試薬を含有す
る試験キットを提供する。 【構成】 標的核酸についての２つのプライマー、１つ
以上のデオキシリボヌクレオチド−５′−三リン酸、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼコファクター
を使用する鋭敏な様式のＰＣＲにより、標的核酸が増幅
できる。両方のプライマーが同じ検出部分、例えば、放
射性同位体、酵素、アビジンもしくはビオチンで標識さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）及び２つの標識プライマーを用いた標的核酸
の生成、増幅及び検出方法に関する。またそれは、この
ような方法に有用な試験キット、標識プライマー及びＰ
ＣＲに必要とされる別の試薬を含有する試験キットに関
する。

【０００２】

【従来の技術】微量の核酸を検出するための技術は、増
幅技術にプローブを使用する高性能ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ、例えば、ＰＣＲの開発を包含するこの20
年間に亘って急速に進歩してきた。研究者らは、ヒトも
しくは動物の試験被検体中の疾病及び遺伝的特徴を検出
するためのこのような技術の価値を容易に認めてきた。
このような技術にプローブ及びプライマーを使用するこ
とは、相補性の概念、すなわち、相補的核酸（また核酸
対として既知である）の間の水素結合による二本鎖の核
酸の結合に基づいている。ＰＣＲは、非常に低濃度の標
的核酸を検出するための当該技術分野における著しい進
歩である。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許
第 4,683,195号、同第 4,683,202号及び同第 4,965,188
号明細書に記載されているとはいえ、この分野には急速
に膨張している大量の文献が存在する。

【０００３】増幅生成物を検出するのに使用できる適当
な検出可能な部分でＰＣＲに使用されるプライマーの１
つを標識せしめることは、普通のことになってきた。有
用な標識には、例えば、米国特許第 4,879,214号明細書
に記載されるような、放射性同位体類、蛍光部分、酵素
類又は特異的バインディング部分、例えば、アビジンも
しくはビオチンが挙げられる。ヨーロッパ特許第 0 443
748号明細書は、ゲノムＤＮＡの増幅におけるプライマ
ーへの同一又は異なる標識の使用が可能であることを言
及するが、しかしどのようにこれを行うか、又はどのよ
うな結果をそれが提供するのかは具体的に説明していな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】被検体中の最低濃度の
標的核酸を検出するためにＰＣＲの感度を改良すること
が、依然として必要とされ続けている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】ＰＣＲの感度は、標的核
酸の相補鎖に相補的である２つのプライマーの存在下で
標的核酸の変性鎖を増幅せしめる段階を含んで成る標的
核酸の生成方法であって、両方のプライマーが同じ検出
部分で標識されている方法をもって改良される。

【０００６】更に、標的核酸の検出方法は、 Ａ）標的核酸の変性鎖を、標的核酸の相補鎖に相補的で
ある２つのプライマーを含んで成るポリメラーゼ連鎖反
応試薬の存在下で、１つ以上のデオキシリボヌクレオチ
ド−５′−三リン酸と接触せしめる段階であって、両方
のプライマーが同じ検出部分で標識されている段階、 Ｂ）標識プライマーを用いて標的核酸鎖のプライマー伸
長生成物を形成せしめる段階、 Ｃ）得られたプライマー伸長生成物の鎖を変性せしめる
段階、 Ｄ）Ｂ）及びＣ）段階をＰＣＲサイクルとして少なくと
も１回以上繰り返す段階、並びに Ｅ）最終ＰＣＲサイクルの後で少なくとも１つの変性鎖
を検出する段階、を含んで成る。

【０００７】ポリメラーゼ連鎖反応についてのキット
は、 ａ）一組の、標的核酸の相補鎖に相補的な２つのプライ
マーであって、両方のプライマーが同じ検出部分で標識
されているもの、及び ｂ）少なくとも１つの更なるＰＣＲ試薬、を含んで成
る。

【０００８】

【具体的な態様】ポリメラーゼ連鎖反応を使用する核酸
の増幅及び検出についての一般的な原理及び条件はかな
り良く知られている。本発明は、試験被検体中の１つ以
上の標的核酸中に存在する１つ以上の特定の核酸配列の
増幅又は検出に向けられている。そのような被検体とし
ては、細胞もしくはウイルス材料、髪、体液、又は検出
可能である遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する別の
材料が挙げられる。検出の主目的が事実上診断である場
合、また本発明は、クローニングＤＮＡもしくはメッセ
ンジャーＲＮＡの能率を改良するために、又は化学的合
成より得られた核酸の混合物から大量の所望の配列を得
るために使用できる。

【０００９】本発明は、関与する反応段階の数に比例し
て指数関数的な量で、感染性病原体と関係がある少なく
とも１つの特定の核酸配列を生成するのに特に有用であ
る。生成物は、使用される特異的プライマーの末端に対
応する終端を有する別個の核酸二本鎖である。既知であ
るか、又は検出の標的とされる特定の核酸配列を含有す
ると推測されるものであれば、精製した、又は精製して
いない、いずれかの核酸供給源が出発物質として利用で
きる。更に、複数の標的核酸が、各特定の核酸について
対応する一連の標識プライマー及び検出手段を使用する
ことにより、同時に増幅及び検出できる。また、同じ核
酸中の複数の配列が増幅及び検出できる。

【００１０】検出しようとする核酸は、プラスミド類並
びにいずれかの供給源（例えば、細菌、酵母、ウイル
ス、植物及び高等動物、ヒト）由来の天然産ＤＮＡもし
くはＲＮＡを包含する多様な供給源より得ることができ
る。それは、既知方法を用いて、血液、末梢血液単核細
胞（ＰＢＭＣ）、組織材料もしくは当該技術分野で既知
である別の供給源を包含する様々な組織から抽出しても
よい。本発明は、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、ウイルスＲ
ＮＡ又は細菌もしくはウイルス感染細胞中に見いだされ
るＤＮＡ中に見いだされる標的核酸の増幅及び検出に特
に有用である。本発明は、各種細菌もしくはウイルスと
関係があるＤＮＡの存在の検出に特に有用である。

【００１１】「ＰＣＲ試薬」とは、いずれかのＰＣＲに
必須であるとみなされる試薬、すなわち、標的核酸につ
いての１つ以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ
ＮＡポリメラーゼコファクター並びに１つ以上のデオキ
シリボヌクレオチド−５′−三リン酸を称する。

【００１２】「プライマー」の語は、核酸鎖（すなわ
ち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘
導される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作
用できる、天然産又は合成的に生成されたオリゴヌクレ
オチドを称する。このような条件は、ヌクレオチド類
（例えば、４種の標準デオキシリボヌクレオシド−５′
−三リン酸）、ＤＮＡポリメラーゼ並びに適当な温度、
pH及びコファクターの存在を包含する。

【００１３】各プライマーが同一の検出標識で標識され
る。標識を付着せしめる方法及びプライマーを調製する
方法は、例えば、Agrawal 他，Nucleic Acid Res.,14,
6227〜45ページ（1986）、ビオチン標識に関する米国特
許第 4,914,210号明細書、酵素標識に関する米国特許第
4,962,029号明細書、並びにそこに記載された文献に記
載されているように、当該技術分野で周知である。また
有用な標識には、放射性同位体類、高電子密度試薬類、
色原体類、発蛍光団類、リン光部分、フェリチン及び別
の磁気粒子（米国特許第 4,795,698号及び同第 4,920,0
61号明細書参照）、化学ルミネセンス部分（例えば、ル
ミノール）、並びに別の特異的バインディング種（アビ
ジン、ストレプトアビジン、糖類及びレクチン類）が挙
げられる。好ましい標識は酵素類、放射性同位体類及び
特異的バインディング種（例えば、ビオチン）である。
有用な酵素は、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ類、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及び当
該技術分野で既知である別のものを包含し、そして既知
方法を用いてオリゴヌクレオチドに付着せしめることが
できる。

【００１４】標識が酵素、例えば、ペルオキシダーゼで
ある場合には、アッセイにおける幾つかの時点で、検出
可能な色素を提供するために過酸化水素及び適当な色素
生成性組成物が添加される。特に有用な色素生成性組成
物がヨーロッパ特許第 0 308236号明細書に記載され
る。

【００１５】好ましい態様では、両方のプライマーがビ
オチニル化され、そして増幅された核酸が、検出可能に
標識されたアビジンもしくはそれらの誘導体（例えば、
ストレプトアビジン）を用いて検出される。例えば、ア
ビジンは酵素と接合せしめられるか、又は既知技術を用
いて放射性同位体を有することができる。増幅された生
成物上のビオチンはアビジンと複合し、そして放射性、
比色もしくは化学ルミネセンス信号を検出するための適
当な検出技術が使用される。

【００１６】多数の有用なＤＮＡポリメラーゼが当該技
術分野で既知である。好ましくはポリメラーゼが、それ
が熱に対して安定であり且つ高温、特にＤＮＡ鎖の変性
に使用される高い温度で活性であることを意味する「熱
安定性」である。より詳細には、熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼは、本明細書に記載されるようなＰＣＲで使用さ
れる高い温度により実質的に不活性化されない。

【００１７】本明細書で用いられる捕捉「プローブ」と
は、標的核酸の１つ以上の鎖の核酸配列と実質的に相補
的であり、且つ増幅された核酸を不溶化するのに使用さ
れるオリゴヌクレオチドである。一般的にはプローブオ
リゴヌクレオチドは、適当な水不溶性支持体、例えば、
ポリマーもしくはガラスビーズ、マイクロタイタープレ
ートウェル、薄いポリマーもしくはセルロースフィルム
又は当業者に容易に明らかな別の材料に付着される。

【００１８】数多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが従
来技術文献に報告されており、それらには米国特許第
4,965,188号及び同第 4,889,818号明細書に詳細に言及
されたものを包含する。ＤＮＡポリメラーゼコファクタ
ーとは、酵素が活性について依存する非タンパク質化合
物を意味する。従って、酵素はコファクターの存在なく
しては触媒的に不活性である。コファクターとポリメラ
ーゼとの相互作用の正確なメカニズムは現時点では未知
である。数多くのこのような材料が、マグネシウム及び
マグネシウム化合物を包含する既知コファクターであ
る。

【００１９】またＰＣＲに必要とされるものは、デオキ
シリボヌクレオチド−５′−三リン酸、例えば、dATP、
dCTP、dGTP、dUTPもしくはdTTPである。通常、dATP、dC
TP、dGTP及びdTTPがすべてＰＣＲに使用される。また類
似体類、例えば、dITP及び７−ジアザ−dGTPが有用であ
る。

【００２０】標的核酸（すなわち、増幅又は検出しよう
とするもの）は、前記種々供給源のいずれかより得るこ
とができる。一般的にはそれは、それをプライマー及び
別のＰＣＲ試薬と接触可能にする何らかの方法で抽出さ
れる。これは、通常適当な方法で被検体から望ましくな
いタンパク質及び細胞性物質を除去することを意味す
る。様々な方法が当該技術分野で既知である。

【００２１】ＰＣＲで形成されたプライマー伸長生成物
は、ハイブリダイゼーション生成物として、又は検出の
ために１つもしくは両方の鎖のどちらかを変性せしめる
か、あるいは更にＰＣＲサイクルを循環せしめて、適当
な方法で検出できる。ハイブリダイゼーションプライマ
ー伸長生成物が変性される場合には、ＰＣＲは、プライ
マー伸長生成物を形成するサイクルを更に数回実施しそ
して所望の通りに変性を実施することができる。一般的
には、少なくとも20回のサイクルが実施され、20〜50回
のサイクルが好ましい。２つの標識プライマーが各サイ
クルに使用される。

【００２２】アッセイにおける最終回の変性が終了した
後、最終プライマー伸長生成物は下記のように検出でき
る。好ましくは本発明の増幅方法は、反応混合物が、所
望の設定時間について調整された方法でサイクルにかけ
られる温度であるために連続自動方法で遂行される。或
る通常の当業者が既知であるように、数多くの機器がこ
の目的で開発されてきた。この目的についてのそのよう
な機器の１つが、幾分詳細に米国特許第 4,965,188号明
細書及びヨーロッパ特許第 0 236 069号明細書に記載さ
れている。

【００２３】使い捨て化学試験パックで増幅反応を処理
するのに好ましい機器は、幾分詳細にヨーロッパ特許第
0 402 994号明細書に記載されている。またヨーロッパ
特許第 0 402 994号明細書は、その同じ刊行物に記載さ
れる機器を用いて処理できる有用な化学試験パックの詳
細を提供する。またそこに記載されるものは、本発明方
法に適当な繰り返し間隔で（すなわち、サイクルを通し
て）試験パックを加熱及び冷却する手段である。

【００２４】検出しようとする増幅生成物のために、そ
れを反応媒体中の別の物質から分離することは有用であ
る（しかし必須ではない）ことが多い。これは数多くの
方法のいずれかにより行われるが、しかし好ましくは、
その方法で複製されるプライマー伸長生成物が水不溶化
せしめられ且つ試薬混合物から取り出せるので、水不溶
性捕捉プローブを用いることにより行われる。プローブ
は適当な方法で水不溶性材料に付着できる。

【００２５】増幅生成物は、それに相補的なオリゴヌク
レオチドを用いることにより望ましくない材料から分離
できる。オリゴヌクレオチドは、既知付着技術を用いて
不溶性支持体（例えば、ポリマーもしくは磁気粒子）に
付着せしめられて捕捉プローブ（前記）を形成する。こ
のような技術の１つがヨーロッパ特許第 0 439 222号明
細書に記載されている。別の技術が、捕捉オリゴヌクレ
オチド及び増幅された核酸が合わさった複数成分のハイ
ブリダイゼーション生成物に、いかにして中間体オリゴ
ヌクレオチドが使用されるかについて、例えば、米国特
許第 4,713,326号明細書、WO-A-88/01302 及びヨーロッ
パ特許第 0 070 687号明細書に記載されている。分離
は、遠心又は混合物を磁界に委ねることにより達成でき
る。

【００２６】別の有用な分離手段は、微孔質濾過膜、例
えば、Pall Corp.市販のポリアミド膜（例えば、 LOPRO
DYNE（商標）もしくは BIODYNE（商標）膜）である。そ
れらは、何も被覆しないで、又は界面活性剤もしくは分
析方法を促進する別の材料で予め被覆して使用すること
ができる。

【００２７】いずれかの有用な固体支持体が、検出のた
めに水不溶性生成物を分離する際に使用でき、それらに
は、マイクロタイタープレート、試験管、ビーカー、ビ
ーズ、フィルム、薄膜フィルター、濾紙、ゲル、磁気粒
子もしくはガラスウールが挙げられる。それは、ガラ
ス、セラミック、金属、天然産もしくは合成ポリマー、
セルロース材料、フィルター材料及び通常の当業者に容
易に明らかである別のものを包含する数多くの材料から
製造できる。特に有用な固体支持体材料は、一般に平均
粒子径 0.1〜10μｍを有するポリマービーズである。

【００２８】また検出は、捕捉プローブを平らな支持体
（例えば、前記微孔質濾過膜）上に、又は薄いポリマー
フィルム、フィルム積層体、非コーティング紙もしくは
コーティング紙の上に固定化することにより実施でき、
多数のそのようなものが当該技術分野で既知である。こ
のような材料についての別の詳細な事項がヨーロッパ特
許第 0 408 738号明細書に提供される。

【００２９】

【実施例】以下の例は本発明の実施を具体的に説明する
ために包含する。すべてのパーセンテージが特に断らな
い限り重量％である。実施例についての材料及び方法 ：サーマス・アクアティ
クス（Thermus aquaticus)由来の組換えＤＮＡポリメラ
ーゼを、約 250,000単位／タンパク質１mgの活性を有す
るように、特願平3-0280052 号明細書（1991）に記載さ
れるように調製した。活性は、酵素を得るための供給源
及び方法に依存して変更できる。

【００３０】例１に使用したプライマー及びプローブ
は、既知出発材料及び方法を用いて、BIOSEARCH (商標)
Model 8700 ＤＮＡ合成装置を用いて製造した。それ
らは以下の配列を有した。 配列番号：１： 5′-X-CAGCACCATC CTCCTCTTCC TCTGG-3′ 配列番号：２： 5′-X-GAGGCTATTG TAGCCTACAC TTTGG-3′

【００３１】２つの先のプライマーは、サイトメガロウ
イルスＤＮＡの「主働即時（majorimmediate early)」
ＭＩＥ遺伝子中の核酸配列の相補鎖に相補的である。以
下の２つのプライマーは、サイトメガロウイルスＤＮＡ
の「晩発（late) 」（ＬＡ）遺伝子中の核酸配列の相補
鎖に相補的である。 配列番号：３： 5′-X-GTCGCCTGCA CTGCCAGGTG CTTCG-3′ 配列番号：４： 5′-X-CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT-3′ これらの配列では、Ｘは、米国特許第 4,914,210号明細
書の技術を用いて２つのテトラエチレングリコールスペ
ーサー単位及び３−アミノ− 1,2−プロパンジオールを
介して配列に付着せしめたビオチン部分を表す。

【００３２】捕捉プローブに使用したオリゴヌクレオチ
ドは以下のものであった。 配列番号：５： 5′-Y-GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC-3 ′ 配列番号：６： 5′-Y-GTGGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT-3 ′ 上式中、Ｙは、前記 Levenson 他の特許の方法を用いて
製造したポリエチレングリコール（分子量 600）スペー
サー及び３−アミノ− 1,2−プロパンジオール部分であ
る。

【００３３】第１オリゴヌクレオチドはＭＩＥ遺伝子配
列に向けられており、一方第２オリゴヌクレオチドはＬ
Ａ遺伝子配列に向けられていた。また、以下の配列のオ
リゴヌクレオチドを有する、例２についての更なる捕捉
プローブを製造した。 配列番号：７： 5′-GACACAGTGT CCTCCCGCTC CTCCTGAGCA-Y-3 ′ 配列番号：８： 5′-GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG-Y-3 ′ 第１捕捉プローブオリゴヌクレオチドはＭＩＥ遺伝子配
列に相補的であり、一方第２捕捉プローブオリゴヌクレ
オチドはサイトメガロウイルスＤＮＡのＬＡ遺伝子配列
に相補的である。

【００３４】例１ サイトメガロウイルスと関係がある
ＤＮＡの増幅及び検出 本例は、二組の標識プライマーを用いてサイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）と関係があるＤＮＡを増幅及び検出す
るための本発明の実施を具体的に説明するものである。
またそれは、本発明の実施と、一組のプライマーの１つ
のプライマーのみを標識した対照実験との比較を示すも
のである。

【００３５】Towne strain由来の精製ＣＭＶ ＤＮＡ
（1:500 希釈物）を、Perkin Elmer市販のTHERMOCYCLER
（商標）を用いてミクロ遠心管（容量 250μＬ）中で増
幅した。４種のプライマー（配列番号：１〜配列番号：
４の各々について１マイクロモル）を、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（10ミリモ
ル）、塩化カリウム（50ミリモル）、塩化マグネシウム
（10ミリモル）、ゼラチン（100μg/mL) 、前記サーマ
ス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（10単位）及び
dNTP類（各々 1.5ミリモル）と混合してＰＣＲ試薬組成
物を生成した。

【００３６】下記一連の段階のサイクルを33回行うこと
でＰＣＲを実施した。98℃で30秒間変性せしめる段階、
55℃で90秒間標的核酸鎖をプライミングせしめる段階、
72℃で 120秒間プライマー伸長生成物を形成せしめる段
階。最終回のプライマー伸長処理は、70℃で15分間実施
した。ＰＣＲ処理工程における記載時間は、約15〜60秒
間の或る温度から別の温度へ移動させるための時間を含
まない。冷却時間は、より高い温度への加熱時間よりも
わずかに長かった。

【００３７】得られた増幅標的核酸を、市販 SURECELL
（商標）使い捨て試験デバイス（Eastman Kodak Compan
y)の試験ウェル中の LOPRODYNE（商標）微孔質ポリアミ
ド膜（孔径５μＬ，Pall Corp.) の異なる領域に固定化
された捕捉プローブを用いたハイブリダイゼーションに
よってビオチニル化生成物を捕捉することにより検出し
た。プローブは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドを用いてポリ〔スチレン−
コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕
（モル比 97.6:2.4 ）の粒子（平均直径 1.4μｍ）に共
有結合せしめた配列番号：５及び配列番号：６で同定さ
れるオリゴヌクレオチドから成るものであった。各プロ
ーブを、２μＬ中0.25％分散体として膜の異なる領域に
置いて30分間乾燥させた。

【００３８】増幅生成物（１：20希釈物，５μＬ）を、
95℃で５分間最終変性処理後に、前記塩化物及びゼラチ
ンを含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
塩酸塩（10ミリモル，pH８）緩衝剤（95μＬ）の１：10
希釈物中に捕捉プローブを含有する試験ウェルに添加し
た。生成物を、捕捉プローブに対して５分間42℃でハイ
ブリダイゼーションした。次いで55℃で、またデシル硫
酸ナトリウム（１％）を含有するＳＳＰＥ緩衝剤（Sigm
a Chemical Co., 250μＬ）の１：10希釈物の洗浄溶液
で膜を洗浄した。

【００３９】ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ接合体（ 126μL/L ）カゼイン（ 0.5％）及び
メルチオレート防腐剤（ 0.5％）を含有する組成物（50
μＬ）を試験ウェルに添加し、そして室温で２分間膜上
でビオチニル化生成物と反応せしめた。未結合材料を、
55℃の洗浄溶液（ 250μＬ）で洗い流した。

【００４０】次いで粒子上の捕捉生成物を、ロイコ色素
を（ 0.1％溶液を調製するために）リン酸ナトリウム緩
衝剤（５ミリモル）中ポリ（ビニルピロリドン）（20
％）の溶液に分散せしめることにより調製した 4,5−ビ
ス（４−メトキシフェニル）−２−（ 3,5−ジメトキシ
−４−ヒドロキシフェニル）イミダゾール ロイコ色素
の分散体（ 100μＬ）と接触せしめ、そして得られた分
散物をリン酸ナトリウム緩衝剤中過酸化水素（10ミリモ
ル）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）
及びジエチレントリアミン五酢酸（10マイクロモル）の
溶液に添加して、最終濃度１％ポリマー及び 0.005％ロ
イコ色素となるようにした。

【００４１】色素生成に２分間かけ、その後アジ化ナト
リウム（ 0.1％）の溶液（ 100μＬ）を添加した。次い
で膜上の可視色素濃度を０（色素なし）から10（最高濃
度）までの較正色濃度スコアと比較した。ＭＩＥ遺伝子
配列についてのビオチニル化プライマーを１つだけ用い
たことを除いて（ビオチン部分を担持しない配列番号：
１を使用した）、同様の様式で対照実験を実施した。同
時に実施した２つのアッセイの結果を下記表に提供す
る。対照１及び２は同じ実験の別個の実験操作である。

【００４２】

【表１】

【００４３】例２ 各増幅鎖についての捕捉プローブを
用いた増幅及び検出 増幅標的核酸配列の各鎖について捕捉プローブを使用し
たことを除いて、本例は例１と同様である。SURECELL
（商標）使い捨て試験デバイスの試験ウェル中の微孔質
膜を、配列番号：５及び配列番号：７のオリゴヌクレオ
チド（各々 0.125％）を有する捕捉プローブの分散物の
混合物をそれらの異なる領域に添加しそして乾燥せしめ
たことを除いて同様に調製した。配列番号：６及び配列
番号：８のオリゴヌクレオチド（各々 0.125％）を有す
る捕捉プローブの分散物の混合物を膜の異なる領域に置
きそして乾燥せしめた。

【００４４】同時に実施した２つのアッセイの結果及、
並びに別の日に同じ標的核酸試料（１：500 希釈物）を
用いて実施した重複アッセイの結果を下記第II表に示
す。これらの結果は、各増幅標的核酸鎖についての捕捉
プローブの使用が優れた感度を提供したことを示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】

【発明の効果】本発明は、増幅又は検出しようとする標
的核酸の各核酸配列についての２つの標識プライマーの
使用によってＰＣＲにおける改良された感度を提供す
る。両プライマー上の標識は、増幅された標的核酸の検
出に使用される。

【００４７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 CAGCACCATC CTCCTCTTCC TCTGG

【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 GAGGCTATTG TAGCCTACAC TTTGG

【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 GTCGCCTGCA CTGCCAGGTG CTTCG

【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT

【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC

【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 GTGGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT

【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 GACACAGTGT CCTCCCGCTC CTCCTGAGCA

【００５４】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ（オリゴヌクレオチ
ド） ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer 配列 GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的核酸の相補鎖に相補的である２つの
   プライマーの存在下で標的核酸の変性鎖を増幅せしめる
   段階を含んで成る標的核酸の生成方法であって、両方の
   プライマーが同じ検出部分で標識されている方法。
2. 【請求項２】 標的核酸の検出方法であって、 Ａ）標的核酸の変性鎖を、標的核酸の相補鎖に相補的で
   ある２つのプライマーを含んで成るポリメラーゼ連鎖反
   応（ＰＣＲ）試薬と接触せしめる段階であって、両方の
   プライマーが同じ検出部分で標識されている段階、 Ｂ）標識プライマーを用いて標的核酸鎖のプライマー伸
   長生成物を形成せしめる段階、 Ｃ）得られたプライマー伸長生成物の鎖を変性せしめる
   段階、 Ｄ）Ｂ）及びＣ）段階をＰＣＲサイクルとして少なくと
   も１回以上繰り返す段階、並びに Ｅ）最終ＰＣＲサイクルの後で少なくとも１つの変性鎖
   を検出する段階、を含んで成る方法。
3. 【請求項３】 ポリメラーゼ連鎖反応についてのキット
   であって、 ａ）一組の、標的核酸の相補鎖に相補的な２つのプライ
   マーであって、両方のプライマーが同じ検出部分で標識
   されているもの、及び ｂ）少なくとも１つの更なるＰＣＲ試薬、を含んで成る
   キット。