JPH0730119B2 - エグリン及びその製造方法並びにそれを含有する医薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、エグリンと称されるプロテアーゼ阻害物質
をコードするDNA配列、このDNA配列を含有するハイブリ
ドベクター、このハイブリドベクターにより形質転換さ
れた宿主、この形質転換された宿主により生産される、
プロテアーゼ阻害活性を有する新規なポリペプチド、並
びにこれらのDNA配列、ハイブリドベクター及び形質転
換された宿主の製造方法、及び形質転換された微生物に
よるエグリンの製造方法に関する。

エグリンＢ及びエグリンＣと称される、ヒル 〔ヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinalis）か
ら単離された２種類のプロテアーゼ阻害物質がヨーロッ
パ出願公開第2808396号に記載されている。このポリペ
プチドは約70個のアミノ酸から成り、約8,100の分子量
を有し、そしてキモトリプシン、ズブチリシン、動物及
びヒトの顆粒球プロテアーゼであるエラスターゼ及びカ
テプシンＧ、並びにマスト細胞プロテアーゼであるチマ
ーゼ（Chymase）（１）に対する強い阻害物質である。

エグリンＣは次の一次構造を有する（２）。

エグリンＣは、ほとんどの公知のプロテアーゼ阻害物質
と異りジスルフィルド橋を含有せず、そしてミニ蛋白質
であるために酸、アルカリ又は熱による変性、及び蛋白
質分解性破壊に対して非常に安定であることが証明され
ている。エグリンＢの一次構造は、35位のアミノ酸であ
るチロシンがヒスチジンにより置き換えられていること
によってエグリンＣのそれと区別される。

エグリンは、ヒト及び動物の顆粒球エラスターゼ、並び
にヒト顆粒球カテプシンＧ及びズブチリシン型の細菌性
プロテアーゼに対する、現在知られている最も強力な阻
害物質に属する。生物におけるこれらの細胞性プロテア
ーゼの制御されない又は過剰な放出は、炎症過程を強化
し、そして非特異的な蛋白質分解により組織破壊を惹起
することができる。これは特に、これらの細胞間消化の
ために機能する酵素は生理的（中性ないし弱塩基性）環
境下で最適に作用し、そして内因性組織物質（例えば、
エラスチン）及び液性因子（例えば、血液凝固因子及び
補体因子）を急速に破壊しそして不活性化することに基
ずく。これらの今まで知られている性質に基いて、エグ
リンは医療における用途（抗炎症、消炎、敗血症シヨッ
ク、肺気腫、膵臓線維症等）に大きな関心がよせられて
いる。

ヒルにおいては、エグリンは非常に少量（約16μg/ヒ
ル）のみ生産されている。従って、ヒルからのエグリン
の単離及び精製は長時間と多くの費用を必要とし、そし
てこれを商業的規模で実施することはできない。

いわゆる組換DNA技法（又は遺伝子工学）の大きな進歩
に基いて、現在では種々の生理活性ポリペプチドをこの
技法を用いて製造することが可能である。

この発明は、遺伝子工学的手段を用いて、エグリンを工
業的規模で微生物的に製造することを可能にする発現系
を用いるという課題を基礎にしている。この課題は、こ
の発明において、エグリンをコードするDNA配列を含有
するハイブリドベクターであって、該ベクターにより形
質転換された宿主が該エグリンを発現するように該DNA
配列が発現制御配列により制御されているベクターを造
成することによって解決される。

エグリンをコードするDNA配列の調製 この発明は、エグリン、例えばエグリンＢ及び特にエグ
リンＣ、又は変形されたエグリン、例えば変形されたエ
グリンＢ又は特に変形されたエグリンＣ（エグリン活性
を保持しながらエグリンの一次構造を短縮することによ
り変形されている）をコードするDNA配列、及びその断
片に関する。

「エグリン」なる一般的記載は、この発明の範囲内にお
いて、特にことわらない限り、蛋白質分解酵素阻害活性
を有し、一次構造がエグリンＡ又はエグリンＢの一次構
造とかなりの程度（一般に80％までの構造相同性）一致
しており、しかしながらＮ末端が変形、例えばスレオニ
ンにおいてＮ^α‐アセチル化、Ｎ^α‐メチオニル化又は
Ｎ^α‐アセチルメチオニル化されていてもよいポリペプ
チドを意味する。

変形されたエグリンにおいて、この変形は好ましくは天
然エグリンの一次構造の短縮、例えばＮ末端側の１〜10
個、特に１〜６個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜
６個、特に２個のアミノ酸の短縮から成り、さらにＮ末
端において変形されているもの、例えばアセチル化及び
メチオニル化、又はN-アセチルメチオニル化されている
ものも含まれる。

この発明はさらに、エグリン、例えばエグリンＢ及び特
にエグリンＣ、又は変形されたエグリン、例えば変形さ
れたエグリンＢ又は変形されたエグリンＣをコードする
DNA配列、及びその断片の製造方法に関し、この方法
は、ヒルのゲノムDNAからエグリン構造遺伝子を分離
し、又はエグリンmRNAから相補的二重鎖エグリンDNA
（エグリン‐ds cDNA）を製造し、そして変形されたエ
グリンをコードするDNA配列を製造するために、ゲノム
性エグリン構造遺伝子又はエグリン‐ds DNAを適当なヌ
クレアーゼで処理し、あるいは対応する（変形された）
エグリン構造遺伝子又はその断片を化学的及び酵素的方
法により製造することを特徴とする。

ゲノム性エグリンDNA及びエグリン‐ds cDNAは、例えば
それ自体公知の方法により得られる。すなわち、ゲノム
性エグリンDNAは例えばエグリン遺伝子を含有するヒル
のジーンバンクから得る。この方法においては、ヒルの
DNA断片を微生物にクローニングし、そしてエグリンDNA
を含有するクローンを、例えばコロニーハイブリダイゼ
ーションにより、エグリンDNAに特異的な放射性ラベル
オリゴヌクレオチド（少なくとも15、好ましくは15〜30
のデオキシヌクレオチドを含有する）を用いて同定す
る。こうして得られたDNA断片は一般にエグリン遺伝子
のほかに不所望のDNA成分をさらに含有しており、このD
NA成分は適当なエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレア
ーゼで処理することにより除去することができる。

二重鎖エグリンcDNAは、例えば次のようにして調製する
ことができる。適当な、好ましくはエグリンの生産のた
めに誘導されたヒルの細胞からmRNAを得、こうして得ら
れたmRNA混合物をそれ自体公知の方法によりエグリンmR
NAについて濃縮し、このmRNAを鋳型として用いて単鎖cD
NAを調製し、そしてRNA依存性DNAポリメラーゼによりds
cDNAを合成し、そしてこれを適当なベクターにクロー
ニングする。エグリンcDNAを含有するクローンは、例え
ば前記のようにして、エグリンDNAに特異的な放射性ラ
ベルオリゴヌクレオチドを用いるコロニーハイブリダイ
ゼーションにより同定する。

変形されたエグリンをコードするDNA配列を調製するた
めに、得られたゲノム性エグリンDNA又はエグリンcDNA
を、Ｎ末端又はＣ末端エグリンアミノ酸をコードするDN
A片を開裂せしめる適当なエキソヌクレアーゼ及び／又
はエンドヌクレアーゼにより処理することができる。

このようにして得られたゲノム性エグリンDNA、又はエ
グリンcDNAには好ましくは、５′末端及び３′末端にお
いて化学的に合成したアダプターオリゴヌクレオチドを
連結する。このオリゴヌクレオチドは１個又は複数個の
制限酵素の認識配列を含有し、適当なベクターへの導入
を容易にする。さらに、エグリンDNA又はエグリンcDNA
の５′末端用のアダプター分子は翻訳開始シグナル（AT
G）を含有していなければならない。この翻訳開始シグ
ナルは、このすぐ後にエグリンの第一アミノ酸をコード
するコドンが続くように配置されなければならない。

天然エグリン遺伝子は知られておらず、そして近年の合
成の可能性を基礎にして、そして特に時間的な考慮を行
って、エグリン遺伝子の化学合成が有利であるため、こ
の発明の好ましい態様を後者について説明する。

エグリン遺伝子の化学合成 この発明は特に、エグリンもしくは変形されたエグリン
の構造遺伝子又はその断片の製造方法に関し、この方法
はエグリン又は変形されたエグリンのコード鎖及び相補
鎖のセグメントを化学的に合成し、そして得られたセグ
メントをエグリンもしくは変形されたエグリンの構造遺
伝子又はその断片に酵素的に誘導することを特徴とす
る。

この発明はさらに、エグリン、例えばエグリンＢもしく
はエグリンＣ、変形されたエグリン、例えば変形された
エグリンＢもしくは変形されたエグリンＣ、又はこれら
の断片をコードする二重鎖DNAに関する。

この発明のDNAはさらに、エグリン又は変形されたエグ
リンのコドンのほかに、適当な宿主細胞例えばE.コリで
の発現を可能にする翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグ
ナル、並びにベクターへの導入に適する末端ヌクレオチ
ド配列を含有する。

この発明の好ましい態様においては、DNAは、５′末端
における制限酵素により切断され得るヌクレオチド配列
とそれに続く翻訳開始シグナル、エグリン又は変形され
たエグリンのコドン（場合によっては１又は複数ケ所に
おいて制限酵素により切断され得る）、翻訳終止シグナ
ル、及び３′末端における制限酵素により切断され得る
ヌクレオチドを含有する。この発明において使用する制
限酵素は、例えばEcoRI、BamHI、HpaII、PstI、AVaI、
又はHindIIIである。

この発明は特に、次の式（Ｉ）で表わされるヌクレオチ
ド配列及び相補的ヌクレオチド配列から成る、エグリン
をコードする二重鎖DNA、並びにこの二重鎖DNAの断片を
含む。

式中、５′末端から始まるヌクレオチドが示されてお
り、そして一層よく理解されるために各トリプレットに
よりコードされるアミノ酸が示されており； Ｄ直接結合又はエグリンのＮ末端側アミノ酸をコードす
るヌクレオチドであり、そしてＢは直接結合又は対応す
るＮ末端側アミノ酸であり、そして次の群、 から選ばれ；そして Ｄ′は直接結合又はエグリンのＣ末端側のアミノ酸をコ
ードするヌクレオチドであり、そしてＢ′は直接結合又
は対応するＣ末端側アミノ酸であり、そして次の群、 から選ばれ；そして Ａはデオキシアデノシルであり、 Ｔはチミジルであり、 Ｇはデオキシグアノシルであり、 Ｃはデオキシシチジルであり、 ＸはA,T,C又はＧであり、 ＹはＴ又はＣであり、 ＹがＣの場合、ＺはA,T,C又はＧであり、 ＹがＴの場合、ＺはＡ又はＧであり、 ＱはＴ又はＡであり、 ＱがＴの場合、ＲはＣであり、そしてＳはA,T,C又はＧ
であり、 ＱがＡの場合、ＲはＧであり、そしてＳはＴ又はＣであ
り、 ＭはＡ又はＧであり、 ＬはＡ又はＣであり、 ＬがＡの場合、ＮはＡ又はＧであり、 ＬがＣの場合、ＮはA,T,C又はＧであり、 ＭがＡの場合、ＫはＡ又はＧであり、 ＭがＧの場合、ＫはＡであり、 ＷはTyr又はHisであり； そして、(X)_n及び(X)_mはそれぞれｎ及びｍが３以上100
以下、好ましくは５以上12以下であるヌクレオチドであ
り、そして制限酵素により認識されそして切断され得
る。

この発明は特に、ＤがYTZ AAM QRS TTY、QRS GAM YTZ A
AM QRS TTY、及び ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM Q
RS TTYから成る群から選ばれたヌクレオチド配列であ
り、そしてＤ′がヌクレオチド配列CAY GTX CCX CAY GT
X GGXであり、そしてその他の記号は式（Ｉ）について
前記した意味を有する式（Ｉ）のエグリンコード二重鎖
DNAに関する。

この発明は特に、Ｄがヌクレオチド配列ACX GAM TTY GG
X QRS GAM YTZ AAM QRS TTYであり、そしてＤ′がヌク
レオチド配列CAY GTX CCX CAY GTX GGXであり、そして
その他の記号が式（Ｉ）について前記した意味を有する
式（Ｉ）のエグリンコード二重鎖DNAに関する。

好ましい態様において、DNA配列は５′末端にEooRIによ
り切断されるヌクレオチド配列を、中間にHpaIIにより
切断されるヌクレオチド配列を、そして３′末端にBamH
Iにより切断されるヌクレオチド配列を含有する。

この発明は特に、エグリン又は変形されたエグリンのア
ミノ酸をコードする、E.コリ（E.coli）にとって好まし
いトリプレットを含有する二重鎖DNAを含む。このよう
なトリプレットは次の通りである。

グリシン（Gly） GGT アラニン（Ala） GCT バリン（Val） GTT ロイシン（Leu） CTG セリン（Ser） TCT スレオニン（Thr） ACT フェニルアラニン（Phe）TTC チロシン（Tyr） TAC メチオニン（Met）ATG アスパラギン酸（Asp） GAC グルタミン酸（Glu） GAA リジン（Lys） AAA アルギニン（Arg） CGT ヒスチジン（His） CAT プローリン（Pro） CCG グルタミン（Gln） CAG アスパラギン（Asn） AAC この発明においては、フェニルアラニンについてはさら
にコドンTTTが使用され、そしてプローリンについてはC
CA又はCCTが使用され、５′末端のEcoRI切断部位、３′
末端のBamHI切断部位、及びHpaII切断部位のほかにはこ
れらの制限酵素のための他の切断部位を含有しない。好
ましい終止シグナル（NON）はコドンTAGである。

上記のように、エグリンＣの遺伝子の好ましい態様は次
の式（IIa）で表わされるDNAである。

エグリンＢの遺伝子の好ましい態様は次の式（IIb）のD
NAである。

変形された（Ｎ末端側が短縮された）エグリンC-ポリペ
プチドの遺伝子の好ましい態様は次の式（IIc）及び（I
Id）で表わされるDNAである。

上記の式において、A,T,G,Cは式（Ｉ）に記載した意味
を有し、そして一層の理解のため各トリプレットにより
コードされるアミノ酸、及び制限酵素の切断部位を示
す。

この発明はさらに、その末端が制限酵素により切断され
ることができ、そして完全エグリン遺伝子又は変形され
たエグリン遺伝子に組み立てることができるエグリン遺
伝子の二重鎖DNA断片を含む。エグリン遺伝子のこのよ
うな二重鎖DNA断片は特に30〜70の塩基対（bp）を有す
る。

例えば、この発明は、次の式（IIIa）〔F₁（Ｃ）〕のDN
AのDNA断片、式（IIIa′）〔F₁（Ｃ′）〕のDNA、式（I
IIa″）〔F₁（Ｃ″）〕のDNA、式（IIIb）〔F₁（Ｂ）〕
のDNA、及び式（IV）（F₂）のDNAを含む。

この発明はさらに、エグリン遺伝子及び変形されたエグ
リン遺伝子の単鎖DNA断片、特に化学的方法及び／又は
酵素的方法によってエグリン遺伝子又は変形されたエグ
リン遺伝子に組み立てられる断片を含む。この発明は特
に、20以上のヌクレオチド、特に20〜70ヌクレオチドを
有する単鎖DNA断片に関する。

DNAの合成方法は、S.A.Narang（11）により要約的に記
載されている。公知の合成技法により、約20塩基の長さ
を有するポリヌクレオチドを好収量で、高純度で、そし
て比較的短時間で製造することが可能である。適切に保
護されたヌクレオチドをホスホジエステル法（12）、さ
らに効率的なホスホトリエステル法（13）又はホスフィ
ト‐トリエステル法（14）により相互に連結する。オリ
ゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの合成は、固相法
を用いて単純化することが可能であり、この方法におい
ては、ヌクレオチド鎖が適当な重合体に結合される。イ
タクラ等（15）は、固相法において、個々のヌクレオチ
ドの代りに、ホスホトリエステル法により連結されたト
リヌクレオチドを使用している。このトリヌクレオチド
は短時間の内に良好な収率で、例えば31塩基を有するポ
リヌクレオチドに縮合せしめることができる。実際の二
重鎖DNAは、化学的に合成された短いセグメントから酵
素的に形成することができる。

Khorana等（16）はこのために、塩基対合により正しい
配置に組立てられそして酵素DNAリガーゼによって酵素
的に連結される両DNA鎖からのオーバーラップポリヌク
レオチド配列を用いている。他の可能性として、短いオ
ーバーラップセグメントを有する２つのDNA鎖からのポ
リヌクレオチド配列を、４種類の必要なデオキシヌクレ
オチドトリホスフェートの存在下で、DNAポリメラー
ゼ、例えばDNAポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのKleno
w断片、T₄DNAポリメラーゼ、又はAMV（鳥類骨髄球症ウ
イルス）逆転写酵素と共にインキュベートする。これに
より、両ポリヌクレオチド配列が塩基対合により正しい
順序に接着し、そして酵素により、必要なヌクレオチド
をもって完全な二重鎖に補完される。イタクラ等（18）
は、基本的にこの原理に基いて、DNAポリメラーゼＩ（K
lenow断片）の存在下で、39〜42塩基の長さの４個の化
学合成断片から132塩基対のヒト白血球インターフェロ
ンα₂遺伝子が構成し得ることを記載している。この方
法においては、リガーゼのみを用いる方法に比べて、化
学合成における40％の節約が達成される。

この発明は特に、エグリン又は変形されたエグリンをコ
ードし、宿主細胞における発現に適し、そしてその末端
がベクターへの導入を可能にするDNA、及びその断片の
製造方法に関し、この方法は、 （ａ）適切に保護されたデオキシヌクレオチドを固体担
体に結合せしめ； （ｂ）適切に保護されたジ‐、トリ‐又はテトラ‐ヌク
レオチドをホスホトリエステル法又はホスフィト法によ
り調製し； （ｃ）担体に結合したデオキシヌクレオチド又はオリゴ
デオキシヌクレオチドと、適切に保護されたモノヌクレ
オチド、又は（ｂ）に従って調製されたジ‐、トリ‐も
しくはオリゴヌクレオチドとを、ホスホトリエステル法
又はホスフィト法により連結し； （ｄ）（ｃ）により得られた、担体に結合した約20〜約
70塩基の長さのオリゴヌクレオチドを担体から切断し、
場合によっては精製し、保護基を除去し、そして遊離し
た５′末端ヒドロキシ基を燐酸化し； （e1）コード鎖及び相補鎖から成り、そして少なくとも
３個、好ましくは８〜15個のオーバーラップ塩基対を有
し、それぞれが約20〜約70塩基の長さを有する２個のオ
リゴヌクレオチドをアニールし、そしてDNAポリメラー
ゼを用いて４種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートの存在下で二重鎖DNAセグメント（エグリン遺伝子
又は変形されたエグリン遺伝子の断片）に補完し；そし
て場合によっては、適当な（ｄ）によって燐酸化された
末端を有する２個の二重鎖DNAセグメントを連結してエ
グリン又は変形されたエグリンの構造遺伝子とし、又は
得られた２個の二重鎖DNAセグメントを適当なベクター
にサブクローニングし、次に（ｄ）に従って燐酸化し、
そしてリガーゼにより連結してエグリン又は変形された
エグリンの構造遺伝子にするか；あるいはこの方法に代
えて、 （e2）例えば20〜70塩基の長さを有するコード鎖及び相
補鎖から成り、そしてそれぞれが少なくとも３個、好ま
しくは８〜15個のオーバラップ塩基対を有する２個のオ
リゴデオキシヌクレオチドをアニールし、DNAポリメラ
ーゼを用いて４種類のデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェートの存在下で補完し、そしてリガーゼを用いて連結
してエグリン又は変形されたエグリンの構造遺伝子にす
る。

この発明の方法はそれ自体公知であるが、しかしまず条
件の適切な組合わせにより、そしてこの発明の本質的な
改良により、エグリンをコードするDNAの製造を可能に
する。

段階（ａ）においては、種々の固体担体、例えば種種の
態様で架橋されており、そして種々の膨潤度を有するポ
リスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド
共重合体、無機材料、例えば珪藻土、シリカゲル、又は
アロックス上に吸着されたポリアミド、又は官能化され
たシランを用いることができる。この発明の好ましい態
様においては、固体担体として、架橋ポリスチレンを挙
げることができ、このものは「スペーサー」、例えばイ
ミノ、オキソ、チオ、オキソカルボニル又はアミドカル
ボニルのごとき極性二価官能基１〜５個により中断され
た炭素原子数２〜12個のアルキレン基を介して、適切に
保護されたデオキシヌクレオシドの５′‐OH基に連結さ
れる。特に好ましくは、５′‐位及び場合によっては塩
基部分が保護された式（Ｖ）のヌクレオチド（ここで、
R¹は酸により除去され得る保護基、例えばトリアリール
メチル保護基、例えば4-メトキシトリチル基もしくは4,
4′‐ジメトキシトリチル基、又はトリ低級アルキルシ
リル保護基、例えばtert-ブチルジメチルシリル基であ
り、そしてＢはチミル、シトシル、アデニル又はグアニ
ルから選ばれた保護されている場合がある塩基である）
と、無水コハク酸とを、場合によっては塩基、例えばピ
リジン、トリエチルアミン又はジメチルアミノピリジン
の存在下で反応せしめ、続いてカルボン酸基活性化試
薬、好ましくはN-ヒドロキシサクシンイミド、又はp-ニ
トロフェノール及び除水剤、例えばカルボジイミド、例
えばジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて、0.5〜
２％のジビニルベンゼンにより架橋されたアミノメチル
化ポリスチレンと反応せしめる〔反応方式（１）〕。

この反応は、不活性非プロトン溶剤、例えばピリジン、
テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、クロロ
ホルム、塩化メチレン、ジメチルホルムアミドもしくは
ジエチルアセトアミド、又はこれらの混合物中で、室温
又はわずかに高温もしくは低温において、例えば約−10
℃〜約50℃の温度において、好ましくは室温において、
除水剤の存在下ではさらに低温、例えば約０℃において
実施する。

段階（ｂ）に従うジ‐、トリ‐又はテトラヌクレオチド
の調製においては、５′位及び場合によっては塩基部分
において保護された式（Ｖ）のヌクレオシド（ここで、
R¹及びＢは前記の意味を有する）を、式（VII）の活性
化された燐酸エステル〔ここで、X¹及び及X²は相互に独
立にヒドロキシもしくはこれから誘導された塩、ハロゲ
ン、イミダゾリル、1,2,4-トリアゾール‐1-イル、テト
ラゾリル、又は1-ベンズトリアゾリルオキシであり、そ
してX²はさらにまた2-シアノエチルオキシ、2-トリハロ
エチルオキシ、2-アリールスルホニルエチルオキシ、2-
低級アルキルチオエチルオキシ、2-アリールエチルオキ
シ、又は2-（4-ニトロフェニル）‐エチルオキシであ
り、そしてR²は塩基又は求核剤、例えば水酸化アンモニ
ウム、チオフェノレート又はアリールアルドキシメート
により除去し得る保護基、例えば場合によってはハロゲ
ン、ニトロ及び／又は低級アルキルにより置換されたフ
ェニル、メチル、又は場合によってはニトロにより置換
されたベンジル、あるいは金属イオンにより除去され得
る保護基、例えば8-キノリル又は5-クロロ‐8-キノリル
である〕と、場合によっては除水剤の存在下、又は塩基
の存在下で反応せしめる。

次に、こうして生成した式（VIII）の化合物（ここで、
R¹，X²及びR²は前記と同じ意味を有する）を場合によっ
てはまず、X²を基OR³〔ここで、R³はシアノエチル、2-
トリハロエチル、2-アリールスルホニルエチル、2-低級
アルキルチオエチル、2-アリールチオエチル、又は2-
（4-ニトロフェニル）‐エチルである〕に転換する2-置
換エタノールと反応せしめ、そして次に保護基R¹を除去
し、そしてこうして得られた式（IX）の化合物を、式
（VIII）の他の化合物と、場合によっては除水剤の存在
下、又は塩基の存在下で反応せしめてジヌクレオチド
（Ｘ）を得る〔反応方式（２）〕。場合によっては、式
（VIII）の化合物を、塩基及び水との反応により式（VI
II）の他の化合物（ここで、X²はヒドロキシ又はこれか
ら誘導された塩である）に転換する。

反応は、前記の不活性溶剤中で、室温又はわずかに高温
もしくは低温において、例えば室温において実施する。

保護基R¹の除去は、例えば酸、例えば鉱酸、例えば塩酸
もしくは硫酸、カルボン酸、例えば酢酸、トリクロロ酢
酸もしくは蟻酸、スルホン酸、例えばメタンスルホン酸
もしくはp-トリエンスルホン酸、又は特にルイス酸、例
えば塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム、ジアルキ
ルアルミニウムハライド、例えばジブチルアルミニウム
クロリドもしくはジエチルアルミニウムクロリド、又は
三弗化硼素を用いて、10℃〜50℃の温度、特に室温にお
いて行う。ジアルキルアルミニウムハライドを使用する
場合には親脂性溶剤、例えばトルエン中で除去を行い、
そして上記のその他のルイス酸を使用する場合には、ハ
ロゲン化炭化水素、例えば塩化メチレンと、低級アルカ
ノール、例えばエタノール又はイソプロパノールとの混
合溶剤中で除去を行う。

式（Ｘ）のジヌクレオチドのこの発明による調製はま
た、式（Ｖ）のヌクレオシド〔ここで、R¹及びＢは前記
の意味を有する）と、式（VIIA）のホスフィト〔ここ
で、X¹はハロゲン、特に塩素であり、X²はハロゲン、特
に塩素、又はジ低級アルキルアミノ、特にジメチルアミ
ノもしくはジイソプロピルアミノ、又はモルホリノ、ピ
ペリジノ、又はピロリジノであり、そしてR²は式（VI
I）において前記した意味を有し、特にメチルである〕
とを、場合によっては適当な塩基の存在下で反応せしめ
ることによっても行われる。こうして得られた式（VIII
A）の化合物を、一方において、X²を基OR³（ここで、R³
は前記の意味を有する）に転換する2-置換エタノールと
反応せしめ、次に塩基の存在下で酸化剤、例えばヨウ素
により酸化してホスフェートを生成せしめ、そして保護
基R¹を除去して式（IX）の化合物を生成せしめる。他方
において、式（VIIIA）の化合物を式（IX）の化合物と
反応せしめ、次に塩基の存在下で酸化剤、例えばヨウ素
で酸化して式（Ｘ）の化合物を生成せしめる〔反応方式
（３）〕。

トリヌクレオチドを製造するためには、式（Ｘ）のジヌ
クレオチド（ここで、R¹，R²及びR³は上記の意味を存
し、そしてB¹及びB²は相互に独立にチミル、シトシル、
アデニル又はグアニルである）において、保護基R¹を除
去し、そして得られた化合物を、式（VIII）の化合物
と、場合によっては除水剤の存在下又は塩基の存在下で
反応せしめ、あるいは式（VIIIA）の化合物と反応せし
め、そして次に酸化して式（XI）の化合物を生成せしめ
る〔反応方式（４）〕。保護基R₁の除去、及び式（XI）
のトリヌクレオチドへの縮合は、式（Ｘ）のジヌクレオ
チドの調製の場合と同様にして行う。

テトラヌクレオチドをこの発明に従って調製するために
は、式XIのトリヌクレオチドを、式（Ｘ）のジヌクレオ
チドについて前記したのと同様にして反応せしめる。

この発明の好ましい態様においては、保護基R¹として4-
メトキシトリチル基を、保護基R²として塩素により置換
されたフェニル基、特に2-クロロフェニルを、そして保
護基R³として2-シアノエチル基を用いる。式（VII）の
化合物中の好ましい基X¹及びX²は1-ベンズトリアゾリル
オキシ基である。

式（XI）のトリヌクレオチドは好ましくは、式（Ｘ）の
ジヌクレオチド中の保護基R¹を除去し、そして得られた
化合物を、X²がヒドロキシ又はこれから誘導された塩で
ある式（VIII）の化合物と、除水剤の存在下で反応せし
める〔反応方式（４）〕。この発明の除水剤は、例えば
場合によってはニトロにより置換されている、2,4,6-ト
リメチル‐ベンゼンスルホニル‐もしくはトリイソプロ
ピル‐ベンゼンスルホニル‐クロリド、‐イミダゾリ
ド、テトラゾリド又は‐1,2,4-トリアゾリドである。好
ましい除水剤は次式（XII）、 で示される2,4,6-トリメチルベンゼンスルホニル‐3-ニ
トロ‐1,2,4-トリアゾリドである。

段階（ｃ）に従うオリゴヌクレオチドの調製において
は、半自動式又は全自動式の、マイクロプロセッサーに
より制御された溶剤及び試薬供給系を有する公知の装置
が使用される。段階（ａ）に従って調製された式（VI）
の化合物において、保護基R¹を上記のようにして除去
し、そして生成物を、次に式（VIII）の化合物と、又は
式（VIIIA）の化合物と、又は式（Ｘ）もしくは（XI）
の化合物〔保護基R³はあらかじめ塩基により除去されて
いる（R³としての2-シアノエチル基は、例えばトリ低級
アルキルアミン、例えばトリエチルアミンにより、前記
の不活性溶剤又は溶剤混合物中で、10℃〜40℃、例えば
室温において除去される）〕と、場合によって除水剤の
存在下、又は塩基の存在下で反応せしめる。この発明は
さらに、式（Ｘ）のジヌクレオチド又は式（XI）のトリ
ヌクレオチドのほかに、段階（ｂ）に従って調製された
テトラヌクレオチドを導入する反応を含む。

式（VIIIA）のホスフィトを用いる場合、次に酸化剤、
例えば塩基の存在下でのヨウ素により後処理する。こう
して調製したｎが１〜４の整数である次の式（XIII）、 （式中、R¹，R²及びＢは前記の意味を有し、そしてｎは
１〜４の整数である、） で表わされる化合物を、ｎが約19〜約69の最適に選択さ
れた数である式（XIII）が得られるまで、式（VI）の化
合物に関して前に記載した反応段階（R¹の除去；（VII
I），（VIIIA），（Ｘ），（XI）、又は対応するテトラ
ヌクレオチドとの反応；場合によっては酸化的後処理）
にゆだねる。

この発明の好ましい態様においては、保護基R¹として4-
メトキシトリチルを使用し、そしてCH-又はNH-酸化合
物、特に1,2,4-トリアゾール又はテトラゾールの存在下
で臭化亜鉛を用いて除去する。4-メトキシトリチル保護
基の除去の際の例えば1,2,4-トリアゾールの使用は新規
であり、そして驚くべきことに、これにより除去が急速
であり、高い収率が得られ、そして副反応が生じない。
臭化亜鉛及び1,2,4-トリアゾールを、20:1〜100:1のモ
ル比において、非プロトン性溶剤とアルコール、例えば
塩化メチレンと2-プロパノールとの混合溶剤中で使用す
るのが最も好ましい。

この発明の好ましい態様においては、保護基R¹が除去さ
れている式（VI）又は式（XIII）の化合物を、保護基R³
が除去されている式（XI）のトリヌクレオチドと、除水
剤、例えば場合によってはニトロで置換されている、2,
4,6-トリメチル‐又はトリイソプロピル‐ベンゼンスル
ホニル‐クロリド、‐イミダゾリド、‐テトラゾリド又
は‐1,2,4-トリアゾリドの存在下で反応せしめる。式
（XII）の2,4,6-トリメチルベンゼンスルホニル‐3-ニ
トロ‐1,2,4-トリアゾリドが特に好ましい。

保護基R¹として4-メトキシトリチル基を使用し、R¹の除
去のために1,2,4-トリアゾールの存在下で臭化亜鉛を使
用し、そして式（XIII）の脱保護されたオリゴヌクレオ
チド‐ポリスチレン樹脂と式（XI）の脱保護されたトリ
ヌクレオチドとの反応のための除水剤として式（XII）
のトリアゾールを使用することから成る特に好ましい組
合わせにより、驚くべきことに、約40〜約70塩基の長い
ヌクレオチド鎖を、短時間に、高い収率で、そして高純
度で調製することができる。

オリゴヌクレオチド鎖を担体から除去するため、及び段
階（ｄ）に従って保護基を除去するために、それ自体公
知の方法が使用される。担体からの除去のため、及び好
ましい2-クロロフェニル保護基の除去のための好ましい
試薬は、アリールアルドキシメート、例えば1,1,3,3-テ
トラメチルグアニジウム‐2-ニトロベンゼンアルドキシ
メートである。この反応は、前記の不活性溶剤（少量の
水が添加されている）、例えば95％ピリジン中で、室温
において行う。次に、室温、又は高温、例えば20℃〜70
℃、特に50℃において、アンモニア水溶液と反応せしめ
る。

この発明のオリゴヌクレオチドを連結するために、５′
‐末端ヒドロキシ基に燐酸基を導入する。燐酸基の導入
（燐酸化）は、それ自体公知の方法によりATPの存在下
でT₄ポリヌクレオチドキナーゼを用いて行う。

コードDNA鎖と相補DNA鎖とから成るこの発明に従って得
られたオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも３
個、好ましくは８〜10個のオーバラップ塩基対から成る
オーバラップ配列を含有する。このようなオリゴデオキ
シヌクレオチド対は、混合された場合に水素結合により
一体になる。突出した単鎖端は、段階（e1）及び（e2）
において、４種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ート（dATP,dCTP,dGTP及びdTTP）の存在下で、DNAポリ
メラーゼ、例えばDNAポリメラーゼＩ、DNAポリメラーゼ
ＩのKlenow断片もしくはT₄DNAポリメラーゼにより、又
はAMV逆転写酵素により第２の（相補的な）鎖を形成す
るためのマトリクス（鋳型）として機能する。相補的な
鎖の形成により生ずるデュプレックスDNA〔この場合特
に、（変形された）エグリン遺伝子の断片（方法e1）、
又は完全な（変形された）エグリン遺伝子（方法e2）で
ある〕は平滑末端を有する。

方法（e1）に従って調製された（変形された）エグリン
遺伝子の断片は、その末端に、制限エンドヌクレオチド
に認識され、そして切断され得るヌクレオチド配列を含
有する。ヌクレオチド配列の選択により、そして制限エ
ンドヌクレアーゼに応じて、切断の際に完全塩基対の末
端（平滑末端）又は突出DNA鎖を伴う末端（接着末端）
が生ずる。平滑末端を形成する制限エンドヌクレアーゼ
により処理されたDNA断片の連結により、又は接着末端
の塩基対形成及びそれに次ぐオーバーハングDNA鎖のDNA
断片の連結により前記の（変形された）エグリン構造遺
伝子が生成するように、制限認識配列を選択する。２個
の二重鎖DNA断片の連結には、ドナー断片における５′
‐末端燐酸基及びアクセプター断片における３′‐末端
ヒドロキシル基が必要である。得られるDNA断片は容易
に燐酸化され、そしてそれ自体公知の方法により、リガ
ーゼ、特にT₄DNAリガーゼを用いて連結される。

この発明の好ましい態様においては、上記のようにし
て、エグリンＣ遺伝子又はエグリンＢ遺伝子の断片、特
にエグリンＣ遺伝子の２個の断片、特に式（IIIa）及び
（IV）で示される断片F₁（Ｃ）及びF₂、そしてエグリン
Ｂ遺伝子の場合には時に式（IIIb）及び（IV）で示され
る断片F₁（Ｂ）及びF₂が調製される。必要に応じて適当
なベクターにサブクローニングすることができる断片
は、好ましくは各連結末端に制限エンドヌクレアーゼ、
特にHpaIIの認識配列を含有し、このためこの制限配列
による切断及び両断片の連結の後に正しいコードエグリ
ンDNA配列が生ずる。さらに、断片１は翻訳開始シグナ
ル（TAG）の前に、そして断片２は翻訳終止シグナル
（例えばTAG）後に（変形された）エグリン遺伝子、又
は（変形された）エグリン遺伝子断片の適当なベクター
への導入を可能にする追加の「末端」制限部位を含有す
る。

この発明は特に、式（IIIa）及び（IV）で示される２つ
の断片F₁（Ｃ）及びF₂からのエグリンC-遺伝子の製造に
関し、ここでこれらの断片は制限酵素HpaIIによる切断
及び連結の後に正しいエグリンC-DNA配列をもたらし、
そしてF₁（Ｃ）は翻訳開始シグナルの前にEcoRI制限部
位を有し、そしてF₂は翻訳終止シグナルの後にBamHI制
限部位を有する。

他の態様（段階e2）においては、コード鎖及び相補鎖か
ら成る２個のオリゴデオキシヌクレオチドを、少なくと
も１個、好ましくは８〜15個の塩基によりアニールし、
DNAポリメラーゼ、例えば前記の酵素により修復し、そ
してT₄DNAリガーゼで連結して（変形された）エグリン
構造遺伝子にする。

エグリン遺伝子をコードする発現ベクターの製造 この発明はさらに発現ベクターに関し、このベクター
は、該発現ベクターにより形質転換された宿主中でエグ
リン活性を有するポリペプチドが発現される様に発現制
御配列により制御されるエグリン又は変形されたエグリ
ンをコードする遺伝子を含有する。

この発明の発現ベクターは、エグリンＢ、変形されたエ
グリンＢ、変形されたエグリンＣ、又は特にエグリンＣ
をコードする配列を含有する。

この発明の発現ベクターは、例えば、エグリン又は変形
されたエグリンをコードするDNA配列を、発現制御配列
を含有するベクターDNAに、該発現制御配列が該DNA配列
を制御するように挿入することによって造成される。

適当なベクターの選択は、形質転換に使用される宿主細
胞に依存する。適当な宿主は、例えば微生物、例えば酵
母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（saccharomy
ces cerevisiae）、及び特に制限酵素及び修飾酵素を有
しない細菌株、特にエセリヒア・コリの菌株、例えばE.
コリX1776、E.コリHB101、E.コリW3110、E.コリHB101/L
M1035、E.コリJA221（37）、又はE.コリK12菌株294、バ
シルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシルス
・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophi
lus）、シュードモナス（Pseudomonas）、ヘモフィルス
（Haemophilus）、ストレプトコッカス（Streptococcu
s）等、並びに高等動物の細胞、特に樹立されたヒト又
は動物のセルラインである。E.コリの上記菌株、例えば
E.コリHB101及びE.コリJA221、さらにはサッカロミセス
・セレビシエーが宿主微生物として好ましい。

原則として、この発明のDNA配列を選択された宿主中で
複製し、そして発現せしめるすべてのベクターが適当で
ある。

例えば、エグリン遺伝子又は変形されたエグリンの遺伝
子をE.コリの菌株中で発現せしめるために適当なベクタ
ーとして、バクテリオファージ、例えばバクテリオファ
ージλの誘導体、又はプラスミド、例えばプラスミドco
l E1及びその誘導体、例えばpM89、pSF2124、pBR317も
しくはpBR322が挙げられる。この発明の好ましいベクタ
ーはプラスミドpBR322である。好ましいベクターは、完
全なレプリコン、及び発現プラスミドにより形質転換さ
れた宿主の選択及び同定を表現形質に基いて可能にする
マーカー遺伝子を含有する。好ましいマーカー遺伝子は
例えば、重金属，抗生物質等に対する耐性を宿主に付与
する。さらに、この発明の好ましいベクターは、レプリ
コン領域及びマーカー遺伝子領域のほかに制限エンドヌ
クレアーゼの認識部位を含有し、この部位にエグリン遺
伝子及び場合によっては発現制御配列を導入することが
できる。好ましいベクターであるプラスミドpBR322は無
傷のレプリコン、テトラサイクリン及びアシピシリンに
対する耐性をもたらすマーカー遺伝子（tet^R及びam
p^R）、並びにエンドヌクレアーゼ、例えばPstI（amp^R‐
遺伝子中で切断し、tet^R‐遺伝子を無傷のまま保持す
る）、BamHI、HindIII、SalI（tet^R‐遺伝子中で切断
し、amp^R遺伝子を無傷のまま保持する）、NruI及びEcoR
Iの一個のみ存在する認識部位を含有する。

複数の発現制御配列を遺伝子発現の制御のために導入す
ることができる。特に、形質転換されるべき宿主の強力
に発現する遺伝子の発現制御配列を使用する。ハイブリ
ドベクターとしてpBR322を使用し、そして宿主微生物と
してE.コリを用いる場合、例えば、ラクトースオペーロ
ン、トリプトファンオペーロン、アラビノースオペーロ
ン等の発現制御配列、β‐ラクタマーゼの発現制御配
列、λN-遺伝子又はファージfd-表面蛋白質の対応する
配列等が好ましく、これらの発現制御配列は特にプロモ
ーター及びリボゾーム結合部位を含有する。β‐ラクタ
マーゼ遺伝子（β‐lac-Gen）のプロモーターはすでにp
BR322中に含まれているが、他の発現制御配列をプラス
ミド中に導入しなければならない。この発明の発現制御
配列としてトリプトファンオペーロン（trp op）のそれ
が好ましい。

酵母における複製及び発現のために適当なベクターは酵
母複製開始点及び酵母のための遺伝的選択マーカーを含
有する。酵母複製開始点、例えば染色体性自律複製セグ
メント（ars）を含有するハイブリドベクターは、酵母
細胞に形質転換された後染色体外に保持され、そして有
糸分裂の際に自律的に複製する。さらに、酵母２μプラ
スミドDNAに相同な配列を含有するハイブリドベクター
を使用することもできる。このようなハイブリドベクタ
ーは組換により、細胞内にすでに存在する２μプラスミ
ドに組み込まれ、又は自律複製する。２μ配列は大きな
形質転換頻度有するプラスミドのために特に適当であ
り、そして高いコピー数を許容する。酵母のための好ま
しいマーカー遺伝子は、特に宿主に抗生物質耐性を付与
するものであるが栄養要求性酵母菌株の場合には宿主の
欠損を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は例えば
抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性をもたらし、又
は栄養要求性酵母菌株に原栄養性、例えばURA3遺伝子、
LEU2遺伝子、HLS3遺伝子、又は特にTRP1遺伝子を付与す
る。好ましくは、酵母ハイブリドベクターはさらに、細
菌宿主、特にE.コリのための複製開始点及びマーカー遺
伝子を含有し、これによって細菌宿主におけるハイブリ
ドベクター及びその中間体の造成及びクローニングを行
うことができる。酵母での発現のために適当な発現制御
配列は、例えば、TRP1遺伝子、ADHI遺伝子、ADHII遺伝
子、PHO3遺伝子又はPHO5遺伝子のそれであり、さらには
解糖系に関与するプロモーター、例えばPGKプロモータ
ー及びGAPDHプロモーターである。

この発明は特に複製及び表現型による選択が可能な発現
ベクターに関し、このベクターは発現制御配列及びエグ
リン又は変形されたエグリンをコードするDNA配列を含
有し、ここで前記DNA配列が転写開始シグナル及び転写
停止シグナル並びに翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグ
ナルと共に前記発現プラスミド中で前記発現制御配列の
制御のもとに配列されており、この配列は前記発現プラ
スミドにより形質転換された宿主がエグリン活性を有す
るポリペプチドを発現するようにされている。

効率的な発現を達成するためには、構造遺伝子を発現制
御配列に対して正しく（位相を整合させて）配置しなけ
ればならない。発現制御配列を、大mRNA出発部と該発現
制御配列に天然に連結されている遺伝子コード配列（例
えばβ‐lac-プロモーターを使用する場合にはβ‐lac-
コード配列）のATGとの間の領域において、エグリン遺
伝子（又は変形されたエグリン遺伝子）〔この遺伝子は
好ましくはそれ自体の翻訳開始シグナル（ATG）及び翻
訳終止シグナル（例えばTAG）を担持する〕に連結する
のが好ましい。こうすることによって、効率的な転写及
び翻訳が保証される。

例えば、ベクター、特にpBR322を制限エンドヌクレアー
ゼで切断し、そして場合によってはこうして得られた線
状ベクターを変形した後、対応する制限末端を有する発
現制御配列を導入する。発現制御配列はその３′‐末端
（翻訳の方向について）に制限エンドヌクレオチドの認
識配列を有し、これによって、発現制御配列をすでに含
有するベクターを該制限酵素で切断し、そして適合する
末端を有するエグリン（又は変形されたエグリン）構造
遺伝子を導入することができるようにされている。この
場合、遺伝子を正しい方向に含むハイブリドプラスミド
と誤った方向に含むハイブリドプラスミドの２種類の混
合物が生ずる。発現制御配列をすでに含有するベクター
をさらに第２の制限エンドヌクレアーゼによってベクタ
ーDNA内で切断し、そして生ずるベクター断片に正しい
末端を有する構造遺伝子導入するのが好ましい。ベクタ
ーのすべての操作は、レプリコン及び少なくとも１つの
マーカー遺伝子の機能が害されない方法によって行うの
が好ましい。

この発明の好ましい態様においては、３′‐末端（大mR
NA出発部と第１のATGとの間）に好ましくは接着末端を
形成する制限エンドヌクレアーゼ例えばEcoRIの認識部
位を担持する発現制御配列、特にトリプトファンオペー
ロン（trp op）の発現制御配列を含有するpBR322由来ベ
クターを、前記制限エンドヌクレアーゼにより、そして
ベクターDNA部分において、平滑末端又は好ましくは接
着末端を形成する第２の制限エンドヌクレアーゼ、例え
ばBamHIにより切断し、そして次に、こうして生成した
線状化ベクターを、対応する末端を有するエグリン（又
は変形されたエグリン）遺伝子（例えば、ATG出発部の
前にEcoRI末端を有し、そして翻訳終止コドンの後にBam
HI末端を有する）と連結する。この連結は公知の方法に
より、相補性（接着）末端の対合、及び例えばT₄DNAリ
ガーゼを用いる連結により行う。

mRNA経路を介してゲノムDNAから得られた、又は合成的
に得られた、対応する接着末端（特にEcoRI末端及びBam
HI末端）を有するエグリン（又は変形されたエグリン）
遺伝子は、発現プラスミドに導入する前に、例えば配列
分析用に大量の構造遺伝子を得るために、ベクター、例
えばpBR322にクローニングすることができる。ハイブリ
ドプラスミドを含有するクローンの分離は、例えばエグ
リン特異的放射性標識オリゴデオキシヌクレオチドプロ
ーブ（前記）を用いて行う。エグリン（又は変形された
エグリン）遺伝子の特徴付けは、例えばMaxam及びGilbe
rtの方法（３）により行う。

この発明の好ましい態様においては、エグリン遺伝子又
は変形されたエグリン遺伝子の２個の断片、例えばエグ
リンＣ遺伝子の２個の断片を合成する。遺伝子の最初の
部分を含む断片１はATGの前及びその末端に、各場合に
接着末端を形成する制限エンドヌクレオチドの認識部位
を、例えばATGの前にEcoRIの認識部位を、そして末端に
HpaIIの認識部位を含有する。遺伝子の後半部分を含む
断片２は先端に、対応する認識配列、例えばHpaIIの認
識配列を含有し、そして翻訳終止シグナル（例えばTA
G）の後にBamHI認識部位を含有する。断片は外側の認識
配列において（断片１は例えばEcoRIにより、そして断
片２は対応してBamHIにより）切断し、そして対応して
切断されたベクター（例えばpBR322）にサブクローニン
グする。断片を含有するクローンの同定、及び断片の特
徴付けは前記のようにして行う。次に、対応する制限エ
ンドヌクレアーゼによりハイブリドベクターから断片を
切り出し（断片１は例えばEcoRI及びHpaIIにより、そし
て断片２は例えばHpaII及びBamHIにより切り出す）、そ
してこれらの接着末端、特にHpaII末端を介して連結し
て完全なエグリン（又は変形されたエグリン）遺伝子を
生成せしめ、これを前記のようにしてベクターDNAに導
入する。

宿主細胞の形質転換 この発明はさらに形質転換された宿主の製造方法に関
し、この方法は、発現制御配列により制御される、エグ
リン又は変形されたエグリンをコードするDNA配列を含
有する発現ベクターにより宿主を形質転換することを特
徴とする。

適当な宿主は、例えば前記の微生物、例えばサッカロミ
セス・セレビシエー、バシルス・ズブチリス、及び特に
エセリヒア・コリの菌株である。この発明の発現プラス
ミドによる形質転換は、例えば文献に記載されているよ
うにして行う。S.セレビシエーについては文献（４）
に、B.ズブチリスについては（５）に、そしてE.コリに
ついては（６）に記載されている。形質転換された宿主
の分離は、発現プラスミドに含まれているマーカー遺伝
子がそれに対して耐性をもたらす殺生物剤を添加した選
択培地において行うのが有利である。

好ましくは、発現ベクターがamp^R遺伝子を含有する場合
には、培地にアンピシリンを添加する。発現プラスミド
を含有しない細胞はこのような培地中で死滅する。

この発明はさらに、上記のようにして得られた形質転換
された宿主に関する。

形質転換された宿主の培養及びエグリンの採取 形質転換された宿主は、エグリン及び変形されたエグリ
ンの製造のために使用することができる。このエグリン
及び変形されたエグリンの製造方法は、形質転換された
宿主を培養し、そして生産物を宿主細胞から放出せし
め、そして分離することを特徴とする。

驚くべきことに、今や、この発明の形質転換された宿主
がエグリン活性を有するポリペプチドの混合物を生産す
ることが見出された。この混合物から天然エグリン、メ
チオニル‐エグリン、及びN-末端アセチル化エグリンが
分離される。E.コリの形質転換株は特に、N-末端アミノ
酸であるスレオニンがN-アセチル化されている点におい
て天然エグリンＢ及びＣと区別される、エグリン活性を
有するポリペプチドを生産し、他の形質転換された宿主
は天然エグリンを発現し、そして第３の宿主は特に、宿
主に導入されたエグリンDNAに正確に対応するポリペプ
チド、すなわちN-末端アミノ酸としてメチオニンを有す
るポリペプチドを発現する。Ｎ^α‐アセチル化生成物の
生産は特に驚くべきことである。遺伝子工学的方法によ
るこの種のポリペプチドの生産は今まで観察されていな
い。すなわち、天然にはN-末端アセチル化されているα
‐チモシンでさえ、遺伝的に修飾された対応する宿主か
らは非アセチル化形として発現される（35）。

N-末端アセチル化エグリンの生産は非常に有利である。
なぜなら、このような化合物は宿主細胞中に存在するア
ミノペプチターゼに対して高い耐性を有し、このためN-
末端から始まる（部分的）蛋白質分解的破壊が阻害さ
れ、そしてそのために収量が増加するからである。さら
に、このために精製方法が著しく簡素化される。なぜな
ら、目的生成物が蛋白質分解破壊によって生ずる断片に
よって汚染されないからである。

この発明はさらに。次の式（XIV）、 〔式中、Ｂは直接結合、又は天然エグリンのＮ末端側の
１〜10個のアミノ酸単位から成るペプチド基であって、
例えばSerPhe-、LeuLysSerPhe-、SerGluLeuLysSerPhe
-、PheGlySerGluLeuLysSerPhe-及びThrGluPheGlySerGlu
LeuLysSerPhe-から成る群から選ばれた基であり、Ｂ′
はペプチド基ではなく、又は天然エグリンのＣ末端側の
１〜６個のアミノ酸単位から成るペプチド基であって、
例えば‐HisVal、‐HisValProHis及び‐HisValProHisVa
lGlyから成る群から選ばれた基であり、ＷはTry又はHis
であり、そしてｒは０又は１であり、ここで式（XIV）
の化合物においてｒが０の場合はＮ末端アミノ酸はN-ア
セチル化されている場合がある、〕で表わされるエグリ
ン化合物、及び該化合物の塩の製造方法に関し、この方
法は発現制御配列により制御されておりエグリンをコー
ドするDNA配列を含有する発現プラスミドにより形質転
換された宿主を、資化性の炭素源及び窒素源を含有する
液体培地中で培養し、そして生成物を宿主細胞から遊離
せしめそして単離し、あるいはｒが０でありそしてＮ末
端アミノ酸がN-アセチル化されている式（XIV）の化合
物を製造するために、遊離のＮ末端アミノ基を有する式
（XIV）の化合物をアセチル化し、そして所望により得
られた式（XIV）のエグリン化合物を式（XIV）の他のエ
グリン化合物に転換し、そして必要な場合には式（XI
V）の化合物のこの発明の得られた混合物を個々の成分
に分離し、そして／又は所望により得られた塩を遊離ポ
リペプチドに、又は得られたポリペプチドをその塩に転
換することを特徴とする。

この発明は特に、次の式（XIV′）、 （式中、ＶはThr、N-アセチル‐Thr、又はMet-Thrであ
り、そしてＷはTyr、又はHisである、） で表わされるエグリン化合物、及びその塩の製造方法に
関し、この方法は、発現制御配列により制御されるエグ
リンをコードするDNA配列を含有する発現プラスミドに
より形質転換された宿主微生物を、資化性炭素源及び窒
素源を含有する液体培地に培養し、そして微生物細胞か
らエグリンを遊離せしめ、そして単離し、そして場合に
よっては、ＶがN-アセチル‐Thr又はMet-Thrでありそし
てＷが前記の意味を有する得られたエグリンをＶがThr
であるエグリンに転換し、そして必要であればこの発明
により得られた式（XIV）の化合物の混合物を個々の成
分に分離し、そして／又は所望により得られた塩を遊離
ポリペプチドに、もしくは得られたポリペプチドを塩に
転換することを特徴とする。

この発明はさらに、ＢがLeuLysSerPhe-、 SerGluLeuLysSerPhe-及び ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-から成る群から選ば
れたペプチド基であり、そしてＢ′が基‐HisValProHis
ValGlyであり、ＷがTyrであり、そしてｒが０又は１で
ある式（XIV）のエグリンＣ化合物の製造方法、さらに
はＢがペプチド基ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-で
あり、Ｂ′がペプチド基‐HisValProHisValGlyであり、
ＷがHisであり、そしてｒが０又は１であり、ここで式
（XIV）の化合物においてｒが０であるときはN-末端ア
ミノ酸は場合によってはアセチル化されている式（XI
V）のエグリンＢ化合物及び該化合物の塩の製造方法に
関する。

式（XIV）の化合物において、Ｗは好ましくはTyrである
（エグリンＣ化合物）。

この発明は特に、Ｂが N-アセチル‐SerGluLeuLysSerPhe-、 ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-、又は N-アセチル‐ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-基であ
り、Ｂ′が基‐HisValProHisValGlyであり、ＷがTyrで
あり、そしてｒが０である式（XIV）のエグリンＣ化合
物、及び該化合物の塩の製造方法に関する。

この発明は特に、エグリンＣ、エグリンＢ、Ｎ^α‐アセ
チルエグリンＣ、並びに変形されたエグリンＣ化合物で
あるエグリンＣ′及びエグリンＣ″の製造方法に関す
る。

この発明の形質転換された宿主を培養するために種々の
炭素源を使用することができる。例えば、好ましい炭素
源は、資化性炭水化物、例えばグルコース、マルトー
ス、マンニトールもしくはラクトース、又は酢酸塩であ
り、これらは単独で、又は適当な混合物として使用する
ことができる。適当な窒素源は、例えばアミノ酸、例え
ばカサミノ酸、ペプチド、並びに蛋白質及びその分解生
成物、例えばトリプトン、ペプトン又は肉エキス、さら
に酵母エキス、マルトエキス、さらにはアンモニウム
塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は硝
酸アンモニウムであり、これらは単独で、又は適当な混
合物として使用することができる。使用し得る無機塩
は、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカ
ルシウムの硫酸塩、塩化物、燐酸塩及び炭酸塩である。

さらに、培地は、例えば増殖促進物質、例えば微量元
素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等を含有し、そして好ま
しくは選択圧を与えそして発現ベクターを喪失した細胞
の増殖を阻害する物質を含有する。すなわち、発現ベク
ターがamp^R遺伝子を含有する場合、培地に例えばアンピ
シリンを加える。抗生物質のこのような添加はまた、抗
生物質感受性の汚染微生物を死滅させるためにも寄与す
る。

培養は公知の方法により行う。培養条件、例えば温度、
培地のpH、及び発酵時間は、最高のエグリン力価が得ら
れるように選択する。そしてE.コリ菌株は好ましくは、
好気的条件下液中で、振とう又は攪拌しながら、約20℃
〜40℃、好ましくは約30℃の温度において、そして４〜
９のpH、好ましくはpH7において、約４〜20時間、好ま
しくは８〜12時間培養する。この場合、発現生産物（エ
グリン）は細胞内に蓄積する。

培養濃度が十分な値に達した時、培養を停止し、そして
宿主の細胞からエグリンを遊離せしめる。この目的のた
めに、例えば、洗浄例えばSDSもしくはトリトンで処理
することにより細胞を破壊し、又はリゾチームもしくは
同様の作用を有する酵素により細胞を溶解する。この方
法に代えて、又はこの方法と同時に、機械的力、例えば
剪断力（例えば、X-プレス、フレンチプレス、ダイノミ
ル）、又はガラスビーズもしくは酸化アルミニウムとの
振とう、あるいは例えば液体窒素中での凍結と例えば約
30℃〜40℃での解凍との反復により細胞を破砕すること
ができる。蛋白質、核酸及び他の細胞成分を含有する得
られた混合物を、遠心分離した後、それ自体公知の方法
によりエグリンを含む蛋白質について濃縮する。すなわ
ち、例えば、非蛋白質性成分の大部分をポリエチレンイ
ミン処理により除去し、そしてエグリンを含む蛋白質
を、例えば硫酸アンモニウム又は他の塩で溶液を飽和す
ることによって沈澱せしめる。細菌性蛋白質はまた、酢
酸による酸性化（例えば0.1％、pH4〜５）によっても沈
澱せしめることができる。エグリンのこれ以上の濃縮は
酢酸性上相をn-ブタノールで抽出することによって行う
ことができる。他の精製段階には、例えばゲル電気泳
動、クロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、サイズエクスクルーションクロマトグラフィ
ー、HPLC、逆相HPLC等、適当なセファデックスカラムに
よる分子の大きさに基く混合物成分の分離、透析、アフ
ィニティークロマトグラフィー、例えば抗体アフィニテ
ィークロマトグラフィー、特にモノクローナル抗体アフ
ィニティークロマトグラフィー、又はアンヒドロキモト
リプシンカラムでのアフィニティークロマトグラフィー
等、特に文献により知られる方法が含まれる。

例えば、発現されたエグリンの分離は次の段階を含む。

遠心分離により培養液から細胞を分離し； 例えば溶解酵素で処理することにより、そして／又は凍
結と解凍を反複することにより、細胞を破壊して粗抽出
物を調製し； 不溶性成分を遠心分離により除去し； ポリエチレンイミンを添加することによってDNAを沈澱
せしめ； 硫酸アンモニウムによってエグリンを含む蛋白質を沈澱
せしめ； この沈澱物を溶解して、モノクローナル抗‐エグリン抗
体カラム又はアンヒドロキモトリプシンカラム上でアフ
ィニティークロマトグラフ処理し； こうして得られた溶液を、透析又はセファデックスG25
上でのクロマトグラフィーにより脱塩する。

上記の方法に代えて、DNAを除却した後0.1％の酢酸によ
り細菌蛋白質を沈澱せしめ、酸性上相からn-ブタノール
で抽出することができ、あるいは酸性上相を直接にイオ
ン交換クロマトグラフィー（例えばカルボキシメチルセ
ルロース上での）にかけることができる。他の精製段階
にはセファデックスG50（又はG75）でのゲル過、及び
逆相HPLCが含まれる。脱塩を再びセファデックスG25に
より行う。

エグリン活性を証明するためには、抗エグリン抗体（例
えば、ラビットから得られる抗体、又はハイブリドーマ
細胞から得られるモノクローナル抗体）を用いる試験、
あるいはプロテアーゼであるヒト白血球エラスターゼ
（HLE）又はカテプシンＧ（GatG）（１）のエグリンに
よる阻害を用いることができる。

ｒが０であり、そしてN-末端アミノ基が遊離形である式
（XIV）の化合物の、N-末端アミノ酸がN-アセチル化さ
れている式（XIV）の対応する化合物への転換は、酵素
的方法により行うのが好ましい。すなわち、アセチル基
の導入は例えば、Ｎ^α‐アセチルトランスフェラーゼ
（精製された形で、抽出物として、又は適当な微生物の
溶解物として、又は器官抽出物として）により、例えば
E.コリ、ラビット‐網状赤血球、又は小麦胚芽からの該
酵素により、アセチルコエンチームＡの存在下で行うこ
とができる。

この発明に従って得られた式（XIV）の化合物は、それ
自体公知の方法によって式（XIV）の他の化合物に転換
することができる。

すなわち、N-末端アミノ酸としてメチオニンを有し、又
はN-末端アセチル化アミノ基を有する式（XIV）の得ら
れた化合物において、メチオニン又はアセチル基を除去
することができる。例えば、N-末端メチオニン基を有す
るこの発明の方法により得られたエグリン化合物をこの
基を有しないエグリンに転換することができ、この方法
においては末端メチオニン基を常法に従ってシアノゲン
ブロミドを用いて除去する。シアノゲンブロミドとの反
応は、例えば水性酸性媒体中、例えば大きく稀釈した塩
酸、例えば0.1〜0.3N塩酸中で、又は強有機酸、例えば5
0〜70％の蟻酸中で、室温、又はわずかに高温もしくは
低温において、例えば約15℃〜約25℃において、約24時
間にわたって行う。N-末端アセチル化アミノ基を有する
この発明に従って得られた式（XIV）の化合物におい
て、アセチル基を対応して除去することができる。アセ
チル基の除去は例えば酵素的に、例えば適当なアシラー
ゼ、例えばブタ腎臓又は適当な微生物からのアシラーゼ
を用いて、あるいはコエンチームＡの存在下で適当なア
セチルトランスフェラーゼを用いて行うことができ、こ
の場合、精製酵素標品の代りに、この酵素を含有する微
生物からの抽出物もしくは溶解物、又は器官抽出物を使
用することができる（Ｎ^α‐アセチル‐エグリンＢ又は
Ｃの生産菌株としてE.コリHB101を使用する場合には、
例えばE.コリHB101の溶解物）。

式（XIV）の化合物のこの発明の方法により得られた混
合物、例えばＶがThr又はアセチルThrである式（XIV）
の化合物の混合物は、それ自体公知の方法により個々の
成分に分離することができる。好ましい分離法は、例え
ばクロマトグラフ法、例えば吸着クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィーHPLC又は逆相HPLC、さら
には多段分配又は電気泳動法、例えば酢酸セルロース上
での電気泳動又はゲル電気泳動、特にポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）である。

この発明はまた、この発明の方法により得られた、エグ
リン活性を有する新規なペプチド、該ペプチドの混合
物、及び該ペプチドの塩に関する。

この発明は、次の式（XIV）、 （式中、ｒは１であり;Bは直接結合、又は天然エグリン
のＮ末端側の１〜10個のアミノ酸単位から成るペプチド
基であって、例えばSerPhe-、LeuLysSerPhe-、SerGluLe
uLysSerPhe-、 PheGlySerGluLeuLysSerPhe-及び ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-から成る群から選ば
れた基であり、Ｂ′はペプチド基ではなく、又は天然エ
グリンのＣ末端側の１〜６個のアミノ酸単位から成るペ
プチド残基であって、例えば‐HisVal、‐HisValProHis
及び‐HisValProHisValGlyから成る群から選ばれた基で
あり、そしてＷはTyr又はHisであり；あるいは、ｒは０
であり;BはＮ末端アセチル化ペプチド基であって、例え
ばN-アセチル‐SerPhe-、N-アセチル‐ LeuLysSerPhe-、N-アセチル‐SerGluLeuLysSerPhe-、N-
アセチル‐PheGlySerGluLeuLysSerPhe-及び N-アセチル‐ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-から成
る群から選ばれた基であり;B′は前記の意味を有し、そ
してＷはTyr又はHisである、） で表わされるエグリン化合物、及び該化合物の塩に関す
る。

この発明は特に、ｒが０であり、Ｂがペプチド基N-アセ
チル‐SerGluLeuLysSerPhe-、又はN-アセチル‐ThrGluP
heGlySerGluLeuLysSerPhe-であり、Ｂ′はペプチド基‐
HisValProHisValGlyであり、そしてＷはTyrである化合
物、及び該化合物の塩に関する。

この発明は特に、次の式（XIV′）、 （式中、ＶはN-アセチル‐Thr、又はMet-Thrであり、そ
してＷはTyr、又はHisである、） で表わされるエグリン化合物、及び該化合物の塩に関す
る。

この発明は特に、Ｎ^α‐アセチル‐エグリンＣ、及びそ
の塩に関する。

この発明によって得られる化合物、すなわち式（XIV）
の新規化合物は、遊離形のみならず、その塩の形、特に
その医薬として許容される塩の形でも存在する。これら
は遊離アミノ基又はグアジノ基を有する複数のアミノ酸
基を含有するから、この発明の化合物は例えば酸付加塩
の形で存在することができる。酸付加塩として、常用の
医薬として許容される酸との特に生理的に許容される塩
を挙げることができる。無機酸としてハロゲン化水素酸
（例えば塩酸）、又はさらに硫酸、及び燐酸又はピロ燐
酸を挙げることができ、そして有機酸として特にスルホ
ン酸（例えば、ベンゼン‐もしくはp-トルエン‐スルホ
ン酸、又は低級アルカンスルホン酸、例えばメタンスル
ホン酸）、さらにはカルボン酸、例えば酢酸、乳酸、パ
ルミチン酸及びステアリン酸、リンゴ酸、酒石酸、アス
コルビン酸、及びクエン酸を挙げることができる。エグ
リン化合物はまた、ペプチド全体に酸性をもたらす遊離
カルボン酸を有するアミノ酸残基を含有するから、これ
らはまた金属塩として、特にアルカリ金属塩又はアルカ
リ土類金属塩として、例えばナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩として、又は
アンモニアから、もしくは生理的に許容される窒素含有
有機塩基から誘導されるアンモニウム塩として存在し得
る。これらはしかし遊離カルボキシ基及び遊離アミノ
（及びアミド）基を同時に含有するから、これらはまた
内部塩としても存在し得る。

この発明の化合物は処理方法に従って、遊離の形、酸付
加塩の形、内部塩の形、又は塩基との塩の形で得られ
る。酸付加塩から、それ自体公知の方法により遊離化合
物が得られる。遊離化合物を酸又は塩基と反応せしめる
ことにより、例えば上記の塩形成性酸又は塩基と反応せ
しめ、そして蒸発又は凍結乾燥を行うことにより医薬と
して許容される酸付加塩又は金属塩が得られる。内部塩
は、適当な中性点にpHを調整することによって得られ
る。

エグリンに対するモノクローナル抗体及び該抗体を含む
キット 特定の抗原に結合する抗体の性質は、体外において、定
量的測定（免疫測定法）の場合、及び抗原の精製（イム
ノアフィニティークロマトグラフィー）の場合に実用さ
れる。免疫された動物の血清は通常、種々の結合部位に
おいて種々の親和性をもって同一の抗原と反応する多数
の抗体、及びさらに固体の過去の経験を反映する。他の
抗原に対する抗体を含有する。しかしながら、抗原を測
定のため又は抗原の精製のために好結果をもって使用す
るためには、高い特異性と再現性が要求される。

このような要件を満たす均一な抗体は、Koehler及びMil
stein（26）により記載されたハイブリドーマ技法によ
り得られる。この技法の原理は次の通りである。抗体分
泌性B-リンパ球、例えば免疫された動物の脾臓からのB-
リンパ球を、腫瘍細胞と融合せしめる。形成されたハイ
ブリドーマ細胞は分裂により無制限に増加する性質と、
単一タイプの抗体を産生しそして分泌する性質とを合わ
せ持つ。融合していない腫瘍細胞は死滅するがハイブリ
ドーマ細胞は増加する選択培地中での培養、及び適切な
操作により、クローン、すなわち１個のハイブリドーマ
細胞に由来し、そして遺伝的に同一の細胞集団を得るこ
とができ、そしてこれを培養し、そして細胞によって産
生されたモノクローナル抗体を分離することができる。

この発明は、エグリン又は変形されたエグリンに対する
モノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞、及びこれらの製造方法に関す
る。ハイブリドーマ細胞系（セルライン）、及びこれか
ら分泌されたモノクローナル抗体であって、エグリンＢ
もしくはエグリンＣ、又はこれらの誘導体、例えばＮ^α
‐アセチル‐エグリンＣもしくはＢ、又はＮ^α‐メチオ
ニル‐エグリンＣもしくはＢと特異的に反応するものが
好ましい。モノクローナル抗‐エグリン‐抗体の製造方
法は、マウスをエグリン又は変形されたエグリンで免疫
し、こうして免疫された動物のB-リンパ球を骨髄腫細胞
と融合せしめ、形成されたハイブリドーマ細胞をクロー
ニングし、そして試験管内で、又は注射によってマウス
内で培養し、そして培養物から抗体を分離する。

この発明はさらに、これらの抗体を含むイムノアフィニ
ティークロマトグラフィーカラム、及び免疫測定用試験
キットに関する。

この発明の方法に従えば、マウス、例えばBalb/cマウス
を、それ自体公知の方法により又は特別な方法により免
疫する。驚くべきことに、エグリンは比較的小さい蛋白
質分子であるにもかかわらず免疫化が生ずる。好ましい
態様においては、完全フロインドアジュバント及び不完
全フロインドアジュバント中、及び緩衝化塩溶液中50〜
500μｇ、好ましくは100μｇのエグリンＢ又はＣの溶液
を、およそ１週間に１回又はさらに長い間隔を置いて、
複数週間、例えば５〜12週間にわたり、十分な数の抗体
産生B-リンパ球が形成されるまで皮下注射する。

B-リンパ球を含有する器官、例えば免疫されたマウスの
脾臓細胞を取り出し、そして変異のために選択培地中で
増殖しない骨髄腫細胞と融合せしめる。このような骨髄
腫細胞は知られており、そして例えばX63-Ag8、X63-Ag
8.6.5.3、MPC-11、NS1-Ag4/1、MOPC-21 NS/1、又は特に
SP2/0と標示されるものである。好ましい態様において
は、免疫されたマウスの脾臓細胞とセルラインSP2/0の
骨髄腫細胞とを融合せしめる。

融合は、それ自体公知の方法に従って、B-リンパ球と骨
髄腫細胞とを混合することにより、細胞融合剤、例えば
ポリエチレングリコール、センダイ‐ウイルス、塩化カ
ルシウム又はリゾレシチンを加えて行う。好ましくは、
例えば500の分子量を有するポリエチレングリコールの
存在下で融合を行う。融合の後、生成されたハイブリド
ーマを、それ自体公知の方法に従って、ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン及びチミジンを補充した選択培地
（HAT-培地）中で培養する。未融合の骨髄腫細胞はこの
培地中で増殖することができず、従って正常なリンパ球
と同様に死滅する。

ハイブリドーマ培養物の上清液は、それ自体公知の方法
に従って、例えば放射免疫測定法により、又は凝集反応
により、特異抗体の含量について検定することができ
る。こうして、驚くべきことに、上記の方法により、エ
グリンＢ又はエグリンＣに対して特異的な抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞が得られることが確認される。こ
の抗体はさらにＮ^α‐アセチルエグリンＣ及びＢ、並び
にＮ^α‐メチオニル‐エグリンＣ及びＢとも反応する。

所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細
胞を、融合により生じた種々のハイブリドーマ細胞の混
合物からクローニングによって選択する。このために、
「限界稀釈法」と称する公知の方法により、１個の増殖
細胞から培養物を調製する。

この方法により３種類のハイブリドーマセルラインが得
られ、これらはパスツール研究所（フランス，パリ）
に、299S18-20、299S22-1、及び299S22-10として寄託さ
れている。

大量生産のために、所望の特異性を有する抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞系をそれ自体公知の培地中で生体
外培養し、又は増殖のためマウスに注射する。好ましい
態様においては、ハイブリドーマ細胞をプリスタンによ
り前処理したマウスに注射し、腹水を採取し、そしてこ
れから硫酸アンモニウムを用いる沈澱により抗体を分離
する。このハイブリドーマ細胞により得られたモノクロ
ーナル抗体は、それ自体公知の方法によりイムノ‐アフ
ィニティークロマトグラフィーカラムを製造するために
使用することができる。この発明の好ましい態様におい
ては、適当な担体（緩衝液中に懸濁されている）を抗体
溶液と混合し、次に未結合部分を洗浄除去し、そして担
体の未結合部分をブロックする。

ハイブリドーマにより得られたモノクローナル抗体は、
それ自体公知の方法により試験キットを製造するために
使用することができる。この試験キットは、種々の方
法、例えば放射免疫拡散法、ラテックス凝集、スポット
テスト、競争的もしくはサンドイッチ放射免疫測定法、
酵素免疫測定法、免疫螢光、又は免疫化学的酵素試験、
例えばELISAもしくはタンデムELISAに基づくことができ
る。このようなキットは、種々の由来の所望の抗体のほ
かに、酵素又は螢光担体との抗体接合物、並びにエグリ
ン及び変化されたエグリンのほかに、例えば、放射性同
位元素、例えばI¹²⁵により標識された、又は酵素、例え
ばセイヨウワサビ‐パーオキシダーゼもしくはアルカリ
性ホスファターゼと接合したエグリンＢ、エグリンＣも
しくはＮ^α‐アセチルエグリンＣ、さらには酵素基質、
適当な緩衝剤、ゲル、ラテックス、ポリスチレン又は他
の充填剤、及び担体を含むことができる。

血清学的試験は、例えば次のようにして行うことができ
る。

抗‐エグリンＣ抗体活性を確認するため、競争的RIAの
ほかに、直接結合試験を行うことができる。この目的の
ために、エグリンＣを一夜インキュベートすることによ
りミクロタイタープレートのウエルに固定し（200mg/ウ
エル）、次にハイブリドーマ培養液と共にインキュベー
トし、そして¹²⁵Iにより放射性標識された（固相RI
A）、又はアルカリ性ホスファターゼにより標識された
（固相ELISA）ヤギ抗‐マウスIg-抗体により可視化する
ことができる。

選択された３種類のモノクローナル抗体は非放射性タン
デムELISAのために適当であり、これにより体液中のエ
グリンを定量的に測定することが可能になる。

抗体の適当な対は競争的RIAのために、次のようにして
選択される。モノクローナル抗体 299S18-20、299S22-1、及び299S22-10（200〜300ng/ウ
エル、腹水の硫安塩析により得たもの）、並びにポリク
ローナルラビット抗‐エグリンＣ抗体（200〜300ng/ウ
エル、血清から得たもの）を、ミクロタイタープレート
のウエルに固定する。¹²⁵I‐標識エグリンＣの結合の阻
害を交差的に試験する。

この試験により、モノクローナル抗体299S18-20、及び2
99S22-10はエグリンＣとの結合を相互に阻害することが
明らかになり、この両者がエグリンＣ分子の同じエピト
ープに結合することが結論される。

モノクローナル抗体299S18-20及び299S22-1は相互に阻
害しない。このことは、これらがエグリンＣ分子の異る
エピトープに結合することを意味する。

固定された抗体に結合した固定された放射性標識エグリ
ンＣの量により決定された相対的結合能は、299S22-10
において最大であり、そして299S18-20において最小で
ある。

タンデムELISA実験（この方法においてはモノクローナ
ル抗体が対として試験され、この場合１つの抗体が常に
固相としてミクロタイタープレートに固定され、そして
他方が液相として酵素、例えばアルカリ性ホスファータ
ーゼにより標識された）に基いて、交差反応性でない29
9S18-20/299S22-1の対、及び299S22-1/299S22-10の対が
この種の定量的測定に最適であり、この場合エグリンＣ
と弱く結合する上記モノクローナル抗体対の最初のもの
を固相として使用しなければならないことが確認され
た。

この発明のモノクローナル抗体はまたは固相として、液
相としてのポリクローナル抗‐エグリンＣ抗体、例えば
やぎからの抗体と共に、エグリンＣの定量測定のために
使用することができる。

タンデムELISAの感度は、約１〜10ngエグリンC/mlサン
プルである。

この発明に従って得られる公知のエグリン（例えば、エ
グリンＢ及びエグリンＣ）、及び新規なエグリン（例え
ば、Ｎ^α‐アセチル‐エグリンＢ及び‐エグリンＣ、メ
チオニル‐エグリンＣ及び‐エグリンＢ）、及び変形さ
れたエグリンは、価値ある薬理学的性質を有し、そして
ヒルから抽出されたエグリン（西独出願公開第2808396
号）と同様に、予防的に、又は特に治療的に使用するこ
とができる。

この発明の新規なエグリン化合物、例えばＮ^α‐アセチ
ル‐エグリンＢ及びＮ^α‐アセチル‐エグリンＣは、ヒ
ト白血球エラスターゼ（HLE）、白血球カテプシンＧ
（H.Cat.G）及びキモトリプシンに対する非常に強力で
特異的な阻害を示す。

Ｎ^α‐アセチル‐エグリンＣ、並びに２種類の天然プロ
テアーゼ阻害物質、すなわちα₁‐プロテイナーゼ阻害
物（α₁PI、以前α₁‐アンチトリプシンと称された）及
びα₂‐マクログロブリン（α₂M）と、HLE及びH.Cat.G.
との反応により形成される‐酵素‐阻害物質複合体の会
合速度定数（Kass）及び平衡定数（Ki）を次の表に要約
する。

条件：会合速度定数（Kass）はBieth等（36）の方法に
従って行う。Ｎ^α‐アセチル‐エグリンＣとHLE及びH.C
at.G.との相互作用のK_i値は、この相互作用が可逆的で
あると仮定して「定常状態」反応速度から計算する。す
べての値は37℃及びpH7.4において求める。

このデータは、Ｎ^α‐アセチル‐エグリンＣ、並びに天
然阻害物質であるα₁PI及びα₂MとHLE及びH.Cat.G.との
反応の会合速度定数が同じ程度であることを示してい
る。Ｎ^α‐アセチル‐エグリン‐酵素複合体の高い安定
性（K_i値）、示された非常に小さいエグリンの毒性、及
びその特異性（他の哺乳動物プロテイナーゼ、特に血液
凝固系、フィブリン分解系及び補体系のプロテイナーゼ
との有意な相互作用は観察されない）、アミノペプチタ
ーゼによる蛋白質分解的破壊に対する、N-末端アセチル
基に基づくその高い安定性、及びこの発明の方法により
多量に、体由来因子α₁PI及びα₂Mに比べて容易に入手
できることにより、この物質について、HLEにより生ず
る組織破壊を特徴とする疾患における薬理学的評価がな
されることが推奨される。

この発明の化合物の活性は、例えば実験的気腫模型にお
いて証明される。0.3mgのHLEをハムスターに気管内投与
して気腫を誘発する１時間前に、0.5mg又は2mgのＮ^α‐
アセチル‐エグリンＣを（それぞれ８匹ずつの動物の
に）同様に気管内投与する。保護されていない（Ｎ^α‐
アセチル‐エグリンＣにより前処理されていない）動物
においては、２ケ月後に行われた肺機能検査及び組織学
的試験により重症の肺閉塞及び気腫が認められた。これ
に対して、Ｎ^α‐アセチル‐エグリンＣにより前処理さ
れたすべての動物は正常の肺機能を示した。肺の組織学
的試験により、低投与量群（Ｎ^α‐アセチル‐エグリン
C0.5mg投与群）の８動物の内２動物のみにわずかな局所
的気腫性変化が生ずることが示されたが、残りの動物は
なんらの変化も示さず、これによって気管内に投与され
たＮ^α‐アセチル‐エグリンＣの保護作用、及び同時に
その低い毒性が証明された。

従って、この発明の新規なエグリン化合物、特にＮ^α‐
アセチル‐エグリン化合物は、肺疾患例えば白血球エラ
スターゼによって生ずる肺疾患、例えば肺気腫及びARDS
（急性呼吸器疾患症候群）、膵臓線維症の予防及び治療
のために、さらには敗血ショックの際に、さらに消炎剤
（antiphlogistics）及び抗炎症剤（antiinflammatorie
s）として使用することができる。この発明の新規なエ
グリン化合物及び医薬として許容される塩の、前記の疾
患状態の予防及び治療における使用もまたこの発明の対
象である。

この発明はさらに、この発明の化合物又はその医薬とし
て許容される塩の少なくとも１種を、場合によっては医
薬として許容される担体及び／又は助剤と共に含んでな
る医薬組成物に関する。

これらの組成物は、それが例えば非経口的に（例えば静
脈内にもしくは肺内に）又は局所的に投与される場合、
上記の症状に対して使用することができる。投与量はま
ず特定の投与形態、及び治療又は予防の目的に依存す
る。

投与は、静脈内注射により、又は吸入により、例えばバ
ード装置を用いて気管内に行う。従って、非経口投与の
ための単位投与形の医薬組成物は、投与方法に依存し
て、投与当り約10mg〜50mgのこの発明の化合物を含有す
る。この医薬組成物は、活性物質のほかに、通常はさら
に塩化ナトリウム、マンニトール、又はソルビトールを
浸透圧の調整のために含有する。これらの医薬組成物は
凍結乾燥形又は溶液であってよい、溶液は、好ましくは
抗細菌性防腐剤、例えば0.2〜0.3％の4-ヒドロキシ安息
香酸‐メチルエステル又は‐エチルエステルを含有する
ことができる。

局所投与のための薬剤は、水溶液、ローションもしくは
ゼリー、油性溶液もしくは懸濁液、又は脂肪含有もしく
は特に乳剤軟膏として存在し得る。水溶液形の薬剤は例
えば、この発明の化合物又はその医薬として許容される
塩をpH4〜7.5の水性緩衝液に溶解し、そして場合によっ
ては他の活性物質、例えば抗炎症剤及び／又はポリマー
担体、例えばポリビニルピロリドン及び／又は防腐剤を
添加することにより製造する。活性物質の濃度は、10ml
の溶液又は10gのゼリー当り約0.1〜約5mg、好ましくは
0.25〜1.0mgである。

局所適用のための油性投与剤は、例えば、この発明の化
合物又はその医薬として許容される塩を、場合によって
は湿潤剤、例えばステアリン酸アルミニウム及び／又は
HLB値（親水性‐親脂性バランス）が10より低い界面活
性剤、例えば多価アルコールの脂肪酸モノエステル、例
えばグリセリンモノエステル、ソルビタンモノラウレー
ト、ソルビタンモノステアレート又はソルビタンモノオ
レエートの添加のもとで油に懸濁することにより製造す
ることができる。脂肪含有軟膏は例えば、この発明の化
合物又はその塩を、場合によっては10より低いHLB値を
有する界面活性剤の添加のもとで塗布可能な脂肪基剤に
懸濁することによって製造することができる。乳剤軟膏
は、この発明の化合物又はその塩の水溶液を、HLB値が
より低い界面活性剤の添加のもとに、軟質の塗布可能な
脂肪基剤中ですりつぶすことによって製造することがで
きる。これらすべての局所投与剤はさらに防腐剤を含有
することができる。活性物質の濃度は約10gの基剤中約
0.1〜約5mg、好ましくは0.25〜1.0mgである。

気管内投与により呼吸器を治療するための吸入剤はエー
ロゾル又はスプレー剤であり、これらは薬理学的活性物
質を溶液又は懸濁液の液滴の形で含有することができ
る。薬理学的活性成分が溶液として存在する薬剤は、こ
のほかに適当な噴射ガス、さらに必要により追加の溶解
剤及び／又安定剤を含有する。噴射ガスのかわりに加圧
空気を用いることもでき、この場合、この加圧空気を適
当な加圧装置及び圧力開放装置を用いて必要に応じて発
生せしめることができる。この適用のためには、医療に
導入されており、そして知られているバードレスピレー
ター装置が特に適当であり、この場合、活性物質の溶液
を装置に入れ、そしてわずかの加圧により霧化し、そし
て吸入される患者の肺に導入する。

年齢、個体の状態、及び疾患の種類に依存して、体重約
70kgの温血動物（ヒト又は動物）の場合、気管内投与の
投与量は吸入（１日に１〜２回）当り約10mg〜約30mgで
あり、そして静脈内投与の場合は、例えばまた持続注入
による場合、１日当り約10mg〜1000mgである。

免疫的方法、例えばELISAにより測定され得る医療的に
活性な喀痰濃度及び血漿濃度は10〜100μg/ml（約１〜1
0μM/l）である。

この発明は特に、例に記載した、エグリン又は変形され
たエグリンをコードするDNA配列、このDNA配列を含有す
る発現プラスミド、この発現プラスミドにより形質転換
された微生物、エグリンに対するモノクローナル抗体、
この抗体を産生するハイブリドーマ細胞、この抗体を含
む免疫測定キット、これらの例に記載した製造方法、形
質転換された微生物を用いてエグリンを製造するための
例に記載した製造方法、並びに例に記載した新規なエグ
リン化合物に関する。

次に、この発明をさらに具体的に説明するために例を記
載する。

実験の部 例において使用する略号は次の意味を有する。

TNE 100mM NaCl、50mM Tris・HCl、pH 7.5、及び5mM EDTAを含有する溶液 SDS ドデシル硫酸ナトリウム EDTA エチレンジアミン四酢酸 DTT 1,4-ジチオスレイトール（1,4-ジメルカプト ‐2,3-ブタンジオール） BSA ウシ血清アルブミン EtBr エチジウムブロミド Tris トリス‐（ヒドロキシメチル）‐アミノメタン Tris・HCl Trisの一塩酸塩 例1.保護されたヌクレオシド‐ポリスチレン樹脂 の調製 20mlの純ピリジン中3.1g（5mモル）の５′‐（4-メトキ
シトリチル）‐N-ベンゾイル‐デオキシシチジンを750m
gの無水コハク酸及び910mgの4-ジメチルアミノピリジン
と混合し、そして16時間室温にて置く。濃縮した後、ピ
リジン溶液を200mlの酢酸エチルに入れ、10mlの飽和塩
化ナトリウム溶液を添加して200mlずつの0.1M燐酸緩衝
液と共に２回振とうし、さらに飽和塩化ナトリウム溶液
で洗浄し、乾燥し、濃縮し、そしてヘキサンを滴加す
る。沈澱生成物を分離し、エーテルと共に２回すりつぶ
し、次に300mlの酢酸エチルに溶解し、そして０℃にて1
80mlの0.1M硫酸水素カリウム（pH2.5）と共に振とうす
る。水で２回洗浄した後、酢酸エチル溶液を硫酸ナトリ
ウムにより乾燥し、過し、0.5mlのピリジンと混合
し、濃縮し、そしてヘキサンを滴加して稀釈する。沈澱
したコハク酸誘導体を過する。

1.17gのこの化合物を、190mgのN-ヒドロキシサクシンイ
ミドと共に4mlの酢酸エチル及び2mlのジメチルホルムア
ミドに溶解し、そして０℃にて370mgのN,N′‐ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを添加する。冷蔵庫に一夜置い
た後、沈澱したN,N′‐ジシクロヘキシル尿素を去
し、そして液を酢酸エチルで稀釈し、冷0.1M炭酸水素
ナトリウム溶液及び水で抽出し、乾燥し、そして真空蒸
発乾燥する。残渣を酢酸エチルを用いてシリカゲル上で
クロマトグラフ処理する。

TLC:Rf＝0.58、ジクロロメタン／メタノール（9:1）。

88mgのこのN-サクシンイミドイル‐コハク酸エステル
を、2mlのジクロロメタン及び4mlのジメチルホルムアミ
ド中1gのアミノメチルポリスチレン（アミノ含量110μ
モル/gと共に20時間攪拌する。ポリマー樹脂を取し、
そしてジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメ
タン、及びメタノールで洗浄する。乾燥した後、未反応
アミノ基を次のようにしてアセチル化する。6mlのピリ
ジン中の樹脂を1mlの無水酢酸及び100mgの4-ジメチルア
ミノピリジンと共に30分間拌攪する。ポリマー樹脂をジ
クロロメタン、ジメチルホルムアミド、メタノール及び
ジクロロメタンにより洗浄し、そして重量が一定になる
まで乾燥する。メトキシトリチル（MMT）の分光測定に
よれば負荷量は85μモル/gである。

例2. 例１と同様にして、次の保護されたヌクレオシドポリス
チレン樹脂を調製する。

5-（4-メトキシトリチル）‐チミジンから ５′‐（4-メトキシトリチル）‐N-イソブチリル‐デオ
キシグアノシンから 例3.トリヌクレオチド の合成 ａ）ジヌクレオチドの合成 7.73g（15mモル）の５′‐（4-メトキシトリチル）‐チ
ミジン（MMT-O-T-OH）を純ピリジンと共に２回蒸発処理
する。残基を20mlの純テトラヒドロフランに溶解し、テ
トラヒドロフラン中0.2Mの2-クロロフェニル‐ジ‐（1-
ベンゾトリアゾール）‐ホスフェートの溶液80mlに、攪
拌及び水分遮断のもとで滴加し、そして反応混合物を室
温にて１時間攪拌する。得られた2-クロロフェニル‐1-
ベンゾトリアゾリル‐５′‐（4-メトキシトリチル）‐
チミジル‐３′‐ホスフェートを３つに分ける。

α）トリエチルアンモニウム‐2-クロロフェニル‐５′
‐（4-メトキシトリチル）‐チミジン‐３′‐ホスフェ
ートへの加水分解 2-クロロフェニル‐1-ベンドトリアゾリル‐５′‐（4-
メトキシトリチル）‐チミジン‐３′‐ホスフェートの
上記溶液の1/3に、冷却下で100mlの0.5M炭酸水素トリエ
チルアンモニウムを加える。15分間の後、塩化メチレン
により抽出する。塩化メチレン溶液を水で洗浄し、濃縮
し、そして石油エーテルを滴加する。生じた沈澱を取
し、エーテル／石油エーテル（1:1）で洗浄し、そして
真空乾燥する。TLC:Rf＝0.35、ジクロロメタン／メタノ
ール／水（75:22:3）。

β）2-シアノエチル‐2-クロロフェニル‐５′‐（4-メ
トキシトリチル）‐チミジン‐３′‐ホスフェートへの
エステル化、及び4-メトキシトリチル保護基の除去 2-クロロフェニル‐1-ベンゾトリアゾリル‐５′‐（4-
メトキシトリチル）‐チミジン‐ホスフェートの溶液の
1/3に、1.3mlの2-シアノエタノール及び2mlのピリジン
を加える。この混合物を一夜室温に置く。溶剤を真空蒸
発せしめ、そして残渣を酢酸エチルに溶解し、そして0.
1M燐酸緩衝液（pH7）で数回、及び水と共に振とうす
る。有機相を乾燥し、一緒にし、そしてヘキサン中に適
加する。沈澱を取し、50mlのジクロロメタン／メタノ
ール（7:3）に溶解し、そして０℃にて、75mlの塩化メ
チレン／メタノール（7:3）中3.8gのp-トルエンスルホ
ン酸一水和物の溶液と混合する。２時間後、反応溶液を
塩化メチレンで稀釈し、そして冷炭酸水素ナトリウム溶
液と共に振とうする。有機相を濃縮し、そしてヘキサン
により沈澱せしめる。沈澱した2-シアノエチル‐2-クロ
ロフェニル‐チミジン‐３′‐ホスフェートを、シリカ
ゲル上で塩化メチレン／メタノール（96:4）によりクロ
マトグラフ処理する。TLC:Rf＝0.45、塩化メチレン／メ
タノール（9:1）。

γ）５′‐（4-メトキシトリチル）‐３′‐（2-シアノ
エチル）‐ビス‐チミジン‐ジヌクレオチドへの縮合 2.2gの2-シアノエチル‐2-クロロフェニル‐チミジン‐
３′‐ホスフェートを、純ピリジンと共に２回蒸発せし
めることにより脱水し、20mlの純テトラヒドロフランに
溶解し、そして2-クロロフェニル‐1-ベンゾトリアゾリ
ル‐５′‐（4-メトキシトリチル）‐チミジン‐３′‐
ホスフェートの溶液の残りの1/3に加える。室温で18時
間置いた後、反応溶液に、氷冷しながら10mlの水及び20
0mlの酢酸エチルを加える。有機相を炭酸水素ナトリウ
ム及び水で数回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥し、
そして少容量に濃縮する。ホスフェート部分において、
及び５′‐又は３′‐末端において保護されたジヌクレ
オチドを、エーテル／ヘキサン（1:1）に滴加すること
により沈澱せしめる。TLC:Rf＝0.48、塩化メチレン／メ
タノール（9:1）。

ｂ）トリヌクレオチドの合成 上記の完全に保護されたジヌクレオチド1.17g（1mモ
ル）を、30mlの塩化メチレン／メタノール（7:3）に溶
解し、そして氷冷しながら、20mlの塩化メチレン／メタ
ノール（7:3）中1.9gのn-トルエンスルホン酸一水和物
と混合する。２時間後、氷冷した炭酸水素ナトリウム溶
液を加え、そして塩化メチレンで抽出する。有機相を乾
燥し、濃縮し、そしてヘキサンに滴加する。沈澱した遊
離５′‐ヒドロキシル基を有する粗ジヌクレオチドをシ
リカゲル上で、塩化メチレン中２〜８％メタノールのグ
ラジエントによりクロマトグラフ処理する。TLC:Rf＝0.
33、塩化メチレン／メタノール（9:1）。

850mgのこの５′‐ヒドロキシ‐ジヌクレオチド及び1.0
6gのトリエチルアンモニウム‐2-クロロフェニル‐５′
‐（4-メトキシトリチル）‐チミジン‐３′‐ホスフェ
ート〔段階ａ）α）を参照のこと〕を、ピリジンと共に
２回蒸発処理し、そして10mlの純ピリジンに溶解し、そ
して560mgのメシチレンスルホニル‐3-ニトロ‐1,2,4-
トリアゾリド（MSNT）を加える。２時間後、2mlの氷冷
水を加え、さらに１時間後塩化メチレンにより抽出す
る。有機相を炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄し、乾燥
し、濃縮し、そしてエーテルを加える。沈澱したトリヌ
クレオチドをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製
する。Rf＝0.45、塩化メチレン／メタノール（9:1）。

例4. 例３と同様にして、次の一般式、 で表わされる下記の保護されたトリヌクレオチドを得
る。B¹B²B³で表わし、ヌクレオチドB¹、B²、B³を次の略
号で表わす。

A:N-ベンゾイル‐デオキシアデノシン C:N-ベンゾイル‐デオキシシチジン G:N-イソブチリル‐デオキシグアノシン T:チミジン 例5.相補DNA鎖の塩基No172から塩基No232までの61塩基
の長さのDNA断片 （172/61相補体）の合成 ａ）トリヌクレオチドの2-シアノエチル保護基の除去 例３又は４からのトリヌクレオチド15μモルを水分を遮
断した状態で60μｌのピリジン／アセトニトリル／トリ
エチルアミン（1:1:1）に溶解する。室温で１時間置い
た後、0.7mlの過酸化物不含エーテルを滴加し、そして
沈澱を遠心分離する。粗トリエチルアンモニウム塩を50
μｌのピリジンに溶解し、そしてさらに0.5mlのエーテ
ルで沈澱せしめ、遠心分離し、そして15時間高真空下で
乾燥する。

ｂ）部分保護されたトリヌクレオチドとポリスチレン樹
脂に結合したオリゴヌクレオチド鎖との連結 すべての操作は水分を遮断した状態で、280μｌの内容
積を有する反応容器中で、マイクロプロセサーにより制
御された溶剤及び試薬の供給のもとで行う。17.6mg（1.
5μモル）のシチジン‐ポリスチレン樹脂（例１）を反
応容器中に入れ、そして次の操作を行う。

1.塩化メチレン、2ml/分、５分間。

2.塩化メチレン／イソプロパノール（85:15）、2ml/
分、２分間。

3.塩化メチレン／イソプロパノール（7:3）中臭化亜鉛1
M及び1,2,4-トリアゾール0.02M、1ml/分、２〜3.5分
間。

4.塩化メチレン／イソプロパノール（85:15）、2ml/
分、３分間。

5.DMF中トリエチルアンモニウムアセテート 0.5M,2ml/分、10分間。

6.分子篩乾燥ピリジン、2ml/分、５分間。

7.テトラヒドロフラン（過酸化物不含、分子篩乾燥）、
2ml/分、５分間。

8.窒素流子、10分間。

9.160μｌのピリジンに溶解した15μモルのトリヌクレ
オチド〔段階ａ〕からのトリメチルアンモニウム塩〕及
び13.3mg（45μモル）メシチレンスルホニル‐3-ニトロ
‐1,2,4-トリアゾリド（MSNT）の注入。

10.40℃、30分間。

11.ピリジン、2ml/分、５分間。

12.ピリジン中無水酢酸５％及び4-ジメチルアミノピリ
ジン2.5％、2ml/分、５分間。

13.ピリジン、2ml/分、５分間。

14.ピリジン／イソプロパノール（1:1）、2ml/分、３分
間。

14の操作のすべてを19回反復する。この場合、９の操作
はAAAの代りにそれぞれ下記のトリヌクレオチドをそれ
らのトリエチルアンモニウム塩の形〔段階ａ）〕で導入
する:AGA、TGT、 GGT、CTG、TAC、TAG、CGT、CAA、TAA、GGT、CAT、GAA、
GCG、CAT、CAA、 AAC、CCT、GAT、CAG。

平均連結収率は96％である。最終生成物は次の構造を有
する。

MMT-CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAGTACC
TGGGTTGTAGAAAAC-ポリスチレン ｃ）担体からのDNA断片の切断及び保護基の除去 40.2mg（約0.66μモル）のDNA-合成樹脂/172/61相補体
を、66mg（0.40mモル）のｏ−ニトロベンザルドキシム
及び50μｌ（0.40mモル）の1,1,3,3-テトラメチルグア
ニジンと共に、400μｌの95％ピリジン中に50℃にて３
時間、そして室温にて12時間保持する。ピリジンを窒素
によって除去した後、残渣に1.6mlのアンモニア水（33
％）を加え、そして密閉容器中で50℃にて24時間保持す
る。

分離した液相から、真空中でアンモニアを除去し、そし
て3mlずつの過酸化物不含ジエチルエーテルで３回洗浄
する。低分子成分を除去した後、ビオゲルP6カラム（10
0〜200メッシュ、３×66cm、0.01モル炭酸水素トリメチ
ルアンモニウム、pH7.5、1.5ml/分）において285OD（26
0nm）のDNAを分離する。

合計60ODをHPLC-カラム（PRP-1/ハミルトン、250×1.6m
m）において分離する。グラジエント〔溶液A:0.05M酢酸
トリエチルアンモニウム（pH7.0）；溶液B:溶液A/アセ
トニトリル（1:1）〕:A中30％のＢ→Ａ中60％のＢ、20
分間、50℃にて2ml/分間。親脂性主ピーク（リテンショ
ンタイム約14分）を集め、DE52-セルロース（ワットマ
ン）カラムで濃縮し、溶出し、そしてエタノールで沈澱
せしめる。4-メトキシトリチル‐保護基を除去するた
め、沈澱を50μｌの酢酸／水（4:1）に溶解し、そして
室温に45分間保持する。反応生成物を凍結乾燥し、エタ
ノールで沈澱せしめ、そして精製のために８％ポリアク
リルアミド（7M尿素）上で電気泳動分離する。予想され
るDNAの大きさに対応するバンドを切り出し、そして生
成物を電気溶出し、DE52-セルロース上で濃縮し、そし
て次の構造:5′‐CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAAC
AACGTTAGTACCTGGGTTGTAGAAAAC-3′を有するDNAをエタノ
ールで沈澱せしめる。

例6. 例５と同様にして、下記のDNA断片（５′‐３′）を調
製する。

さらに、下記の短い断片を調製する。

1/40（Δ12）（Ｃ′） CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTT 1/40（Δ18）（Ｃ″） CTGGAATTCATGCTGAAATCTT 例7.断片30/37、67/34、124/61、及び172/61の燐酸化 ５′‐末端の燐酸化及び放射性標識は、（19）に記載さ
れているようにして〔γ‐³²P〕ATP、及びT₄ポリヌクレ
オチドキナーゼ（ベーリンガー）を用いて行う。

例8.デュプレックスIII（エグリンＣ遺伝子及びエグリ
ンＢ遺伝子の断片F₂）への重合 50pモルずつのキナーゼ処理断片124/61、及びキナーゼ
処理断片172/61を24μｌの水に溶解し、この溶液を90℃
にて３分間加熱し、５分間で12℃に冷却する。４μｌの
エンド‐Ｒ緩衝液（0.1MTris・HCl、pH7.5、66mM MgC
l₂、66mM β‐メルカプトエタノール、0.6M NaCl）、10
μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフェート混合物
（それぞれ２×10^-3MのdATP、dCTP、dGTP、TTP、NH₃に
よりpHを7.0に調整したもの）、及び２μｌ（10ユニッ
ト）のDNAポリメラーゼIKlenow断片（ベーリンガー）を
加えた後、12℃にて30分間インキュベートする。90℃に
て３分間加熱することにより反応を停止せしめ、そして
混合物を、さらに処理するために−80℃にて貯蔵する。

同様にして、断片1/40と30/37、67/34と91/37（Ｃ）、
及び67/34と91/37（Ｂ）をデュプレックＩ、II（Ｃ）、
及びII（Ｂ）に重合せしめる。

デュプレックスＩ〜IIIは次の構造を有する。

同様にして、断片1/40（Δ12）（Ｃ′）と30/37、及び
断片1/40（Δ18）（Ｃ″）と30/37を、デュプレックス
Ｉ（Ｃ′）及びＩ（Ｃ″）に重合せしめる。

例9.デュプレックスＩとデュプレックスII（Ｃ）との連
結、エグリンＣ遺伝子の断片F₁（Ｃ）の調製 60pモルずつのデュプレックスＩ及びデュプレックスII
（Ｃ）（例８を参照のこと;5′‐末端のＡ及びＧのみが
キナーゼ処理されている）を54μｌのリガーゼ緩衝液66
mM Tris・HCl,pH7.5、6.6mM MgCl₂、10mMジチオスレイ
トール、5mM ATP）に溶解し、6ml（６ユニット）のT₄‐
DNAリガーゼ（ベーリンガー）を加え、そして20℃にて2
1時間インキュベートする。70℃にて５分間加熱するこ
とによって反応を停止せしめ、そしてフェノール／クロ
ロホルム抽出、及びエタノール沈澱の後DNAを分離す
る。

混合物を８％ポリアクリルアミドゲル（天然）電気泳動
により分離した後、122〜132塩基対を有する連結生成物
を電気溶出し、DE52-セルロースカラムに濃縮し、そし
て溶出した後、エタノール沈澱により分離する。

エグリンＣ遺伝子の断片F₁（Ｃ）は次の構造を有する。

同様にして、60pモルずつのデュプレックスＩ（Ｃ′）
又はＩ（Ｃ″）とデュプレックスIIとを連続してエグリ
ンＣ遺伝子の断片F₁（Ｃ′）又はF₁（Ｃ″）を得る。

部分断片F₁（Ｃ′）、及びF₁（Ｃ″）は次の構造を有す
る。

例10.デュプレックスＩとデュプレックスII（Ｂ）との
連結、エグリンＢ遺伝子の断片 F₁（Ｂ）の調製 例９に記載したのと同様にして、60pモルずつのデュプ
レックスＩとデュプレックスII（Ｂ）とを相互に連結す
る。

エグリン（Ｂ）遺伝子の部分断片F₁（Ｂ）は次の構造を
有する。

例11.エグリンＣ遺伝子のF₁（Ｃ）‐DNAを含有するプラ
スミドpML87の調製（第２図） ａ）線状化されたベクターpBR322/EcoRI/BalIの調製 30μｇのpBR322プラスミドDNAを５ユニットのBalI制限
エンドヌクレアーゼ（ビオラブス）により、100μg/ml
のゼラチンからの溶液200μｌ中で37℃にて５時間消化
する。次にこの溶液を100mM Tris・HCl（pH7.5）、50mM
NaCl調整し、そしてDNAを30ユニットのEcoRI制限エン
ドヌクレアーゼ（ビオラブス）により37℃にて２時間消
化する。次のこの溶液をTNEに調整し、１容量のフェノ
ール及びクロロホルムにより抽出し、そして消化された
DNAを２容量のアルコールにより−20℃にて一夜沈澱せ
しめる。

pBR322DNAから切り出されたベクター（pBR322/EcoRI/Ba
lI、2916塩基対）を、50mM Tris・HCl（pH8）及び1mM E
DTA中シュークロース（５〜23％）の密度勾配遠心分離
により小DNA断片（1445bp）から分離する。遠心分離
は、TST41ローター（コントロンAG）中15℃にて16時
間、36,000rpmにて行う。次に、遠心分離された溶液か
ら、0.2mlずつの画分をISCO勾配コレクターにより得
る。大DNA断片（2916bp）を含有する各画分を一緒に
し、そしてDNAをアルコールで沈澱せしめる。沈澱物を1
00μｌの10mM Tris・HCl（pH8）、0.1mM EDTAの溶液に
溶解し、そしてクローニングベクターとして使用するま
で−20℃にて貯蔵する。5.1μｇ（10.5モル）のDNAが得
られる。

ｂ）F₁（Ｃ）‐DNA/EcoRIの調製 16ng（0.84pモル）の化学合成F₁（Ｃ）‐DNA（例９を参
照のこと）を５ユニットのEcoRI制限エンドヌクレアー
ゼ（ビオラブス）により、50μｌの100mM Tris・HCl（p
H7.5）、50mM NaCl及び100μg/mlゼラチンの溶液中で37
℃にて１時間消化する。次に、この溶液に0.5μｇ（1p
モル）の線状化ベクターpBR322/EcoRI/BalI（例11a）を
加える。次に、酵素を65℃にて10分間加熱することによ
り不活性化し、溶液をTNEに調整し、そしてフェノール
／クロロホルムで抽出する。DNAをアルコールで沈澱せ
しめる。沈澱したDNAは、アルコールのもとで−20℃に
てさらに処理するまで貯蔵する。

ｃ）pBR322/EcoRI/BalIベクターDNAとF₁（Ｃ）‐DNA/Ec
oRIとの連結、及びプラスミドpML87の造成 上記の両DNA断片を含有する、例11bにおいて得られたDN
A沈澱物を、30μｌの50mM Tris・HCl（pH7.8）、10mM M
gCl₂、10mM DTT、0.5mM ATP、100μg/mlゼラチンの溶液
に溶解し、そして25ユニット／μｌのT₄DNAリガーゼ
（ビオラブス）により15℃にて16時間処理する。こうし
て、F₁（Ｃ）‐DNAを含有する組換プラスミドpML87が溶
液中に生ずる。

ｄ）プラスミドpML87によるE.コリHB101の形質転換 形質転換のために欠くことができないカルシウムで前処
理されたE.コリHB101細胞を、Mandel等（６）の方法に
より調製する。

組換プラスミドpML87を含有するｃ）において得られた
溶液を65℃にて10分間加熱してT₄‐DNAリガーゼを不活
性化し、そして次に37℃に冷却する。10μｌのこの反応
混合物を、10mM MgCl₂及び10mM Tris・HCl（pH7.5）中1
50μｌのカルシウム処理E.コリHB101細胞に加え全体を2
00μｌとする。

次に、この混合物を氷中で30分間冷却し、42℃に２分間
加温し、そして次に37℃にて50分間L-培地（例21を参照
のこと）1ml中に置く。この混合物の0.2mlずつのアリコ
ートを、60μg/mlのアンピシリン（セルバ）を含有する
寒天プレート（Mc Coukey-寒天、ディフコ）５枚に塗布
する。次に、寒天プレートを37℃にて16〜18時間置く。
形質転換されたE.コリHB101のアンピシリン耐性コロニ
ー470個が得られる。

ｅ）F₁（Ｃ）‐DNAを含有するコロニーのスクリーニン
グ 470個の形質転換されたコロニー（例11d）を、ニトロセ
ルロースフィルターB85（シュライヘル及びシュール）
にレプリカする。

Grunstein及びHogness（24）の方法によりコロニーを溶
解し、その変性DNAをフィルター上に固定する。次に、2
0ml（フィルター当り）の４×SET〔30mM Tris・HCl（pH
8）、150mM NaCl、1mM EDTAの溶液〕、0.1（g/V）フィ
コール400（ファルマシア）、0.5％SDS、50μg/l変性子
ウシ胸腺DNAの溶液中で、フィルターを前ハイブリド形
成処理する。次にこのニトロセルロースフィルターを、
20ml（フィルター当り）の５×SET（g/V）フィコール40
0、0.2％SDS及び50μg/ml変性子ウシ胸腺DNAの溶液中
で、64℃にて16時間、³²P‐放射性標識プローブ（約10³
〜10⁴Cerencov cpm/フィルター）で処理する。プローブ
としてオリゴヌクレオチド91/37相補体（Ｃ）（例６参
照のこと）を用いる。

次に、フィルターを２×SET、0.2％SDS中、室温にて２
回洗浄し、次に２×SET、0.5％SDS中で60℃にて２回
（少なくとも30分間、次に60分間）洗浄する。次にフィ
ルターを3MM紙（ワットマン）の間で乾燥し、そして−8
0℃にてＸ線フィルター（フジ）上で強化スクリーンを
用いて１〜２日間暴露する。

得られたオートラジオグラムは71個の陽性コロニー（ク
ローン）を示し、これらは次の検討のために使用するこ
とができる。その１つをpML87と称する。

同様にして、化学合成F₁（Ｃ′）‐DNA、及びF
₁（Ｃ″）‐DNA（例９を参照のこと）のそれぞれをEcoR
Iにより消化し、そして線状化されたベクターpBR322/Ec
oRI/BalIに連結する。この場合、F₁（Ｃ′）‐DNAを含
有するプラスミドpML87（Ｃ′）、及びF₁（Ｃ″）‐DNA
を含有するプラスミドpML87（Ｃ″）がそれぞれ生ず
る。E.コリHB101細胞をプラスミドpML（Ｃ′）、又はpM
L87（Ｃ″）で形質転換し、そしてアンピリシン含有寒
天プレート上で培養する。それぞれ92個及び120個のア
ンピリシン耐性コロニーを得る。形質転換されたコロニ
ーをオリゴヌクレオチド91/37相補体（Ｃ）によりスク
リーニングすることにより、F₁（Ｃ′）‐DNAを含有す
る37個のコロニー、及びF₁（Ｃ″）‐DNAを含有する58
個のコロニーを得る。

例12.エグリンＢ遺伝子のF₁（Ｂ）‐DNAを含有するプラ
スミドpML90の調製 例11bに記載したのと同様にして、16μｇの化学合成F₁
（Ｂ）‐DNAを５ユニットのEcoRI制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、そして線状化されたベクターpBR322/EcoRI
/BalIと混合する。酵素を不活性化し、そしてDNAをアル
コールで沈澱せしめる。DNA沈澱物を例11cに準じてT₄DN
Aリガーゼに処理し、これによってＦ（Ｂ）‐DNAを含有
するプラスミドが生ずる。

組換プラスミドを含有する溶液を、例11dに対応して、
カルシウム処理されたE.コリHB101細胞を形質転換する
のに用いる。形質転換されたE.コリHB101のアンピシリ
ン耐性コロニー310個が得られる。

310個のコロニーを、例11eと同様にして、プローブとし
てオリゴヌクレオチド91/37相補体（Ｂ）を用いて、F₁
（Ｂ）‐DNAの存在について試験する。得られたオート
ラジオグラムにおいて、55個が陽性であり、後の検討に
使用し得るコロニーであることが明らかになった。これ
らの内の１つをpML90と称する。

例13.F₂‐DNAを含有するプラスミドpML136の調製（第３
図） ａ）線状化ベクターpBR322/BamHI/NruIの調整 15μｇのpBR322プラスミドDNAを、30ユニットのBamHI制
限エンドヌクレアーゼを用いて37℃にて30分間、100mM
NaCl、6mM Tris・HCl（pH7.9）、6mM MgCl₂及び100μg/
mlゼラチンの溶液中で消化する。次に、この溶液に15ユ
ニットのNruI制限エンドヌクレアーゼを加え、そして37
℃にて２時間消化する。

反応混合物を70℃にて10分間加熱して酵素を不活性化す
る。次に、両DNA断片をEDTA緩衝液（pH8）中１％低融ア
ガロースゲル電気泳動により分離する。アガロースゲル
中のDNAをEtBrにより着色した後、pBR322/BamHI/NruIベ
クターのDNAバンド（3766bp）を含有するゲル部分をゲ
ルから切り取り、そして65℃にて10分間液化する。次
に、液化したアガロースゲル断片に２容量の100mM Tris
・HCl（pH8.7）を加え、そして混合物を37℃に冷却す
る。このDNA混合物を0.5ユニットの子ウシ腸アルカリ性
ホスファターゼ（ベーリンガー）により37℃にて30分間
消化する。溶液65℃にて60分間加熱することにより酵素
を不活性化する。

このホスファターゼ処理DNA溶液に20容量のTNEを加え、
そしてMueller等（23）の方法に従って、DE-52クロマト
グラフィーによりDNAを精製し、フェノール／クロロホ
ルム混合物で抽出し、そしてDNAを−20℃において一夜
アルコールで沈澱せしめる。DNA沈澱物を50μｌの0.01M
Tris・HCl（pH8）、0.1mM EDTAの溶液に溶解し、そし
て使用まで−20℃にて貯蔵する。1.5μｇ（2.4pモル末
端）のDNAを得る。

ｂ）F₂‐DNA/BamHIの調製 1.6μｇ（90pモル末端）の化学合成F₈‐DNA（例８）を1
6ユニットのBamHI制限エンドヌクレオチド（ビオラブ
ス）により20μｌの150mM NaCl、6mM Tris・HCl（pH7.
9）、6mM MgCl₂及び100μg/mlゼラチンの溶液中で、37
℃にて30分間消化する。次に、この溶液に60ng（96nモ
ル末端）の線状化ベクターpBR322/BamHI/NruI（例13a）
を加え、全体をTNEに調整し、そしてフェノール／クロ
ロホルムで抽出し、そしてDNAを２容積のアルコールで
沈澱せしめる。沈澱したDNAを、次に使用するまでアル
コールのもとで−20℃にて貯蔵する。

ｃ）pBR322/BamHI/NruIベクターDNAとF₂‐DNA/BamHIと
の連結、及びプラスミド pML136の造成 例13b）に従って得られたDNA沈澱物（前記の両DNA断片
を含有する）を、20μｌの50mM Tris・HCl（pH7.8）、1
0mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mM ATP、100μg/mlゼラチン
の溶液に溶解し、そして15ユニット／μｌのT₄DNAリガ
ーゼ（ビオラブス）により15℃にて３時間処理する。こ
れにより、溶液中に、F₂‐DNAを含有する組換プラスミ
ドpML136が生成する。

ｄ）プラスミドpML136によるE.コリHB101の形質転換 カルシウム処理されたE.コリHB101細胞の形質転換を例1
1d）に記載した方法と同様にして行う。例13c）におい
て得られた反応混合物10μｌを使用する。65個のアンピ
シリン耐性コロニーを得る。

ｅ）F₂‐DNAを含有するコロニーのスクリーニング 65個の形質転換されたコロニー（例13d）を、例11e）に
記載した方法と同様にしてF₂‐DNAについて試験する。
放射性プローブとしてオリゴヌクレオチド172/61相補体
（例５を参照のこと）を使用する。オートラジオグラム
において２個の陽性コロニーが得られる。この内の１つ
をpML136と称する。

例14.クローンpML87、pML90及びpML136の特徴付け 組換プラスミドpML87、pML90、及びpML136のDNAをIsh-H
orowitz（25）の方法に従って分離する。F₁（Ｃ）‐DNA
挿入部、F₁（Ｂ）‐DNA挿入部及びF₂‐DNA挿入部のヌク
レオチド配列をMaxam及びGilbertの方法に従って決定す
る。この目的のために、それぞれ10μｇの、pML87及びp
ML90からのプラスミドDNAをCooRI制限エンドヌクレアー
ゼにより、そして10μｇのpML136由来プラスミドDNAをB
amHI制限エンドヌクレアーゼにより切断し、そして線状
化されたDNAをアガロースゲル溶出により分離する〔例1
1a）及び13a）を参照のこと〕。次に、分離されたDNAを
アルカリ性ホスファターゼにより消化し、そしてDE-52
上でクロマトグラフ処理する（例13aを参照のこと）。
次に、DNAを５′‐末端において、〔γ‐³²P〕ATP（比
活性＞5000Ci/mモル、アマーシャム）及びT₄‐ポリヌク
レオチドキナーゼ（P-L-ビオケミカルス）により放射性
標識する。

次に放射性標識されたDNAを第２の制限エンドヌクレア
ーゼ（PvuII）により切断する。生じたDNA断片をアガロ
ースゲル溶出により分離する。次に、pML87及びpML90の
場合にはPvuII-EcoRI^*断片（約2190bp）中のF₁（Ｃ）‐
DNA又はF₁（Ｂ）‐DNAのヌクレオチド配列を決定し、pM
L136の場合にはPvuII-BamHI^*断片（約1815bp）中のF₂‐
DNAのヌクレオチド配列を決定する。（^*は放射性標識さ
れたDNA-末端を示す） F₁（Ｃ）‐DNA、F₁（Ｂ）‐DNA、及びF₂‐DNAについて
決定されたヌクレオチド配列は例８〜10において記載し
たそれと同じである。

例15.F₁（Ｃ）‐F₂‐DNAを含有するプラスミドpML141の
調製 ａ）線状ベクターpBR322/EcoRI/BamHIの調製 10μｇのpBR322プラスミドDNA10ユニットずつのEcoRI制
限エンドヌクレアーゼ及びBamHI制限エンドヌクレアー
ゼ（ビオラブス）により100μｌの50mM Tris・HCl（pH
7.5）、50mM NaCl、6mM MgCl₂、及び100μg/mlゼラチン
の溶液中で37℃にて１時間消化する。次にこの溶液をTN
Eに調整し、１容量のフェノール及びクロロホルムで抽
出し、そしてDNAを２容量のアルコールにより−20℃に
て一夜沈澱せしめる。

pBR322のDNAから切り出されたベクター（pBR322/EcoRI/
BalI,3986bp）を、50mM Tris・HCl（pH8）及び1mM EDTA
の溶液中シュークロース（５〜23％）において、密度勾
配遠心分離により小DNA断片（376bp）から分離する。遠
心分離は、TST41ローター（コントロンAG）中で30,000r
pmにて15時間、15℃において行う。次に、遠心分離され
た溶液から、約0.2mlずつの画分をISCO勾配コレクター
により得る。大DNA断片（3986bp）を含有する各画分を
一緒にし、そしてDNAをアルコールで沈澱せしめる。沈
澱を、100μｌの50mM Tris・HCl（pH8）中で、0.3ユニ
ットの子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガ
ー）を用いて37℃にて30分間消化する。溶液を65℃にて
１時間加熱することにより酵素を不活性化する。次に、
溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてDNA
をアルコールにより−20℃にて一夜沈澱せしめる。沈澱
物を50μｌの10mM Tris・HCl（pH8）、10mM EDTAの溶液
に溶解し、そしてクローニングベクターとして使用する
まで−20℃にて貯蔵する。3.75μｇのDNA（5.7pモル末
端）を得る。

ｂ）F₁（Ｃ）‐DNA/EcoRI/HpaII、及びF₂‐DNA/BamHI/H
paIIの調製 I.F₁（Ｃ）‐DNA/EcoRI/HpaIIの調製 pML87のプラスミドDNA10μｇをまず20ユニットのHpaII
制限エンドヌクレアーゼにより、100μｌの10mM Tris・
HCl（pH7.4）、6mM KCl、10mM MgCl₂、1mM DTT及び100
μg/mlゼラチンの溶液中で消化する。次に、溶液をフェ
ノール／クロロホルムで抽出し、そして生成したDNA断
片を−20℃にてアルコールで沈澱せしめる。

次に、DNA断片混合物を、Tris-アセテート‐EDTA緩衝液
pH8中６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離
する。最大のDNA断片（586bp）をゲル溶出により分離
し、そして次にEcoRI制限エンドヌクレアーゼにより切
断する（例11aを参照のこと）。生成したDNA断片混合物
を、再度８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
る。こうして、40ngのF₁（Ｃ）‐DNA/EcoRI/HpaII（127
bp）を分離する。

II）F₂‐DNA/BamHI/HpaIIの調製 pML136のプラスミドDNA20μｇを20ユニットのBamHI制限
エンドヌクレアーゼにより切断する。この線状化プラス
ミドDNA/BamHIのアリコート（１μｇ）を、アガロース
ゲルを用いるゲル溶出により分離し（例13aを参照のこ
と）、そして〔γ‐³²P〕ATPにより放射性標識する（例
14）。次に、プラスミドDNA/BamHIの大部分を、この放
射性標識DNAと混合し、PvuII制限エンドヌクレアーゼで
消化し、そして１％アガロースによるゲル電気泳動の後
PvuII-BamHI^*断片（1203bp）を分離する。14μｇのPvuI
-BamHI^*断片をHpaII制限エンドヌクレアーゼで消化し
（上記参照のこと）、次にDNA混合物を８％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分離し、そして150ngのF-D
NA/BamHI^*/HpaII（109bp）をゲル溶出により単離する。

ｃ）F₁（Ｃ）‐DNAとF₂‐DNAとの連結、及びプラスミド
pML141の造成 10ng（473nモル末端）のF₁（Ｃ）‐DNA/EcoRI/HpaII、
及び9ng（495nモル末端）のF₂‐DNA/BamHI/HpaIIを、20
μｌのみ容量中でT₄‐DNAリガーゼにより、例13cに記載
したのと同様にして処理する。次に、混合物をフェノー
ル／クロロホルム抽出し、そしてDNAをアルコールで沈
澱せしめる。次に、DNA沈澱物を例13aに記載したように
して溶解し、そしてEcoRI及びBamHI制限エンドヌクレア
ーゼで消化する。次に、溶液をTNEに調整し、そして30n
g（50nモル末端）のベクターDNA pBR322/EcoRI/BamHI
（例15a参照のこと）を加える。次に、この溶液を再度
フェノール／クロロホルムで抽出し、そしてDNAをアル
コールで沈澱せしめる。沈澱したDNA混合物を例13cに記
載したようにしてT₄‐DNAリガーゼで処理する。こうし
て、挿入部としてF₁（Ｃ）‐F₂‐DNA（エグリンＣ遺伝
子）を含有する組換プラスミドを溶液中に形成する。

ｄ）プラスミドpML141によるE.コリHB101の形質転換 カルシウム処理E.コリHB101細胞の形質転換を例11dに記
載したのと同様にして行う。これは、例15cにおいて得
られた反応混合物を用いて行う。2586個のアンピシリン
耐性コロニーを得る。

ｅ）F₁（Ｃ）‐F₂‐DNAを含有するコロニーのスクリー
ニング 18個の形質転換コロニー（例15d）をそのF₁（Ｃ）‐F₂
‐DNAの含有について、例11eに記載したのと同様にして
試験する。放射性標識プローブとして、例５及び例６に
記載したオリゴヌクレオチドの混合物を使用する。オー
トラジオグラムにおいて13個の陽性コロニーが得られ、
この内４個をpML141、pML143、pML144、pML145と称す
る。

同様にして、プラスミドpML87（Ｃ′）、及び pML87（Ｃ″）を制限エンドヌクレアーゼHpaII及びEcoR
Iで切断し、生成したF₁（Ｃ′）‐DNA/EcoRI/HpaII、及
びF₁（Ｃ″）‐DNA/EcoRI/HpaIIを、 F₂‐DNA/BamHI/HpaIIと連結し、そして生成したF
₁（Ｃ′）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHI、及び F₁（Ｃ″）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHIを、線状化されたベ
クターpBR322/EcoRI/BamHIに連結する。F₁（Ｃ′）‐F₂
‐DNA、又はF₁（Ｃ″）‐F₂‐DNAを含有する得られたプ
ラスミドを用いて、カルシウム処理E.コリHB101細胞を
形質転換する。形質転換された細胞の培養により850個
及び585個のアンピシリン耐性コロニーを得る。形質転
換されたコロニーを、オリゴヌクレオチド91/37相補体
（Ｃ）を用いて、F₁（Ｃ′）‐F₂‐DNA、及びF
₁（Ｃ″）‐F₂‐DNAの存在について試験する。F
₁（Ｃ′）‐F₂‐DNAを含有する18個のコロニー、及びF₁
（Ｃ″）‐F₂‐DNAを含有する31個のコロニーを同定す
る。コロニーを１個ずつ選択し、pML141（Ｃ′）、及び
pML141（Ｃ″）と称する。

例16.F（Ｂ）‐F₂‐DNAを含有するプラスミドpML160の
調製 ａ）F₁（Ｂ）‐DNA/EcoRI/HpaIIの調製 F₁（Ｃ）‐DNA/EcoRI/HpaIIについて記載した（例15b
I）のと同様にして、pML90のプラスミドDNA10μｇをま
ずHpaIIで切断し、そして次にEcoRIで切断する。断片の
混合物を、前記のようにしてPAGEにより精製する。

ｂ）F₁（Ｂ）‐DNAとF₂‐DNAとの連結、及び組換プラス
ミドの造成 例15cに記載したようにして、10μｇのF₁（Ｂ）‐DNA/E
coRI/HpaII（前記参照）、及び９μｇのF₂‐DNA/BamHI/
HpaII（例15bII）から出発して連結を行う。生成したF₁
（Ｂ）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHIを、前記のようにして、3
0μｇのベクターDNA pBR322/EcoRI/BamHI（例15a参照）
と連結する。

生成した組換プラスミドを含有する溶液を用いてカルシ
ウム処理E.コリHB101細胞を形質転換する。15個の形質
転換されたクローンを、例11eに記載したようにして、
そのF₁（Ｂ）‐F₂‐DNAの含有について試験する。放射
性プローブとして、やはり例５及び例６において記載し
たオリゴヌクレオチドの混合物を使用する。オートラジ
オグラムにおいて６個の陽性コロニーが得られ、その１
つをpML160と称する。

例17.クローンpML141及びpML160の特徴付け pML141及びpML160のプラスミドDNAのそれぞれ10μｇず
つを、それぞれEcoRI及びBamHI制限エンドヌクレオチド
により消化する（例11a、及び13aを参照のこと）。pML1
41及びpML160の特徴付けを例14に記載したようにして行
う。

F₁（Ｃ）‐F₂‐DNA、及びF₁（Ｂ）‐F₂‐DNAについて決
定されたDNA配列は、前記の合成エグリンＣ遺伝子及び
エグリンＢ遺伝子のそれと同一である。

例18.発現プラスミドpML147の調製 ａ）trp-プロモーター‐オペレーターを含有する線状化
されたベクターpHRi148/EcoRI/BamHIの造成（第５図及
び第６図） A.プラスミドp159の造成 10μｇのプラスミドpBRHtrp（21）を50ユニットのEcoRI
（ビオラブス）により37℃にて60分間切断し、そして消
化混合物を、フェノール抽出の後、TST41ローター（コ
ントロンAG）中で、50mM Tris・HCl（pH8.0）1mM EDTA
中シュークロース密度勾配（５〜23％）により画分す
る。遠心分離は14時間、40,000rpm、15℃にて行う。0.3
mlの画分を、ISCO勾配コレクターにより1ml/分で集め
る。小断片を含有する画分を一緒にし、溶液をTNEに調
整し、そして２容量のエタノールにより−20℃にて沈澱
せしめる。エッペンDNAを、ドルフ遠心分離機により遠
心分離した後、100μｌの10mM Tris・HCl,pH7.5,0.5mM
EDTAの溶液中に溶解する。このDNA断片５μｇを５ユニ
ットのBglII（ビオラブス）により37℃にて60分間切断
する。反応混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出
し、そしてDNAを２容量のエタノールと共に−80℃にて1
0分間インキュベートし、そして遠心分離によりDNAを集
め、そしてあらたに50μｌの50mM Tris・HCl（pH8.0）
に溶解する。２μｌのこの溶液を取り出し（0.2μｇのD
NA）、そして50mM Tris・HCl（pH8.0）中10ng/μｌのDN
A濃度において１ユニットの子ウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼ（ベーリンガー）と共に37℃にて30分間インキ
ュベートする。溶液を65℃にて60分間加熱することによ
り酵素を不活性化する。0.04μｇのDNAを取り出し、そ
して10μCi〔γ‐‐³²P〕‐ATP（＞5000Ci/mモル、アマ
ーシャム）及び５ユニットのT₄ポリヌクレオチドキナー
ゼ（P-Lビオケミカルス）を用いて、20μｌの反応容積
において、50mM Tris・HCl（pH9.5）、10mM gCl₂、及び
5mM DTT中で、37℃にて30分間インキュベートして５′
‐末端をキナーゼ処理する。放射性プローブを非標識プ
ローブ（前記を参照のこと）と混合し、そしてDNA断片
をTST60ローター中で、50mM Tris・HCl（pH8.0）、1mM
EDTA中５〜23％のシュークロース密度勾配法により画分
する。遠心分離は、60,000rpm、15℃にて５時間行う。
0.2mlの画分を得る。各画分の放射能をCerencov線の測
定により決定し、そしてこれにより断片を同定する。小
DNA断片を含有する選択された画分を一緒にし、DNAを２
容積のエタノールにより沈澱せしめ、そして遠心分離後
20μｌの10mM Tris・HCl,pH7.5,0.5mM EDTA中に溶解す
る。³² P‐標識EcoRI-BalIIDNA断片を0.2ユニットのTaqI（ビ
オラブス）により、50μｌの容積中で37℃にて10分間部
分分解する。反応混合物を0.2％SDS、10％グリセリン、
10mM EDTA、0.05％ブロムフェノールブルーに調整し、
そしてDNA断片を６％ポリアクリルアミドゲル上Tris-ボ
レート‐EDTA（22）中で分離する。オートラジオグラム
において、選択されたEcoRI-TaqIを含有するバンド（最
大断片）を同定する。この断片（Ｌ、第５図を参照のこ
と）をゲルから抽出し、そして精製し（23）、そして10
μｌの10mM Tris・HCl,pH7.5,1mM EDTAの溶液に溶解す
る。

アクセプタープラスミドとしてClaI及びEcoRIにより切
断されたpBR322を使用する。２μｇのpBR322を４ユニッ
トのClaIにより、20μｌの反応容積中で37℃にて60分間
消化する。蛋白質をフェノールにより抽出し、そして次
にDNAを２容量のエタノールにより−80℃にて10分間沈
澱せしめる。DNAを遠心分離により集め、そして次に10
ユニットのEcoRI（ビララブス）により37℃にて30分
間、20μｌの反応容積中で消化する。次に、溶液に２容
量の0.1M Tris・HCl（pH8.7）を加え、そして１ユニッ
トの子ウシアルカリ性ホスファターゼ（ベーリンガー）
と共に37℃にて30分間インキュベートする。次に、ホス
ファターゼを、65℃での60分間のインキュベートにより
不活性化する。

100ngのアクセプタープラスミドを５μｌの断片L-DNAと
共に、15μｌの10mM gCl₂,20M Tris・HCl（pH7.8）,10m
M DDT,0.5mM ATPの溶液中で、反応溶液μｌ当り50ユニ
ットのT₄DNAリガーズ（ビオラブス）の存在下で２時間
インキュベートする。

５μｌのこの溶液を、10mM gCl₂,10mM CaCl₂及び10mM T
ris・HCl（pH7.5）中カルシウム処理E.コリHB101細胞
（６）の混合物150μｌに加え、全体を200μｌにする。
混合物を氷中で20分間冷却し、42℃にて１分間加熱し、
そして20℃にて10分間インキュベートする。1mlのトリ
プトン培地〔トリプトン培地は１の蒸留水中に10gの
バクトトリプトン（ディフコ）、1gの酵母エキス（ディ
フコ）、1gのグルコース、8gのNaCl及び294mgのCaCl₂・
2H₂Oを含有する〕を加え、そして混合物を37℃にて30分
間、300rpmで振とうしながらインキュベートする。この
混合物を２枚の50μg/mlのアンピシリン（シグマ）を補
充した寒天プレート（McConkey寒天、ディフコ、0.6ml/
プレート）上にプレートする。プレートを37℃にて12〜
17時間インキュベートする。

10個の異るコロニーからのプラスミドDNAを次のように
して分離する。

コロニーを用いて、25mlのエルレンマイヤーフラスコ
中、50μg/mlのアンピシリンを補充した10mlのトリプト
ン培地（上記と同様）に接種する。培養物を37℃、300r
pmにて15〜18時間振とうする。細胞を遠心分離（ソルバ
ルHS-4ローター、10分間、4000rpm、４℃）により集め
る。約0.1gの細胞を得、これを1mlの50mM Tris・HCl（p
H8.0）中に再懸濁する。0.25mlのリゾチウム溶液〔50mM
Tris・HCl（pH8.0）1ml中10mg;リゾチウムはシグマ
製〕を加え、そして０℃にて10分間インキュベートした
後、0.15mlの0.5mM EDTA（pH7.5）を加える。さらに10
分間０℃にて置いた後、60μｌの２％トリトンX-100
（メルク）を加える。０℃にて30分間置いた後、プロー
ブを15,000rpm、４℃にて30分間、ソルバルSA-600ロー
ター中で遠心分離する。上清液を１容量のフェノール
（TNE中飽和）により脱蛋白する。5000rpm、４℃にて10
分間遠心分離（ソルバルHB-4ローター）することにより
相を分離する。

上相を１容量のクロロホルムで２回抽出する。膵臓DNA
アーゼＡ（シグマ;TNE中10mg/mlにて、85℃で10分間前
加熱したもの）を最終濃度が25μg/mlとなるように加
え、そして混合物を37℃にて40分間インキュベートす
る。次に溶液を1M NaCl及び10％のポリエチレングリコ
ール6000（フルカ;120℃にて20分間オートクレーブ処理
したもの）に調整し、そして−10℃にて２時間インキュ
ベートする。沈澱物をソルバルHB-4ローター（20分間、
10,000rpm、０℃）中で集め、そしてあらためて100μｌ
のTNEに溶解する。DNA溶液を１容量のフェノールで抽出
し、そしてDNAを２容量のエタノールにより−80℃にて1
0分間沈澱せしめる。沈澱物をエッペンドルフ遠心分離
機中で遠心分離して散めそしてDNAを再度20μｌの10mM
Tris・HCl（pH7.5）及び0.5mM EDTAの溶液中に溶解す
る。10mlの培養物から８〜10μｇのプラスミドDNAを得
る。

プラスミドDNAを次の制限エンドヌクレオチドで消化す
ることにより分析する。

0.5μｇずつのプラスミドDNAを、酵素の供給者の指示に
従って標準的方法により、HpaI（ビオラブス）により、
及びHpaI（ビオラブス）とEcoRI（ビオラブス）によりC
laI（ビオラブス）により切断する。DNAを％アガロース
ゲル上40mM Tris・アセテート（pH7.8）、1mM EDTA及び
0.5μg/mlエチジウムブロミド中で画分する。所望のプ
ラスミドはHpaI部位を含有し、そして３回の消化の後、
大DNA断片のほかに、pBR322の小EcoRI-ClaI断片よりも
大きい２個の小断片を含有する。これらのプラスミドの
１つをp159と称する（第５図参照のこと）。

B.プラスミドpHRi145の造成 ２μｇのp159DNAを10ユニットのEcoRI（ビオラブス）に
より37℃にて30分間消化する。DNAをフェノールで抽出
し、そしてエタノールで沈澱せしめ、そして遠心分離し
た後10μｌの10mM Tris・HCl（pH7.5）、0.5mM EDTA中
に溶解する。EcoRIにより消化したDNAをさらに５ユニッ
トのDNAポリメラーゼ（Klenow断片（ベーリンガー）に
より、10mM gCl₂、10mM β‐メルカプトエタノール、50
mM NaCl、0.1mM dATP（Ｐ＆Ｌビオケミカルス）、0.1mM
dTTP（Ｐ＆Ｌビオケミカルス）の溶液中で12℃にて15
分間処理する。次に、85℃にて５分間インキュベートす
ることによりポリメラーゼを不活性化する。反応混合物
を、20mM Tris・HCl（pH7.8）、10mM gCl₂、10mM DTT、
0.5mM ATP（シグマ）の溶液中に10倍に稀釈し、そして
反応混合物μｌ当り30ユニットのT₄DNAリガーゼと共に1
5℃にて１時間インキュベートする。

50ngのDNAをE.コリに形質転換し（前記のようにし
て）、そして50μg/mlのアンピリシンを含有するMcConk
ey寒天プレートにプレートする。

10個の異るコロニーからのプラスミドDNAを、前記のよ
うにして分離する。プラスミドDNAを、EcoRIにより消化
することによって分析する。選択されたプラスミドはEc
oRI耐性である。分析は上記のようにして行う。選択さ
れたプラスミドをHRi145と称する（第５図）。

C.プラスミドpHRi148の造成 ２μｇのpHRi145のDNAを５ユニットのClaI（ベーリンガ
ー）により37℃にて60分間処理し、次にフェノール抽出
により脱蛋白する。DNAをエタノールで沈澱せしめ、そ
して20μｌの10mM Tris・HCl（pH7.5）、0.5mM EDTAに
溶解する。突出末端を前記のようにしてDNAポリメラー
ゼＩ（Klenow断片）を用いて満たす。但し、dATP及びdT
TPの代りにdCTP（Ｐ＆Ｌビオケミカルス）及びdGTP（Ｐ
＆Ｌビオケミカルス）を使用する。ポリメラーゼを、85
℃にて５分間インキュベートすることにより不活性化す
る。反応混合物に２容量の0.1M Tris・HCl（pH8.7）を
加え、そして0.5ユニットの子ウシ‐ホスファターゼ
（ベーリンガー）と共に37℃にて30分間インキュベート
する。反応混合物をフェノール抽出により脱蛋白する。
DNAをエタノールで沈澱せしめ、そして８μｌの10mM Tr
is・HCl（pH7.5）、0.5mM EDTAの溶液に溶解する。

次の構造 ５′‐GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3′ を有する化学合成DNAリンカーの５′‐末端を燐酸化す
る。この場合、8pモルのリンカーを ５μCi〔γ³²P〕‐ATP（5500Ci・ｍmol^-1、アモーシャ
ム）を用いて、0.1mM r ATP（シグマ）、50mM Tris・HC
l（pH9.5）、10mM gCl₂、5mM DDT及び２ユニットのT₄ポ
リヌクレオチドキナーゼＰ＆Ｌビオケミカルス）を含有
する８μｌの反応容積中で37℃にて30分間インキュベー
トする。−80℃に凍結することによって反応を停止す
る。

次に、放射性標識リンカーを１μｇのClaI及びホスファ
ターゼで処理し、そして0.5mMrATP（シグマ）、10mM DT
T（カルビオケム）、20mM Tris・HCl（pH7.8）、1mM gC
l₂及び800ユニットのT₄DNAリガーゼ（ビオラブス）を含
有する20μｌの反応容積中でpHRi145のDNA（前記を参照
のこと）と連結する。インキュベーションを15℃にて２
時間行う。リガーゼを85℃にて10分間インキュベートす
る。次に２容量の水を加え、塩化ナトリウム濃度を10mM
に調整し、そして20ユニットのKpnI（ビオラブス）を、
37℃にて30分間にわたって加える。フェノール及びクロ
ロホルムで抽出した後、混合物を0.9％低融アガロース
ゲル（ビオラド）により40mM Tris・アセテート（pH7.
8）、1mM EDTA及び0.5μg/mlエチジウムブロミド中で画
分する。同じ大きさのマーカーDNAと同じ移動性を示
す、UU照射により可視化されたバンドを、スカプレル
（scaplel）により切り取る。ゲル片を65℃にて５分溶
融し、そして次に37℃に冷却する。約20μｌを得る。５
μｌのこの溶液を取り出し、そして400ユニットのT₄リ
ガーゼ（ビオラブス）と共に、0.5mM ATP、10mM DTT、1
0mM gCl₂、20mM Tris・HCl（pH7.8）を含有する10μｌ
の反応容積中で15℃にて12時間インキュベートする。10
0mM Tris・HCl（pH7.5）、100mM CaCl₂及び100mM MgCl₂
の溶液1/10容量をリガーゼ混合物（15℃にて固化）に加
え、そして65℃にて５分間インキュベートする。次にこ
の溶液を用いてカルシウム処理E.コリHB101細胞を前記
のようにして形質転換する。50μg/mlのアンピリシンを
補充したMcConkey寒天プレート上にプレートする。

10個の異るコロニーのプラスミドDNAを上記のようにし
て分離し、そしてDNAを次の制限酵素分析にかける。各
場合に、0.5μｇのプラスミドDNAを、酵素製造者の指示
に従って、KpnI（ビオラブス）、NcoI（ビオラブス）、
及びEcoRI（ビオラブス）により次々と切断する。切断
生成物を１％アガロースゲル上、40mM Tris・アセテー
ト（pH7.8）、1mM EDTA及び0.5μg/mlのエチジウムブロ
ミド中で画分する。すべてのプラスミドはそれぞれ１個
これらの酵素の切断部位を示す。１つをHRi148と称す
る。

プラスミドHRi148はトリプトファンプロモーターオペレ
ーター、及びATGまでのリボゾーム結合部位及びATGを含
有する。エグリンＣ遺伝子及びさらに他の外来性遺伝子
を、このプラスミド中に１個のみ存在するEcoRI部位、N
coI部位及びKpnl部位を介して直接連結することができ
る。さらに、この構成は、対応する遺伝子上に存在しな
ければならない翻訳開始に必要なATGを伴わないで外来
性遺伝子を直接に連結し、そして発現することを可能に
する。このことは、NcoIで切断しそして接着末端をDNA
ポリメラーゼＩにより前記のようにして修復することに
より、又はKpnIで切断しそして接着末端をヌクレアーゼ
S₁で除去することにより容易に達成される。従って、プ
ラスミドHRi148は広範囲に応用し得る発現プラスミドで
ある。

D.線状化されたベクターpHRi148/EcoRI/BamIの調製 pHRi148のプラスミドDNA5μｇを制限エンドヌクレアー
ゼEcoRI及びBamHIにより、例15aに記載したようにして
消化する。切り出されたベクターpHRi148/EcoRI/BamHI
を、密度勾配遠心分離（例15aを参照のこと）により分
離する。

ｂ）F₁（Ｃ）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHIの調製（第６図） pML141のプラスミドDNA5μｇをEcoRI及びBamHI制限エン
ドヌクレアーゼにより、例11a及び例13aに記載したのと
同様にして消化する。フェノール／クロロホルム抽出、
及びエタノールによる沈澱の後、プラスミド（pBR322/E
coRI/BamHI）のF₁（Ｃ）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHIを、１
％低融アガロース（ビオラド）上でのゲル電気泳動（例
13a）により分離し、そしてEtBrにより可視化する。F₁
（Ｃ）‐F₂‐DNA（236bp）のDNAバンドを含有するゲル
の部分をゲルから切り取り、そして65℃にて10分間液化
する。

ｃ）pHRi148/EcoRI/BamHIベクターDNAとF₁（Ｃ）‐F₂‐
DNA/EcoRI/BamHIとの連結、及びプラスミドpML147の造
成（第６図） 100ng（約100nモル）のpHRi148/EcoRI/BamHIのプラスミ
ドDNA、及び28ng（713nモル）のF₁（Ｃ）‐F₂‐DNA/Eco
RI/BamHI（例18bにおいて得られた液状ゲル10μｌ中に
溶解）を20μｌの容積中に相互に混合し、そして15℃に
て16時間T₄DNAリガーゼにより、例13cに記載したように
して連結する。

エグリンＣ遺伝子〔F₁（Ｃ）‐F₂‐DNA〕を含有する発
現プラスミドpML147は、この混合物中に、このようにし
て生成する。

ｄ）プラスミドpML147によるE.コリHB101の形質転換 プラスミドpML147（例18c）を含有する10μｌの混合物
を65℃にて10分間液化し、そしてこれを用いてカルシウ
ム処理E.コリHB101細胞を形質転換する。約6,000個のア
ンピシリン耐性コロニーを得る。

ｅ）F₁（Ｃ）‐F₂‐DNAを含有するコロニーのスクリー
ニング 形質転換されたコロニー（例18d）を、例15eに記載した
ようにして、F₁（Ｃ）‐F₂‐DNAの存在について試験す
る。

pML-147〜pML-153と称する７個の陽性コロニーを得る。

プラスミドpML147（Ｃ′）、又はpML147（Ｃ″）から調
製されたF₁（Ｃ′）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHI、又はF
₁（Ｃ″）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHIを、同様にしてpHRi14
8/EcoRI/BamHIと連結する。エグリンＣ′遺伝子〔F
₁（Ｃ′）‐F₂‐DNA〕、又はエグリンＣ″遺伝子〔F
₁（Ｃ″）‐F₂‐DNA〕を含有するプラスミドを、こうし
て形成する。このプラスミドを用いてカルシウム処理E.
コリHB101細胞を形質転換する。この形質転換細胞の培
養により、それぞれ940個、又は1080個のアンピシリン
耐性コロニーが生ずる。コロニーを、オリゴヌクレオチ
ド91/37相補体（Ｃ）を用いて、F₁（Ｃ′）‐F₂‐DNA、
又はF₁（Ｃ″）‐F₂‐DNAの存在について試験する。F₁
（Ｃ′）‐F₂‐DNA（エグリンＣ′遺伝子）を含有する
９個のコロニー、及びF₁（Ｃ″）‐F₂‐DNA（エグリン
Ｃ″遺伝子）を含有する17個のコロニーを同定する。各
場合において１コロニーを選択し、そしてpML147
（Ｃ′）又はpML147（Ｃ″）と称する。

例19.発現プラスミドpML199の調製 a.F₁（Ｂ）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHIの調製 例18bと同様にして、pML160のプラスミドDNA5μｇを制
限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBamHIにより消化する。
F₁（Ｂ）‐F₂‐DNA/EcoRI/BamHIを前記のようにしてゲ
ル電気泳動により分離する。

b.pHRi148/EcoRI/BamHIベクターDNAとF₁（Ｂ）−F₂−DN
A/EcoRI/BamHIとの連結及び組換プラスミドの造成 pHRi148/EcoRI/BamHI（例18aDを参照のこと）のプラス
ミドDNA100μｇを、例18cに従って、28μｇのF₁（Ｂ）
−F₂−DNA/EcoRI/BamHIと連結する。組成プラスミドを
含有する得られた溶液を用いて、カルシウム処理された
E.コリHB101細胞を形質転換する。形質転換されたコロ
ニーを、例15eに記載したようにして、F₁（Ｂ）−F₂−D
NAの存在について試験する。

６個の陽性コロニーを得、これをpML199〜pML204と称す
る。

例20.クローンpML147及びpML199の特徴付け 組換プラスミドpML147及びpML199中のF₁（Ｃ）−F₂−DN
A及びF₁（Ｂ）−F₂−DNAの配列を、例17に記載したよう
にしてMaxam及びGilbert（３）の方法によりF₁（Ｃ）−
F₂−DNA及びF₁（Ｂ）−F₂−DNAの配列を決定することに
より特徴付ける。Ｆ（Ｃ）−F₂−DNAのヌクレオチド配
列は合成エグリンＣ遺伝子について記載したそれと同一
であり、そしてF₁（Ｂ）−F₂−DNAの配列は合成エグリ
ンＢ遺伝子について記載したそれと同一である。

例21.組換エグリン遺伝子を有するプラスミドを含有す
るE.コリ細胞によりエグリン活性を有するポリペプチド
の合成 a.エグリンＣ活性を有するポリペプチドの合成 組換エグリンＣ遺伝子を有する７個のクローン、すなわ
ちE.コリHB101 pML147、E.コリHB101 pML148、E.コリHB
101 pML149、E.コリHB101 pML150、E.コリHB101 pML15
1、E.コリHB101 pML152、E.コリHB101 pML153、E.コリH
B101 pML147（Ｃ′）、及びE.コリHB101 pML147
（Ｃ″）をエグリンＣ活性の生成について試験する。

この目的のため、上記のクローンを5mlのＬ培地中、37
℃、250rpmにて一夜（16時間）培養する。Ｌ培地は次の
組成を有する。10gのバクトトリプトン、5gのバクト酵
母エキス、5gのNaCl、5gのグルコース及び0.1gのアンピ
シリン。

1mlのこの一夜培養物を、次の日に25mlのM9培地に移
す。M9培地は次の組成を有する。13.25gのNa₂HPO₄・7H
₂O、3.0gのKH₂PO₄、0.5gのNaCl、1.0gのNH₄Cl、0.015g
のCaCl₂・2H₂O、0.25gのMgSO₄・7H₂O、2.5gのカザミノ
酸、0.0099gのビタミンB₁、5.0gのグルコース、及び0.1
gのアンピシリン。

培養は、37℃、250rpmにて、細菌懸濁液が約0.9〜1.0の
光学濃度（OD₆₂₃）に達するまで行う。次に、細胞（5ml
の増殖培養物）を集め、そして細菌を0.5mlの50mM Tris
・HCl（pH8）、及び30mM NaClの溶液に再懸濁する。次
に、懸濁液を、1mg/mlのリゾチウム（ベーリンガー）に
調整し、そして30分間氷中に置く。懸濁液を液体窒素中
で凍結し、そして37℃において解凍し、これを交互に行
うことにより細菌を破壊する。この操作を５回反復し、
そして次に16,000rpm、４℃にて30分間遠心分離する。
ヒト白血球エラスターゼ（１）の阻害を測定することに
より、上清液をエグリンＣ活性について試験する。

次の活性が得られる。

b.エグリンＢ活性を有するポリペプチドの合成 組換エグリンＢ遺伝子を含有する６個のクローンのそれ
ぞれ、すなわちE.コリHB101 pML199、E.コリHB101 pML2
00、E.コリHB101 pML201、E.コリHB101 pML202、E.コリ
HB101 pML203、及びE.コリHB101 pML204を、例21aに記
載したのと同様にして、エグリンＢ活性の形成について
試験する。

前記のように、上に挙げたクローンをＬ培地中で培養
し、そして次にM9培地に移す。光学濃度（OD₆₂₃）が約
0.9〜1.0に達したとき、細胞を細め、溶解し、そして凍
結及び解凍を反復することによって破壊する。混合物を
遠心分離し、そして上清液を、ヒト白血球エラスターゼ
（１）の阻害の測定により、エグリンＢ活性について試
験する。

次の活性が得られる。

例22.E.コリHB101 pML147株の培養 20mlのＬ培地（例21）に、寒天プレートに十分増殖した
E.コリHB101 pML147細胞を接種し、そして振とうフラス
コ中、ロータリーシェーカー上で150rpm、37℃にて12時
間振とうする。この前培養物の5mlを120mlのM9培地に移
す。この培養物を250rpm、37℃にて振とうする。約８〜
10時間後、培養物はエグリンＣ活性を有するポリペプチ
ドの最高力価に達し、そしてこれを収得する。

例23.エグリンＣ活性の検出 エグリンＣ活性を有するポリペプチドを含有するサンプ
ル（例21及び22を参照のこと）約５〜10μｌを１cm²の
ニトロセルロース紙（NZ）（ビオラド）に落し、そして
紙を室温にて30分間乾燥する。次にNZを37℃にて１時
間、３％の血清アルブミン、0.01MTris・HCl（pH8）及
び0.9％NaClの溶液中でインキュベートする。

次にNZを0.01MTris・HCl（pH8）及び0.9％NaClの溶液中
で30分間洗浄する。溶液を５回かえる。次に、洗浄され
たNZを25℃にて２時間、エグリンＣに対する抗体（ラビ
ットから調製したもの、又はモノクローナル抗体）２μ
g/mlを含有する0.01MTris・HCl（pH8）及び0.9％NaCl中
血清アルブミン３％の溶液中で処理する。次に、NZを上
記のようにして洗浄する。

次に、NZを、25℃にて２〜３時間、0.2μCi/mlの¹²⁵I−
プロテインＡ（比活性89.8μCi/mg）（NEN）を含有する
0.01MTris・HCl（pH8）及び0.9％NaCl中３％血清アルブ
ミンの溶液で処理する。次に、NZを上記のようにして再
度洗浄し、そして乾燥し、そして結合した放射能をγ−
カウンター（マルチガムマ1260ガンマーカウンター、LK
B、ワラス）中で測定する。これにより、NZ上に存在す
るエグリンＣ活性を有するポリペプチドの測定がなされ
る。

これに代る方法においては、上記プローブをSDS/ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（PAGE）〔（７）を参照のこ
と〕にかける。PAGE電気泳動物を、エレクトロ−ブロッ
ティングによりNZに移す。次に、NZを上記のように処理
し、そして／又はＸ線フィルム（フジ）を用いて一夜オ
ートラジオグラフ処理する。エグリンＣ活性を有するポ
リペプチドを含有するNZ上の部位はフィルム上の黒色ス
ポットとして現われる。

例24.モノクローナル抗体カラムによるＮ^α−アセチル
−エグリンＣの分離及び精製 a.モノクローナル抗体カラムのためのポリペプチド溶液
の調製 150mlの培養液（例22に従って得られる）を４℃に冷却
し、そして遠心分離（5,000rpm,15分間、ソルバルRC 3
B）により細胞を分離する。透明な上清液はエグリンＣ
活性を含有しない。

次に、細胞を20mlの溶解緩衝液（50mM Tris・HCl、pH
8、及び30mMNaCl）に懸濁する。この混合物に15mgのリ
ゾチーム（ベーリンガー）を加え、そして混合物を４℃
にて30分間保持する。次に、液体窒素中での凍結及び37
℃における解凍を４回反復することにより細胞を破壊す
る。

次に混合物を16,000rpm、４℃にて30分間遠心分離す
る。上清液はＮ^α−アセチル−エグリンＣ活性を含有す
る。次に、上清液（15ml）に7.7gの固体硫酸アンモニウ
ムを溶解する。濁った混合物を４℃にて30分間置き、そ
して次に遠心分離する（上記を参照のこと）。湿潤沈澱
物を1mlの0.05mMTris・HCl緩衝液（pH8）中に溶解し、
目的のポリペプチド溶液を得る。

ｂ）モノクローナル抗体カラム上でのＮ^α−アセチル−
エグリンＣの精製 モノクローナル抗体カラム1K−F299−22−10（ベッドボ
リゥム0.8ml、下記を参照のこと）を、0.05MTris・HCl
（pH8）により平衡化する。上記のようにして得たポリ
ペプチド溶液の0.5mlの部分を、４℃、7ml/時の流速に
おいてカラムに負荷する。次に、カラムを10mlの0.05MT
ris・HCl（pH8）により洗浄する。第１画分は非吸着ポ
リペプチドを含有し、これは廃棄する。次に、カラム0.
05MTris・HCl（pH8）中5Mチオシアン化ナトリウム（メ
ルク）の溶液5mlにより洗浄し、そして得られた画分をH
LE試験（１）によりＮ^α−アセチル−エグリンＣについ
て試験する。ポリペプチドを含有する画分をOD₂₈₀nmの
測定により決定する。画分19及び20がＮ^α−アセチル−
エグリンＣ活性を含有する。これらをさらに処理するま
で−20℃、又は氷浴中に保存する。画分19中のＮ^α−ア
セチル−エグリンＣ活性は61μg/mlであり、そして画分
20のそれは49μg/mlである。次に、これらの画分を透析
し、又はセファデックス−G25（ファルマシア）により
脱塩する。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（７）により、Ｎ^α−アセチル−エグリンＣの分子量が
約8,100ドルトンであることが示される。

Ｎ^α−アセチル−エグリンＢ、エグリンＣ、及びエグリ
ンＢは、モノクローナル抗体カラムK1−F299−22−10に
よる方法と同様の方法により精製することができる。

e.モノクローナル抗体カラム1K−F299−22−10の調製 Ａ）マウスの免疫 凍結乾燥後の純粋なエグリンＣ（6mg）を少量の0.1％酢
酸に溶解し、そしてpH7.2に調製された燐酸緩衝化塩化
ナトリウム溶液により最終濃度が2mg/mlとなるようにす
る。この抗原溶液の部分を同量の完全フロインドアジュ
バント、不完全フロインドアジュバント、又は燐酸緩衝
化塩化ナトリウム溶液と混合し、そして混合物を乳化す
る。

雌性Balb/cマウス〔８−14週齢、スイス、シセルン（Si
sseln）の動物飼育場から得る〕を、100μｇのエグリン
を含有する上記の乳剤を足に注射することにより免疫す
る。これに続く６週間にわたり、不完全アジュバントに
前記のように乳化した追加の100μｇのエグリンを各週
に皮下注射し、そして最後に燐酸緩衝化塩溶液中200μ
ｇのエグリンを皮下注射する。４日後、融合のために脾
臓を取り出す。

Ｂ）ハイブリドーマの調製及び抗体試験 得られた脾臓細胞と骨髄腫セルラインSP2/0とを融合せ
しめることによりハイブリドーマ細胞を調製する。ここ
で、10⁸個の脾臓細胞と10⁷個の骨髄腫細胞を使用する。
融合は（９），（26）に記載されている方法により行
う。

ハイブリドーマ上清液中の抗−エグリンＣ活性を競争的
放射免疫測定〔RIA,（10）〕により決定する。

この目的のために、通常のクロラミンＴ法により放射性
¹²⁵ヨウ素を用いてエグリンＣをラベルする（30,000cp
m）。一夜インキュベートすることによりポリクローナ
ルラビット抗−エグリンＣ抗体をポリエチレンミクロタ
イタープレートのウエル中に固定する。約50〜70％の放
射性エグリンＣがこれらの固相抗体に結合する。45のハ
イブリドーマ培養物の内、32の上清液が50％より大きな
程度にこの結合を有意に阻害する。２つの大きく阻害す
る上清液、又はそのハイブリドーマ細胞を299S18、及び
299S22と称し、そしてさらに特徴付けるために選択す
る。これらをまず限界稀釈法によりクローニングレ、29
9S18から４個の陽性クローンを得、そして299S22から９
個の陽性クローンを得る。これらの内クローン299S18−
20,299S22−１、及び299S22−10を選択し、そしてさら
に厳密に特徴付ける。上記のハイブリドーマセルライン
はサブタイプI_g1カッパのモノクローナル抗体（同じ名
称を有する）を産生する。

Ｃ）腹水からの抗−エグリンＣ抗体の分離及び精製 Balb/cマウスを0.4mlのプリスタン（カールロス）によ
り腹腔内前処理する。１週間後、２〜５×10⁶個のクロ
ーン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射する。各マウ
スから腹水を反復して採取し、そして−80℃で凍結す
る。集めた液を解凍し、そして４℃、16,000rpmにて30
分間遠心分離する。脂肪を吸引除去し、そして0.9容積
の飽和硫酸アンモニウム溶液を、残った小片を含有しな
い上清液に０℃において撹拌しながら、ゆっくりと滴加
する。生成した阻免疫グロブリン画分を、0.1MTris・HC
l（pH8.2）を用いながら、製造者の指示に従ってセファ
クリルG200（ファルマシア）を通す。活性画分を一緒に
し、そしてアミコンXM50フィルター（アミコン）を用い
て濃縮する。こうしてモノクローナル抗−エグリンＣ抗
体299S18−20,299S22−１、及び299S22−10を得る。

Ｄ）抗体カラム1K−F299−22−10の調製 アフィゲル10（ビオラド）を製造者の指示に従って冷蒸
留水及びカップリング緩衝液（pH8.0）（0.1MNaHCO₃溶
液）で洗浄する。カップリング緩衝液中50％のゲル懸濁
液をプラスチックチューブに移し、そして同じ量の精製
抗体溶液（19mgのモノクローナル抗−エグリンＣ抗体29
9S22−10）と混合し、そして混合物を室温にて４時間回
転せしめる。次に、ゲルをカップリング溶液により洗浄
する。なお遊離している活性部位をブロックするため、
ゲルを、ゲルml当り0.1mlの1Mエタノールアミン−HCl
（pH8.0）により室温にて２時間処理し、そしてゲルml
当り10mMナトリウムアジドを含有する燐酸緩衝化塩溶液
で洗浄し、混合物を４℃に保持する。カップリングの程
度を、280nmにおける吸光の測定により決定する。カッ
プリングの程度はゲルml当り15〜30mgの抗体である。形
成された0.8mlのイムのゲルを用いてモノクローナル抗
体カラム1K−F299−22−10を調製する。

例25.アンヒドロキモトリプシンカラムによるＮ^α−ア
セチル−エグリンＣの分離及び精製 ａ）アンヒドロキモトリプシンカラムのためのポリペプ
チド溶液の調製 150mlの培養液（例22に従って得られる）を、４℃に冷
却し、そして細胞を遠心分離（5,000rpm、15分間、ソル
バルRC 3B）により分離する。透明な上清液はエグリン
Ｃ活性を含有しない。

次に、細胞を12mlの溶解緩衝液（50mMTris・HCl,pH8、
及び30mM NaCl）中に懸濁する。15mgのリゾチーム（ベ
ーリンガー）をこの混合物に加え、そしてこの混合物を
４℃に30分間保持する。次に細胞を液体窒素中で凍結
し、そして次に37℃にて解凍し、これを４回反復する。
上清液はＮ^α−アセチル−エグリンＣ活性を含有する。
次に、上清液（15ml）中に7.7gの固体硫酸アンモニウム
を溶解する。濁った混合物を４℃にて30分間置き、そし
て次に遠心分離する（前記を参照のこと）。湿沈澱物を
1mlの0.05mMTris・HCl緩衝液、pH8、に溶解し、そして
所望のポリペプチド溶液を得る。

b.アンヒドロキモトリプシン（AnCht）カラムでのＮ^α
−アセチル−エグリンＣの精製 AnChtカラム（ベッドボニゥム4ml）を0.05MTris・HCl,p
H8緩衝液により平衡化する。上記のようにして得たポリ
ペプチド溶液の部分2.5mlを４℃にて7ml/時の流速でカ
ラムに負荷する。次に、カラムを25mlの0.05MTris・HCl
（pH8）で洗浄する。この第１画分は非吸着ポリペプチ
ドを含有し、これは廃棄する。次にカラムを、0.05MTri
s・HCl（pH8）中5Mチオシアン産ナトリウム（メルク）1
0mlで洗浄し、そして得られた画分を、HLE試験（１）に
よりＮ^α−アセチル−エグリンＣ活性について試験す
る。ポリペプチドを含有する画分を、OD₂₈₀nmの測定に
より決定する。画分30及び31がＮ^α−アセチル−エグリ
ンＣ活性を有する。これらを、さらに処理するまで−20
℃において、又は氷浴上で保持する。Ｎ^α−アセチル−
エグリンＣの活性は画分中30μg/mlであり、そして画分
31中64μg/mlである。次に、画分を透析し、又はセファ
デックス−G25（ファルマシア）により脱塩する。SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７）によれば、Ｎ^α
−アセチル−エグリンＣの分子量は約8,000ドルトンで
ある。

c.アンヒドロキモトリプシンカラムの調製 A.アンヒドロキモトリプシン（AnCht）の調製 AnChtはAko等（27）により記載された方法により調製さ
れる。

500mgのキモトリプシン（メルク）を、50mlの0.1MNaC
l、0.12MCaCl₂及び13（v/v）％のメタノールを含有する
0.1MTris・HCl緩衝液（pH8）中に溶解する。フェニルメ
チルスルホニルフルオリド（PMSF）（フルカ、アセトン
中7mg/ml溶液）の0.1mlのアリコート７個を撹拌しなが
らこの溶液に加え、そして各場合におけるキモトリプシ
ン活性の低下を決定する（28）。キモトリプシン活性が
１％より低くなったとき、溶液を1mlHClに対して４℃に
て１夜透析し（３×10l）、そして凍結乾燥する。

生成したフェニルメチルスルホニル−キモトリプシン
（PMS−Cht）を100mlの氷冷0.1MKOHに溶解し、そして溶
液を１時間氷中に置き、そして6N HClによりpH3に調整
する。得られた溶液を1mM HClに対して４℃にて一夜
（３×10l）透析し、そして次に凍結乾燥する。AnChtを
白色粉末（120mg）として得る。

B.AnChtカラムの調製 アフィゲル10（ビオラド）を製造者の指示に従って冷蒸
留水及びカップリング緩衝液（pH8.5）（0.1MNaHCO₃/Na
₂CO₃溶液）で洗浄する。カップリング緩衝液（4ml）中5
0％ゲル懸濁液をプラスチックチューブに移し、そして
同じ量のアンヒドロキモトリプシン溶液（4mlのカップ
リング緩衝液中120mg）と混合し、そしてこの混合物を
４℃にて一夜回転せしめる。次に、ゲルをカップリング
緩衝液により洗浄する。なお遊離状態にある活性部位を
ブロックするために、ゲルを、ゲルml当り0.1mlの1Mエ
タノールアミン−HCl（pH8.0）で４℃にて３時間処理
し、そして次にゲルml当り10mMのナトリウムアジドを含
有する燐酸化塩溶液で温度を４℃に保持しながら処理す
る。カップリングの程度は、280nmにおける吸光を測定
することにより決定する。吸光はゲルml当り15〜30mgの
AnChtである。

形成されたAnCht4mlを用いてアフィニティーカラムを調
製する。

同じ方法でＮ^α−アセチルエグリンＢ、エグリンＣ、及
びエグリンＢを精製することができる。

例26.N^α−アセチル−エグリンＣのその他の精製方法 前記の精製法（例24及び25）の代りに、又はこの方法に
加えて、下記の精製段階を用いることができる。

a.溶解物のブタノール抽出 細胞溶解の後凍結及び乾燥を４回反復（例24aを参照の
こと）することによって破壊した細胞に、酢酸を（最終
濃度が0.1％になるように;pH4.5）加える。沈澱する細
菌性蛋白質を遠心分離により分離する。Ｎ^α−アセチル
−エグリンＣは上清液に残る。

ｎ−ブタノール／氷酢酸／水（5:1:4）（25ml）の２相
混合物を激しく混合する。次に室温にて２時間放置して
平衡にし、次に混合物を２相に分離する。0.1％酢酸溶
解物サンプル（前記）0.5mlを250μｌの下相と混合し、
そしてＮ^α−アセチル−エグリンＣを750μｌの上相に
より抽出する（５分間、ボルテックス、ベンダーホベイ
ン）。次に、室温にて（5,4000rpm）60分間遠心分離す
ることにより相を分離する（ヘッチッヒ卓上遠心分離機
EBA 3S）。サバント装置（スピードバックコンセント
レーター）を用いて高真空下でサンプルを蒸発乾固す
る。Ｎ^α−アセチル−エグリンＣの検出を、HLE試験、R
P−HPLC、及びSDS−ゲル電気泳動により行う。

b.セファデックスG50でのゲル過 こうして得られた31mgの材料を600μｌの30％酢酸中に
懸濁し、懸濁液を5,000rpm、室温にて５分間遠心分離
し、そして透明な上清液をセファデックスG50微細カラ
ム（ファルマシア）（カラム寸法:1.5cm×30cm;検出 L
KB8300ユビコードII;254nm、トランスミッション500mV;
流速:0.4ml/分）に負荷する。カラムを50mlの２％酢酸
により溶出する。画分６〜８（2.5ml）はＮ^α−アセチ
ル−エグリンＣを含有する。収量：純粋な凍結乾燥物3m
g、純度約95％。

c.N^α−アセチル−エグリンＣ及びエグリンＣを得るた
めのDEAE−セルロース上での陰イオン交換クロマトグラ
フィー 酢酸による蛋白質沈澱（例26aを参照のこと）後の上清
液100mlを濃縮し、そしてpH6.6におけるDEAE−53（ワッ
トマン）上での陰イオン交換クロマトグラフィー（クロ
マトグラフィー条件；カラム1.5×80cm、溶出緩衝液:30
mM酢酸アンモニウム、pH6.6、流速:15ml/時、画分容積:
3.5ml）にかける。カラムを溶出緩衝液で平衡化し、そ
して画分18〜25間の第１ピーク（エグリンＣ）が溶出す
るまで展開する。画分50から、それぞれ300mlずつの溶
出緩衝液及び0.06M酢酸アンモニウム/0.4MNaCl,pH4.7、
の直線塩グラジエントで溶出する。Ｎ^α−アセチル−エ
グリンＣは画分70〜85の間で溶出する。検出はRP−HPL
C、PAGE、及びHLE試験により行う。生成物の純度は蛋白
質含量に関して約90％である。

IP（プール画分18〜25）:6.5 IP（プール画分70〜85）:5.4 Ｎ^α−アセチル−エグリンＢ、エグリンＢ及び他のエグ
リン化合物（特に、メチオニン−エグリンＣ、生合成か
ら）もまた、上記の方法で分離しそして精製することが
できる。

例27.N^α−アセチル−エグリンＣの構造の証明及び物理
化学的特徴 200μｇのＮ^α−アセチル−エグリンＣを6NHClにより、
110℃にて24時間加水分解し、そして次に混合物をS.Moo
re等（29）の方法により分析する。加水分解物は次の組
成を有する。

アミノ酸 加水分解物組成 Asn 7.2（７） Thr 4.6（５） Ser 3.5（３） Gln 7.8（７） Pro 5.4（６） Gly 5.7（５） Ala 1.6（１） Val 10.1（11） Met 0（０） Leu 5.3（５） Tyr 4.9（６） Phe 4.9（５） Lys 2.3（２） His 2.5（３） Trp 0（０） Arg 4.5（４） 合 計 （70） b.N^α−アセチル−エグリンＣのペプチドマッピング Ｎ^α−アセチル−エグリンＣのアミノ酸配列、並びにト
リプシン及びストレプトコッカス・アウレウス（Strept
ococcus aureus）プロテアーゼ（V8）についての切断部
位は次のスキームにより標示される（参考文献31を参照
のこと）。

Ｉ）Ｎ^α−アセチル−エグリンＣのトリプシン分解 Ｎ^α−アセチル−エグリンＣ（9.6mg,1.18μモル）を、
0.1N酢酸アンモニウム及び10^-3MCaCl₂の緩衝液2ml中に
懸濁し、希アンモニアによりpHを7.5に調節し、そして
混合物をTPCKトリプシン（ウオーシントン、500μｇ）
と共に37℃にて90時間インキュベートする。酵素反応を
50μｌの氷酢酸により停止する。トリプシン分解断片
（T₄）を遠心分離により除去し、そして透明な上清液
を、逆相HPLCによりそのほかのトリプシン分解断片T₁〜
T₇に分離する（前記のスキームを参照のこと）。FABマ
ッピング（30）により分析する。

Ｎ^α−アセチル−エグリンＣ（200pモル）のトリプシン
分解、及びR.Knecht等（32）の方法によるDABTCペプチ
ドのミクロ−調製用RP−HPLC分離、並びに天然エグリン
Ｃとの比較により、トリプシン分解ペプチドT₂,T₃,T₄,T
₅,T₆、及びT₇（上記スキーム）の一致が確認される。

ペプチドT₁（Ｎ−末端にスレオニンを有する）は、HPLC
分析において、両実験において、天然エグリンＣと異る
リテンションタイムを有する〔ヌクレオシル5/C18,4.6
×120mm;1.2ml/分；溶離剤:0.1％トリフルオロ酢酸;0.0
7％トリフロオロ酢酸を伴うアセトニトリル／水（8:
2）〕：R_t＝9.44分（比較のため、天然エグリンＣ中の
ペプチドT₁：R_t＝7.34分）。

II Ｎ^α−アセチル−エグリンＣのトリプシン分解断片
T₄の、スタフィロコッカス・アウレウスプロテアーゼV8
による分解 スタフィロコッカス・アウレウスプロテアーゼV8によ
る、100μｇのＮ^α−アセチル−エグリンＣのトリプシ
ン分解断片T₄の分解を、100μｌの0.1M酢酸アンモニウ
ム（pH8.0）中で37℃にて４時間行う。分解により予想
される断片が生ずる（上記のスキームを参照のこと;FAB
−MSによる混合分析）。

c.部分配列分析 Ｉ）エドマン分解 標準的条件下でのエドマン法（33）による古典的な配列
分析が成功しない（Ｎ−末端アミノ酸基が同定されな
い）ことにより、Ｎ^α−アセチル−エグリンＣ中のＮ−
末端が変形されている（ブロックされている）ことが示
される。

II）FAB−MSによる配列決定 Ｎ−末端トリプシン分解断片「T₁」は、FAB（iast atom
bombardment）−MSに従えば、951の名目分子量を有す
る。これは、対応する天然エグリンＣ由来T₁断片（90
9）より42大である。重量の相異に基いて、変形はＮ−
末端アミノ酸スレオニン上に存在しなければならない。

前記の実験（例27bI）からのその他のトリプシン分解断
片の分子量は予想と一致する。

d.N^α−アセチル−エグリンＣの分子量の決定（天然エ
グリンＣとの比較） 化学的分子量は、３回の異る測定から平均されている
（C12.011;H1.0079;N14.0067;及びO15.9994）。

実験条件：約30μｇのサンプルを、プレゼンター上のマ
トリクスとしてのチオグリセロール中に直接溶解し、そ
して、ZAB−HF（1,000のリゾリューション）マススペク
トロメーター、VG−アナリティカル社、マンチェスタ
ー：キセノンボンバードメント；イオンエネルギー3ke
V;スキャンニングリニューモード；換算:CsI/RbIリファ
レンス混合物、を用いて測定する。

e.等電点 等電点 IPN^α−アセチル−エグリンＣ 5.4 IP天然エグリンＣ 6.5 条件：各場合に、20μｇのサンプルを20μｌの水に適用
する。PAGプレートLKG−アンフォラインpH3.5−9.5、５
％のPAG1mm。電解質：陽極（＋）1MH₃PO₄、陰極（−）1
NNaOH、20mA、700V、2.5時間。常法による、10（w/v）
％トリクロロ酢酸溶液、又はクマーシーブリリアントブ
ルーＲ−250による染色。

f.酢酸セルロース電気泳動（上昇） Ｎ^α−アセチル−エグリンC:出発点から陰極方向に4.7c
m。

エグリンＣ ：出発点から陰極方向に5.
8cm。

条件：各場合に、２μｌの水中２μｇのサンプルをセロ
ゲル８×17cm箔（ケメトロン、ミラノ）に適用する：ホ
リフォールフラットベッド電気泳動チャンバー（インノ
バティブラボ）、電解質pH1.9、250ボルト、１時間；通
常の染色剤、例えばTPM、ニンヒドリン、ポンシューＳ
液（ビオテク−フィッシャー）により検出。

g.N^α−アセチル−エグリンＣ中のＮ−アセチル基の検
出 Ｉ）100μｇのＮ^α−アセチル−エグリンＣを、100μｌ
の0.03N塩酸中で110℃にて16時間部分加水分解し、そし
てこの混合物を高真空下で乾燥する。0.5当量より多く
の酢酸がガスクロマトグラフィーにより同定される（3
4）。

II）トリプシン分解断片「T₁」（例27BI参照のこと）中
のアセチル官能を、360MHz陽子共鳴スペクトル法により
明瞭に同定する:N^α−アセチル−エグリンＣからの断片
「T₁」400μｇを高真空下で２時間乾燥し、そして1mlの
D₂Oに溶解する。360MHz¹H−NMRスペクトルを一夜297°
Ｋにて4,000SWで測定する。リファレンスH₂O（δ4.95pp
m）。

δ2.15ppm singlet（3H）:N−アセチル基からのCH₃。

δ1.2ppm doublet（3H,J＝7Hz）：スレオニンからのγ
−CH₃。

例28.プラスミドpML 147による種々のE.コリ菌株の形
質転換、及び形質転換された宿主細胞の培養E.コリ LM1035株、E.コリJA211株、及びE.コリW3110trp,
trpΔED24株（参考文献38を参照のこと）を、例18dに記
載したのと同様にして、プラスミドpML147により形質転
換する。形質転換されたコロニーを、例15eに記載した
のと同様にしてF₁（Ｃ）−F₂−DNAの存在について試験
する。それぞれ３個,5個，及び３回の形質転換体が得ら
れる。これらを次のように称する。

E.coli LM1035/pML147/1 E.coli LM1035/pML147/2 E.coli LM1035/pML147/3 E.coli JA221/pML147/1 E.coli JA221/pML147/2 E.coli JA221/pML147/3 E.coli JA221/pML147/4 E.coli JA221/pML147/5 E.coli W3110trpR,ΔtrpED24/pML147/1 E.coli W3110trpR,ΔtrpED24/pML147/2 E.coli W3110trpR,ΔtrpED24/pML147/3 上記の菌株を次の組成を有する変形M9培地に培養する。

Na₂HPO₄・7H₂O 9.0g KH₂PO₄ 3.0g NaCl 0.5g NH₄Cl 3.5g CaCl₂・2H₂O 0.015g MgSO₄・7H₂O 0.25g カザミノ酸 7.0g 酵母エキス 5.0g ビタミンB₁ 0.0099g クエン酸鉄III 0.006g MOPS（３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸）34.0
g グルコース 20.0g アンピシリン 0.1g 培養を37℃、180rpmにおいて、細胞懸濁液が約13.0の光
学濃度（OD₆₂₃）に達するまで続ける。次に細胞（5mlの
増殖培養物）を集菌し、そして細菌を0.5mlの50mMTris
・HCl（pH8）及び30mMNaClの溶液中に再懸濁する。次に
懸濁液を1mg/mlのリゾチームに調整し、そして30分間氷
中におく。懸濁液を液体窒素中で凍結し、37℃で解凍
し、これを反復することにより細胞を破壊する。この操
作を５回反復する。次に、混合物を16,000rpm、４℃に
て30分間遠心分離する。

各コロニーを、例21に記載したようにしてエグリンＣ活
性の生成について試験する。3.0〜13μg/ml培養物のエ
グリンＣ活性が細胞抽出物中に得られる。例えば、次の
活性が得られる。

例29.形質転換されたE.コリW3110trpR,trpΔED24/pML14
7/1株の発酵及び培養液の処理E.コリ W3110trpR,trpΔED24/pML147/1細胞を、5,000lの
発酵槽中3,000lの変形M9培地において、例28に記載した
のと同様にして、懸濁液が約10〜13の光学濃度（O
D₆₂₃）に達するまで培養する。

培養液（pH7.4）を10℃に冷却し、そして細胞をアルフ
ァーラバルBRPX−207スラッジ処理機により処理する。
透明な上清液はエグリン活性を含有せず、これを廃棄す
る。スラッジ除去中、スラッジチャンバーから連続的
に、溶解緩衝液Ａ（50mMTris・HCl及び30mM NaCl,HClに
よりpHを8.0に調整）を用いてスラッジを少しずつ廃出
し、そして最後に遠心ディッシュ（7l）の内容物を、分
解緩衝液Ａを用いて完全に放出する。得られた細胞塊
を、溶解緩衝液Ａにより375lにする。7.6のpH値を有す
る。５〜10℃に冷却した後、懸濁液を、直径0.5〜0.75m
mのガラスビーズ4.2lを入れたダイノミル（KD5型）に通
す。こうして細胞を破壊する。この懸濁液に酢酸を加え
てその濃度を約２（v/v）％にし、そして10℃にて一夜
撹拌する。pH3.9の懸濁液を上記のようにして処理して
スラッジ除去する。300lの透明な上清液を、落下膜蒸発
機（１時間当り能力：水60l）中で35lに濃縮する。わず
かに濁った濃縮液を遠心分離し、そしてこうして得た透
明な上清液を、DDS〔GR81 PP膜（2.5m²）を有するラブ3
5限外過ユニット〕において、２％酢酸に対して透析
する。最終容量は31lである。

この透明な溶液の2lのアリコートを、ベッドボリウム96
lのセファデックスＧ−50カラム（KS370ファルマシア）
に適用する（カラムを２％酢酸により平衡化する）。15
lの溶出液中に含有される主画分を限外過により濃縮
し、そして次に水に対して透析する。こうして得られた
透明な水溶液を凍結乾燥する。残渣は純粋なエグリンＣ
化合物から成る。

例30.E.コリW3110trpR,trpΔED24/pML147/1の発酵の生
成物混合物の分析 エグリンＣ化合物から成る、例29において得られた残渣
を、HPLC分析にかける。

実験条件:Vydac218TP510−RP−HPLCカラム、10×250mm;
分離当り1mgのエグリン化合物;AUFC:2.0、220nmにおい
て；流速:2ml/分；溶出:A＝0.1％トリフロオロ酢酸、Ｂ
＝アセトニトリル／水（8:2）＋0.07％トリフルオロ酢
酸、40％B1分間、次に30分間で60％Ｂに増加。

結果:7種類の生成物が同定される。これを画分し、そし
てHLE試験にかける。等電点（IP:例27eに記載したアイ
ソエレクトリックフォーカシング、LKB−アンホラインp
H4.0−6.5）も測定する。結果を次の表に要約する。

測定された等電点、HPLC値、及びチェックとして行われ
た分子量の測定（分子量の測定値:8,133.2）に基いて、
主生成物（画分F2）はＮ^α−アセチル−エグリンＣであ
る。画分Ｏ（FO）中の物質は、等電点、HPLC値及びチェ
ックとして行われた分子量の測定（分子量の測定値:8,0
91.2）から証明されるように天然エグリンＣである。

例31 プラスミドpML147（Ｃ′）又はpML147（Ｃ″）に
より形質転換されたＥ。コリHB101細胞による変形され
たエグリンＣ化合物の合成E.コリ HB101 pML147（Ｃ′）株及びE.コリHB101 pLM147
（Ｃ″）株を例22に記載したようにして培養し、細胞を
破壊した後、培養液をアンヒドロトリプシンカラム（例
25を参照のこと）上でのクロマトグラフィーにより精製
する。

２種類の生成物（Ａ及びＢ）を、HPLC分離（条件：例30
を参照のこと）によりE.コリHB101 pML147（Ｃ′）の培
養液から分離する。生成物Ａはディスク電気泳動（pH8.
9,15％ゲル;Maurer系No.2に対応する）において0.42のR
f値を有する。トリプシンによる分解により７個の断片
が生じ、この内６個はＮ^α−アセチル−エグリンＣ（例
27bを参照のこと）の分解により得られる断片と同じで
ある。ペプチドのＮ−末端に相当する第７断片は、Edma
n（33）法によるアミノ酸配列分析によれば、配列Ser−
Glu−Leu−Lysから成る。従って、生成物Ａは次に示す
エグリンＣ′について予想される構造を有する。

トリプシン分解において、生成物Ｂは同様に７個の断片
を生ずる。このものは、Ｎ−末端断片においてのみ生成
物Ａと異る。この断片は、セリン基に追加のＮ−アセチ
ル基を有し、そして配列Ｎ−アセチル−Ser−Glu−Leu
−Lysを有する。このため、生成物ＢをＮ^α−アセチル
−エグリンＣ′と称する。

培養されたE.コリHB101 pML147（Ｃ″）細胞の破壊細胞
からは、アンヒドロキモトリプシンカラムでのクロマト
グラフィー、及びHPLCによる精製の後、唯一の生成物
（生成物Ｃ）のみが同定される。生成物Ｃは、ディスク
電気泳動（上記の条件）において0.30のRf値を有する。
トリプシン分解によりＮ−末端断片としてジペプチドLe
u−Lysが生じ、他の断片は、Ｎ^α−アセチル−エグリン
Ｃのトリプシン分解において分離される対応断片と同一
である。従って、生成物Ｃは次に示すエグリンＣの予想
構造を有する。

例32.N^α−アセチル−エグリンＣの酵素的合成 0.5μモルのアセチル−コエンチームＡ、及び約200μｇ
のE.コリHB101抽出物（Ｎ^α−アセチル−トランスフェ
ラーゼ含有）を8mg（１μモル）のエグリンＣ（例26cに
従って得、そしてHPLCにより精製したもの）に、0.06M
燐酸緩衝液,pH7.5、中で加える。インキュベーションを
37℃において行う。３時間後、60℃において加熱するこ
とにより酵素を不活性化し、そして混合物をHPLC精製に
かける。分離されたＮ^α−アセチル−エグリンＣは生合
成生成物（例26cを参照のこと）と同一である。

例33.エグリンＣを測定するためのモノクローナル抗−
エグリンＣ抗体を用いるキット、競争的放射免疫測定法 抗−エグリンＣ抗体の溶液（例24cCに従って調製）を燐
酸緩衝化塩溶液（PBS溶液）により１μg/100μｌの濃度
に稀釈する。この溶液100μｌをプラスチックチューブ
中で、又はプラスチックミクロタイタープレート上で37
℃において２時間インキュベートし、抗体をプラスチッ
クの表面に吸着せしめる。プラスチックの表面上のなお
遊離状態にある活性部位を飽和せるため、ウシ血清アル
ブミン溶液（BSA溶液）によりプラスチックを後処理す
る。

公知の方法（20）に従って放射性¹²⁵Iによりラベルさ
れ、そして50μｌ当り10,000cpmの活性を有するエグリ
ンＣ溶液50μｌずつを、BSA溶液中サンプル溶液又は標
準溶液の一連の稀釈物に加え、そして次にこの混合物を
プラスチックの表面上で37℃にて２時間、そして次に４
℃にて12時間インキュベートする。チューブ又はミクロ
タイタープレートを燐酸緩衝化塩溶液で洗浄し、そして
放射能を測定する。サンプル溶液中のエグリンＣの濃度
を、標準溶液を用いて測定いた換算曲線により決定す
る。

上記の放射免疫測定用の試験キットは、１〜10mg/mlの
濃度の例24cCからの抗エグリン抗体の溶液2ml、燐酸緩
衝化塩溶液（PBS溶液）100ml、PBS中0.3％ウシ血清アル
ブミン及び0.1％ナトリウムアジドの溶液（BSA溶液）30
0ml、活性200,000cpm/mlの放射性エグリンＣの溶液2m
l、100ng/mlのエグリンＣを含有する標準溶液2ml、及び
プラスチックの1mlチューブ又はミクロタイターチュー
ブを含む。

例34.モノクローナル抗−エグリンＣ抗体を用いるタン
デムELISA用試験キット 炭素水素ナトリウム固定緩衝液（pH9.6）中に溶解した3
00ng/ウエルのモノクローナル抗体299S18−20を、４℃
にて一夜インキュベートすることによりミクロタイター
プレート上に固定する。プレートを、0.005％トゥイー
ン20を含有する燐酸緩衝化塩化ナトリウム溶液（pH7.
2）により３回洗浄し、そして次にウエルを、４℃にお
いて一夜、0.2％ゼラチン及び0.02％ナトリウムアジド
を含有する燐酸緩衝化塩化ナトリウム溶液（PBS＋ゼラ
チン＋Ａ）200μl/ウエルにより処理する。プレートを
上記のようにして３回洗浄する。PBS＋ゼラチン＋Ａ中
に稀釈した種々の濃度のエグリンＣを加え、そしてプレ
ートを室温にて４時間インキュベートする。前記のよう
にして３回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼと接
合した第２のモノクローナル抗体（299S22−１）の混合
物100μl/ウエルを、最適力価において（接合体0.5mg/m
l、試験のためにPBS＋ゼラチン＋Ａにより1:200に稀
釈）加え、そしてプレートを室温において２時間インキ
ュベートし、その後、ジエタノールアミン緩衝液（pH9.
8）中ｐ−ニトロフェニルホスフェート150μｌを加えた
後、発色する。マルチスキャンELISA読取り機を用いて
色度（OD₄₀₅）を15分毎に１時間測定する。

試験すべきサンプル中のエグリンＣ含量は、測定された
OD₄₀₅を比較することにより、既知量（例えば10¹〜10³n
g/ml）の天然エグリンＣを用いる換算曲線により決定す
る。

この方法はまた、エグリンＢ又は他のエグリン例えばＮ
^α−アセチル−エグリンＣの測定のためにも使用するこ
とができ、そしてさらに、エグリンを測定する場合には
血漿において、例えばラット、ネコ又はラビットの血漿
においても使用することができる。

このタンデムELISAのための試験キットは、試験に必要
な試薬、特にモノクローナル抗−エグリン抗体、例えば
299S18−20及び299S22−１（適当であれば使用する緩衝
液中の溶液として）、使用する緩衝液（基質緩衝液を含
む）、洗浄溶液、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（基
質として）、測定すべきエグリン（例えばエグリンＣ）
を含有する標準溶液、プラスチックミクロタイタープレ
ート、及び／又は適当であればテーブル又は換算曲線を
含む。換算曲線は例えば上記のタンデムELISAに従って
得られた次のようなものである。

例35 非経口投与のための、Ｎ^α−アセチル−エグリン
Ｃを含有する医薬製品 例24又は25に従って調製されたＮ^α−アセチル−エグリ
ンＣ含有溶液を0.9％NaCl溶液に対して透析する。次
に、同じNaCl溶液で稀釈することによって溶液濃度を1m
g/ml又は10mg/mlに調整する。これらの溶液を限外過
（0.22μｍの孔を有する膜を用いる）により無菌化す
る。

この無菌溶液は静脈注射用、連続注入用、及び吸入器
（例えばハード装置）での霧化用に直接使用することが
できる。

例36.酵母におけるエグリンの発現 酵母における外来遺伝子の発現系は強力な酵母プロモー
ター、好ましくは誘導性プロモーター、及び酵母転写停
止シグナルを、外来遺伝子の挿入のためのユニーク制限
部位により分離されたタンデム配置として有することを
必要とする。発現ベクターはまた、酵母における自律複
製を許容しそしてプラスミドの高コピー数を導く酵母DN
A配列を含有する。これらの配列は好ましくは酵母２μ
配列である。ベクターはまた、酵母選択マーカー、好ま
しくは酵母LEU2遺伝子、並びにE.コリにおける増幅のた
めの複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子を含有す
る。この様なベクターは、E.コリ及び酵母において使用
するための“シャトル”ベクターである。

上記の様な適切な発現系はヨーロッパ特許出願No.100,5
61中に開示されており、そして酵母において非常に効率
的であることが示されている。外来遺伝子が酵母酸性ホ
スファターゼの適当なPH05プロモーターの制御のもとで
発現される。PH05プロモーター、外来遺伝子及びPH05転
写停止シグナルがプラスミドpJDB 207中にタンデム配置
で挿入される。このものは酵母２μ配列、酵母LEU2遺伝
子、E.コリ複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子を含
有する。

発現プラスミドpJDB207R/PHO5−EGLは次の様にして作製
される。

ａ）pJDB207ベクター断片の単離 ６μｇのプラスミドpJDB207R/IF（α−３）（EP100,56
1）を制限酵素BamHIにより完全消化する。6.85kb及び1.
15kbの生ずるDNA断片をエタノールで沈澱せしめ、そし
て400μｌの50mM Tris−HCl（pH8.0）中に再懸濁し、4.
5ユニットのウシ腸アルカリホスファターゼ（ベーリン
ガー・マンハイム）を加える。この混合物を37℃にて１
時間インキュベートする。次に、65℃にて1.5時間イン
キュベートすることによりホスファターゼを不活性化す
る。この溶液を150mM NaClに調整する。このDNA溶液
を、150mM NaCl及び1mM EDTAを含有する10mM Tris−HCl
（pH7.5）により平衡化した100μｌのベッドのDE52（ワ
ットマン）に適用する。Tris−ボレート−EDTA緩衝液
（pH8.3）中0.6％低融点アガロースゲル上で大6.85kbBa
mHI断片を小断片から分離する。

ｂ）534bp PH05プロモーター断片の単離 10μｇのプラスミドp31/R（EP100,561）を制限エンドヌ
クレアーゼEcoRI及びBamHIにより消化する。生ずる３種
類の断片を、Tris−ボレート−EDTA緩衝液（pH8.3）中
0.6低融点アガロースゲル上で分離する。mRNA出発部位
を含むPH05プロモーターを含有する534bp BamHI−EcoRI
断片を単離する。

ｃ）エグリンのコード配列を含有する221bpDNA断片の単
離 ８μｇのプラスミドpML147を制限エンドヌクレアーゼBa
mHI及びEcoRIにより消化する。生ずる２個のDNA断片
を、Tris−ボレート−EDTA緩衝液（pH8.3）中0.6％低融
点アガロースゲル上で分離する。221bp断片を単離す
る。

ｄ）DNA断片の連結 適切な接着末端を有する前記（例36a〜ｃ）の３種類のD
NA断片を一回の反応で連結する。0.1pmole（0.45μｇ）
の6.85kbBamHIベクター断片、0.2pmole（70μｇ）の534
bpBamHI−EcoRIPH05プロモーター断片及び0.2pmole（29
ng）のpML147の221bpEcoRI−BamHI断片を連結する。３
種類のDNA断片のすべてが低融点アガロースの小ゲルブ
ロック中に含有される。３片のアガロースゲルをプール
し、65℃にて液化しそして２倍稀釈する。全容270μｌ
の60mM Tris−HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、10mM DTT、1
mM ATP中で、16ユニットのT4 DNAリガーゼ（ベーリンガ
ー、マンハイム）を用いて15℃にて16時間、連結を行
う。この連結混合物の10μｌのアリコートを、カルシウ
ム処理された形質転換コンピテントE.コリHB101細胞100
μｌに添加する。

24個の形質転換されたamp^Rコロニーを、100μg/mlのア
ンピシリンを含有するLB培地中で別々に増殖せしめる。
Holmes等、（Anal.Biochem.114,193（1981）の方法に従
ってプラスミドDNAを調製し、そしてHindIII/EcoRI二重
消化により分析する。600bpのEcoRI−HindIII断片の出
現により、特定のクローンが発現ベクター中に正しい方
向で挿入されたPH05プロモーター−エグリンＣ−DNA断
片を有することが示される。予想されるように、約50％
のクローンが正しい方向に挿入部を有する。これらのク
ローンの１つを単離しそしてpJDB207R/PH05−EGLと命名
する。

ｅ）サッカロミセス・セレビシエ−GRF 18の形質転換 Hinnen等（４）により記載された方法により、プラスミ
ドpJDB207R/PH05−EGLをサッカロミセス・セレビシエ−
GRF 18株（α、his3−11、his3−15、leu2−３、leu2−
112、can^R）に導入する。形質転換された酵母細胞を、
ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選択する。単
一の形質転換された酵母コロニーを単離し、そしてサッ
カロミセス・セレビシエ−GRF 18/pJDB207R/PH05−EGL
と命名する。

ｆ）S.セレビシエ−GRF 18/pJDB207R/PH05−EGLの発酵 S.セレビシエ−GRF 18/pJDB207R/PH05−EGLの細胞を、3
00mlの酵母最少培地（アミノ酸を含有しないディフコ・
イースト・ナイトロジェン・ベースに２％のグルコース
及び20mg/lのＬ−ヒスチジンを添加したもの（）中で１
のエルレンマイヤーフラスコにおいて、30℃にて振と
うしながら24時間、３×10⁷細胞/mlの密度になるまで増
殖せしめる。細胞を0.9％NaCl中で洗浄し、そしてアミ
ノ酸を含有しないディフコ・イースト・ナイトロジェン
・ベースに0.03g/lのKH₂PO₄、1g/lのKl、(NH₄)₂SO₄に代
る10g/lのＬ−アスパラギン、２％のグルコース、及び1
g/lのＬ−ヒスチジンを加えた低Pi最少培地に接種す
る。培地に0.25の初発OD₆₀₀となる様に接種する。細胞
をMBR−ミニ−バイオリアクター中で30℃にて24時間、5
00rpmにて撹拌しながら増殖せしめ、そして1.9のOD₆₀₀
において収得する。

例37.形質転換されたサッカロミセス・セレビシエ−GRF
18/pJDB207R/PH05−EGLからのエグリンＣ及びＮα−ア
セチル−エグリンＣの回収 エグリンＣ構造遺伝子を含有するプラスミドにより形質
転換されたサッカロミセス・セレビシエーから、エグリ
ンＣ及びＮα−アセチル−エグリンＣの両者が回収され
る。生成物は、逆相HPLCに基いて培地ｌ当り15〜20mgの
収量、2:1（W/W）の比率で発現される。S.セレビシエー
の細胞は、例36.f）において記載したように600nmにお
いて、1.9の細胞密度（O.D.）に増殖する。

形質転換された酵母細胞の収得物3lを４℃に冷却し、そ
して遠心する。ペレット中の細胞を150mlの緩衝液〔50m
Mリン酸塩（pH7.4）、4mMツゥイッテルゲント（Zwitter
gent）（カルビオケム）中に再懸濁し、そしてガラスビ
ーズにより破砕する。ホモジネートを遠心分離し、そし
て上清を同量の２％酢酸により稀釈する。懸濁液を4000
rpmにて15分間遠心分離し、沈澱を分離し、そして不透
明な上清を12,000rpmにて60分間再度遠心する。透明な
上清をカルボキシメチルセルロース（CM）陽イオン交換
カラム（ベッドボリウム32ml）にpH4（１ベッドボリウ
ム出発緩衝液）にて通す。５ベッドボリウムの緩衝液Ａ
と５ベッドボリウムの緩衝液Ｂとの直線塩グラジエント
により溶出を行う〔緩衝液A:20mM酢酸アンモニウム（pH
4.0）；緩衝液Ｂ＊200mM酢酸アンモニウム（pH6.5）；
流速43ml/時）；画分量:14ml〕。Ｎα−アセチル−エグ
リンＣは画分29−31（15mg）に回収され、これを別途記
載するようにして半分取用逆相HPLCによりさらに精製す
る（収量8mg）。

エグリンＣは画分32−33（24mg）中に回収され、これを
凍結乾燥し、そしてジエチルアミノエチルセルロースカ
ラム（DE53、ワットマン、32mlのベッドボリウム）上で
のクロマトグラフィーによりさらに精製する。生成物を
15mlの出発緩衝液（pH7.6）に溶解し、負荷し、そして
１ベッドボリウムの緩衝液Ａにより洗浄する。90％より
高純度のエグリンＣ（全蛋白質に対する）が、直線塩グ
ラジエントを用いて画分48−54の間に溶出する〔緩衝液
A:20mM酢酸アンモニウム（pH7.6）５ベッドボリウム；
緩衝液B:200mM酢酸アンモニウム（pH5.0）５ベッドボリ
ウム；流速42ml/時；画分量3.8ml〕。純粋な画分（等電
点電気泳動に基く）をプールし、３回凍結乾燥する（収
量18mg）。

回収された両エグリンをアッセイし、そして例27〜30に
記載したようにして化学的に特徴付ける。

結果 エグリンＣ 等電点 6.5 分子量（FAB−MS） 8091 Ｎ−末端アミノ酸 Thr HLE阻害 ＋ Ｎα−アセチル−エグリンＣ 等電点 5.4 分子量（FAB−MS） 8133 Ｎ−末端アミノ酸 Ｎα−アセチル−Thr HLE阻害 ＋ 形質転換された酵母からのエグリンＣは、ヒルからの天
然エグリンＣについて観察されるのと同じ、HPLC上で保
持時間を示す。形質転換された酵母からのＮα−アセチ
ル−エグリンＣは、E.コリからの対応物と同時泳動す
る。アミオ酸組成及び他のデータは予想通りである。

例38.30l発酵槽中でのサッカロミセス・セレビシエ−GR
F 18/pJDB207R/PH05−EGLの発酵 サッカロミセス・セレビシエ−GRF 18/pJDB207R/PH05−
EGL株を下記の培地（低Pi）中で、600nmにて1.87の細胞
濃度（O.D.）に増殖せしめる。

Ｌ−アスパラギン・H₂O 10g Ｌ−ヒスチジン 1.0g KH₂PO₄ 0.03g MgSO₄・7H₂O 0.5g NaCl 0.1g KCl 1.0g CaCL₂・2H₂O 0.1g セレロース（別殺菌） 20g 硼酸 50mg CuSO₄ 5mg ヨウ化カリウム 10mg FeCl₃ 20mg MnSO₄ 40mg モリブデン酸ナトリウム 20mg ZnSO₄ 40mg パントテン酸−Ca 40mg 葉酸 5mg イノシトール 200mg ニコチン酸 40mg パラアミノ安息香酸 20mg ピリドキサールリン酸 40mg リボフラビン 20mg チアミン 40mg ビオチン溶液 （10mg/100ml 50％エタノール） 条件 NaOHにてpH調整、下限pH4.6、温度30℃。

試験サンプル（100mlの培養液を合計８個）を６時間毎
に採取し、細胞を機械的に破砕し、そして透明な上清を
RP−HPLC、PAGE、及びヒト白血球エラスターゼ（HLE）
−阻害によりアッセイする。36時間の培養の後、最適収
量、すなわち培養液１当り4.4mgのＮα−アセチル−
エグリンＣ及び13.6mgのエグリンＣが得られる。PAGEで
の見かけ分子量は予想通りである。

下限pH5でのpH調整及び同じ条件下での30時間の培養に
より、２種類の生成物間の比率がエグリンＣ側にシフト
する（エグリン6.4mg/l、Ｎα−アセチル−エグリンC0.
1mg/l）。例29に記載したようにして、酵母エグリンＣ
及び酵母Ｎα−アセチル−エグリンＣを回収し、そして
均一に精製する。

この発明に従って得られ、モノクローナル抗−エグリン
抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、フランス、パ
リ、パスツール研究所の「コレクチョン・ナチョラレ・
デ・カルチュレス・デ・ミクロオーガミスメス（Collec
tion Nationale de Cultures de Microorganismes）」
に、1984年11月６日に寄託された。

299S18−20,No1−361; 299S22−1,No1−362:299S22−10,No1−363。

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【図面の簡単な説明】

第１図はエグリンＣ遺伝子の断片F₁（Ｃ）及びF₂の合成
の概略を示し； 第２図はエグリンＣ遺伝子の断片F₁（Ｃ）のためのクロ
ーニングベクターであるプラスミドpML87の造成を示
し； 第３図はエグリンＣ遺伝子又はエグリンＢ遺伝子の断片
のクローニングのためのプラスミドpML136の造成を示
し； 第４図はF₁（Ｃ）−F₂DNAを含有するクローニングベク
ターpML141の造成を示し； 第５図はtrp−プロモーターを含有するベクターpHRi148
の造成の概略を示し；そして、 第６図はtrp−プロモーターの制御のもとにエグリンＣ
遺伝子〔F₁（Ｃ）−F₂DNA〕を含有する発現ベクターpML
147の造成の概略を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥ (72)発明者 マンフレツド リールシユ スイス国，4125 リーヘン，リユツテイリ ンク 26 (72)発明者 ペーター ジーバー スイス国4153 ライナツハ，バツハマツト ベク 10 (72)発明者 ベルナー リツテル スイス国，4144 アルレシヤイム，フイン ケラーベク ６ (72)発明者 フランソワ メイヤー スイス国，8046 チユーリツヒ，レルヘン ベルク 42 (72)発明者 ウルスラ ゼーミユラー ドイツ連邦共和国，8000 ミユンヘン 40，デシユトウヘシユトラーセ 60 (72)発明者 ハンス フリツツ ドイツ連邦共和国，8011 ホーヘンブル ン，ノイリンガーシユトラーセ 15 (72)発明者 バルカー メルキ スイス国，4313 メーリン，ブレメンシユ タルシユトラーセ 30 (72)発明者 ゼフイク アルカン スイス国，4125 リーヘン，ビンゼナツカ ーシユトラーセ ３ (56)参考文献 西独国特許出願公開2808396（ＤＥ，Ａ)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の式： Ｂ−Leu Lys Ser Phe Pro Glu Val Val Gly Lys Thr Va
   l Asp Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Thr Leu His Tyr Pro Gln Tyr As
   p Val Tyr Phe Leu Pro Glu Gly Ser Pro Val Thr Leu Asp Leu Ar
   g Tyr Asn Arg Val Arg Val Phe Tyr Asn Pro Gly Thr Asn Val Va
   l Asn His Val Pro His Val Gly （式中、ＢはＮ−アセチル基、Ｎ−アセチル−Ser Gl
   u、又はＮ−アセチル−Thr Glu Phe Gly Ser Gluであ
   る） で表されるエグリン化合物、又は該化合物の塩。
2. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載のN^a−アセチル
   −エグリンＣ、及びその塩。
3. 【請求項３】次の式： Ｂ−Leu Lys Ser Phe Pro Glu Val Val Gly Lys Thr Va
   l Asp Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Thr Leu His Tyr Pro Gln Tyr As
   p Val Tyr Phe Leu Pro Glu Gly Ser Pro Val Thr Leu Asp Leu Ar
   g Tyr Asn Arg Val Arg Val Phe Tyr Asn Pro Gly Thr Asn Val Va
   l Asn His Val Pro His Val Gly （式中、ＢはＮ−アセチル基、Ｎ−アセチル−Ser Gl
   u、又はＮ−アセチル−Thr Glu Phe Gly Ser Gluであ
   る） で表されるエグリン化合物、又は該化合物の塩の製造方
   法であって、発現制御配列により制御されておりエグリ
   ン化合物をコードするDNA配列を含有する発現プラスミ
   ドにより形質転換された宿主を、資化性の炭素源及び窒
   素源を含有する液体培地中で培養し、そして生成物を宿
   主細胞から遊離せしめ、遊離のＮ末端アミノ基を有する
   前記式の化合物はそれを所望によりアセチル化し、そし
   て／又は所望により得られた塩を遊離ポリペプチドに、
   又は得られたポリペプチドをその塩に転換することを特
   徴とする方法。
4. 【請求項４】N^a−アセチル−エグリンＣを製造するため
   の特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. 【請求項５】次の式： Ｂ−Leu Lys Ser Phe Pro Glu Val Val Gly Lys Thr Va
   l Asp Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Thr Leu His Tyr Pro Gln Tyr As
   p Val Tyr Phe Leu Pro Glu Gly Ser Pro Val Thr Leu Asp Leu Ar
   g Tyr Asn Arg Val Arg Val Phe Tyr Asn Pro Gly Thr Asn Val Va
   l Asn His Val Pro His Val Gly （式中、ＢはＮ−アセチル基、Ｎ−アセチル−Ser Gl
   u、又はＮ−アセチル−Thr Glu Phe Gly Ser Gluであ
   る） で表される生物学的活性を有するエグリン化合物、又は
   該化合物の塩を含んで成る、白血球エラスターゼにより
   生ずる肺疾患の治療剤。