JPH07303482A - 新規なメタロプロテアーゼおよびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 新規なメタロプロテアーゼ、それをコードす
るＤＮＡ、そのＤＮＡ配列を有するプラスミドおよびそ
のプラスミドを有する宿主細胞ならびにそのタンパク質
に特異的に結合するモノクローナル抗体。 【効果】 癌細胞の存在の有無、癌の悪性度の診断等の
医学的、生理学的分野の用途に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、癌細胞の存在の有無、癌の悪性
度の診断等に、あるいはその他の医学的、生理学的分野
の用途に有用な新規なメタロプロテアーゼに関する。

【０００２】さらに詳しく言えば、本発明はヒト癌細胞
で特異的に発現しているメタロプロテアーゼの１種なら
びにそれをコードする遣伝子ＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配
列を含有する塩基配列を有するプラスミド、そのプラス
ミドを有する宿主細胞、該宿主細胞を用いる該タンパク
質の製造方法、前記ＤＮＡ配列とハイブリダイズするプ
ローブ、該プローブを用いる前記ＤＮＡ配列を有するＤ
ＮＡまたはＲＮＡの検出方法、前記のタンパク質に特異
的に結合するモノクローナル抗体に関するものである。

【０００３】

【背景技術】コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチ
ン、フィブロネクチン、ラミニン等の複雑な成分から構
成される細胞外マトリックスの分解には、基質特異性を
異にするマトリックスメタロプロテアーゼと総称される
一群の酵素（以下ＭＭＰｓと略記する）が関与してい
る。

【０００４】これまでＭＭＰｓとしては、間質型コラゲ
ナーゼ（ＭＭＰ−１）、７２ｋＤａゼラチナーゼ（ＩＶ
型コラゲナーゼあるいはゼラチナーゼＡともいう：ＭＭ
Ｐ−２）、９２ｋＤａゼラチナーゼ（ＩＶ型コラゲナー
ゼあるいはゼラチナーゼＢともいう：ＭＭＰ−９）、ス
トロムライシン−１（ＭＭＰ−３）、マトリライシン
（ＭＭＰ−７）、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）、
ストロムライシン−２（ＭＭＰ−１０）、ストロムライ
シン−３（ＭＭＰ−１１）等が報告されている。

【０００５】これらのＭＭＰｓはファミリーを形成し、
遺伝子の一次構造は既に報告されている。決定されてい
るＭＭＰｓファミリー間の一次構造においては、ＭＭＰ
−７を除き各ＭＭＰは基本的にＮ−末端プロペプチドド
メイン、Ｚｎ^＋結合触媒ドメイン、Ｃ−末端ヘモペキシ
ン凝血酵素様ドメインの３つから構成されている。ＭＭ
Ｐ−７においてはヘモペキシン凝血酵素様ドメインはな
い。ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９では、この他にゼラチン結
合ドメインを含んでいる。さらに、ＭＭＰ−９では、Ｚ
ｎ^＋結合触媒ドメインとＣ−末端ヘモペキシン凝血酵素
様ドメインの間にプロリンに富むＶ型コラーゲンα２鎖
と相同性の高いドメインが挿入されている。

【０００６】転移性の高い癌細胞では、ＩＶ型コラーゲ
ンを主たる基質とするＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−
２、ＭＭＰ−９）の顕著な発現が見られることが報告さ
れており（キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．）、第４６巻、１〜７頁（１９８６）；バイオケミ
カル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニ
ケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、第１５４巻、８３２〜８３８頁
（１９８８）；キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、第７１
巻、１３６８〜１３８３頁（１９９３））、また、ＭＭ
Ｐ−９の活性化がＭＭＰ−３の作用によって引き起こさ
れることが報告されている（ザ ジャーナルオブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）第２６７巻、３５８１〜３５８４頁（１９９
２））。マトリックスメタロプロテアーゼの発現の程度
は、癌の悪性度を診断する指標となる。

【０００７】

【発明の開示】本発明者らは新規なマトリックスメタロ
プロテアーゼ（以下本明細書においてはＭＴ−ＭＭＰと
記述する）を見出し、その構造分析を行った。本発明に
より、下記に記載されるとおり、新規なメタロプロテア
ーゼタンパク質、そのタンパク質をコードする塩基配列
を有するＤＮＡ、このＤＮＡ塩基配列を有するプラスミ
ド、このプラスミドを有する宿主細胞ならびに上記メタ
ロプロテアーゼタンパク質を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体が提供される。

【０００８】１．配列表配列番号１に示されているアミ
ノ酸配列を有するタンバク質。 ２．配列表配列番号１に示されているアミノ酸配列を有
するタンパク質をコードする配列表配列番号２に示され
ている塩基配列を有するＤＮＡ。 ３．配列表配列番号２に示されている塩基配列を有する
ＤＮＡ配列を含有し、配列表配列番号１に示されている
タンパク質を発現するプラスミド。 ４．配列表配列番号２に示されている塩基配列を有する
ＤＮＡ配列を含有し、配列表配列番号１に示されている
タンパク質を発現するプラスミドを有する宿主細胞。 ５．配列表配列番号１に示されているアミノ酸配列を有
するタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗
体。

【０００９】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
者らは、公知のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭ
Ｐ）ファミリーのアミノ酸配列から選択した高度に保存
されている配列（配列表配列番号３および４）より、配
列表配列番号５および６に記載した配列を有するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを設計、合成した。該オリゴヌ
クレオチドプライマーとヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー
を用い、ＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物の各Ｄ
ＮＡの塩基配列を決定し、公知のＭＭＰと相同でない配
列を有する３９０ｂ．ｐ．のＤＮＡ断片を得た。この３
９０ｂ．ｐ．ＤＮＡ断片をプローブとし、ヒト胎盤ｃＤ
ＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、得られた陽
性クローンのファージＤＮＡ中に組み込まれていたｃＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列は配列表配列番号
２に記載の塩基配列である。配列表配列番号２に記載の
塩基配列と同一の配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ／ＥＭＢＬ
ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ中には存在せず、この塩基
配列を有するＤＮＡは全く新規なものであることが認め
られた。

【００１０】配列表配列番号２に記載した上記のクロー
ンのｃＤＮＡの塩基配列は、３′非翻訳配列と共に推定
５８２アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを
有していた。開始コドンは塩基番号１１２に位置し、停
止コドンは塩基番号１８５８に存在する。このオープン
リーディングフレームは、配列表配列番号１に記載した
５８２アミノ酸からなる配列をコードしており、開始コ
ドンのすぐ下流から推定されるシグナル配列が続き、Ｃ
末端のアミノ酸番号５３３から５６２に２０個以上の疎
水性アミノ酸の連続した膜結合型タンパク質に特徴的な
疎水性領域（配列表配列番号７）が存在することが認め
られた。

【００１１】図２に示すようにＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸
配列と公知のＭＭＰファミリーのアミノ酸配列との相同
性を調査した結果、ＭＴ−ＭＭＰは公知のＭＭＰファミ
リーと高い相同性を示した。ＭＭＰファミリーで保存さ
れている前駆体と成熟体のプロセッシング部位近傍の配
列、および活性部位の配列はＭＴ−ＭＭＰ中で最も良好
に保存されていた。またＭＴ−ＭＭＰでは、他のＭＭＰ
ファミリーのアミノ酸配列上には認められない配列表配
列番号７に示した疎水性アミノ酸の連続した配列が存在
し、膜貫通型タンパク質の構造的特徴を有することか
ら、他のＭＭＰファミリーとは異なる膜結合型のＭＭＰ
であることが強く示唆された。

【００１２】ＭＴ−ＭＭＰのヒト組織中での発現を各種
の組織由来Ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡに対するノーザンブロ
ット分析により検討した結果、胎盤、肺、腎臓で高い発
現をしていることが認められた（図３参照）。また、ヒ
ト肺偏平上皮癌の正常部分および癌部分から抽出したＲ
ＮＡに対しノーザンブロット分析を行った結果、ＭＴ−
ＭＭＰは癌部位で特異的に発現していることが認められ
た（図４参照）。なお、本発明のＭＴ−ＭＭＰは、抗Ｍ
Ｔ−ＭＭＰモノクローナル抗体を用いた免疫沈降や免疫
染色実験により遺伝子産物が分泌されることなく細胞膜
上に発現されていることが示され、また、ＭＴ−ＭＭＰ
遺伝子をトランスフェクションした細胞では、ＭＴ−Ｍ
ＭＰの発現に依存したＭＭＰ−２の活性化が観察された
（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３７０巻、６１〜６
５頁（１９９４））。以上述べた本発明者らの研究成果
により、本発明により、配列表配列番号１に記載された
アミノ酸配列を有する新規なマトリックスメタロプロテ
アーゼタンパク質が提供される。

【００１３】また、本発明により配列表配列番号１に記
載されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードして
いる配列表配列番号２に記載された塩基配列を有するＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを有し発現し得るプラスミド、このプラ
スミドを有する宿主細胞が提供される。上記の宿主細胞
としては、大腸菌、枯草菌などの原核細胞宿主、酵母、
ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞などの真核細胞、
Ｓｆ２１などの昆虫細胞等、通常遺伝子組換え技術で用
いられる全ての宿主細胞を用いることができる。上記の
プラスミドとしては、通常用いられる宿主細胞に応じた
発現ベクターを用いることができる。

【００１４】さらに本発明により、配列表配列番号２に
記載された塩基配列を有するＤＮＡから転写されるｍＲ
ＮＡが提供される。上記のＤＮＡあるいはＲＮＡとハイ
ブリダイズし、該ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に検出す
るプローブも提供されるが、該プローブは、通常使用さ
れる放射性同位元素、酵素などにより標識され、通常の
ブロッティング分析、Ｉｎ ｓｉｔｕハイ ブリダイゼ
ーションで該ＤＮＡあるいはＲＮＡと特異的にハイブリ
ダイズし、検出できるものであれば配列表配列番号２に
記載した塩基配列の一部を有するものであればよく、ど
のような塩基配列でもよい。

【００１５】さらに、本発明は、本発明に係るＭＴ−Ｍ
ＭＰと特異的に結合するモノクローナル抗体を提供す
る。本発明に係るモノクローナル抗体は、ヒトＭＴ−Ｍ
ＭＰを免疫原として公知の方法、例えばミルシュタイン
らの方法（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻、
４９５〜４９７頁（１９７５））により製造することが
できる。この方法において、免疫原としては天然型ヒト
ＭＴ−ＭＭＰ、組換えヒトＭＴ−ＭＭＰおよびそれらの
一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド等の何れでも
よい。

【００１６】本発明により、本発明に係る新規なＭＴ−
ＭＭＰのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする
塩基配列を有するＤＮＡをクローン化し、そのＤＮＡお
よびそのＤＮＡにコードされているタンパク質を遺伝子
工学的方法により製造することができる。この新規なＭ
Ｔ−ＭＭＰのｃＤＮＡクローンを用いることにより、上
記の塩基配列を遺伝子工学的に常用される方法を用いて
他のベクターあるいは宿主へのクローン化を行うことが
できる。また、上記のｃＤＮＡの塩基配列に準拠して適
宜、プローブに適したＤＮＡを設計し、調製することが
できる。さらに、本発明に係わるＭＴ−ＭＭＰの遺伝子
塩基配列をもとに遺伝子工学的に常用される方法を用い
ることにより、ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列中に適宜、
１個ないしは複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿
入、転移あるいは付加した如き変異を導入した相当する
タンパク質を製造することができる。メタロプロテアー
ゼの共通の特徴である前駆体と成熟体のプロッセシング
部位近傍の配列や活性部位の配列、ドメイン構造、ＭＴ
−ＭＭＰの特徴であるＣ末端近傍に存在する疎水性アミ
ノ酸の連続した疎水性領域が維持されていれば、上記の
如き誘導体は全て本発明に包含される。

【００１７】本発明の前述した種々の態様を利用するこ
とにより、癌細胞の存在の有無、癌の悪性度などの診断
用の診断剤あるいは診断方法の用途に、あるいはまた、
その他の医学的生理学的分野の用途に適用される種々の
技術手段を提供することができる。以下、実施例により
本発明を具体的に説明するが、本発明は、これら実施例
により限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】

実施例１ 新規なメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）ｃＤＮＡの
単離 （ａ）ｃＤＮＡライブラリーの構築 ヒト胎盤組織から全ＲＮＡをグアニジン−塩化セシウム
法（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、第１８巻、５２９４〜５２９９頁（１９７９））
により抽出し、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−
セルロースカラムを使用して精製した。精製したポリ
（Ａ）^＋ＲＮＡをテンプレート、オリゴ（ｄＴ）をプラ
イマーとしてガブラー・ホフマン（ＧｕｂＩｅｒ・Ｈｏ
ｆｆｍａｎ）法（ジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、２６
３〜２６９頁（１９８３））に従い、ｃＤＮＡを合成し
た。Ｔ_４ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡの末端を平
滑化した後、ＥｃｏＲ ＩメチラーゼによりｃＤＮＡ中
に存在するＥｃｏＲ Ｉサイトをメチル化した。さらに
ＥｃｏＲ Ｉリンカー〔ｄ（ＰＧ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ
−Ｃ−Ｃ）〕とｃＤＮＡをＴ_４ＤＮＡリガーゼを用い連
結させた後、ＥｃｏＲ Ｉ消化することにより両末端に
ＥｃｏＲ Ｉサイトを有するｃＤＮＡを構築した。この
ｃＤＮＡをλｇｔｌｌのＥｃｏＲ ＩサイトにＴ_４ＤＮ
Ａリガーゼを用い連結させた。次にこのｃＤＮＡを例え
ばインビトロパッケージングキット（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）を使用し、インビトロパッケージングを行い、ｃＤ
ＮＡライブラリーを構築した。ｃＤＮＡライブラリーと
して市販の例えばヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬ
ＯＮＴＥＣＨ）を使用することもできる。

【００１９】（ｂ）合成オリゴヌクレオチドプライマー
の作製 既知のＭＭＰｓファミリーのアミノ酸配列の中から、Ｍ
ＭＰｓファミリー中で高度に保存されているアミノ酸配
列として配列表配列番号３（Ｐ−１）および配列番号４
に記載した配列（Ｐ−２）を選択した。このオリゴペプ
チドＰ−１およびオリゴペプチドＰ−２のそれぞれに対
応するオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを設計し
た。すなわち、オリゴペプチド中に２つ以上のコドンで
コードされるアミノ酸が存在する場合その混合物とし配
列表配列番号５（プライマー１）および配列番号６（プ
ライマー２）に記載した配列のごとく設計した。このプ
ライマー１およびプライマー２をＤＮＡシンセサイザＭ
ｏｄｅｌ ３９２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を使用し、β−シアノエチルフォスフォアミダイ
ト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉ
ｄｉｔｅ）法により合成した。得られたプライマー１お
よびプライマー２は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ６．８で平衡化したニックカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を用い精製した。

【００２０】（ｃ）ＰＣＲによる遺伝子増幅 ヒト胎盤由来のｃＤＮＡをテンプレート、前項（ｂ）に
記載したプライマー１およびプライマー２をプライマー
としてＰＣＲ反応（ＰＣＲテクノロジー（ＰＣＲ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）６３〜６７頁、ストックトンプレス
（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ））を行った。その結
果、３９０ｂ．ｐ．のＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣ
Ｒ産物を適当なプラスミド、例えばｐＵＣ １１９やｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、このＰＣＲ産
物の塩基配列を、蛍光ＤＮＡシーケンサＭｏｄｅｌ ３
７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔ
ａｑダイプライマーサイクルシークエンシングキット
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し決
定した。塩基配列を決定した種々のＰＣＲ産物の中から
既知ＭＭＰの塩基配列と相同性のないＰＣＲ産物Ａを得
た。このＰＣＲ産物Ａを前述の（ａ）項に記載したヒト
胎盤組織ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めのプローブとして用いた。プローブの^３２Ｐ標識は、
ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ）を使用して行った。

【００２１】（ｄ）ｃＤＮＡライブラリーからの新規Ｍ
ＭＰ遺伝子のスクリーニングと塩基配列の決定 前述の（ａ）に記載したλｇｔｌｌ中に構築したヒト胎
盤ｃＤＮＡライブラリーを宿主菌大腸菌Ｙ１０９０に感
染させ、プラークを形成させた。すなわち、Ｙ１０９０
株を０．０２％マルトースを含むＬ培地で１晩培養後、
集菌し、１０ｍＭＭｇＳＯ_４に懸濁した。この細胞懸濁
液とファージ液を混合し３７℃１５分間インキュベート
し、ファージを宿主菌に吸着させた。これに軟寒天を加
え、Ｌプレート上に広げた（上記の操作を以後プレーテ
ィングと称す）。プレートを４２℃で１晩インキュベー
トし、プラークを形成させた後、ナイロンフィルター
（例えば、ハイボンド−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ））ある
いはニトロセルロースフィルター（例えばＨＡＴＦ（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ））をプレート上に置き、約３０秒間
放置した。膜を穏やかに剥がしアルカリ変性液（０．１
Ｍ ＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ）に３０秒間浸した
後、中和液（１．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．５ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８）に５分間浸した。このフィル
ターを２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ
ＮａＨ_２ＰＯ_４、２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した後、
風乾した。上述のプラークのフィルターへの転写を繰り
返し、少なくとも２枚のフィルターを調製した。但し、
２枚目以降のフィルターとプレートの接触時間は２分間
程度に延長した。このフィルターを８０℃で２時間べー
キングし、ＤＮＡを固定した。１つのプレートから調製
した少なくとも２枚のフィルターをそれぞれ４２℃、１
時間洗浄液（１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡおよび
０．１％ＳＤＳ含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液、ｐＨ８．０）で洗浄後、ハイブリダイゼーションバ
ッグ中にフィルターを入れ、プレハイブリダイゼーショ
ン溶液（５０％ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、５×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ溶液（０．２％ウシ血清アルブミン、０．２％
ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）、５×ＳＳ
ＰＥ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精
子ＤＮＡ）に浸し、４２℃で６〜８時間プレハイブリダ
イゼーションを行った。次に１００℃、５分間加熱変性
させた（ｃ）項で記載した^３２Ｐ標識プローブをプレハ
イブリダイゼーション溶液に添加し、４２℃で１晩ハイ
ブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション
完了後、フィルターを室温で多量の０．１％ＳＤＳ含有
２×ＳＳＣ溶液で洗浄した。次にフィルターを０．１％
ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液中に６８℃、１５分間置い
た。このフィルターを風乾した後、Ｘ線フィルム（Ｋｏ
ｄａｋ ＸＲ）と重ね−７０℃で１週間オートラジオグ
ラフィーを行った。Ｘ線フィルムを現像し、１枚のプレ
ートからできた２枚のフィルムを重ね、重なるシグナル
をマークした。マークしたシグナルに相当するプラーク
をＳＭ溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ_４含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐｎ
７．５）に懸濁した。このファージ懸濁液を適度に希釈
してプレーティングし、上記と同様のスクリーニング行
い、組換え体ファージを得た。

【００２２】（ｅ）組換え体λｇｔｌｌＤＮＡの調製 クローン化したファージをそれぞれプレーティングし４
２℃、３時間インキュベートし、続いて３７℃、１晩イ
ンキュベートした後ＳＭ溶液に数滴のクロロホルムを加
え室温で３０分間放置した。ＳＭ溶液と共に上層の軟寒
天を掻き取り、遠心分離した。遠心後の上清に終濃度１
０％になるようにポリエチレングリコールを加え撹拌し
た後、４℃で１時間放置した。これを遠心分離し上清を
捨て、ファージ粒子を回収した。このファージ粒子をＳ
Ｍ溶液に懸濁し、グリセロールグラジエント超遠心分離
法（モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニ
ュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、Ｔ．マニアスチ
ス（Ｔ．Ｍａｎｉａｓｔｉｓ）他著、コールド スプリ
ングハーバー ラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ）発行、２．７８頁（１９８９））により精製し
た。得られたファージをＴＭ溶液に懸濁し、ＤＮａｓｅ
ＩおよびＲＮａｓｅ Ａで処理後、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋおよび
０．５％ＳＤＳの混合液を加え６５℃、１時間インキュ
ベートした。これをフェノール抽出、ジエチルエーテル
抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。得
られたＤＮＡを７０％エタノールで洗浄後乾燥し、ＴＥ
溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８）に溶解した。

【００２３】（ｆ）挿入断片の塩基配列決定 前項（ｅ）で調製したλｇｔｌｌＤＮをＥｃｏＲ Ｉで
分解し、挿入断片を分離精製後、ベクターｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ Ｉ部
位にクローニングした。この組換え体ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔで大腸菌ＮＭ５２２ＸＬＩ−Ｂｌｕｅを形質軟換
した。形質転換細胞をＦ′選択後、ヘルパーファージＶ
ＣＳＭ１３（Ｓｔｈａｔａｇｅｎｅ）を感染させ終夜培
養した。培養液を遠心分離し菌体を除き、これにＰＥＧ
／ＮａＣｌを加えファージを沈殿させた。沈殿をＴＥ溶
液に懸濁後、１本鎖ＤＮＡをフェノール抽出、エタノー
ル沈殿により回収した。この１本鎖ＤＮＡの塩基配列を
蛍光ＤＮＡシーケンサＭｏｄｅｌ ３７３Ａ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔａｑダイプイマー
サイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し決定した。決定した塩基
配列の全長は３４０３塩基対であり、その配列は配列表
配列番号２に記載した。ＧＥＮＢＡＮＫ／ＥＭＢＬＤＮ
Ａ ＤａｔａＢａｓｅを使用し、配列表配列番号２に記
載した塩基配列を検索したが、同一の配列は存在しなか
った。

【００２４】（ｇ）遺伝子産物の解析 配列表配列番号２に記載した遺伝子塩基配列から予想さ
れる配列表配列番号１に記載したアミノ酸配列の親水、
疎水性値をカイト・ドーリトル（Ｋｙｔｅ・Ｄｏｏｌｉ
ｔｔｌｅ）法（ジャーナル オブ モレキュラーバイオ
ロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１５７巻、１０
５〜１３２頁（１９８２））により算出し、図１に示す
親水性、疎水性分布図を決定した。配列表配列番号１の
アミノ酸５３３位から５６２位のＣ末端領域に膜結合型
タンパク質に特徴的な２０個以上の疎水性アミノ酸が連
続する配列からなる疎水性領域が存在し、その配列を配
列表配列番号７に示した。このような疎水性のアミノ酸
が連続している配列は、既知のＭＭＰｓには見られない
配列である。配列表配列番号１に記載したアミノ酸配列
を公知のＭＭＰｓのアミノ酸配列とその相同性を比較し
た結果、配列表配列番号１に示したアミノ酸配列は、Ｍ
ＭＰｓファミリーと相同性を示した。特に、ＭＭＰｓフ
ァミリーで非常に高度に保存されている前駆体と活性型
の切断部位および活性部位はＭＴ−ＭＭＰでもそれぞれ
高い保存性を示した（配列表配列番号１、アミノ酸８８
位〜９７位およびアミノ酸番号１１２位〜２２２位）。

【００２５】実施例２ 遺伝子発現 （ａ）組織での発現 ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、
各組織由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをブロットしてあるメ
ンブレン ヒューマン マルチプル ディッシュ ノー
ザン ブロッツ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に対し、^３２Ｐ標
識した実施例１（ｃ）項に記載したＰＣＲ産物Ａをプロ
ーブとして用いてハイブリダイゼーションを行った。３
×ＳＳＣ（０．４５ＭＮａＣｌ、０．０４５Ｍ ｔｒｉ
ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ−２Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．０）
で湿らせたヒューマン マルチプル ティッシュノーザ
ンブロッツのフィルターをプレハイブリダイゼーション
溶液（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭＥＤＴＡ、
０．５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｓ溶液、５０％Ｆｏｒｍａ
ｍｉｄｅおよび１％ＳＤＳ含有２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．５）中で穏やかに撹拌しながら２
〜３時間プレハイブリダイズした。次にハイブリダイゼ
ーション溶液（プレハイブリダイゼーション溶液に１０
％Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｘｔｒａｎ、５０μｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを加えた溶液）に熱変性したプローブを
加えプレハイブリダイゼーション溶液と交換し、４３℃
で１晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイ
ゼーション完了後、０．１％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ溶液
で洗浄した。次にフィルターを０．１％ＳＤＳ含有１×
ＳＳＣ溶液中に６８℃、１５分間置いた。このフィルタ
ーを風乾した後、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ ＸＲ）と
重ね−７０℃で１週間オートラジオグラフィーを行っ
た。ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子の転写産物のサイズは、何れの
組織でも４．８ｋｂ．であった。現像したＸ線フィルム
をデンシトメーターでトレースしシグナルの強度を測定
した結果、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子は、調べた組織中、肺、
胎盤、腎臓で高い発現を認めた。

【００２６】（ｂ）癌組織での発現 ヒト肺偏平上皮癌２例それぞれから正常組織と癌組織を
採取し、全ＲＮＡをグアニジン−塩化セシウム法により
抽出した。１０μｇの該ＲＮＡそれぞれを１％アガロー
ス電気泳動後、ナイロンメンブレンにトランスファー
し、実施例１（ｃ）項に記載した^３２Ｐ標識したプロー
ブを使用してハイブリダイゼーションを行った。ハイブ
リダイゼーションおよびオートラジオグラフィーのトレ
ースは前項（ａ）と同様に行った。いずれのヒト肺偏平
上皮癌においても癌組織（図４ Ｔ参照）での発現が正
常組織（図４ Ｎ参照）に比べ有意に高値を示した。

【００２７】実施例３ モノクローナル抗体の調製 （ａ）抗原ポリペプチドの調製 配列表配列番号１に記載したＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配
列中より他のＭＭＰファミリーとの相同性が低い特異的
な配列として配列表配列番号８（配列表配列番号１アミ
ノ酸番号１６０位〜１７３位の配列）、同９（配列表配
列番号１アミノ酸番号３２０位〜３３３位の配列）およ
び同１０（配列表配列番号１アミノ酸番号４９８位〜５
１２位の配列）に記載した配列（以下それぞれポリペプ
チドＡ、ポリペプチドＢおよびポリペプチドＣと略記す
る）を選択した。これらのポリペプチドをペプチド合成
機（ペプチドシンセサイザー９６００、ＭｉｌｌｉＧｅ
ｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）を用いＦｍｏｃ−ＢＯＰ法に
より合成し、Ｎ末端にシステインを導入した。合成した
各ペプチドは高速液体クロマトグラフィーにより精製し
た。

【００２８】（ｂ）各ポリペプチドとキーホールリンベ
ットヘモシアニンの複合体の調製 ２ｍｇキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）を
１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し
たものと１．８５ｍｇＮ−（ε−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃ
ａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを２００
μｌのジメチルホルムアミドに溶解したものと混合し、
３０℃、３０分間反応させた。ついで、上記の混合液を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌｌ７．０）で平衡化したＰ
Ｄ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過した。マレ
イミドが結合したＫＬＨを分取し、１．５ｍｌ以下に濃
縮した。マレイミドが結合したＫＬＨに対し５０倍モル
量の前記（ａ）で合成した各ポリペプチドを１ｍｌの
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したものと
をそれぞれ混合し、４℃、２０時間インキュベートし、
ＫＬＨ−ポリペプチド複合体を調製した。

【００２９】（ｃ）抗体産生細胞の調製 前項（ｂ）で調製した３種類のポリペプチドＡ、ポリペ
プチドＢおよびポリペプチドＣとＫＬＨとの複合体それ
ぞれ２５０μｇを完全フロインドアジュバントと共に８
週令Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに腹腔内投与し、初回免疫し
た。１８日後に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
溶解した各複合体２００μｇをそれぞれの初回免疫した
マウスに腹腔内投与し、追加免疫した。さらに３２日後
に追加免疫時と同様に各複合体１００μｇを静脈内投与
し、最終免疫とした。その３日後に脾臓を摘出し、脾細
胞懸濁液を調製した。

【００３０】（ｄ）細胞融合 ８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／
Ｏ−Ａｇ１４）との融合は、オイ（Ｏｉ）らの方法（セ
レクテッドメソッドイン セルラーイムノロジー（Ｓｅ
ｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｂ．Ｂ．ミッシェルとＳ．
Ｍ．シーギ編（ｅｄ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ
Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン アン
ドカンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）発行、３５１〜３７２頁（１９８０））を
若干改変して行った。以下では、ポリペプチドＡ−ＫＬ
Ｈ複合体で免疫したマウス由来の有核脾細胞とミエロー
マ細胞ＳＰ２との融合に関して詳述する。

【００３１】前項（ｃ）で調製した有核脾細胞（生細胞
率１００％）それぞれとミエローマ細胞（生細胞率１０
０％）とを５：１の比率で以下の手順で融合した。ポリ
ペプチドＡ脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそれぞれＲ
ＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に同じ培地に懸濁
し、融合させるために有核脾細胞３×１０^８個とミエロ
ーマ細胞６×１０^７個を混合した。次に遠心分離により
細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去した。沈殿した
細胞に３７℃に加温したＰＥＧ４０００溶液（５０％
（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４０００含有ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地）２．０ｍｌを１分間で滴下し、１分間
撹拌し、細胞を再懸濁、分散させた。次に３７℃に加温
したＲＰＭＩ１６４０培地２．０ｍｌを１分間で滴下し
た。この操作をさらに１回繰り返した後、同培地１４ｍ
ｌを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、細胞を分散
させた。これを遠心分離し、上清を完全に吸引除去し
た。次にこの沈殿した細胞に３７℃に加温したＮＳ−１
培地（除菌ろ過した１５％（ｗ／ｖ）仔牛胎児血清（Ｊ
ＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）含有ＲＰＭＩ１６４０
培地）３０ｍｌを速やかに加え、大きい細胞塊を注意深
くピペッティングで分散した。さらに同培地３０ｍｌを
加えて希釈し、ポリスチレン製９６穴マイクロウェルに
ウェル当り６．０×１０^５個／０．１ｍｌの細胞を加え
た。細胞を加えた上記マイクロウェルを７％炭酸ガス／
９３％空気中で温度３７℃、湿度１００％で培養した。

【００３２】ポリペプチドＢ−ＫＬＨ複合体で免疫した
マウス由来脾細胞の場合では、脾細胞６．４×１０^８個
とミエローマ細胞１．２８×１０^８個を混合し、上記で
使用したＰＥＧ４０００溶液、ＲＰＭＩ１６４０培地、
ＮＳ−１培地をそれぞれ４．３ｍｌ、３８．７ｍｌ、１
２９ｍｌ用いた。ポリペプチドＣ−ＫＬＨ複合体で免疫
したマウス由来の脾細胞の場合、脾細胞６．８×１０^８
個とミエローマ細胞１．３６×１０^８個を混合し、ＰＥ
Ｇ４０００溶液、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＮＳ−１培地
をそれぞれ４．５ｍｌ、４０．５ｍｌ、１３５ｍｌ使用
した。

【００３３】（ｅ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 前項（ｄ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパスツ
ールピペットでＨＡＴ培地（ＮＳ−１培地にヒポキサン
チン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）お
よびチミジン（１６μＭ）を加えた培地）２滴（約０．
１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８日目に培地の半分
（約０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１１
日目に培地の半分を新しいＨＴ培地（アミノプテリン不
含ＨＡＴ培地）で置き換えた。１４日目にハイブリドー
マの生育が肉眼にて認められた全ウェルについて固相−
抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウェルを調
べた。すなわち、ポリスチレン性９６穴プレートを抗原
としたポリペプチドＡ、ＢおよびＣそれぞれでコート
し、次に洗浄用ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含
有）を用いて洗浄して未吸着のペプチドを除いた。さら
に各ウェルの未コート部分を１％ＢＳＡでブロックし
た。この各ウェルにハイブリドーマの生育が確認された
ウェルの上清０．１ｍｌを添加し、室温で約１時間静置
した。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウス免疫グロブリンを加え、さらに室温で約１
時間静置した。次に基質である過酸化水素とｏ−フェニ
レンジアミンを加え、発色の程度をマイクロプレート用
吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー）を用いて４９２
ｎｍの吸光度で測定した。

【００３４】（ｆ）ハイブリドーマのクローニング 前項（ｅ）で得られた各抗原ペプチドに対する陽性ウェ
ル中のハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクロ
ーン化した。すなわち、９６穴マイクロウェルにハイブ
リドーマをウェル当り５個、１個、０．５個になるよう
に希釈し、それぞれ３６穴、３６穴、２４穴に加えた。
５日目、１２日目に全ウェルに約０．１ｍｌのＮＳ−１
培地を追加した。クローニング開始後約２週間で、肉眼
的に十分なハイブリドーマの生育を認め、コロニー形成
陰性ウェルが５０％以上である群について（ｅ）に記載
したＥＬＩＳＡを行った。調べた全ウェルが陽性でない
場合、抗体陽性ウェル中のコロニー数が１個のウェルを
４〜６個選択し、再クローニングを行った。最終的に表
１および表２にまとめて示したように各ポリペプチド
Ａ、ポリペプチドＢまたはポリペプチドＣに対するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマがそれぞれ１
２個、２０個、９個得られた。

【００３５】（ｇ）ハイブリドーマの培養とモノクロー
ナル抗体の精製 得られた各ハイブリドーマ細胞をＮＳ−１培地で培養
し、その上清から濃度１０〜１００μｇ／ｍｌのモノク
ローナル抗体を得ることができた。また、得られたハイ
ブリードーマを１０^７個を予め１週間前にプリスタンを
腹腔内投与したマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系、雌、６週齢）
に同じく腹腔内投与し、１〜２週間後、腹水中からも４
〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得る
ことができた。得られた腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで塩析後、ＩｇＧクラスの抗体をプロテインＡアフ
ィゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に吸着させ、０．１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ５）で溶出することにより精製した。

【００３６】（ｈ）モノクローナル抗体のクラス、サブ
クラスの決定 前述したＥＬＩＳＡに従い、各ポリペプチドＡ、ポリペ
プチドＢまたはポリペプチドＣをコートしたマイクロタ
イトレーションプレートに、（ｆ）で得られたモノクロ
ーンの上清を加えた。次にＰＢＳで洗浄後、アイソタイ
プ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａ
ｂ．）を加えた。ＰＢＳにより洗浄後、西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加
え、基質として過酸化水素および２，２′−アジノージ
（３−エチルベンゾチアゾリン酸）を用いてクラス、サ
ブクラスを決定した。

【００３７】（ｉ）抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体
の特異性 ヒト新生児線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）の培養上清中か
らそれぞれ精製した潜在型ＭＭＰ−１（クリニカ キミ
カ アクタ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、第２１
９巻、１〜１４頁（１９９３））、潜在型ＭＭＰ−２
（クリニカ キミカ アクタ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａ
ｃｔａ）、第２２１巻、９１〜１０３頁（１９９３））
および潜在型ＭＭＰ−３（クリニカ キミカ アクタ
（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、第２１１巻、５９
〜７２頁（１９９２））、ヒト直腸癌細胞（Ｃａｒ−
１）の培養上清から精製した潜在型ＭＭＰ−７（キャン
サー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第５０
巻、７７５８〜７７６４頁、（１９９０））、ヒト好中
球より精製した潜在型ＭＭＰ−８（バイオロジカル ケ
ミストリー ホップ セイラー（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ）、第３７１巻、サプルメン
ト、２９５〜３０４頁、（１９９０））並びにヒト線維
芽細胞腫株（ＨＴ１０８０）の培養上清から精製した潜
在型ＭＭＰ−９（ザジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、第２６７
巻、２１７１２〜２１７１９頁、（１９９２））をそれ
ぞれ抗原として使用し、前述の（ｅ）に記載したＥＬＩ
ＳＡによりヒトＭＴ−ＭＭＰペプチドと陽性反応を示す
５種類の抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（モノクロ
ーン番号１１３−５Ｂ７、１１３−１５Ｅ７、１１４−
１Ｆ１、１１４−２Ｆ２および１１８−３Ｂ１）の交差
反応性を調べた。

【００３８】すなわち、ポリスチレン製９６穴プレート
を使用し、各ウエルに精製した各ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−
２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ
−９をそれぞれ５０ｎｇ／ｗｅｌｌで加えコートした。
洗浄用ＰＢＳで洗浄し未吸着の抗原を除去した後、各ウ
エルの未コート部分を３％スキムミルク含有ＰＢＳでブ
ロックした。この各ウエルに各抗ＭＴ−ＭＭＰモノクロ
ーナル抗体それぞれを１μｇ／Ｗｅｌｌで加え、室温で
約１時間静置した。プレートを洗浄後、２次抗体として
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンを加
えさらに室温で約１時間反応させた。次に基質である過
酸化水素とｏ−フェニレンジアミンを加え、発色の程度
をマイクロプレート用吸光度測定機（ＭＲＰ−Ａ４、東
ソー）を用いて４９２ｎｍの吸光度で測定した。その結
果、表３に示したように、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナ
ル抗体は何れも、供試したＭＴ−ＭＭＰ以外の精製ＭＭ
Ｐｓと反応性を示さなかった。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】実施例４ 遺伝子産物の発現と同定 実施例１（ｆ）で構築したＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をクロー
ン化した組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからＥｃｏＲ
Ｉ切断により挿入断片を切出し、真核細胞用発現ベクタ
ーｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ Ｉサ
イトにクローニングした。該組換えｐＳＧ５をヒト線維
芽細胞腫株ＨＴ１０８０にリン酸カルシウム法によりト
ランスフェクションした。すなわち、蒸留水に２０μｇ
の組換えｐＳＧ５、６２μｌの２Ｍ ＣａＣｌ_２を加
え、次に２×ＨＢＳＰ溶液（１．５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ
_４、１０ｍＭ ＫＣｌ、２８０ｍＭ ＮａＣｌおよび１
２ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ含有５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝
液、ｐＨ７．１）をチューブの底に加え全量が１ｍｌに
なるようにした。これを混合後、室温で３０分程度放置
し、沈殿形成を十分行った。沈殿をピペッティングによ
り分散し、ＨＴ１０８０細胞に滴下した後、ＣＯ_２イン
キュベーター中で約４時間インキュベートした。次に培
地を除き、１５％グリセリン溶液を加え１〜３時間処理
した後、グリセリンを吸引除去、ＰＢＳで洗浄後、^３５
Ｓ−メチオニンを含む新鮮な培地を加えた。培養を継続
し、細胞タンパク質を^３５Ｓで標識した。因みに、ＨＴ
１０８０細胞におけるＭＴ−ＭＭＰ遺伝子の発現はノー
ザンブロット分析では検出できない。

【００４３】細胞を溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００、１％ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉ
ｎ、１ｍＭｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ、０．２Ｕ ｔ
ｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｍＭ ＰＭＳＦ
および０．１４ＭＮａＣｌ含有０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８）中で４℃、１時間インキュベー
トした。細胞溶解液を遠心分離し、上清を回収した。上
清に実施例３で得られたモノクローナル抗体をカップリ
ングさせたセファロースー４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を加え、４℃で２時間撹拌しながらインキュベートし、
免疫沈降を行った。免疫沈降には実施例３で得られたポ
リペプチドＡに対する１２個のモノクローナル抗体のう
ち非特異的反応性の低いモノクローン番号 １１４−１
Ｆ２および１１４−２Ｆ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−
４７４３）の２種類をそれぞれ使用した。次に、遠心分
離により免疫沈降させたモノクローナル抗体をカップリ
ングしたセファロースー４Ｂを沈殿させ、洗浄液（１％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ ｂｏｖｉｎｅ ｈｅ
ｍｏｇｌｏｂｉｎおよび０．１４Ｍ ＮａＣｌ含有０．
０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）で３回洗浄し、最
後に０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．８
で洗浄した。この洗浄したモノクローナル抗体をカップ
リングしたセファロース−４ＢにＳＤＳポリアクリルア
ミド電気泳動用サンプル緩衝液を加え、１００℃で５分
間加熱した後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行
った。泳動後のゲルをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ Ｘ
Ｒ）と重ね−７０℃で１週間オートラジオグラフィーを
行った後、現像したＸ線フィルムをデンシトメーターで
トレースしシグナルの強度を測定した。使用した抗ＭＴ
−ＭＭＰモノクローナル抗体モノクローン番号１１４−
１Ｆ２および１１４−２Ｆ２はいずれも、６３ｋＤａの
タンパク質を免疫沈降した。対照としたＭＴ−ＭＭＰ遺
伝子を含まないベクターｐＳＧ５のみをトランスフェク
ションした細胞では、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗
体モノクローン番号１１４−１Ｆ２および１１４−２Ｆ
２で６３ｋＤａタンパク質は免疫沈降されなかった。免
疫沈降で検出されたタンパク質の分子量６３ｋＤａは、
配列表配列番号１に記載したアミノ酸配列から算出され
る分子量６５．７８ｋＤａとほぼ一致した。さらに、配
列表配列番号１に記載したアミノ酸配列のアミノ酸１３
位から１０１位までを欠失した変異体ＭＴ−ＭＭＰ発現
プラスミドを作成し、前述と同様ＨＴ１０８０細胞にト
ランスフェクションし、免疫沈降を行った。変異体ＭＴ
−ＭＭＰ遺伝子を導入したＨＴ１０８０細胞では、６３
ｋＤａタンパク質は検出されず、５５ｋＤａタンパク質
を検出した。この分子量は、導入した欠失から予想され
る分子量と一致した。

【００４４】

【実験例】

（ａ）ＭＴ−ＭＭＰの発現による潜在型ＭＭＰ−２の活
性化 実施例４で構築したＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をクローン化し
た組換えｐＳＧ５あるいはコントロールとしてベクター
ｐＳＧ５単独を同じく実施例４に記載したリン酸カルシ
ウム法によりＨＴ１０８０細胞、あるいはマウス胎児由
来線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションし
た。ただし、^３５Ｓ−メチオニン含有新鮮培地の代わり
に、通常の新鮮培地を使用した。なお、ＨＴ１０８０細
胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞は、何れも潜在型ＭＭＰ−２
および潜在型ＭＭＰ−９を分泌してり（図６中の６６ｋ
Ｄａおよび９７．４ｋＤａのバンドにそれぞれ相当）、
また、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をトランスフェクションした
細胞では、ＭＴ−ＭＭＰが発現していることを免疫沈降
実験により確認した（実施例４参照）。

【００４５】得られたトランスフェクタントを無血清培
地中で２４時間培養し、回収した培養上清をザイモグラ
フィーに供試した。培養上清をＳＤＳポリアクリルアミ
ド電気泳動用緩衝液（非還元）と混和後４℃で一晩放置
した後、１ｍｇ／ｍｌのカゼイン含有１０％ポリアクリ
ルアミドゲルを用い、電流２０ｍＡ、４℃で電気泳動を
行った。泳動終了後、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００含有ゼラチナーゼ用緩衝液（５ｍＭ ＣａＣｌ
_２、１μＭ ＺｎＳＯ_４含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．６）で１５分間ゆっくり振盪させながら洗浄し、こ
の操作を２回繰り返した。次にゲルを１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００含有ゼラチナーゼ用緩衝液中に浸し、３７
℃で一晩放置した。緩衝液を廃棄し、ゲルを０．０２％
クマシーブリリアントブルーＲ（５０％メタノール−１
０％酢酸に溶解）で１時間染色後、脱色液（５％メタノ
ール−７．５％酢酸）に浸し脱色した。

【００４６】図６に示すように、ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子を
トランスフェクションしたＨＴ１０８０細胞では、新た
に６４ｋＤａと６２ｋＤａのバンドが生じ、潜在型ＭＭ
Ｐ−２の活性化が確認された。この活性型ＭＭＰ−２
は、細胞を１００μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡで処理
して誘導される活性型ＭＭＰ−２分子と同じ分子量を示
し、また抗ＭＭＰ−２モノクローナル抗体と特異的に反
応した。この活性化は、ベクター単独をトランスフェク
ションしたコントロールでは観察されなかった。一方、
潜在型ＭＭＰ−９は、コントロールの細胞と同様に分子
量の変化は認められず、活性化は認められなかった。こ
のＭＴ−ＭＭＰの発現に伴う潜在型ＭＭＰ−２の活性化
は、ＭＴ−ＭＭＰ遣伝子をトランスフェクションしたＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞でも観察された。

【００４７】（ｂ）ＭＴ−ＭＭＰ発現細胞膜画分による
潜在型ＭＭＰ−２の活性化 前項（ａ）の記載と同様にＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をクロー
ン化した組換えｐＳＧ５あるいはコントロールとしてベ
クターｐＳＧ５単独をリン酸カルシウム法によりアフリ
カミドリザル腎由来細胞ＣＯＳ−１にトランスフェクシ
ョンした。得られたトランスフェクタントからストロン
ジン（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ）らの方法（ザジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）、第２６８巻、１４０３３〜１４０３９頁
（１９９３））に従い、細胞膜画分を調製した。

【００４８】トランスフェクタントをＰＢＳで洗浄後、
遠心により細胞を集め８．５％Ｓｕｃｒｏｓｅ）５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍ
ｉｄｅ、１０μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１μｇ
／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１μｇ／ｍｌ ｌｅｕ
ｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕ
ｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ含有２５ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁した。細胞懸濁
液をＤｏｕｎｃｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒで破砕し、
破砕液を遠心分離（３０００×ｇ、１０分間、４℃）し
た。得られた上清をさらに超遠心分離（１００，０００
×ｇ、２時間）し、沈殿を５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ、１０μｇ／ｍｌ
ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔ
ｉｎ Ａ、１μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ
ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙＩｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕ
ｏｒｉｄｅ含有２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）に懸濁した。この懸濁液を段階的ショ糖密度
勾配遠心（２０、３０、５０、６０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ
溶液、１００，０００×ｇ、２時間、４℃）で分画し、
生じた細胞膜画分のバンドを回収した。この画分を再度
超遠心分離（１００，０００×ｇ、２時間）により沈殿
させた後、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．２５％ Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００含有２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ
（ｐＨ７．５）に懸濁し、タンパク質終濃度１〜２ｍｇ
／ｍｌとなるように調整した。この懸濁液を超遠心分離
（１００，０００／ｇ、１．５時間、４℃）し不溶残渣
を除き得られた上清を細胞膜画分とした。

【００４９】ベクターｐＳＧ５単独またはＭＴ−ＭＭＰ
遺伝子をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞およ
び無処理のＣＯＳ−１細胞からそれぞれ調製した細胞膜
画分（タンパク質含量２０μｇ）をＨＴ１０８０細胞の
培養上清と３７℃で２時間インキュベートした。これら
試料を用いて前項（ａ）に記載したザイモグラフィーを
行った。その結果、ＭＴ−ＭＭＰ遣伝子をトランスフェ
クションしたＣＯＳ−１細胞由来の細胞膜画分を用いた
場合のみ、新たな６４ｋＤａと６２ｋＤａのバンドが出
現し、ＨＴ１０８０細胞の培養上清中に存在する潜在型
ＭＭＰ−２の活性化が観察された（図７参照）。この潜
在型ＭＭＰ−２の活性化は、組換えＴＩＭＰ−２の添加
により阻害された。この結果から、細胞膜上に発現した
ＭＴ−ＭＭＰによる潜在型ＭＭＰ−２の活性化が示され
た。

【００５０】（ｃ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＴ−Ｍ
ＭＰ発現による浸潤能の促進 細胞の浸潤能の測定は、ボイデン チャンバー（Ｂｏｙ
ｄｅｎ Ｃｈａｍｂｅｒ）法（キャンサー リサーチ
（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第４７巻、３２３９〜３
２４５頁（１９８７））を改変して行い、操作はバイオ
コート マトリゲル インベージョン チャンバー（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の操作方法に従っ
た。

【００５１】前述の（ａ）の記載と同様にＭＴ−ＭＭＰ
遺伝子をクローン化した組換えｐＳＧ５あるいはコント
ロールとしてベクターｐＳＧ５単独をリン酸カルシウム
法によりＨＴ１０８０細胞、あるいはＮＩＨ３Ｔ３細胞
にトランスフェクションした。これらの宿主細胞はいず
れも潜在型ＭＭＰ−２を分泌している。得られたトラン
スフェクタンとを０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地に懸
濁し、２×１０^５個の細胞をバイオコート マトリゲル
インベージョン チャンバー中の未コートフィルタ
ー（ポアサイズ８μｍ）あるいは予め膨潤させたマトリ
ゲルコートフィルター上に接種した。２４時間、３７℃
炭酸ガスインキュベーター中で培養した後、フィルター
を１０秒間メタノール中に浸し固定した。次にヘマトキ
シリンで３分間水洗後、エオジンで１０秒間染色し、フ
ィルター下面に浸潤した細胞数を光学顕微鏡下（４００
倍）で計測した。

【００５２】ＭＴ−ＭＭＰ遺伝子をトランスフェクショ
ンしたＨＴ１０８０細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞では、
いずれもコントロールのベクター単独をトランスフェク
ションした細胞に比べ、２倍以上の浸潤した細胞が観察
された（図８マトリゲル参照）。すなわち、ＭＴ−ＭＭ
Ｐの発現により細胞の浸潤能が上昇したことが示され
た。また、この測定系に１０μｇ／ｍｌの組換えＴＩＭ
Ｐ−２を添加すると明らかに細胞の浸潤能が抑制される
ことが認められた（図８ マトリゲル＋ｒＴＩＭＰ−２
参照）。

【００５３】

【配列表１】

【００５４】

【配列表２】

【００５５】

【配列表３】

【００５６】

【配列表４】

【００５７】

【配列表５】

【００５８】

【配列表６】

【００５９】

【配列表７】

【００６０】

【配列表８】

【００６１】

【配列表９】

【００６２】

【配列表１０】

【配列表１１】

【配列表１２】

【００６３】

【配列表１３】

【配列表１４】

【配列表１５】

【００６４】

【配列表１６】

【配列表１７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列のカイト・ドーリ
トル法による親水性、疎水性分布図である。

【図２Ａ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｂ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｃ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｄ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｅ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｆ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｇ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図２Ｈ】ＭＴ−ＭＭＰのアミノ酸配列と公知のＭＭＰ
ファミリー（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、Ｍ
ＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、Ｍ
ＭＰ−１１）のアミノ酸配列との配列上の相同性を比較
した図である。各図中の記号は、それぞれアミノ酸を表
し、ＡはＡｌａ、ＣはＣｙｓ、ＤはＡＳｐ、ＥはＧｌ
ｕ、ＦはＰｈｅ、ＧはＧｌｙ、ＨはＨｉｓ、ＩはＩｌ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＮはＡｓ
ｎ、ＰはＰｒｏ、ＱはＧｌｎ、ＲはＡｒｇ、ＳはＳｅ
ｒ、ＴはＴｈｒ、ＶはＶａｌ、ＷはＴｒｐ、ＹはＴｙｒ
に対応する。これらの２Ａ〜２Ｈの図は一体となって１
つの図を構成する。

【図３】ノーザンブロット分析による各種のヒト組織中
でのＭＴ−ＭＭＰ ｍＲＮＡの発現を相対的に示したも
のである。

【図４】ノーザンブロット分析によるヒト肺偏平上皮癌
２例の正常部および癌部におけるＭＴ−ＭＭＰ ｍＲＮ
Ａの発現を相対的に示したものである。

【図５】ＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＨＴ１０８０細胞
中で発現したＭＴ−ＭＭＰタンパク質を免疫沈降法によ
り検出した結果を示したものである。図はデンシトメー
タによるスキャンを示したものであり、黒塗り部分が抗
ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体で免疫沈降したＭＴ−
ＭＭＰの位置を示す。

【図６】ＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＨＴ１０８０細胞
およびＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＮＩＨ３Ｔ３細胞の
培養上清のザイモグラフィーにより、ＭＴ−ＭＭＰの発
現による潜在型ＭＭＰ−２の活性化を示したものであ
る。

【図７】ＭＴ−ＭＭＰ ｃＤＮＡ導入ＣＯＳ−１細胞の
細胞膜画分による潜在型ＭＭＰ−２の活性化をザイモグ
ラフィーにより示したものである。

【図８】ＭＴ−ＭＭＰの発現による細胞の浸潤能の促進
を一部改変したボイデン チャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ
Ｃｈａｍｂｅｒ）法により示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 Ａ 33/574 Ｚ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｐ (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１に示されているアミノ
   酸配列を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 配列表配列番号１に示されているアミノ
   酸配列を有するタンパク質をコードする配列表配列番号
   ２に示されている塩基配列を有するＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表配列番号２に示されている塩基配
   列を有するＤＮＡ配列を含有し、配列表配列番号１に示
   されているタンパク質を発現するプラスミド。
4. 【請求項４】 配列表配列番号２に示されている塩基配
   列を有するＤＮＡ配列を含有し、配列表配列番号１に示
   されているタンパク質を発現するプラスミドを有する宿
   主細胞。
5. 【請求項５】 配列表配列番号１に示されているアミノ
   酸配列を有するタンパク質を特異的に認識するモノクロ
   ーナル抗体。