JPH0731196B2 - 複雑抗原抗体反応系における細胞同定法及びこの方法に使用される細胞固相化装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は様々な抗原を有する細胞や多種類の抗体を含む
液体の中から抗原と抗体が結合して成る抗原抗体複雑体
を有する細胞を同定する細胞同定法及びこの方法に使用
する装置に関する。

（従来の技術） 従来より一般に用いられている免疫反応検出方式には下
記のものがある。

沈降法、重層法、毛細管法、試験管法、免疫拡散法
等の特定的手法と、定量沈降法、レーザネフェロメトリ
ー、定量的免疫拡散法（SRID、RSRID、免疫電気拡散
法、交叉免疫電気泳動法）等の定量的手法がある。

溶血、溶菌法 凝集法；細胞凝集法、抗グロブリン試験（クームス
試験）、受身赤血球凝集法（PHA,HA）免疫粘着法（IA）
等がある。

受身皮膚アナフェラキシー法（PCA） 標識抗体法；免疫蛍光法（FIA）、酵素免疫法（EI
A）放射性同位元素標識法（RIA）等がある。

（発明が解決しようとする課題） これらの各方法においては、用途により種々の改良が加
えられ、自動化、省略化が図られている。しかし一般的
な免疫反応においては特異性の高いモノクロナール抗体
ないし補体の存在しない場合あるいは補体が存在しても
補体活性機能が有効に使用しない場合が多い。このよう
な場合非特異反応その他の要因によるバックグラウンド
上昇が無視できない状態となり、目的とする特異反応の
同定が極めて困難となる。

例えば溶皿、溶菌法に基づく組織適合性因子（HLA）の
細胞毒性試験（LCT）では次の様な問題点がある。この
試験は、多種、多様な特異性と抗体価を有する経産婦由
来の抗血清を抗体として用い、この抗体と検体リンパ球
表面HLA抗原と反応させてリンパ球を同定するものであ
る。この場合、反応の結果生じた抗原抗体複合体の影響
で特異的にリンパ球細胞膜損傷機能が高まる補体と、破
壊されたリンパ球を染める色素とが用いられる。そして
細胞損傷頻度に比例する色素染色度数からリンパ球の特
異性の高さが評価される。しかし、１のリンパ球の表面
において抗原が分散した状態等のように抗原濃度が薄い
状態にあるときは、補体活性能が充分に作用しない。ま
た、1gG4サブクラス抗体反応では補体活性能を認められ
ない。このような場合リンパ球の特異性の把握はきわめ
て困難となる。更に、HLA抗原は140種以上発見されてい
るが予測される抗原の種類は大巾にこの数を上まわる見
込であるにもかかわらず、固定の手段が確立されていな
い。

本発明は補体を用いずに、かつ非特異反応を抑制してバ
ックグラウンドを低下させ、抗原抗体複合体を有する細
胞を同定することを目的とする。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明の同定法は、妖気の内壁の一部に免疫グロブリン
と特異的に結合する物質を固着し、この容器に、抗原と
抗体が結合して成る抗原抗体複合体をその表面に有する
細胞を含む第１の液体よりも高比重の第２の液体を収容
してこの第２の液体に前記物質が浸漬された状態とし、
次にこの第２の液体の上に前記第１の液体を収容し、前
記内壁のうち、前記一部が最も回転中心から遠い位置と
なる状態で前記容器を回転運動させ、前記細胞を前記物
質に結合させて固相化した後、洗浄して同化するもので
ある。

本発明の装置は、容器と、この容器の内壁の一部に固着
され免疫グロブリンと特異的に結合する物質と、抗原と
抗体が結合して成る抗原抗体複合体を表面に有する細胞
を含む第１の液体よりも高比重であって前記物質を浸漬
するように前記容器に収容された第２の液体と、前記内
壁のうの前記一部が最も回転中心から遠い位置となる状
態で前記容器を回転運動させる容器回転手段とを具備す
るものである。

（作用） 本発明の同定法において、第１の液体中のある細胞はそ
の表面に抗原抗体複合体を有している。この複合体は細
胞の表面に存在する抗原とこの抗原に対する免疫グロブ
リン（抗体）が結合して成るものである。このような抗
原抗体複合体を有する細胞が第１の液体中に浮遊してい
る。次に容器を回転させたときに前記抗原抗体複合体を
有する細胞は遠心力を受け、前記第２の液体の中に入り
容器の内壁に固着された物質に近づく。そしてその物質
は前記細胞に結合している抗原抗体複合体を形成する免
疫グロブリンFC部と結合する。こうして前記細胞は容器
の内壁に固相化される。

ここで第１の液体に前記免疫グロブリン（免疫グロブリ
ン（Ｉ））とは異なる免疫グロブリン（II）、及び、前
記細胞（細胞（Ｉ））とは異なる細胞（II）が含まれて
おり、これらは相互に結合しないものとする。この場合
であっても前記内壁に固相化されるのは細胞（Ｉ）のみ
とすることができる。それは次の理由による。まず、免
疫グロブリン（II）は細胞（Ｉ）よりもきわめて小さい
ため拡散速度が遅い。このため細胞（Ｉ）の方が速く前
記物質に到達する。従って免疫グロブリン（II）が前記
物質に到達する前に容器の回転を止めるならば両者は区
別することができるからである。これは残余の免疫グロ
ブリン（Ｉ）であっても同様である。一方、細胞（II）
は、容器が回転すると遠心力により細胞（Ｉ）と同様に
前記物質に近づく。しかし細胞（II）は前記物質と結合
する免疫グロブリンを持たないため、単に前記物質及び
その周辺の容器内壁に当接するだけであり、洗浄される
ならば前記物質から容易に分離されるからである。

本発明に装置において、第１の液体と第２の液体とを容
器に収容し、この容器を容器回転手段によって回転させ
る。このとき抗原抗体複合体をその表面に有する細胞は
容器に固着されている物質に固相化される。この固相化
に至るまでの説明は、上記方法についての説明で既にな
されているのでここでは省略する。

（実施例） 本発明の同定方法の一実施例をその方法に用いられる装
置と共に説明する。

第１図に本実施例装置の全体を示す。ドラム１は４本の
支持部材２を介して軸３に支持されている。軸３はその
両端を一対のアーム４に支持され回転自在とされてい
る。アーム４は、アーム支持台５により支持されてい
る。アーム支持台５は基台６に固定されている。アーム
支持台５は筐体であり、内部にモータが収容されてい
る。このモータの回転軸にギヤ７が取付けられている。
ドラム１の外周にはギヤ８が設けられており、このギヤ
８にギヤ７が噛み合っている。９はコントローラであ
る。コントローラ９は上記モータの回転速度を制御する
ものである。コントローラ９も基台６に取付けられてい
る。ドラム１の内壁には１個以上のホルダ10が隣接して
取付けられている。ホルダ10は第２図に示すようにウェ
ル11が多数個設けられたプレート12を着脱自在に保持す
るものである。第３図に示すように、各ウェル11にはそ
の底面内壁にプロティンA30が層状に固着されて固相さ
れている。

本実施例では、血漿液に含まれている所定のリンパ球を
固相化するものである。従って第３図に示すように上記
所定のリンパ球より高比重の液体13がプレート12のウェ
ル11に収容されている。検査を受ける血漿液14は液体13
の上に保持されてい。血漿液14には、血清成分15、血球
成分16、Ａ抗体17、Ｂ抗体18、Ａリンパ球19及びＢリン
パ球20が含まれている。ここで血清成分15と血球成分16
は免疫反応に直接関与しない血液成分である。Ａ抗体17
及びＡリンパ球19は免疫反応において非特異的であり、
Ｂ抗体18及びＢリンパ球20は免疫反応において特異的で
ある。すなわちＢリンパ球20はＢ抗体18の一部と抗原抗
体反応を生じ、Ｂ抗体18と結合する。この実施例では同
じリンパ球を含む血漿液を夫々各ウェル11に収容し、夫
々に異なる抗体を加え、抗原抗体反応が生じたリンパ球
を同化するものとする。１のプレート12には96個のウェ
ル11が設けられている。各プーレート12の各ウェル11が
第３図に示すように血漿液14より高比重の液体13と血漿
液14とを注入された状態とされている。この第３図に示
す状態から明らかなように操作者はウェル11にまず高比
重の液体13を注入し、次に血漿液14を注入する。このよ
うにしなければドラム１を回転させる前に血漿液14中の
抗体がウェル11に固相されたプロティンA30に捕捉され
るからである。操作者は１個以上のプレート12を第１図
に示すホルダ10に保持させコントローラ９を操作し、ド
ラム１を回転させる。コントローラ９は、ドラム１が第
１回転目から最終回転目に至るまでその回転速度を制御
してウェル11内の血漿液14と液体13との位置関係が維持
されるようにする。

ドラム１が回転中、ウェル11内は次のような現象が生じ
る。まずＡリンパ球19と、リンパ球20は液体13を通過し
てプロティンA30に到達する状態となる。ここでＡリン
パ球19はプロティンA30に単に接触しているだけである
が、Ｂリンパ球20はＢ抗体18が結合しておりこのＢ抗体
18のFC部がプロティンA30に結合している。一方、血清
成分15、血球成分16、Ａ抗体17、Ｂ抗体18（Ｂリンパ球
20と結合しなかった残余分）はＡリンパ球19及びＢリン
パ球20よりも拡散速度が遅いので、あるいは比重が小さ
いのでＡリンパ球19及びＢリンパ球20がプロティンA30
に到達した時点では未だ液体13の上層部に滞留した状態
となっている。

コントローラ９はドラム１を予めセットされた時間回転
させると、これを停止させる。操作者はプロティンA30
が固着されているウェル11から液体13及び血漿液14を除
去し、所定時間プレート12を静置する。このときウェル
11の底部周辺は第４図に示すようにＢリンパ球20がＢ抗
体18を介してプロティンA30に捕捉されており、またＡ
リンパ球19がウェル11の底部に接触している。次に操作
者はウェル11の底部を洗浄してＡリンパ球19を除去し、
Ｂリンパ球20を残すようにする。このようにしてＢリン
パ球20は固相化かされる。

本実施例によれば血漿液の中から確実に所定のリンパ球
を固相化することができ、またこの方法に使用した装置
によれば確実に所定のリンパ球を同定することができ
る。

本実施例では容器内壁の一部に固着された物質はプロテ
ィンＡであるが、これは免疫グロブリンと特異的に結合
するものであれば他の物質、例えばプロティンＧであっ
ても良い。

また本実施例では同化されるべき細胞はリンパ球である
が、これはABO型、MN型、Rh型のいずれかの抗原を有す
る赤血球、あるいは組織適合性因子HLA抗原を有する血
小板であっても良い。ただしこれらの細胞を固相化する
場合には予め血漿液の中からこれらの細胞よりも比重が
大きい細胞、例えばリンパ球等を取り除いておく必要が
ある。

本実施例装置ではウェル11は円柱状で底部が半球状であ
るが、ウェル11形状は第５図（ａ）〜（ｉ）に示される
ようにいかなる形状であっても良い。第５図中（ａ）は
円錐台状、（ｂ）はその上下が反転した形状、、（ｃ）
は半楕円体状、（ｄ）は球状、（ｅ）は円錐状、（ｆ）
は先端部が楕円体となっている円錐状、（ｇ）は円柱
状、（ｈ）は角柱状、（ｉ）は角錐状である。

また本実施例装置ではプレート12は四角形の板状である
が、この形状は円形の板状、多角形の板状であっても良
い。また、これらのプレートを層状に重ねた状態のもの
でも良い。

また本実施例装置ではドラム１は円筒状であったが、こ
れは第６図（ａ）に示すような多角形の筒状のものでも
良いし、同図（ｄ）に示されるように同軸的に複数個の
ドラムを重ねても良い。更に第６図（ｂ）、（ｃ）に示
すように軸３から支持部材40を突設し、その先端側にプ
レート12を保持させるようにしても良い。

本実施例装置ではプレート12を鉛直面に沿って円軌道が
描かれるように回転させたが、第７図（ａ）（ｂ）のよ
うにプレート12を回転させても良い。第７図（ａ）は鉛
直方向に設けられた軸50に対し水平方向にアーム60が取
り付けられ、このアーム60の先端にプレート12を支持す
る支持台70が回動自在となるように取付けられたもので
ある。この場合、軸50が回転すると支持台70は遠心力を
受けて徐々に傾き、回転速度が高まると一点鎖線で示す
如くもとの状態から鉛直平面に沿って90°傾いた状態に
近づくようになる。この例によれば軸50を最初から急激
に回転させなくとも、第３図に示した液体13と血漿14の
位置関係は常に維持される。第７図（ｂ）は同図（ａ）
に示した支持台70が水平面に対し傾斜した状態でアーム
60の先端に取付けられたものである。この場合も第７図
（ａ）の効果と略同様の効果が得られる。

［発明の効果］ 本発明によれば、補体を用いることなく、かつ非特異反
応を抑制しながら正確に細胞を同定することができる。
この場合、リンパ球単離、除蛋白、血清分離等の検体血
液の前処理を厳密に行う必要が無い。

本発明によればリンパ球の損傷がほとんど無いので、本
発明を血液細胞学、免疫学研究における検体前処理に応
用できる。

本発明において、第２の液体の組成及び比重を調整すれ
ば、本発明を血液成分の分離、濃縮、除去に応用するこ
とができる。

本発明によれば簡単な装置によって自動化することがで
きるので、コスト、時間、労力の削減を図ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法に使用される装置の全体構成図、第
２図は第１図に示したプレートの拡大図、第３図は第１
図及び第２図に示したプレートのウェルに収容された液
体の説明図、第４図は第３図に示したウェル内の現象の
説明図、第５図は第３図に示したウェルの形状の他の例
を示す図、第６図は第１図に示したドラムに代わる種々
の構成を示す図、第７図は第１図に示したプレート12を
保持して回転させる機構の他の例を示す図である。 １…ドラム、２…支持部材 ３…軸、４…アーム ５…アーム支持台、６…基台 7,8…ギア、９…コントローラ 11…ウェル、12…プレート 13…液体（第２の液体） 14…血漿液（第１の液体） 30…プロティンＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−252252（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−500962（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501233（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】容器の内壁の一部に免疫グロブリンと特異
   的に結合する物質を固着し、この容器に、抗原と抗体が
   結合して成る抗原抗体複合体をその表面に有する細胞を
   含む第１の液体よりも高比重の第２の液体を収容してこ
   の第２の液体に前記物質が浸漬された状態とし、次にこ
   の第２の液体の上に前記第１の液体を収容し、前記内壁
   のうち前記一部が最も回転中心から遠い位置となる状態
   で前記容器を回転運動させ、前記細胞を前記物質に結合
   させて固相化した後、洗浄して同定する複雑抗原抗体反
   応系における細胞同定法。
2. 【請求項２】容器と、この容器の内壁の一部に固着され
   免疫グロブリンと特異的に結合する物質と、抗原と抗体
   が結合して成る抗原抗体複合体を表面に有する細胞を含
   む第１の液体よりも高比重であって前記物質を浸漬する
   ように前記容器に収容された第２の液体と、前記内壁の
   うち前記一部が最も回転中心から遠い位置となる状態で
   前記容器を回転運動させる容器回転手段とを具備する複
   雑抗原抗体反応系における細胞同定法に使用される細胞
   固相化装置。