JPH07313166A - 昆虫毒素ＡａＩＴに関するコドン最適化ＤＮＡ配列 - Google Patents
昆虫毒素ＡａＩＴに関するコドン最適化ＤＮＡ配列Info
- Publication number
- JPH07313166A JPH07313166A JP6023391A JP2339194A JPH07313166A JP H07313166 A JPH07313166 A JP H07313166A JP 6023391 A JP6023391 A JP 6023391A JP 2339194 A JP2339194 A JP 2339194A JP H07313166 A JPH07313166 A JP H07313166A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aait
- virus
- codon
- sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 昆虫特異毒素であるアンドロクトヌス・オー
ストラリス昆虫毒素（ＡａＩＴ）を暗号化するコドン最
適化ＤＮＡ配列の構成体。 【効果】 コドン最適化配列が挿入された昆虫ウイルス
を摂取する感受性昆虫はＡａＩＴ遺伝子が欠けている野
生型の昆虫ウイルスより早い時期に毒素−誘発性麻痺の
ために植物上で食べることを止めるので、昆虫被害から
植物を保護するのに有用である。
ストラリス昆虫毒素（ＡａＩＴ）を暗号化するコドン最
適化ＤＮＡ配列の構成体。 【効果】 コドン最適化配列が挿入された昆虫ウイルス
を摂取する感受性昆虫はＡａＩＴ遺伝子が欠けている野
生型の昆虫ウイルスより早い時期に毒素−誘発性麻痺の
ために植物上で食べることを止めるので、昆虫被害から
植物を保護するのに有用である。
Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は、昆虫−特異毒素ＡａＩＴを暗
号化する（eneording）コドン最適化ＤＮＡ配列、該毒
素の発現、および該毒素を暗号化する昆虫ウイルスの生
体内毒性の証明に関するものである。
号化する（eneording）コドン最適化ＤＮＡ配列、該毒
素の発現、および該毒素を暗号化する昆虫ウイルスの生
体内毒性の証明に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】下記の略語を本明細書中で使用する：Ａ .ｃａｌ. − オートグラファ・カリフォルニカ(Aut
ographa californica) ＡｃＭＮＰＶ − オートグラファ・カリフォルニカ核
多角体病(nuclear polyhedrosis)ウイルス ＡａＩＴ − アンドロクトヌス・オーストラリス(And
roctonus australis)昆虫毒素 ｂｐ − 塩基対 ＣＰＵ − 収縮性麻痺単位 ＥＣＶ − 細胞外ウイルス ＧＶ − グラニュローシス(granulosis)ウイルス ｋＤ − キロダルトン ＬＴ − 致死時間 ＭＯＩ − 感染多重度 ＮＰＶ − 核多角体病ウイルス ＯＢ − 吸蔵体 Ｏｃｃ− − 吸蔵陰性ウイルス（類） Ｏｃｃ＋ − 吸蔵陽性ウイルス（類） ＰＣＲ − ポリメラーゼ鎖反応 ＰＤＶ − 多面体誘導ウイルス ＰＦＵ − プラーク形成単位 ｐ.ｉ. − 感染後 ＰＩＢ − 多面封入体（polyhedron inclusion bod
y）（ＯＢとしても知られている） ＳＴ − 生存時間 バキュロヴィリデ(Baculoviridae)として知られている
科のＤＮＡ昆虫ウイルスには、核多角体病ウイルス（Ｎ
ＰＶ）およびグラニュローシスウイルス（ＧＶ）が包含
される。これらのウイルスはそれらの寿命サイクルにお
いて吸蔵体（ＯＢ）を製造する。また、それらの寿命サ
イクルにおいてＯＢを製造しない非吸蔵ウイルス（ＮＯ
Ｖ）も包含される。他の科のＤＮＡ昆虫ウイルスは、エ
ントモポックスウイルスである。
ographa californica) ＡｃＭＮＰＶ − オートグラファ・カリフォルニカ核
多角体病(nuclear polyhedrosis)ウイルス ＡａＩＴ − アンドロクトヌス・オーストラリス(And
roctonus australis)昆虫毒素 ｂｐ − 塩基対 ＣＰＵ − 収縮性麻痺単位 ＥＣＶ − 細胞外ウイルス ＧＶ − グラニュローシス(granulosis)ウイルス ｋＤ − キロダルトン ＬＴ − 致死時間 ＭＯＩ − 感染多重度 ＮＰＶ − 核多角体病ウイルス ＯＢ − 吸蔵体 Ｏｃｃ− − 吸蔵陰性ウイルス（類） Ｏｃｃ＋ − 吸蔵陽性ウイルス（類） ＰＣＲ − ポリメラーゼ鎖反応 ＰＤＶ − 多面体誘導ウイルス ＰＦＵ − プラーク形成単位 ｐ.ｉ. − 感染後 ＰＩＢ − 多面封入体（polyhedron inclusion bod
y）（ＯＢとしても知られている） ＳＴ − 生存時間 バキュロヴィリデ(Baculoviridae)として知られている
科のＤＮＡ昆虫ウイルスには、核多角体病ウイルス（Ｎ
ＰＶ）およびグラニュローシスウイルス（ＧＶ）が包含
される。これらのウイルスはそれらの寿命サイクルにお
いて吸蔵体（ＯＢ）を製造する。また、それらの寿命サ
イクルにおいてＯＢを製造しない非吸蔵ウイルス（ＮＯ
Ｖ）も包含される。他の科のＤＮＡ昆虫ウイルスは、エ
ントモポックスウイルスである。
【０００３】他の４００種のバキュロウイルスが無脊椎
動物中に存在していることが同定されている。ＮＰＶに
は、リマントリア・ジスパル(Lymantria dispar)ＮＰＶ
（ジプシー・モスＮＰＶ）、オートグラファ・カリフォ
ルニカ(Autographa californica)ＭＮＰＶ、シングラフ
ァ・ファルシフェラ(Syngrapha falcifera)ＮＰＶ（セ
ロリ・ルーパーＮＰＶ）、スポドプテラ・リッツラリス
(Spodoptera litturalis)ＮＰＶ、スポドプテラ・フル
ギペルダ(Spodoptera frugiperda)ＮＰＶ、ヘリオシス
・アルミゲラ(Heliothis armigera)ＮＰＶ、マメストラ
・ブラシケ(Mamestra brassicae)ＮＰＶ、コリストネウ
ラ・フミフェラナ(Choristoneura fumiferana)ＮＰＶ、
トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)ＮＰＶおよびヘ
リコヴェルパ・ゼア(Helicoverpa zea)ＮＰＶなどが包
含される。ＧＶの例には、シディア・ポモネラ(Cydia p
omonella)ＧＶ（コドリング・モスＧＶ）、ピエリス・
ブラシケ(Pieris brassicae)ＧＶ、トリコプルシア・ニ
ＧＶなどが包含される。ＮＯＶの例は、オルシテス・リ
ノセロス(Orcytes rhinoceros)ＮＯＶおよびヘリオシス
・ゼア(Heliothis zea)ＮＯＶである。エントモポック
スウイルスの例には、メロロンサ・メロノサ(Melolonth
a melnotha)ＥＰＶ、アンサクタ・ムーレイ(Amsacta mo
orei)ＥＰＶ、ロクスタ・ミグラトリア(Locusta migrat
oria)ＥＰＶ、メラノプルス・サングイニペス(Melanopl
us sanguinipes)ＥＰＶ、シストセルサ・グレガリア(Sc
histocerca gregaria)ＥＰＶ、エーデス・エジプチ(Aed
es aegypti)ＥＰＶおよびキロノムス・ルリジュス(Chir
onomus luridus)ＥＰＶなどが包含される。
動物中に存在していることが同定されている。ＮＰＶに
は、リマントリア・ジスパル(Lymantria dispar)ＮＰＶ
（ジプシー・モスＮＰＶ）、オートグラファ・カリフォ
ルニカ(Autographa californica)ＭＮＰＶ、シングラフ
ァ・ファルシフェラ(Syngrapha falcifera)ＮＰＶ（セ
ロリ・ルーパーＮＰＶ）、スポドプテラ・リッツラリス
(Spodoptera litturalis)ＮＰＶ、スポドプテラ・フル
ギペルダ(Spodoptera frugiperda)ＮＰＶ、ヘリオシス
・アルミゲラ(Heliothis armigera)ＮＰＶ、マメストラ
・ブラシケ(Mamestra brassicae)ＮＰＶ、コリストネウ
ラ・フミフェラナ(Choristoneura fumiferana)ＮＰＶ、
トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)ＮＰＶおよびヘ
リコヴェルパ・ゼア(Helicoverpa zea)ＮＰＶなどが包
含される。ＧＶの例には、シディア・ポモネラ(Cydia p
omonella)ＧＶ（コドリング・モスＧＶ）、ピエリス・
ブラシケ(Pieris brassicae)ＧＶ、トリコプルシア・ニ
ＧＶなどが包含される。ＮＯＶの例は、オルシテス・リ
ノセロス(Orcytes rhinoceros)ＮＯＶおよびヘリオシス
・ゼア(Heliothis zea)ＮＯＶである。エントモポック
スウイルスの例には、メロロンサ・メロノサ(Melolonth
a melnotha)ＥＰＶ、アンサクタ・ムーレイ(Amsacta mo
orei)ＥＰＶ、ロクスタ・ミグラトリア(Locusta migrat
oria)ＥＰＶ、メラノプルス・サングイニペス(Melanopl
us sanguinipes)ＥＰＶ、シストセルサ・グレガリア(Sc
histocerca gregaria)ＥＰＶ、エーデス・エジプチ(Aed
es aegypti)ＥＰＶおよびキロノムス・ルリジュス(Chir
onomus luridus)ＥＰＶなどが包含される。
【０００４】バイオ殺昆虫剤(bioinsecticides)として
のバキュロウイルスおよびエントモポックスウイルスの
使用は非常に将来性がある。農業におけるそれらの広範
囲の用途に関する主な障害は、昆虫の初期感染と昆虫の
死亡の間の時間的な遅れである。この遅れは２、３日間
〜５、６週間の範囲である。この遅れの間に、昆虫は食
べ続けて、植物にさらに被害を与える。ウイルスゲノム
中に異種遺伝子を挿入して例えば毒素の如き昆虫調節ま
たは修飾物質を発現させることによりこの欠点を克服し
ようとする多くの研究が試みられている（文献目録番号
１、２、３）。ＡｃＭＮＰＶにより例示されるバキュロ
ウイルスの寿命サイクルは二段階を含む。寿命サイクル
の各段階は特異形態のウイルス、すなわち吸蔵されてい
ない細胞外ウイルス粒子および吸蔵されているウイルス
粒子（ＯＢ）により代表される（４、５）。細胞外およ
び吸蔵ウイルス形態は同一ゲノムを有するが、異なる生
物学的性質を示す。これらの二形態のウイルスのそれぞ
れの成熟はウイルス遺伝子のオーバーラップセットによ
り指定され、それらの一部はそれぞれの形態に関して非
反復性である。
のバキュロウイルスおよびエントモポックスウイルスの
使用は非常に将来性がある。農業におけるそれらの広範
囲の用途に関する主な障害は、昆虫の初期感染と昆虫の
死亡の間の時間的な遅れである。この遅れは２、３日間
〜５、６週間の範囲である。この遅れの間に、昆虫は食
べ続けて、植物にさらに被害を与える。ウイルスゲノム
中に異種遺伝子を挿入して例えば毒素の如き昆虫調節ま
たは修飾物質を発現させることによりこの欠点を克服し
ようとする多くの研究が試みられている（文献目録番号
１、２、３）。ＡｃＭＮＰＶにより例示されるバキュロ
ウイルスの寿命サイクルは二段階を含む。寿命サイクル
の各段階は特異形態のウイルス、すなわち吸蔵されてい
ない細胞外ウイルス粒子および吸蔵されているウイルス
粒子（ＯＢ）により代表される（４、５）。細胞外およ
び吸蔵ウイルス形態は同一ゲノムを有するが、異なる生
物学的性質を示す。これらの二形態のウイルスのそれぞ
れの成熟はウイルス遺伝子のオーバーラップセットによ
り指定され、それらの一部はそれぞれの形態に関して非
反復性である。
【０００５】それの自然に起きる昆虫感染形態では、多
重ウイルス粒子が吸蔵体（ＯＢ）として知られている準
結晶性蛋白質マトリックスの中に埋められていることが
見いだされており、該吸蔵体は多面封入体（ＰＩＢ）と
も称される。蛋白質様ウイルス吸蔵体は多面体（polyhe
dra、複数形）と称される（多面体(polyhedon)は単数語
である）。２９ｋＤの分子量を有するポリヘドリン蛋白
質は、ウイルス吸蔵体の主要なウイルス−暗号化された
構造蛋白質である（４、６）。（同様に、ＧＶはポリヘ
ドリンよりむしろ主としてグラヌリンからなるＯＢを製
造する）。
重ウイルス粒子が吸蔵体（ＯＢ）として知られている準
結晶性蛋白質マトリックスの中に埋められていることが
見いだされており、該吸蔵体は多面封入体（ＰＩＢ）と
も称される。蛋白質様ウイルス吸蔵体は多面体（polyhe
dra、複数形）と称される（多面体(polyhedon)は単数語
である）。２９ｋＤの分子量を有するポリヘドリン蛋白
質は、ウイルス吸蔵体の主要なウイルス−暗号化された
構造蛋白質である（４、６）。（同様に、ＧＶはポリヘ
ドリンよりむしろ主としてグラヌリンからなるＯＢを製
造する）。
【０００６】ウイルス吸蔵体は天然バキュロウイルス寿
命サイクルの重要部分であり、感受性昆虫種の中での水
平的（昆虫から昆虫）伝播手段を供するものである。該
環境中では、感受性昆虫（一般的には幼虫段階）は例え
ば植物の如き汚染食料源からウイルス吸蔵体を摂取す
る。結晶性吸蔵体が感受性昆虫の腸の中で解離して感染
性ウイルス粒子を放出する。これらの多面体誘導ウイル
ス（ＰＤＶ）は中腸組織の細胞中に侵入しそして複製す
る（４）。
命サイクルの重要部分であり、感受性昆虫種の中での水
平的（昆虫から昆虫）伝播手段を供するものである。該
環境中では、感受性昆虫（一般的には幼虫段階）は例え
ば植物の如き汚染食料源からウイルス吸蔵体を摂取す
る。結晶性吸蔵体が感受性昆虫の腸の中で解離して感染
性ウイルス粒子を放出する。これらの多面体誘導ウイル
ス（ＰＤＶ）は中腸組織の細胞中に侵入しそして複製す
る（４）。
【０００７】ウイルス粒子はエンドサイトーシスまたは
融合により細胞内に入り、そしてウイルスＤＮＡは核孔
のところまたは核中では被覆されていない。ウイルスＤ
ＮＡ複製は６時間以内に検出される。感染後（ｐ.ｉ.）
１０−１２時間までに、細胞の表面からの細胞外ウイル
ス（ＥＣＶ）の分芽により二次感染が他の昆虫組織に拡
散する。ウイルスのＥＣＶ形態は個々の感染された昆虫
内でのウイルスの細胞から細胞への拡散並びに細胞培養
中の伝播感染の原因となる。
融合により細胞内に入り、そしてウイルスＤＮＡは核孔
のところまたは核中では被覆されていない。ウイルスＤ
ＮＡ複製は６時間以内に検出される。感染後（ｐ.ｉ.）
１０−１２時間までに、細胞の表面からの細胞外ウイル
ス（ＥＣＶ）の分芽により二次感染が他の昆虫組織に拡
散する。ウイルスのＥＣＶ形態は個々の感染された昆虫
内でのウイルスの細胞から細胞への拡散並びに細胞培養
中の伝播感染の原因となる。
【０００８】感染サイクルの後半（感染後１２時間）
に、ポリヘドリン蛋白質を感染細胞から検出できる。ポ
リヘドリン蛋白質が感染細胞の核の中で組み立てられる
のは感染後１８−２４時間以後であり、そしてウイルス
粒子は蛋白質様吸蔵体の中に埋められる。ウイルス吸蔵
体は細胞が溶解するにつれて４−５日間で多数になる。
これらの多面体は幼虫内の感染拡散では活性な役割を有
していない。血リンパ中のＥＣＶは増加しそして拡散し
て、幼虫の死をもたらす（４、５、６）。
に、ポリヘドリン蛋白質を感染細胞から検出できる。ポ
リヘドリン蛋白質が感染細胞の核の中で組み立てられる
のは感染後１８−２４時間以後であり、そしてウイルス
粒子は蛋白質様吸蔵体の中に埋められる。ウイルス吸蔵
体は細胞が溶解するにつれて４−５日間で多数になる。
これらの多面体は幼虫内の感染拡散では活性な役割を有
していない。血リンパ中のＥＣＶは増加しそして拡散し
て、幼虫の死をもたらす（４、５、６）。
【０００９】感染した幼虫が死んだ時には、数百万の多
面体が衰退している組織の中に残存しているがＥＣＶは
分解されている。他の幼虫を例えば汚染された植物また
は他の食料物質の摂取により多面体に呈する時には、サ
イクルが繰り返される（４）。
面体が衰退している組織の中に残存しているがＥＣＶは
分解されている。他の幼虫を例えば汚染された植物また
は他の食料物質の摂取により多面体に呈する時には、サ
イクルが繰り返される（４）。
【００１０】まとめると、吸蔵された形態のウイルスは
腸による昆虫の初期感染並びにウイルスの環境安定性の
原因となる。ＰＤＶは注射により投与される時には本質
的に感染性ではないが、経口的投与では高感染性であ
る。非−吸蔵形態のウイルス（すなわちＥＣＶ）は二次
感染および細胞から細胞への感染の原因となる。ＥＣＶ
は培養中の細胞または注射による内部昆虫組織に対して
は高感染性であるが、経口的投与によると本質的に感染
性でない。
腸による昆虫の初期感染並びにウイルスの環境安定性の
原因となる。ＰＤＶは注射により投与される時には本質
的に感染性ではないが、経口的投与では高感染性であ
る。非−吸蔵形態のウイルス（すなわちＥＣＶ）は二次
感染および細胞から細胞への感染の原因となる。ＥＣＶ
は培養中の細胞または注射による内部昆虫組織に対して
は高感染性であるが、経口的投与によると本質的に感染
性でない。
【００１１】昆虫に対して毒性である異種蛋白質を発現
する組み換えバキュロウイルスの使用は、これらのウイ
ルスが脊椎動物や植物に対して病原性でないという事実
のために、促進される。さらに、バキュロウイルスは一
般的に狭い宿主範囲を有する。多くの菌株が１種または
２、３種の昆虫種に限定される。
する組み換えバキュロウイルスの使用は、これらのウイ
ルスが脊椎動物や植物に対して病原性でないという事実
のために、促進される。さらに、バキュロウイルスは一
般的に狭い宿主範囲を有する。多くの菌株が１種または
２、３種の昆虫種に限定される。
【００１２】オートグラファ・カリフォルニカ核多面分
解ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）は、バキュロヴィリデ科の
プロトタイプウイルスである。ＡｃＭＮＰＶウイルスは
最初は、一般的にはアルファルファ・ルーパーとして知
られている鱗翅目ノクチュード(lepidopteran noctuid)
（それの成長段階では夜行性蛾である）であるオートグ
ラファ・カリフォルニカ（Ａ.ｃａｌ.）から分離され
た。このウイルスは、鱗翅目(Lepidoptera)昆虫目の中
の１２種類の科およびに３０種類以上の種に感染する
（７）。この目以外の種には増殖感染することは知られ
ていない。最も広く研究されているバキュロウイルスは
ＡｃＭＮＰＶである。このウイルスは高級真核細胞中で
起きる多くの蛋白質成熟および移送システムを利用して
いる。
解ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）は、バキュロヴィリデ科の
プロトタイプウイルスである。ＡｃＭＮＰＶウイルスは
最初は、一般的にはアルファルファ・ルーパーとして知
られている鱗翅目ノクチュード(lepidopteran noctuid)
（それの成長段階では夜行性蛾である）であるオートグ
ラファ・カリフォルニカ（Ａ.ｃａｌ.）から分離され
た。このウイルスは、鱗翅目(Lepidoptera)昆虫目の中
の１２種類の科およびに３０種類以上の種に感染する
（７）。この目以外の種には増殖感染することは知られ
ていない。最も広く研究されているバキュロウイルスは
ＡｃＭＮＰＶである。このウイルスは高級真核細胞中で
起きる多くの蛋白質成熟および移送システムを利用して
いる。
【００１３】本発明では、昆虫特異毒素を暗号化する遺
伝子をウイルスゲノム中の適当な位置に挿入する。Ａｃ
ＭＮＰＶ中に挿入される異種遺伝子は感染昆虫細胞中で
生物学的に活性な蛋白質を製造する。これらの蛋白質
は、ほとんどの部分に関して、移植後処理を受けて、真
性蛋白質のものと同一でないとしても非常に似ている組
み換え生成物を分泌する。このようにして発現された毒
素はウイルスのバイオ殺昆虫剤効果を増加させる。
伝子をウイルスゲノム中の適当な位置に挿入する。Ａｃ
ＭＮＰＶ中に挿入される異種遺伝子は感染昆虫細胞中で
生物学的に活性な蛋白質を製造する。これらの蛋白質
は、ほとんどの部分に関して、移植後処理を受けて、真
性蛋白質のものと同一でないとしても非常に似ている組
み換え生成物を分泌する。このようにして発現された毒
素はウイルスのバイオ殺昆虫剤効果を増加させる。
【００１４】そのような毒素の１種はＡａＩＴであり、
それは北アフリカサソリであるアンドロクトヌス・オー
ストラリス・ヘクターの毒により製造される。この毒素
は７０個のアミノ酸長さであり、そして昆虫内のナトリ
ウム経路と結合しそして昆虫幼虫中でナノグラムないし
マイクログラム範囲において収縮性麻痺を引き起こす。
ＡａＩＴは哺乳動物のナトリウム経路とは結合しないた
め、ＡａＩＴはバイオ殺昆虫剤としての使用の候補とな
り、人間により摂取される作物を保護する。
それは北アフリカサソリであるアンドロクトヌス・オー
ストラリス・ヘクターの毒により製造される。この毒素
は７０個のアミノ酸長さであり、そして昆虫内のナトリ
ウム経路と結合しそして昆虫幼虫中でナノグラムないし
マイクログラム範囲において収縮性麻痺を引き起こす。
ＡａＩＴは哺乳動物のナトリウム経路とは結合しないた
め、ＡａＩＴはバイオ殺昆虫剤としての使用の候補とな
り、人間により摂取される作物を保護する。
【００１５】ＡａＩＴ遺伝子の暗号化領域の上流領域
は、細胞からのＡａＩＴの分泌を指示するシグナル配列
を含んでいる。特に、該シグナル配列は細胞表面への分
泌経路中で毒素を指示し、該表面でそれが細胞から分泌
される。移送中に、酵素がシグナル配列を分割させて成
熟ＡａＩＴを残す。
は、細胞からのＡａＩＴの分泌を指示するシグナル配列
を含んでいる。特に、該シグナル配列は細胞表面への分
泌経路中で毒素を指示し、該表面でそれが細胞から分泌
される。移送中に、酵素がシグナル配列を分割させて成
熟ＡａＩＴを残す。
【００１６】感染宿主中で異種毒素を発現する遺伝子的
に処理された組み換え昆虫ウイルスに対する要望が引き
続いて存在している。これらの組み換えウイルスによる
感染は野生型ウイルスと比べた時に殺害速度を増加させ
る。
に処理された組み換え昆虫ウイルスに対する要望が引き
続いて存在している。これらの組み換えウイルスによる
感染は野生型ウイルスと比べた時に殺害速度を増加させ
る。
【００１７】
【発明の要旨】本発明は、昆虫特異毒素であるＡａＩＴ
を暗号化するコドン最適化ＤＮＡ配列の構成体(constru
ction)を提供するものである。コドン最適化配列を次に
例えばバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶの如き昆虫ウイル
ス中に挿入する。
を暗号化するコドン最適化ＤＮＡ配列の構成体(constru
ction)を提供するものである。コドン最適化配列を次に
例えばバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶの如き昆虫ウイル
ス中に挿入する。
【００１８】バキュロウイルスは特異的な感受性昆虫目
標種に感染して、昆虫の幼虫段階で昆虫を事実上死亡さ
せる。サソリにより製造される毒素であるＡａＩＴも感
受性昆虫目標種に関して特異的であり（しかし脊椎動物
ではそうでない）、そして昆虫の麻痺を引き起こして最
終的には死亡させる。
標種に感染して、昆虫の幼虫段階で昆虫を事実上死亡さ
せる。サソリにより製造される毒素であるＡａＩＴも感
受性昆虫目標種に関して特異的であり（しかし脊椎動物
ではそうでない）、そして昆虫の麻痺を引き起こして最
終的には死亡させる。
【００１９】ＡａＩＴを暗号化する遺伝子のバキュロウ
イルス中への挿入が、毒素の発現をもたらす。そのよう
な修飾されたバキュロウイルスを摂取する感受性昆虫
は、ＡａＩＴ遺伝子が欠けている野生型バキュロウイル
スを摂取する昆虫より早い時期に毒素誘発性麻痺のため
に植物上で食べるのを止めるであろう。時間の短縮が大
きくなればなるほど、幼虫が食べる期間が短くなるた
め、作物被害が大きく減じられる。従って、本発明は植
物に（噴霧または他の投与手段により）ＡａＩＴを製造
するためのこのコドン最適化核酸配列を加える発現ベク
ターを投与することにより昆虫被害から植物を保護する
方法を提供する。
イルス中への挿入が、毒素の発現をもたらす。そのよう
な修飾されたバキュロウイルスを摂取する感受性昆虫
は、ＡａＩＴ遺伝子が欠けている野生型バキュロウイル
スを摂取する昆虫より早い時期に毒素誘発性麻痺のため
に植物上で食べるのを止めるであろう。時間の短縮が大
きくなればなるほど、幼虫が食べる期間が短くなるた
め、作物被害が大きく減じられる。従って、本発明は植
物に（噴霧または他の投与手段により）ＡａＩＴを製造
するためのこのコドン最適化核酸配列を加える発現ベク
ターを投与することにより昆虫被害から植物を保護する
方法を提供する。
【００２０】遺伝子暗号の縮重により、先天的ＤＮＡ配
列により暗号化されたポリペプチドと同一のアミノ酸配
列を有するポリペプチドを製造しながら、核ペプチド配
列を変動させることができる。
列により暗号化されたポリペプチドと同一のアミノ酸配
列を有するポリペプチドを製造しながら、核ペプチド配
列を変動させることができる。
【００２１】同種アミノ酸類に関する個々の同義コドン
の頻度は真核生物および原核生物の中でゲノム毎に広く
変動する。コドン選択パターンにおけるこれらの差はペ
プチド伸長速度を調節することによる個々の遺伝子の全
体的な発現水準によるようである。
の頻度は真核生物および原核生物の中でゲノム毎に広く
変動する。コドン選択パターンにおけるこれらの差はペ
プチド伸長速度を調節することによる個々の遺伝子の全
体的な発現水準によるようである。
【００２２】本発明は、バキュロウイルス発現システム
中で使用するためのＡａＩＴ遺伝子の設計を含んでい
る。この合成遺伝子に好適なコドン使用頻度を組み換え
蛋白質発現用に使用する細胞／有機体のゲノムから誘導
される遺伝子のコドン使用に反映させるということが最
初に試みられた。しかしながら、ＤＮＡ配列情報は少数
の遺伝子からしか入手できなかったため、信頼性のある
コドン使用表を作成するための鱗翅目遺伝子配列および
昆虫ウイルス遺伝子配列の両者の適当な代表は本発明の
時点では入手できなかった。
中で使用するためのＡａＩＴ遺伝子の設計を含んでい
る。この合成遺伝子に好適なコドン使用頻度を組み換え
蛋白質発現用に使用する細胞／有機体のゲノムから誘導
される遺伝子のコドン使用に反映させるということが最
初に試みられた。しかしながら、ＤＮＡ配列情報は少数
の遺伝子からしか入手できなかったため、信頼性のある
コドン使用表を作成するための鱗翅目遺伝子配列および
昆虫ウイルス遺伝子配列の両者の適当な代表は本発明の
時点では入手できなかった。
【００２３】従って、コドン使用表は充分な数（少なく
とも１０）の既知の遺伝子配列を有するドロソフィラ・
メラノガスター(Drosophila melanogaster)から得られ
ている。これらのコドン使用表を使用してＡａＩＴを暗
号化するコドン最適化遺伝子を設計する。この方法によ
り、制限酵素認識部位の保存または破壊（希望による）
も可能となる。ＡａＩＴのそれぞれのアミノ酸に関する
コドン使用頻度はドロソフィラ・メラノガスター・コド
ン使用表中の頻度を反映している。
とも１０）の既知の遺伝子配列を有するドロソフィラ・
メラノガスター(Drosophila melanogaster)から得られ
ている。これらのコドン使用表を使用してＡａＩＴを暗
号化するコドン最適化遺伝子を設計する。この方法によ
り、制限酵素認識部位の保存または破壊（希望による）
も可能となる。ＡａＩＴのそれぞれのアミノ酸に関する
コドン使用頻度はドロソフィラ・メラノガスター・コド
ン使用表中の頻度を反映している。
【００２４】本発明のＡａＩＴを暗号化するコドン最適
化遺伝子は配列同定番号：３に示されている２１０のヌ
クレオチドの配列を有する。この配列は２１０のヌクレ
オチドの中の５８で野生型（先天的）ＡａＩＴ遺伝子配
列（配列同定番号：１）のものと異なる（図１参照）。
化遺伝子は配列同定番号：３に示されている２１０のヌ
クレオチドの配列を有する。この配列は２１０のヌクレ
オチドの中の５８で野生型（先天的）ＡａＩＴ遺伝子配
列（配列同定番号：１）のものと異なる（図１参照）。
【００２５】
【発明の詳細な記述】本発明は、昆虫−特異毒素である
ＡａＩＴを暗号化するコドン最適化ＤＮＡ配列の構成体
を提供するものである。この分離された核酸配列を次
に、毒素を内部で製造しようとする宿主細胞または有機
体に適している発現ベクター中に挿入する。この毒素は
先天的ＡａＩＴと同じアミノ酸配列を有する。ＤＮＡ配
列は発現ベクター中に直接挿入することもでき、または
伝達ベクターを用いて挿入することもできる。
ＡａＩＴを暗号化するコドン最適化ＤＮＡ配列の構成体
を提供するものである。この分離された核酸配列を次
に、毒素を内部で製造しようとする宿主細胞または有機
体に適している発現ベクター中に挿入する。この毒素は
先天的ＡａＩＴと同じアミノ酸配列を有する。ＤＮＡ配
列は発現ベクター中に直接挿入することもでき、または
伝達ベクターを用いて挿入することもできる。
【００２６】昆虫ウイルス中へのＡａＩＴ暗号化遺伝子
の挿入は毒素の発現をもたらし、それはウイルスが幼虫
を無能力化および死亡させるのに必要な時間の短縮に寄
与する。そのような修飾された昆虫ウイルスを摂取する
感受性昆虫は、ＡａＩＴが欠けている野生型昆虫ウイル
スを摂取する昆虫より早い時期に、植物上で食べること
を止めるであろう。時間の短縮が大きくなればなるほ
ど、幼虫の食べる期間が短縮されるため、作物被害が大
きく減じられる。
の挿入は毒素の発現をもたらし、それはウイルスが幼虫
を無能力化および死亡させるのに必要な時間の短縮に寄
与する。そのような修飾された昆虫ウイルスを摂取する
感受性昆虫は、ＡａＩＴが欠けている野生型昆虫ウイル
スを摂取する昆虫より早い時期に、植物上で食べること
を止めるであろう。時間の短縮が大きくなればなるほ
ど、幼虫の食べる期間が短縮されるため、作物被害が大
きく減じられる。
【００２７】先天的ＤＮＡ配列により暗号化されるポリ
ペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
依然として製造しながら、遺伝子暗号の縮重によりヌク
レオチド配列の変動が可能になる。コドン最適化として
知られている工程は、そのような変更されたＤＮＡ配列
を設計する手段を含む工程である。
ペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
依然として製造しながら、遺伝子暗号の縮重によりヌク
レオチド配列の変動が可能になる。コドン最適化として
知られている工程は、そのような変更されたＤＮＡ配列
を設計する手段を含む工程である。
【００２８】コドン最適化遺伝子の設計に際しては、有
機体中でのコドン使用の頻度、最も近い隣接頻度、ＤＮ
Ａ安定性、二次構成体生成能力、合成方式および遺伝子
の意図するその後のＤＮＡ操作などを含む種々の因子を
考慮すべきである。
機体中でのコドン使用の頻度、最も近い隣接頻度、ＤＮ
Ａ安定性、二次構成体生成能力、合成方式および遺伝子
の意図するその後のＤＮＡ操作などを含む種々の因子を
考慮すべきである。
【００２９】遺伝子暗号の縮重により、同じアミノ酸配
列を多種の方法で暗号化しそして翻訳することができ
る。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンは６種
のコドンによりそれぞれ暗号化されるが、バリン、プロ
リン、スレオニン、アラニンおよびグリシンは４種のコ
ドンによりそれぞれ暗号化される。
列を多種の方法で暗号化しそして翻訳することができ
る。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンは６種
のコドンによりそれぞれ暗号化されるが、バリン、プロ
リン、スレオニン、アラニンおよびグリシンは４種のコ
ドンによりそれぞれ暗号化される。
【００３０】しかしながら、そのような同義コドンの使
用頻度は真核生物および原核生物の中ではゲノム毎に広
く変動する。例えば、哺乳動物の中では同義コドン−選
択パターンは非常に似ているが、例えば酵母（Ｓ.セレ
ヴィシエ(S. cereisiae)、バクテリア（例えば大腸菌
(E. coli)）および昆虫類（例えばＤ.メラノガスター
(D. meranogaster))の如き進化的に特徴のある有機体は
明らかに異なるゲノムコドン使用頻度を示す（８−１
３）。
用頻度は真核生物および原核生物の中ではゲノム毎に広
く変動する。例えば、哺乳動物の中では同義コドン−選
択パターンは非常に似ているが、例えば酵母（Ｓ.セレ
ヴィシエ(S. cereisiae)、バクテリア（例えば大腸菌
(E. coli)）および昆虫類（例えばＤ.メラノガスター
(D. meranogaster))の如き進化的に特徴のある有機体は
明らかに異なるゲノムコドン使用頻度を示す（８−１
３）。
【００３１】コドン選択パターンにおけるこれらの差
は、ペプチド伸長速度を調節することによる個々の遺伝
子の全体的な発現水準に寄与するようである。二系統の
実験証拠がこの議論を支持する。第一に、ポリペプチド
合成速度は翻訳しようとするコドンの性質並びに伝達Ｒ
ＮＡ（「ｔＲＮＡ」）三重複合体生成用の初期運動に依
存する（１３−１８）。第二に、細胞の伝達ＲＮＡ分布
はメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）プールの同種
コドン頻度に従う傾向がある（１８−２１）。
は、ペプチド伸長速度を調節することによる個々の遺伝
子の全体的な発現水準に寄与するようである。二系統の
実験証拠がこの議論を支持する。第一に、ポリペプチド
合成速度は翻訳しようとするコドンの性質並びに伝達Ｒ
ＮＡ（「ｔＲＮＡ」）三重複合体生成用の初期運動に依
存する（１３−１８）。第二に、細胞の伝達ＲＮＡ分布
はメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）プールの同種
コドン頻度に従う傾向がある（１８−２１）。
【００３２】これらの理由のために、コドン頻度が同種
細胞ｔＲＮＡ頻度を反映する昆虫ウイルス発現システム
を意図する遺伝子を設計することが望ましく且つ有用で
ある。これは特に、１個のｍＲＮＡ種が細胞翻訳能力の
半分にわたり使用されるようなポリヘドリンプロモータ
ーを用いるバキュロウイルス発現システムのような発現
システム用に望ましい。従って、組み換え蛋白質を高水
準で発現する時にはコドン頻度は真に同種細胞ｔＲＮＡ
頻度を反映するはずである。
細胞ｔＲＮＡ頻度を反映する昆虫ウイルス発現システム
を意図する遺伝子を設計することが望ましく且つ有用で
ある。これは特に、１個のｍＲＮＡ種が細胞翻訳能力の
半分にわたり使用されるようなポリヘドリンプロモータ
ーを用いるバキュロウイルス発現システムのような発現
システム用に望ましい。従って、組み換え蛋白質を高水
準で発現する時にはコドン頻度は真に同種細胞ｔＲＮＡ
頻度を反映するはずである。
【００３３】合成遺伝子用の好適なコドン使用頻度は組
み換え蛋白質発現用に使用する細胞／有機体のゲノムそ
のもの（またはできるだけ関連性のあるもの）から誘導
される遺伝子のコドン使用に反映するはずである。
み換え蛋白質発現用に使用する細胞／有機体のゲノムそ
のもの（またはできるだけ関連性のあるもの）から誘導
される遺伝子のコドン使用に反映するはずである。
【００３４】本発明では、初期実験用の信頼性のあるコ
ドン使用表を作成するための鱗翅目遺伝子配列および昆
虫ウイルス遺伝子配列の両者の適当な代表は利用できな
かった。
ドン使用表を作成するための鱗翅目遺伝子配列および昆
虫ウイルス遺伝子配列の両者の適当な代表は利用できな
かった。
【００３５】例えば、ＡａＩＴ遺伝子の設計用には、本
発明の時点では二種だけの特異化された蛋白質、すなわ
ちＡｃＭＮＰＶポリヘドリンおよびＡｃＭＮＰＶｐ１
０、からのＤＮＡ配列情報しかなかった（２２、２
３）。イケムラ(Ikemura)他は、信頼性のあるコドン選
択パターンには異なる機能を有する１０種以上の遺伝子
から得られるコドン頻度の集積が必要であると注意して
いる（１０、２４）。このコドン最適化配列はＡｃＭＮ
ＰＶにより感染されたものだけでなく種々の昆虫類にお
いて発現させる意図を有する。従って、まず重要なこと
はコドン最適化が種々の昆虫細胞中のｔＲＮＡプール分
布と相容性であることである。
発明の時点では二種だけの特異化された蛋白質、すなわ
ちＡｃＭＮＰＶポリヘドリンおよびＡｃＭＮＰＶｐ１
０、からのＤＮＡ配列情報しかなかった（２２、２
３）。イケムラ(Ikemura)他は、信頼性のあるコドン選
択パターンには異なる機能を有する１０種以上の遺伝子
から得られるコドン頻度の集積が必要であると注意して
いる（１０、２４）。このコドン最適化配列はＡｃＭＮ
ＰＶにより感染されたものだけでなく種々の昆虫類にお
いて発現させる意図を有する。従って、まず重要なこと
はコドン最適化が種々の昆虫細胞中のｔＲＮＡプール分
布と相容性であることである。
【００３６】この理由のために、充分な数の既知遺伝子
配列を有する昆虫種が選択される。ドロソフィラ・メラ
ノガスターは合計２０,４５１のコドンの中の４４の核
遺伝子から誘導されるコドン使用表を有する（１１）。
これらのコドン使用表を使用してシグナル配列および本
発明のＡａＩＴ毒素配列を暗号化するコドン最適化遺伝
子を設計する。
配列を有する昆虫種が選択される。ドロソフィラ・メラ
ノガスターは合計２０,４５１のコドンの中の４４の核
遺伝子から誘導されるコドン使用表を有する（１１）。
これらのコドン使用表を使用してシグナル配列および本
発明のＡａＩＴ毒素配列を暗号化するコドン最適化遺伝
子を設計する。
【００３７】全長シグナル配列用の遺伝子をコドン最適
化ＡａＩＴ毒素ペプチド配列と融合させる。以下で詳細
に論じられている如く、シグナル配列はＡａＩＴシグナ
ル配列であってもまたは異種シグナル配列を暗号化する
先天的なもしくはコドン最適化ヌクレオチド配列であっ
てもよい。
化ＡａＩＴ毒素ペプチド配列と融合させる。以下で詳細
に論じられている如く、シグナル配列はＡａＩＴシグナ
ル配列であってもまたは異種シグナル配列を暗号化する
先天的なもしくはコドン最適化ヌクレオチド配列であっ
てもよい。
【００３８】これらのアミノ酸配列は全ての可能なヌク
レオチド縮重（最大のあいまいさ）を示すＤＮＡ配列中
に逆翻訳される。（コドン縮重理由のために）確定的な
および可能性のある制限酵素認識部位のリストが作成さ
れる。遺伝子合成並びに追加的ＤＮＡ操作にとって重要
な制限酵素部位が選択されそして保存される。最適化遺
伝子の設計中にコドンに付与される重要な一利点は、制
限酵素部位を当技術の専門家に都合よく容易に保存また
は破壊することができて、遺伝子構成および操作を促進
させることである。
レオチド縮重（最大のあいまいさ）を示すＤＮＡ配列中
に逆翻訳される。（コドン縮重理由のために）確定的な
および可能性のある制限酵素認識部位のリストが作成さ
れる。遺伝子合成並びに追加的ＤＮＡ操作にとって重要
な制限酵素部位が選択されそして保存される。最適化遺
伝子の設計中にコドンに付与される重要な一利点は、制
限酵素部位を当技術の専門家に都合よく容易に保存また
は破壊することができて、遺伝子構成および操作を促進
させることである。
【００３９】ＡａＩＴおよびそれぞれのシグナル配列中
で生ずるそれぞれのアミノ酸を多数回記録するリストを
作成する。コドンは、ドロソフィラ・メラノガスター・
コドン使用の相対的頻度を反映する配列中に存在するア
ミノ酸残基の数を基にして、割り当てられる。（１１） 例えば、ドロソフィラ・メラノガスター中のシステイン
・コドン頻度は配列ＴＧＣに関しては７６％でありそし
て配列ＴＧＴに関しては２４％である。ＡＤＫシグナル
−ＡａＩＴ遺伝子構造中には８個のシステイン残基があ
る（全てが成熟ＡａＩＴ蛋白質を暗号化する遺伝子中に
ある（配列同定番号：３））。従って、６個のコドンは
ＴＧＴ（残基の７５％）としてそして２個のコドンはＴ
ＧＴ（残基の２５％）として割り当てられる。この分布
を基にして、次にそれぞれのシステイン・コドンが正確
な明白な配列を割り当てられる。隣接しているイソコド
ンの変更に関しては注意が払われる。例えば、ＡａＩＴ
ペプチド中の２個の隣接しているシステイン残基（アミ
ノ酸３７および３８）は、２個の同一コドン配列が続い
て割り当てられるのを避けるために、配列ＴＧＴ ＴＧ
Ｃと割り当てられる。
で生ずるそれぞれのアミノ酸を多数回記録するリストを
作成する。コドンは、ドロソフィラ・メラノガスター・
コドン使用の相対的頻度を反映する配列中に存在するア
ミノ酸残基の数を基にして、割り当てられる。（１１） 例えば、ドロソフィラ・メラノガスター中のシステイン
・コドン頻度は配列ＴＧＣに関しては７６％でありそし
て配列ＴＧＴに関しては２４％である。ＡＤＫシグナル
−ＡａＩＴ遺伝子構造中には８個のシステイン残基があ
る（全てが成熟ＡａＩＴ蛋白質を暗号化する遺伝子中に
ある（配列同定番号：３））。従って、６個のコドンは
ＴＧＴ（残基の７５％）としてそして２個のコドンはＴ
ＧＴ（残基の２５％）として割り当てられる。この分布
を基にして、次にそれぞれのシステイン・コドンが正確
な明白な配列を割り当てられる。隣接しているイソコド
ンの変更に関しては注意が払われる。例えば、ＡａＩＴ
ペプチド中の２個の隣接しているシステイン残基（アミ
ノ酸３７および３８）は、２個の同一コドン配列が続い
て割り当てられるのを避けるために、配列ＴＧＴ ＴＧ
Ｃと割り当てられる。
【００４０】この方法を全ての２０個のアミノ酸および
終止コドンに関して繰り返す（しかし、終止コドン配列
ＴＡＡはこの工程では変更されない）。さらに、全ての
重要な制限酵素部位は保存されそして望まれない部位は
破壊されない。
終止コドンに関して繰り返す（しかし、終止コドン配列
ＴＡＡはこの工程では変更されない）。さらに、全ての
重要な制限酵素部位は保存されそして望まれない部位は
破壊されない。
【００４１】本発明のコドン最適化核酸配列は一般的技
術を用いて合成および組み立てられる。下記の実施例２
は、その後に結合されて完全な暗号配列を形成する一連
の合成オリゴヌクレオチド断片を使用するそのような一
方法を記載する。
術を用いて合成および組み立てられる。下記の実施例２
は、その後に結合されて完全な暗号配列を形成する一連
の合成オリゴヌクレオチド断片を使用するそのような一
方法を記載する。
【００４２】本発明の完全なコドン最適化配列（配列同
定番号：３）は、２１０のヌクレオチドの中の５８で、
ＡａＩＴを暗号化する先天的ｃＤＮＡ配列（配列同定番
号：１）と異なっている。しかしながら、先天的ｃＤＮ
Ａおよびコドン最適化ｃＤＮＡにより製造されるＡａＩ
Ｔは同一のアミノ酸配列を有する。希望により、ＡａＩ
Ｔ用のシグナル配列も上記と同じ工程によりコドン最適
化することもできる。コドン最適化核酸配列を含有する
合成遺伝子が構成される時に、該遺伝子を例えば１種以
上の適当な制限酵素を用いる消化後のベクター中でのク
ローニングの如き一般的技術により適当な発現ベクター
中に挿入する。スミス(Smith)およびサマーズ(Summers)
の米国特許４,７４５,０５１（６）はバキュロウイルス
発現ベクターの構造を記載しており、それらは別の遺伝
子用の暗号配列がウイルス性ポリヘドリン遺伝子の代わ
りにバキュロウイルスプロモーターの後方に挿入されて
いる。ポリヘドリン遺伝子は細胞間の生産的なウイルス
感染に関して必須ではない。
定番号：３）は、２１０のヌクレオチドの中の５８で、
ＡａＩＴを暗号化する先天的ｃＤＮＡ配列（配列同定番
号：１）と異なっている。しかしながら、先天的ｃＤＮ
Ａおよびコドン最適化ｃＤＮＡにより製造されるＡａＩ
Ｔは同一のアミノ酸配列を有する。希望により、ＡａＩ
Ｔ用のシグナル配列も上記と同じ工程によりコドン最適
化することもできる。コドン最適化核酸配列を含有する
合成遺伝子が構成される時に、該遺伝子を例えば１種以
上の適当な制限酵素を用いる消化後のベクター中でのク
ローニングの如き一般的技術により適当な発現ベクター
中に挿入する。スミス(Smith)およびサマーズ(Summers)
の米国特許４,７４５,０５１（６）はバキュロウイルス
発現ベクターの構造を記載しており、それらは別の遺伝
子用の暗号配列がウイルス性ポリヘドリン遺伝子の代わ
りにバキュロウイルスプロモーターの後方に挿入されて
いる。ポリヘドリン遺伝子は細胞間の生産的なウイルス
感染に関して必須ではない。
【００４３】伝達ベクターは別の遺伝子をウイルスゲノ
ム中に伝達するための手段として使用される。伝達ベク
ターは一般的には、同種組み換えによるウイルスゲノム
中への別の遺伝子の挿入を促進させるのに充分なウイル
ス配列を含有しているバクテリア性プラスミドである。
ム中に伝達するための手段として使用される。伝達ベク
ターは一般的には、同種組み換えによるウイルスゲノム
中への別の遺伝子の挿入を促進させるのに充分なウイル
ス配列を含有しているバクテリア性プラスミドである。
【００４４】培養された細胞中での組み換えバキュロウ
イルスの構成方法はＭ.Ｄ.サマーズおよびＧ.Ｅ.スミス
のバキュロウイルスベクター方法および昆虫細胞培養工
程のためのマニュアル(A Manual of Methods for Bacul
ovirus Vectors and InsectCell Culture Procedure
s)、テキサス農業実験場会報番号１５５５（１９８７）
（２５）中に示されている。好適な細胞系はＳｆ９細胞
系（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＧＲＬ１７１１）であり、そ
れらはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodopterafrugipe
rda)２１（Ｓｆ２１）と指定された細胞系の誘導体であ
る。望ましい昆虫ウイルスの増殖用に適する他の昆虫細
胞系には、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)（Ｔ
Ｎ３６８）、シルクウォームであるボンビックス・モリ
(Bombyx mori)（ＢＭ）およびヘリヴェコヴェルパ・ゼ
ア(Helicoverpa zea)（ＢＣＩＲＬ−Ｈｚ−Ａｍｌ、Ｂ
ＣＩＲＬ−Ｈｚ−Ａｍ３）から誘導されるものが包含さ
れる。
イルスの構成方法はＭ.Ｄ.サマーズおよびＧ.Ｅ.スミス
のバキュロウイルスベクター方法および昆虫細胞培養工
程のためのマニュアル(A Manual of Methods for Bacul
ovirus Vectors and InsectCell Culture Procedure
s)、テキサス農業実験場会報番号１５５５（１９８７）
（２５）中に示されている。好適な細胞系はＳｆ９細胞
系（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＧＲＬ１７１１）であり、そ
れらはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodopterafrugipe
rda)２１（Ｓｆ２１）と指定された細胞系の誘導体であ
る。望ましい昆虫ウイルスの増殖用に適する他の昆虫細
胞系には、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)（Ｔ
Ｎ３６８）、シルクウォームであるボンビックス・モリ
(Bombyx mori)（ＢＭ）およびヘリヴェコヴェルパ・ゼ
ア(Helicoverpa zea)（ＢＣＩＲＬ−Ｈｚ−Ａｍｌ、Ｂ
ＣＩＲＬ−Ｈｚ−Ａｍ３）から誘導されるものが包含さ
れる。
【００４５】適当な昆虫ウイルスには、以上の本発明の
背景中で挙げられているものが包含される。好適な昆虫
ウイルスはバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶである。Ｅ２
と指定されているＡｃＭＮＰＶの特定菌株が実施例で使
用されている。当技術の専門家は他のバキュロウイルス
菌株も使用できることを認識するであろう。これらに
は、トリコプルシア・ニＭＮＰＶ、ラキプルシア・オウ
(Rachiplusia ou)ＭＮＰＶ、ガレリア・マロネラ(Galle
ria mallonell)ＭＮＰＶ、スポドプテラ・フルギペルダ
ＮＰＶ、並びにプラーク−精製菌株、例えばスミス,Ｇ.
Ｅ.およびサマーズ,Ｍ.Ｄ.、J. Virol.、３３、３１１
−３１９（１９８０）（２６）中で分離および同定され
ているプラーク−精製菌株、例えばＡｃＭＮＰＶのＭ
３、Ｒ９、Ｓ１およびＳ３菌株、並びにボンビックス・
モリＮＰＶが包含される。これもスミス,Ｇ.Ｅ.および
サマーズ,Ｍ.Ｄ.、J. Virol.、８９、５１７−５２７
（１９７８）（２７）を参照のこと。
背景中で挙げられているものが包含される。好適な昆虫
ウイルスはバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶである。Ｅ２
と指定されているＡｃＭＮＰＶの特定菌株が実施例で使
用されている。当技術の専門家は他のバキュロウイルス
菌株も使用できることを認識するであろう。これらに
は、トリコプルシア・ニＭＮＰＶ、ラキプルシア・オウ
(Rachiplusia ou)ＭＮＰＶ、ガレリア・マロネラ(Galle
ria mallonell)ＭＮＰＶ、スポドプテラ・フルギペルダ
ＮＰＶ、並びにプラーク−精製菌株、例えばスミス,Ｇ.
Ｅ.およびサマーズ,Ｍ.Ｄ.、J. Virol.、３３、３１１
−３１９（１９８０）（２６）中で分離および同定され
ているプラーク−精製菌株、例えばＡｃＭＮＰＶのＭ
３、Ｒ９、Ｓ１およびＳ３菌株、並びにボンビックス・
モリＮＰＶが包含される。これもスミス,Ｇ.Ｅ.および
サマーズ,Ｍ.Ｄ.、J. Virol.、８９、５１７−５２７
（１９７８）（２７）を参照のこと。
【００４６】上記の如く、昆虫ウイルスによるＡａＩＴ
の発現は幼虫を無能力にするのに必要な時間を短縮す
る。また、機能性毒素の成熟および分泌もシグナルペプ
チドにより促進される。
の発現は幼虫を無能力にするのに必要な時間を短縮す
る。また、機能性毒素の成熟および分泌もシグナルペプ
チドにより促進される。
【００４７】蛋白質の分泌をもたらす複雑な一連の翻訳
後処理段階のためには、シグナル配列が必要である。無
傷のシグナル配列が存在しているなら、発現するであろ
う蛋白質は粗面小胞体の内腔中に入りそして次にゴルギ
器官を通って分泌小胞に移送されそして最後に細胞外に
移送される。一般的には、シグナル配列は開始コドンに
すぐ続いており、そして分泌しようとする蛋白質のアミ
ノ末端においてシグナルペプチドを暗号化する。ほとん
どの場合、シグナル配列はシグナルペプチダーゼと称さ
れている特異プロテアーゼにより分割される。好適なシ
グナル配列はウイルス発現ベクターを使用する組み換え
蛋白質発現のプロセシングおよびエクスポート効率を改
良する。適当な異種シグナル配列を使用する毒素の最適
化発現により、野生型昆虫ウイルスより急速な死亡が得
られる。
後処理段階のためには、シグナル配列が必要である。無
傷のシグナル配列が存在しているなら、発現するであろ
う蛋白質は粗面小胞体の内腔中に入りそして次にゴルギ
器官を通って分泌小胞に移送されそして最後に細胞外に
移送される。一般的には、シグナル配列は開始コドンに
すぐ続いており、そして分泌しようとする蛋白質のアミ
ノ末端においてシグナルペプチドを暗号化する。ほとん
どの場合、シグナル配列はシグナルペプチダーゼと称さ
れている特異プロテアーゼにより分割される。好適なシ
グナル配列はウイルス発現ベクターを使用する組み換え
蛋白質発現のプロセシングおよびエクスポート効率を改
良する。適当な異種シグナル配列を使用する毒素の最適
化発現により、野生型昆虫ウイルスより急速な死亡が得
られる。
【００４８】サマーズの米国特許５,１５５,０３７（２
８）は、ＤＮＡベクターで形質転換されたかまたはトラ
ンスフェクションされた鱗翅目昆虫細胞中の例えば脂肪
運動ホルモンおよびクチクラの如き昆虫シグナル配列の
使用を記載しており、そこでは該シグナルが昆虫細胞か
らの異種蛋白質の分泌を指示している。開示されている
少数の別の蛋白質はＣＤ４、インターロイキン−２およ
びベータ−インターフェロンである。これらの蛋白質の
全ては哺乳動物の蛋白質であり、いずれも昆虫毒素では
ない。米国特許５,１５５,０３７以前は、昆虫細胞中で
別の蛋白質を分泌する唯一の方法は別の遺伝子の先天的
シグナルペプチドを使用する方法であった。別の遺伝子
は一般的には非−昆虫性であるため、それらのシグナル
は昆虫細胞では劣悪認識性であるかもしれず、発現の最
適でない水準をもたらす。シグナル配列は一般的には別
の遺伝子の翻訳開始部位にすぐ続く（５′〜３′）ＤＮ
Ａ配列により暗号化される。細胞から分泌される蛋白質
は疎水性Ｎ−末端信号ペプチドを含有している先駆分子
として合成される。
８）は、ＤＮＡベクターで形質転換されたかまたはトラ
ンスフェクションされた鱗翅目昆虫細胞中の例えば脂肪
運動ホルモンおよびクチクラの如き昆虫シグナル配列の
使用を記載しており、そこでは該シグナルが昆虫細胞か
らの異種蛋白質の分泌を指示している。開示されている
少数の別の蛋白質はＣＤ４、インターロイキン−２およ
びベータ−インターフェロンである。これらの蛋白質の
全ては哺乳動物の蛋白質であり、いずれも昆虫毒素では
ない。米国特許５,１５５,０３７以前は、昆虫細胞中で
別の蛋白質を分泌する唯一の方法は別の遺伝子の先天的
シグナルペプチドを使用する方法であった。別の遺伝子
は一般的には非−昆虫性であるため、それらのシグナル
は昆虫細胞では劣悪認識性であるかもしれず、発現の最
適でない水準をもたらす。シグナル配列は一般的には別
の遺伝子の翻訳開始部位にすぐ続く（５′〜３′）ＤＮ
Ａ配列により暗号化される。細胞から分泌される蛋白質
は疎水性Ｎ−末端信号ペプチドを含有している先駆分子
として合成される。
【００４９】分泌シグナル配列は三領域、すなわち塩基
性Ｎ−末端領域（ｎ−領域）、中央の疎水性領域（ｈ−
領域）、およびさらに極性のＣ−末端領域（ｃ−領
域）、を含有する（２９）。エクスポートが進行してい
る時の成熟蛋白質シグナルからのシグナル配列の分割は
ｎ−およびｈ−領域中の構造に依存しているようである
が、分割部位（ｃ−領域中）に関しては−３および−１
位置が最も重要であると示唆されている（２９）。−１
位置における残基は小さくなくてはならない（アラニ
ン、セリン、グリシン、システイン、スレオニンまたは
グルタミン）が、−３位置における残基は芳香族（フェ
ニルアラニン、ヒスチジン、チロシンもしくはトリプト
ファン）でなければならないか、荷電されていなければ
ならないか（アスパラギン、グルタミン酸、リシンもし
くはアルギニン）、または大きく且つ極性でなければな
らず（アスパラギンもしくはグルタミン）、ここでプロ
リンは領域−３〜＋１には存在しい。これらの要素のい
くつかの例外が許容される（２９）。
性Ｎ−末端領域（ｎ−領域）、中央の疎水性領域（ｈ−
領域）、およびさらに極性のＣ−末端領域（ｃ−領
域）、を含有する（２９）。エクスポートが進行してい
る時の成熟蛋白質シグナルからのシグナル配列の分割は
ｎ−およびｈ−領域中の構造に依存しているようである
が、分割部位（ｃ−領域中）に関しては−３および−１
位置が最も重要であると示唆されている（２９）。−１
位置における残基は小さくなくてはならない（アラニ
ン、セリン、グリシン、システイン、スレオニンまたは
グルタミン）が、−３位置における残基は芳香族（フェ
ニルアラニン、ヒスチジン、チロシンもしくはトリプト
ファン）でなければならないか、荷電されていなければ
ならないか（アスパラギン、グルタミン酸、リシンもし
くはアルギニン）、または大きく且つ極性でなければな
らず（アスパラギンもしくはグルタミン）、ここでプロ
リンは領域−３〜＋１には存在しい。これらの要素のい
くつかの例外が許容される（２９）。
【００５０】この−３、−１原則は哺乳動物システム中
の分割部位の７５−８０％の予測値であるが（２９）、
昆虫システムでは確認されていない。
の分割部位の７５−８０％の予測値であるが（２９）、
昆虫システムでは確認されていない。
【００５１】サマーズの米国特許５,１５５,０３７（２
８）は、鱗翅目（マンジュカ・セクスタ(Manduca sext
a)）脂肪運動ホルモンシグナルペプチドを暗号化する配
列を記載している。これは、昆虫におけるエネルギー基
質運動および代謝を調節する遮断された神経ペプチド用
の短いシグナルペプチド（１９個のアミノ酸）である。
該特許の図２Ｂはシグナルペプチドのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示している。
８）は、鱗翅目（マンジュカ・セクスタ(Manduca sext
a)）脂肪運動ホルモンシグナルペプチドを暗号化する配
列を記載している。これは、昆虫におけるエネルギー基
質運動および代謝を調節する遮断された神経ペプチド用
の短いシグナルペプチド（１９個のアミノ酸）である。
該特許の図２Ｂはシグナルペプチドのヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列を示している。
【００５２】該特許はまた、ドロソフィラ・メラノガス
ターのクチクラシグナルペプチドを暗号化する配列も記
載している。該特許の図２Ａは、クチクラ遺伝子ＣＰ１
リーダーペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を
示している。ヌクレオチド配列は１６個のアミノ酸シグ
ナルペプチドを暗号化する。
ターのクチクラシグナルペプチドを暗号化する配列も記
載している。該特許の図２Ａは、クチクラ遺伝子ＣＰ１
リーダーペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を
示している。ヌクレオチド配列は１６個のアミノ酸シグ
ナルペプチドを暗号化する。
【００５３】コドン最適化ＡａＩＴ遺伝子と共に使用さ
れる異種シグナル配列を同定する研究で、異種シグナル
配列を有する８種の構成体が出願人により製造された。
これらのシグナル配列を暗号化するＤＮＡ配列は、シグ
ナル配列を暗号化する先天的ＤＮＡ配列またはこれらの
シグナル配列を暗号化するコドン最適化ＤＮＡ配列のい
ずれであってもよい。
れる異種シグナル配列を同定する研究で、異種シグナル
配列を有する８種の構成体が出願人により製造された。
これらのシグナル配列を暗号化するＤＮＡ配列は、シグ
ナル配列を暗号化する先天的ＤＮＡ配列またはこれらの
シグナル配列を暗号化するコドン最適化ＤＮＡ配列のい
ずれであってもよい。
【００５４】これらのシグナル配列を次にブルースクリ
プト・プラスミド（ストラタジーン、ラジョラ、カリフ
ォルニア）中で前記のコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子と組
み合わせる。それぞれのそのような遺伝子をバキュロウ
イルス伝達ベクター中に挿入しそして培養細胞中での同
種ＤＮＡ組み換えによりＡｃＭＮＰＶゲノム中に移動さ
せる（２５）。異種シグナル配列は下記の如くである：
インターロイキン−２、エステラーゼ−６、脂肪運動ホ
ルモン、クチクラ、ｐＢＭＨＰＣ−１２、漿膜、アポリ
ポフォリン、および性特異種。
プト・プラスミド（ストラタジーン、ラジョラ、カリフ
ォルニア）中で前記のコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子と組
み合わせる。それぞれのそのような遺伝子をバキュロウ
イルス伝達ベクター中に挿入しそして培養細胞中での同
種ＤＮＡ組み換えによりＡｃＭＮＰＶゲノム中に移動さ
せる（２５）。異種シグナル配列は下記の如くである：
インターロイキン−２、エステラーゼ−６、脂肪運動ホ
ルモン、クチクラ、ｐＢＭＨＰＣ−１２、漿膜、アポリ
ポフォリン、および性特異種。
【００５５】インターロイキン−２はヒトシグナル配列
（Ｔ−細胞成長ファクター用）であり、ＡａＩＴと一緒
のそれの使用はすでに記載されている（３０）。脂肪運
動ホルモンシグナル配列（神経ペプチド用）はマンジュ
カ・セクスタからのものでありそして−３、−１原則
（２９）に良く合致する。ボンビックス・モリからの漿
膜シグナル配列（卵殻構造蛋白質用）およびドロスフィ
ラ・メラノガスターのクチクラシグナル配列（骨格外蛋
白質用）は両者とも大量のそれらの関連成熟蛋白質を分
泌する。マンジュカ・セクスタからのアポリポフォリン
シグナル配列（血漿脂質輸送蛋白質用）、ボンビックス
・モリの性特異シグナル配列（主要成体血漿貯蔵蛋白質
用）およびボンビックス・モリからのｐＢＭＨＰＣ−１
２シグナル配列（３０ｋＤ幼虫血漿リポ蛋白質用）は脂
肪体細胞中で見いだされ且つそれぞれが血リンパ蛋白質
を分泌するため、それらは全て選ばれる。最後に、エス
テラーゼ−６シグナル配列はドロスフィラ・メラノガス
ターからのセリンヒドロラーゼの分泌用に使用される。
アポリポフォリン以外のこれらのシグナル配列のそれぞ
れは分割部位を予測する−３、−１原則（２９）に従
う。
（Ｔ−細胞成長ファクター用）であり、ＡａＩＴと一緒
のそれの使用はすでに記載されている（３０）。脂肪運
動ホルモンシグナル配列（神経ペプチド用）はマンジュ
カ・セクスタからのものでありそして−３、−１原則
（２９）に良く合致する。ボンビックス・モリからの漿
膜シグナル配列（卵殻構造蛋白質用）およびドロスフィ
ラ・メラノガスターのクチクラシグナル配列（骨格外蛋
白質用）は両者とも大量のそれらの関連成熟蛋白質を分
泌する。マンジュカ・セクスタからのアポリポフォリン
シグナル配列（血漿脂質輸送蛋白質用）、ボンビックス
・モリの性特異シグナル配列（主要成体血漿貯蔵蛋白質
用）およびボンビックス・モリからのｐＢＭＨＰＣ−１
２シグナル配列（３０ｋＤ幼虫血漿リポ蛋白質用）は脂
肪体細胞中で見いだされ且つそれぞれが血リンパ蛋白質
を分泌するため、それらは全て選ばれる。最後に、エス
テラーゼ−６シグナル配列はドロスフィラ・メラノガス
ターからのセリンヒドロラーゼの分泌用に使用される。
アポリポフォリン以外のこれらのシグナル配列のそれぞ
れは分割部位を予測する−３、−１原則（２９）に従
う。
【００５６】それぞれのシグナル配列を暗号化するｃＤ
ＮＡはそれの先天的配列または上記の如くして製造され
たコドン最適化配列のいずれを有することもできる。個
々のコドン最適化シグナル配列は下記の実施例２に記さ
れている如くして構成される。
ＮＡはそれの先天的配列または上記の如くして製造され
たコドン最適化配列のいずれを有することもできる。個
々のコドン最適化シグナル配列は下記の実施例２に記さ
れている如くして構成される。
【００５７】コドン最適化シグナル配列は先天的配列と
下記の点で異なっている：ｐＢＭＨＰＣ−１２ − ４
８個のヌクレオチドの中の７個（配列同定番号：５（コ
ドン最適化）を配列同定番号：７（先天的）と比較する
こと）；脂肪運動ホルモン − ５７個のヌクレオチド
の中の６個（配列同定番号：９（コドン最適化）を配列
同定番号：１１（先天的）と比較すること）；アポリポ
フォリン −６９個のヌクレオチドの中の１４個（配列
同定番号：１３（コドン最適化）を配列同定番号：１５
（先天的）と比較すること）；漿膜 − ６３個のヌク
レオチドの中の１０個（配列同定番号：１７（コドン最
適化）を配列同定番号：１９（先天的）と比較するこ
と）、クチクラ − ４８個のヌクレオチドの中の６個
（配列同定番号：２１（コドン最適化）を配列同定番
号：２３（先天的）と比較すること）；エステラーゼ−
６ − ６３個のヌクレオチドの中の１５個（配列同定
番号：２５（コドン最適化）を配列同定番号：２７（先
天的）と比較すること）；性−特異種 − ４５個のヌ
クレオチドの中の１５個（配列同定番号：２９（コドン
最適化）を配列同定番号：３１（先天的）と比較するこ
と）。しかしながら、異なる核酸配列により暗号化され
るシグナル配列のアミノ酸類はコドン最適化および先天
的配列の両者に関して同一である。
下記の点で異なっている：ｐＢＭＨＰＣ−１２ − ４
８個のヌクレオチドの中の７個（配列同定番号：５（コ
ドン最適化）を配列同定番号：７（先天的）と比較する
こと）；脂肪運動ホルモン − ５７個のヌクレオチド
の中の６個（配列同定番号：９（コドン最適化）を配列
同定番号：１１（先天的）と比較すること）；アポリポ
フォリン −６９個のヌクレオチドの中の１４個（配列
同定番号：１３（コドン最適化）を配列同定番号：１５
（先天的）と比較すること）；漿膜 − ６３個のヌク
レオチドの中の１０個（配列同定番号：１７（コドン最
適化）を配列同定番号：１９（先天的）と比較するこ
と）、クチクラ − ４８個のヌクレオチドの中の６個
（配列同定番号：２１（コドン最適化）を配列同定番
号：２３（先天的）と比較すること）；エステラーゼ−
６ − ６３個のヌクレオチドの中の１５個（配列同定
番号：２５（コドン最適化）を配列同定番号：２７（先
天的）と比較すること）；性−特異種 − ４５個のヌ
クレオチドの中の１５個（配列同定番号：２９（コドン
最適化）を配列同定番号：３１（先天的）と比較するこ
と）。しかしながら、異なる核酸配列により暗号化され
るシグナル配列のアミノ酸類はコドン最適化および先天
的配列の両者に関して同一である。
【００５８】ＡａＩＴを暗号化するコドン最適化ＤＮＡ
配列と結合されそしてバキュロウイルス伝達ベクター中
に挿入される異種クチクラシグナル配列を暗号化するコ
ドン最適化ＤＮＡ配列の一例は、ｐＡＣ００５５.１と
表示される伝達ベクターである（下記の実施例１、２お
よび４を参照のこと）。この伝達ベクターｐＡＣ００５
５.１を固定する大腸菌(E. coli)菌株ＨＢの試料は出願
人により米国２０８５２、メリーランド、ロックヴィ
ル、パークレーン・ドライブ、１２３０１のアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに預託された。こ
の預託された物質を使用して、当技術の専門家は該プラ
スミド中に含まれているクチクラ配列を異なるシグナル
配列で置換することができる。
配列と結合されそしてバキュロウイルス伝達ベクター中
に挿入される異種クチクラシグナル配列を暗号化するコ
ドン最適化ＤＮＡ配列の一例は、ｐＡＣ００５５.１と
表示される伝達ベクターである（下記の実施例１、２お
よび４を参照のこと）。この伝達ベクターｐＡＣ００５
５.１を固定する大腸菌(E. coli)菌株ＨＢの試料は出願
人により米国２０８５２、メリーランド、ロックヴィ
ル、パークレーン・ドライブ、１２３０１のアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに預託された。こ
の預託された物質を使用して、当技術の専門家は該プラ
スミド中に含まれているクチクラ配列を異なるシグナル
配列で置換することができる。
【００５９】特に、第一段階は下記の特徴を有する合成
二重ストランドＤＮＡ断片を構成することである：
（ｉ）５′末端Ｂａｍ ＨＩ−相容性付着末端、（ii）
ＡＴＧ開始コドンを暗号化する配列および新しいシグナ
ルペプチドのアミノ酸配列、並びに（iii）コドン最適
化ＡａＩＴ遺伝子の頂部ストランド中の最初の１９のヌ
クレオチドおよび底部ストランド中の最初の２３のヌク
レオチドを包含する配列。そのような断片の３′末端は
Ｓａｌ Ｉ−相容性付着末端を含有する。この断片によ
る対応するｐＡＣ００５５.１のＢａｍ ＨＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片の置換は、ＤＮＡリガーゼの存在下で下記の三断
片を結合させることにより行われる：（１）上記のＢａ
ｍ ＨＩ／Ｓａｌ Ｉ合成断片、（２）コドン最適化Ａａ
ＩＴ毒素遺伝子中のコドン６−７におけるＳａｌ Ｉ部
位から３′フランキングポリヘドリン遺伝子配列に伸び
るＳａｌ Ｉ／Ｋｐｎ Ｉ断片、および（３）ｐＡＣ００
５５.１中に含まれる最大のＫｐｎ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ断
片。ｐＶＬ９８５（３１）から誘導されるこの断片はｐ
ＵＣ８クローニングベクター並びにポリヘドリン遺伝子
の５′および３′末端をフランキングするＡｃＭＮＰＶ
を含有する。当技術の専門家は、生ずる構成体がｐＡＣ
００５５.１とはシグナルペプチドの性質においてのみ
異なるということを認識するであろう。
二重ストランドＤＮＡ断片を構成することである：
（ｉ）５′末端Ｂａｍ ＨＩ−相容性付着末端、（ii）
ＡＴＧ開始コドンを暗号化する配列および新しいシグナ
ルペプチドのアミノ酸配列、並びに（iii）コドン最適
化ＡａＩＴ遺伝子の頂部ストランド中の最初の１９のヌ
クレオチドおよび底部ストランド中の最初の２３のヌク
レオチドを包含する配列。そのような断片の３′末端は
Ｓａｌ Ｉ−相容性付着末端を含有する。この断片によ
る対応するｐＡＣ００５５.１のＢａｍ ＨＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片の置換は、ＤＮＡリガーゼの存在下で下記の三断
片を結合させることにより行われる：（１）上記のＢａ
ｍ ＨＩ／Ｓａｌ Ｉ合成断片、（２）コドン最適化Ａａ
ＩＴ毒素遺伝子中のコドン６−７におけるＳａｌ Ｉ部
位から３′フランキングポリヘドリン遺伝子配列に伸び
るＳａｌ Ｉ／Ｋｐｎ Ｉ断片、および（３）ｐＡＣ００
５５.１中に含まれる最大のＫｐｎ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ断
片。ｐＶＬ９８５（３１）から誘導されるこの断片はｐ
ＵＣ８クローニングベクター並びにポリヘドリン遺伝子
の５′および３′末端をフランキングするＡｃＭＮＰＶ
を含有する。当技術の専門家は、生ずる構成体がｐＡＣ
００５５.１とはシグナルペプチドの性質においてのみ
異なるということを認識するであろう。
【００６０】コドン最適化遺伝子を含有する組み換えウ
イルスが製造された時に（上記の議論並びに下記の実施
例１、２、４および５を参照のこと）、それらを試験し
てコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子の存在を確認する。コド
ン最適化遺伝子はバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子
を置換するため、毒素遺伝子を有する組み換えウイルス
は多面体を製造できずそしてそのようにして吸蔵−陰性
プラークを製造できない。プラーク精製を用いてＡａＩ
Ｔ遺伝子を含有する組み換えウイルスをトランスフェク
ション上澄み液からサマーズおよびスミスの方法（２
５）の方法により分離する（実施例５参照）。
イルスが製造された時に（上記の議論並びに下記の実施
例１、２、４および５を参照のこと）、それらを試験し
てコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子の存在を確認する。コド
ン最適化遺伝子はバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子
を置換するため、毒素遺伝子を有する組み換えウイルス
は多面体を製造できずそしてそのようにして吸蔵−陰性
プラークを製造できない。プラーク精製を用いてＡａＩ
Ｔ遺伝子を含有する組み換えウイルスをトランスフェク
ション上澄み液からサマーズおよびスミスの方法（２
５）の方法により分離する（実施例５参照）。
【００６１】次に、ウイルス感染細胞をＡａＩＴ遺伝子
に特異的な放射標識付きＤＮＡプローブにハイブリッド
形成する核酸に関するドットブロット・ハイブリッド形
成法により検定する。放射活性は自動放射計により検出
され、陽性結果はウイルス分離体中のＡａＩＴ遺伝子の
存在を確認するものである（実施例６参照）。
に特異的な放射標識付きＤＮＡプローブにハイブリッド
形成する核酸に関するドットブロット・ハイブリッド形
成法により検定する。放射活性は自動放射計により検出
され、陽性結果はウイルス分離体中のＡａＩＴ遺伝子の
存在を確認するものである（実施例６参照）。
【００６２】下記の実施例１、２、４および５に記載さ
れているものと同様な方法を使用して、陰性ＡａＩＴ遺
伝子および先天的ＡａＩＴシグナル配列を暗号化する先
天的核酸配列を含有するバキュロウイルス伝達ベクター
を構成し、そして次にそれから組み換えウイルスを製造
する（下記の実施例３−５参照）。ポリメラーゼ鎖反応
を使用して組み換えウイルスがＡａＩＴ遺伝子を含有す
る正確な寸法の挿入体を含有するように変える（下記の
実施例７参照）。異種シグナル配列を有するコドン最適
化ＡａＩＴ遺伝子を含有する組み換えウイルスの生物学
的活性に関する検定では、先天的ＡａＩＴ遺伝子を含有
する組み換えウイルスを陽性対照として使用する。
れているものと同様な方法を使用して、陰性ＡａＩＴ遺
伝子および先天的ＡａＩＴシグナル配列を暗号化する先
天的核酸配列を含有するバキュロウイルス伝達ベクター
を構成し、そして次にそれから組み換えウイルスを製造
する（下記の実施例３−５参照）。ポリメラーゼ鎖反応
を使用して組み換えウイルスがＡａＩＴ遺伝子を含有す
る正確な寸法の挿入体を含有するように変える（下記の
実施例７参照）。異種シグナル配列を有するコドン最適
化ＡａＩＴ遺伝子を含有する組み換えウイルスの生物学
的活性に関する検定では、先天的ＡａＩＴ遺伝子を含有
する組み換えウイルスを陽性対照として使用する。
【００６３】コドン最適化ウイルスまたは先天的ＡａＩ
Ｔ−ウイルスのいずれかが感染している昆虫細胞中のＡ
ａＩＴ遺伝子の発現は、ウイルス−感染細胞から分離さ
れた合計細胞ＲＮＡのノザーン・ブロット分析により推
定される（下記の実施例８参照）。分析は、感染後２４
時間に高水準のＲＮＡを暗号化する毒素を示している
（実施例８参照）。
Ｔ−ウイルスのいずれかが感染している昆虫細胞中のＡ
ａＩＴ遺伝子の発現は、ウイルス−感染細胞から分離さ
れた合計細胞ＲＮＡのノザーン・ブロット分析により推
定される（下記の実施例８参照）。分析は、感染後２４
時間に高水準のＲＮＡを暗号化する毒素を示している
（実施例８参照）。
【００６４】上記の如く、バキュロウイルスは広範囲の
昆虫に感染するが、哺乳動物には無害である。試験され
た昆虫の全種類はＡａＩＴにより引き起こされる麻痺に
対して感受性であるが、哺乳動物は毒素により悪影響を
受けない。
昆虫に感染するが、哺乳動物には無害である。試験され
た昆虫の全種類はＡａＩＴにより引き起こされる麻痺に
対して感受性であるが、哺乳動物は毒素により悪影響を
受けない。
【００６５】野生型バキュロウイルス、先天的ＡａＩＴ
遺伝子を含有しているウイルス、およびコドン最適化Ａ
ａＩＴ遺伝子を含有するウイルス（これはまた異種シグ
ナル配列も含有しているかもしれない）の比較するため
の生物学的活性を昆虫幼虫を用いる二種の生体内試験、
すなわち注射検定および飼育検定、により検査する。予
備検定では、コドン最適化ＡａＩＴ−ウイルス株の製造
中に得られる培養媒体および細胞ペレット（緩衝溶液中
に再懸濁されている）をムスカ・ドメスチカ(Musca dom
estica)（一般的なイエハエ）幼虫に注射してこれらの
試料が検出可能量の生物学的に活性なＡａＩＴを含有し
ているかどうかを測定する。
遺伝子を含有しているウイルス、およびコドン最適化Ａ
ａＩＴ遺伝子を含有するウイルス（これはまた異種シグ
ナル配列も含有しているかもしれない）の比較するため
の生物学的活性を昆虫幼虫を用いる二種の生体内試験、
すなわち注射検定および飼育検定、により検査する。予
備検定では、コドン最適化ＡａＩＴ−ウイルス株の製造
中に得られる培養媒体および細胞ペレット（緩衝溶液中
に再懸濁されている）をムスカ・ドメスチカ(Musca dom
estica)（一般的なイエハエ）幼虫に注射してこれらの
試料が検出可能量の生物学的に活性なＡａＩＴを含有し
ているかどうかを測定する。
【００６６】幼虫を注射から５秒後に体節の不随意的収
縮の兆候に関して試験した。検定からの結果（下記の実
施例９中の表を参照のこと）は、生物学的に活性なＡａ
ＩＴが異種シグナル配列（エステラーゼ−６、脂肪運動
ホルモンおよびクチクラ）を有する１４のコドン最適化
ＡａＩＴ−ウイルス単離物の中の１３が感染培養媒体中
で検出されることを示している。ＩＬ２−ＡａＩＴ−ウ
イルス構成体では、毒素遺伝子暗号化領域中の断片移動
相互関係の存在のために陰性結果が予測される。細胞培
養上澄み液のいずれにも検出可能なＡａＩＴ活性が欠け
ていることは、生物学的に活性な分泌された毒素の水準
が約０.２μｇ／ｍｌより少ないことを示している。
縮の兆候に関して試験した。検定からの結果（下記の実
施例９中の表を参照のこと）は、生物学的に活性なＡａ
ＩＴが異種シグナル配列（エステラーゼ−６、脂肪運動
ホルモンおよびクチクラ）を有する１４のコドン最適化
ＡａＩＴ−ウイルス単離物の中の１３が感染培養媒体中
で検出されることを示している。ＩＬ２−ＡａＩＴ−ウ
イルス構成体では、毒素遺伝子暗号化領域中の断片移動
相互関係の存在のために陰性結果が予測される。細胞培
養上澄み液のいずれにも検出可能なＡａＩＴ活性が欠け
ていることは、生物学的に活性な分泌された毒素の水準
が約０.２μｇ／ｍｌより少ないことを示している。
【００６７】投与量−応答注射検定は、コドン最適化Ａ
ａＩＴ遺伝子の挿入が目標昆虫種を死滅させるのに必要
な時間を短縮することによりバキュロウイルスの性能を
強化させることを示している。下記の実施例１０および
図５中に示されている如く、コドン最適化クチクラ−Ａ
ａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成体から製造されたおよびＡａ
ＩＴ遺伝子なしでＡｃＭＮＰＶの野生型Ｅ２菌株から製
造された発芽ウイルスを第４齢中の幼虫の別群に幼虫当
たり１０2、１０3および１０4ＰＦＵの投与量で注射す
る。
ａＩＴ遺伝子の挿入が目標昆虫種を死滅させるのに必要
な時間を短縮することによりバキュロウイルスの性能を
強化させることを示している。下記の実施例１０および
図５中に示されている如く、コドン最適化クチクラ−Ａ
ａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成体から製造されたおよびＡａ
ＩＴ遺伝子なしでＡｃＭＮＰＶの野生型Ｅ２菌株から製
造された発芽ウイルスを第４齢中の幼虫の別群に幼虫当
たり１０2、１０3および１０4ＰＦＵの投与量で注射す
る。
【００６８】試験した投与量のそれぞれにおいて、クチ
クラ−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶは野生型ＡｃＭＮＰＶよ
り早くそれの宿主を死亡させる。１０4ＰＦＵでは、野
生型ウイルスに関するＬＴ50は約９７時間であるが、ク
チクラ−ＡａＩＴＡｃＭＮＰＶに関する対応するＬＴ50
は６７時間である。この結果は、ＡａＩＴ遺伝子および
クチクラシグナル配列のＡｃＭＮＰＶ中への挿入が生物
学的に活性な毒素の発現により死亡速度を促進させるこ
とを示している。
クラ−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶは野生型ＡｃＭＮＰＶよ
り早くそれの宿主を死亡させる。１０4ＰＦＵでは、野
生型ウイルスに関するＬＴ50は約９７時間であるが、ク
チクラ−ＡａＩＴＡｃＭＮＰＶに関する対応するＬＴ50
は６７時間である。この結果は、ＡａＩＴ遺伝子および
クチクラシグナル配列のＡｃＭＮＰＶ中への挿入が生物
学的に活性な毒素の発現により死亡速度を促進させるこ
とを示している。
【００６９】７種のコドン最適化異種シグナル−ＡａＩ
Ｔ−ＡｃＭＮＰＶ構成体、陰性ＡａＩＴシグナル−先天
的ＡａＩＴ遺伝子−ＡｃＭＮＰＶ構成体、およびＡａＩ
Ｔ遺伝子なしのＡｃＭＮＰＶの野生型Ｅ２菌株を用い
て、それより成長した幼虫（初期第５齢）を使用して注
射検定処方を繰り返した。１０4ＰＦＵの投与量をそれ
ぞれの構成体の発芽ウイルスを幼虫の別群に注射する。
Ｔ−ＡｃＭＮＰＶ構成体、陰性ＡａＩＴシグナル−先天
的ＡａＩＴ遺伝子−ＡｃＭＮＰＶ構成体、およびＡａＩ
Ｔ遺伝子なしのＡｃＭＮＰＶの野生型Ｅ２菌株を用い
て、それより成長した幼虫（初期第５齢）を使用して注
射検定処方を繰り返した。１０4ＰＦＵの投与量をそれ
ぞれの構成体の発芽ウイルスを幼虫の別群に注射する。
【００７０】下記の実施例１１に記載されている如く、
コドン最適化異種シグナル−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構
成体のそれぞれ（並びに先天的ＡａＩＴシグナル−先天
的ＡａＩＴ遺伝子−ＡｃＭＮＰＶ構成体）はそれの宿主
を野生型ＡｃＭＮＰＶより早く死亡させる。野生型ウイ
ルスに関するＬＴ50は約１２６時間であるが、７種のシ
グナル−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成体に関する対応す
るＬＴ50は約６８−８９時間の範囲でありそして先天的
ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成体は約７４時間のＬＴ50を
有する。これらの結果は、ＡａＩＴ遺伝子および異種シ
グナル配列のＡｃＭＮＰＶ中への挿入が生物学的に活性
な毒素の発現により死亡速度を促進させるという実施例
１０の結果を確認するものである。
コドン最適化異種シグナル−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構
成体のそれぞれ（並びに先天的ＡａＩＴシグナル−先天
的ＡａＩＴ遺伝子−ＡｃＭＮＰＶ構成体）はそれの宿主
を野生型ＡｃＭＮＰＶより早く死亡させる。野生型ウイ
ルスに関するＬＴ50は約１２６時間であるが、７種のシ
グナル−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成体に関する対応す
るＬＴ50は約６８−８９時間の範囲でありそして先天的
ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成体は約７４時間のＬＴ50を
有する。これらの結果は、ＡａＩＴ遺伝子および異種シ
グナル配列のＡｃＭＮＰＶ中への挿入が生物学的に活性
な毒素の発現により死亡速度を促進させるという実施例
１０の結果を確認するものである。
【００７１】ポリヘドリン製造の欠点であるこれらの組
み換えウイルスの経口的毒性を試験するために、培養中
に細胞に組み換えＡａＩＴ−ウイルスおよび野生型ヘル
パーウイルス（例えばＡｃＭＮＰＶのＥ２菌株）と共に
感染させることにより野生型および組み換えウイルス粒
子の混合物を含有する多面体を製造する。この方法は、
１個の多面体（吸蔵体）が数百のウイルス粒子を含有し
ているため、可能となる。
み換えウイルスの経口的毒性を試験するために、培養中
に細胞に組み換えＡａＩＴ−ウイルスおよび野生型ヘル
パーウイルス（例えばＡｃＭＮＰＶのＥ２菌株）と共に
感染させることにより野生型および組み換えウイルス粒
子の混合物を含有する多面体を製造する。この方法は、
１個の多面体（吸蔵体）が数百のウイルス粒子を含有し
ているため、可能となる。
【００７２】従って、宿主細胞を種々の量の組み換えＡ
ａＩＴ−ウイルス並びに野生型ウイルスと共に感染させ
る。生ずる感染細胞は野生型および組み換えウイルス粒
子の混合物を含有する多面体を有する。下記の実施例１
２に示されている如く、野生型ウイルスのＭＯＩが細胞
当たり少なくとも２ＰＦＵである時には、組み換えウイ
ルスのＭＯＩが増加するにつれて、ウイルス吸蔵体を有
する細胞の百分率および細胞当たりの多面体の平均数は
相当減少する。従って、それぞれ３のＭＯＩにおいて吸
蔵−陰性組み換えウイルスおよび野生型ウイルスを用い
る共−吸蔵研究が行われた。これにより多面体製造の許
容可能水準において多面体中の組み換えウイルス粒子の
有効な代表となり得る。
ａＩＴ−ウイルス並びに野生型ウイルスと共に感染させ
る。生ずる感染細胞は野生型および組み換えウイルス粒
子の混合物を含有する多面体を有する。下記の実施例１
２に示されている如く、野生型ウイルスのＭＯＩが細胞
当たり少なくとも２ＰＦＵである時には、組み換えウイ
ルスのＭＯＩが増加するにつれて、ウイルス吸蔵体を有
する細胞の百分率および細胞当たりの多面体の平均数は
相当減少する。従って、それぞれ３のＭＯＩにおいて吸
蔵−陰性組み換えウイルスおよび野生型ウイルスを用い
る共−吸蔵研究が行われた。これにより多面体製造の許
容可能水準において多面体中の組み換えウイルス粒子の
有効な代表となり得る。
【００７３】最後に、希望する量のＰＩＢを含有してい
る昆虫飼料の小滴を幼虫に供することにより経口的毒性
検定を行う。野生型ウイルスを除いて、それぞれのＰＩ
Ｂは野生型および組み換えウイルス粒子の混合物を含有
する。組み換えウイルス粒子は先天的ＡａＩＴ遺伝子
（および先天的シグナル配列）または異種シグナル配列
と結合されたコドン最適化遺伝子をのいずれかを暗号化
することができる。
る昆虫飼料の小滴を幼虫に供することにより経口的毒性
検定を行う。野生型ウイルスを除いて、それぞれのＰＩ
Ｂは野生型および組み換えウイルス粒子の混合物を含有
する。組み換えウイルス粒子は先天的ＡａＩＴ遺伝子
（および先天的シグナル配列）または異種シグナル配列
と結合されたコドン最適化遺伝子をのいずれかを暗号化
することができる。
【００７４】幼虫を次に麻痺および死亡に関して監視す
る。検定の結果は実施例１３および図６−１５に示され
ている。
る。検定の結果は実施例１３および図６−１５に示され
ている。
【００７５】一種を除いて全ての組み換えウイルスが野
生型ＡｃＭＮＰＶ（これはＡａＩＴ遺伝子が欠けてい
る）より早い罹病開始を示す。例外は、ＡａＩＴを暗号
化するコドン最適化配列と結合されたｐＢＭＨＰＣ−１
２シグナル配列を含有するＡｃＭＮＰＶ構造であり、そ
れは野生型ＡｃＭＮＰＶとほぼ同じように機能する。組
み換えウイルスは、野生型ウイルスにより引き起こされ
る病因とは容易に識別される特徴的な麻痺応答を示す。
多面体中および感染昆虫中の野生型対組み換えウイルス
の実際の比は分析されない。
生型ＡｃＭＮＰＶ（これはＡａＩＴ遺伝子が欠けてい
る）より早い罹病開始を示す。例外は、ＡａＩＴを暗号
化するコドン最適化配列と結合されたｐＢＭＨＰＣ−１
２シグナル配列を含有するＡｃＭＮＰＶ構造であり、そ
れは野生型ＡｃＭＮＰＶとほぼ同じように機能する。組
み換えウイルスは、野生型ウイルスにより引き起こされ
る病因とは容易に識別される特徴的な麻痺応答を示す。
多面体中および感染昆虫中の野生型対組み換えウイルス
の実際の比は分析されない。
【００７６】本発明をさらに良く理解するために、下記
の実施例を示す。該実施例は説明目的のためだけであり
そして本発明の範囲を限定しようとするものではない。
の実施例を示す。該実施例は説明目的のためだけであり
そして本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００７７】
【実施例】サムブルーク(Sambrook)他（３２）中に記載
されている処方に従い標準的な分子生物学的技術を使用
した。
されている処方に従い標準的な分子生物学的技術を使用
した。
【００７８】実施例１ ＡａＩＴを暗号化するコドン最適化ｃＤＮＡ配列の決定 ＡａＩＴ用のコドン最適化遺伝子の設計は、組み換え蛋
白質発現用に使用する細胞／有機体の正確な（またはで
きるかぎり近い関係の）ゲノムから誘導される核遺伝子
のコドン使用を反映するという試みで始まる。しかしな
がら、ここでは鱗翅目およびバキュロウイルス遺伝子配
列の両者に関する適切な発現はこれらの初期実験に関す
る信頼性のあるコドン使用表を作成するために利用でき
なかった。
白質発現用に使用する細胞／有機体の正確な（またはで
きるかぎり近い関係の）ゲノムから誘導される核遺伝子
のコドン使用を反映するという試みで始まる。しかしな
がら、ここでは鱗翅目およびバキュロウイルス遺伝子配
列の両者に関する適切な発現はこれらの初期実験に関す
る信頼性のあるコドン使用表を作成するために利用でき
なかった。
【００７９】イケムラ(Ikemura)他は、信頼性のあるコ
ドン−選択パターンには異なる機能を有する１０以上の
遺伝子からのコドン頻度の集計を必要とすると注意して
いる（１０、２４）。しかしながら、本発明の時点で
は、２種の特定蛋白質すなわちＡｃＭＮＰＶポリヘドリ
ンおよびＡｃＭＮＰＶｐ１０だけからのＤＮＡ配列情報
しかなかった（２２、２３）。
ドン−選択パターンには異なる機能を有する１０以上の
遺伝子からのコドン頻度の集計を必要とすると注意して
いる（１０、２４）。しかしながら、本発明の時点で
は、２種の特定蛋白質すなわちＡｃＭＮＰＶポリヘドリ
ンおよびＡｃＭＮＰＶｐ１０だけからのＤＮＡ配列情報
しかなかった（２２、２３）。
【００８０】この理由のために、ドロソフィラ・メラノ
ガスターのコドン使用表は２０,４５１のコドンを合計
した４４の核遺伝子から誘導されているため、ドロソフ
ィラ・メラノガスターが選択される（１１）。これらの
コドン使用表を使用して、本発明のシグナル配列および
ＡａＩＴ毒素配列を暗号化するコドン最適化遺伝子を設
計する。
ガスターのコドン使用表は２０,４５１のコドンを合計
した４４の核遺伝子から誘導されているため、ドロソフ
ィラ・メラノガスターが選択される（１１）。これらの
コドン使用表を使用して、本発明のシグナル配列および
ＡａＩＴ毒素配列を暗号化するコドン最適化遺伝子を設
計する。
【００８１】それぞれの全長シグナルペプチド配列をＡ
ａＩＴ毒素ペプチド配列と融合させる。これらのアミノ
酸配列をインテリゲネティック・スートTMソフトウエア
（アージョン１９８８、パラアルト、カリフォルニア）
を用いて全ての可能なヌクレオチド縮重（最大のあいま
いさ）を示すＤＮＡ配列に逆−翻訳する。インテリゲネ
ティック・スートTMソフトウエアは全てのコンピュータ
ー使用核酸配列分析用に使用される。
ａＩＴ毒素ペプチド配列と融合させる。これらのアミノ
酸配列をインテリゲネティック・スートTMソフトウエア
（アージョン１９８８、パラアルト、カリフォルニア）
を用いて全ての可能なヌクレオチド縮重（最大のあいま
いさ）を示すＤＮＡ配列に逆−翻訳する。インテリゲネ
ティック・スートTMソフトウエアは全てのコンピュータ
ー使用核酸配列分析用に使用される。
【００８２】確定的および可能性のある（コドン縮重の
理由のため）制限酵素認識部位のリストを作成する。遺
伝子合成用に並びに追加的ＤＮＡ操作用に重要な制限酵
素部位が選択されそして保存される。例えば、Ｂａｍ
ＨＩおよびＡｖａ Ｉ制限酵素部位はブルースクリプト
ＳＫ／ＫＳベクター（ストラタジーン、ラジョラ、カリ
フォルニア）を用いる遺伝子合成用に必要である。Ｓａ
ｌ ＩおよびＡｐａ Ｉ制限部位が追加的遺伝子操作に柔
軟性を与えるのに望ましい。
理由のため）制限酵素認識部位のリストを作成する。遺
伝子合成用に並びに追加的ＤＮＡ操作用に重要な制限酵
素部位が選択されそして保存される。例えば、Ｂａｍ
ＨＩおよびＡｖａ Ｉ制限酵素部位はブルースクリプト
ＳＫ／ＫＳベクター（ストラタジーン、ラジョラ、カリ
フォルニア）を用いる遺伝子合成用に必要である。Ｓａ
ｌ ＩおよびＡｐａ Ｉ制限部位が追加的遺伝子操作に柔
軟性を与えるのに望ましい。
【００８３】インテリゲネティック・スートTMソフトウ
エアを用いて、ＡａＩＴおよびそれぞれのシグナル配列
中でそれぞれのアミノ酸が製造される時間数を記録する
リストが作成される。コドンは、ドロソフィラ・メラノ
ガスター・コドン使用の相対的頻度を反映する配列中に
存在しているアミノ酸残基の数を基にして割り当てられ
る（１１）。
エアを用いて、ＡａＩＴおよびそれぞれのシグナル配列
中でそれぞれのアミノ酸が製造される時間数を記録する
リストが作成される。コドンは、ドロソフィラ・メラノ
ガスター・コドン使用の相対的頻度を反映する配列中に
存在しているアミノ酸残基の数を基にして割り当てられ
る（１１）。
【００８４】例えば、ドロソフィラ・メラノガスター中
のシステイン・コドン頻度は配列ＴＧＣに関しては７６
％でありそして配列ＴＧＴに関しては２４％である。Ａ
ＤＫシグナル−ＡａＩＴ遺伝子構成体には８個のシステ
イン残基がある（全てが成熟ＡａＩＴ蛋白質を暗号化す
る遺伝子中にある（配列同定番号：３））。従って、６
個のコドンがＴＧＣとして（残基の７５％）そして２個
のコドンがＴＧＴとして（残基の２５％）割り当てられ
る。この分布を基にして、それぞれのシステイン・コド
ンに次に正確なあいまいでない配列が割り当てられる。
隣接イソコドンの変更に注意をすること。例えば、Ａａ
ＩＴペプチド中の２個の隣接システイン残基（アミノ酸
３７および３８）は配列ＴＧＴ ＴＧＣを割り当てられ
て、２個の同一コドン配列が続いて割り当てられるのを
避ける。
のシステイン・コドン頻度は配列ＴＧＣに関しては７６
％でありそして配列ＴＧＴに関しては２４％である。Ａ
ＤＫシグナル−ＡａＩＴ遺伝子構成体には８個のシステ
イン残基がある（全てが成熟ＡａＩＴ蛋白質を暗号化す
る遺伝子中にある（配列同定番号：３））。従って、６
個のコドンがＴＧＣとして（残基の７５％）そして２個
のコドンがＴＧＴとして（残基の２５％）割り当てられ
る。この分布を基にして、それぞれのシステイン・コド
ンに次に正確なあいまいでない配列が割り当てられる。
隣接イソコドンの変更に注意をすること。例えば、Ａａ
ＩＴペプチド中の２個の隣接システイン残基（アミノ酸
３７および３８）は配列ＴＧＴ ＴＧＣを割り当てられ
て、２個の同一コドン配列が続いて割り当てられるのを
避ける。
【００８５】この方法を全部で２０個のアミノ酸および
終止コドン（終止コドン配列ＴＡＡはこの工程により変
化されないが）に関して繰り返す。さらに、全ての重要
な制限酵素部位は保存されそして望ましくない部位は破
壊される。
終止コドン（終止コドン配列ＴＡＡはこの工程により変
化されないが）に関して繰り返す。さらに、全ての重要
な制限酵素部位は保存されそして望ましくない部位は破
壊される。
【００８６】プラスミドベクター並びに伝達ベクターに
関するフランキングＤＮＡ配列を完成したイソ配列と融
合させて、切断−結合境界に望ましくない制限酵素部位
がないということを確認する。
関するフランキングＤＮＡ配列を完成したイソ配列と融
合させて、切断−結合境界に望ましくない制限酵素部位
がないということを確認する。
【００８７】実施例２ 異種シグナル配置およびＡａＩＴを暗号化するコドン最
適化ｃＤＮＡ配列を含有する遺伝子カセットの構成 ８個の異種シグナル配列−コドン最適化ＡａＩＴ毒素カ
セットを、二部分、すなわち８個の異種シグナル配列の
１個を暗号化するＤＮＡおよび毒素暗号化領域のアミノ
末端部分（全ての構成に共通）からなるそれぞれの構成
に関する「Ｂ」断片、並びにそれぞれの構成に関して同
一でありそして毒素暗号化領域の残部を暗号化する
「Ａ」断片、で合成しそして組み立てる。
適化ｃＤＮＡ配列を含有する遺伝子カセットの構成 ８個の異種シグナル配列−コドン最適化ＡａＩＴ毒素カ
セットを、二部分、すなわち８個の異種シグナル配列の
１個を暗号化するＤＮＡおよび毒素暗号化領域のアミノ
末端部分（全ての構成に共通）からなるそれぞれの構成
に関する「Ｂ」断片、並びにそれぞれの構成に関して同
一でありそして毒素暗号化領域の残部を暗号化する
「Ａ」断片、で合成しそして組み立てる。
【００８８】断片ＡおよびＢのそれぞれは、ニューイン
グランド・バイオラブス（ベヴェリー、マサチュセッ
ツ）から購買した１５ｂｐオーバーラップを含有する一
対のオリゴマーをアニーリングすることにより、製造さ
れる。ＤＮＡポリメラーゼであるセクエナーゼTM２.０
（ユナイテド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレー
ション、クリーブランド、オハイオ）を使用して二重標
準分子を完成し、それは異種シグナル配列およびＡａＩ
Ｔを暗号化するコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含有する。
下記のものは、これらの８個の構成体の構成で使用され
るオリゴマーのリストである： 断片Ａ
グランド・バイオラブス（ベヴェリー、マサチュセッ
ツ）から購買した１５ｂｐオーバーラップを含有する一
対のオリゴマーをアニーリングすることにより、製造さ
れる。ＤＮＡポリメラーゼであるセクエナーゼTM２.０
（ユナイテド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレー
ション、クリーブランド、オハイオ）を使用して二重標
準分子を完成し、それは異種シグナル配列およびＡａＩ
Ｔを暗号化するコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含有する。
下記のものは、これらの８個の構成体の構成で使用され
るオリゴマーのリストである： 断片Ａ
【００８９】
【表１】
【００９０】（配列同定番号：３３）
【００９１】
【表２】
【００９２】（配列同定番号：３４） 断片Ｂ１−８ 共通
【００９３】
【表３】
【００９４】（配列同定番号：３５）
【００９５】
【表４】
【００９６】（配列同定番号：３６）
【００９７】
【表５】
【００９８】（配列同定番号：３７） 漿膜
【００９９】
【表６】
【０１００】（配列同定番号：３８） エステラーゼ−６
【０１０１】
【表７】
【０１０２】（配列同定番号：３９） アポリポフォリン
【０１０３】
【表８】
【０１０４】（配列同定番号：４０） 性−特異種
【０１０５】
【表９】
【０１０６】（配列同定番号：４１） クチクラ
【０１０７】
【表１０】
【０１０８】（配列同定番号：４２）
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】（配列同定番号：４３） 図２は、ドロソフィラ・メラノガスター・クチクラ・シ
グナル配列を含有するＡａＩＴ遺伝子カセットに関する
構成方法を示している。残りの７個の異種シグナル配列
−ＡａＩＴ遺伝子カセットはシグナル配列に関する特異
オリゴを用いて上記と同じ方法で構成される。
グナル配列を含有するＡａＩＴ遺伝子カセットに関する
構成方法を示している。残りの７個の異種シグナル配列
−ＡａＩＴ遺伝子カセットはシグナル配列に関する特異
オリゴを用いて上記と同じ方法で構成される。
【０１１１】第一段階では、Ｂ断片に関するシグナル配
列−特異オリゴおよび共通Ｂオリゴをアニーリングし、
そして単独ストランド領域をセクエナーゼTM２.０を用
いて充填する。それぞれのシグナル配列−特異オリゴは
クローニング用に必要なＢａｍ ＨＩ部位を含有する同
一の１２ヌクレオチド上流非暗号化領域、シグナル配列
用の暗号化領域、およびＡａＩＴの最初の５個のアミノ
−末端アミノ酸を暗号化する最初の１５個のヌクレオチ
ドからなっている。二重ストランドＤＮＡのこの短い部
分はＢａｍ ＨＩおよびＡｖａ Ｉで消化されそしてすで
にＸａｍ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化されているｐブル
ースクリプトＳＫ＋（ストラタジーン、ラジョラ、カリ
フォルニア）にサブクローニングされる。陽性サブクロ
ーンは、ｐブルースクリプトＳＫ＋だけの中に存在して
いる４４５ｂｐ断片より大きいＰｖｕ ＩＩ断片の存在
により証明される。Ａｖａ ＩおよびＸｍａ Ｉ部位に関
するオーバーラップの間に１個の塩基対不適合がある。
この不適合を補正してＡｖａ Ｉ部位を作成しそしてＸ
ｍａ Ｉ部位をなくすクローンが適当な制限酵素消化に
より選択される。図２では、生ずるプラスミドはｐＢＳ
クチクラＢ７と指定される。
列−特異オリゴおよび共通Ｂオリゴをアニーリングし、
そして単独ストランド領域をセクエナーゼTM２.０を用
いて充填する。それぞれのシグナル配列−特異オリゴは
クローニング用に必要なＢａｍ ＨＩ部位を含有する同
一の１２ヌクレオチド上流非暗号化領域、シグナル配列
用の暗号化領域、およびＡａＩＴの最初の５個のアミノ
−末端アミノ酸を暗号化する最初の１５個のヌクレオチ
ドからなっている。二重ストランドＤＮＡのこの短い部
分はＢａｍ ＨＩおよびＡｖａ Ｉで消化されそしてすで
にＸａｍ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化されているｐブル
ースクリプトＳＫ＋（ストラタジーン、ラジョラ、カリ
フォルニア）にサブクローニングされる。陽性サブクロ
ーンは、ｐブルースクリプトＳＫ＋だけの中に存在して
いる４４５ｂｐ断片より大きいＰｖｕ ＩＩ断片の存在
により証明される。Ａｖａ ＩおよびＸｍａ Ｉ部位に関
するオーバーラップの間に１個の塩基対不適合がある。
この不適合を補正してＡｖａ Ｉ部位を作成しそしてＸ
ｍａ Ｉ部位をなくすクローンが適当な制限酵素消化に
より選択される。図２では、生ずるプラスミドはｐＢＳ
クチクラＢ７と指定される。
【０１１２】ＡａＩＴ暗号化領域の大部分を暗号化する
Ａ断片を構成するために、オリゴＥ１およびＥ２をアニ
ーリングしそしてセクエナーゼTM２.０を使用して単独
ストランド領域に充填する。この結果、５′末端にＡｖ
ａ Ｉ部位をそして毒素暗号化領域の３′端部の次に入
れられたＢａｍ ＨＩおよびＡｓｐ ７１８部位を含有す
る。クローニングを促進させるために、Ｂａｍ ＨＩお
よびＡｓｐ ７１８部位が加えられる。断片Ａを次にＡ
ｖａ ＩおよびＡｓｐ ７１８で消化させる。断片Ｂ−含
有プラスミドであるｐＢＳクチクラＢ７もＡｖａ Ｉお
よびＡｓｐ ７１８で消化させ、そして断片Ａは消化さ
れたプラスミド中にサブクローニングされる。図２の場
合、生ずるプラスミドはｐＢＳクチクラ−ＡａＩＴと指
定される。断片ＡおよびＢをこの目的のためだけにＡａ
ＩＴ配列中に設定されている非反復性Ａｖａ Ｉ部位で
結合させる。断片Ａの断片Ｂ−含有プラスミド中への連
結反応後に、連結反応されたＤＮＡを使用して競合ＤＨ
α大腸菌(E. coli)を形質転換させる。生じたバクテリ
アコロニーからプラスミドＤＮＡのミニプレップを製造
する。制限酵素分析を使用して、どのコロニーが希望す
る組み換えＤＮＡを含有しているかを決定する。別の制
限酵素分析およびその後のＤＮＡ配列順序決定を使用し
て、ＡａＩＴを暗号化するコドン最適化ｃＤＮＡを含有
する８個のプラスミドの一体性を確認する。
Ａ断片を構成するために、オリゴＥ１およびＥ２をアニ
ーリングしそしてセクエナーゼTM２.０を使用して単独
ストランド領域に充填する。この結果、５′末端にＡｖ
ａ Ｉ部位をそして毒素暗号化領域の３′端部の次に入
れられたＢａｍ ＨＩおよびＡｓｐ ７１８部位を含有す
る。クローニングを促進させるために、Ｂａｍ ＨＩお
よびＡｓｐ ７１８部位が加えられる。断片Ａを次にＡ
ｖａ ＩおよびＡｓｐ ７１８で消化させる。断片Ｂ−含
有プラスミドであるｐＢＳクチクラＢ７もＡｖａ Ｉお
よびＡｓｐ ７１８で消化させ、そして断片Ａは消化さ
れたプラスミド中にサブクローニングされる。図２の場
合、生ずるプラスミドはｐＢＳクチクラ−ＡａＩＴと指
定される。断片ＡおよびＢをこの目的のためだけにＡａ
ＩＴ配列中に設定されている非反復性Ａｖａ Ｉ部位で
結合させる。断片Ａの断片Ｂ−含有プラスミド中への連
結反応後に、連結反応されたＤＮＡを使用して競合ＤＨ
α大腸菌(E. coli)を形質転換させる。生じたバクテリ
アコロニーからプラスミドＤＮＡのミニプレップを製造
する。制限酵素分析を使用して、どのコロニーが希望す
る組み換えＤＮＡを含有しているかを決定する。別の制
限酵素分析およびその後のＤＮＡ配列順序決定を使用し
て、ＡａＩＴを暗号化するコドン最適化ｃＤＮＡを含有
する８個のプラスミドの一体性を確認する。
【０１１３】実施例３ ＡａＩＴを暗号化する先天的ｃＤＮＡ配列を含有する遺
伝子カセットの構成 ＡａＩＴを暗号化する先天的ｃＤＮＡ配列を含有する遺
伝子カセットを、実施例２のコドン最適化遺伝子の構成
とは異なる方法で、二部分で構成した。遺伝子を構成す
るためのオーバーラップの短領域だけを有する長いオリ
ゴを用いる代わりに、完全にオーバーラップするオリゴ
のセットを使用する。構成方法における第二の差は、Ａ
ａＩＴシグナル配列および暗号化領域の両者に関する先
天的ＤＮＡが使用されることから、必然的に生ずるもの
である。人工的な制限酵素部位はＤＮＡ配列中に設定さ
れていない。従って、シグナル配列およびＡａＩＴ遺伝
子の暗号化領域を結合させる異なる方法が必要である。
この方法では、非対称的に切断する制限酵素を使用して
遺伝子の機能的に別個な領域を互いにきちんと融合させ
ることができる。これにより、いずれの将来の構成体に
おいても予備製造された領域を混合しそして適合させる
ことができる。先天的ＡａＩＴ遺伝子の構成用に使用さ
れる１−１０の番号が付けられたオリゴマーの配列は下
記のリストに示される： オリゴ１
伝子カセットの構成 ＡａＩＴを暗号化する先天的ｃＤＮＡ配列を含有する遺
伝子カセットを、実施例２のコドン最適化遺伝子の構成
とは異なる方法で、二部分で構成した。遺伝子を構成す
るためのオーバーラップの短領域だけを有する長いオリ
ゴを用いる代わりに、完全にオーバーラップするオリゴ
のセットを使用する。構成方法における第二の差は、Ａ
ａＩＴシグナル配列および暗号化領域の両者に関する先
天的ＤＮＡが使用されることから、必然的に生ずるもの
である。人工的な制限酵素部位はＤＮＡ配列中に設定さ
れていない。従って、シグナル配列およびＡａＩＴ遺伝
子の暗号化領域を結合させる異なる方法が必要である。
この方法では、非対称的に切断する制限酵素を使用して
遺伝子の機能的に別個な領域を互いにきちんと融合させ
ることができる。これにより、いずれの将来の構成体に
おいても予備製造された領域を混合しそして適合させる
ことができる。先天的ＡａＩＴ遺伝子の構成用に使用さ
れる１−１０の番号が付けられたオリゴマーの配列は下
記のリストに示される： オリゴ１
【０１１４】
【表１２】
【０１１５】（配列同定番号：４４） オリゴ２
【０１１６】
【表１３】
【０１１７】（配列同定番号：４５） オリゴ３
【０１１８】
【表１４】
【０１１９】（配列同定番号：４６） オリゴ４
【０１２０】
【表１５】
【０１２１】（配列同定番号：４７） オリゴ５
【０１２２】
【表１６】
【０１２３】（配列同定番号：４８） オリゴ６
【０１２４】
【表１７】
【０１２５】（配列同定番号：４９） オリゴ７
【０１２６】
【表１８】
【０１２７】（配列同定番号：５０） オリゴ８
【０１２８】
【表１９】
【０１２９】（配列同定番号：５１） オリゴ９
【０１３０】
【表２０】
【０１３１】（配列同定番号：５２） オリゴ１０
【０１３２】
【表２１】
【０１３３】（配列同定番号：５３） 先天的ＡａＩＴ毒素遺伝子カセットのクローニングを促
進させるために、修飾されたブルースクリプトＳＫプラ
スミドを作成する。ｐＢＳ ＳＫ Ｂｓｍ Ｉと指定され
たこのベクターは、ブルースクリプト地図上の３３０ｂ
ｐに位置するＮａｅ Ｉ中に挿入されているＢｇｌ ＩＩ
リンカー（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）を有する。このリンカー
挿入がＮａｅ Ｉ部位を破壊する。さらにこのベクター
は図３で頂部に示されている修飾されたポリリンカーを
含有する。この修飾されたプラスミドはｐＢＳ ＳＫ Ｂ
ｓｍ Ｉと指定される。このポリンカーはＢｓｍ Ｉと隣
接配置されているＮａｅ Ｉ部位を、Ｎａｅ Ｉ部位がＢ
ｓｍ Ｉ制限酵素の使用およびその後のＤＮＡポリメラ
ーゼＩのレナウ(Klenow)断片（ギブコ／ＢＲＬ、ガイザ
ースブルグ、メインランド）によりの付着末端中への充
填による平滑末端分子として明白に切り出されるような
方法で、含有する。
進させるために、修飾されたブルースクリプトＳＫプラ
スミドを作成する。ｐＢＳ ＳＫ Ｂｓｍ Ｉと指定され
たこのベクターは、ブルースクリプト地図上の３３０ｂ
ｐに位置するＮａｅ Ｉ中に挿入されているＢｇｌ ＩＩ
リンカー（ＣＡＧＡＴＣＴＧ）を有する。このリンカー
挿入がＮａｅ Ｉ部位を破壊する。さらにこのベクター
は図３で頂部に示されている修飾されたポリリンカーを
含有する。この修飾されたプラスミドはｐＢＳ ＳＫ Ｂ
ｓｍ Ｉと指定される。このポリンカーはＢｓｍ Ｉと隣
接配置されているＮａｅ Ｉ部位を、Ｎａｅ Ｉ部位がＢ
ｓｍ Ｉ制限酵素の使用およびその後のＤＮＡポリメラ
ーゼＩのレナウ(Klenow)断片（ギブコ／ＢＲＬ、ガイザ
ースブルグ、メインランド）によりの付着末端中への充
填による平滑末端分子として明白に切り出されるような
方法で、含有する。
【０１３４】カセットの先天的シグナル配列部分を構成
するために、オリゴ１および２をアニーリングする。こ
れらの２個のオリゴが適切にアニーリングされた時に、
それらは平滑３′末端およびＢａｍ ＳＫ付着末端を
５′末端に含有する。プラスミドｐＢＳ ＳＫ Ｂｓｍ
ＩをＢａｍ ＨＩおよびＮａｅ Ｉで消化させる。アニー
リングされたオリゴを次に消化されたプラスミドに連結
反応させる。生ずるプラスミドサブクローンはｐＢＳ
ＧＩＩＩ ｓｉｇと指定される。
するために、オリゴ１および２をアニーリングする。こ
れらの２個のオリゴが適切にアニーリングされた時に、
それらは平滑３′末端およびＢａｍ ＳＫ付着末端を
５′末端に含有する。プラスミドｐＢＳ ＳＫ Ｂｓｍ
ＩをＢａｍ ＨＩおよびＮａｅ Ｉで消化させる。アニー
リングされたオリゴを次に消化されたプラスミドに連結
反応させる。生ずるプラスミドサブクローンはｐＢＳ
ＧＩＩＩ ｓｉｇと指定される。
【０１３５】ＡａＩＴ毒素の暗号化領域はＤＮＡの二部
分として構成される。オリゴ４、５、８および９の５′
末端をＴ４キナーゼを用いてホスホリル化する。オリゴ
３、６、７および１０は終止ホスフェートなしで残され
る。２回のアニーリング反応およびその後のＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（ニューイングランド・バイオラブス、ベヴ
ェリー、マサチュセッツ）を用いる連結反応を行う。Ａ
ａＩＴ毒素のアミノ終止部分を暗号化するオリゴ３、
４、５および６を図３に示されている如くアニーリング
しそして連結反応させる。ＡａＩＴ毒素のカルボキシ末
端を暗号化するオリゴ７、８、９および１０を図３に示
されている如くアニーリングしそして連結反応させる。
分として構成される。オリゴ４、５、８および９の５′
末端をＴ４キナーゼを用いてホスホリル化する。オリゴ
３、６、７および１０は終止ホスフェートなしで残され
る。２回のアニーリング反応およびその後のＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（ニューイングランド・バイオラブス、ベヴ
ェリー、マサチュセッツ）を用いる連結反応を行う。Ａ
ａＩＴ毒素のアミノ終止部分を暗号化するオリゴ３、
４、５および６を図３に示されている如くアニーリング
しそして連結反応させる。ＡａＩＴ毒素のカルボキシ末
端を暗号化するオリゴ７、８、９および１０を図３に示
されている如くアニーリングしそして連結反応させる。
【０１３６】これらの２個のオリゴ断片を、ＴＡＥ（４
０ｍＭトリス−アセテート、ｐＨ７.８、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）を含有する２.５％低融点アガロースゲル（バイオ
−ラド、リッチモンド、カリフォルニア）上での電気泳
動により精製する。断片が汚染断片から充分に分離され
た時点で、それらをゲル切片として切断しそして個別管
の中に入れる。断片はサンブルーク(Sambrook)他（３
２）中に記載されている如きフェノール抽出により下記
の点を改変して精製される：（１）塩化ナトリウムをゲ
ル切片に加熱前に１.５Ｍの最終的濃度となるまで加え
る。その後の段階中ではそれ以上の塩の添加は必要な
い。（２）エタノール沈澱の前に液化されそして希釈さ
れたゲル切片上でフェノール抽出を２回だけ行う。
０ｍＭトリス−アセテート、ｐＨ７.８、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）を含有する２.５％低融点アガロースゲル（バイオ
−ラド、リッチモンド、カリフォルニア）上での電気泳
動により精製する。断片が汚染断片から充分に分離され
た時点で、それらをゲル切片として切断しそして個別管
の中に入れる。断片はサンブルーク(Sambrook)他（３
２）中に記載されている如きフェノール抽出により下記
の点を改変して精製される：（１）塩化ナトリウムをゲ
ル切片に加熱前に１.５Ｍの最終的濃度となるまで加え
る。その後の段階中ではそれ以上の塩の添加は必要な
い。（２）エタノール沈澱の前に液化されそして希釈さ
れたゲル切片上でフェノール抽出を２回だけ行う。
【０１３７】プラスミドｐＢＳ ＧＩＩＩ ｓｉｇをＢｓ
ｍ Ｉで消化し、そして付着末端を充填し且つＤＮＡポ
リメラーゼＩのレナウ(Klenow)断片（ギブコ／ＢＲＬ、
ガイザースブルグ、メインランド）を用いて平滑化す
る。上記の如く、この結果として、シグナル配列の最後
の塩基対のところのプラスミドの解放が生ずる。プラス
ミドを次にＥｃｏ ＲＩで消化する。次に三方向連結反
応をゲル精製されたオリゴ断片および消化されたプラス
ミドの間で設定する。陽性のサブクローンが制限酵素分
析およびその後のＤＮＡ配列分析により証明される。ｐ
ＢＳ ＧＩＩＩ−ＡａＩＴと指定されている１個の陽性
クローンは先天的シグナル配列およびＡａＩＴの全長先
天的暗号化領域を含有する（図３）。
ｍ Ｉで消化し、そして付着末端を充填し且つＤＮＡポ
リメラーゼＩのレナウ(Klenow)断片（ギブコ／ＢＲＬ、
ガイザースブルグ、メインランド）を用いて平滑化す
る。上記の如く、この結果として、シグナル配列の最後
の塩基対のところのプラスミドの解放が生ずる。プラス
ミドを次にＥｃｏ ＲＩで消化する。次に三方向連結反
応をゲル精製されたオリゴ断片および消化されたプラス
ミドの間で設定する。陽性のサブクローンが制限酵素分
析およびその後のＤＮＡ配列分析により証明される。ｐ
ＢＳ ＧＩＩＩ−ＡａＩＴと指定されている１個の陽性
クローンは先天的シグナル配列およびＡａＩＴの全長先
天的暗号化領域を含有する（図３）。
【０１３８】実施例４ バキュロウイルス伝達ベクター中へのＡａＩＴ遺伝子構
成の挿入 実施例２の異種シグナル配列−コドン最適化ＡａＩＴ遺
伝子カセットをｐＢＳシグナル−ＡａＩＴクローンから
Ｂａｍ ＨＩ断片として分離する（図２中のｐＢＳクチ
クラ−ＡａＩＴ例を参照のこと）。これらのＢａｍ Ｈ
Ｉ断片を、Ｂａｍ ＨＩで消化されたｐＶＬ ９８５バキ
ュロウイルス伝達ベクターＤＮＡ（３１）中にサブクロ
ーニングする。挿入体の制限酵素分析およびその後の配
列分析を使用して、ｐＶＬ異種シグナル配列−コドン最
適化ＡａＩＴクローンの正確な配向および一体性を確認
する。
成の挿入 実施例２の異種シグナル配列−コドン最適化ＡａＩＴ遺
伝子カセットをｐＢＳシグナル−ＡａＩＴクローンから
Ｂａｍ ＨＩ断片として分離する（図２中のｐＢＳクチ
クラ−ＡａＩＴ例を参照のこと）。これらのＢａｍ Ｈ
Ｉ断片を、Ｂａｍ ＨＩで消化されたｐＶＬ ９８５バキ
ュロウイルス伝達ベクターＤＮＡ（３１）中にサブクロ
ーニングする。挿入体の制限酵素分析およびその後の配
列分析を使用して、ｐＶＬ異種シグナル配列−コドン最
適化ＡａＩＴクローンの正確な配向および一体性を確認
する。
【０１３９】例えば、プラスミドｐＢＳクチクラ−Ａａ
ＩＴをｐＶＬバキュロウイルス伝達ベクターにサブクロ
ーニングして、ｐＡＣ００５５.１と指定されるプラス
ミドを生成する。
ＩＴをｐＶＬバキュロウイルス伝達ベクターにサブクロ
ーニングして、ｐＡＣ００５５.１と指定されるプラス
ミドを生成する。
【０１４０】実施例３の先天的ＡａＩＴ遺伝子カセット
をｐＢＳ ＧＩＩＩ−ＡａＩＴクローンからＢａｍ ＨＩ
〜Ｅｃｏ ＲＩ断片として分離する（図３参照）。これ
らのＢａｍ ＨＩ〜Ｅｃｏ ＲＩ断片を、Ｂａｍ ＨＩお
よびＥｃｏ ＲＩで消化されたｐＶＬ １３９３バキュロ
ウイルス伝達ベクターＤＮＡ（３３）にサブクローニン
グする。挿入体の制限酵素分析およびその後の配列分析
を試用して、ｐＶＬ先天的ＡａＩＴクローンの一体性を
確認する。
をｐＢＳ ＧＩＩＩ−ＡａＩＴクローンからＢａｍ ＨＩ
〜Ｅｃｏ ＲＩ断片として分離する（図３参照）。これ
らのＢａｍ ＨＩ〜Ｅｃｏ ＲＩ断片を、Ｂａｍ ＨＩお
よびＥｃｏ ＲＩで消化されたｐＶＬ １３９３バキュロ
ウイルス伝達ベクターＤＮＡ（３３）にサブクローニン
グする。挿入体の制限酵素分析およびその後の配列分析
を試用して、ｐＶＬ先天的ＡａＩＴクローンの一体性を
確認する。
【０１４１】実施例５ ＡａＩＴを暗号化する組み換えウイルスの作成 Ｍ.Ｄ.サマーズおよびＧ.Ｅ.スミス（２５）により記載
されている培養されたＳｆ９細胞中での同種ＤＮＡ組み
換えにより、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの
調節下で先天的およびコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子を含
有する組み換えウイルスを作成する。Ｓｆ９細胞（ＡＴ
ＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ１７１１）は、スポドプテラ・
フルギペルダ２１（Ｓｆ２１）の誘導体である。
されている培養されたＳｆ９細胞中での同種ＤＮＡ組み
換えにより、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの
調節下で先天的およびコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子を含
有する組み換えウイルスを作成する。Ｓｆ９細胞（ＡＴ
ＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ１７１１）は、スポドプテラ・
フルギペルダ２１（Ｓｆ２１）の誘導体である。
【０１４２】この工程では、２.０×１０6個のＳｆ９細
胞を６０ｍｍ培養皿中で５ｍｌの補充ＴＮＭ−ＦＨ媒体
（０.３３％ＴＣラクトアルブミンヒドロリゼート（ジ
フコ、デトロイト、ミシガン）および０.３３％ＴＣイ
ーストレート（ジフコ）、１０％胎牛血清、０.１％プ
ルロニックTMＦ−６８（ギブコ／ＢＲＬ）が補充されて
いるグレース昆虫媒体（３４））中で接種する。細胞が
しっかり結合された時点で（２−１６時間）、媒体を除
去しそして１０％胎牛血清が補充されている０.７５ｍ
ｌのグレース昆虫媒体で置換した。１マイクログラムの
ＡｃＭＮＰＶ（Ｅ２菌株）ＤＮＡを０.７５ｍｌのトラ
ンスフェクション緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７.０５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣ
ｌ2）中で２μｇの実施例４からのＡａＩＴ−伝達ベク
ターＤＮＡと混合し、そして細胞に滴々添加する。細胞
を次に２７℃において４時間培養した。培養期間の終了
時に、トランスフェクション媒体を除去しそして細胞を
ＴＮＭ−ＦＨで１回洗浄し、再び５ｍｌの補充ＴＮＭ−
ＦＨを供給し、そして２７℃の培養器中に入れた。５日
後に、媒体を細胞から除去し、ベックマンＧＰＲ遠心器
中で２０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心により透明
とし、そして４℃で貯蔵する。これが最初のトランスフ
ェクション上澄み液を構成する。
胞を６０ｍｍ培養皿中で５ｍｌの補充ＴＮＭ−ＦＨ媒体
（０.３３％ＴＣラクトアルブミンヒドロリゼート（ジ
フコ、デトロイト、ミシガン）および０.３３％ＴＣイ
ーストレート（ジフコ）、１０％胎牛血清、０.１％プ
ルロニックTMＦ−６８（ギブコ／ＢＲＬ）が補充されて
いるグレース昆虫媒体（３４））中で接種する。細胞が
しっかり結合された時点で（２−１６時間）、媒体を除
去しそして１０％胎牛血清が補充されている０.７５ｍ
ｌのグレース昆虫媒体で置換した。１マイクログラムの
ＡｃＭＮＰＶ（Ｅ２菌株）ＤＮＡを０.７５ｍｌのトラ
ンスフェクション緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７.０５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣ
ｌ2）中で２μｇの実施例４からのＡａＩＴ−伝達ベク
ターＤＮＡと混合し、そして細胞に滴々添加する。細胞
を次に２７℃において４時間培養した。培養期間の終了
時に、トランスフェクション媒体を除去しそして細胞を
ＴＮＭ−ＦＨで１回洗浄し、再び５ｍｌの補充ＴＮＭ−
ＦＨを供給し、そして２７℃の培養器中に入れた。５日
後に、媒体を細胞から除去し、ベックマンＧＰＲ遠心器
中で２０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心により透明
とし、そして４℃で貯蔵する。これが最初のトランスフ
ェクション上澄み液を構成する。
【０１４３】先天的およびコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子
はＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝子を置換するため、こ
れらの毒素遺伝子を有する組み換えウイルスは多面体を
生成できず、従って吸蔵−陰性プラークを与えることが
できない。このフェノタイプを同定用の基礎として用い
て、ＡａＩＴ遺伝子を含有する組み換えウイルスが最初
のトランスフェクション上澄み液から３回のプラーク精
製によりＭ.Ｄ.サマーズおよびＧ.Ｅ.スミス（２５）の
プラーク検定方法を用いて分離される。
はＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝子を置換するため、こ
れらの毒素遺伝子を有する組み換えウイルスは多面体を
生成できず、従って吸蔵−陰性プラークを与えることが
できない。このフェノタイプを同定用の基礎として用い
て、ＡａＩＴ遺伝子を含有する組み換えウイルスが最初
のトランスフェクション上澄み液から３回のプラーク精
製によりＭ.Ｄ.サマーズおよびＧ.Ｅ.スミス（２５）の
プラーク検定方法を用いて分離される。
【０１４４】この工程では、１.５−２.０×１０6個の
Ｓｆ９細胞を補充ＴＮＭ−ＦＨ中の６０ｍｍ培養物の中
に接種する。細胞が結合した後に（２−１６時間）、媒
体を除去しそして０.００１−０.１％の最初のトランス
フェクション上澄み液を含有する１ｍｌの補充ＴＮＭ−
ＦＨで置換する。ウイルスを２７℃において１−２時間
にわたり放置して細胞に吸着させ、その後にそれを除去
しそして抗生物質および１.５％の低ゲル化温度アガロ
ースを含有する４ｍｌの溶融された（３９℃）補充ＴＮ
Ｍ−ＦＨで置換する。アガロースがゲル化した時に、細
胞を湿った２７℃の培養器に４−６日にわたり移す。吸
蔵−陰性プラークを次にステレオ顕微鏡下での視覚的検
査により同定し、そしてそれぞれの希望するプラークに
重なっているアガロースプラグを取り出しそして１ｍｌ
の補充ＴＮＭ−ＦＨ中で希釈する。
Ｓｆ９細胞を補充ＴＮＭ−ＦＨ中の６０ｍｍ培養物の中
に接種する。細胞が結合した後に（２−１６時間）、媒
体を除去しそして０.００１−０.１％の最初のトランス
フェクション上澄み液を含有する１ｍｌの補充ＴＮＭ−
ＦＨで置換する。ウイルスを２７℃において１−２時間
にわたり放置して細胞に吸着させ、その後にそれを除去
しそして抗生物質および１.５％の低ゲル化温度アガロ
ースを含有する４ｍｌの溶融された（３９℃）補充ＴＮ
Ｍ−ＦＨで置換する。アガロースがゲル化した時に、細
胞を湿った２７℃の培養器に４−６日にわたり移す。吸
蔵−陰性プラークを次にステレオ顕微鏡下での視覚的検
査により同定し、そしてそれぞれの希望するプラークに
重なっているアガロースプラグを取り出しそして１ｍｌ
の補充ＴＮＭ−ＦＨ中で希釈する。
【０１４５】プラーク精製工程をそれぞれのプラークか
ら回収された合計ウイルスの１−１０％を使用してさら
に２回繰り返す。第３回の終了時に、１個のプラークか
ら回収されたウイルスの全て（すなわち１ｍｌ）を２５
ｃｍ2フラスコ中で接種された２×１０6個のＳｆ９細胞
に加え、そしてフラスコを２７℃において１−２時間に
わたり培養する。ウイルスを次に除去しそして３ｍｌの
補充ＴＮＭ−ＦＨで置換し、そしてフラスコを培養器に
戻す。５日間の終了時に、継代１すなわち「Ｐ１」ウイ
ルス株と指定され、ベックマンＧＰＲ遠心器中で２００
０ｒｐｍで１０分間の遠心により透明にされる。Ｐ１株
の保管試料を−１５０℃に保ち、そしてウイルスの残部
を４℃において貯蔵する。
ら回収された合計ウイルスの１−１０％を使用してさら
に２回繰り返す。第３回の終了時に、１個のプラークか
ら回収されたウイルスの全て（すなわち１ｍｌ）を２５
ｃｍ2フラスコ中で接種された２×１０6個のＳｆ９細胞
に加え、そしてフラスコを２７℃において１−２時間に
わたり培養する。ウイルスを次に除去しそして３ｍｌの
補充ＴＮＭ−ＦＨで置換し、そしてフラスコを培養器に
戻す。５日間の終了時に、継代１すなわち「Ｐ１」ウイ
ルス株と指定され、ベックマンＧＰＲ遠心器中で２００
０ｒｐｍで１０分間の遠心により透明にされる。Ｐ１株
の保管試料を−１５０℃に保ち、そしてウイルスの残部
を４℃において貯蔵する。
【０１４６】吸蔵−陰性ウイルスが希望するＡａＩＴ遺
伝子を含有しているということは、コドン最適化ＡａＩ
Ｔウイルスに関するドットブロット・ハイブリッド形成
（下記の実施例６）および先天的ＡａＩＴ−ウイルスに
関するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（下記の実施例
７）により、確認される。
伝子を含有しているということは、コドン最適化ＡａＩ
Ｔウイルスに関するドットブロット・ハイブリッド形成
（下記の実施例６）および先天的ＡａＩＴ−ウイルスに
関するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（下記の実施例
７）により、確認される。
【０１４７】実施例６ ドットブロット・ハイブリッド形成による組み換えウイ
ルスの確認 吸蔵−陰性ウイルス中のコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子の
存在を確認するために、実施例５からのウイルス−感染
Ｓｆ９細胞をＡａＩＴ遺伝子に特異的な放射標識ＤＮＡ
プローブにハイブリッド形成する核酸に関するドットブ
ロット・ハイブリッド形成により検定する。この方法の
ためには、ウイルス性Ｐ１株の透明化中に得られる細胞
ペレットをそれぞれ１ｍｌのダルベッコホスフェート緩
衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中に再懸濁させそして１００μ
ｌの部分試料をハイブリッド形成用に除去する。細胞を
エッペンドルフ遠心器中で最高速度で１５秒間にわたり
ペレット化しそして次に０.５ｍｌの０.５Ｍ ＮａＯＨ
中に溶解させる。室温における１０分後に、それぞれの
試料を５０μｌの１０Ｍ ＮＨ4ＯＨで中和する。９６ウ
エル・ドットブロット装置を用いて、１０〜１００μｌ
の溶解された細胞ペレットを、１Ｍ ＮＨ4ＯＨ、０.０
２Ｍ ＮａＯＨで平衡化されているニトロセルロース膜
（シュライヘル(Schleicher)およびシュエル(Schuell)
ＢＡ８５（キーン(Keene)、ＮＨ）上で直径が３ｍｍの
サークル中に通す。ブロット装置のウエルを次に０.５
ｍｌの１Ｍ ＮＨ4ＯＨ、０.０２Ｍ ＮａＯＨで洗浄す
る。フィルターを装置から除去し、ＳＳＰＥ（０.９Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１６.２５ｍＭ Ｎ
ａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で５回すすぎ、そして核酸
を真空炉の中で膜の上で８０℃において２−３時間にわ
たりベーキングする。使用前に、膜をポリハイブリッド
形成緩衝液（５×ＳＳＰＥ、５０（容量／容量）％のホ
ルムアミド、０.２％のＳＤＳ、５×デンハーズ（０.１
（重量／容量）％のポリビニルピロリドン、０.１（重
量／容量）％のフィコル４００TM（ファーマシアＬＫ
Ｂ、ピスカタウェイ、ニュージャージー）、０.１（重
量／容量）％の牛血清アルブミン）の中で４２℃におい
て一夜培養する。
ルスの確認 吸蔵−陰性ウイルス中のコドン最適化ＡａＩＴ遺伝子の
存在を確認するために、実施例５からのウイルス−感染
Ｓｆ９細胞をＡａＩＴ遺伝子に特異的な放射標識ＤＮＡ
プローブにハイブリッド形成する核酸に関するドットブ
ロット・ハイブリッド形成により検定する。この方法の
ためには、ウイルス性Ｐ１株の透明化中に得られる細胞
ペレットをそれぞれ１ｍｌのダルベッコホスフェート緩
衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中に再懸濁させそして１００μ
ｌの部分試料をハイブリッド形成用に除去する。細胞を
エッペンドルフ遠心器中で最高速度で１５秒間にわたり
ペレット化しそして次に０.５ｍｌの０.５Ｍ ＮａＯＨ
中に溶解させる。室温における１０分後に、それぞれの
試料を５０μｌの１０Ｍ ＮＨ4ＯＨで中和する。９６ウ
エル・ドットブロット装置を用いて、１０〜１００μｌ
の溶解された細胞ペレットを、１Ｍ ＮＨ4ＯＨ、０.０
２Ｍ ＮａＯＨで平衡化されているニトロセルロース膜
（シュライヘル(Schleicher)およびシュエル(Schuell)
ＢＡ８５（キーン(Keene)、ＮＨ）上で直径が３ｍｍの
サークル中に通す。ブロット装置のウエルを次に０.５
ｍｌの１Ｍ ＮＨ4ＯＨ、０.０２Ｍ ＮａＯＨで洗浄す
る。フィルターを装置から除去し、ＳＳＰＥ（０.９Ｍ
ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１６.２５ｍＭ Ｎ
ａＯＨ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で５回すすぎ、そして核酸
を真空炉の中で膜の上で８０℃において２−３時間にわ
たりベーキングする。使用前に、膜をポリハイブリッド
形成緩衝液（５×ＳＳＰＥ、５０（容量／容量）％のホ
ルムアミド、０.２％のＳＤＳ、５×デンハーズ（０.１
（重量／容量）％のポリビニルピロリドン、０.１（重
量／容量）％のフィコル４００TM（ファーマシアＬＫ
Ｂ、ピスカタウェイ、ニュージャージー）、０.１（重
量／容量）％の牛血清アルブミン）の中で４２℃におい
て一夜培養する。
【０１４８】コドン最適化ＡａＩＴ遺伝子構成に関する
ハイブリッド形成プローブは、オリゴヌクレオチドＥ１
およびＥ２（実施例２に記載されている）をアニーリン
グしそして次に32Ｐ−標識ｄＡＴＰ並びに未標識ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰの存在下でファージＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼを有する単独ストランド領域中に充填す
ることにより、製造される。放射標識付きプローブを加
熱により変性させ、そして次にハイブリッド形成緩衝液
（１００μｇ／ｍｌの共用されそして変性された鮭精子
ＤＮＡが補充されているプレハイドブリッド形成緩衝
液）の中で希釈する。膜をプローブ−含有ハイブリッド
形成緩衝液の中に入れ、そして３７℃において１６時間
にわたり培養する。ハイブリッド形成されていないプロ
ーブを次に４回の連続的な２０−３０分間の洗浄、すな
わち室温における２×ＳＳＰＥ、０.２％のＳＤＳ中で
の２回、および６５℃における０.２×ＳＳＰＥ、０.２
％のＳＤＳ中での２回、により除去する。過剰の流体を
膜から除去し、そして膜と結合されている放射活性をデ
ュポンのクロネックスTM（ウィルミントン、デラウェ
ア）のライトニング・プラス・インテンシファイング・
スクリーンの存在下でのコダックＸＡＲ医学用Ｘ線フィ
ルムを用いる自動放射写真により検出する。この検定を
用いて、試験した推定コドン最適化ＡａＩＴ−ウイルス
分離体の９３％でＡａＩＴ遺伝子の存在が確認される。
ハイブリッド形成プローブは、オリゴヌクレオチドＥ１
およびＥ２（実施例２に記載されている）をアニーリン
グしそして次に32Ｐ−標識ｄＡＴＰ並びに未標識ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰの存在下でファージＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼを有する単独ストランド領域中に充填す
ることにより、製造される。放射標識付きプローブを加
熱により変性させ、そして次にハイブリッド形成緩衝液
（１００μｇ／ｍｌの共用されそして変性された鮭精子
ＤＮＡが補充されているプレハイドブリッド形成緩衝
液）の中で希釈する。膜をプローブ−含有ハイブリッド
形成緩衝液の中に入れ、そして３７℃において１６時間
にわたり培養する。ハイブリッド形成されていないプロ
ーブを次に４回の連続的な２０−３０分間の洗浄、すな
わち室温における２×ＳＳＰＥ、０.２％のＳＤＳ中で
の２回、および６５℃における０.２×ＳＳＰＥ、０.２
％のＳＤＳ中での２回、により除去する。過剰の流体を
膜から除去し、そして膜と結合されている放射活性をデ
ュポンのクロネックスTM（ウィルミントン、デラウェ
ア）のライトニング・プラス・インテンシファイング・
スクリーンの存在下でのコダックＸＡＲ医学用Ｘ線フィ
ルムを用いる自動放射写真により検出する。この検定を
用いて、試験した推定コドン最適化ＡａＩＴ−ウイルス
分離体の９３％でＡａＩＴ遺伝子の存在が確認される。
【０１４９】実施例７ ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いる組み換えウイル
スの確認 推定先天的ＡａＩＴ組み換えウイルスが正確な寸法の挿
入体を含有していることを立証するために、ＡａＩＴ遺
伝子挿入体をフランキングしている２個の既知のマーカ
ー部位の間の距離を発芽ウイルスのＰＣＲ分析により測
定する。工程は、Ｂ.マリツシェク(Malitschek)および
Ｍ.シャルトル(Scahrtl)（３５）により記載されている
工程の変法である。この分析用のプライマーは、ＡｃＭ
ＮＰＶポリヘドリン遺伝子翻訳開始部位の８４〜１１０
塩基上流（５′−ＣＡＡＴＡＴＡＴＡＧＴＴ−ＧＣＴＧ
ＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＧ−３′、ＰＶＬ前進）および２
０５〜２２６塩基下流（５′−ＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＧ
ＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧ−３′、ＰＶＬ復帰）である。
スの確認 推定先天的ＡａＩＴ組み換えウイルスが正確な寸法の挿
入体を含有していることを立証するために、ＡａＩＴ遺
伝子挿入体をフランキングしている２個の既知のマーカ
ー部位の間の距離を発芽ウイルスのＰＣＲ分析により測
定する。工程は、Ｂ.マリツシェク(Malitschek)および
Ｍ.シャルトル(Scahrtl)（３５）により記載されている
工程の変法である。この分析用のプライマーは、ＡｃＭ
ＮＰＶポリヘドリン遺伝子翻訳開始部位の８４〜１１０
塩基上流（５′−ＣＡＡＴＡＴＡＴＡＧＴＴ−ＧＣＴＧ
ＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＧ−３′、ＰＶＬ前進）および２
０５〜２２６塩基下流（５′−ＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＧ
ＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＧ−３′、ＰＶＬ復帰）である。
【０１５０】分析用のウイルス試料を製造するために、
４μｌのそれぞれのＰ１株および対照としての野生型Ａ
ｃＭＮＰＶＥ２菌株の部分試料をそれぞれ、ジーンアン
プ管（パーキン−エルマー／セツス、ノルウォーク、コ
ネチカット）中で２００μｇ／ｍｌのストレプトマイセ
ス・グリセウス(Streptomyces griseus)からの非−特異
プロテアーゼが補充されている２１μｌの緩衝液Ａ（１
０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、４０ｍＭのＫ
Ｃｌ、０.１ｍｇ／ｍｌのゼラチン、０.４５（容量／容
量）％のノニデットTMＰ４０（シェル・オイル・カンパ
ニー）、０.４５（容量／容量）％のツイーンTM２０
（ＩＣＩアメリカズ））と混合する。それぞれの管を次
に単独サイクル３温度プログラム：（１）６０分間にわ
たる５５℃、（２）１２分間にわたる９５℃、および
（３）４℃におけるソーキング、で操作されているパー
キン−エルマー／セツスＤＮＡサーマルサイクラー中で
培養する。このプログラムの機能は、ウイルス性ＤＮＡ
を発芽ウイルスから遊離させそしてＰＣＲ増殖段階前に
プロナーゼを破壊する。
４μｌのそれぞれのＰ１株および対照としての野生型Ａ
ｃＭＮＰＶＥ２菌株の部分試料をそれぞれ、ジーンアン
プ管（パーキン−エルマー／セツス、ノルウォーク、コ
ネチカット）中で２００μｇ／ｍｌのストレプトマイセ
ス・グリセウス(Streptomyces griseus)からの非−特異
プロテアーゼが補充されている２１μｌの緩衝液Ａ（１
０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、４０ｍＭのＫ
Ｃｌ、０.１ｍｇ／ｍｌのゼラチン、０.４５（容量／容
量）％のノニデットTMＰ４０（シェル・オイル・カンパ
ニー）、０.４５（容量／容量）％のツイーンTM２０
（ＩＣＩアメリカズ））と混合する。それぞれの管を次
に単独サイクル３温度プログラム：（１）６０分間にわ
たる５５℃、（２）１２分間にわたる９５℃、および
（３）４℃におけるソーキング、で操作されているパー
キン−エルマー／セツスＤＮＡサーマルサイクラー中で
培養する。このプログラムの機能は、ウイルス性ＤＮＡ
を発芽ウイルスから遊離させそしてＰＣＲ増殖段階前に
プロナーゼを破壊する。
【０１５１】１×緩衝液Ａ、３.０ｍＭのＭｇＣｌ2、４
００μＭのｄＡＴＰ、４００μＭのｄＧＴＰ、４００μ
ＭのｄＣＴＰ、４００μＭのＴＴＰ、５０ｐモルのプラ
イマー１（ＰＶＬ前進）、５０ｐモルのプライマー２
（ＰＶＬ逆）を含有する２４.５μｌの溶液を加えるこ
とにより、それぞれの試料を増殖反応用に製造する。
０.５μｌ（２.５単位）のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラー
ゼ（パーキン−エルマー／セツス）を加えそして２５−
３５温度サイクルからなる熱サイクルプログラムを始め
ることによりＰＣＲを開始し、そこではそれぞれのサイ
クルは（１）９４℃における１分間、（２）５５℃にお
ける１.５分間、および（３）７２℃における２.５−
３.０分間からなっている。最後のサイクルでは、７２
℃における培養時間はさらに７分間延長され、そして試
料を次に４℃においてソーキングする。それぞれのＰＣ
Ｒ反応の部分試料を次にＤＮＡ寸法マーカーの適当なセ
ットの存在下でゲル電気泳動により分析する。
００μＭのｄＡＴＰ、４００μＭのｄＧＴＰ、４００μ
ＭのｄＣＴＰ、４００μＭのＴＴＰ、５０ｐモルのプラ
イマー１（ＰＶＬ前進）、５０ｐモルのプライマー２
（ＰＶＬ逆）を含有する２４.５μｌの溶液を加えるこ
とにより、それぞれの試料を増殖反応用に製造する。
０.５μｌ（２.５単位）のＡｍｐｌｉＴａｑポリメラー
ゼ（パーキン−エルマー／セツス）を加えそして２５−
３５温度サイクルからなる熱サイクルプログラムを始め
ることによりＰＣＲを開始し、そこではそれぞれのサイ
クルは（１）９４℃における１分間、（２）５５℃にお
ける１.５分間、および（３）７２℃における２.５−
３.０分間からなっている。最後のサイクルでは、７２
℃における培養時間はさらに７分間延長され、そして試
料を次に４℃においてソーキングする。それぞれのＰＣ
Ｒ反応の部分試料を次にＤＮＡ寸法マーカーの適当なセ
ットの存在下でゲル電気泳動により分析する。
【０１５２】この方法により試験された４種の推定先天
的ＡａＩＴ組み換えウイルスのそれぞれが単独ＰＣＲ生
成物を生成し、それの運動性は異なる試料間で同一であ
りそして増殖しようとする断片に関して４９３ｂｐの予
測寸法と同量である。この断片は遺伝子挿入体の部位を
フランキングするプライマーを含有する。同様に、野生
型ＡｃＭＮＰＶ菌株Ｅ２ウイルスを有する単独ＰＣＲ生
成物が得られ、そしてそれの運動性は３３７ｂｐの予測
寸法と良く合致する。
的ＡａＩＴ組み換えウイルスのそれぞれが単独ＰＣＲ生
成物を生成し、それの運動性は異なる試料間で同一であ
りそして増殖しようとする断片に関して４９３ｂｐの予
測寸法と同量である。この断片は遺伝子挿入体の部位を
フランキングするプライマーを含有する。同様に、野生
型ＡｃＭＮＰＶ菌株Ｅ２ウイルスを有する単独ＰＣＲ生
成物が得られ、そしてそれの運動性は３３７ｂｐの予測
寸法と良く合致する。
【０１５３】実施例８ ウイルス−感染細胞中のＲＮＡ水準の分析 コドン最適化ウイルスおよび先天的ＡａＩＴ−ウイルス
を感染させたＳｆ９細胞中でのＡａＩＴ遺伝子の発現
は、ウイルス−感染細胞から分離される合計細胞ＲＮＡ
のノザーンブロット分析により推定される。合計細胞Ｒ
ＮＡはチオシアン酸グアニジン／ＣｓＣｌ工程（３６、
３７）により分離される。
を感染させたＳｆ９細胞中でのＡａＩＴ遺伝子の発現
は、ウイルス−感染細胞から分離される合計細胞ＲＮＡ
のノザーンブロット分析により推定される。合計細胞Ｒ
ＮＡはチオシアン酸グアニジン／ＣｓＣｌ工程（３６、
３７）により分離される。
【０１５４】この工程では、Ｓｆ９細胞（１５０ｃｍ2
フラスコ中の５×１０7）にウイルスを５ＰＦＵ／細胞
のＭＯＩで感染させそして２７℃において２４時間にわ
たり培養する。細胞を次に遠心（ベックマンＧＰＲ遠心
器中で２０００ｒｐｍで１０分間）により収穫し、そし
て細胞ペレットを１０ｍｌの４Ｍチオシアン酸グアニジ
ン溶液（５０（重量／容量）％のチオシアン酸グアニジ
ン、０.５（重量／容量）％のＮ−ラウリルサルコシ
ン、０.７（容量／容量）％のβ−メルカプトエタノー
ル、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０））の
中に再懸濁させる。合計ＲＮＡを次に６０,０００ｒｐ
ｍで回転されているベックマン７０.１Ｔｉローター中
で５.７ＭのＣｓＣｌ、０.１ＭのＥＤＴＡパッドを通す
沈澱により４.５時間にわたり部分的に精製する。ＲＮ
Ａペレットを２ｍｌのＴＥＳ緩衝液（１０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ（ペレット７.５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１
（重量／容量）％のＳＤＳ）の中に再溶解させそして５
５℃において５−１０分間にわたり培養して試料の溶解
を助ける。溶液を次に０.１５ＭのＮａＣｌに調節しそ
して水を飽和させてあるフェノールで１回抽出する。水
相を除去しそして有機相を２ｍｌのＴＥＳ、０.１５Ｍ
のＮａＣｌで２回以上抽出する。次に水相を一緒にしそ
してＲＮＡをエタノールを用いて沈澱させる。ＲＮＡペ
レットを２ｍｌのＨ2Ｏ中に再溶解させ、そして４℃に
おいて等量の４ＭのＬｉＣｌを用いて再沈澱させる。ペ
レットを次に氷冷２ＭのＬｉＣｌで１回洗浄し、そして
０.５ｍｌのＨ2Ｏ中に再溶解させる。残存ＬｉＣｌを次
に１回の最終的なエタノール沈澱により除去しそして最
終的なペレットを０.２ｍｌのＨ2Ｏ中に再溶解させる。
ＲＮＡ収率は紫外線分光計により測定する。
フラスコ中の５×１０7）にウイルスを５ＰＦＵ／細胞
のＭＯＩで感染させそして２７℃において２４時間にわ
たり培養する。細胞を次に遠心（ベックマンＧＰＲ遠心
器中で２０００ｒｐｍで１０分間）により収穫し、そし
て細胞ペレットを１０ｍｌの４Ｍチオシアン酸グアニジ
ン溶液（５０（重量／容量）％のチオシアン酸グアニジ
ン、０.５（重量／容量）％のＮ−ラウリルサルコシ
ン、０.７（容量／容量）％のβ−メルカプトエタノー
ル、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０））の
中に再懸濁させる。合計ＲＮＡを次に６０,０００ｒｐ
ｍで回転されているベックマン７０.１Ｔｉローター中
で５.７ＭのＣｓＣｌ、０.１ＭのＥＤＴＡパッドを通す
沈澱により４.５時間にわたり部分的に精製する。ＲＮ
Ａペレットを２ｍｌのＴＥＳ緩衝液（１０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ（ペレット７.５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１
（重量／容量）％のＳＤＳ）の中に再溶解させそして５
５℃において５−１０分間にわたり培養して試料の溶解
を助ける。溶液を次に０.１５ＭのＮａＣｌに調節しそ
して水を飽和させてあるフェノールで１回抽出する。水
相を除去しそして有機相を２ｍｌのＴＥＳ、０.１５Ｍ
のＮａＣｌで２回以上抽出する。次に水相を一緒にしそ
してＲＮＡをエタノールを用いて沈澱させる。ＲＮＡペ
レットを２ｍｌのＨ2Ｏ中に再溶解させ、そして４℃に
おいて等量の４ＭのＬｉＣｌを用いて再沈澱させる。ペ
レットを次に氷冷２ＭのＬｉＣｌで１回洗浄し、そして
０.５ｍｌのＨ2Ｏ中に再溶解させる。残存ＬｉＣｌを次
に１回の最終的なエタノール沈澱により除去しそして最
終的なペレットを０.２ｍｌのＨ2Ｏ中に再溶解させる。
ＲＮＡ収率は紫外線分光計により測定する。
【０１５５】ノザーン分析のために、２０μｇのそれぞ
れのＲＮＡを２.７Ｍのホルムアルデヒド、４０ｍＭの
ＭＯＰＳ（４−モルホリンプロパンスルホン酸）（ｐＨ
７.０）、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＥ
ＤＴＡを含有する１％アガロースゲル上での電気泳動に
より寸法で分別する。ＲＮＡを次に毛管ブロット法によ
り２０×ＳＳＣ（３ＭのＮａＣｌ、０.３Ｍのクエン酸
ナトリウム、ＮａＯＨでｐＨ７.０に調節されている）
の存在下でニトロセルロース膜（シュレイヘルおよびシ
ュエルＢＡ８５）に移す。膜をハイブリッド形成緩衝液
（５０（容量／容量）％のホルムアミド、０.９ＭのＮ
ａＣｌ、５０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７.０）、５
ｍＭのＥＤＴＡ、０.１（重量／容量）％のＳＤＳ、４
×デンハーズ、０.４ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、０.２５ｍ
ｇ／ｍｌの牛胸腺）の中で短時間でプレハイブリッド形
成し、そして次に３′のすぐ次にある４６４ｂｐ Ｂａ
ｍ ＨＩ〜Ｋｐｎ Ｉ制限断片をＡｃＭＮＰＶポリヘドリ
ン遺伝子中のＡａＩＴ遺伝子挿入体の部位に対する不規
則的プライミング（３８）により製造される32Ｐ−標識
付きＤＮＡプローブを含有する同一緩衝液中で４２℃に
おいて１６時間にわたりハイブリッド形成する。ハイブ
リッド形成後に、結合されていないプローブを０.２５
×ＳＳＣ、０.１％のＳＤＳを用いる６５℃における４
回の連続的な３０分間にわたる洗浄により除去する。モ
レキュラー・ダイナミックス・フォスフォルイメージャ
ーTMを用いる自動放射写真を用いて膜と結合されている
プローブのデジタル化された像を作成し、そして個々の
帯をイメージクアントTMｖ３.１５ソフトウエア（モレ
キュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォ
ルニア）を用いて定量化する。
れのＲＮＡを２.７Ｍのホルムアルデヒド、４０ｍＭの
ＭＯＰＳ（４−モルホリンプロパンスルホン酸）（ｐＨ
７.０）、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＥ
ＤＴＡを含有する１％アガロースゲル上での電気泳動に
より寸法で分別する。ＲＮＡを次に毛管ブロット法によ
り２０×ＳＳＣ（３ＭのＮａＣｌ、０.３Ｍのクエン酸
ナトリウム、ＮａＯＨでｐＨ７.０に調節されている）
の存在下でニトロセルロース膜（シュレイヘルおよびシ
ュエルＢＡ８５）に移す。膜をハイブリッド形成緩衝液
（５０（容量／容量）％のホルムアミド、０.９ＭのＮ
ａＣｌ、５０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７.０）、５
ｍＭのＥＤＴＡ、０.１（重量／容量）％のＳＤＳ、４
×デンハーズ、０.４ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、０.２５ｍ
ｇ／ｍｌの牛胸腺）の中で短時間でプレハイブリッド形
成し、そして次に３′のすぐ次にある４６４ｂｐ Ｂａ
ｍ ＨＩ〜Ｋｐｎ Ｉ制限断片をＡｃＭＮＰＶポリヘドリ
ン遺伝子中のＡａＩＴ遺伝子挿入体の部位に対する不規
則的プライミング（３８）により製造される32Ｐ−標識
付きＤＮＡプローブを含有する同一緩衝液中で４２℃に
おいて１６時間にわたりハイブリッド形成する。ハイブ
リッド形成後に、結合されていないプローブを０.２５
×ＳＳＣ、０.１％のＳＤＳを用いる６５℃における４
回の連続的な３０分間にわたる洗浄により除去する。モ
レキュラー・ダイナミックス・フォスフォルイメージャ
ーTMを用いる自動放射写真を用いて膜と結合されている
プローブのデジタル化された像を作成し、そして個々の
帯をイメージクアントTMｖ３.１５ソフトウエア（モレ
キュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォ
ルニア）を用いて定量化する。
【０１５６】図４は、野生型ＡｃＭＮＰＶ（「野生型」
と標識が付けられている）並びにコドン最適化（特異的
な異種シグナル配列と標識が付けられている）および先
天的（ｇｒｐ ＩＩＩ ＡａＩＴと標識が付けられてい
る）組み換えウイルスを感染させてあるＳｆ９細胞中の
ＡａＩＴ／ポリヘドリンＲＮＡ水準の分析をまとめてい
る。ポリヘドリン−含有ＲＮＡの一種だけがそれぞれの
試料中で検出され、そして全てがポリヘドリンの構造ま
たはウイルス中に存在しているＡａＩＴ／ポリヘドリン
遺伝子の構造体に関して適切な寸法を有する。コドン最
適化ＡａＩＴ−ウイルス−感染細胞中で検出されるＡａ
ＩＴ／ポリヘドリンＲＮＡの量は野生型ＡｃＭＮＰＶ−
感染細胞中で集計されるポリヘドリンＲＮＡの水準の４
５−６７％の範囲である。先天的ＡａＩＴ−ウイルス−
感染細胞に関する対応する値は３０％である。この分析
は、ＡａＩＴ／ポリヘドリン遺伝子が正確に利用されそ
してＡａＩＴ−ウイルス−感染Ｓｆ９細胞中で高活性で
あることを示している。
と標識が付けられている）並びにコドン最適化（特異的
な異種シグナル配列と標識が付けられている）および先
天的（ｇｒｐ ＩＩＩ ＡａＩＴと標識が付けられてい
る）組み換えウイルスを感染させてあるＳｆ９細胞中の
ＡａＩＴ／ポリヘドリンＲＮＡ水準の分析をまとめてい
る。ポリヘドリン−含有ＲＮＡの一種だけがそれぞれの
試料中で検出され、そして全てがポリヘドリンの構造ま
たはウイルス中に存在しているＡａＩＴ／ポリヘドリン
遺伝子の構造体に関して適切な寸法を有する。コドン最
適化ＡａＩＴ−ウイルス−感染細胞中で検出されるＡａ
ＩＴ／ポリヘドリンＲＮＡの量は野生型ＡｃＭＮＰＶ−
感染細胞中で集計されるポリヘドリンＲＮＡの水準の４
５−６７％の範囲である。先天的ＡａＩＴ−ウイルス−
感染細胞に関する対応する値は３０％である。この分析
は、ＡａＩＴ／ポリヘドリン遺伝子が正確に利用されそ
してＡａＩＴ−ウイルス−感染Ｓｆ９細胞中で高活性で
あることを示している。
【０１５７】実施例９ ウイルス−感染Ｓｆ９細胞中での生物学的に活性なＡａ
ＩＴの製造 １ｎｇ以上をサルコファガ・アルギロストマ(Sarcophag
a argyrostoma)（フレッシュフライ）幼虫（３９）の側
背部分中に注射する時に、ＡａＩＴが急性の興奮性麻痺
（収縮）を引き起こす。ムスカ・ドメスチカ（イエハ
エ）の幼虫を用いる同様な検定を使用して、検出可能量
（１ｎｇ）の生物学的に活性なＡａＩＴが培養媒体中ま
たはコドン最適化ＡａＩＴウイルス性Ｐ１株の製造中に
得られる細胞ペレット中のいずれかに存在しているかど
うかを決定する。
ＩＴの製造 １ｎｇ以上をサルコファガ・アルギロストマ(Sarcophag
a argyrostoma)（フレッシュフライ）幼虫（３９）の側
背部分中に注射する時に、ＡａＩＴが急性の興奮性麻痺
（収縮）を引き起こす。ムスカ・ドメスチカ（イエハ
エ）の幼虫を用いる同様な検定を使用して、検出可能量
（１ｎｇ）の生物学的に活性なＡａＩＴが培養媒体中ま
たはコドン最適化ＡａＩＴウイルス性Ｐ１株の製造中に
得られる細胞ペレット中のいずれかに存在しているかど
うかを決定する。
【０１５８】培養媒体を検定するために、２−６μｌの
それぞれのＰ１株（６００−１０００細胞当量／μｌ）
をムスカ・ドメスチカ幼虫の側背部分中に２６ゲージ針
が備えられているハミルトン注射器を用いて注射する。
幼虫を注射から５分後に体節の不随意的収縮の兆候に関
して試験する。それぞれのウイルスに対して５匹の幼虫
を検定する。
それぞれのＰ１株（６００−１０００細胞当量／μｌ）
をムスカ・ドメスチカ幼虫の側背部分中に２６ゲージ針
が備えられているハミルトン注射器を用いて注射する。
幼虫を注射から５分後に体節の不随意的収縮の兆候に関
して試験する。それぞれのウイルスに対して５匹の幼虫
を検定する。
【０１５９】細胞ペレット中のＡａＩＴ活性を検定する
ために、ウイルス−感染Ｓｆ９細胞を遠心により１回洗
浄し、そしてダルベッコホスフェート緩衝食塩水（Ｄ−
ＰＢＳ）中で１マイクロリットル当たり３０,０００個
の細胞の密度で再懸濁させる。２マイクロリットルの凍
結／解凍溶解産物（すなわち、６０,０００細胞当量）
を次にムスカ・ドメスチカ幼虫に上記の如く注射しそし
て体節の急性収縮に関して試験する。
ために、ウイルス−感染Ｓｆ９細胞を遠心により１回洗
浄し、そしてダルベッコホスフェート緩衝食塩水（Ｄ−
ＰＢＳ）中で１マイクロリットル当たり３０,０００個
の細胞の密度で再懸濁させる。２マイクロリットルの凍
結／解凍溶解産物（すなわち、６０,０００細胞当量）
を次にムスカ・ドメスチカ幼虫に上記の如く注射しそし
て体節の急性収縮に関して試験する。
【０１６０】下表は、インターロイキン−２シグナル−
ＡａＩＴ−ウイルス変異体（フレームシフト変異体）お
よび３種の異種シグナル−コドン最適化ＡａＩＴ−ウイ
ルス分離体を用いて得られる結果をまとめている。生物
学的に活性なＡａＩＴはこの検定で試験されたいずれの
Ｐ１株（細胞培養上澄み液）中でも検出されず、そのこ
とは活性毒素の濃度は上澄み液中では０.２ｎｇ／μｌ
以下の範囲であることを示している。対照的に、１７種
の細胞ペレット溶解産物の中の１３種ではＡａＩＴが容
易に検出される。４種の陰性溶解産物の中の３種は、領
域を暗号化する毒素遺伝子中の位置２６５におけるフレ
ームシフト変異を含有する変異体ＩＬ２−ＡａＩＴ−ウ
イルス単離体から誘導される。他の陰性は、ＡａＩＴ遺
伝子挿入体に関するドットブロット・ハイブリッド形成
により陰性分離体Ｔ９.４.１（推定クチクラ−ＡａＩ
Ｔ）を用いて得られる。他の４種の推定クチクラ−Ａａ
ＩＴ構成体は陽性結果を与え、エステラーゼ−６−Ａａ
ＩＴおよび脂肪運動ホルモン−ＡａＩＴ構成体の９種全
部もそうである。
ＡａＩＴ−ウイルス変異体（フレームシフト変異体）お
よび３種の異種シグナル−コドン最適化ＡａＩＴ−ウイ
ルス分離体を用いて得られる結果をまとめている。生物
学的に活性なＡａＩＴはこの検定で試験されたいずれの
Ｐ１株（細胞培養上澄み液）中でも検出されず、そのこ
とは活性毒素の濃度は上澄み液中では０.２ｎｇ／μｌ
以下の範囲であることを示している。対照的に、１７種
の細胞ペレット溶解産物の中の１３種ではＡａＩＴが容
易に検出される。４種の陰性溶解産物の中の３種は、領
域を暗号化する毒素遺伝子中の位置２６５におけるフレ
ームシフト変異を含有する変異体ＩＬ２−ＡａＩＴ−ウ
イルス単離体から誘導される。他の陰性は、ＡａＩＴ遺
伝子挿入体に関するドットブロット・ハイブリッド形成
により陰性分離体Ｔ９.４.１（推定クチクラ−ＡａＩ
Ｔ）を用いて得られる。他の４種の推定クチクラ−Ａａ
ＩＴ構成体は陽性結果を与え、エステラーゼ−６−Ａａ
ＩＴおよび脂肪運動ホルモン−ＡａＩＴ構成体の９種全
部もそうである。
【０１６１】
【表２２】
【０１６２】実施例１０ 幼虫への注射によるウイルス性能の分析 ＡａＩＴ遺伝子の挿入体がＡｃＭＮＰＶ性能を強化する
かどうかを試験するために、コドン最適化クチクラ−Ａ
ａＩＴからおよびＡａＩＴ遺伝子のないＡｃＭＮＰＶの
野生型Ｅ２菌株から製造された発芽ウイルスを第４齢中
のヘリオシス・ヴィレセンス(Heliothis virescens)
（タバコ・バッド・ウォーム）幼虫への注射により生物
学的に検定する。それぞれのウイルスをＭ.Ｄ.サマーズ
およびＧ.Ｅ.スミス（２５）により記載されているよう
なプラーク検定方法により滴定し、そして次に０.５
（容量／容量）％の赤色染料番号５が補充されているＴ
ＮＭ−ＦＨ媒体中で２×１０7、２×１０6、および２×
１０5ＰＦＵ／ｍｌに希釈する。それぞれの幼虫を二酸
化炭素を用いて２−５分間にわたり麻酔をかけ、そして
次に２６ゲージ針が備えられているハミルトン注射器を
用いて０.５μｌの希釈されたウイルスを注射する。針
を最後の２本の前足の間に縦に挿入しそして次に注射前
に２〜３個の体節に前方に移動させる。注射後に、それ
ぞれの幼虫を染料−着色された血リンパの放出に関して
検査しそして試料損失が明らかであるかまたは疑われる
なら廃棄される。幼虫を次に２７℃において被覆された
４ｃｍ2の飼料細胞（１個の細胞当たり１匹の幼虫）の
中に保ちそして１日に２−３回死亡または生存に関して
検査する。背中に曲げた後に０.５−２分以内に自身で
直せないなら、その個体は瀕死であると記録される。
かどうかを試験するために、コドン最適化クチクラ−Ａ
ａＩＴからおよびＡａＩＴ遺伝子のないＡｃＭＮＰＶの
野生型Ｅ２菌株から製造された発芽ウイルスを第４齢中
のヘリオシス・ヴィレセンス(Heliothis virescens)
（タバコ・バッド・ウォーム）幼虫への注射により生物
学的に検定する。それぞれのウイルスをＭ.Ｄ.サマーズ
およびＧ.Ｅ.スミス（２５）により記載されているよう
なプラーク検定方法により滴定し、そして次に０.５
（容量／容量）％の赤色染料番号５が補充されているＴ
ＮＭ−ＦＨ媒体中で２×１０7、２×１０6、および２×
１０5ＰＦＵ／ｍｌに希釈する。それぞれの幼虫を二酸
化炭素を用いて２−５分間にわたり麻酔をかけ、そして
次に２６ゲージ針が備えられているハミルトン注射器を
用いて０.５μｌの希釈されたウイルスを注射する。針
を最後の２本の前足の間に縦に挿入しそして次に注射前
に２〜３個の体節に前方に移動させる。注射後に、それ
ぞれの幼虫を染料−着色された血リンパの放出に関して
検査しそして試料損失が明らかであるかまたは疑われる
なら廃棄される。幼虫を次に２７℃において被覆された
４ｃｍ2の飼料細胞（１個の細胞当たり１匹の幼虫）の
中に保ちそして１日に２−３回死亡または生存に関して
検査する。背中に曲げた後に０.５−２分以内に自身で
直せないなら、その個体は瀕死であると記録される。
【０１６３】図５は、ヘリオシス・ヴィレセンス幼虫に
１０2、１０3および１０4ＰＦＵのそれぞれのウイルス
を注射する時に得られる結果をまとめている。それぞれ
のウイルス投与量に関して４８匹の幼虫が使用される。
８０匹の昆虫（「ウイルスなし」）にはＴＮＭ−ＦＨだ
けを陰性対照として注射する。結果は、試験した投与量
のそれぞれにおいてクチクラ−コドン−ＡｃＭＮＰＶは
それの宿主を野生型ＡｃＭＮＰＶより早く死亡させるこ
とを示している。１０4ＰＦＵにおいては、野生型ウイ
ルスに関するＬＴ50は約９７時間であるが、クチクラ−
ＡａＩＴＡｃＭＮＰＶに関する対応するＬＴ50は約６７
時間である。さらに、野生型ＡｃＭＮＰＶ以外のクチク
ラ−ＡａＩＴを感染させた事実上全ての対応する幼虫は
死亡前に収縮性麻痺にかかる。この結果は、ＡａＩＴ遺
伝子およびクチクラシグナル配列のＡｃＭＮＰＶ中への
挿入体が生物学的に活性な毒素の発現により死亡速度を
促進させることを示している。
１０2、１０3および１０4ＰＦＵのそれぞれのウイルス
を注射する時に得られる結果をまとめている。それぞれ
のウイルス投与量に関して４８匹の幼虫が使用される。
８０匹の昆虫（「ウイルスなし」）にはＴＮＭ−ＦＨだ
けを陰性対照として注射する。結果は、試験した投与量
のそれぞれにおいてクチクラ−コドン−ＡｃＭＮＰＶは
それの宿主を野生型ＡｃＭＮＰＶより早く死亡させるこ
とを示している。１０4ＰＦＵにおいては、野生型ウイ
ルスに関するＬＴ50は約９７時間であるが、クチクラ−
ＡａＩＴＡｃＭＮＰＶに関する対応するＬＴ50は約６７
時間である。さらに、野生型ＡｃＭＮＰＶ以外のクチク
ラ−ＡａＩＴを感染させた事実上全ての対応する幼虫は
死亡前に収縮性麻痺にかかる。この結果は、ＡａＩＴ遺
伝子およびクチクラシグナル配列のＡｃＭＮＰＶ中への
挿入体が生物学的に活性な毒素の発現により死亡速度を
促進させることを示している。
【０１６４】実施例１１ 幼虫への注射によるウイルス性能の別の分析 初期第４齢のヘリオシス・ヴィレセンス幼虫の別群に、
ＡａＩＴ遺伝子なしのＡｃＭＮＰＶの野生型Ｅ２菌株、
先天的ＡａＩＴシグナル−先天的ＡａＩＴ遺伝子−Ａｃ
ＭＮＰＶ構成体、または７種のコドン最適化異種シグナ
ル−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成の中の１種から製造さ
れた１０4ＰＦＵの発芽ウイルスを注射することによ
り、実施例１０の工程を繰り返す。１種のウイルスが３
２匹の幼虫に投与される。３回の別個の検定が行われ
る。注射理由により損傷された幼虫は分析には含まれて
いない。データを集め、そして結果を下表に示す。
ＡａＩＴ遺伝子なしのＡｃＭＮＰＶの野生型Ｅ２菌株、
先天的ＡａＩＴシグナル−先天的ＡａＩＴ遺伝子−Ａｃ
ＭＮＰＶ構成体、または７種のコドン最適化異種シグナ
ル−ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰＶ構成の中の１種から製造さ
れた１０4ＰＦＵの発芽ウイルスを注射することによ
り、実施例１０の工程を繰り返す。１種のウイルスが３
２匹の幼虫に投与される。３回の別個の検定が行われ
る。注射理由により損傷された幼虫は分析には含まれて
いない。データを集め、そして結果を下表に示す。
【０１６５】
【表２３】
【０１６６】表において、「ｎ」は３回の検定からの幼
虫の合計数を表しており、「Ｎ／Ａ」は適用不能を意味
し、そして「Ｌ１（９５％）」および「Ｌ２（９５
％）」は検定が等数の幼虫を用いて再試験される場合に
９５％の信頼水準となってＬ１およびＬ２に示されてい
る値以内に入るであろうデータの信頼限度を表してい
る。結果は、コドン最適化異種シグナル−ＡａＩＴ−Ａ
ｃＭＮＰＶ構成体（並びに先天的ＡａＩＴシグナル−先
天的ＡａＩＴ遺伝子−ＡｃＭＮＰＶ構成体）のそれぞれ
がそれの宿主を野生型ＡｃＭＮＰＶより早く死亡させる
ことを示している。野生型ウイルスに関するＬＴ50は約
１２６時間であるが、７種の異種シグナルＡａＩＴ−Ａ
ｃＭＮＰＶ構成体に関する対応するＬＴ50は約６８−８
９時間の範囲でありそして先天的ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰ
Ｖ構成体は約７４時間のＬＴ50を有する。これらの結果
は、ＡａＩＴ遺伝子および異種シグナル配列のＡｃＭＮ
ＰＶ中への挿入が生物学的に活性な毒素の発現により死
亡速度を促進させるという実施例１０の結果を確認する
ものである。
虫の合計数を表しており、「Ｎ／Ａ」は適用不能を意味
し、そして「Ｌ１（９５％）」および「Ｌ２（９５
％）」は検定が等数の幼虫を用いて再試験される場合に
９５％の信頼水準となってＬ１およびＬ２に示されてい
る値以内に入るであろうデータの信頼限度を表してい
る。結果は、コドン最適化異種シグナル−ＡａＩＴ−Ａ
ｃＭＮＰＶ構成体（並びに先天的ＡａＩＴシグナル−先
天的ＡａＩＴ遺伝子−ＡｃＭＮＰＶ構成体）のそれぞれ
がそれの宿主を野生型ＡｃＭＮＰＶより早く死亡させる
ことを示している。野生型ウイルスに関するＬＴ50は約
１２６時間であるが、７種の異種シグナルＡａＩＴ−Ａ
ｃＭＮＰＶ構成体に関する対応するＬＴ50は約６８−８
９時間の範囲でありそして先天的ＡａＩＴ−ＡｃＭＮＰ
Ｖ構成体は約７４時間のＬＴ50を有する。これらの結果
は、ＡａＩＴ遺伝子および異種シグナル配列のＡｃＭＮ
ＰＶ中への挿入が生物学的に活性な毒素の発現により死
亡速度を促進させるという実施例１０の結果を確認する
ものである。
【０１６７】実施例１２ ウイルス多面体中での野生型および吸蔵−陰性組み換え
ウイルスの共−吸蔵 組み換えＡａＩＴ−ウイルスはポリヘドリンの製造用に
はないため、Ｓｆ９細胞に組み換えＡａＩＴ−ウイルス
および野生型ヘルパーウイルス（すなわち、ＡｃＭＮＰ
ＶのＥ２菌株）を共−感染させることにより野生型およ
び組み換えウイルス粒子の混合物を含有する多面体を製
造する。共−感染用に使用するそれぞれのウイルス量を
決定するために、２×１０7個のＳｆ９細胞を１５０ｃ
ｍ2のフラスコ中に接種し、そして種々の量の野生型お
よび組み換えウイルスをそれぞれ１個の細胞当たり少な
くとも１プラーク生成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（Ｍ
ＯＩ）で感染させる。４日後に、細胞を計数しそして細
胞核中に明らかに認識可能なウイルス吸蔵体を有する細
胞の百分率を顕微鏡観察により測定する。０.２％のト
リトンＸ−１００および２（重量／容量）％のＳＤＳで
処理された試料中で多面体を計測することにより、麻痺
の合計数も測定される。野生型Ｅ２ＡｃＭＮＰＶおよび
クチクラ−ＡａＩＴ組み換えＡｃＭＮＰＶの共−吸蔵体
を含むそのような一分析の結果が下表にまとめられてい
る。
ウイルスの共−吸蔵 組み換えＡａＩＴ−ウイルスはポリヘドリンの製造用に
はないため、Ｓｆ９細胞に組み換えＡａＩＴ−ウイルス
および野生型ヘルパーウイルス（すなわち、ＡｃＭＮＰ
ＶのＥ２菌株）を共−感染させることにより野生型およ
び組み換えウイルス粒子の混合物を含有する多面体を製
造する。共−感染用に使用するそれぞれのウイルス量を
決定するために、２×１０7個のＳｆ９細胞を１５０ｃ
ｍ2のフラスコ中に接種し、そして種々の量の野生型お
よび組み換えウイルスをそれぞれ１個の細胞当たり少な
くとも１プラーク生成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（Ｍ
ＯＩ）で感染させる。４日後に、細胞を計数しそして細
胞核中に明らかに認識可能なウイルス吸蔵体を有する細
胞の百分率を顕微鏡観察により測定する。０.２％のト
リトンＸ−１００および２（重量／容量）％のＳＤＳで
処理された試料中で多面体を計測することにより、麻痺
の合計数も測定される。野生型Ｅ２ＡｃＭＮＰＶおよび
クチクラ−ＡａＩＴ組み換えＡｃＭＮＰＶの共−吸蔵体
を含むそのような一分析の結果が下表にまとめられてい
る。
【０１６８】
【表２４】 ──────────────────────────────────── 培養 ＭＯＩ 合計細胞 吸蔵体のある 合計多面体 １個の細胞当 番号 [重量:切断-AaIT] ×107 細胞の百分率 ×108 たりの多面体 ──────────────────────────────────── 1 10:0 2.15 94% 4.10 19.0 ──────────────────────────────────── 2 10:1 1.85 92% 3.65 19.7 ──────────────────────────────────── 3 10:2 2.30 89% 3.30 14.3 ──────────────────────────────────── 4 5:5 1.85 74% 2.15 11.6 ──────────────────────────────────── 5 2:10 2.00 36% 0.55 2.75 ──────────────────────────────────── 6 2:20 2.10 23% 0.12 0.57 ──────────────────────────────────── これらの結果は、野生型ウイルスのＭＯＩが１個の細胞
当たり少なくとも２ＰＦＵである時でさえウイルス多面
体（吸蔵体）を有する細胞の百分率および１個の細胞当
たりの多面体の平均数は組み換えウイルスのＭＯＩが増
加するにつれて相当減少することを示している。１個の
多面体当たりの組み換えウイルス粒子の大部分を多面体
の収率における許容不能な犠牲なしに保つために、全て
のその後の共−吸蔵実験はウイルス（すなわち野生型お
よび吸蔵−陰性組み換え）の両者を用いてそれぞれ３の
ＭＯＩで行われる。
当たり少なくとも２ＰＦＵである時でさえウイルス多面
体（吸蔵体）を有する細胞の百分率および１個の細胞当
たりの多面体の平均数は組み換えウイルスのＭＯＩが増
加するにつれて相当減少することを示している。１個の
多面体当たりの組み換えウイルス粒子の大部分を多面体
の収率における許容不能な犠牲なしに保つために、全て
のその後の共−吸蔵実験はウイルス（すなわち野生型お
よび吸蔵−陰性組み換え）の両者を用いてそれぞれ３の
ＭＯＩで行われる。
【０１６９】実施例１３ 野生型ＡｃＭＮＰＶと共に多面体中に共−吸蔵されてい
るコドン最適化および先天的配列組み換えＡａＩＴ−ウ
イルスの経口的活性を測定するための小滴生物学的検定 ＩＴを暗号化するコドン最適化または先天的配列を含有
する組み換えＡｃＭＮＰＶの経口的毒性を試験するため
に、それぞれのウイルス（検定されなかったＩＬ−２／
ＡａＩＴ組み換えを除く）を野生型ＡｃＭＮＰＶと共に
ウイルス性多面体（実施例１２参照）の中に共−吸蔵さ
せ、そして下記の如き小滴生物学的検定工程を用いて第
２齢ヘリオシス・ヴィレッセンス幼虫に供する。個々の
第２齢ヘリオシス・ヴィレッセンス幼虫をあらかじめ湿
らされている円形濾紙を含有する空の検定ウエルの中に
移す。幼虫を次に２６℃、５０％相対的湿度において１
２〜２０時間（一夜）にわたり保つ。
るコドン最適化および先天的配列組み換えＡａＩＴ−ウ
イルスの経口的活性を測定するための小滴生物学的検定 ＩＴを暗号化するコドン最適化または先天的配列を含有
する組み換えＡｃＭＮＰＶの経口的毒性を試験するため
に、それぞれのウイルス（検定されなかったＩＬ−２／
ＡａＩＴ組み換えを除く）を野生型ＡｃＭＮＰＶと共に
ウイルス性多面体（実施例１２参照）の中に共−吸蔵さ
せ、そして下記の如き小滴生物学的検定工程を用いて第
２齢ヘリオシス・ヴィレッセンス幼虫に供する。個々の
第２齢ヘリオシス・ヴィレッセンス幼虫をあらかじめ湿
らされている円形濾紙を含有する空の検定ウエルの中に
移す。幼虫を次に２６℃、５０％相対的湿度において１
２〜２０時間（一夜）にわたり保つ。
【０１７０】翌日に、１５ｍｌのストーンヴィル昆虫飼
料（４０）部分試料を加熱沸騰させる。５ｍｌの水を溶
融飼料に加える。この混合物を再び加熱沸騰させ、そし
て直ちに低速で遠心する。上澄み液を除去しそして２、
３滴の食品染料を透明な上澄み液に飼料の視覚化助剤と
して加える。溶融飼料をマイクロフュージ管の中で部分
試料とし、ベックマンマイクロフュージ中で再回転さ
せ、そして透明になった上澄み液を新しいマイクロフュ
ージ管の中に移す。この溶融飼料を必要となるまで遮熱
器の中に入れておく。
料（４０）部分試料を加熱沸騰させる。５ｍｌの水を溶
融飼料に加える。この混合物を再び加熱沸騰させ、そし
て直ちに低速で遠心する。上澄み液を除去しそして２、
３滴の食品染料を透明な上澄み液に飼料の視覚化助剤と
して加える。溶融飼料をマイクロフュージ管の中で部分
試料とし、ベックマンマイクロフュージ中で再回転さ
せ、そして透明になった上澄み液を新しいマイクロフュ
ージ管の中に移す。この溶融飼料を必要となるまで遮熱
器の中に入れておく。
【０１７１】飼料が５４℃に冷えた後に、希望量のＰＩ
Ｂを加える。典型的には、これはμｌ当たり１０〜２５
０ＦＩＢの範囲である。良く混合した後に、１μｌの処
理された試料滴をパラフィルムTM（アメリカン・ナショ
ナル・キャン、グリーンウィッヒ、コネチカット）の上
で部分試料とすると、そこでそれらは硬化する。硬化し
た滴を個別幼虫を含有しているウエルに、１匹の幼虫当
たり１滴ずつ、急いで移す。幼虫は２時間にわたり飼料
が与えられ、そして全部の小滴を消費する幼虫を標準量
の未処理のストーンヴィル飼料を含有する新しい検定ウ
エルの中に入れる。次に幼虫を２６℃、５０％相対的湿
度に入れ、そして１日に２回麻痺および死亡に関して監
視する。幼虫を背中の上に曲げそして３０秒間観察する
ことにより、麻痺が測定される。幼虫が背中の上にある
ままなら、それは瀕死であると考えられる。瀕死の幼虫
は一般的には診断後２４時間内に死亡する。試験期間は
一般的に８日間である。
Ｂを加える。典型的には、これはμｌ当たり１０〜２５
０ＦＩＢの範囲である。良く混合した後に、１μｌの処
理された試料滴をパラフィルムTM（アメリカン・ナショ
ナル・キャン、グリーンウィッヒ、コネチカット）の上
で部分試料とすると、そこでそれらは硬化する。硬化し
た滴を個別幼虫を含有しているウエルに、１匹の幼虫当
たり１滴ずつ、急いで移す。幼虫は２時間にわたり飼料
が与えられ、そして全部の小滴を消費する幼虫を標準量
の未処理のストーンヴィル飼料を含有する新しい検定ウ
エルの中に入れる。次に幼虫を２６℃、５０％相対的湿
度に入れ、そして１日に２回麻痺および死亡に関して監
視する。幼虫を背中の上に曲げそして３０秒間観察する
ことにより、麻痺が測定される。幼虫が背中の上にある
ままなら、それは瀕死であると考えられる。瀕死の幼虫
は一般的には診断後２４時間内に死亡する。試験期間は
一般的に８日間である。
【０１７２】幼虫を１日に２〜３回検査しそして生存お
よび死亡の兆候に関して記録する。死亡および瀕死の両
者の幼虫は処理に対応して記録される。図６−１５はそ
れぞれのウイルスを用いて得られた結果をまとめてい
る。
よび死亡の兆候に関して記録する。死亡および瀕死の両
者の幼虫は処理に対応して記録される。図６−１５はそ
れぞれのウイルスを用いて得られた結果をまとめてい
る。
【０１７３】１個の例外を除いて全ての組み換えウイル
スは野生型ＡｃＭＮＰＶ（これはＡａＩＴ遺伝子が欠け
ている）より早い応答開始を示す。例外はＡａＩＴを暗
号化するコドン最適化ｃＤＮＡと結合されているｐＢＭ
ＨＰＣ−１２シグナル配列を含有するＡｃＭＮＰＶ構成
であり、それは野生型ＡｃＭＮＰＶと大体同じように機
能する。多面体中および感染昆虫中の野生型対組み換え
ウイルスの実際の比は分析されていない。
スは野生型ＡｃＭＮＰＶ（これはＡａＩＴ遺伝子が欠け
ている）より早い応答開始を示す。例外はＡａＩＴを暗
号化するコドン最適化ｃＤＮＡと結合されているｐＢＭ
ＨＰＣ−１２シグナル配列を含有するＡｃＭＮＰＶ構成
であり、それは野生型ＡｃＭＮＰＶと大体同じように機
能する。多面体中および感染昆虫中の野生型対組み換え
ウイルスの実際の比は分析されていない。
【０１７４】文献目録 １．トマルスキイ(Tomalski),M.D.およびミラー(Mille
r),L.K.、ネーチャー(Nature)、３５２、８２−８５
（１９９１）。
r),L.K.、ネーチャー(Nature)、３５２、８２−８５
（１９９１）。
【０１７５】２．フェデリシ(Federici),B.A.、イン・
ヴィトロ(In Vitro)、２８、５０Ａ（１９９２）。
ヴィトロ(In Vitro)、２８、５０Ａ（１９９２）。
【０１７６】３．マルテンス(Martens),J.W.M.他、App.
& Envir. Microbiology、５６、２７６４−２７７０
（１９９０）。
& Envir. Microbiology、５６、２７６４−２７７０
（１９９０）。
【０１７７】４．ルコフ(Luckow),V.A.およびサマーズ
(Summers),M.D.、バイオ／テクノロジー(Bio/Technolog
y)、６、４７−５３（１９８８）。
(Summers),M.D.、バイオ／テクノロジー(Bio/Technolog
y)、６、４７−５３（１９８８）。
【０１７８】５．ミラー(Miller),L.K.、Ann. Rev. Mic
robiol.、 ４２、１７７−１９９（１９８８）。
robiol.、 ４２、１７７−１９９（１９８８）。
【０１７９】６．スミス(Smith),G.E.およびサマーズ,
M.D.、米国特許番号４,７４５,０５１。
M.D.、米国特許番号４,７４５,０５１。
【０１８０】７．グラナドス(Granados),R.R.およびフ
ェデリシ,B.A.、ザ・バイオロジー・オブ・バキュロウ
イルセス(The Biology of Baculoviruses)、Ｉ、９９
（１９８６）。
ェデリシ,B.A.、ザ・バイオロジー・オブ・バキュロウ
イルセス(The Biology of Baculoviruses)、Ｉ、９９
（１９８６）。
【０１８１】８．グランタム(Grantham),R.他、Nucl. A
cids Res.、８、４９−６２（１９８０）。
cids Res.、８、４９−６２（１９８０）。
【０１８２】９．グランタム,R.他、Nucl. Acids Re
s.、９、４３−７４（１９８１）。
s.、９、４３−７４（１９８１）。
【０１８３】１０．マロヤマ(Maroyama),T.他、Nucl. A
cids Res.、１４、１５１−１９７（１９８６）。
cids Res.、１４、１５１−１９７（１９８６）。
【０１８４】１１．アオタ(Aota),S.他、Nucl. Acids R
es.、１６、３１５−４０２（１９８８）。
es.、１６、３１５−４０２（１９８８）。
【０１８５】１２．ワダ(Wada),K.他、Nucl. Acids Re
s.、１９補、１９８１−１９８５（１９９１）。
s.、１９補、１９８１−１９８５（１９９１）。
【０１８６】１３．カーランド(Kurland),C.G.、ＦＥＢ
Ｓレターズ(FEBS Letters)、２８５、１６５−１６９
（１９９１）。
Ｓレターズ(FEBS Letters)、２８５、１６５−１６９
（１９９１）。
【０１８７】１４．ペダーセン(Pedersen),S.、ＥＭＢ
Ｏジャーナル(EMBO J.)、３、２８９５−２８９８（１
９８４）。
Ｏジャーナル(EMBO J.)、３、２８９５−２８９８（１
９８４）。
【０１８８】１５．ソレンセン(Sorensen),M.A.、J. Mo
l. Biol.、２０７、３６５−３７７（１９８９）。
l. Biol.、２０７、３６５−３７７（１９８９）。
【０１８９】１６．ランダル(Randall),L.L.他、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.
J. Biochem.)、１０７、３７５−３７９（１９８０）。
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.
J. Biochem.)、１０７、３７５−３７９（１９８０）。
【０１９０】１７．クラン(Curran),J.F.およびヤルス
(Yarus),M.、J. Mol. Biol.、２０９、６５−７７（１
９８９）。
(Yarus),M.、J. Mol. Biol.、２０９、６５−７７（１
９８９）。
【０１９１】１８．ヴァレンネ(Varenne),S.他、J. Mo
l. Biol.、１８０、５４９−５７６（１９８４）。
l. Biol.、１８０、５４９−５７６（１９８４）。
【０１９２】１９．ガレル(Garel),J.-P.、J. Theor. B
iol.、４３、２１１−２２５（１９７４）。
iol.、４３、２１１−２２５（１９７４）。
【０１９３】２０．イケムラ(Ikemura),T.、J. Mol. Bi
ol.、１４６、１−２１（１９８１）。
ol.、１４６、１−２１（１９８１）。
【０１９４】２１．イケムラ,T.、J. Mol. Biol.、１５
１、３８９−４０９（１９８１）。 ２２．フーフト・ファン・イッデキンゲ(Hooft van Idd
ekinge),B.J.L.他、ヴィロロジー(Virology)、１３１、
５６１−５６５（１９８３）。
１、３８９−４０９（１９８１）。 ２２．フーフト・ファン・イッデキンゲ(Hooft van Idd
ekinge),B.J.L.他、ヴィロロジー(Virology)、１３１、
５６１−５６５（１９８３）。
【０１９５】２３．クジオ(Kuzio),J.他、ヴィロロジー
(Virology)、１３９、４１４−４１８（１９８４）。
(Virology)、１３９、４１４−４１８（１９８４）。
【０１９６】２４．イケムラ,T.、Mol. Biol. Evol.、
２、１３−２４（１９８５）。
２、１３−２４（１９８５）。
【０１９７】２５．サマーズ,M.D.およびスミス,G.E.、
バキュロウイルセスベクター用の方法および昆虫細胞培
養工程のマニュアル(A Manual Of Methods For Baculov
irusVectors And Insect Cell Culture Procedures)、
３５、３８−４２頁、テキサス７７８４３−２４７５、
テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメント・ス
テーション・アンド・テキサスＡ＆Ｍユニバーシティ
ー、カレッジ・ステーション、昆虫学部門、テキサス農
業実験場会報番号１５５５（１９８７）。
バキュロウイルセスベクター用の方法および昆虫細胞培
養工程のマニュアル(A Manual Of Methods For Baculov
irusVectors And Insect Cell Culture Procedures)、
３５、３８−４２頁、テキサス７７８４３−２４７５、
テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメント・ス
テーション・アンド・テキサスＡ＆Ｍユニバーシティ
ー、カレッジ・ステーション、昆虫学部門、テキサス農
業実験場会報番号１５５５（１９８７）。
【０１９８】２６．スミス,G.E.およびサマーズ,M.D.、
J. Virol.、３３、３１１−３１９（１９８０）。
J. Virol.、３３、３１１−３１９（１９８０）。
【０１９９】２７．スミス,G.E.およびサマーズ,M.D.、
ヴィロロジー(Virology)、８９、５１９−５２７（１９
７８）。
ヴィロロジー(Virology)、８９、５１９−５２７（１９
７８）。
【０２００】２８．サマーズ,M.D.、米国特許番号５,１
５５,０３７。
５５,０３７。
【０２０１】２９．フォン・ヘイン(von Heijne),G.、N
ucl. Acids Res.、１４、４６８３−４６９０（１９８
６）。
ucl. Acids Res.、１４、４６８３−４６９０（１９８
６）。
【０２０２】３０．ディー(Dee),A.他、バイオ／テクノ
ロジー(Bio/Technology)、８、３３９−３４２（１９９
０）。
ロジー(Bio/Technology)、８、３３９−３４２（１９９
０）。
【０２０３】３１．ルコフ(Luckow),V.A.およびサマー
ズ,M.D.、ヴィロロジー(Virology)、１７０、３１−３
９（１９８９）。
ズ,M.D.、ヴィロロジー(Virology)、１７０、３１−３
９（１９８９）。
【０２０４】３２．サムルーク(Sambrook),J.他、分子
クローニング：研究室マニュアル(Molecular Cloning:
A Laboratory Manual)、２版、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）。
クローニング：研究室マニュアル(Molecular Cloning:
A Laboratory Manual)、２版、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）。
【０２０５】３３．ウェッブ(Webb),N.R.およびサマー
ズ,M.D.、J. Methods Cell & Molec.Biol.、２、１７３
−１８８（１９９０）。
ズ,M.D.、J. Methods Cell & Molec.Biol.、２、１７３
−１８８（１９９０）。
【０２０６】３４．グレース(Grace),T.C.C.、ネーチャ
ー(Nature)、１９５、７８８−７８９（１９６２）。
ー(Nature)、１９５、７８８−７８９（１９６２）。
【０２０７】３５．マリツチェク(Malitschek),B.およ
びシャートル(Schartl),M.、バイオテクニクス(BioTech
niques)、１１、１７７−１７８（１９９１）。
びシャートル(Schartl),M.、バイオテクニクス(BioTech
niques)、１１、１７７−１７８（１９９１）。
【０２０８】３６．グリシン(Glisin),V.他、バイオケ
ミストリー(Biochemistry)、１３、２６３３−２６３８
（１９７４）。
ミストリー(Biochemistry)、１３、２６３３−２６３８
（１９７４）。
【０２０９】３７．チャーウィン(Chirgwin),J.他、バ
イオケミストリー(Biochemistry)、１８、５２９４−５
２９９（１９７９）。
イオケミストリー(Biochemistry)、１８、５２９４−５
２９９（１９７９）。
【０２１０】３８．フェインベルグ(Feinberg),A.P.お
よびフォゲルステイン(Vogelstein),B.、Anal. Bioche
m.、１３２、６−１３（１９８３）。
よびフォゲルステイン(Vogelstein),B.、Anal. Bioche
m.、１３２、６−１３（１９８３）。
【０２１１】３９．ズロトキン(Zlotkin),E.他、トキシ
コン(Toxicon)、９、１−８（１９７１）。
コン(Toxicon)、９、１−８（１９７１）。
【０２１２】４０．キング(King),E.G.およびハートレ
ー(Hartley),G.G.、「ヘリオシス・ヴィレッセンス(Hel
iothis virescens)」、昆虫飼育ハンドブック(Handbook
ofInsect Rearing)、II巻、シンおよびムーア編集、３
２３−３２８頁（エルセヴィア、１９８５）。
ー(Hartley),G.G.、「ヘリオシス・ヴィレッセンス(Hel
iothis virescens)」、昆虫飼育ハンドブック(Handbook
ofInsect Rearing)、II巻、シンおよびムーア編集、３
２３−３２８頁（エルセヴィア、１９８５）。
【０２１３】本発明の主なる特徴および態様は以下のと
おりである。
おりである。
【０２１４】１．配列が配列同定番号３に記載されてい
るものである、単離されたアンドロクトヌス・オースト
ラリス昆虫毒素（ＡａＩＴ）を暗号化するコドン最適化
核酸配列。
るものである、単離されたアンドロクトヌス・オースト
ラリス昆虫毒素（ＡａＩＴ）を暗号化するコドン最適化
核酸配列。
【０２１５】２.上記１の核酸配列を含有する発現ベク
ター。
ター。
【０２１６】３.発現ベクターが昆虫ウイルスである上
記２の発現ベクター。
記２の発現ベクター。
【０２１７】４．昆虫ウイルスが核多角体病ウイルス、
グラニュローシスウイルス、非吸蔵ウイルスおよびエン
トモポックスウイルスよりなる群から選択される上記３
の発現ベクター。
グラニュローシスウイルス、非吸蔵ウイルスおよびエン
トモポックスウイルスよりなる群から選択される上記３
の発現ベクター。
【０２１８】５．昆虫ウイルスが（ａ）リマントリア・
ジスパルＮＰＶ（ジプシー・モスＮＰＶ）、オートグラ
ファ・カリフォルニカＭＮＰＶ、シングラファ・ファル
シフェラＮＰＶ（セロリ・ルーパーＮＰＶ）、スポドプ
レテ・リッツラリスＮＰＶ、スポドプテラ・フルギペル
ダＮＰＶ、ヘリオシス・アルミゲラＮＰＶ、マメストラ
・ブラシケＮＰＶ、コリストネウラ・フミフェラナＮＰ
Ｖ、トリコプルシア・ニＮＰＶおよびヘリオコヴェルガ
・ゼアＮＰＶよりなる群から選択される多角体病ウイル
ス、（ｂ）シディア・ポモネラＧＶ（コドリング・モス
ＧＶ）、ピエリス・ブラシケＧＶおよびトリコプルシア
・ニＧＶよりなる群から選択されるグラニュローシスウ
イルス、（ｃ）オルシテス・リノセロスＮＯＶおよびヘ
リオシス・ゼアＮＯＶよりなる群から選択される非吸蔵
ウイルス、または（ｄ）メロロンサ・メロノサＥＰＶ、
アンサクタ・ムーレイＥＰＶ、ロクスタ・ミグラトリア
ＥＰＶ、メロプルス・サングイニペスＥＰＶ、シストセ
ルカ・グレガリアＥＰＶ、エーデス・エジプチＥＰＶお
よびキロノムス・ルリジュスＥＰＶよりなる群から選択
されるエントモポックスウイルスである上記４の発現ベ
クター。
ジスパルＮＰＶ（ジプシー・モスＮＰＶ）、オートグラ
ファ・カリフォルニカＭＮＰＶ、シングラファ・ファル
シフェラＮＰＶ（セロリ・ルーパーＮＰＶ）、スポドプ
レテ・リッツラリスＮＰＶ、スポドプテラ・フルギペル
ダＮＰＶ、ヘリオシス・アルミゲラＮＰＶ、マメストラ
・ブラシケＮＰＶ、コリストネウラ・フミフェラナＮＰ
Ｖ、トリコプルシア・ニＮＰＶおよびヘリオコヴェルガ
・ゼアＮＰＶよりなる群から選択される多角体病ウイル
ス、（ｂ）シディア・ポモネラＧＶ（コドリング・モス
ＧＶ）、ピエリス・ブラシケＧＶおよびトリコプルシア
・ニＧＶよりなる群から選択されるグラニュローシスウ
イルス、（ｃ）オルシテス・リノセロスＮＯＶおよびヘ
リオシス・ゼアＮＯＶよりなる群から選択される非吸蔵
ウイルス、または（ｄ）メロロンサ・メロノサＥＰＶ、
アンサクタ・ムーレイＥＰＶ、ロクスタ・ミグラトリア
ＥＰＶ、メロプルス・サングイニペスＥＰＶ、シストセ
ルカ・グレガリアＥＰＶ、エーデス・エジプチＥＰＶお
よびキロノムス・ルリジュスＥＰＶよりなる群から選択
されるエントモポックスウイルスである上記４の発現ベ
クター。
【０２１９】６．核多角体病ウイルスがオートグラファ
・カリフォルニカＭＮＰＶである上記５の発現ベクタ
ー。
・カリフォルニカＭＮＰＶである上記５の発現ベクタ
ー。
【０２２０】７．バキュロウイルス伝達ベクター中に挿
入されている上記１の核酸配列を含んでなる発現ベクタ
ー。
入されている上記１の核酸配列を含んでなる発現ベクタ
ー。
【０２２１】８．上記１の核酸配列で形質転換された宿
主細胞。
主細胞。
【０２２２】９．宿主細胞が昆虫細胞である上記８の宿
主細胞。
主細胞。
【０２２３】１０．宿主細胞を上記１の核酸配列で形質
転換させるかまたは宿主細胞に該配列を感染させ、そし
て宿主細胞により該核酸配列の発現を可能にさせる条件
下で宿主細胞を培養することを含んでなる、ＡａＩＴの
製造方法。
転換させるかまたは宿主細胞に該配列を感染させ、そし
て宿主細胞により該核酸配列の発現を可能にさせる条件
下で宿主細胞を培養することを含んでなる、ＡａＩＴの
製造方法。
【０２２４】１１．宿主細胞が昆虫細胞である、上記１
０の方法。
０の方法。
【０２２５】１２．配列同定番号：３のコドン最適化核
酸配列を含有する昆虫ウイルスを植物に投与する（deli
ver）ことを含んでなる、植物を昆虫による被害から保
護する方法。
酸配列を含有する昆虫ウイルスを植物に投与する（deli
ver）ことを含んでなる、植物を昆虫による被害から保
護する方法。
【０２２６】
【表２５】
【０２２７】
【表２６】
【０２２８】
【表２７】
【０２２９】
【表２８】
【０２３０】
【表２９】
【０２３１】
【表３０】
【０２３２】
【表３１】
【０２３３】
【表３２】
【０２３４】
【表３３】
【０２３５】
【表３４】
【０２３６】
【表３５】
【０２３７】
【表３６】
【０２３８】
【表３７】
【０２３９】
【表３８】
【０２４０】
【表３９】
【０２４１】
【表４０】
【０２４２】
【表４１】
【０２４３】
【表４２】
【０２４４】
【表４３】
【０２４５】
【表４４】
【０２４６】
【表４５】
【０２４７】
【表４６】
【０２４８】
【表４７】
【０２４９】
【表４８】
【０２５０】
【表４９】
【０２５１】
【表５０】
【０２５２】
【表５１】
【０２５３】
【表５２】
【０２５４】
【表５３】
【０２５５】
【表５４】
【図１】ＡａＩＴを暗号化する先天的およびコドン最適
化遺伝子のヌクレオチド配列の比較を、ＡａＩＴのアミ
ノ酸配列と一緒に示す。
化遺伝子のヌクレオチド配列の比較を、ＡａＩＴのアミ
ノ酸配列と一緒に示す。
【図２】異種クチクラシグナル配列およびＡａＩＴを暗
号化するコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミ
ドｐＢＳクチクラ−ＡａＩＴの詳細構造を示す。
号化するコドン最適化ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミ
ドｐＢＳクチクラ−ＡａＩＴの詳細構造を示す。
【図３】先天的シグナル配列およびＡａＩＴを暗号化す
る先天的ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＢＳ Ｇ
ＩＩＩ−ＡａＩＴの詳細構造を示す。
る先天的ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＢＳ Ｇ
ＩＩＩ−ＡａＩＴの詳細構造を示す。
【図４】野生型ＡｃＭＮＰＶが感染しているＳｆ９細胞
中に集まるポリヘドリンＲＮＡの百分率としての毒素暗
号化ＲＮＡの水準を示す。
中に集まるポリヘドリンＲＮＡの百分率としての毒素暗
号化ＲＮＡの水準を示す。
【図５】ウイルス注射検定におけるＨ.ヴィレッセンス
(H. virescens)幼虫の応答時間のグラフを示す。
(H. virescens)幼虫の応答時間のグラフを示す。
【図６】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、図７−１０の対照として使用さ
れる野生型ＡｃＭＮＰＶ（菌株Ｅ２）を示す。
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、図７−１０の対照として使用さ
れる野生型ＡｃＭＮＰＶ（菌株Ｅ２）を示す。
【図７】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、エステラーゼ−６−ＡａＩＴ−
ウイルス構成体を示す。
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、エステラーゼ−６−ＡａＩＴ−
ウイルス構成体を示す。
【図８】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、脂肪運動ホルモン−ＡａＩＴ−
ウイルス構成体を示しす。
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、脂肪運動ホルモン−ＡａＩＴ−
ウイルス構成体を示しす。
【図９】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それは
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、クチクラ−ＡａＩＴ−ウイルス
構成体を示す。
摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示投
与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の百
分率として表すもので、クチクラ−ＡａＩＴ−ウイルス
構成体を示す。
【図１０】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それ
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、先天的シグナル−先天的Ａａ
ＩＴ−ウイルス構成体を示す。
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、先天的シグナル−先天的Ａａ
ＩＴ−ウイルス構成体を示す。
【図１１】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それ
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、図１２−１５の対照として使
用される野生型ＡｃＭＮＰＶ（菌株Ｅ２）を示す。
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、図１２−１５の対照として使
用される野生型ＡｃＭＮＰＶ（菌株Ｅ２）を示す。
【図１２】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それ
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、ｐＢＭＨＰＣ−１２−ＡａＩ
Ｔ−ウイルス構成体を示す。
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、ｐＢＭＨＰＣ−１２−ＡａＩ
Ｔ−ウイルス構成体を示す。
【図１３】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それ
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、漿膜−ＡａＩＴ−ウイルス構
成体を示す。
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、漿膜−ＡａＩＴ−ウイルス構
成体を示す。
【図１４】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それ
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、アポリポフォリン−ＡａＩＴ
−ウイルス構成体を示す。
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、アポリポフォリン−ＡａＩＴ
−ウイルス構成体を示す。
【図１５】ウイルスの経口的毒性のグラフを示し、それ
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、性特異体−ＡａＩＴ−ウイル
ス構成体を示す。
は摂取された飼料小滴中に存在しているウイルスの指示
投与量に対して種々の時間間隔において応答する幼虫の
百分率として表すもので、性特異体−ＡａＩＴ−ウイル
ス構成体を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ０１Ｎ 63/00 Ｆ Ｃ０７Ｋ 14/01 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リン・アン・ブレナン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州ローレ ンスビル・シカモアコート25 (72)発明者 ピーター・マイケル・デイアクス アメリカ合衆国ペンシルベニア州ヤードレ イ・デイルビユウドライブ262
Claims (6)
- 【請求項１】 配列が配列同定番号３に記載されている
ものである、分離されたアンドロクトヌス・オーストラ
リス（Androctonus australia）昆虫毒素（ＡａＩＴ）
を暗号化するコドン最適化核酸配列。 - 【請求項２】 請求項１に記載の核酸配列を含有する発
現ベクター。 - 【請求項３】 バキュロウイルス伝達ベクター中に挿入
されている請求項１に記載の核酸配列を含んでなる発現
ベクター。 - 【請求項４】 請求項１に記載の核酸配列で形質転換さ
れた宿主細胞。 - 【請求項５】 宿主細胞を請求項１に記載の核酸配列で
形質転換させるかまたは宿主細胞に該配列を感染させ、
そして宿主細胞により該核酸配列の発現を可能にさせる
条件下で宿主細胞を培養することを特徴とするＡａＩＴ
の製造方法。 - 【請求項６】 配列同定番号：３のコドン最適化核酸配
列を含有する昆虫ウイルスを植物に投与することを特徴
とする植物を昆虫による被害から保護する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US926493A | 1993-01-25 | 1993-01-25 | |
| US009264 | 1993-01-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07313166A true JPH07313166A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=21736588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6023391A Pending JPH07313166A (ja) | 1993-01-25 | 1994-01-24 | 昆虫毒素ＡａＩＴに関するコドン最適化ＤＮＡ配列 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0621337A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07313166A (ja) |
| KR (1) | KR940018465A (ja) |
| AU (1) | AU5396794A (ja) |
| CA (1) | CA2113981A1 (ja) |
| IL (1) | IL108396A0 (ja) |
| ZA (1) | ZA94458B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006517090A (ja) * | 2002-09-26 | 2006-07-20 | コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | 合成遺伝子 |
| JP2013541952A (ja) * | 2010-10-11 | 2013-11-21 | イェネヴァイン ビオテヒノロギー ゲーエムベーハー | 新規フコシルトランスフェラーゼおよびそれらの適用 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
| EG22218A (en) | 1994-07-27 | 2002-10-31 | American Cyanamid Co | Coated pesticidal agents processes for their preparation and compositions containing them |
| NZ308772A (en) * | 1995-05-17 | 1999-04-29 | Du Pont | Recombinant baculovirus insecticides |
| FR2744724B1 (fr) * | 1996-02-14 | 2002-08-02 | Pasteur Institut | Proteine recombinante contenant un fragment c-terminal de la proteine msp-1 d'un plasmodium infectieux pour l'homme pour la production de vaccins anti-paludiques |
| RU2153258C1 (ru) * | 1999-02-08 | 2000-07-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Штамм вируса ядерного полиэдроза капустной совки mamestrа вrassicae l., используемый для получения инсектицидного препарата |
| EP2612867A1 (en) | 2007-11-01 | 2013-07-10 | Perseid Therapeutics LLC | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
| CN111474336B (zh) * | 2020-03-21 | 2023-07-28 | 南昌大学 | 一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5177308A (en) * | 1989-11-29 | 1993-01-05 | Agracetus | Insecticidal toxins in plants |
| WO1992011363A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-07-09 | Ciba-Geigy Ag | Recombinant molecules useful for producing insecticidal microbes |
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
-
1994
- 1994-01-10 EP EP94100264A patent/EP0621337A1/en not_active Withdrawn
- 1994-01-21 IL IL10839694A patent/IL108396A0/xx unknown
- 1994-01-21 CA CA002113981A patent/CA2113981A1/en not_active Abandoned
- 1994-01-24 JP JP6023391A patent/JPH07313166A/ja active Pending
- 1994-01-24 AU AU53967/94A patent/AU5396794A/en not_active Abandoned
- 1994-01-24 ZA ZA94458A patent/ZA94458B/xx unknown
- 1994-01-24 KR KR1019940001341A patent/KR940018465A/ko not_active Ceased
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006517090A (ja) * | 2002-09-26 | 2006-07-20 | コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | 合成遺伝子 |
| JP2013541952A (ja) * | 2010-10-11 | 2013-11-21 | イェネヴァイン ビオテヒノロギー ゲーエムベーハー | 新規フコシルトランスフェラーゼおよびそれらの適用 |
| US9441211B2 (en) | 2010-10-11 | 2016-09-13 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Fucosyltransferases and their applications |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR940018465A (ko) | 1994-08-18 |
| IL108396A0 (en) | 1994-04-12 |
| AU5396794A (en) | 1994-07-28 |
| CA2113981A1 (en) | 1994-07-26 |
| EP0621337A1 (en) | 1994-10-26 |
| ZA94458B (en) | 1994-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5547871A (en) | Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling proteins | |
| JPH07313166A (ja) | 昆虫毒素ＡａＩＴに関するコドン最適化ＤＮＡ配列 | |
| Haase et al. | Genetic engineering of baculoviruses | |
| JP2001501824A (ja) | 昆虫特異的ダニ毒素遺伝子を発現する生物学的昆虫防除剤、方法および組成物 | |
| US5461032A (en) | Insecticidally effective peptides | |
| AU753930B2 (en) | Recombinant baculovirus-based insecticides | |
| US6087165A (en) | Recombinant baculovirus and its use as a biocontrol agent for crop pests | |
| US5674485A (en) | Insect diagnostic and control compositions with truncated JHE | |
| AU661997B2 (en) | Insecticidally effective peptides | |
| CA2213444A1 (en) | Insecticidal toxins from bracon hebetor | |
| WO1996025429A9 (en) | Insecticidal toxins from bracon hebetor | |
| AU743526B2 (en) | Transgenic virus | |
| JPH09510871A (ja) | 生物学的昆虫制御剤 | |
| AU721364B2 (en) | Codon optimized DNA sequence for insect toxin AaIT | |
| Kuzio et al. | An overview of the molecular biology and applications of baculoviruses | |
| AU720082B2 (en) | Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling toxins | |
| WO1998009522A1 (en) | Insecticidal peptides from segestria sp. spider venom | |
| van der Beek | On the origin of the polyhedral protein of the nuclear polyhedrosis virus of Autographa californica | |
| US5827518A (en) | Viral and insect genes that inhibit the immune system and methods of use thereof | |
| SK282444B6 (sk) | Hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa a spôsob jeho výroby | |
| MXPA00010981A (es) | Insecticidas con base en basculovirus recombinantes | |
| MXPA98000646A (en) | Transgen virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040323 |