JPH07313198A - 改良されたｄｎａの塩基配列決定法 - Google Patents
改良されたｄｎａの塩基配列決定法Info
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- JPH07313198A JPH07313198A JP10850494A JP10850494A JPH07313198A JP H07313198 A JPH07313198 A JP H07313198A JP 10850494 A JP10850494 A JP 10850494A JP 10850494 A JP10850494 A JP 10850494A JP H07313198 A JPH07313198 A JP H07313198A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ビオチン、ジコキシゲニン、酵素あるいは蛍光
色素などを使用する非ＲＩ標識配列決定法において、Ｄ
ＮＡの標識方法を簡素化し、ノイズ発生を低減させる。 【構成】下記化１で示される標識修飾ヌクレオチド三燐
酸誘導体を使用するサンガー配列決定法。 【化１】 （式中、Ｑは、７−デアザアデニン、７−デアザグアニ
ン、シトシンまたはウラシル残基であり、Ｒ1 、Ｒ2 、
Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
標識を示す。）
色素などを使用する非ＲＩ標識配列決定法において、Ｄ
ＮＡの標識方法を簡素化し、ノイズ発生を低減させる。 【構成】下記化１で示される標識修飾ヌクレオチド三燐
酸誘導体を使用するサンガー配列決定法。 【化１】 （式中、Ｑは、７−デアザアデニン、７−デアザグアニ
ン、シトシンまたはウラシル残基であり、Ｒ1 、Ｒ2 、
Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
標識を示す。）
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は放射性同位元素を用いな
い、改良されたＤＮＡの非ＲＩ標識塩基配列決定法に関
する。さらに詳細にはＤＮＡの検出に必要な標識物質を
ダイデオキシヌクレオチド三燐酸へ付加した新規なＤＮ
Ａプローブを使用する配列決定法であり、ＤＮＡの塩基
配列決定の際のノイズの低減、すなわち正確性を向上さ
せる。
い、改良されたＤＮＡの非ＲＩ標識塩基配列決定法に関
する。さらに詳細にはＤＮＡの検出に必要な標識物質を
ダイデオキシヌクレオチド三燐酸へ付加した新規なＤＮ
Ａプローブを使用する配列決定法であり、ＤＮＡの塩基
配列決定の際のノイズの低減、すなわち正確性を向上さ
せる。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの塩基配列分析は、分子生物学に
おいて基幹的な技術である。従来から慣用的なＤＮＡ配
列決定法として、２つの基本的な技術がある。１つはマ
キサム及びギルバート法(Maxam-Gilbert法)(Methods En
zymology, 第65巻、1980年、第499-560 頁）であり、他
方はサンガー(Sanger)法(Proc. Natl. Acad.Sci.,USA,
第74巻、1977年、第5463頁）である。
おいて基幹的な技術である。従来から慣用的なＤＮＡ配
列決定法として、２つの基本的な技術がある。１つはマ
キサム及びギルバート法(Maxam-Gilbert法)(Methods En
zymology, 第65巻、1980年、第499-560 頁）であり、他
方はサンガー(Sanger)法(Proc. Natl. Acad.Sci.,USA,
第74巻、1977年、第5463頁）である。
【０００３】近年、ＤＮＡの配列決定のためには、ほと
んどサンガー配列決定法が使用されており、この方法に
おいては、配列決定されるべきＤＮＡ鎖の一部分に相補
的であるオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、４種
のデオキシヌクレオチド三燐酸と１種のダイデオキシヌ
クレオチド三燐酸からなる混合物の存在下で、配列決定
すべきＤＮＡの相補的なコピーをＤＮＡポリメラーゼに
より合成する。新しく合成されるＤＮＡ中に、該ダイデ
オキシヌクレオチド三燐酸が組み込まれることにより、
伸長されたヌクレオチドの末端ヌクレオチドのヒドロキ
シル基がなくなり、合成による伸長はもはや可能ではな
くなり、配列特異的な合成に中断が生じる。この伸長は
一般に４種のデオキシヌクレオチド三燐酸と１種のダイ
デオキシヌクレオチド三燐酸とからなる４種の可能な混
合物全てに関して別々の反応を行なう。
んどサンガー配列決定法が使用されており、この方法に
おいては、配列決定されるべきＤＮＡ鎖の一部分に相補
的であるオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、４種
のデオキシヌクレオチド三燐酸と１種のダイデオキシヌ
クレオチド三燐酸からなる混合物の存在下で、配列決定
すべきＤＮＡの相補的なコピーをＤＮＡポリメラーゼに
より合成する。新しく合成されるＤＮＡ中に、該ダイデ
オキシヌクレオチド三燐酸が組み込まれることにより、
伸長されたヌクレオチドの末端ヌクレオチドのヒドロキ
シル基がなくなり、合成による伸長はもはや可能ではな
くなり、配列特異的な合成に中断が生じる。この伸長は
一般に４種のデオキシヌクレオチド三燐酸と１種のダイ
デオキシヌクレオチド三燐酸とからなる４種の可能な混
合物全てに関して別々の反応を行なう。
【０００４】引き続き、生じたＤＮＡフラグメントの長
さによる分離をゲル電気泳動法で行ない、さらに分離し
たＤＮＡフラグメントを検出することによりＤＮＡ配列
の直接の読み取りが可能となる。ＤＮＡフラグメントの
検出には、オリゴヌクレオチドプライマーの１部、また
は少なくとも１種のデオキシヌクレオチド、または４種
のダイデオキシヌクレオチドを、標識、例えば放射性同
位元素、蛍光物質あるいは酵素を結合し、該標識を検出
することにより行う。
さによる分離をゲル電気泳動法で行ない、さらに分離し
たＤＮＡフラグメントを検出することによりＤＮＡ配列
の直接の読み取りが可能となる。ＤＮＡフラグメントの
検出には、オリゴヌクレオチドプライマーの１部、また
は少なくとも１種のデオキシヌクレオチド、または４種
のダイデオキシヌクレオチドを、標識、例えば放射性同
位元素、蛍光物質あるいは酵素を結合し、該標識を検出
することにより行う。
【０００５】現在、最も常用されている塩基配列決定法
においては、少なくとも下記工程を実施する。 第１工程：配列決定されるべきＤＮＡおよびその相補的
ＤＮＡを高温にて数十秒から数分放置することにより一
本鎖に分離する。 第２工程：その後、徐々に温度を下げて、オリゴヌクレ
オチドプライマーを配列決定されるべきＤＮＡに結合さ
せる（アニーリング）。 第３工程：ＤＮＡポリメラーゼを至適温度に加熱して、
オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型に沿って伸長させ
た後、ターミネーション反応を行う。 第４工程：伸長させたオリゴヌクレオチドプライマーを
高温にて数十秒から数分間放置することにより配列決定
されるべきＤＮＡより分離する。電気泳動法により伸長
させたオリゴヌクレオチドプライマーを大きさに分画
し、オリゴヌクレオチドプライマーに予め標識された標
識物質を検出することにより塩基配列を決定する。
においては、少なくとも下記工程を実施する。 第１工程：配列決定されるべきＤＮＡおよびその相補的
ＤＮＡを高温にて数十秒から数分放置することにより一
本鎖に分離する。 第２工程：その後、徐々に温度を下げて、オリゴヌクレ
オチドプライマーを配列決定されるべきＤＮＡに結合さ
せる（アニーリング）。 第３工程：ＤＮＡポリメラーゼを至適温度に加熱して、
オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型に沿って伸長させ
た後、ターミネーション反応を行う。 第４工程：伸長させたオリゴヌクレオチドプライマーを
高温にて数十秒から数分間放置することにより配列決定
されるべきＤＮＡより分離する。電気泳動法により伸長
させたオリゴヌクレオチドプライマーを大きさに分画
し、オリゴヌクレオチドプライマーに予め標識された標
識物質を検出することにより塩基配列を決定する。
【０００６】ＤＮＡフラグメントを検出する際、放射性
同位元素を用いることは人体への影響、廃棄物処理など
を考慮すると最善の手法とはいえない。これに対し蛍光
物質による標識方法は、適切な励起光（レーザー光）を
照射することで安全に高感度に検出できる長所がある。
しかしながら、これらの技術はいずれも施設・設備の面
でかなりの投資を必要とする。特に多数の検体を処理す
る場合、設備の規模に依存してその処理能力も限定され
る。特殊な設備や機器を必要としないＤＮＡ配列決定方
法が求められ、いくつかの報告がなされている（Nuclei
c Acids Research Vol.17, No.13, 1989, 5115-5123 な
ど）。これらの技術のひとつはビオチンで標識したプラ
イマーを用いて、サンガー法によりＤＮＡ配列を決定す
る方法である。ビオチンを直接検出することはできない
ので、間接的にビオチンを検出する。例えばビオチン−
アビジンシステムにより、ＤＮＡフラグメントをアルカ
リホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素で間接
的に標識することも報告されている（Anal. Biochem. V
ol.164, 512-520 ）。これらの酵素により分解されて発
色、発光するような基質、例えば５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−燐酸およびニトロブルーテトラゾ
リウムなどを加えることにより、放射性同位元素や蛍光
物質を用いた場合と同様の感度でＤＮＡフラグメントを
検出することが可能となる。
同位元素を用いることは人体への影響、廃棄物処理など
を考慮すると最善の手法とはいえない。これに対し蛍光
物質による標識方法は、適切な励起光（レーザー光）を
照射することで安全に高感度に検出できる長所がある。
しかしながら、これらの技術はいずれも施設・設備の面
でかなりの投資を必要とする。特に多数の検体を処理す
る場合、設備の規模に依存してその処理能力も限定され
る。特殊な設備や機器を必要としないＤＮＡ配列決定方
法が求められ、いくつかの報告がなされている（Nuclei
c Acids Research Vol.17, No.13, 1989, 5115-5123 な
ど）。これらの技術のひとつはビオチンで標識したプラ
イマーを用いて、サンガー法によりＤＮＡ配列を決定す
る方法である。ビオチンを直接検出することはできない
ので、間接的にビオチンを検出する。例えばビオチン−
アビジンシステムにより、ＤＮＡフラグメントをアルカ
リホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素で間接
的に標識することも報告されている（Anal. Biochem. V
ol.164, 512-520 ）。これらの酵素により分解されて発
色、発光するような基質、例えば５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−燐酸およびニトロブルーテトラゾ
リウムなどを加えることにより、放射性同位元素や蛍光
物質を用いた場合と同様の感度でＤＮＡフラグメントを
検出することが可能となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
のビオチン、ジコキシゲニン、酵素あるいは蛍光色素な
どを使用する非ＲＩ標識配列決定法では、非ＲＩ標識配
列決定法ではＤＮＡの標識方法が煩雑になりやすくノイ
ズが発生するという欠点がある。したがって、本発明が
解決しようとする課題は、検出に必要な標識物質のＤＮ
Ａへの新規な付加方法により、ＤＮＡの塩基配列決定の
際のノイズの低減、すなわち正確性を向上させることで
ある。
のビオチン、ジコキシゲニン、酵素あるいは蛍光色素な
どを使用する非ＲＩ標識配列決定法では、非ＲＩ標識配
列決定法ではＤＮＡの標識方法が煩雑になりやすくノイ
ズが発生するという欠点がある。したがって、本発明が
解決しようとする課題は、検出に必要な標識物質のＤＮ
Ａへの新規な付加方法により、ＤＮＡの塩基配列決定の
際のノイズの低減、すなわち正確性を向上させることで
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、下記
工程からなる改良されたＤＮＡの塩基配列決定法であ
る。 ａ）配列を決定すべきＤＮＡおよびプライマーを加熱変
性する工程 ｂ）配列を決定すべきＤＮＡに対して、上記プライマー
をハイブリダイズする工程 ｃ）非修飾ヌクレオチド三燐酸、下記化２で示される標
識修飾ヌクレオチド三燐酸誘導体および核酸合成酵素を
用いて、伸長反応と非特異的連鎖中断反応および特異的
連鎖中断反応を伴うＤＮＡ合成工程 ｄ）特異的連鎖中断反応により生成されたＤＮＡフラグ
メントのみを非電気的に検出する工程
工程からなる改良されたＤＮＡの塩基配列決定法であ
る。 ａ）配列を決定すべきＤＮＡおよびプライマーを加熱変
性する工程 ｂ）配列を決定すべきＤＮＡに対して、上記プライマー
をハイブリダイズする工程 ｃ）非修飾ヌクレオチド三燐酸、下記化２で示される標
識修飾ヌクレオチド三燐酸誘導体および核酸合成酵素を
用いて、伸長反応と非特異的連鎖中断反応および特異的
連鎖中断反応を伴うＤＮＡ合成工程 ｄ）特異的連鎖中断反応により生成されたＤＮＡフラグ
メントのみを非電気的に検出する工程
【０００９】
【化２】 （式中、Ｑは、７−デアザアデニン、７−デアザグアニ
ン、シトシンまたはウラシル残基であり、Ｒ1 、Ｒ2 、
Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
標識を示す。）
ン、シトシンまたはウラシル残基であり、Ｒ1 、Ｒ2 、
Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
標識を示す。）
【００１０】本発明に使用する配列決定すべきＤＮＡと
は、Ｍ１３ファージＤＮＡのような−本鎖ＤＮＡ、ｐＵ
ＣＤＮＡなどのスーパーコイル型で存在する二本鎖ＤＮ
Ａに組み込まれた任意のＤＮＡである。
は、Ｍ１３ファージＤＮＡのような−本鎖ＤＮＡ、ｐＵ
ＣＤＮＡなどのスーパーコイル型で存在する二本鎖ＤＮ
Ａに組み込まれた任意のＤＮＡである。
【００１１】本発明に使用するプライマーとしては、配
列決定されるべきＤＮＡ鎖の一部分に相補的であるオリ
ゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの数は
一般に１０〜５０である。
列決定されるべきＤＮＡ鎖の一部分に相補的であるオリ
ゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの数は
一般に１０〜５０である。
【００１２】プライマーの利用法は２つに分けられる。
１つはプライマーを固定して行う方法である（ディリー
ション法）。これは配列決定されるべき検体ＤＮＡを既
知のＤＮＡ断片に連結し、既知ＤＮＡの断片部分と相補
的なプライマーを利用して、検体ＤＮＡを解析する方法
である。そのため数種のプライマーをあらかじめビオチ
ンで標識しておく。もう一方は、検体ＤＮＡの一部と相
補的なプライマーを利用し、解析した後、さらに数百塩
基離れた部分のプライマーを合成し、さらに解析した結
果をもとに数百塩基離れた部分の別のプライマーを合成
し解析を順次進めていくような、すなわち検体ＤＮＡと
相補的なプライマーを次々と合成していく方法である
（プライマーウォーキング法）。
１つはプライマーを固定して行う方法である（ディリー
ション法）。これは配列決定されるべき検体ＤＮＡを既
知のＤＮＡ断片に連結し、既知ＤＮＡの断片部分と相補
的なプライマーを利用して、検体ＤＮＡを解析する方法
である。そのため数種のプライマーをあらかじめビオチ
ンで標識しておく。もう一方は、検体ＤＮＡの一部と相
補的なプライマーを利用し、解析した後、さらに数百塩
基離れた部分のプライマーを合成し、さらに解析した結
果をもとに数百塩基離れた部分の別のプライマーを合成
し解析を順次進めていくような、すなわち検体ＤＮＡと
相補的なプライマーを次々と合成していく方法である
（プライマーウォーキング法）。
【００１３】前者は必要なプライマーは少なくて済む
が、連結できる断片の大きさが限定されるため、検体を
一時分解して解析するため再構成（検体の分解がランダ
ムに行なわれるために必要）に労力が必要である。後者
はプライマー数は多く必要であるが、検体を細かく分解
する必要がないため解析の結果は常に連続している。Ｄ
ＮＡ自動合成機の普及と高性能化にともないプライマー
合成にかかる負担は減少してきている。そのためプライ
マーウォーキング法を用いるデメリットは少なくなって
きている。
が、連結できる断片の大きさが限定されるため、検体を
一時分解して解析するため再構成（検体の分解がランダ
ムに行なわれるために必要）に労力が必要である。後者
はプライマー数は多く必要であるが、検体を細かく分解
する必要がないため解析の結果は常に連続している。Ｄ
ＮＡ自動合成機の普及と高性能化にともないプライマー
合成にかかる負担は減少してきている。そのためプライ
マーウォーキング法を用いるデメリットは少なくなって
きている。
【００１４】プライマーをビオチンで標識するプライマ
ーウォーキング法は、安全で確実なＤＮＡ解析方法であ
るが、必要なプライマーをビオチンで逐次標識すること
は非常に無駄が多く、この方法の長所を損なう結果とな
っている。本発明では上記化２で示される標識修飾ヌク
レオチド三燐酸誘導体を使用することにより、このよう
な欠点を解消する。
ーウォーキング法は、安全で確実なＤＮＡ解析方法であ
るが、必要なプライマーをビオチンで逐次標識すること
は非常に無駄が多く、この方法の長所を損なう結果とな
っている。本発明では上記化２で示される標識修飾ヌク
レオチド三燐酸誘導体を使用することにより、このよう
な欠点を解消する。
【００１５】本発明に使用する核酸合成酵素としては、
サーマス・サーモフィラス(ThermusThermophilus)由来
のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、、サーマス・アクアチカ
ス(Thermus aquaticus) 由来のＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ、超好熱始原菌(Pyrococcus furiosus) 由来のＰｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーー
ゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼを欠失したＤＮＡポ
リメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失した
ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ
−フラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの改変型ＤＮ
Ａポリメラーゼなどを挙げることができる。これらの核
酸合成酵素のうち、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好まし
く、さらに５’→３’エキソヌクレアーゼを欠失した耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアー
ゼを欠失した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばΔＴｔ
ｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）やΔＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（United States Biochemical 社製) など
が特に好ましい。
サーマス・サーモフィラス(ThermusThermophilus)由来
のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、、サーマス・アクアチカ
ス(Thermus aquaticus) 由来のＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ、超好熱始原菌(Pyrococcus furiosus) 由来のＰｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーー
ゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼを欠失したＤＮＡポ
リメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失した
ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ
−フラグメント、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの改変型ＤＮ
Ａポリメラーゼなどを挙げることができる。これらの核
酸合成酵素のうち、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好まし
く、さらに５’→３’エキソヌクレアーゼを欠失した耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ、３’→５’エキソヌクレアー
ゼを欠失した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばΔＴｔ
ｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）やΔＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（United States Biochemical 社製) など
が特に好ましい。
【００１６】本発明に使用する化２で示される標識修飾
ヌクレオチド三燐酸誘導体は、例えば７−（Ｎ−ビオチ
ニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’−
ダイデオキシ−７−デアザグアノシン−５’−三燐酸
（下記化３）、７−（Ｎ−ビオチニル−（３−アミノ−
１−プロピニル））−２’３’−ダイデオキシ−７−デ
アザアデノシン−５’−三燐酸（下記化４）、５−（Ｎ
−ビオチニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−
２’３’−ダイデオキシ−ウリジン−５’−三燐酸（下
記化５）または５−（Ｎ−ビオチニル−（３−アミノ−
１−プロピニル））−２’３’−ダイデオキシ−シチジ
ン−５’−三燐酸（下記化６）である。これらの化合物
は、有機合成薬品工業株式会社から購入したものであ
る。
ヌクレオチド三燐酸誘導体は、例えば７−（Ｎ−ビオチ
ニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’−
ダイデオキシ−７−デアザグアノシン−５’−三燐酸
（下記化３）、７−（Ｎ−ビオチニル−（３−アミノ−
１−プロピニル））−２’３’−ダイデオキシ−７−デ
アザアデノシン−５’−三燐酸（下記化４）、５−（Ｎ
−ビオチニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−
２’３’−ダイデオキシ−ウリジン−５’−三燐酸（下
記化５）または５−（Ｎ−ビオチニル−（３−アミノ−
１−プロピニル））−２’３’−ダイデオキシ−シチジ
ン−５’−三燐酸（下記化６）である。これらの化合物
は、有機合成薬品工業株式会社から購入したものであ
る。
【００１７】
【化３】
【００１８】
【化４】
【００１９】
【化５】
【００２０】
【化６】
【００２１】標識としては、ビオチン、ジコキシゲニ
ン、酵素または蛍光色素を挙げることができる。標識は
信号を生じる物質と複合体を形成し、信号を生じる。標
識がビオチンである場合、信号を生じさせる物質はアビ
ジンおよびアルカリホスファターゼ、またはアビジン、
ビオチンおよびアルカリホスファターゼなどである。標
識が蛍光物質である場合、信号を生じさせる物質は抗蛍
光色素およびアルカリホスファターゼなどである。標識
がジコキシゲニンである場合、信号を生じさせる物質は
抗ジコキシゲニンおよびアルカリホスファターゼなどで
ある。標識がアルカリホスファターゼである場合、信号
を生じる物質は１，２ジオキセタンの誘導体などであ
る。標識がアルカリホスファターゼである場合、信号を
生じる物質は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−燐酸およびニトロブルーテトラゾリウムなどである。
本発明における標識方法としては、上記化合物の使用に
限られない。
ン、酵素または蛍光色素を挙げることができる。標識は
信号を生じる物質と複合体を形成し、信号を生じる。標
識がビオチンである場合、信号を生じさせる物質はアビ
ジンおよびアルカリホスファターゼ、またはアビジン、
ビオチンおよびアルカリホスファターゼなどである。標
識が蛍光物質である場合、信号を生じさせる物質は抗蛍
光色素およびアルカリホスファターゼなどである。標識
がジコキシゲニンである場合、信号を生じさせる物質は
抗ジコキシゲニンおよびアルカリホスファターゼなどで
ある。標識がアルカリホスファターゼである場合、信号
を生じる物質は１，２ジオキセタンの誘導体などであ
る。標識がアルカリホスファターゼである場合、信号を
生じる物質は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−燐酸およびニトロブルーテトラゾリウムなどである。
本発明における標識方法としては、上記化合物の使用に
限られない。
【００２２】ＤＮＡの標識方法にはプライマーの５’末
端（エンドラベル法）、ＤＮＡフラグメントの中間（イ
ンターナルラベル法）、ＤＮＡフラグメントの３’末端
（ターミネータラベル法）の３種類の標識箇所がある。
本発明では、ＤＮＡの塩基配列決定は、前記いずれかの
標識物質から信号を発生させ、その信号を検出すること
により達成される。本発明における非電気的検出とは、
フォトンカウンターや液体シンチレーションカウンター
により生じた信号を電気的に増幅して検出するのではな
く、信号を肉眼で確認できるように、発色させるかある
いはフィルムに感光させ、光学的に検出する方法などを
意味する。
端（エンドラベル法）、ＤＮＡフラグメントの中間（イ
ンターナルラベル法）、ＤＮＡフラグメントの３’末端
（ターミネータラベル法）の３種類の標識箇所がある。
本発明では、ＤＮＡの塩基配列決定は、前記いずれかの
標識物質から信号を発生させ、その信号を検出すること
により達成される。本発明における非電気的検出とは、
フォトンカウンターや液体シンチレーションカウンター
により生じた信号を電気的に増幅して検出するのではな
く、信号を肉眼で確認できるように、発色させるかある
いはフィルムに感光させ、光学的に検出する方法などを
意味する。
【００２３】ＤＮＡの塩基配列決定における正確性は、
特異的な長さのＤＮＡ断片が核酸合成酵素により生成さ
れることから、変性ポリアクリルアミドゲルなどの分離
単体により１分子ごとに正確に分離される。エンドラベ
ルまたはインターナルラベル法を用いる場合の正確性
は、核酸合成酵素の基質特異性の高さと合成したＤＮＡ
の分解活性の低さに依存する。本発明では、５’−３’
および／または３’−５’分解活性を完全に欠落した核
酸合成酵素を用いることにより、ＤＮＡの分解活性を消
失させることが可能となる。一方、基質特異性を１００
％とする（いわゆる読み間違いのない）核酸合成酵素は
発見されていないためノイズの原因となるが、本発明で
は、ダイデオキシヌクレオチド三燐酸を標識することに
より、このノイズ発生の頻度を極限にまで低下させてい
る。すなわちデオキシヌクレオチド三燐酸の読み違いや
配列を決定すべきＤＮＡの特性（純度・構造）により反
応の停止によるノイズは検出はされないため、酵素の正
確性が悪くエラーが多い場合でも正確に合成されたＤＮ
Ａのみを検出することができる。
特異的な長さのＤＮＡ断片が核酸合成酵素により生成さ
れることから、変性ポリアクリルアミドゲルなどの分離
単体により１分子ごとに正確に分離される。エンドラベ
ルまたはインターナルラベル法を用いる場合の正確性
は、核酸合成酵素の基質特異性の高さと合成したＤＮＡ
の分解活性の低さに依存する。本発明では、５’−３’
および／または３’−５’分解活性を完全に欠落した核
酸合成酵素を用いることにより、ＤＮＡの分解活性を消
失させることが可能となる。一方、基質特異性を１００
％とする（いわゆる読み間違いのない）核酸合成酵素は
発見されていないためノイズの原因となるが、本発明で
は、ダイデオキシヌクレオチド三燐酸を標識することに
より、このノイズ発生の頻度を極限にまで低下させてい
る。すなわちデオキシヌクレオチド三燐酸の読み違いや
配列を決定すべきＤＮＡの特性（純度・構造）により反
応の停止によるノイズは検出はされないため、酵素の正
確性が悪くエラーが多い場合でも正確に合成されたＤＮ
Ａのみを検出することができる。
【００２４】特殊な施設、設備なしに安全にＤＮＡの配
列決定を効率よく行うには、特にビオチンによるターミ
ネーターラベル法が適切である。さらに、ノイズの低減
（正確性の向上）のためには、特異的な長さのＤＮＡ断
片が生成された後に標識物質が付加されるビオチン・タ
ーミネーター法が適切である。さらに具体的には、配列
決定されるべき検体ＤＮＡ、プライマー、反応用の緩衝
液、４種のデオキシリボ核酸およびＤＮＡポリメラーゼ
を混合し、さらにビオチン修飾ダイデオキシ−７−デア
ザヌクレオチド−５’−三燐酸などを用いて、伸長反応
と非特異的連鎖中断反応および特異的連鎖中断反応を伴
うＤＮＡ合成を行い、ターミネーション反応を行う。こ
のターミネーション反応はビオチンで標識された４種の
ダイデオキシリボ核酸すべてにおいて別々に反応を行う
必要がある。
列決定を効率よく行うには、特にビオチンによるターミ
ネーターラベル法が適切である。さらに、ノイズの低減
（正確性の向上）のためには、特異的な長さのＤＮＡ断
片が生成された後に標識物質が付加されるビオチン・タ
ーミネーター法が適切である。さらに具体的には、配列
決定されるべき検体ＤＮＡ、プライマー、反応用の緩衝
液、４種のデオキシリボ核酸およびＤＮＡポリメラーゼ
を混合し、さらにビオチン修飾ダイデオキシ−７−デア
ザヌクレオチド−５’−三燐酸などを用いて、伸長反応
と非特異的連鎖中断反応および特異的連鎖中断反応を伴
うＤＮＡ合成を行い、ターミネーション反応を行う。こ
のターミネーション反応はビオチンで標識された４種の
ダイデオキシリボ核酸すべてにおいて別々に反応を行う
必要がある。
【００２５】ダイデオキシヌクレオチド三燐酸はデオキ
シヌクレオチド三燐酸が加水分解されて酸素原子が１つ
減少しているアナログである。ところが大部分のＤＮＡ
ポリメラーゼはこのアナログの取り込みが悪く、反応中
に高濃度で使用される。ビオチンで標識されたダイデオ
キシリボ核酸は、分子量の増大や構造の変化により、特
にＤＮＡポリメラーゼによる取り込みが低下している。
シヌクレオチド三燐酸が加水分解されて酸素原子が１つ
減少しているアナログである。ところが大部分のＤＮＡ
ポリメラーゼはこのアナログの取り込みが悪く、反応中
に高濃度で使用される。ビオチンで標識されたダイデオ
キシリボ核酸は、分子量の増大や構造の変化により、特
にＤＮＡポリメラーゼによる取り込みが低下している。
【００２６】しかしながら、本発明では分子量の増大や
構造の変化を受けにくいＤＮＡポリメラーゼを用い、さ
らに下記工程を実施する。 ａ）配列を決定すべきＤＮＡおよびプライマーを加熱変
性する工程 ｂ）配列を決定すべきＤＮＡに対して、上記プライマー
をハイブリダイズする工程 ｃ）非修飾ヌクレオチド三燐酸、上記化２で示される標
識修飾ヌクレオチド三燐酸誘導体および核酸合成酵素を
用いて、伸長反応と非特異的連鎖中断反応および特異的
連鎖中断反応を伴うＤＮＡ合成工程 ｄ）特異的連鎖中断反応により生成されたＤＮＡフラグ
メントのみを非電気的に検出する工程
構造の変化を受けにくいＤＮＡポリメラーゼを用い、さ
らに下記工程を実施する。 ａ）配列を決定すべきＤＮＡおよびプライマーを加熱変
性する工程 ｂ）配列を決定すべきＤＮＡに対して、上記プライマー
をハイブリダイズする工程 ｃ）非修飾ヌクレオチド三燐酸、上記化２で示される標
識修飾ヌクレオチド三燐酸誘導体および核酸合成酵素を
用いて、伸長反応と非特異的連鎖中断反応および特異的
連鎖中断反応を伴うＤＮＡ合成工程 ｄ）特異的連鎖中断反応により生成されたＤＮＡフラグ
メントのみを非電気的に検出する工程
【００２７】工程ａ）〜ｃ）を複数回、好ましくは５〜
６０回繰り返すことにより、標識されたダイデオキシリ
ボ核酸が核酸合成酵素により取り込まれる機会を増加さ
せることにより、感度の増大を図ることが可能である。
また、本発明の方法によれば、核酸合成酵素が特異的連
鎖中断反応に失敗したＤＮＡについては検出されないの
でノイズを低減できる。また検出には電気的な検出を伴
わない。
６０回繰り返すことにより、標識されたダイデオキシリ
ボ核酸が核酸合成酵素により取り込まれる機会を増加さ
せることにより、感度の増大を図ることが可能である。
また、本発明の方法によれば、核酸合成酵素が特異的連
鎖中断反応に失敗したＤＮＡについては検出されないの
でノイズを低減できる。また検出には電気的な検出を伴
わない。
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、ＤＮＡの検出に必要な
標識物質をダイデオキシンヌクレオチド三燐酸へ付加し
た新規なＤＮＡプローブを使用することにより、ＤＮＡ
の塩基配列決定の際のノイズの低減、すなわち正確性を
向上させる。また放射性同位元素や特殊な機器を用いず
にＤＮＡの塩基配列を決定することができる。本発明で
は標識として、ビオチンを使用する際のＤＮＡポリメラ
ーゼによる取り込みによる低下を減少させることが可能
である。
標識物質をダイデオキシンヌクレオチド三燐酸へ付加し
た新規なＤＮＡプローブを使用することにより、ＤＮＡ
の塩基配列決定の際のノイズの低減、すなわち正確性を
向上させる。また放射性同位元素や特殊な機器を用いず
にＤＮＡの塩基配列を決定することができる。本発明で
は標識として、ビオチンを使用する際のＤＮＡポリメラ
ーゼによる取り込みによる低下を減少させることが可能
である。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例および比較例により具
体的に説明する。 比較例１（結果１）Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマーラベル法に
よるシークエンシング反応 Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ ５０ｆｍｏｌ、ビオチン標識ユ
ニバーサルプライマー（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＧＣＣ
ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−
３’）１ｐｍｏｌｅを反応用緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５
０ｍＭ ＮａＣｌ）１０μｌに溶解した。６５℃で２分
間加熱した後、３０分かけて室温に戻すことにより鋳型
とプライマーをハイブリダイズさせた。次いで０．１Ｍ
ジチオスレイトール１μｌ、１ＵＴ７ＤＮＡポリメラー
ゼを加え、全量を１５．５μｌにした。この混合液を
３．５μｌずつ４本のチューブに分注し、第１のチュー
ブには各８０μＭ デオキシヌクレオチド三燐酸、８μ
Ｍ ２’−ダイデオキシグアノシン−５’−三燐酸２．
５μｌ、第２のチューブには各８０μＭ デオキシヌク
レオチド三燐酸、８μＭ ２’−ダイデオキシアデノシ
ン−５’−三燐酸 ２．５μｌ、第３のチューブには各
８０μＭ デオキシヌクレオチド三燐酸、８μＭ ２’
−ダイデオキシシチジン−５’−三燐酸２．５μｌ、第
４のチューブには各８０μＭ デオキシヌクレオチド三
燐酸、８μＭ ２’−ダイデオキシチミジン−５’−三
燐酸２．５μｌを加えた。
体的に説明する。 比較例１（結果１）Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマーラベル法に
よるシークエンシング反応 Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ ５０ｆｍｏｌ、ビオチン標識ユ
ニバーサルプライマー（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＧＣＣ
ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−
３’）１ｐｍｏｌｅを反応用緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５
０ｍＭ ＮａＣｌ）１０μｌに溶解した。６５℃で２分
間加熱した後、３０分かけて室温に戻すことにより鋳型
とプライマーをハイブリダイズさせた。次いで０．１Ｍ
ジチオスレイトール１μｌ、１ＵＴ７ＤＮＡポリメラー
ゼを加え、全量を１５．５μｌにした。この混合液を
３．５μｌずつ４本のチューブに分注し、第１のチュー
ブには各８０μＭ デオキシヌクレオチド三燐酸、８μ
Ｍ ２’−ダイデオキシグアノシン−５’−三燐酸２．
５μｌ、第２のチューブには各８０μＭ デオキシヌク
レオチド三燐酸、８μＭ ２’−ダイデオキシアデノシ
ン−５’−三燐酸 ２．５μｌ、第３のチューブには各
８０μＭ デオキシヌクレオチド三燐酸、８μＭ ２’
−ダイデオキシシチジン−５’−三燐酸２．５μｌ、第
４のチューブには各８０μＭ デオキシヌクレオチド三
燐酸、８μＭ ２’−ダイデオキシチミジン−５’−三
燐酸２．５μｌを加えた。
【００３０】この反応混合物を３７℃、５分間反応させ
た。第１、２、３、４のそれぞれのチューブに反応停止
液（９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ エチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム、０．０５％ ブロムフェノールブ
ルー、０．０５％ キシレンシアノール）を４μｌずつ
加えた。８０℃で２分間加熱した後、氷上にて急冷し
た。
た。第１、２、３、４のそれぞれのチューブに反応停止
液（９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ エチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウム、０．０５％ ブロムフェノールブ
ルー、０．０５％ キシレンシアノール）を４μｌずつ
加えた。８０℃で２分間加熱した後、氷上にて急冷し
た。
【００３１】実施例１（結果２）ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用いたターミネーターラベ
ル法によるシークエンシング反応 Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ ５０ｆｍｏｌ、ユニバーサルプ
ライマー（５’−ＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）１ｐｍｏｌｅ、２００μ
Ｍ デオキシヌクレオチド三燐酸各１μｌ、反応用緩衝
液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、７ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、５μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミ
ン、）３μｌ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡
績）４単位を混合し、１７μｌの容量にした。この混合
液を４μｌずつ４本のチューブに分注し、第１のチュー
ブには１．５ｍＭ ７−（Ｎ−ビオチニル−（３−アミ
ノ−１−プロピニル））−２’３’−ジデオキシ−７−
デアザグアノシン−５’−三燐酸（化３）２μｌ、第２
のチューブには１．５ｍＭ ７−（Ｎ−ビオチニル−
（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’−ジデオ
キシ−７−デアザアデノシン−５’−三燐酸（化４）２
μｌ、第３のチューブには１．５ｍＭ ５−（Ｎ−ビオ
チニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’
−ジデオキシウリジン−５’−三燐酸（化５）２μｌ、
第４のチューブには１．５ｍＭ ５−（Ｎ−ビオチニル
−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’−ジデ
オキシシチジン−５’−三燐酸（化６）２μｌを加え
た。
ル法によるシークエンシング反応 Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ ５０ｆｍｏｌ、ユニバーサルプ
ライマー（５’−ＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）１ｐｍｏｌｅ、２００μ
Ｍ デオキシヌクレオチド三燐酸各１μｌ、反応用緩衝
液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍ
Ｍ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、７ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、５μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミ
ン、）３μｌ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡
績）４単位を混合し、１７μｌの容量にした。この混合
液を４μｌずつ４本のチューブに分注し、第１のチュー
ブには１．５ｍＭ ７−（Ｎ−ビオチニル−（３−アミ
ノ−１−プロピニル））−２’３’−ジデオキシ−７−
デアザグアノシン−５’−三燐酸（化３）２μｌ、第２
のチューブには１．５ｍＭ ７−（Ｎ−ビオチニル−
（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’−ジデオ
キシ−７−デアザアデノシン−５’−三燐酸（化４）２
μｌ、第３のチューブには１．５ｍＭ ５−（Ｎ−ビオ
チニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’
−ジデオキシウリジン−５’−三燐酸（化５）２μｌ、
第４のチューブには１．５ｍＭ ５−（Ｎ−ビオチニル
−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’−ジデ
オキシシチジン−５’−三燐酸（化６）２μｌを加え
た。
【００３２】この反応混合物を鉱油２０μｌで被覆し、
温度プログラミング可能なブロック(Thermal cycler PJ
-500, Perkin Elmer Cetus) 中で９５℃、３０秒；６０
℃、３０秒；及び７２℃、１分からなる温度循環を３０
回行った。第１、２、３および４のそれぞれのチューブ
に反応停止液（９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ エチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム、０．０５％ ブロムフ
ェノールブルー、０．０５％ キシレンシアノール）を
４μｌずつ加えた。８０℃で２分間加熱した後、氷上に
て急冷した。
温度プログラミング可能なブロック(Thermal cycler PJ
-500, Perkin Elmer Cetus) 中で９５℃、３０秒；６０
℃、３０秒；及び７２℃、１分からなる温度循環を３０
回行った。第１、２、３および４のそれぞれのチューブ
に反応停止液（９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ エチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム、０．０５％ ブロムフ
ェノールブルー、０．０５％ キシレンシアノール）を
４μｌずつ加えた。８０℃で２分間加熱した後、氷上に
て急冷した。
【００３３】実施例１および比較例１変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 幅２０ｃｍ、長さ４０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍの変性アク
リルアミドゲル（８％アクリルアミド、７Ｍ 尿素、８
９ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）、８９ｍＭ
硼酸、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、１
０％ ホルムアミド）に、上記実施例１および比較例１
の各第１、２、３、４の反応液を２μｌずつ順に添加
し、２５Ｗで２時間電気泳動を行った。
リルアミドゲル（８％アクリルアミド、７Ｍ 尿素、８
９ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）、８９ｍＭ
硼酸、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、１
０％ ホルムアミド）に、上記実施例１および比較例１
の各第１、２、３、４の反応液を２μｌずつ順に添加
し、２５Ｗで２時間電気泳動を行った。
【００３４】ナイロンメンブレンへの転写およびＤＮＡ
フラグメントの検出 泳動の終了した変性アクリルアミドゲルを片方のガラス
板に剥し、ナイロンメンブレン（バイオダインＢ、ＰＡ
ＬＬ）を密着させ、２．５ｇ／平方センチメートルの荷
重を一晩かけ、ゲル中のＤＮＡフラグメントをナイロン
メンブレンに転写した。転写したナイロンメンブレンを
ブロッキング緩衝液（２５ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７．
２）、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、５％ ドデシル硫
酸ナトリウム）で、０．５ｍｌ／平方センチメートルの
割合で５分間処理した。続いて、１μｇ／ｍｌのストレ
プトアビジンを含むブロッキング緩衝液で、０．５ｍｌ
／平方センチメートルの割合で５分間処理した。続い
て、１／１０濃度のブロッキング緩衝液で１ｍｌ／平方
センチメートルの割合で３分間処理し、この操作を２回
繰り返した。続いて、５０ｎｇ／ｍｌのビオチンおよび
アルカリホスファターゼを含むブロッキング緩衝液で、
０．５ｍｌ／平方センチメートルの割合で５分間処理し
た。続いて、１／１０濃度のブロッキング緩衝液で１ｍ
ｌ／平方センチメートルの割合で３分間処理し、この操
作を２回繰り返した。続いて、洗浄液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．６）、１０ｍＭ 塩化ナトリウ
ム、１ｍＭ 塩化マグネシウム）で１ｍｌ／平方センチ
メートルの割合で３分間処理し、この操作を２回繰り返
した。続いて、発光液（０．７５Ｍ ２−アミノ−２−
メチル−１−プロパノール（ｐＨ９．６）、１ｍＭ 塩
化マグネシウム、１ｍＭ 臭化セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド、２０ｎｇ／ｍｌ ＰＰＤ）で０．５ｍ
ｌ／平方センチメートルの割合で５分間処理し、発光液
を除いた後、３０分間室温に放置した。続いて、暗室に
て処理したナイロンメンブレンをＸ線フィルムに密着さ
せ、３０分間露光し現像した。得られたＤＮＡフラグメ
ントパターンを解析することによりＤＮＡの塩基配列を
決定した。
フラグメントの検出 泳動の終了した変性アクリルアミドゲルを片方のガラス
板に剥し、ナイロンメンブレン（バイオダインＢ、ＰＡ
ＬＬ）を密着させ、２．５ｇ／平方センチメートルの荷
重を一晩かけ、ゲル中のＤＮＡフラグメントをナイロン
メンブレンに転写した。転写したナイロンメンブレンを
ブロッキング緩衝液（２５ｍＭ 燐酸緩衝液（ｐＨ７．
２）、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、５％ ドデシル硫
酸ナトリウム）で、０．５ｍｌ／平方センチメートルの
割合で５分間処理した。続いて、１μｇ／ｍｌのストレ
プトアビジンを含むブロッキング緩衝液で、０．５ｍｌ
／平方センチメートルの割合で５分間処理した。続い
て、１／１０濃度のブロッキング緩衝液で１ｍｌ／平方
センチメートルの割合で３分間処理し、この操作を２回
繰り返した。続いて、５０ｎｇ／ｍｌのビオチンおよび
アルカリホスファターゼを含むブロッキング緩衝液で、
０．５ｍｌ／平方センチメートルの割合で５分間処理し
た。続いて、１／１０濃度のブロッキング緩衝液で１ｍ
ｌ／平方センチメートルの割合で３分間処理し、この操
作を２回繰り返した。続いて、洗浄液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．６）、１０ｍＭ 塩化ナトリウ
ム、１ｍＭ 塩化マグネシウム）で１ｍｌ／平方センチ
メートルの割合で３分間処理し、この操作を２回繰り返
した。続いて、発光液（０．７５Ｍ ２−アミノ−２−
メチル−１−プロパノール（ｐＨ９．６）、１ｍＭ 塩
化マグネシウム、１ｍＭ 臭化セチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド、２０ｎｇ／ｍｌ ＰＰＤ）で０．５ｍ
ｌ／平方センチメートルの割合で５分間処理し、発光液
を除いた後、３０分間室温に放置した。続いて、暗室に
て処理したナイロンメンブレンをＸ線フィルムに密着さ
せ、３０分間露光し現像した。得られたＤＮＡフラグメ
ントパターンを解析することによりＤＮＡの塩基配列を
決定した。
【００３５】その結果を図１に示す。図１中、結果１
は、比較例１（プライマーラベル＋Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ）、結果２は実施例１（ビオチンターミネーター＋
ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）の結果を示す電気泳動の写
真である。図１から明らかなように、本発明ではノイズ
が見られないが、比較例では多数のノイズが見られる。
は、比較例１（プライマーラベル＋Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ）、結果２は実施例１（ビオチンターミネーター＋
ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）の結果を示す電気泳動の写
真である。図１から明らかなように、本発明ではノイズ
が見られないが、比較例では多数のノイズが見られる。
【図１】 本発明および比較例におけるシークエンシン
グ反応結果を示す電気泳動の写真である。
グ反応結果を示す電気泳動の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内
Claims (18)
- 【請求項１】 下記工程からなる改良されたＤＮＡの塩
基配列決定法。 ａ）配列を決定すべきＤＮＡおよびプライマーを加熱変
性する工程 ｂ）配列を決定すべきＤＮＡに対して、上記プライマー
をハイブリダイズする工程 ｃ）非修飾ヌクレオチド三燐酸、下記化１で示される標
識修飾ヌクレオチド三燐酸誘導体および核酸合成酵素を
用いて、伸長反応と非特異的連鎖中断反応および特異的
連鎖中断反応を伴うＤＮＡ合成工程 ｄ）特異的連鎖中断反応により生成されたＤＮＡフラグ
メントを非電気的に検出する工程 【化１】 （式中、Ｑは、７−デアザアデニン、７−デアザグアニ
ン、シトシンまたはウラシル残基であり、Ｒ1 、Ｒ2 、
Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立に、水素原子、ナトリ
ウム原子またはリチウム原子を表す。ただしナトリウム
原子とリチウム原子が同時に存在することはない。Ａは
標識を示す。） - 【請求項２】 標識がビオチン、ジコキシゲニン、酵素
または蛍光色素であることを特徴とする請求項１記載の
改良されたＤＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項３】 ヌクレオチド三燐酸誘導体が、ダイデオ
キシ−７−デアザヌクレオチド−５’−三燐酸であるこ
とを特徴とする請求項１記載の改良されたＤＮＡの塩基
配列決定法。 - 【請求項４】 標識修飾ヌクレオチド誘導体が、７−
（Ｎ−ビオチニル−（３−アミノ−１−プロピニル））
−２’３’−ダイデオキシ−７−デアザグアノシン−
５’−三燐酸、７−（Ｎ−ビオチニル−（３−アミノ−
１−プロピニル））−２’３’−ダイデオキシ−７−デ
アザアデノシン−５’−三燐酸、５−（Ｎ−ビオチニル
−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’−ダイ
デオキシウリジン−５’−三燐酸または５−（Ｎ−ビオ
チニル−（３−アミノ−１−プロピニル））−２’３’
−ダイデオキシシチジン−５’−三燐酸であることを特
徴とする請求項１記載の改良されたＤＮＡの塩基配列決
定法。 - 【請求項５】 標識は信号を生じさせる物質と複合体を
形成し、信号を生じることを特徴とする請求項１記載の
改良されたＤＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項６】 標識がビオチンであり、信号を生じさせ
る物質がアビジンおよびアルカリホスファターゼである
ことを特徴とする請求項１記載の改良されたＤＮＡの塩
基配列決定法。 - 【請求項７】 標識がビオチンであり、信号を生じさせ
る物質がアビジン、ビオチンおよびアルカリホスファタ
ーゼであることを特徴とする請求項１記載の改良された
ＤＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項８】 標識がジコキシゲニンであり、信号を生
じさせる物質が抗ジコキシゲニンおよびアルカリホスフ
ァターゼであることを特徴とする請求項１記載の改良さ
れたＤＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項９】 標識が蛍光物質であり、信号を生じさせ
る物質が抗蛍光色素およびアルカリホスファターゼであ
ることを特徴とする請求項１記載の改良されたＤＮＡの
塩基配列決定法。 - 【請求項１０】 標識がアルカリホスファターゼであ
り、信号を生じる物質が１，２−ジオキセタン誘導体で
あることを特徴とする請求項１記載の改良されたＤＮＡ
の塩基配列決定法。 - 【請求項１１】 標識がアリカリホスファターゼであ
り、信号を生じる物質が、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−燐酸およびニトロブルーテトラゾリウム
であることを特徴とする請求項１記載の改良されたＤＮ
Ａの塩基配列決定法。 - 【請求項１２】 非修飾ヌクレオチド三燐酸が、デオキ
シヌクレオチド三燐酸であることを特徴とする請求項１
記載の改良されたＤＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項１３】 核酸合成酵素として、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼを欠失したＤＮＡ
ポリメラーゼまたは３’→５’エキソヌクレアーゼを欠
失したＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする請
求項１記載の改良されたＤＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項１４】 ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑａｔｉｃｕｓ由来の
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼの少なくと
も一つであることを特徴とする請求項１３記載の改良さ
れたＤＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項１５】 核酸合成酵素として、５’→３’エキ
ソヌクレアーゼおよび／または３’→５’エキソヌクレ
アーゼを欠失したＤＮＡポリメラーゼを用いることを特
徴とする請求項１記載の改良されたＤＮＡの塩基配列決
定法。 - 【請求項１６】 工程ａ）〜ｃ）を複数回繰り返すこと
を特徴とする請求項１記載の改良されたＤＮＡの塩基配
列決定法。 - 【請求項１７】 ２段階叉は３段階の反応を異なる温度
で行うことを特徴とする請求項１６記載の改良されたＤ
ＮＡの塩基配列決定法。 - 【請求項１８】 標識修飾されたヌクレオチド三燐酸誘
導体が、非修飾ヌクレオチド三燐酸に対して、１／１０
〜５０／１倍の濃度（ｖ／ｖ）であることを特徴とする
請求項１記載の改良されたＤＮＡの塩基配列決定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10850494A JPH07313198A (ja) | 1994-05-23 | 1994-05-23 | 改良されたｄｎａの塩基配列決定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10850494A JPH07313198A (ja) | 1994-05-23 | 1994-05-23 | 改良されたｄｎａの塩基配列決定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07313198A true JPH07313198A (ja) | 1995-12-05 |
Family
ID=14486460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10850494A Pending JPH07313198A (ja) | 1994-05-23 | 1994-05-23 | 改良されたｄｎａの塩基配列決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07313198A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007521833A (ja) * | 2004-02-12 | 2007-08-09 | コンパス ジェネティクス エルエルシー | 配列特異的分類による遺伝的分析 |
| JP2010132578A (ja) * | 2008-12-02 | 2010-06-17 | Kyushu Univ | ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブおよび標的核酸の検出方法 |
| US8148068B2 (en) | 2005-02-10 | 2012-04-03 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
-
1994
- 1994-05-23 JP JP10850494A patent/JPH07313198A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007521833A (ja) * | 2004-02-12 | 2007-08-09 | コンパス ジェネティクス エルエルシー | 配列特異的分類による遺伝的分析 |
| US8148068B2 (en) | 2005-02-10 | 2012-04-03 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US8168385B2 (en) | 2005-02-10 | 2012-05-01 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US8318433B2 (en) | 2005-02-10 | 2012-11-27 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US8470996B2 (en) | 2005-02-10 | 2013-06-25 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US8476018B2 (en) | 2005-02-10 | 2013-07-02 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US9018365B2 (en) | 2005-02-10 | 2015-04-28 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US9194001B2 (en) | 2005-02-10 | 2015-11-24 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| JP2010132578A (ja) * | 2008-12-02 | 2010-06-17 | Kyushu Univ | ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブおよび標的核酸の検出方法 |
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