JPH0731456A

JPH0731456A - 細胞融合装置

Info

Publication number: JPH0731456A
Application number: JP5183631A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Suzuki; 弘之鈴木; Toshio Yasunaka; 敏男安中; Makoto Aoki; 真青木
Original assignee: Tokimec Inc
Current assignee: Tokyo Keiki Inc
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1995-02-03

Abstract

(57)【要約】【目的】融合操作を自動的に実行することができる細
胞融合装置。【構成】搬送手段と、会合手段と、融合手段と、後処
理手段との実行を制御する制御装置を有し、観察手段
は、視野内の画像を画像データとして上記制御装置に送
信し、上記制御装置は、上記画像データを解析する機能
と、該解析結果に応じて、上記搬送手段と、上記会合手
段と、上記融合手段と、上記後処理手段とのうち、少な
くとも１の手段の動作を制御する機能とを有することを
特徴とする細胞融合装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はバイオテクノロジーの分
野において、細胞を融合させる細胞融合装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、この種の細胞融合装置としては、
例えば図２に示すようなものがある。図２に示す細胞融
合装置は、細胞を観察するための顕微鏡２１と細胞に電
圧を印加するための一対の電極２２と該電極２２に電圧
を印加するための電源２３と、スタンド２４と、上記顕
微鏡２１の視野を照らすための照明２５とを有する。ス
タンド２４は、上記顕微鏡２１と、上記照明２５を支持
する。また、スタンド２４は、ステージ２９と、水平部
材２６とを備える。上記電極２２は棒状であり先端が細
く、スタンド２４に接続した水平部材２６に移動可能に
取付けられている。

【０００３】操作者は、まず、スタンド２４のステージ
２９上に、融合に供する細胞２８を懸濁させた懸濁液の
入ったシャーレ２７を置く。次に、顕微鏡２１で細胞を
観察しながら、電極２２で細胞を押して移動させ、融合
させる細胞２８どうしを接触させる。電極２２で細胞を
会合させた状態のまま、電極２２に直流パルスを印加す
れば、細胞が融合する（Senda et.al., Plant and Cell
Physiol. 20(7) 1441-1443 (1979) ）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな従来の細胞融合装置にあっては、熟練した操作者が
て作業で融合を行わなければならず、一回の融合操作に
も時間がかかり、また、多大な労力が必要となる。ゆえ
に、このような細胞融合装置で、大量の融合細胞を得る
ことは、現実的ではない。なお、ここで融合操作とは、
細胞の選択、搬送、会合、融合、および、後処理を含む
工程をいう。

【０００５】そこで、本発明は、上記融合操作を自動的
に実行することができる細胞融合装置を提供することを
目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、融合に供するための細胞を保持する、少
なくとも１つの懸濁液チャンバと、細胞を融合するため
の融合チャンバと、融合処理後の細胞を回収するための
回収チャンバと、視野内を観察する観察手段と、細胞を
搬送する搬送手段と、細胞を会合させる会合手段と、細
胞を融合させる融合手段と、融合処理後の後処理を行う
後処理手段とを有する細胞融合装置において、上記搬送
手段と、上記会合手段と、上記融合手段と、上記後処理
手段との実行を制御する制御装置を有し、上記観察手段
は、視野内の画像を画像データとして上記制御装置に送
信する機能を有し、上記制御装置は、上記画像データを
解析する機能と、該解析結果に応じて、上記搬送手段、
上記会合手段、上記融合手段、および、上記後処理手段
のうち、少なくとも１の手段の動作を制御する機能とを
有することを特徴とする細胞融合装置を提供する。

【０００７】さらに、本発明は、前記画像データを解析
する機能は、細胞の輪郭および／または位置を検出し、
該輪郭の形および／または位置に基いて判断を下す機能
を有することを特徴とする細胞融合装置を提供する。

【０００８】また、前記搬送手段は、細胞に光を照射
し、該光のスポットの照射位置を移動することにより細
胞を移動する、光トラッピング現象を用いた搬送機構を
有し、前記画像データを解析する機能は、上記光スポッ
トの照射位置および／または輪郭を検出する機能を有
し、前記制御装置は、上記照射位置および／または輪郭
に基いて、搬送手段の制御を行う機能を有することを特
徴とする細胞融合装置を提供する。

【０００９】

【作用】本発明の細胞融合装置は、顕微鏡に取付けたモ
ニタカメラからの画像データをパターン認識して、細
胞、器壁、およびレーザー光のスポットの輪郭および位
置を求める。さらに、求めた輪郭を解析することによ
り、融合に供する細胞の選択、会合および融合の成否の
判断、光トラッピングによる搬送速度および搬送位置の
制御、レーザー光のスポットの大きさの調節、会合のた
めに印加する高周波電圧の強さの調節、融合のために印
加する直流パルスの回数などの調節、を行う。これによ
り、本発明の細胞融合装置は、細胞の搬送、会合、およ
び融合を自動的におこなうものである。また、本発明の
細胞融合装置は、上記の各処理を繰り返して実行するこ
とができる。

【００１０】なお、細胞の輪郭は、次のようにして求め
る。まず、輪郭を求める細胞が入り得ると考えられる大
きさの矩形領域を対象にヒストグラムから閾値を設定
し、２値化処理により細胞（領域）を求める。あるい
は、上記の矩形領域内において画像の微分処理、または
差分処理を行い、細胞の輪郭を求める。

【００１１】通常、細胞はほぼ円形をしているため、本
発明の細胞融合装置は、顕微鏡視野内の細胞のうち、最
も円に近い輪郭を有する細胞を、融合に供する細胞とし
て決定する。また、会合した細胞や、融合直後の細胞
は、複数の円を接触させた形をしているため、細胞の輪
郭により、会合および融合の成否を認識することができ
るのである。

【００１２】本発明の細胞融合装置は、細胞の搬送のた
めに、光トラッピング現象と誘電泳動現象とを利用す
る。まず、細胞を懸濁させた細胞懸濁液を保持する懸濁
液チャンバ内から、電極の近傍まで、光トラッピング現
象により搬送する。すなわち、融合に供する細胞に、レ
ーザー光を照射して細胞を捕捉し、照射位置を移動させ
ることにより捕捉した細胞を搬送する。

【００１３】光トラッピング現象とは、光により粒体が
捕捉される現象である。これは、光が周囲溶媒と細胞と
の境界面で屈折する際に、光子のもつ運動量の向きが変
化するため、反射、屈折のいずれの場合にも、光と物体
の運動量が保存されるような方向に力が発生することに
よるものである。この力は、レーザー光線の強度が強い
方向への成分を有するため、細胞をレーザー光線の光軸
付近に捕促できる。この現象を利用すれば、レーザー光
線に捕捉した細胞を、レーザー光源を移動させることに
より搬送し、所望の位置に配置することができる。

【００１４】つぎに、本発明の細胞融合装置は、誘電泳
動現象により、電極の近傍に配置された細胞を会合させ
る。すなわち、電極に高周波電圧を印加し、これによっ
て、細胞どうしを互いに接近させ、会合させる。

【００１５】誘電泳動現象は、高周波交番電界中で電気
的中性粒子に生ずる分極によって中性粒子どうしが電界
方向につながったり、中性粒子が電界強度の強い方へひ
かれたりする現象である。細胞は電気的中性粒子なの
で、誘電泳動により移動させ、会合させることができ
る。

【００１６】

【実施例】以下、本発明の実施例を図２を用いて説明す
る。本実施例の細胞融合装置は、細胞の状態を観察する
ための観察部１６と、細胞を保持する各チャンバと該チ
ャンバ間の流路とを備える細胞保持部１７と、細胞を搬
送するためのレーザー光を発生するレーザー光発生部１
８と、上記各部を制御する制御装置１９とを備える。

【００１７】観察部１６は、細胞の状態を観察するため
の顕微鏡１２と、顕微鏡により得られた画像を制御装置
１９に画像データとして送信するための、ＣＣＤカメラ
などのモニタカメラ１３とを有する。なお、顕微鏡１２
は、融合に供する細胞の大きさによっては、拡大鏡であ
ってもよい。

【００１８】細胞保持部１７は、保持する液体が流動し
ないように、水平に保たれているチャンバ台７と、該チ
ャンバ台７を、水平を保ったまま移動させるための移動
機構であるチャンバ台用ＸＹＺステージ８とを備える。
チャンバ台用ＸＹＺステージ８は、図示しない駆動装置
を有する。

【００１９】チャンバ台７には、細胞を会合、融合させ
るための１対の電極１と、細胞の懸濁液を保持する懸濁
液チャンバ３と、細胞融合を行うための融合チャンバ２
と、融合した細胞を回収するための回収チャンバ４と、
融合に失敗した細胞を回収するための廃棄チャンバ５と
を備える。また、各チャンバ間は、幅５０μｍ、長さ５
ｍｍの流路が設けられている。なお、本実施例では、直
径約３０μｍのプロトプラストを用いた。各流路の長さ
は、電極１に高周波電圧を印加した際に、懸濁液チャン
バ３、回収チャンバ４、および廃棄チャンバ５に保持さ
れている細胞が、該高周波電圧による誘電泳動を起こし
て、融合チャンバ２に引き込まれない程度に長くなけれ
ばならない。

【００２０】本実施例では、２種の細胞を融合させるた
め、２つの懸濁液チャンバ３が設けられている。しか
し、懸濁液チャンバ３は、融合させる細胞の種類に応じ
て用意され、同一の細胞のみを融合させる場合には、懸
濁液チャンバ３は１つで足りる。上記融合チャンバ２
は、上記対向する電極１の間隙に設けられている。ま
た、細胞保持部１７は、上記電極１のための駆動装置６
を有する。該駆動装置６は、電源を有し、上記電極１間
に高周波電圧および直流パルスを発生させることができ
る。また、上記駆動装置６は、高周波電圧の周波数、振
幅、継続時間および直流パルスの電圧、継続時間を調整
できる。

【００２１】対向する電極１間の間隙は、本実施例では
１ｍｍとした。また、本実施例では、高周波電圧は、周
波数５００ＫＨｚ〜１ＭＨｚ、電圧１〜２０Ｖ／ｍｍと
し、直流パルスは、７５Ｖ／ｍｍ、１０μ秒とした。

【００２２】なお、チャンバ台、チャンバ、および、流
路の、レーザー光を照射する側の器壁は、レーザー光を
吸収、反射しない素材であることが望ましい。本実施例
では、チャンバ台の下からレーザー光を照射する。この
ため、本実施例のチャンバ台７底部はガラス製である。

【００２３】レーザー光発生部１８は、レーザー光を発
生するレーザー光源９と、該レーザー光源９を移動させ
るためのレーザー光源用ＸＹＺステージ１０と、レーザ
ー光源用駆動装置１１とを有する。上記レーザー光源９
は、レーザー光を発生し、該光を集光させるための機構
であり、本実施例では、３０ｍＷの半導体レーザーを用
いて近赤外域のレーザー光を発生させた。また、上記レ
ーザー光源９は、コリメート機構を有し、さらに、光軸
調整されており、焦点距離を変更することの可能な集光
レンズを有する。駆動装置１１は、電源を有し、上記レ
ーザー光源９によるレーザー光の発生を制御する。ま
た、上記駆動装置は、電子的なリレーを備え、このリレ
ーを制御装置１９からの信号に応じて開閉することによ
り、制御される。

【００２４】本実施例では、レーザー光発生部１８は、
照射されるレーザー光をチャンバ台７の底面に任意の角
度で入射させることができるように構成されており、レ
ーザー光源用ＸＹＺステージ１０は、図示しない駆動装
置を有し、レーザー光の入射角度を一定に維持したま
ま、チャンバ内の任意の位置にレーザー光を照射できる
よう、レーザー光源９を移動させることができる。

【００２５】なお、本実施例では、チャンバ台用ＸＹＺ
ステージ８と、レーザー光源用ＸＹＺステージ１０とを
両方備えているが、本実施例では、レーザー光源用ＸＹ
Ｚステージ１０を、レーザー光をチャンバ台７の任意の
位置に照射させるために用い、チャンバ台用ＸＹＺステ
ージ８を顕微鏡１２の視野をチャンバ台７の任意の位置
にするために用いている。しかし、本発明は、上述の移
動機構に限定されるものではない。レーザー光をチャン
バ台７の任意の位置に照射でき、さらに、顕微鏡１２の
視野をチャンバ台７の任意の位置にすることのできる機
構であればいかなる機構であってもよい。

【００２６】上記２つのＸＹＺステージ８、１０は、３
方向の軸（Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸）についてそれぞれマイク
ロメータ（図示せず）を有する。該マイクロメータを回
動させることにより、ＸＹＺステージ８、１０をＸ、
Ｙ、Ｚの各軸方向へそれぞれ直動させることができる。
なお、各方向のステージの取付順序は、図示した通りで
なくてもよい。

【００２７】また、上記２つのＸＹＺステージ８、１０
は、上記マイクロメータ毎に上記マイクロメータを回動
させる駆動装置（図示せず）を有する。該駆動装置は、
外部からの電気的な信号（電圧値）に応じて上記マイク
ロメータを任意の回転角で回動させる。本実施例では、
該駆動装置にステッピングモータを用いたが、超音波モ
ータなどを用いてもよい。上記制御装置１９は、該駆動
装置に信号を送ることで、上記マイクロメータによる移
動を制御でき、ステージの微小な移動およびＸ、Ｙ、Ｚ
各軸以外の方向への直進的な移動、曲線に沿った移動等
を行わせることが可能となる。なお、本実施例では、鉛
直方向をＺ軸、水平方向のうち、電極１間の電気力線の
方向をＸ軸、電気力線に直交する方向をＹ軸とした。

【００２８】本実施例では、上記駆動装置に、Ａ相、Ｂ
相の２相を有する２相ステッピングモータを用い、マイ
クロステッピング方式で駆動する。例えば、１／４波長
ずらせた正弦波をデジダイズしたマイクロステップによ
り、Ａ相、Ｂ相をそれぞれ駆動する。このようにすれ
ば、マイクロステップの分解能に比例した滑らかさ、精
度、位置ぎめで、ステージを移動させることができる。
移動速度は、マイクロステップの周期あるいは時間幅で
調節できる。また、チャンバ台の位置を正確に把握でき
るため、チャンバ間の細い流路内を、レーザー光の照射
位置や、顕微鏡１２の視野位置を、チャンバ間の細い流
路内で正確に移動させることができる。例えば、チャネ
ルの長手方向をＸＹ平面（チャンバ台の底面に水平な平
面）上の直線で表し、この直線に沿って（平行して）正
確に移動させることが容易に可能である。さらに、移動
速度をコントロールできるため、常に一定速度で移動さ
せる、緩急をつけて移動させる等細胞の移動し易さに応
じて任意に移動速度を変化させることが容易にできる。

【００２９】制御装置１９は、上記各部との信号の送受
信の制御を行うインタフェース部３０と、操作者の入力
を受け付け、処理結果などを出力する入出力装置３４
と、演算処理を行う中央処理装置３１と、データを保持
する記憶装置３２とを有する。さらに、制御装置１９
は、操作者の入力を受け付ける入力装置３４と、モニタ
カメラ１３を介して得られた画像や、処理結果などを出
力する出力装置３３とを有する。本実施例では、出力装
置３３として、画像データの出力を高速に行うことがで
きるため、テレビモニタを用いているが、他の出力手段
を用いてもよい。

【００３０】制御装置１９は、電極１への電圧の印加の
制御、チャンバ台用ＸＹＺステージ８の移動による顕微
鏡の視野位置の移動の制御、レーザー光源用ＸＹＺステ
ージ１０の駆動によるレーザー光の照射位置の移動の制
御、レーザー光源９からのレーザー光の照射の制御、お
よびレーザー光源９内の集光レンズの焦点距離の移動の
制御などを行う。

【００３１】本実施例の細胞融合装置内の、制御装置１
９の機能に関係する部分のハードウエア構成の概略を、
図３に示す。制御装置１９はデータバス３５を有する。
本実施例では、１６bitの論理回路をデータバス３５と
して用いた。また、制御装置１９の中央演算装置３１
は、画像処理部３１ａと演算処理部３１ｂとを有する。
上記画像処理部３１ａと、演算処理部３１ｂとは、機能
に応じた区分けであり、実際には、本実施例では、どち
らの機能も、同一ハードウエア上で実現される。しか
し、それぞれの機能を専用に行うハードウエアを用意し
てもよい。制御装置１９の記憶装置３２は、フレームメ
モリ（画像メモリ）３２ａを有し、画像データを保持す
ることができる。なお、フレームメモリ３２ａに保持さ
れた画像データは、アナログ／デジタル変換器３６を経
てアナログ信号に変換され、出力装置３３に出力され
る。この、画像データの出力は、操作者の確認のために
行われるものであり、制御装置１９による細胞融合処理
に不可欠なものではない。ゆえに、このような画像デー
タの出力は、省略、または、簡略化してもよい。

【００３２】制御装置１９に対する入力には、モニタカ
メラ１３によって採取され、アナログ／デジタル変換器
３６によってデジタル信号に変換された画像データと、
入力装置の受け付けた、操作者の指示データとがある。
また、制御装置１９からの出力には、チャンバ台用ＸＹ
Ｚステージ８の駆動装置８ａ、および、レーザー光源用
ＸＹＺステージ１０の駆動装置１０ａに対する駆動の制
御データや、電極１の駆動装置６、および、レーザー光
源９の駆動装置１１に対する制御データがある。なお、
各駆動装置と制御装置１９との間には、コマンド解析器
３７が設けられている。上記各制御データは、制御装置
１９からコマンドの形で出力されるので、上記コマンド
解析器３７により該コマンドを解析し、実際に各駆動装
置の駆動情報に変換する必要があるからである。

【００３３】制御装置１９は、モニタカメラ１３により
採取された画像データを、フレームメモリ３２に保持す
る。さらに、フレームメモリ３２に保持されている画像
データは、出力装置３３に画像として出力される。ま
た、上記画像データを画像処理部３１ａは、上記画像デ
ータを画像認識処理し、細胞の輪郭を決定する。演算処
理部３１ｂは、決定された細胞の輪郭などの情報をもと
に、どの駆動装置をどのように制御するかを決定し、デ
ータバス３５を介して各駆動装置に出力する。

【００３４】本実施例における細胞融合は、次のように
して行われる。あらかじめ、融合チャンバ２、回収チャ
ンバ４、廃棄チャンバ５には、培養液が保持されてい
る。また、懸濁液チャンバ３には、融合に供する細胞の
懸濁液が保持されている。本実施例では、入力装置３４
を介して入力される、操作者の開始指示を制御装置１９
が受け付けると、以下の融合操作が開始される。また、
融合操作は、操作者の終了指示が入力されるか（ステッ
プ４０１）、あらかじめ設定された個数の融合細胞が得
られるまで（ステップ４０２）、繰り返される。

【００３５】（１）制御装置１９は、チャンバ台用ＸＹ
Ｚステージ８を駆動させ（ステップ４０３）、チャンバ
台７を水平に移動させて、顕微鏡１２の視野を懸濁液チ
ャンバ３内に設定する。ここで、制御装置１９は、視野
内の細胞１つを、融合に供する目標細胞として決定する
（ステップ４０４）。なお、この決定は、操作者が出力
装置３３の画像を観察して決定し、入力装置３４を介
し、フレームメモリにスーパーインポーズされたカーソ
ルを用いて制御装置１９に指定してもよいし、制御装置
１９が、視野内で細胞の輪郭が最も円に近いもの、など
の基準により、自ら決定してもよい。本実施例では、後
者により行う。なお、細胞の輪郭は、次のようにして求
める。まず、輪郭を求める細胞が入り得ると考えられる
大きさの矩形領域を対象にヒストグラムから閾値を設定
し、２値化処理により細胞（領域）を求める。あるい
は、上記の矩形領域内において画像の微分処理、または
差分処理を行い、細胞の輪郭を求める。この輪郭内の領
域を細胞領域とする。細胞領域の重心を細胞位置とす
る。

【００３６】（２）つぎに、制御装置１９は、画像上の
目標細胞の周りに監視エリア（ウインド）を設ける（ス
テップ４０５）。すなわち、フレームメモリに（１）の
処理で選ばれた目標細胞が完全に入るような矩形状の領
域（ウインド）を設定する。この細胞領域（細胞の種類
などにより異なるが、本実施例では、直径約３０μｍ）
より若干大きめの矩形領域（本実施例では、一辺約４０
μｍの正方形）を監視エリアとして設ける。このエリア
は、細胞の特定や、輪郭検出のための処理時間の短縮に
有効である。

【００３７】（３）制御装置１９は、レーザー光源９を
点灯する。さらに、レーザー光源用ＸＹＺステージ１０
を駆動させてレーザー光源９を移動させ、監視エリア内
の（１）で決定された目標細胞にレーザーの光軸を合わ
せ、さらに、レーザー光源９内の集光レンズの焦点距離
を制御し、レーザー光スポットの大きさを、目標細胞の
大きさに応じて調節する（ステップ４０６）。該目標細
胞は、光トラッピング現象により、レーザー光に捕促さ
れる。

【００３８】（４）制御装置１９は、視野内の流路およ
びチャンバの内壁を画像処理により検出し、さらに、細
胞位置およびレーザー光照射位置を検出する（ステップ
４０７）。なお、レーザーの照射位置は、視野内におい
て最も輝度の高い領域を求めることにより認識される。
また、レーザー光スポットは、輝度が高いため赤色カッ
トフィルタを用いて画像上の輝度を下げるつぎに、制御
装置１９は、細胞が目標位置（電極１に印加される電圧
による誘電泳動が有効に働く範囲）に達しているかどう
か検査する（ステップ４０８）。達していなければ、制
御装置１９は、チャンバ台用ＸＹＺステージ１０を駆動
させることによりチャンバ台７とレーザー光源とを相対
的に変位させ、捕捉した目標細胞を光トラッピングによ
り一定時間搬送し（ステップ４０９）、処理をステップ
４０７に戻す。なお、上記の移動方法のように、チャン
バ台７を移動させ、レーザー光の照射位置を固定すれ
ば、該照射位置は、常に顕微鏡１２の視野に収まってい
るようにできる。

【００３９】上記の細胞の搬送において、制御装置１９
は、細胞位置とレーザー光照射位置との距離があらかじ
め設定された値より小さい場合は、レーザー光源の移動
速度（チャンバ台の移動速度）を上げ（ステップ４０９
ａ）、大きい場合は、移動速度を下げる（ステップ４０
９ｂ）。このようにすれば、細胞が上記監視エリア内に
収まるように速度調整して、レーザー光に捕捉されてい
る細胞を移動させることができる。

【００４０】移動方向・距離の制御は、画像処理により
流路およびチャンバの内壁を検出し、これに沿って、細
胞およびレーザー光の照射位置が移動するように行われ
る。上記画像処理の方法としては、（２）で述べたよう
な差分あるいは微分処理により内壁の輪郭を求め、この
内壁輪郭と細胞との距離を一定にするように制御しなが
ら、内壁に対して平行に移動させる方法が用いられる。

【００４１】なお、各ステージ駆動装置８のステッピン
グモーターの回転から、顕微鏡１２の視野の、チャンバ
に対する相対位置を求めることができるため、予めコー
スを設定しておき、上記相対位置を加味して、設定され
たコースに沿って細胞およびレーザー光の照射位置を移
動させる方法を採ることもできる。また、上記の２つの
方法を組み合わせた方法を採ることもできる。すなわ
ち、大筋は予め設定されたコースにより移動させ、細か
い動きのとき（チャンバから流路へ出すとき等）、輪郭
を求める画像処理情報に基づいて正確に移動を制御する
方法である。

【００４２】（５）上記ステップ４０８で、目標位置に
達していれば、細胞は、既に誘電泳動現象により会合さ
せることのできる位置まで搬送されているので、これ以
上光トラッピング現象による搬送を行う必要はない。そ
こで、制御装置は、他に光トラッピング現象による搬送
を行うべき細胞があるかどうか検査し、全ての融合チャ
ンバ３毎に上記（１）〜（４）を実行する（ステップ４
１０）。これにより、融合させる全ての細胞が電極１付
近に配置される。

【００４３】（６）制御装置１９は、電極１間に高周波
電圧を印加し（ステップ４１１）、誘電泳動現象を生じ
させる。さらに、制御装置１９は、画像データの解析に
より、融合に供する細胞が会合したことを確認する（ス
テップ４１２）。通常、細胞はほぼ円形をしているの
で、細胞の輪郭が、２つの円を接触させた、瓢形のよう
な形（図５の（ａ）に図示）をしていれば、２つの細胞
が会合していると認識することができるのである。

【００４４】まだ細胞が会合していない場合は、電圧が
上限値なら（ステップ４１３）、廃棄チャンバ経搬送し
（ステップ４１６）、処理をステップ４０１へ戻して、
再度、融合チャンバから新たな細胞を得る。また、電圧
が上限値でない場合、制御装置１９は、細胞が破壊され
ていないかどうかを、細胞の輪郭がまだ円形かどうかで
判断する（ステップ４１４）。破壊されている場合は、
電圧が上限値の場合と同様、ステップ４１６の処理へ進
み、破壊されていない場合は、電圧を上げて、再度高周
波電圧を印加する（ステップ４１１）。

【００４５】誘電泳動のための電圧は、細胞懸濁液の電
導度により異なり、電導度が低いほど電圧も低くてよい
が、高周波電圧は、０〜２０Ｖ／ｍｍの範囲で印加する
のが望ましい。２０Ｖ／ｍｍより高いの電圧では、懸濁
液に水流が発生し、細胞が揺動してしまうため、安定し
た会合を得ることができない。なお、５０μＳ／ｃｍの
電導度では、１０Ｖ／ｍｍ程度の電圧で、細胞の会合を
引き起こすことができる。本実施例では、１Ｖ／ｍｍか
ら開始し、１Ｖ／ｍｍずつ電圧を増加して、２０Ｖ／ｍ
ｍを印加しても会合が得られなかった場合は、細胞が器
壁に付着していることなどが考えるため、該細胞を廃棄
し、新たに細胞を用意することとした。

【００４６】（７）細胞の会合が成功すると、制御装置
１９は、電極１間に直流パルス（融合に必要な強さは、
細胞の種類や、懸濁液の状態などにより異なるが、本実
施例では、７５Ｖ／ｍｍ、１０μ秒の直流パルス）を印
加する（ステップ４１７）。次に、制御装置１９は、ス
テップ４１４と同様にして細胞が破壊されたかどうか検
査する（ステップ４１８）。破壊された場合は、該細胞
を破棄し（ステップ４１６）、ステップ４０１へ戻る。
破壊されていない場合は、細胞が融合したかどうか検査
する（４１９）。融合直後の細胞は、会合した２つの細
胞の輪郭である、２つの円を接触させた、瓢形のような
形（図５（ａ））よりも、２つの細胞が接触している界
面が拡がった形（図５（ｂ））をしているため、細胞の
輪郭により、融合の成否を認識することができるのであ
る。融合されていない場合は、ステップ４１７へ戻り、
再度、直流パルスを印加する。融合された場合は、該融
合細胞を回収チャンバへ回収し（ステップ４２０）、ス
テップ４０１へ戻り、制御装置１９は、上記（１）〜
（７）の処理を、必要回数繰り返す。なお、細胞の廃棄
チャンバへの搬送（ステップ４１６）や、回収チャンバ
への搬送（ステップ４２０）は、上記（１）〜（４）と
同様の手順により、光トラッピング現象を用いて行われ
る。

【００４７】上記（７）の処理では、直流パルスを印加
しても、細胞が融合しない場合は、細胞が融合するか、
破壊されるまで、直流パルスを繰返し印加する方法を採
っているが、直流パルスの印加時間を長くする方法を併
用することもできる。印加時間が長くなるほど、細胞は
融合しやすいが、印加時間が長すぎると、細胞の破壊さ
れる確率も上がるため、印加時間は、１０〜５０μ秒で
あることが好ましく、１０〜３０μ秒であることが、さ
らに好ましい。

【００４８】

【発明の効果】以上説明してきたように、本発明によれ
ば、融合操作を自動的に実行することができる細胞融合
装置が提供される。本発明の細胞融合装置では、融合操
作を繰り返して実行することにより、簡便に、かつ、大
量に融合細胞を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細胞融合装置の説明図。

【図２】従来の細胞融合装置の説明図。

【図３】本発明の細胞融合装置のハードウエア構成
図。

【図４】制御装置の細胞融合処理を示す流れ図。

【図５】会合した細胞の輪郭と、融合した細胞の輪郭
を示す説明図。

【符号の説明】

１：電極、２：融合チャンバ、３：懸濁液チャン
バ、４：回収チャンバ、５：廃棄チャンバ、６：
電極用駆動装置、７：チャンバ台、８：チャンバ台
用ＸＹＺステージ、９：レーザー光源、１０：レー
ザー光源用ＸＹＺステージ、１１：レーザー光源用駆
動装置、１２：顕微鏡、１３：モニタカメラ、１
６：観察部、１７：細胞保持部、１８：レーザー光
発生部、１９：制御装置、２１：顕微鏡、２２：電
極、２３：電源、２４：スタンド、２５：照明、
２６：スタンドの水平部材、２７：シャーレ、２
８：細胞、２９：ステージ、３０：インターフェー
ス部、３１：中央処理装置、３２：記憶装置、３
３：出力装置、３４：入力装置、３５：データバ
ス、３６：アナログ／デジタル変換器、３７：コマ
ンド解析器。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】融合に供するための細胞を保持する、少な
くとも１つの懸濁液チャンバと、細胞を融合するための
融合チャンバと、融合処理後の細胞を回収するための回
収チャンバと、視野内を観察する観察手段と、細胞を搬
送する搬送手段と、細胞を会合させる会合手段と、細胞
を融合させる融合手段と、融合処理後の後処理を行う後
処理手段とを有する細胞融合装置において、上記搬送手段と、上記会合手段と、上記融合手段と、上
記後処理手段との動作を制御する制御装置を有し、上記観察手段は、視野内の画像を画像データとして上記
制御装置に送信する機能を有し、上記制御装置は、上記画像データを解析する機能と、上記解析結果に応じて、上記搬送手段と、上記会合手段
と、上記融合手段と、上記後処理手段との少なくとも１
の手段の動作を制御する機能とを有することを特徴とす
る細胞融合装置。
【請求項２】請求項１において、前記画像データを解析する機能は、細胞の輪郭および／または位置を検出し、該輪郭の形お
よび／または位置に基いて判断を下す機能を有すること
を特徴とする細胞融合装置。
【請求項３】請求項１または２において、前記搬送手段は、細胞に光を照射し、該光のスポットの
照射位置を移動することにより細胞を移動する、光トラ
ッピング現象を用いた搬送機構を有し、前記画像データを解析する機能は、上記光スポットの照
射位置および／または輪郭を検出する機能を有し、前記制御装置は、上記照射位置および／または輪郭に基
いて、搬送手段の制御を行う機能を有することを特徴と
する細胞融合装置。
【請求項４】請求項２において、前記制御装置は、上記細胞の輪郭に基いて、融合の成否
の判断を下す機能を有することを特徴とする細胞融合装
置。
【請求項５】請求項４において、前記制御装置は、前記融合の成否の判断に応じて、融合
手段を制御することを特徴とする細胞融合装置。
【請求項６】請求項２において、前記会合手段は、細胞に高周波電圧を印加し、細胞を会
合させる、誘電泳動現象を用いた会合機構を有し、前記制御装置は、上記細胞の輪郭に基いて、会合の成否
の判断を下す機能を有することを特徴とする細胞融合装
置。
【請求項７】請求項６において、前記制御装置は、前記会合の成否の判断に応じて、会合
手段を制御することを特徴とする細胞融合装置。
【請求項８】請求項２において、前記制御装置は、前記細胞の輪郭に基いて、前記融合チ
ャンバ内に保持された複数の細胞のうち、融合に供する
細胞を選択する機能を有することを特徴とする細胞融合
装置。