JPH0731488A - バイオポリエステル含有微生物からのバイオポリエステル分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 バイオポリエステル含有微生物から、バイオ
ポリエステルを効率よく顆粒状で分離する方法を提供す
る。 【構成】 バイオポリエステル含有微生物の水性懸濁液
を耐圧性容器に導入し、もしくは予め該懸濁液を４０〜
１００℃に加熱して耐圧性容器に導入し、４０〜１００
℃に加熱，保温して高圧をかけ、該容器の微小開口部か
ら懸濁液を噴出させることにより微生物に流体剪断力を
作用させ、顆粒状のバイオポリエステルを分離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生分解性を有するバイ
オポリエステルの菌体からの分離方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、プラスチック廃棄物は焼却、埋立
などによって処理されているが、これらの処理方法に
は、それぞれ地球の温暖化、埋め立て地の地盤弛緩等の
問題がある。そのため、プラスチックリサイクルへの社
会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進み
つつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあ
り、実際問題としてプラスチック廃棄物処理方法として
は、焼却、埋立、リサイクルだけでは対応しきれず、自
然環境中に放置されたままになるものも多い。そこで、
廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が
有害物質とならないような生分解性プラスチックが注目
されており、その開発が進められている。このようなプ
ラスチックとして、特に、微生物が菌体内で生成するポ
リエステルは、自然界の炭素循環プロセスに組み込まれ
て生態系の安定化がなされると予想されている。また、
医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬
物担体としての利用が可能である。

【０００３】しかし、このポリエステルをプラスチック
として使用するためには、微生物の菌体内から分離して
取り出す必要がある。バイオポリエステル含有微生物か
らバイオポリエステルを得る方法として、クロロホルム
をはじめとする有機溶媒による抽出法、次亜塩素算ソー
ダ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄ Ｗｉｌ
ｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．（１９５８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９，１９８−２０３．）またはリ
ゾチームを用いて菌体を溶解し、残存したポリマーを顆
粒として回収する方法が知られている。その他、リゾチ
ーム以外の特定の酵素による菌体の溶解によってポリマ
ーを回収する方法（特開昭６０−１４５０９７）、１０
０℃超の高圧の水蒸気等の圧力の開放により菌体を破壊
し、菌体破片屑とポリマーとに分離する方法（特開昭５
７−１７４０９４）等もある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、クロロホルム
等による溶媒抽出法は、当該抽出溶媒だけでなく、再沈
澱のための貧溶媒も大量に必要とする。したがって、溶
媒を各々再利用しようとすれば、２種の溶媒を分離する
ことが必要である。更に、一般に溶媒抽出に先だって菌
体全体を完全に乾燥することが必要なため、多大の熱エ
ネルギーを要することにもなるので、バイオポリエステ
ルを工業的に生産するためには、多くのプロセス用設備
やエネルギーが必要となり、事実上不利である。次亜塩
素算ソーダで処理した場合は、溶媒抽出法の欠点を回避
することはできるが、一方、ポリエステルの分子量低下
が起こり（Ｊ．Ａ．Ｒａｍｓａｙ，Ｅ．Ｂｅｒｇｅｒ，
Ｂ．Ａ．Ｒａｍｓａｙ ａｎｄ Ｃ．Ｃｈａｖａｒｉｃ
（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ４，４，２２１−２２６）、ポリマ
ーの品質に問題が生じる。リゾチームのような酵素は、
少量の実験的利用には効果的であるが、大量に確保する
のが困難なため、バイオポリエステルの量産には適切で
ない。特開昭６０−１４５０９７の酵素法では、酵素処
理前後の操作が多段階になり、量産のためには、なお改
善の余地が大きい。特開昭５７−１７４０９４の圧力の
解放による方法は、得られたポリエステルの純度や収量
が未記載のため、効果が不明である。本発明は、有機溶
媒を用いないで、１００℃未満の水性媒体中で菌体に剪
断力をかけることにより、バイオポリエステルを含む微
生物からバイオポリエステルを分離する方法を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、バイオポリエ
ステル含有微生物の水性懸濁液を耐圧性容器に導入し、
もしくは予め該懸濁液を４０〜１００℃の範囲に加熱し
て耐圧性容器に導入し、４０〜１００℃の範囲内で加
熱、保温し、該懸濁液に高圧をかけ、該容器の微小開口
部から該懸濁液を噴出させることによって微生物に流体
剪断力を作用させ、顆粒状のバイオポリエステルを分離
することを特徴とするバイオポリエステル含有微生物か
らのバイオポリエステル分離法に関する。なお、特開昭
５７−１７４０９４の方法では、同じく高圧を用いてい
るが、これが、高圧を急激に低圧化した際の圧力ショッ
クで菌体を破壊するのに対し、本発明は、高圧液体の微
小口噴射時の剪断力によって、菌体破壊とバイオポリエ
ステルの分離を促進する方法である。

【０００６】本発明に用いる微生物は、細胞内にバイオ
ポリエステルを蓄積しているバクテリア（細胞）であ
る。例えば、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）の菌、Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＫ２０１（特
開平５−６４５９２）、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ａ．
ｌａｔｕｓ等、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバク
ター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属
（Ｎｏｃａｒｄｉａ）等の菌株が示されるが、その種類
に限定されるものではない。

【０００７】ここで、バイオポリエステルとは、ポリ−
Ｄ−３−ヒドロキシブチレート〔以下、Ｐ（３ＨＢ）と
略称する〕をはじめとするポリヒドロキシアルカノエー
ト〔以下、Ｐ（ＨＡ）と略称する〕と称される微生物産
生ポリエステルを指す。Ｐ（３ＨＢ）以外の代表的な例
として、３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（３Ｈ
Ｖ）との共重合体〔Ｐ．Ａ．Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ
（ＩＣＩ），Ｅｕｒ．Ｐａｔ．Ａｐｐｌ．００５２４５
９（１９８１）〕、３ＨＢと４−ヒドロキシブチレート
（４ＨＢ）との共重合体〔Ｙ．Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２１，２７２２（１９
８８）〕が挙げられる。細胞内に蓄積しているバイオポ
リエステルは、微小な顆粒として存在することが知られ
ている。処理される細胞内のバイオポリエステル含有率
（以下、ポリマー含有率という）は、高いほうが好まし
い。一般に、乾燥菌体としてポリマー含有率が２０重量
％以上がよい。分離操作の効率、分離ポリマーの純度上
５０重量％以上のポリマー含有率が特に好ましい。水性
懸濁液とは、培養終了後の培養懸濁液そのもの、または
培養液から遠心等で分離した菌体を水に懸濁させたもの
を指す。菌体の懸濁濃度は、乾燥菌体換算で１５０ｇ菌
体／１以下、好ましくは１００ｇ菌体／１以下である。

【０００８】本発明の方法では、水性懸濁液は、微小開
口部を有する耐圧性容器に導入され高圧をかけられる。
このようにして開口部から押し出される菌体には大きな
剪断力が働くため、菌体は破壊されバイオポリエステル
の分離が促進されると推定される。このような耐圧性容
器と加圧機構からなる装置は、循環装置付高圧ホモジナ
イザーに代表される。したがって、本発明のバイオポリ
エステル分離法は、高圧ホモジナイザーの利用によって
実施可能となる。高圧ホモジナイザーの温度設定は４０
〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃にする。懸濁液
の加熱は、高圧ホモジナイザーの導入前に、設定温度に
加熱することも望ましい。高圧ホモジナイザー内に導入
した該懸濁液にかける圧力は、装置によるが、５００〜
１５００ kgf／cm³ で作用させるのが好ましい。

【０００９】循環装置付高圧ホモジナイザーとしては、
マントンゴーリン（独国ＡＰＶ・ゴーリン社製）、ミニ
ラボ（デンマーク ＡＰＶラニー社製）、ブランリュー
ベ連続式細胞破砕機（独国Ｂｒａｎ＋Ｌｕｅｂｂｅ社
製）、マイクロフルイダイザー（米国Ｍｉｃｒｏｆｌｕ
ｉｄｉｃｓ社製）等を用いることができる。これらの装
置は、一般的に加圧によって、分散・乳化・細胞破砕等
に用いられることがよく知られている。本発明では、高
圧ホモジナイザー内での加熱が必須なので、類似の高圧
ホモジナイザーの一種であるが非加熱型であるフレンチ
プレスは、本発明に不適当である。フレンチプレスを用
いて微生物中のバイオポリエステルを実験的な小規模で
分離することは知られているが（Ｈｅｌｍｕｔ Ｂｒａ
ｎｄｌ ｅｔ ａｌ，Ａｄｖａｎｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ．４１，７７−９３（１９９０））、
本発明の技術的特徴である加熱による分離の協同効果を
実現した例は知られていない。

【００１０】以上の処理操作により、短時間で効率よく
菌体壁を破壊し、バイオポリエステルを顆粒状で菌体か
ら分離できる。菌体壁が破壊されると、核酸のような水
溶性の高分子物質が細胞外に溶出するために、該懸濁液
の濃度は一旦上昇するが、剪断力によって核酸のような
高分子の切断も起こるためか、該懸濁液の粘度が再び低
下し、その後の遠心操作、濾過操作等でのバイオポリエ
ステルの分離が容易に行える。処理前の該懸濁液の菌体
濃度は、乾燥菌体換算で１５０ｇ／ｌまで処理可能であ
るため、通常培養後の菌体濃度を薄める必要がない。本
発明では、該懸濁液を加熱することで、菌体壁が脆化し
て破壊しやすくなるため、該懸濁液に剪断力をかけるこ
とにより、短時間で効率の良い処理が可能となるうえ
に、バイオポリエステル顆粒を壊さないで菌体より取り
出すことができる。

【００１１】

【実施例】本実施例で用いた微生物は、アルカリゲネス
属に属する微生物アルカリゲネス・リポリティカ（Ａｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ） ＡＫ２
０１（特開平５−６４５９２）で、培養後、Ｐ（３Ｈ
Ｂ）を約５０ｗｔ％含有している菌を遠心（８０００ｒ
ｐｍ，１０ｍｉｎ．遠心分離機はＫＵＢＯＴＡ製６８１
０使用）によって培養液から分離後、ペースト状菌体に
水を加えて４０ｇ菌体／ｌの水性懸濁液とした。この水
性懸濁液を用いて、以下に示す実施例１〜３および比較
例１，２を行った。

【００１２】実施例１〜３および比較例１，２の操作で
得たＰ（３ＨＢ）は、純度を調べるためにガスクロマト
グラフィー、分子量分布の決定にゲルパーミエーション
クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて分析を行った。
なお、ガスクロマトグラフィーには、実施例１〜３およ
び比較例１，２で得られた沈澱物を乾燥（１０５℃，２
４ｈｒ）した後、メタノール／硫酸（８５／１５ ｗｔ
％／ｗｔ％）によりメタノリシスして菌体内ポリエステ
ルをモノマーのメチルエステルとしたものを分析して、
ポリマー含有率を求めた。これは、〔Ｈ．Ｂｒａｎｄｌ
ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏ
ｌ．，１１，４９−５５（１９８９）〕に示される方法
に従った。ＧＰＣには、試料（約１００mg）中のポリエ
ステルを熱クロロホルム１５０mlで抽出後、溶液を濃縮
してヘキサンを加えて再沈し、沈澱を濾過、真空乾燥
（２ｈｒ）して１０mg／１０mlのクロロホルム溶液にし
て測定した。

【００１３】（実施例１）Ｐ（３ＨＢ）含有菌体の該懸
濁液５００mlを作成した。予め該懸濁液を９０℃で約５
分間加熱後、ＡＰＶ・ゴーリン社製マントンゴーリンに
投入する。この装置内で、該懸濁液をゲージ圧約１００
０ kgf／cm³ に加圧し（この時、装置内の温度は加熱さ
れた懸濁液の温度に制御する）、瞬時（約１０^-6〜１０
^-5ｓｅｃ）に約０．０２mmの隙間を通過させて空気中に
放出し、流体剪断力をかける。この一連の操作を、懸濁
液を自動的に循環させることにより１０回繰り返した。
処理後の懸濁液を遠心分離（２７００ｒｐｍ，１０ｍｉ
ｎ）して沈澱物を得た。 （実施例２）該懸濁液を７０℃、約５分間予備加熱する
こと、およびマントンゴーリン内の加熱温度を７０℃と
する以外は、実施例１と同様に操作した。 （実施例３）本例では、該懸濁液を７０℃、約５分間予
備加熱して、マントンゴーリン操作（１０回）を２０回
に変える以外は、実施例１と同様に操作した。

【００１４】（比較例１）本例では、該懸濁液を予備加
熱しない以外は、実施例１と同様に操作した。 （比較例２）本例では、該懸濁液を１００ml作成し、窒
素置換して密閉にした容器中で攪拌（１００ｒｐｍ）し
ながら８０℃に加熱し、１ｈｒ攪拌を続けた。処理後の
懸濁液を遠心分離（２７００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）して
沈澱物を得た。 実施例１〜３および比較例１，２の分離条件を表１に示
す。

【００１５】

【表１】 （注）加熱温度：実施例１〜３、比較例１は予備加熱温
度、比較例２は処理加熱温度を示す。 実施例，比較例のガスクロマトグラフィー、ＧＰＣで得
られた結果を表２に示した。

【００１６】

【表２】

【００１７】

【発明の効果】本発明により、従来の各方法の欠点を克
服した新しい分離法を開発した。すなわち、有機溶媒を
用いないで、水性媒体中で比較的穏和な条件下で、高圧
ホモジナイザーを作動して剪断力をかけることにより、
バイオポリエステルを含む微生物からバイオポリエステ
ルを分離できた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バイオポリエステル含有微生物の水性懸
   濁液を耐圧性容器に導入し、４０〜１００℃の範囲内で
   加熱、保温し、該懸濁液に高圧をかけ、該容器の微小開
   口部から該懸濁液を噴出させることによって微生物に流
   体剪断力を作用させ、顆粒状のバイオポリエステルを分
   離することを特徴とするバイオポリエステル含有微生物
   からのバイオポリエステル分離法。
2. 【請求項２】 耐圧性容器に導入する前に予め水性懸濁
   液を４０〜１００℃の範囲に加熱する請求項１に記載の
   方法。