JPH07327686A - Ｂ型肝炎ウイルスの変異型ｐｒｅＸ遺伝子オリゴヌクレオチ ド、ポリペプチド、検出方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスの変異型ｐｒｅＸ遺伝子オリゴヌクレオチ ド、ポリペプチド、検出方法Info
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- JPH07327686A JPH07327686A JP6155125A JP15512594A JPH07327686A JP H07327686 A JPH07327686 A JP H07327686A JP 6155125 A JP6155125 A JP 6155125A JP 15512594 A JP15512594 A JP 15512594A JP H07327686 A JPH07327686 A JP H07327686A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、ＨＢＶによる肝疾患の病態変化
を把握し、予測することができる検査方法と、これに供
するオリゴヌクレオチド、ポリペプチドを提供すること
を目的とする。 【構成】 本発明は配列表記載のオリゴヌクレオチ
ド、ポリペプチドの発明であり、また、これらを用いた
Ｂ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法の発明であ
る。 【効果】 本発明の方法は、変異型ｐｒｅＸ遺伝子を
特異的に検出することができ、ＨＢＶによる肝疾患の病
態変化を適切に把握し、予測することができる。本発明
のオリゴヌクレオチド、ポリペプチドは上記検出方法に
供することができる。
を把握し、予測することができる検査方法と、これに供
するオリゴヌクレオチド、ポリペプチドを提供すること
を目的とする。 【構成】 本発明は配列表記載のオリゴヌクレオチ
ド、ポリペプチドの発明であり、また、これらを用いた
Ｂ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法の発明であ
る。 【効果】 本発明の方法は、変異型ｐｒｅＸ遺伝子を
特異的に検出することができ、ＨＢＶによる肝疾患の病
態変化を適切に把握し、予測することができる。本発明
のオリゴヌクレオチド、ポリペプチドは上記検出方法に
供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスの変
異型であるｐｒｅＸ遺伝子およびｐｒｅＸ遺伝子産物の
発明、抗ｐｒｅＸ遣伝子産物抗体を検出する方法の発
明、ならびにその検出に使用することのできるオリゴヌ
クレオチド、抗原性ポリペプチド、抗ｐｒｅＸ遺伝子産
物抗体に関する。
異型であるｐｒｅＸ遺伝子およびｐｒｅＸ遺伝子産物の
発明、抗ｐｒｅＸ遣伝子産物抗体を検出する方法の発
明、ならびにその検出に使用することのできるオリゴヌ
クレオチド、抗原性ポリペプチド、抗ｐｒｅＸ遺伝子産
物抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、一過性
の感染による急性肝炎を引き起すだけではなく、ときに
は劇症肝炎として死をもたらし、また持続性の感染によ
り慢性肝炎、肝硬変、肝癌といった多様な病態の原因と
なるウイルスであることが知られている。ＨＢＶの感染
者は世界で２億人とも云われ、ＨＢＶ感染による人的・
社会的被害は甚大である。
の感染による急性肝炎を引き起すだけではなく、ときに
は劇症肝炎として死をもたらし、また持続性の感染によ
り慢性肝炎、肝硬変、肝癌といった多様な病態の原因と
なるウイルスであることが知られている。ＨＢＶの感染
者は世界で２億人とも云われ、ＨＢＶ感染による人的・
社会的被害は甚大である。
【０００３】ＨＢＶの感染を撲滅するためには、ＨＢＶ
の外被蛋白質を利用したワクチン投与、あるいは汚染血
液の輸血防止を目的とした献血血液のＨＢｓ抗原検査、
抗ＨＢｓ抗体検査、さらには抗ＨＢｃ抗体検査が有効で
あり、わが国では日本赤十字社によって献血検査体制が
導入・整備された結果目覚ましい成果が挙げられた。
の外被蛋白質を利用したワクチン投与、あるいは汚染血
液の輸血防止を目的とした献血血液のＨＢｓ抗原検査、
抗ＨＢｓ抗体検査、さらには抗ＨＢｃ抗体検査が有効で
あり、わが国では日本赤十字社によって献血検査体制が
導入・整備された結果目覚ましい成果が挙げられた。
【０００４】しかし、他方、ＨＢＶ感染者に対する治療
方法については種々の研究が進められているものの、と
くに慢性肝炎から肝硬変を経て肝癌へ至る病態の深刻化
については、その原因および各段階の治療法が未だ確立
されておらず、その病態の変異を適切に把握し、かつ予
測する検査方法の開発が待たれていた。
方法については種々の研究が進められているものの、と
くに慢性肝炎から肝硬変を経て肝癌へ至る病態の深刻化
については、その原因および各段階の治療法が未だ確立
されておらず、その病態の変異を適切に把握し、かつ予
測する検査方法の開発が待たれていた。
【０００５】ＨＢＶの遺伝子は１９７９年にクローニン
グされ全塩基配列が決定されている。これによれば、約
３２００塩基の環状の不完全２本鎖ＤＮＡであって、４
種類の蛋白質を規定する読取り枠が存在することが報告
されている。このうち、Ｘ遺伝子は、ウイルス遺伝子の
転写活性を活性化し、また宿主細胞が有する癌関連遺伝
子をトランスに活性化することが知られているため、発
癌を含む病態との関連が特に注目されている。
グされ全塩基配列が決定されている。これによれば、約
３２００塩基の環状の不完全２本鎖ＤＮＡであって、４
種類の蛋白質を規定する読取り枠が存在することが報告
されている。このうち、Ｘ遺伝子は、ウイルス遺伝子の
転写活性を活性化し、また宿主細胞が有する癌関連遺伝
子をトランスに活性化することが知られているため、発
癌を含む病態との関連が特に注目されている。
【０００６】さらに、最近に至ってＸ遺伝子の上流１６
８塩基の位置に、新たな読み取り開始コドンがあるＨＢ
Ｖ株が存在することが報告され、この開始コドンから読
み始められる遺伝子がｐｒｅＸ遺伝子と命名された。し
かし、ｐｒｅＸ遺伝子が実際に機能しているか否かは不
明であった。
８塩基の位置に、新たな読み取り開始コドンがあるＨＢ
Ｖ株が存在することが報告され、この開始コドンから読
み始められる遺伝子がｐｒｅＸ遺伝子と命名された。し
かし、ｐｒｅＸ遺伝子が実際に機能しているか否かは不
明であった。
【０００７】本発明者は、ＨＢＶ感染患者血清中におけ
るＸ遺伝子産物の研究に従事した結果、従来知られてい
たＸ遺伝子の長さから推定されるＸ遺伝子産物よりも分
子的に大きなＸ遺伝子産物が存在していることを見い出
し、ｐｒｅＸ遺伝子が実際に発現し、かつその発現の実
態が従来推定されたものと異なることを見い出した。
るＸ遺伝子産物の研究に従事した結果、従来知られてい
たＸ遺伝子の長さから推定されるＸ遺伝子産物よりも分
子的に大きなＸ遺伝子産物が存在していることを見い出
し、ｐｒｅＸ遺伝子が実際に発現し、かつその発現の実
態が従来推定されたものと異なることを見い出した。
【０００８】すなわち、ＨＢＶには変異型ｐｒｅＸ遺伝
子を有するものがあり、この変異株においてはｐｒｅＸ
遺伝子開始コドンから４３番目の位置にある停止コドン
が変異して、他のセンスコドンに変化し、その結果連続
した長い読み取り枠を形成することが判明した。この変
異型ｐｒｅＸ遺伝子が前記した大きな遺伝子産物を産生
することが確認された。
子を有するものがあり、この変異株においてはｐｒｅＸ
遺伝子開始コドンから４３番目の位置にある停止コドン
が変異して、他のセンスコドンに変化し、その結果連続
した長い読み取り枠を形成することが判明した。この変
異型ｐｒｅＸ遺伝子が前記した大きな遺伝子産物を産生
することが確認された。
【０００９】本発明者らは、ＨＢＶ無症候性キャリアと
慢性肝疾患患者から各々単離したＨＢＶ−ＤＮＡについ
て研究した結果、変異株の陽性瀕度が無症候性キャリア
に比して慢性Ｂ型肝疾患患者において有意に高いことを
確認した。
慢性肝疾患患者から各々単離したＨＢＶ−ＤＮＡについ
て研究した結果、変異株の陽性瀕度が無症候性キャリア
に比して慢性Ｂ型肝疾患患者において有意に高いことを
確認した。
【００１０】さらに、本発明者らは研究を進めた結果、
ｐｒｅＸ遺伝子の変異株（以下「変異型ｐｒｅＸ遺伝子
株」といい、この型特有のｐｒｅＸ遺伝子を「変異型ｐ
ｒｅＸ遺伝子」という）の検出瀕度が慢性肝炎から肝硬
変、肝癌へと病態が深刻化するのに対応して増加するこ
とも確認した。
ｐｒｅＸ遺伝子の変異株（以下「変異型ｐｒｅＸ遺伝子
株」といい、この型特有のｐｒｅＸ遺伝子を「変異型ｐ
ｒｅＸ遺伝子」という）の検出瀕度が慢性肝炎から肝硬
変、肝癌へと病態が深刻化するのに対応して増加するこ
とも確認した。
【００１１】以上の事実から、本発明者は、変異型ｐｒ
ｅＸ遺伝子の存在、ならびにその発現物の存否を検査す
ることが、ＨＢＶを原因とする疾病の病態を把握し、ま
たその推移を予測するうえて多大の貢献をなしうること
を確認し、本発明を完成した。
ｅＸ遺伝子の存在、ならびにその発現物の存否を検査す
ることが、ＨＢＶを原因とする疾病の病態を把握し、ま
たその推移を予測するうえて多大の貢献をなしうること
を確認し、本発明を完成した。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】前記したように、ＨＢ
Ｖの感染予防については、その検査体制が整備されたも
のの、ＨＢＶ感染を原因とする病態を確認し、またその
変移を予測する方法の確立が待たれていた。本発明は変
異型ｐｒｅＸ遺伝子、およびその遺伝子産物を分子レベ
ルで特定するとともに、これらを使用して変異型ＨＢＶ
ｐｒｅＸ遺伝子およびその遺伝子産物等の存否を検出
し、これによって上記課題を解決することを目的とする
ものである。
Ｖの感染予防については、その検査体制が整備されたも
のの、ＨＢＶ感染を原因とする病態を確認し、またその
変移を予測する方法の確立が待たれていた。本発明は変
異型ｐｒｅＸ遺伝子、およびその遺伝子産物を分子レベ
ルで特定するとともに、これらを使用して変異型ＨＢＶ
ｐｒｅＸ遺伝子およびその遺伝子産物等の存否を検出
し、これによって上記課題を解決することを目的とする
ものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、無症候性
ＨＢＶキャリア、慢性肝炎患者、肝硬変患者、肝癌患者
らの血清よりＨＢＶ−ＤＮＡを単離し、ｐｒｅＸ領域を
含むウイルス遺伝子領域の塩基配列を決定した。その結
果、本発明者らは、一方で各ウイルス株に共通する保存
性の高いｐｒｅＸ遺伝子配列が存在するとともに、他方
では病態の推移とともに検出瀕度が増大する変異株が存
在することを確認し、その遺伝子配列を解明し特定する
ことによって本発明を完成させた。
ＨＢＶキャリア、慢性肝炎患者、肝硬変患者、肝癌患者
らの血清よりＨＢＶ−ＤＮＡを単離し、ｐｒｅＸ領域を
含むウイルス遺伝子領域の塩基配列を決定した。その結
果、本発明者らは、一方で各ウイルス株に共通する保存
性の高いｐｒｅＸ遺伝子配列が存在するとともに、他方
では病態の推移とともに検出瀕度が増大する変異株が存
在することを確認し、その遺伝子配列を解明し特定する
ことによって本発明を完成させた。
【００１４】本発明の要旨は、次のとおりである。すな
わち、本発明は、配列番号１ないし６記載のオリゴヌク
レオチド、配列番号７または８記載のポリペプチドの発
明であり、また、配列番号７または８記載の抗原性ペプ
チドと結合する抗ｐｒｅＸ抗体、配列番号３および配列
番号４記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプ
ライマーペアとして使用して遺伝子増幅を行うＢ型肝炎
変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号１、配列番
号２記載のオリゴヌクレオチド、および／または配列番
号５、配列番号６記載のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーペアとして第一段階のｐｒｅＸ遺伝子増幅を行ったの
ち、配列番号３、配列番号４記載のオリゴヌクレオチド
を使用して第二段階の遺伝子増幅を行うＢ型肝炎変異型
ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号１、配列番号２記
載のオリゴヌクレオチド、および／または配列番号５、
配列番号６記載のオリゴヌクレオチドをプライマーペア
として遺伝子増幅を行ったのちに、制限酵素ＢａｌＩま
たはＳａｕ３ＡＩで処理するＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺
伝子の検出方法、配列番号３および／または配列番号４
記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用す
るＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号
１ないし配列番号６記載のオリゴヌクレオチドのいずれ
かを捕捉プローブとして使用して変異型ｐｒｅＸ遺伝子
を捕捉するＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、
配列番号７記載のポリペプチドを抗原として使用して抗
ｐｒｅＸ抗体を捕捉し、標識抗ヒト免疫グロブリン抗体
と結合させるＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方
法、配列番号７または８記載のポリペプチドを抗原とし
て使用する、抗ｐｒｅＸ抗体の検出方法、抗ｐｒｅＸ抗
体を使用してｐｒｅＸ遺伝子産物を捕捉し、捕捉物を標
識抗ｐｒｅＸ遺伝子産物抗体と結合させるＢ型肝炎変異
型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号７または８記載
のポリペプチドを動物に免疫して得る、Ｂ型肝炎ウイル
スｐｒｅＸ遺伝子産物ポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体、請求項２０記載のポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を使用するＢ型肝炎ｐｒｅＸ遺
伝子産物の検出方法、の発明である。
わち、本発明は、配列番号１ないし６記載のオリゴヌク
レオチド、配列番号７または８記載のポリペプチドの発
明であり、また、配列番号７または８記載の抗原性ペプ
チドと結合する抗ｐｒｅＸ抗体、配列番号３および配列
番号４記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプ
ライマーペアとして使用して遺伝子増幅を行うＢ型肝炎
変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号１、配列番
号２記載のオリゴヌクレオチド、および／または配列番
号５、配列番号６記載のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーペアとして第一段階のｐｒｅＸ遺伝子増幅を行ったの
ち、配列番号３、配列番号４記載のオリゴヌクレオチド
を使用して第二段階の遺伝子増幅を行うＢ型肝炎変異型
ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号１、配列番号２記
載のオリゴヌクレオチド、および／または配列番号５、
配列番号６記載のオリゴヌクレオチドをプライマーペア
として遺伝子増幅を行ったのちに、制限酵素ＢａｌＩま
たはＳａｕ３ＡＩで処理するＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺
伝子の検出方法、配列番号３および／または配列番号４
記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用す
るＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号
１ないし配列番号６記載のオリゴヌクレオチドのいずれ
かを捕捉プローブとして使用して変異型ｐｒｅＸ遺伝子
を捕捉するＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、
配列番号７記載のポリペプチドを抗原として使用して抗
ｐｒｅＸ抗体を捕捉し、標識抗ヒト免疫グロブリン抗体
と結合させるＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方
法、配列番号７または８記載のポリペプチドを抗原とし
て使用する、抗ｐｒｅＸ抗体の検出方法、抗ｐｒｅＸ抗
体を使用してｐｒｅＸ遺伝子産物を捕捉し、捕捉物を標
識抗ｐｒｅＸ遺伝子産物抗体と結合させるＢ型肝炎変異
型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法、配列番号７または８記載
のポリペプチドを動物に免疫して得る、Ｂ型肝炎ウイル
スｐｒｅＸ遺伝子産物ポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体、請求項２０記載のポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を使用するＢ型肝炎ｐｒｅＸ遺
伝子産物の検出方法、の発明である。
【００１５】配列番号１ないし６記載のオリゴヌクレオ
チドは常法に従って化学合成によって得ることができ、
ポリメラーゼチェインリアクション法（以下「ＰＣＲ
法」という）などの遺伝子増幅法におけるプライマーと
して、あるいは捕捉用のプローブとして利用することが
できる。また、酵素や放射性同位元素によって標識した
のち、標識プローブとして用いることもできる。配列番
号１記載のオリゴヌクレオチド＃ＨＸ−１、配列番号２
記載のオリゴヌクレオチド＃ＨＸ−２、は野生型・変異
型共通に用いることができ、とくに遺伝子増幅法におい
て、前者はセンスプライマーとして、後者はアンチセン
スプライマーとして利用することができる。
チドは常法に従って化学合成によって得ることができ、
ポリメラーゼチェインリアクション法（以下「ＰＣＲ
法」という）などの遺伝子増幅法におけるプライマーと
して、あるいは捕捉用のプローブとして利用することが
できる。また、酵素や放射性同位元素によって標識した
のち、標識プローブとして用いることもできる。配列番
号１記載のオリゴヌクレオチド＃ＨＸ−１、配列番号２
記載のオリゴヌクレオチド＃ＨＸ−２、は野生型・変異
型共通に用いることができ、とくに遺伝子増幅法におい
て、前者はセンスプライマーとして、後者はアンチセン
スプライマーとして利用することができる。
【００１６】配列番号３記載のオリゴヌクレオチド＃Ｈ
Ｘ−４、配列番号４記載のオリゴヌクレオチド＃ＨＸ−
５は変異型に特異的に用いることができ、とくに遺伝子
増幅法において、前者はセンスプライマーとして、後者
はアンチセンスプライマーとして利用することができ
る。ＰＣＲ法を利用する場合は＃ＨＸ−１／＃ＨＸ−２
のプライマーペアを利用して得られた増幅産物につい
て、第二段階ＰＣＲのプライマーペアとして用いると有
効である。該プライマーペアにより得られる増幅産物は
１２０ｂｐの長さを有する。
Ｘ−４、配列番号４記載のオリゴヌクレオチド＃ＨＸ−
５は変異型に特異的に用いることができ、とくに遺伝子
増幅法において、前者はセンスプライマーとして、後者
はアンチセンスプライマーとして利用することができ
る。ＰＣＲ法を利用する場合は＃ＨＸ−１／＃ＨＸ−２
のプライマーペアを利用して得られた増幅産物につい
て、第二段階ＰＣＲのプライマーペアとして用いると有
効である。該プライマーペアにより得られる増幅産物は
１２０ｂｐの長さを有する。
【００１７】配列番号５記載のオリゴヌクレオチド＄０
４４、配列番号６記載のオリゴヌクレオチド＄０４５は
野生型・変異型共通に用いることができ、とくに遺伝子
増幅法において、前者はセンスプライマーとして、後者
はアンチセンスプライマーとして利用することができ
る。ＰＣＲ法を利用する場合は＃ＨＸ−１／＃ＨＸ−２
のプライマーペアを利用して得られた増幅産物につい
て、第二段階ＰＣＲのプライマーペアとして用いると有
効である。該プライマーペアーにより得られる増幅産物
は２３３ｂｐの長さを有する。
４４、配列番号６記載のオリゴヌクレオチド＄０４５は
野生型・変異型共通に用いることができ、とくに遺伝子
増幅法において、前者はセンスプライマーとして、後者
はアンチセンスプライマーとして利用することができ
る。ＰＣＲ法を利用する場合は＃ＨＸ−１／＃ＨＸ−２
のプライマーペアを利用して得られた増幅産物につい
て、第二段階ＰＣＲのプライマーペアとして用いると有
効である。該プライマーペアーにより得られる増幅産物
は２３３ｂｐの長さを有する。
【００１８】本発明者らは、供血者、慢性肝疾患患者
（慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌疾患者）より血清を得
て、慣用方法に従ってＤＮＡを抽出し、実施例に示すよ
うにｐｒｅＸ遺伝子領域を含む塩基配列を決定した。こ
れらのＨＢＶ−ＤＮＡの塩基配列を比較することによ
り、全ての型のｐｒｅＸ遺伝子に保存され、かつ遺伝子
増幅を伴う遺伝子検出法に適する性質を有するオリゴヌ
クレオチドを特定し、配列番号１、２および５、６記載
のオリゴヌクレオチドを得た。さらに肝疾患の病態別の
ＨＢＶ−ＤＮＡ塩基配列を相互に比較することにより、
変異株のｐｒｅＸ遺伝子の塩基配列を特定した。変異株
に特有のオリゴヌクレオチドである配列番号３および４
のオリゴヌクレオチドを特定し、これを得ることができ
た。これにより、本発明は変異株の検出に好適に利用す
ることができるオリゴヌクレオチド３および４を提供す
ることができることとなった。
（慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌疾患者）より血清を得
て、慣用方法に従ってＤＮＡを抽出し、実施例に示すよ
うにｐｒｅＸ遺伝子領域を含む塩基配列を決定した。こ
れらのＨＢＶ−ＤＮＡの塩基配列を比較することによ
り、全ての型のｐｒｅＸ遺伝子に保存され、かつ遺伝子
増幅を伴う遺伝子検出法に適する性質を有するオリゴヌ
クレオチドを特定し、配列番号１、２および５、６記載
のオリゴヌクレオチドを得た。さらに肝疾患の病態別の
ＨＢＶ−ＤＮＡ塩基配列を相互に比較することにより、
変異株のｐｒｅＸ遺伝子の塩基配列を特定した。変異株
に特有のオリゴヌクレオチドである配列番号３および４
のオリゴヌクレオチドを特定し、これを得ることができ
た。これにより、本発明は変異株の検出に好適に利用す
ることができるオリゴヌクレオチド３および４を提供す
ることができることとなった。
【００１９】したがって、配列番号３および４のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーペアとして使用し、ポリメラ
ーゼチェインリアクションを実施すれば、遺伝子を増幅
することで目的遺伝子を検出することができる。さら
に、上記オリゴヌクレオチドが有する目的遺伝子に対す
る特異性の高さを利用し、該オリゴヌクレオチドを捕捉
プローブとして、および／または標識プローブとして使
用することによっても目的遺伝子を検出することができ
る。
ヌクレオチドをプライマーペアとして使用し、ポリメラ
ーゼチェインリアクションを実施すれば、遺伝子を増幅
することで目的遺伝子を検出することができる。さら
に、上記オリゴヌクレオチドが有する目的遺伝子に対す
る特異性の高さを利用し、該オリゴヌクレオチドを捕捉
プローブとして、および／または標識プローブとして使
用することによっても目的遺伝子を検出することができ
る。
【００２０】ＨＢＶ−ＤＮＡ量が少ない場合には、ｐｒ
ｅＸ領域を含む、広範囲の遺伝子配列を検索するのが好
ましい。このことから、本発明らはｐｒｅＸ領域を挟む
領域に高い保存性を有する配列番号５、６記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することを見い出
し、前記の遺伝子増幅法と組合わせることによって、Ｄ
ＮＡ量が低い場合であっても高感度にｐｒｅＸ遺伝子を
検出することができる方法を発明した。本発明者らは、
まず配列番号５、６記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーペアとして用いて第一段階の増幅を用い、つぎに前
記記載のｐｒｅＸ遺伝子特異増幅を行う、二段階遺伝子
増幅法を発明した。
ｅＸ領域を含む、広範囲の遺伝子配列を検索するのが好
ましい。このことから、本発明らはｐｒｅＸ領域を挟む
領域に高い保存性を有する配列番号５、６記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用することを見い出
し、前記の遺伝子増幅法と組合わせることによって、Ｄ
ＮＡ量が低い場合であっても高感度にｐｒｅＸ遺伝子を
検出することができる方法を発明した。本発明者らは、
まず配列番号５、６記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーペアとして用いて第一段階の増幅を用い、つぎに前
記記載のｐｒｅＸ遺伝子特異増幅を行う、二段階遺伝子
増幅法を発明した。
【００２１】遺伝子の検出法としては、遺伝子増幅後に
増幅遺伝子を電気泳動しＤＮＡをバンドとして確認する
方法があるが、この他に、特異的オリゴヌクレオチド３
または４のいずれかを捕捉プローブとして使用し、もう
一方の特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性を有す
るオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用して、
試料中のｐｒｅＸ遺伝子を捕捉したうえ、標識プローブ
と結合させてｐｒｅＸ遺伝子を検出する方法、あるいは
増幅遺伝子を適当なメンブレン上に物理的または化学的
に結合させ、その後に標識プローブと反応・結合し検出
する方法等がある。
増幅遺伝子を電気泳動しＤＮＡをバンドとして確認する
方法があるが、この他に、特異的オリゴヌクレオチド３
または４のいずれかを捕捉プローブとして使用し、もう
一方の特異的オリゴヌクレオチドに対して相補性を有す
るオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用して、
試料中のｐｒｅＸ遺伝子を捕捉したうえ、標識プローブ
と結合させてｐｒｅＸ遺伝子を検出する方法、あるいは
増幅遺伝子を適当なメンブレン上に物理的または化学的
に結合させ、その後に標識プローブと反応・結合し検出
する方法等がある。
【００２２】また、本発明者らは、制限酵素を利用した
検出方法を発明した。すなわち、配列番号１、２および
／または配列番号５、６のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして増幅したｐｒｅＸ遺伝子において、野生型に
は制限酵素ＢａｌＩの切断部位が存在するが、変異型ｐ
ｒｅＸの遺伝子には該切断部位が存在しない。これによ
り変異型ｐｒｅＸ遺伝子を検出することができ、また混
合型の感染においては両型のウイルスの比率を検出する
ことができる（図３）。
検出方法を発明した。すなわち、配列番号１、２および
／または配列番号５、６のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして増幅したｐｒｅＸ遺伝子において、野生型に
は制限酵素ＢａｌＩの切断部位が存在するが、変異型ｐ
ｒｅＸの遺伝子には該切断部位が存在しない。これによ
り変異型ｐｒｅＸ遺伝子を検出することができ、また混
合型の感染においては両型のウイルスの比率を検出する
ことができる（図３）。
【００２３】同様に、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ認識部分を
有するので、Ｓａｕ３ＡＩ処理により変異型遺伝子を検
出し、また混合型感染における両型のウイルスの比率を
検出することができる（図３）。
有するので、Ｓａｕ３ＡＩ処理により変異型遺伝子を検
出し、また混合型感染における両型のウイルスの比率を
検出することができる（図３）。
【００２４】さらに、発明者らは、変異株および野生株
の遺伝子配列にもとづき、配列番号７および８記載の抗
原性ペプチドを得た。ポリペプチドは常法により化学合
成によって得ることができ、また、適当なベクターを利
用して大腸菌、酵母等に組み込んで発現して得ることが
できる。
の遺伝子配列にもとづき、配列番号７および８記載の抗
原性ペプチドを得た。ポリペプチドは常法により化学合
成によって得ることができ、また、適当なベクターを利
用して大腸菌、酵母等に組み込んで発現して得ることが
できる。
【００２５】配列番号７記載のポリペプチドは変異型ｐ
ｒｅＸ遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を有してお
り、これを抗原として用いる免疫学的測定法によりサン
プル中の特異抗体を測定し、肝疾患の診断に用いること
ができる。また、配列番号８記載のポリペプチドは野生
型ｐｒｅＸ遺伝子において開始コドンから４３番目の位
置にある停止コドンが変異し、連続して読み取りが行わ
れた場合に翻訳されるアミノ酸配列を有しており、これ
を抗原として用いる免疫学的測定法によりサンプル中の
特異抗体を測定し、肝疾患の診断に用いることができ
る。また上記２ペプチドに反応する特異抗体の反応性を
比較することも有用である。
ｒｅＸ遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を有してお
り、これを抗原として用いる免疫学的測定法によりサン
プル中の特異抗体を測定し、肝疾患の診断に用いること
ができる。また、配列番号８記載のポリペプチドは野生
型ｐｒｅＸ遺伝子において開始コドンから４３番目の位
置にある停止コドンが変異し、連続して読み取りが行わ
れた場合に翻訳されるアミノ酸配列を有しており、これ
を抗原として用いる免疫学的測定法によりサンプル中の
特異抗体を測定し、肝疾患の診断に用いることができ
る。また上記２ペプチドに反応する特異抗体の反応性を
比較することも有用である。
【００２６】また、配列番号７記載のポリペプチド、配
列番号８記載のポリペプチドをそれぞれ動物に免疫し、
常法に従ってポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
を得ることができる。得られた抗変異型ｐｒｅＸ特異抗
体、もしくは抗野生型ｐｒｅＸ特異抗体は、特異抗体同
士の組み合わせや抗ヒト免疫グロブリン抗体との組み合
わせによって、サンドイッチＥＩＡ法やウェスタンブロ
ット法などの免疫学的測定法によりサンプル中の抗原を
測定するのに用いることがてきる。
列番号８記載のポリペプチドをそれぞれ動物に免疫し、
常法に従ってポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
を得ることができる。得られた抗変異型ｐｒｅＸ特異抗
体、もしくは抗野生型ｐｒｅＸ特異抗体は、特異抗体同
士の組み合わせや抗ヒト免疫グロブリン抗体との組み合
わせによって、サンドイッチＥＩＡ法やウェスタンブロ
ット法などの免疫学的測定法によりサンプル中の抗原を
測定するのに用いることがてきる。
【００２７】
【作用】本発明の方法は、変異型ｐｒｅＸ遺伝子を特異
的に検出することができ、ＨＢＶによる肝疾患の病態変
化を適切に把握することができる。本発明のオリゴヌク
レオチド、ポリペプチドは上記検出方法に供することが
できる。
的に検出することができ、ＨＢＶによる肝疾患の病態変
化を適切に把握することができる。本発明のオリゴヌク
レオチド、ポリペプチドは上記検出方法に供することが
できる。
【００２８】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００２９】
【実施例１】ＨＢＶ無症候性キャリアおよび各種Ｂ型肝
疾患例に於けるＨＢＶｐｒｅＸ遺伝子の塩基配列ならび
にアミノ酸配列は次のようにして決定した。 （１）ＤＮＡ抽出 ＨＢＶの無症候性キャリア、慢性肝炎疾患者、肝硬変患
者、肝細胞癌患者の血清より本発明者らが既発表の方法
（Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１
９９０：６４：１２９８−１３０３）に従ってＤＮＡを
抽出した。 （２）塩基配列の決定 （１）の方法に従って５０μｌの血清よりＤＮＡを抽出
した後、これを５０μｌの蒸留水で溶解した。このＤＮ
Ａ溶液５μｌに対し４００ｎＭの配列表１および２記載
のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして含む４５
μｌのポリメラーゼチェインリアクション反応溶液（Ｄ
ＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ
キット：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）ＤＮ
Ａ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、通常の方法に従って遺
伝子増幅を行った（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１，１９８８）。反応
サイクルは変性（９４℃、１分）、プライマーアニーリ
ング（５５℃、１分３０秒）、伸長（７２℃、２分）よ
り構成され、このサイクルを３５回繰り返し行い増幅し
た。増幅遺伝子はＭｉｃｒｏｃｏｎ １００（Ａｍｉｃ
ｏｎ．Ｉｎｃ）を用いて精製し、配列表１記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして市販のキット（ＰＲＩ
ＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ）を用いて反応させ、３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ）を用いて配列決定した。更にウイルス量が少ないこ
とが予想されるＨＢｅ抗体陽性者より得た試料を対象と
する場合には、配列番号５または６記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いて、上記の方法をプライ
マーアニーリング工程を６０℃１分、伸長工程を７２℃
１分３０秒に変更して行う遺伝子増幅作業を引き続いて
行った。この場合には配列決定に際しては配列表１記載
のオリゴヌクレオチドの代わりに配列表５記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて配列を決定し
た。これによってｐｒｅＸ−Ｘ領域を含む塩基配列が決
定された。 （３）ｐｒｅＸ遺伝子ならびに変異型ｐｒｅＸ遺伝子特
異配列の決定 以上の作業より５７クローンのｐｒｅＸ−Ｘ遺伝子領域
の配列が決定され、得られた配列を比較することでｐｒ
ｅＸに保存的な、また愚者に特異的な変異型ｐｒｅＸ遺
伝子配列に特異的な配列を検索した。その結果、ｐｒｅ
Ｘ遺伝子保存的オリゴヌクレオチドとして配列番号１お
よび２の配列を有するオリゴヌクレオチドを、変異型ｐ
ｒｅＸに特異的なオリゴヌクレオチドとして配列番号３
および４記載のオリゴヌクレオチドを見い出した。
疾患例に於けるＨＢＶｐｒｅＸ遺伝子の塩基配列ならび
にアミノ酸配列は次のようにして決定した。 （１）ＤＮＡ抽出 ＨＢＶの無症候性キャリア、慢性肝炎疾患者、肝硬変患
者、肝細胞癌患者の血清より本発明者らが既発表の方法
（Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１
９９０：６４：１２９８−１３０３）に従ってＤＮＡを
抽出した。 （２）塩基配列の決定 （１）の方法に従って５０μｌの血清よりＤＮＡを抽出
した後、これを５０μｌの蒸留水で溶解した。このＤＮ
Ａ溶液５μｌに対し４００ｎＭの配列表１および２記載
のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして含む４５
μｌのポリメラーゼチェインリアクション反応溶液（Ｄ
ＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ
キット：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）ＤＮ
Ａ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、通常の方法に従って遺
伝子増幅を行った（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１，１９８８）。反応
サイクルは変性（９４℃、１分）、プライマーアニーリ
ング（５５℃、１分３０秒）、伸長（７２℃、２分）よ
り構成され、このサイクルを３５回繰り返し行い増幅し
た。増幅遺伝子はＭｉｃｒｏｃｏｎ １００（Ａｍｉｃ
ｏｎ．Ｉｎｃ）を用いて精製し、配列表１記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして市販のキット（ＰＲＩ
ＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ）を用いて反応させ、３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ）を用いて配列決定した。更にウイルス量が少ないこ
とが予想されるＨＢｅ抗体陽性者より得た試料を対象と
する場合には、配列番号５または６記載のオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして用いて、上記の方法をプライ
マーアニーリング工程を６０℃１分、伸長工程を７２℃
１分３０秒に変更して行う遺伝子増幅作業を引き続いて
行った。この場合には配列決定に際しては配列表１記載
のオリゴヌクレオチドの代わりに配列表５記載のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて配列を決定し
た。これによってｐｒｅＸ−Ｘ領域を含む塩基配列が決
定された。 （３）ｐｒｅＸ遺伝子ならびに変異型ｐｒｅＸ遺伝子特
異配列の決定 以上の作業より５７クローンのｐｒｅＸ−Ｘ遺伝子領域
の配列が決定され、得られた配列を比較することでｐｒ
ｅＸに保存的な、また愚者に特異的な変異型ｐｒｅＸ遺
伝子配列に特異的な配列を検索した。その結果、ｐｒｅ
Ｘ遺伝子保存的オリゴヌクレオチドとして配列番号１お
よび２の配列を有するオリゴヌクレオチドを、変異型ｐ
ｒｅＸに特異的なオリゴヌクレオチドとして配列番号３
および４記載のオリゴヌクレオチドを見い出した。
【００３０】
【実施例２】 （１）変異型ｐｒｅＸ遺伝子配列検出系の確立 上記の如く決定された変異型ｐｒｅＸ遺伝子特異オリゴ
ヌクレオチドをプライマーペアとして用いて、遺伝子増
幅法による変異型ｐｒｅＸ遺伝子検出法を確立した。
ヌクレオチドをプライマーペアとして用いて、遺伝子増
幅法による変異型ｐｒｅＸ遺伝子検出法を確立した。
【００３１】（１）ＤＮＡ抽出 ＤＮＡは既記載の方法に従って実施した。 （２）遺伝子増幅 遺伝子増幅は配列番号１および２記載のオリゴヌクレオ
チドをプライマーセットとして、あるいは、同３および
４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして
用い、既記載の反応条件、機器、試薬を用いて増幅し
た。 （３）増幅遺伝子の配列決定 増幅した遺伝子は、既記載の方法にて精製し、既記載の
方法に従って配列を決定した。その結果、配列番号３、
４のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして用いる
ことにより変異型ｐｒｅＸ遺伝子に特異的な配列のみが
増幅されることが判明した。従って、上記のオリゴヌク
レオチドは変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出に有用であり、
記載の方法により特異的に検出できることが確認され
た。
チドをプライマーセットとして、あるいは、同３および
４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして
用い、既記載の反応条件、機器、試薬を用いて増幅し
た。 （３）増幅遺伝子の配列決定 増幅した遺伝子は、既記載の方法にて精製し、既記載の
方法に従って配列を決定した。その結果、配列番号３、
４のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして用いる
ことにより変異型ｐｒｅＸ遺伝子に特異的な配列のみが
増幅されることが判明した。従って、上記のオリゴヌク
レオチドは変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出に有用であり、
記載の方法により特異的に検出できることが確認され
た。
【００３２】
【実施例３】 選択したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた
ｐｒｅＸ遺伝子ならびに変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出 １４３例のＨＢｓ抗原陽性者（供血者４４例、慢性肝炎
患者５４例、肝硬変患者２４例、肝細胞癌患者２１例）
よりＤＮＡを抽出し、配列番号１および２をプライマー
ペアとしてｐｒｅＸ遺伝子（２３３ｂｐ）を、配列番号
３および４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーペア
ーとして変異型ｐｒｅＸ遺伝子（１２０ｂｐ）を検出し
た。使用試料の量、反応条件、ならびに使用試薬・機器
は前述の通りである。結果は表１に示す。
ｐｒｅＸ遺伝子ならびに変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出 １４３例のＨＢｓ抗原陽性者（供血者４４例、慢性肝炎
患者５４例、肝硬変患者２４例、肝細胞癌患者２１例）
よりＤＮＡを抽出し、配列番号１および２をプライマー
ペアとしてｐｒｅＸ遺伝子（２３３ｂｐ）を、配列番号
３および４記載のオリゴヌクレオチドをプライマーペア
ーとして変異型ｐｒｅＸ遺伝子（１２０ｂｐ）を検出し
た。使用試料の量、反応条件、ならびに使用試薬・機器
は前述の通りである。結果は表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】ＨＢｓ抗原陽性者に於ける変異型のｐｒｅ
Ｘ遺伝子陽性者は無症候性ＨＢＶキャリアでは極めて低
い（２．３％）のに対し、Ｂ型慢性肝疾患患者では有意
に高い（５７．４−８１％）ことがわかった。また、慢
性肝疾患群内では慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと進行す
るに伴い陽性率が高くなることが示され（５７．４％、
７５％、８１％）、本検出法がＨＢＶ無症候性ＨＢＶキ
ャリアと肝疾患例との識別およびＢ型慢性肝疾患の病態
推移の予測に有用であることが示された。
Ｘ遺伝子陽性者は無症候性ＨＢＶキャリアでは極めて低
い（２．３％）のに対し、Ｂ型慢性肝疾患患者では有意
に高い（５７．４−８１％）ことがわかった。また、慢
性肝疾患群内では慢性肝炎から肝硬変、肝癌へと進行す
るに伴い陽性率が高くなることが示され（５７．４％、
７５％、８１％）、本検出法がＨＢＶ無症候性ＨＢＶキ
ャリアと肝疾患例との識別およびＢ型慢性肝疾患の病態
推移の予測に有用であることが示された。
【００３５】
【実施例４】 ＨＢｅ抗陽性ＨＢＶ疾病患者、ならびにＨＢｅ抗体陽性
ＨＢＶ疾病患者での変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出。 ＨＢｅ抗原陽性あるいはＨＢｅ抗体陽性の無症候性キャ
リアと肝疾患患者についてＴｏｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡ
のなかでの変異型ｐｒｅＸ遺伝子を調べた。
ＨＢＶ疾病患者での変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出。 ＨＢｅ抗原陽性あるいはＨＢｅ抗体陽性の無症候性キャ
リアと肝疾患患者についてＴｏｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡ
のなかでの変異型ｐｒｅＸ遺伝子を調べた。
【００３６】上記のＨＢＶ−ＤＮＡ陽性者から前述の方
法に従ってＤＮＡを抽出し、これを適当な希釈液を用い
て１０倍ずつ希釈し、希釈ＤＮＡ系列を作成し、これよ
り増幅を行い検出可能な最低濃度より、希釈前の試料の
力価を求めた。具体的には、試料ＤＮＡ溶液１μｌに、
配列番号１および２記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして４０ｎＭ含む前述のポリメラーゼチェインリ
アクション反応液（ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｒｅａｇｅｎｔ キット：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ）を加え、前述の機器を用いて変性（９
４℃、１分）、プライマーアニーリング（６０℃、１分
３０秒）、伸長（７２℃、２分）より構成される反応サ
イクルを３０回繰り返し行い第一段階増幅を行った。こ
の増幅産物Ｔｏｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡ検出の場合には
配列番号５および６記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして、また変異型ｐｒｅＸ遺伝子検出の場合には
配列番号３および４記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして４００ｎＭ含むポリメラーゼチェインリアク
ション反応液（ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒ
ｅａｇｅｎｔ キットＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）を加え、前述の機器を用いて変性（９４℃、１
分）、プライマーアニーリング（６０℃、１分３０
秒）、伸長（７２℃、２分）より構成される反応サイク
ルを３０回繰り返し行い、第二段階増幅を行った。増幅
後、前述の方法に従って電気泳動を実施した。非変異型
ｐｒｅＸ遺伝子は２３３ｂｐ（塩基長）のバンドとし
て、変異型ｐｒｅＸ遺伝子は１２０ｂｐのバンドとして
確認された。
法に従ってＤＮＡを抽出し、これを適当な希釈液を用い
て１０倍ずつ希釈し、希釈ＤＮＡ系列を作成し、これよ
り増幅を行い検出可能な最低濃度より、希釈前の試料の
力価を求めた。具体的には、試料ＤＮＡ溶液１μｌに、
配列番号１および２記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして４０ｎＭ含む前述のポリメラーゼチェインリ
アクション反応液（ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｒｅａｇｅｎｔ キット：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ）を加え、前述の機器を用いて変性（９
４℃、１分）、プライマーアニーリング（６０℃、１分
３０秒）、伸長（７２℃、２分）より構成される反応サ
イクルを３０回繰り返し行い第一段階増幅を行った。こ
の増幅産物Ｔｏｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡ検出の場合には
配列番号５および６記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして、また変異型ｐｒｅＸ遺伝子検出の場合には
配列番号３および４記載のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして４００ｎＭ含むポリメラーゼチェインリアク
ション反応液（ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒ
ｅａｇｅｎｔ キットＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）を加え、前述の機器を用いて変性（９４℃、１
分）、プライマーアニーリング（６０℃、１分３０
秒）、伸長（７２℃、２分）より構成される反応サイク
ルを３０回繰り返し行い、第二段階増幅を行った。増幅
後、前述の方法に従って電気泳動を実施した。非変異型
ｐｒｅＸ遺伝子は２３３ｂｐ（塩基長）のバンドとし
て、変異型ｐｒｅＸ遺伝子は１２０ｂｐのバンドとして
確認された。
【００３７】上記の作業の結果、肝疾患例では変異型ｐ
ｒｅＸ遺伝子がＨＢｅ抗原陽性、抗体陽性にかかわらず
ｔｏｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡとパラレルに検出されるこ
とがわかった。変異型ｐｒｅＸ遺伝子の有無が病態の発
症に大きく関係していることが示され、この変異型ｐｒ
ｅＸ遺伝子が病態のマーカーとして有用であることが確
認された。（図２）
ｒｅＸ遺伝子がＨＢｅ抗原陽性、抗体陽性にかかわらず
ｔｏｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡとパラレルに検出されるこ
とがわかった。変異型ｐｒｅＸ遺伝子の有無が病態の発
症に大きく関係していることが示され、この変異型ｐｒ
ｅＸ遺伝子が病態のマーカーとして有用であることが確
認された。（図２）
【００３８】
【発明の効果】本発明は、ＨＢＶ遺伝子のなかの変異型
ｐｒｅＸ遺伝子ならびにその遺伝子産物および抗遺伝子
産物抗体を高感度に検出する方法ならびにそれに利用で
きるオリゴヌクレオチド、抗原性ペプチド、抗体を提供
できる。従って、Ｂ型肝炎患者にあって正確な診断、特
に病態の把握が可能であり、ウイルス肝炎における治療
上有用な情報を提供できる。
ｐｒｅＸ遺伝子ならびにその遺伝子産物および抗遺伝子
産物抗体を高感度に検出する方法ならびにそれに利用で
きるオリゴヌクレオチド、抗原性ペプチド、抗体を提供
できる。従って、Ｂ型肝炎患者にあって正確な診断、特
に病態の把握が可能であり、ウイルス肝炎における治療
上有用な情報を提供できる。
【００３９】
【配列表】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】
【００４５】
【００４６】
【図１】無症候性キャリアおよび各種肝疾患患者より得
たＨＢＶ−ＤＮＡのｐｒｅＸ領域の塩基配列を示す。図
左に示した番号で（０１）から（２４）は無症候性キャ
リア、（２５）から（５７）は慢性肝疾患者、肝硬変患
者、肝細胞癌患者の血清より得られたクローンを示す。
たＨＢＶ−ＤＮＡのｐｒｅＸ領域の塩基配列を示す。図
左に示した番号で（０１）から（２４）は無症候性キャ
リア、（２５）から（５７）は慢性肝疾患者、肝硬変患
者、肝細胞癌患者の血清より得られたクローンを示す。
【図２】ＨＢｅ抗原陽性群ならびに抗ＨＢｅ抗体陽性群
での無症候性キャリア（○）ならびに各種疾患患者
（●）の変異型ｐｒｅＸ遺伝子力価（縦軸）およびｔｏ
ｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡ力価（横軸）を示す。
での無症候性キャリア（○）ならびに各種疾患患者
（●）の変異型ｐｒｅＸ遺伝子力価（縦軸）およびｔｏ
ｔａｌ ＨＢＶ ＤＮＡ力価（横軸）を示す。
【図３】野生型、変異型のそれぞれＤＮＡ配列のうちプ
ライマー＃ＨＸ−４（配列番号１）、＃ＨＸ−５（配列
番号２）に相当する領域における制限酵素ＢａｌＩ、Ｓ
ａｕ３ＡＩによって認識される配列部分を示す。Ｂａｌ
Ｉは野生型においてのみ、Ｓａｕ３ＡＩは変異型におい
てのみ作用される。
ライマー＃ＨＸ−４（配列番号１）、＃ＨＸ−５（配列
番号２）に相当する領域における制限酵素ＢａｌＩ、Ｓ
ａｕ３ＡＩによって認識される配列部分を示す。Ｂａｌ
Ｉは野生型においてのみ、Ｓａｕ３ＡＩは変異型におい
てのみ作用される。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/576 Ｂ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｓ
Claims (20)
- 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項２】配列番号２記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項３】配列番号３記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項４】配列番号４記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項５】配列番号５記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項６】配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項７】配列番号７記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド。 - 【請求項８】配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプチド。 - 【請求項９】配列番号７記載の抗原性ペプチドと結合す
る抗ｐｒｅＸ抗体。 - 【請求項１０】配列番号３および配列番号４記載の塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーペアとし
て使用して遺伝子増幅を行うＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺
伝子の検出方法。 - 【請求項１１】配列番号１、配列番号２記載のオリゴヌ
クレオチド、および／または配列番号５、配列番号６記
載のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして第一段
階のｐｒｅＸ遺伝子増幅を行ったのち、配列番号３、配
列番号４記載のオリゴヌクレオチドを使用して第二段階
の遺伝子増幅を行うＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検
出方法。 - 【請求項１２】配列番号１、配列番号２記載のオリゴヌ
クレオチド、および／または配列番号５、配列番号６記
載のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして遺伝子
増幅を行ったのちに、制限酵素ＢａｌＩで処理するＢ型
肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法。 - 【請求項１３】配列番号１、配列番号２記載のオリゴヌ
クレオチド、および／または配列番号５、配列番号６記
載のオリゴヌクレオチドをプライマーペアとして遺伝子
増幅を行ったのちに、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで処理する
Ｂ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法。 - 【請求項１４】配列番号３および／または配列番号４記
載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして使用する
Ｂ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方法。 - 【請求項１５】配列番号１ないし配列番号６記載のオリ
ゴヌクレオチドのいずれかを捕捉プローブとして使用し
て変異型ｐｒｅＸ遺伝子を捕捉するＢ型肝炎変異型ｐｒ
ｅＸ遣伝子の検出方法。 - 【請求項１６】配列番号７または８記載のポリペプチド
を抗原として使用する、抗ｐｒｅＸ抗体の検出方法。 - 【請求項１７】配列番号７記載のポリペプチドを抗原と
して使用して抗ｐｒｅＸ抗体を捕捉し、標識抗ヒト免疫
グロブリン抗体と結合させるＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺
伝子の検出方法。 - 【請求項１８】抗ｐｒｅＸ抗体を使用してｐｒｅＸ遺伝
子産物を捕捉し、捕捉物を標識抗ｐｒｅＸ遺伝子産物抗
体と結合させるＢ型肝炎変異型ｐｒｅＸ遺伝子の検出方
法。 - 【請求項１９】配列番号７または８記載のポリペプチド
を動物に免疫して得る、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＸ遺伝
子産物ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体。 - 【請求項２０】請求項１９記載のポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体を使用するＢ型肝炎ｐｒｅＸ遺
伝子産物の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6155125A JPH07327686A (ja) | 1994-06-02 | 1994-06-02 | Ｂ型肝炎ウイルスの変異型ｐｒｅＸ遺伝子オリゴヌクレオチ ド、ポリペプチド、検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6155125A JPH07327686A (ja) | 1994-06-02 | 1994-06-02 | Ｂ型肝炎ウイルスの変異型ｐｒｅＸ遺伝子オリゴヌクレオチ ド、ポリペプチド、検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07327686A true JPH07327686A (ja) | 1995-12-19 |
Family
ID=15599110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6155125A Pending JPH07327686A (ja) | 1994-06-02 | 1994-06-02 | Ｂ型肝炎ウイルスの変異型ｐｒｅＸ遺伝子オリゴヌクレオチ ド、ポリペプチド、検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07327686A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1544311A1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-06-22 | Bio-Rad Pasteur | Oligonucleotides for the detection of hepatitis B virus |
-
1994
- 1994-06-02 JP JP6155125A patent/JPH07327686A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1544311A1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-06-22 | Bio-Rad Pasteur | Oligonucleotides for the detection of hepatitis B virus |
| WO2005061737A1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-07-07 | Bio-Rad Pasteur | Oligonucleotides for the detection of hepatitis b virus |
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