JPH0735691A

JPH0735691A - 化学センサ及びその製造方法並びに化学センサユニット

Info

Publication number: JPH0735691A
Application number: JP18041993A
Authority: JP
Inventors: Katsuaki Umibe; 勝晶海部; Hiroo Miyamoto; 裕生宮本; Minoru Saito; 稔斎藤; Masakazu Kato; 雅一加藤
Original assignee: Oki Electric Industry Co Ltd
Current assignee: Oki Electric Industry Co Ltd
Priority date: 1993-07-21
Filing date: 1993-07-21
Publication date: 1995-02-07

Abstract

(57)【要約】【目的】リポソームを用いた化学センサであって、従
来より取扱が容易な化学センサを提供すること。【構成】光ファイバ１１の先端に膜電位感受性色素を
内包したリポソーム１３を固定する。【効果】光ファイバ１１及びリポソーム１３が一体と
なった化学センサであるので、光ファイバを測定対象の
液体から洗浄液に移動すると、リポソームも共に移動す
る。先回のセンシングにおいてリポソームに吸着した化
学物質をこの洗浄液中で洗い落とせる。その後、この化
学センサを別のセンシングに使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、生物の味覚、嗅覚機
能を模倣した化学センサ、その製造方法、前記化学セン
サを用いた化学センサユニットに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】化学物質のセンサとして従来から研究さ
れているものに、酵素センサ、免疫センサがある。これ
らは、特定の化学物質を選択的に検出するものである。
これに対し生物の味覚や嗅覚は、多種多様な化学物質を
同時に認識する化学センサといえ、多種多様な化学物質
の複雑かつ総合的な組み合わせに由来している味やニオ
イをも認識する。したがって、味覚や嗅覚を模倣した化
学センサが実現できれば、食品工業、化粧品工業、さら
に近年注目されている環境計測などの広い分野で種々の
利点が得られる。しかし、味覚や嗅覚が味やニオイをど
のような機構で認識するかについては、まだはっきりし
ていないことが多い。いまのところ、多数の非特異的な
受容体から得た応答を脳が情報処理してニオイ、味のパ
ターンとして認識するといわれている。

【０００３】味覚や嗅覚を模倣する際の、受容体を模倣
する具体的手段として、例えば、文献Ｉ（バイオケミス
トリー（Biochemistry），２６，６１４１−６１４５
（１９８７））に示されているように、リポソームが考
えられている。即ち、脂質二分子膜で構成されたリポソ
ームでは、これに種々のニオイ物質が吸着すると二分子
膜の構造が変化するため膜電位が変化する。この膜電位
変化は膜電位感受性色素により検知できる。このような
機構でニオイ物質（化学物質）をセンシングしようとす
るのである。

【０００４】この出願にかかる発明者も、リポソーム及
び膜電位感受性色素を利用した化学センサを、例えば特
開平３−２４５０４４号（特願平２−４１１３２号）に
開示している。詳細には、組成の異なる少なくとも二種
類以上のリポソームそれぞれに、蛍光波長の異なる膜電
位感受性色素を内包存在させたリポソームを含む懸濁液
を用い、上記リポソームの膜電位変化を上記色素の蛍光
強度変化として検出する化学センサを開示していた。こ
の化学センサでは同時に多重の情報が得られるので化学
物質の認識に有利と考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開平
３−２４５０４４に開示の化学センサでは、リポソーム
の懸濁液を用いていたため、化学物質の１回の測定毎に
懸濁液は測定対象の化学物質で汚染される。このため、
測定毎に新たなリポソーム懸濁液を用意する必要がある
など、センサとして使用するにはその取り扱いが煩雑で
あるという問題点があった。

【０００６】また、複数種類のリポソームから得られる
情報を区別するために、リポソームの種類と同じ数だけ
の膜電位感受性色素を用意する必要があること、さら
に、これら色素毎の所定波長の励起光を用意する必要が
あること、各色素からの蛍光波長に対応して測定波長を
切り換える必要があることなどの問題点があった。

【０００７】この出願はこのような点に鑑みなされたも
のであり、従ってこの出願の第一発明の目的は、リポソ
ームを利用した化学センサであって取扱が従来より簡易
な化学センサを提供することにある。また、この出願の
第二発明の目的は、リポソームを利用した化学センサで
あって取扱が従来より簡易で、かつ、膜電位感受性色素
の使用種類数の低減及び励起波長や測定波長それぞれの
単一波長化が図れる化学センサを提供することにある。
また、この出願の第三発明の目的は、第一発明及び第二
発明の化学センサを製造するための具体的な方法を提供
することにある。また、この出願の第四発明の目的は、
第一発明及び第二発明のの化学センサを有効に使用する
ための化学センサユニットを提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記第一発明の目的の達
成を図るため、この出願の第一発明によれば、光導波手
段と、該光導波手段の端部に固定され膜電位感受性色素
を内包しているリポソームとを具えたことを特徴とす
る。

【０００９】また、上記第二発明の目的の達成を図るた
め、この出願の第二発明によれば、第一発明の化学セン
サを複数具えたことを特徴とする。ただし、この第二発
明の化学センサにおける前記複数の化学センサにおいて
は、個々の化学センサ（これを、「個別化学センサ」と
いう。）毎でリポソームの脂質組成を異ならせてある
か、あるいは、いくつかの個別化学センサ群毎でリポソ
ームの脂質組成を異ならせてある。

【００１０】なお、第一発明及び第二発明の実施例に当
たり、光導波手段の具体例としては、光ファイバ、又
は、ガラス基板、高分子薄膜若しくは半導体基板に導波
路を作製して構成される導波構造など種々のものを挙げ
ることができる。そのようなものの中でも光ファイバは
センシング時の化学センサの移動の容易さなどを考える
と、光導波手段として好適である。なお、ここでいう光
導波手段は、その一部を光ファイバで構成し、他の部分
を基板に形成した導波構造で構成したものの場合であっ
ても良い。

【００１１】また、上記第三発明の目的の達成を図るた
め、この出願の第三発明によれば、第一発明及び第二発
明の化学センサを製造する方法として、以下の（ａ），
（ｂ）の２つの態様を主張する。

【００１２】（ａ）．前記光導波手段のリポソーム固定
予定の端部にアミノ基を導入する工程と、前記リポソー
ムとして脂質二重膜にタンパク質が埋め込まれたリポソ
ームを形成する工程と、該タンパク質が埋め込まれたリ
ポソームを、前記アミノ基導入済みの光導波手段の端部
に、タンパク質−グルタルアルデヒド−アミノ基の結合
を利用して、固定する工程とを含む方法。

【００１３】（ｂ）．前記光導波手段のリポソーム固定
予定の端部にアミノ基を導入する工程と、該導入された
アミノ基にビオチンを導入する工程と、前記リポソーム
として脂質二重膜にタンパク質が埋め込まれたリポソー
ムを形成する工程と、該埋め込まれたタンパク質にビオ
チンを導入する工程と、前記ビオチン導入済みのリポソ
ームを、前記ビオチン導入済みの光導波手段の端部に、
ビオチン−アビジンの結合又はビオチン−ストレプトア
ビジンの結合を利用して固定する工程とを含む方法。

【００１４】また、上記第四発明の目的の達成を図るた
め、この出願の第四発明によれば、第一及び第二発明の
化学センサから選ばれた化学センサと、該化学センサに
備わる光導波手段の、リポソームが固定されている端部
とは反対側の端部に接続され、該リポソーム内の膜電位
感受性蛍光色素に対し励起光を供給するための光源と、
前記反対側端部に接続され前記膜電位感受性蛍光色素か
らの蛍光を測定するための受光素子とを具えたことを特
徴とする。

【００１５】

【作用】この第一発明の構成によれば、光導波手段のリ
ポソームが固定されている側の端部を所定液体（例えば
バッファ）に浸漬することで化学物質のセンシング状態
が形成できる。この液体にセンシング対象の化学物質が
加わると、リポソームの膜電位が変化する。この膜電位
の変化はリポソームに内包してある膜電位感受性色素に
より従来同様感知できる。ただし、この第一発明では、
膜電位感受性色素を励起するための励起光は光導波手段
によって外部から導入でき、また、膜電位変化に応じて
生じる膜電位感受性色素の蛍光強度変化は同じく光導波
手段によって外部に取り出せる。さらに、光導波手段及
びリポソームは一体となっているので、センシング終了
後は、この化学センサを、化学センシングの対象物が混
入された液体中から例えば純水などの好適な洗浄液中に
移動でき、そして、この洗浄液によって化学センサ（特
にリポソーム）を清浄することで先回のセンシング時の
化学物質を洗い落とせるので、化学センサの再生ができ
る。したがって、リポソーム懸濁液を測定毎に新たに用
意する必要がなくなる。

【００１６】また、第二発明の構成によれば、リポソー
ムの脂質組成を異ならせることで複数種類の個別化学セ
ンサを構成し、これら複数種類の個別化学センサの束に
より化学センサが構成される。脂質組成が異なるリポソ
ームを具えた個別化学センサそれぞれは、１つの化学物
質に対して異なる膜電位変化を示すから、これら個別化
学センサのリポソームに内包してある膜電位感受性色素
が同じ種類のものであっても、これら個別化学センサそ
れぞれでは異なる蛍光強度変化が生じる。このことは、
膜電位感受性色素を励起するための励起波長を統一化し
たとしても、同時に多重の情報が得られることを意味す
る。一方、膜電位感受性色素を統一すると個別化学セン
サから出力される励起光の波長も同じとなってしまう
が、個別化学センサの光導波手段それぞれには例えばフ
ォトダイオード等の好適な受光素子を個別に接続できる
から、個別化学センサから出力される各励起光は容易に
分離して測定できる。このため、測定波長の統一化も図
れる。また、この第二発明の化学センサでは、例えばあ
るニオイ物質に対する各個別化学センサから出力される
励起光をパターンとして登録することも可能になるの
で、化学物質をより生体機能に近い形でセンシングでき
ると考えられる。

【００１７】また、この出願の第三発明の化学センサの
各製造方法では、光導波手段に所定のリポソームを、第
一態様の方法にあっては、アミノ基−グルタルアルデヒ
ド−タンパク質の結合を利用して固定し、第二態様の方
法にあっては、ビオチン−アビジンの結合又はビオチン
−ストレプロアビジンの結合を利用して固定する。この
ため、光導波手段に所定のリポソームを、所望通りかつ
実用的な強度で固定できる。

【００１８】また、この出願の第四発明の化学センサユ
ニットでは、第一発明及び第二発明の化学センサによる
センシングを簡易に行える。

【００１９】

【実施例】以下、図面を参照してこの出願の第一発明〜
第四発明の各実施例についてそれぞれ説明する。しかし
ながら、説明に用いる各図はこの発明を理解出来る程度
に各構成成分の寸法、形状及び配置関係を概略的に示し
てあるにすぎない。また、各図において同様な構成成分
については同一の番号を付して示し、それらの重複説明
は場合により省略する。また、以下の説明中で述べる使
用材料、その使用量、処理方法、処理温度、処理時間な
どの各条件はこれら発明の範囲内の一例に過ぎないこと
は理解されたい。

【００２０】１．第一発明の化学センサの実施例の説明図１（Ａ）、（Ｂ）及び図２（Ａ）、（Ｂ）は第一発明
の実施例の化学センサ１０の説明に供する図である。特
に、図１（Ａ）はこの化学センサ１０の全体を示した
図、図１（Ｂ）はこの化学センサ１０に備わる光導波手
段１１のリポソーム１３が固定されている端部側の部分
（図１（Ａ）のＰ部分）を拡大して示した図、図２
（Ａ）及び（Ｂ）はリポソームの説明図である。

【００２１】第一発明の実施例の化学センサ１０は、光
導波手段１１としての光ファイバ１１と、この光ファイ
バ１１の一方の端部（一方の先端面）に固定され、膜電
位感受性色素（図２（Ａ）、（Ｂ）に２１ａ，２１ｂで
示す。）を内包しているリポソーム１３とを具えてい
る。ただし、この実施例では、リポソーム１３として、
脂質組成が異なる２種類のリポソームであって異なる膜
電位感受性色素を内包している第１のリポソーム１３ａ
及び第２のリポソーム１３ｂを光ファイバ１１の先端面
にそれぞれ固定した例を示している（図１（Ｂ）、図２
（Ａ）、（Ｂ）参照。）。もちろん、リポソームの種類
はこれに限られず化学センサの設計に応じ任意とでき、
１種類の場合でも良く、３種類以上の場合でも良い。な
お、図１（Ｂ）において１５は、光ファイバ１１の先端
にリポソーム１３を固定するための手段を示す。この固
定手段１５は特に限定されるものではないが、後述の製
造方法の項において好適な例を２つ程示している。

【００２２】ここで、光ファイバ１１は化学センサの設
計に応じ任意好適なものを使用できる。波長多重できる
光ファイバを用いることもできる。また、リポソーム１
３ａ、１３ｂの脂質二分子膜１３ｘ（図２（Ａ）、
（Ｂ）参照）を構成するための脂質やリポソームに内包
させる膜電位感受性色素２１ａ，２１ｂとして何を用い
るかは、化学センサの設計に応じ任意とできる。この実
施例では、第１のリポソーム１３ａの脂質を卵ホスファ
チジルコリン（以下、ＰＣ）とし、膜電位感受性色素を
ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）−ペンタメ
チンオキソノール（以下、ＤｉＢａＣ₄（５））と
し、また、第２のリポソーム１３ｂの脂質を上記ＰＣと
卵ホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥ）との
混合脂質とし、膜電位感受性色素をビス−（１，３−ジ
ブチルバルビツール酸）−トリメチンオキソノール（以
下、ＤｉＢａＣ₄（３））としている（詳細は後述の製
造方法の項で説明する。）。

【００２３】この第一発明の化学センサ１０では、詳細
は後述の化学センサユニットの説明の項で説明するが、
その先端部（リポソーム１３を固定してある側）を適当
な液体（例えばバッファ）に浸漬することで化学物質の
センシング可能状態となる。光ファイバ１１の他端から
膜電位感受性色素に応じた波長の励起光を入力すること
でリポソーム１３内の膜電位感受性蛍光色素が励起され
る。センシングに用いている液体に化学物質が加わると
リポソーム１３の膜電位が変化する。この膜電位変化は
膜電位感受性色素の蛍光強度変化として検出できる。こ
の蛍光強度変化は光ファイバ１１により外部に取り出せ
る。また、センシング終了後は、純水等の洗浄液側に化
学センサ１０を移動しその洗浄液により化学センサ１０
のリポソーム１３から化学物質を洗い落とすことができ
るので、多数回のセンシングに繰り返し使用できる。

【００２４】２．第二発明の化学センサの実施例の説明図３（Ａ）、（Ｂ）は第二発明の実施例の化学センサ３
０の説明に供する図である。特に、図３（Ａ）はこの化
学センサ３０の全体を示した図、図３（Ｂ）はこの化学
センサ３０の先端部（図３（Ａ）のＱ部分）を拡大して
示した図である。

【００２５】この第二発明の実施例の化学センサは、複
数個（この例では図３（Ｂ）に示すごとく７個）の第一
発明の化学センサ（以下、それぞれを「個別化学セン
サ」とも称する。）１０ａ〜１０ｇを束ねた構成として
ある。ただし、７個の個別化学センサ１０ａ〜１０ｇで
は、リポソームに内包させてある膜電位感受性色素はい
ずれも同じ種類のものとしている。また、複数個の個別
化学センサ１０ａ〜１０ｇにおいては、個別化学センサ
毎でリポソームの脂質組成を異ならせてあるか、あるい
は、いくつかの個別化学センサ群毎でリポソームの脂質
組成を異ならせてある。この実施例では、７個の個別化
学センサ１０ａ〜１０ｇのうちの、１０ａ〜１０ｄで示
す４個の個別化学センサで構成される第１の群と、１０
ｅ〜１０ｇで示す３個の個別化学センサで構成される第
２の群とで、リポソームの脂質組成を異ならせてある。
すなわち、第１の群の各リポソームとして第１の脂質で
構成したものを用い、第２の群の各リポソームとして第
２の脂質で構成したものを用いている。図３において、
脂質組成が異なる２種類のリポソームを、１３ｙ，１３
ｚとして示している。リポソーム１３ｙ，１３ｚを構成
するための第１の脂質、第２の脂質、またリポソームに
内包させる膜電位感受性色素としてどのような材料を用
いるかは、化学センサの設計に応じ任意とできる。この
実施例では、１０ａ〜１０ｄの個別化学センサの各リポ
ソーム１３ｙの脂質をＰＣとし、１０ｅ〜１０ｇの個別
化学センサの各リポソーム１３ｚの脂質をＰＣとＰＥと
の混合脂質とし、１０ａ〜１０ｇの全個別化学センサの
リポソームに内包させた膜電位感受性色素をＤｉＢａＣ
₄（５）としている（詳細は後述の製造方法の項で説明
する。）。

【００２６】上述の例では個別化学センサの個数を７と
し、リポソームの脂質組成を２種類とし、かつ、７個の
個別化学センサを４：３の割合で２群に分けた例を示し
た。しかし、個別化学センサ数、リポソームの脂質組成
の種類数、個別化学センサの群の構成方法は化学センサ
の設計に応じ変更できる。例えば、リポソームの脂質組
成をｎ種類（ｎは２以上の整数）としたなら、原理的に
は、個別化学センサの数はｎ個で良い。ただし、センサ
の信頼性を考えるとｎ種類の個別センサを複数づつ用い
る構成も好適と考える。

【００２７】この第二発明の化学センサ３０も第一発明
の化学センサと同様な原理で化学物質のセンシングがで
きるものである。ただし、個別化学センサ１０ａ〜１０
ｄの群と個別化学センサ１０ｅ〜１０ｇの群とで、リポ
ソームの脂質組成を異ならせてあるので、各群の個別化
学センサは化学物質に対し固有の応答性を示す。したが
って、この実施例の場合は、第１群の個別化学センサか
らの蛍光強度変化と、第２群の個別化学センサからの蛍
光強度変化とで構成される２種類の蛍光強度変化が同時
に観測できる。また、個別化学センサ１０ａ〜１０ｆの
リポソームに内包させる膜電位感受性色素を同種類のも
のとしてあるから、上記蛍光強度変化の測定は、７個の
個別化学センサに共通な励起光と共通な測定波長により
行える。すなわち、個別化学センサ１０ａ〜１０ｆの光
ファイバの他端（図３（Ａ）中１１ｘで示す）からこれ
ら個別化学センサに対し同じ波長の励起光を入れての測
定ができる。また、個別化学センサ１０ａ〜１０ｆの光
ファイバの他端１１ｘから取り出される励起光は、個別
化学センサ１０ａ〜１０ｆ毎で例えばフォトダイオード
で測定できるので、測定波長も統一できる。

【００２８】３．第三発明（化学センサの製法）の実施
例の説明３−１．第三発明の第一の態様の説明第一及び第二発明の化学センサを製造する当たり光ファ
イバの先端にリポソームを固定する第一の方法として、
アミノ基−グルタルアルデヒド−タンパク質の結合を利
用する方法を説明する。ただし、ここでは、第一発明の
実施例に示した化学センサ１０を製造する場合、即ち、
光ファイバ１１の先端に第１のリポソーム１３ａ及び第
２のリポソーム１３ｂがそれぞれ固定されている化学セ
ンサを製造する場合の例で説明する。図４はその説明に
供する工程図である。

【００２９】先ず、光導波手段としてこの場合石英製光
ファイバ１１を用意する（図４（Ａ））。この光ファイ
バ先端にアミノ基を導入する。この方法として、アミノ
基を有するシランカップラー剤で光ファイバ先端を処理
するのが良い。このため、ここでは、１％アミノプロピ
ルトリエトキシシラン（型番ＬＳ−３１５０：信越シリ
コーン社製）水溶液中に、この光ファイバ１１をその先
端部のみ２分間浸漬する。これを取り出し純水で洗浄し
た後、恒温槽中で１１０℃の温度で１０分間加熱する。
この一連の処理により光ファイバ先端にアミノ基が導入
される（図４（Ｂ））。

【００３０】次に、アミノ基導入済みの光ファイバの当
該先端を１％グルタルアルデヒド水溶液中に１時間浸漬
することにより、光ファイバ先端にアルデヒド基を導入
する（図４（Ｃ））。

【００３１】一方、リポソームは次のように調製する。
まず、リン脂質の一つである卵ホスファチジルコリン
（以下、ＰＣ）１００ｍｇをクロロホルム５ｍｌに溶解
した溶液と、膜タンパク質としてのアラメシチン（シグ
マ社製）１ｍｇをエタノール１ｍｌに溶解した溶液と
を、容量５０ｍｌのナス形フラスコに入れ混合し、次い
で、ロータリエバポレータを用いて溶媒を蒸発させる。
これにより、フラスコ内壁に薄膜状に脂質膜が残る。次
に、このフラスコ内に、膜電位感受性色素としてこの場
合ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）−ペンタ
メチンオキソノール（ＤｉＢａＣ₄（５））を含む１
０ｍｌの重炭酸バッファ（ｐＨ８．５のもの）を加え、
その後、３７℃の下でボルテックスミキサーで攪拌し脂
質膜を分散させる。このように作製した脂質懸濁液に超
音波をかけてリポソームを構成した後、遠心機（100,00
0g）にかけ、上清を集める。さらに、リポソーム懸濁液
をエクストルーダ（日油リポソーム社製）にかけリポソ
ームの径を２００ｎｍ以下に揃える。さらに、重炭酸バ
ッファ（ｐＨ８．５のもの）で１０倍に希釈してＰＣリ
ポソーム懸濁液（第１のリポソーム懸濁液）を調製し
た。このＰＣリポソームは模式的に示すと図４（Ｄ）の
状態にある。図４（Ｄ）において、１３が膜電位感受性
色素（図示せず）を内包するリポソームであり、１５ｘ
がリポソーム１３の脂質二分子膜に組み込まれたタンパ
ク質である。このＰＣリポソームは詳細には図２（Ａ）
の状態のものに相当する。

【００３２】また、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）５
０ｍｇ及び卵ホスファチジルエタノールアミン（以下、
ＰＥ）５０ｍｇをクロロホルム５ｍｌに溶解した溶液
と、膜タンパク質としてのアラメシチン（シグマ社製）
１ｍｇをエタノール１ｍｌに溶解した溶液とを、容量５
０ｍｌのナス形フラスコに入れ混合し、上記ＰＣリポソ
ーム懸濁液を調製した方法に従いＰＣ＋ＰＥリポソーム
懸濁英気（第２のリポソーム懸濁液）を調製した。ただ
し、この場合は、膜電位感受性色素として、ビス−
（１，３−ジブチルバルビツール酸）−トリメチンオ
キソノール（ＤｉＢａＣ₄（３））を用いている。この
ＰＣ＋ＰＥリポソームも模式的に示すと図４（Ｄ）の状
態にある。詳細には図２（Ｂ）の状態のものに相当し、
脂質二分子膜１３ｘがＰＣとＰＥとで構成されたもので
ある。

【００３３】上述のように調製した第１のリポソーム懸
濁液と第２のリポソーム懸濁液とを１：１の割合で混合
したものに、上記アルデヒド導入済みの光ファイバを、
室温で２時間浸漬する。アルデヒド基は、リポソームに
埋め込まれたタンパク質アラメシチンのアミノ基と反応
して結合するため、光ファイバ１１の先端にリポソーム
１３が固定される（図４（Ｅ））。なお、光ファイバに
結合していない不要なリポソームは重炭酸バッファ（ｐ
Ｈ８．５のもの）で光ファイバ先端を洗浄することによ
り除去する。

【００３４】３−２．第三発明の第二の態様の説明第一及び第二発明の化学センサを製造する際の光ファイ
バの先端にリポソームを固定する第二の方法として、ビ
オチン−ストレプトアビジンの結合を利用する方法を説
明する。ただし、ここでも、第一発明の実施例に示した
化学センサ１０を製造する例、即ち、光ファイバ１１の
先端に第１のリポソーム１３ａ及び第２のリポソーム１
３ｂがそれぞれ固定されている化学センサを製造する例
を説明する。図５及び図６はその説明に供する工程図で
ある。

【００３５】先ず、上述の第一の態様で説明した手順で
光ファイバ１１の先端にアミノ基を導入する（図５
（Ａ）及び（Ｂ））。次に、このアミノ基導入済みの光
ファイバの当該先端部を、１０ｍｌの重炭酸バッファ
（ｐＨ８．５）に浸漬し、そして、このバッファ中に３
ｍｇのスルホサクシイミジル−６−（ビオチナミド）ヘ
キサノエート［Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)Hex
anoate］（商品名ＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ：フナコ
シ薬品社製）を添加して１時間反応させる。これによ
り、光ファイバ１１の先端にアミノ基を介しビオチン
（ビオチンロングアーム）が導入される（図５
（Ｃ））。なお、図５（Ｃ）以後、光ファイバ１１とビ
オチン４１との結合状態を化学構造式を用いずに模式的
に示す。

【００３６】次に、ビオチン導入済みの光ファイバをリ
ン酸バッファ（ｐＨ７．３のもの）により洗浄して不要
なビオチンを除去する。その後、この光ファイバの先端
部を、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（フナコ
シ薬品社製）重炭酸バッファ（ｐＨ８．５のもの）溶液
中に室温で２時間浸漬する。これにより、光ファイバ１
１の先端に、アミノ基及びビオチンを介しストレプトア
ビジンが導入される（図５（Ｄ））。

【００３７】一方、リポソームは次のように調製する。
まず、リン脂質の一つである卵ホスファチジルコリン
（以下、ＰＣ）１００ｍｇをクロロホルム５ｍｌに溶解
した溶液と、膜タンパク質としてのアラメシチン（シグ
マ社製）１ｍｇをエタノール１ｍｌに溶解した溶液と
を、容量５０ｍｌのナス形フラスコに入れ混合し、次い
で、ロータリエバポレータを用いて溶媒を蒸発させる。
これにより、フラスコ内壁に薄膜状に脂質膜が残る。次
に、このフラスコ内に、膜電位感受性色素としてこの場
合ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）−ペンタ
メチンオキソノール（ＤｉＢａＣ₄（５））を含む１
０ｍｌの重炭酸バッファ（ｐＨ８．５のもの）を加え、
その後、３７℃の下でボルテックスミキサーで攪拌し脂
質膜を分散させる。このように作製した脂質懸濁液に超
音波をかけてリポソームを構成した後、遠心機（100,00
0g）にかけ、上清を集める。さらに、リポソーム懸濁液
をエクストルーダ（日油リポソーム社製）にかけリポソ
ームの径を２００ｎｍ以下に揃える。この懸濁液に、１
ｍｇ／ｌの濃度のＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮの重炭酸
バッファ溶液を１ｍｌ加え、２時間攪拌させながら反応
させる（図６（Ａ））。さらに、重炭酸バッファ（ｐＨ
８．５のもの）で１０倍に希釈して第二の態様における
ＰＣリポソーム懸濁液（第二の態様における第１のリポ
ソーム懸濁液）を調製した。このＰＣリポソームは模式
的に示すと図６（Ｂ）の状態にある。

【００３８】また、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）５
０ｍｇ及び卵ホスファチジルエタノールアミン（以下、
ＰＥ）５０ｍｇをクロロホルム５ｍｌに溶解した溶液
と、膜タンパク質としてのアラメシチン（シグマ社製）
１ｍｇをエタノール１ｍｌに溶解した溶液とを、容量５
０ｍｌのナス形フラスコに入れ混合し、上記第二の態様
におけるＰＣリポソーム懸濁液を調製した方法に従いＰ
Ｃ＋ＰＥリポソーム懸濁液（第二の態様における第２の
リポソーム懸濁液）を調製した。ただし、この場合は、
膜電位感受性色素として、ビス−（１，３−ジブチルバ
ルビツール酸）−トリメチンオキソノール（ＤｉＢａ
Ｃ₄（３））を用いている。このＰＣ＋ＰＥリポソーム
も模式的に示すと図６（Ｂ）の状態にある。

【００３９】上述のように調製した第二の態様における
第１のリポソーム懸濁液と第２のリポソーム懸濁液とを
１：１の割合で混合したものに、上記ストレプトアビジ
ン導入済みの光ファイバを、室温で２時間浸漬する（図
６（Ｃ））。光ファイバの先端に導入しておいたストレ
プトアビジンは、リポソームに結合したビオチンと強い
結合を作るため、光ファイバ１１の先端にリポソーム１
３が固定される（図６（Ｄ））。なお、光ファイバに結
合していない不要なリポソームは重炭酸バッファ（ｐＨ
８．５のもの）で光ファイバ先端を洗浄することにより
除去する。

【００４０】上述の第三発明の各実施例によれば、光フ
ァイバ先端に膜電位感受性色素を内包するリポソームを
工業的にかつ実用的な強度で固定することができる。ま
た、ビオチン−ストレプトアビジンの結合を利用する代
わりに、ビオチン−アビジンの結合を利用した場合も、
同様な固定が行えた。

【００４１】なお、この第三発明の方法により、第二発
明の実施例の化学センサ３０（図３参照）を製造する場
合は、第１のリポソーム懸濁液のみを用いて上記手順に
従い個別化学センサ１０ａ〜１０ｄをそれぞれ作製し、
第２のリポソーム懸濁液のみを用いて上記手順に従い個
別化学センサ１０ｅ〜１０ｇをそれぞれ作製すれば良い
ので、その詳細な説明を省略する。

【００４２】４．第四発明（化学センサユニット）の実
施例の説明４−１．第四発明の第１実施例第一及び第二発明の化学センサによる化学物質のセンシ
ングに好適な化学センサユニット（第四発明の）の実施
例について説明する。ここでは、化学センサとして第一
発明の実施例の化学センサ１０を用いる例を説明する。
図７は実施例の化学センサユニットの構成を示した図で
ある。

【００４３】この実施例の化学センサユニットは、第一
発明の実施例の化学センサ１０と、この化学センサ１０
に備わる光ファイバ１１の、リポソーム１３が固定され
ている端部とは反対側の端部１１ｘに接続され、リポソ
ーム１３内の膜電位感受性蛍光色素に対し励起光を供給
するための光源５１と、この反対側端部１１ｘに接続さ
れ膜電位感受性蛍光色素からの蛍光を測定するための受
光手段とを具えている。ただし、この実施例の場合は、
受光素子として光電子増倍管を用いている。また光源５
１は、干渉フィルタ６１、ハーフミラー６３及びレンズ
６５を介して光ファイバ１１の他端１１ｘに光学的に接
続してある。また、光電子増倍管５３は、モノクロメー
タ６７、レンズ６９、先のハーフミラー６３及び先のレ
ンズ６５を介して光ファイバ１１の他端１１ｘに光学的
に接続してある。

【００４４】ここで、干渉フィルタ６１は励起光の波長
を可変するため励起波長に応じ差し替えて使用する。ま
た、モノクロメータ６７は測定波長を可変するため設け
ている。これらは、第一発明の実施例の化学センサ１０
が異なる膜電位感受性色素を内包した第一のリポソーム
と第２のリポソームとを光ファイバ先端に固定したもの
であるため励起光の波長や測定光の波長をこれら色素に
応じて可変する必要があるため、設けている。しかし、
光ファイバ先端に１種類のリポソームを固定した場合
や、第二発明の化学センサ３０のように膜電位感受性色
素が１種類の場合であれば、干渉フィルタ６１は１種類
のものを固定的に用いれば良く、またモノクロメータ６
７は不要とできる（詳細は第四発明の第２実施例の項参
照。）。

【００４５】この化学センサユニットでは、化学センサ
１０の先端（リポソーム固定側）をビーカ７１中の例え
ば重炭酸バッファ７３中に浸漬することでセンシング可
能状態になる。実験に当たっての重炭酸バッファ７３中
への化学物質（この場合ニオイ物質を用いる。）７５の
添加はマイクロシリンジを用い行った。

【００４６】この化学センサユニットでは、光源５１か
ら干渉フィルタ６１、ハーフミラー６３及びレンズ６５
を通して励起光を光ファイバに１１に導ける。この励起
光は光ファイバ１１を通ってリポソーム１３に照射され
る。一方、リポソーム１３に化学物質が吸着して生じる
膜電位変化に応じ膜電位感受性色素から発せられる蛍光
は、光ファイバ１１を通りさらにレンズ６５、ハーフミ
ラー６３、レンズ６９及びモノクロメータ６７を通って
光電子増倍管５３に至りここで受光される。実験で使用
している一方の膜電位感受性蛍光色素ＤｉＢａＣ
₄（５）の励起波長は５９１ｎｍであり、蛍光の極大波
長は６１６ｎｍである。また、実験で使用している他方
の膜電位感受性蛍光色素ＤｉＢａＣ₄（３）の励起波長
は４９４ｎｍであり、蛍光の極大波長は５２０ｎｍであ
る。したがって、干渉フィルタ６１及びモノクロメータ
６７を膜電位感受性蛍光色素ＤｉＢａＣ₄（５）に対応
するよう設定すると、第１のリポソーム１３ａでの蛍光
強度変化が観測できる。また、干渉フィルタ６１及びモ
ノクロメータ６７を膜電位感受性蛍光色素ＤｉＢａＣ₄
（３）に対応するよう設定すると、第２のリポソーム１
３ｂでの蛍光強度変化が観測できる。

【００４７】４−２．第四発明の第２実施例図３を用いて既に説明したように、第二発明の化学セン
サ３０では個別の化学センサ１０ａ〜１０ｇ各々はそれ
らで用いる膜電位感受性色素を同種類のものとできた。
このため、個別化学センサ１０ａ〜１０ｇそれぞれを励
起する波長や測定波長は共通化できる。その場合の化学
センサユニットの例を、第四発明の第２実施例として以
下説明する。図８は第２実施例の化学センサユニットの
説明図である。

【００４８】この２実施例の化学センサユニットでは、
第１実施例で用いていたモノクロメータは用いない。ま
た、受光手段として発光ダイオードアレイ８１を用い
る。ダイオードアレイ８１は、レンズ６９、フィルタ８
３、ハーフミラー６３、レンズ６５を介して第二発明の
化学センサの他端３０ａに光学的に接続してある。それ
以外の構成は第１実施例と基本的に同じとしている。

【００４９】ここで、第二発明の実施例の化学センサ３
０で用いていた感受性蛍光色素ＤｉＢａＣ₄（５）の励
起波長は５９１ｎｍであり、蛍光の極大波長は６１６ｎ
ｍであるので、干渉フィルタ６１は波長５９１ｎｍの光
を透過できるものとしている。また、フィルタ８３は波
長６００ｎｍ以下の光をカットできるものとしている。
フォトダイオドアレイ８１にリポソームでの蛍光のみを
供給できるようにするためである。また、フォトダイオ
ードアレイ８１は、アレイ中の個別のフォトダイオード
を、化学センサ３０の個別の化学センサの配列に対応す
るように配列したものとしてある。

【００５０】この第２実施例の化学センサユニットも、
基本的には第１実施例の化学センサユニット同様な原理
で化学物質のセンシングを行える。ただし、個別化学セ
ンサの励起光の波長を共通とし及び測定光の波長の共通
とした状態でセンシングを行える。

【００５１】５．化学物質のセンシング結果の説明以下の４通りの化学センサを図７若しくは図８を用いて
説明した化学センサユニットに順次に組み込んで各化学
センサユニットの何種類かのニオイ物質に対する特性を
以下に説明するように測定する。

【００５２】：第一発明の実施例の化学センサ１０で
あって、リポソームを光ファイバに、アミノ基−グルタ
ルアルデヒド−タンパク質の結合を利用して固定したも
の。

【００５３】：第一発明の実施例の化学センサ１０で
あって、リポソームを光ファイバに、ビオチン−ストレ
プトアビジンの結合を利用して固定したもの。

【００５４】：第二発明の実施例の化学センサ３０で
あって、個別化学センサ１０ａ〜１０ｇの作製におい
て、リポソームを光ファイバに、アミノ基−グルタルア
ルデヒド−タンパク質の結合を利用して固定したもの。

【００５５】：第二発明の実施例の化学センサ３０で
あって、個別化学センサ１０ａ〜１０ｇの作製におい
て、リポソームを光ファイバに、ビオチン−ストレプト
アビジンの結合を利用して固定したもの。

【００５６】上記及びの各センサについては、ニオ
イ物質であるノナノール、β−ヨノン、酢酸−ｎ−アミ
ル及びｄｌ−ムスコンそれぞれに対する応答を調べる。
また、上記及びの各センサについては、ニオイ物質
であるノナノール、メントンｄｌ−ムスコン及びシトラ
ールそれぞれに対する応答を調べる。なお、ここで応答
とは、ニオイ物質を図７のユニットのビーカ７１中に添
加する前の化学センサでの蛍光強度Ｆ₀と添加した後の
化学センサでの蛍光強度Ｆとをそれぞれ測定し、これら
を下記の（１）式に代入して求まる蛍光強度変化ΔＦに
より示している。

【００５７】 ΔＦ＝（Ｆ−Ｆ₀）×１００／Ｆ₀ ・・・（１）図９（Ａ）〜（Ｄ）に、上記の化学センサの各ニオイ
物質に対する応答特性を示した。図１０（Ａ）〜（Ｄ）
に、上記の化学センサの各ニオイ物質に対する応答特
性を示した。図１１（Ａ）〜（Ｄ）に、上記の化学セ
ンサの各ニオイ物質に対する応答特性を示した。図１２
（Ａ）〜（Ｄ）は、上記の化学センサの各ニオイ物質
に対する応答特性を示した。図９〜図１２の各（Ａ）〜
（Ｄ）図において、Ａはリポソームの脂質をＰＣで構成
した場合の応答であり、Ｂはリポソームの脂質をＰＣと
ＰＥとの混合脂質で構成した場合の応答である。図９〜
図１２から、同じニオイ物質をセンシングする場合で
も、リポソームの脂質組成が異なると異なる応答特性を
示すことが分かる。

【００５８】上述においては、この出願の各発明の実施
例について説明したがこれら発明は上述の実施例に限ら
れない。

【００５９】たとえば、リポソームを構成するための脂
質として、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリ
ン、コレステロールなどを用いることもできる。これら
を用いることにより脂質組成が異なる即ち化学物質に対
する応答特性が異なるさらに多種類のリポソームが構成
できるので、化学物質のさらに高度な認識も可能であ
る。また、リポソームに埋め込む膜タンパク質としてア
ラメシチンを用いたが他のタンパク質でも可能である。
タンパク質の種類を変えることによってもリポソームの
膜の性質が変化するので、化学物質に対する認識能を変
化させることができる。

【００６０】

【発明の効果】上述した説明から明らかなように、第一
発明の化学センサによれば、光導波手段及びリポソーム
は一体となっているので、センシング終了後は、この化
学センサをたとえば純水などの好適な洗浄液中に移動で
き、そして、この洗浄液によって化学センサ（特にリポ
ソーム）を清浄することで先回のセンシング時の化学物
質を洗い落とせる。したがって、リポソーム懸濁液を測
定毎に新たに用意する必要がなくなるので、取扱が従来
より簡易な化学センサが提供できる。

【００６１】また、第二発明の化学センサによれば、個
別化学センサのリポソームに内包してある膜電位感受性
色素が同じ種類のものであっても、これら個別化学セン
サそれぞれでは異なる蛍光強度変化が生じる。従って、
膜電位感受性色素を励起するための励起波長を統一化し
たとしても、同時に多重の情報が得られる。一方、膜電
位感受性色素を統一すると個別化学センサから出力され
る励起光の波長も同じとなってしまうが、個別化学セン
サの光導波手段それぞれには例えばフォトダイオード等
の好適な受光素子を個別に接続できるから、個別化学セ
ンサから出力される各励起光は容易に分離して測定でき
る。このため、測定波長の統一化も図れる。このため、
膜電位感受性色素の使用種類数の低減及び励起波長や測
定波長それぞれの単一波長化が図れる化学センサを提供
できる。

【００６２】また、第三発明の化学センサの各製造方法
では、光導波手段に所定のリポソームを、所望通りかつ
実用的な強度で固定できる。

【００６３】また、第四発明の化学センサユニットで
は、第一発明及び第二発明の化学センサによるセンシン
グを簡易に行える。

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）及び（Ｂ）は、第一発明の化学センサの
実施例の説明図である。

【図２】（Ａ）及び（Ｂ）は、リポソームの説明図であ
る。

【図３】（Ａ）及び（Ｂ）は、第二発明の化学センサの
実施例の説明図である。

【図４】（Ａ）〜（Ｅ）は、第三発明の第一の態様によ
る製造工程図である。

【図５】（Ａ）〜（Ｄ）は、第三発明の第二の態様によ
る製造工程図である。

【図６】（Ａ）〜（Ｄ）は、第三発明の第二の態様によ
る図５に続く製造工程図である。

【図７】第四発明の第１実施例の説明に供する図であ
る。

【図８】第四発明の第２実施例の説明に供する図であ
る。

【図９】センサの特性説明図である。

【図１０】センサの図９に続く特性説明図である。

【図１１】センサの図１０に続く特性説明図である。

【図１２】センサの図１１に続く特性説明図である。

【符号の説明】

１０：第一発明の実施例の化学センサ１１：光導波手段（光ファイバ）１３：膜電位感受性色素を内包するリポソーム１３ａ：第１のリポソーム１３ｂ：第２のリポソーム３０：第二発明の実施例の化学センサ１０ａ〜１０ｇ：個別化学センサ１３ｙ，１３ｚ：脂質組成が異なるリポソーム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者加藤雅一東京都港区虎ノ門１丁目７番12号沖電気工業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光導波手段と、該光導波手段の端部に固定され膜電位感受性色素を内包
しているリポソームとを具えたことを特徴とする化学セ
ンサ。
【請求項２】請求項１に記載の化学センサを複数具え
たことを特徴とする化学センサ（ただし、前記複数の化
学センサにおいては、個々の化学センサ（個別化学セン
サ）毎でリポソームの脂質組成を異ならせてあるか、あ
るいは、いくつかの個別化学センサ群毎でリポソームの
脂質組成を異ならせてある。）。
【請求項３】請求項１又は２に記載の化学センサにお
いて、前記光導波手段を光ファイバとしたことを特徴とする化
学センサ。
【請求項４】請求項１に記載の化学センサを製造する
に当たり、前記光導波手段のリポソーム固定予定の端部にアミノ基
を導入する工程と、前記リポソームとして脂質二重膜にタンパク質が埋め込
まれたリポソームを形成する工程と、該タンパク質が埋め込まれたリポソームを、前記アミノ
基導入済みの光導波手段の端部に、タンパク質−グルタ
ルアルデヒド−アミノ基の結合を利用して、固定する工
程とを含むことを特徴とする化学センサの製造方法。
【請求項５】請求項１に記載の化学センサを製造する
に当たり、前記光導波手段のリポソーム固定予定の端部にアミノ基
を導入する工程と、該導入されたアミノ基にビオチンを導入する工程と、前記リポソームとして脂質二重膜にタンパク質が埋め込
まれたリポソームを形成する工程と、該埋め込まれたタンパク質にビオチンを導入する工程
と、前記ビオチン導入済みのリポソームを、前記ビオチン導
入済みの光導波手段の端部に、ビオチン−アビジンの結
合又はビオチン−ストレプトアビジンの結合を利用して
固定する工程とを含むことを特徴とする化学センサの製
造方法。
【請求項６】請求項１〜３のいずれか１項に記載の化
学センサと、該化学センサに備わる光導波手段の、リポソームが固定
されている端部とは反対側の端部に接続され、該リポソ
ーム内の膜電位感受性蛍光色素に対し励起光を供給する
ための光源と、前記光導波手段の前記反対側端部に接続され前記膜電位
感受性蛍光色素からの蛍光を測定するための受光手段と
を具えたことを特徴とする化学センサユニット。