JPH0739398A - 隣接する２種の核酸プローブを用いたｒｎａの検出方法 - Google Patents
隣接する２種の核酸プローブを用いたｒｎａの検出方法Info
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- JPH0739398A JPH0739398A JP6061467A JP6146794A JPH0739398A JP H0739398 A JPH0739398 A JP H0739398A JP 6061467 A JP6061467 A JP 6061467A JP 6146794 A JP6146794 A JP 6146794A JP H0739398 A JPH0739398 A JP H0739398A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ２種の核酸プローブを用いたＲＮＡの検出方
法において、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１
０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａと、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する
１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲ
ＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定
し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検
ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定され
た捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブ
と標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結
合した標識プローブの標識物質を検出することにより被
検ＲＮＡの存在を検出することを特徴とするＲＮＡの検
出方法。 【効果】 ＲＮＡを迅速・簡便に検出することができ
る。これを利用して、生物種の同定・検出を従来法と比
較して迅速・簡便に行うことができる。異種の細菌が混
在していても薬剤感受性を迅速・簡便に調べることがで
きる。
法において、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１
０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａと、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する
１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲ
ＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定
し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被検
ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定され
た捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プローブ
と標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに結
合した標識プローブの標識物質を検出することにより被
検ＲＮＡの存在を検出することを特徴とするＲＮＡの検
出方法。 【効果】 ＲＮＡを迅速・簡便に検出することができ
る。これを利用して、生物種の同定・検出を従来法と比
較して迅速・簡便に行うことができる。異種の細菌が混
在していても薬剤感受性を迅速・簡便に調べることがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＲＮＡの検出方法及びそ
れに用いる検出用キットに関する。さらに詳しくは、リ
ボゾームＲＮＡの検出方法であり、それを利用した生物
種、例えば、細菌の同定・検出方法、薬剤感受性試験方
法及びそれに用いる同定・検出法キットに関する。本発
明はまた、メッセンジャーＲＮＡの検出方法に関し、そ
れを利用した遺伝子発現の検出法キットに関する。
れに用いる検出用キットに関する。さらに詳しくは、リ
ボゾームＲＮＡの検出方法であり、それを利用した生物
種、例えば、細菌の同定・検出方法、薬剤感受性試験方
法及びそれに用いる同定・検出法キットに関する。本発
明はまた、メッセンジャーＲＮＡの検出方法に関し、そ
れを利用した遺伝子発現の検出法キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を検出・同定
する技術は、基礎研究の分野にとどまらず、既に多様な
産業分野で使用されている技術である。この中で、ＲＮ
Ａの検出方法は、生物体における遺伝子発現の仕組みの
解明とその応用、あるいは主にリボゾームＲＮＡ（ｒＲ
ＮＡ）を対象とした進化論的研究や生物種の同定試験等
で極めて重要な技術である。しかし、一般にＲＮＡは極
めて不安定な物質であり、その取扱いには細心の注意を
必要とすることから、ＤＮＡの検出試験と比べると産業
分野への普及は遅れている。それでも、ＲＮＡのうちｒ
ＲＮＡは比較的安定であり、様々な分野でこれを対象と
した試験が次第に普及してきている。例えば、本発明者
らはｒＲＮＡを標的として細菌を検出する方法を検討
し、アクチノバチルス・プレロニューモニエ（特開平5-
219955) 、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（特開
平3-61487)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（特開平4-
179480）、パスツレラ・マルトシダ（特開平5-219954）
などの検出法を開発してきた。他にも、ｒＲＮＡを対象
としたハイブリダイゼーション法により生物の検出・同
定を行う方法が近年数多く報告されている。
する技術は、基礎研究の分野にとどまらず、既に多様な
産業分野で使用されている技術である。この中で、ＲＮ
Ａの検出方法は、生物体における遺伝子発現の仕組みの
解明とその応用、あるいは主にリボゾームＲＮＡ（ｒＲ
ＮＡ）を対象とした進化論的研究や生物種の同定試験等
で極めて重要な技術である。しかし、一般にＲＮＡは極
めて不安定な物質であり、その取扱いには細心の注意を
必要とすることから、ＤＮＡの検出試験と比べると産業
分野への普及は遅れている。それでも、ＲＮＡのうちｒ
ＲＮＡは比較的安定であり、様々な分野でこれを対象と
した試験が次第に普及してきている。例えば、本発明者
らはｒＲＮＡを標的として細菌を検出する方法を検討
し、アクチノバチルス・プレロニューモニエ（特開平5-
219955) 、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（特開
平3-61487)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（特開平4-
179480）、パスツレラ・マルトシダ（特開平5-219954）
などの検出法を開発してきた。他にも、ｒＲＮＡを対象
としたハイブリダイゼーション法により生物の検出・同
定を行う方法が近年数多く報告されている。
【０００３】しかるに、本発明者らの方法を含め、上記
報告に記載された試験法のほとんどは、ＲＮＡを安定に
検出するためにナイロンメンブランなどのフィルターを
用いたシステムを用いており、非熟練者が日常の試験で
用いるには煩雑すぎるきらいがある。その他、サンドイ
ッチハイブリダイゼーション法と呼ばれる方法を用いて
いるケースもある。これは、対象核酸の２ヶ所の配列を
選択し、その逆相補鎖核酸を用い、例えば対象核酸を捕
捉するために、一方をマイクロタイタープレート中に固
定し、一方を標識してハイブリダイゼーションさせ、プ
レートに捕捉された標識化合物を検出する方法である
が、系の中にＲＮＡ分解活性があると検出値は非常に不
安定なものとなってしまうという欠点がある。また、ｒ
ＲＮＡの検出の応用として、薬剤感受性試験は極めて重
要なものである。通常この試験を行うためには、分離し
たコロニーから菌を同定した後に、ディスク法などで最
小阻止濃度（ＭＩＣ）を求める必要があり、熟練と日数
を必要としているのが現状である。さらに、メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はｒＲＮＡよりもいっそう不安
定であり、その分析はより困難である。これを検出する
ためには、従来よりノーザンハイブリダイゼーション法
やドットブロットハイブリダイゼーション法などが用い
られているが、最近では逆転写酵素とＰＣＲ法（ポリメ
ラーゼ・チェーン・リアクション法）を組み合わせたリ
バースＰＣＲ法と呼ばれる方法などが開発され、主に基
礎科学の分野で用いられている。これらの技術は、近年
技術的な進歩により簡便化が進んでいるとはいえ、未だ
に操作者の熟練を必要としている。
報告に記載された試験法のほとんどは、ＲＮＡを安定に
検出するためにナイロンメンブランなどのフィルターを
用いたシステムを用いており、非熟練者が日常の試験で
用いるには煩雑すぎるきらいがある。その他、サンドイ
ッチハイブリダイゼーション法と呼ばれる方法を用いて
いるケースもある。これは、対象核酸の２ヶ所の配列を
選択し、その逆相補鎖核酸を用い、例えば対象核酸を捕
捉するために、一方をマイクロタイタープレート中に固
定し、一方を標識してハイブリダイゼーションさせ、プ
レートに捕捉された標識化合物を検出する方法である
が、系の中にＲＮＡ分解活性があると検出値は非常に不
安定なものとなってしまうという欠点がある。また、ｒ
ＲＮＡの検出の応用として、薬剤感受性試験は極めて重
要なものである。通常この試験を行うためには、分離し
たコロニーから菌を同定した後に、ディスク法などで最
小阻止濃度（ＭＩＣ）を求める必要があり、熟練と日数
を必要としているのが現状である。さらに、メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はｒＲＮＡよりもいっそう不安
定であり、その分析はより困難である。これを検出する
ためには、従来よりノーザンハイブリダイゼーション法
やドットブロットハイブリダイゼーション法などが用い
られているが、最近では逆転写酵素とＰＣＲ法（ポリメ
ラーゼ・チェーン・リアクション法）を組み合わせたリ
バースＰＣＲ法と呼ばれる方法などが開発され、主に基
礎科学の分野で用いられている。これらの技術は、近年
技術的な進歩により簡便化が進んでいるとはいえ、未だ
に操作者の熟練を必要としている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＲＮ
Ａの簡便・迅速な検出法を提供することである。本発明
の他の目的は、上記方法を利用して生物種、例えば細菌
の同定・検出方法、細菌の薬剤感受性試験方法、さらに
メッセンジャーＲＮＡの同定・検出方法を提供すること
である。本発明のさらに他の目的は、上記方法に使用す
る検出用キットを提供することである。
Ａの簡便・迅速な検出法を提供することである。本発明
の他の目的は、上記方法を利用して生物種、例えば細菌
の同定・検出方法、細菌の薬剤感受性試験方法、さらに
メッセンジャーＲＮＡの同定・検出方法を提供すること
である。本発明のさらに他の目的は、上記方法に使用す
る検出用キットを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、２種の核酸プ
ローブを用いたＲＮＡの検出方法において、被検ＲＮＡ
の塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列
（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で
部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配
列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を
捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標
識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標
識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触さ
せて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブ
リダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標
識物質を検出することにより被検ＲＮＡの存在を検出す
ることを特徴とする方法を提供するものである。上記Ｒ
ＮＡの具体例としては、細菌ＲＮＡが挙げられ、さらに
細菌リボゾームＲＮＡが挙げられる。
ローブを用いたＲＮＡの検出方法において、被検ＲＮＡ
の塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列
（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で
部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配
列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を
捕捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標
識して標識プローブとし、被検ＲＮＡを含む試料及び標
識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触さ
せて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブ
リダイズさせ、被検ＲＮＡに結合した標識プローブの標
識物質を検出することにより被検ＲＮＡの存在を検出す
ることを特徴とする方法を提供するものである。上記Ｒ
ＮＡの具体例としては、細菌ＲＮＡが挙げられ、さらに
細菌リボゾームＲＮＡが挙げられる。
【０００６】本発明はさらに、２種の核酸プローブを用
いた生物種の検出方法において、該生物種のリボゾーム
ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分
配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、該リボゾー
ムＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基
以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用
意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を
標識物質で標識して標識プローブとし、該生物種を含む
試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プロー
ブと接触させて該リボゾームＲＮＡに捕捉プローブと標
識プローブをハイブリダイズさせ、該リボゾームＲＮＡ
に結合した標識プローブの標識物質を検出することによ
り該生物種の存在を検出することを特徴とする方法を提
供するものである。上記生物種としては、例えば細菌が
挙げられ、それらの細菌として大腸菌、スタフィロコッ
カス属細菌、パスツレラ・マルトシダ、ボルデテラ・ブ
ロンキセプチカ、アクチノバチルス・プレロニューモニ
エ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、サルモネラ
及び緑膿菌などが挙げられる。
いた生物種の検出方法において、該生物種のリボゾーム
ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分
配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、該リボゾー
ムＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基
以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用
意し、一方を捕捉プローブとして担体に固定し、他方を
標識物質で標識して標識プローブとし、該生物種を含む
試料及び標識プローブを該担体に固定された捕捉プロー
ブと接触させて該リボゾームＲＮＡに捕捉プローブと標
識プローブをハイブリダイズさせ、該リボゾームＲＮＡ
に結合した標識プローブの標識物質を検出することによ
り該生物種の存在を検出することを特徴とする方法を提
供するものである。上記生物種としては、例えば細菌が
挙げられ、それらの細菌として大腸菌、スタフィロコッ
カス属細菌、パスツレラ・マルトシダ、ボルデテラ・ブ
ロンキセプチカ、アクチノバチルス・プレロニューモニ
エ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、サルモネラ
及び緑膿菌などが挙げられる。
【０００７】本発明はさらに、２種の核酸プローブを用
いたｍＲＮＡの検出方法において、被検ｍＲＮＡの塩基
配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の
逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ｍＲＮＡ上で部分配
列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列
（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕
捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識
して標識プローブとし、被検ｍＲＮＡを含む試料及び標
識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触さ
せて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブ
リダイズさせ、被検ｍＲＮＡに結合した標識プローブの
標識物質を検出することにより被検ｍＲＮＡの存在を検
出することを特徴とする方法を提供するものである。
いたｍＲＮＡの検出方法において、被検ｍＲＮＡの塩基
配列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の
逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、被検ｍＲＮＡ上で部分配
列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列
（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕
捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識
して標識プローブとし、被検ｍＲＮＡを含む試料及び標
識プローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触さ
せて被検ＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハイブ
リダイズさせ、被検ｍＲＮＡに結合した標識プローブの
標識物質を検出することにより被検ｍＲＮＡの存在を検
出することを特徴とする方法を提供するものである。
【０００８】本発明はまた、下記の成分を含む上記ＲＮ
Ａの検出方法に使用するためのＲＮＡ検出用キットを提
供するものである。 (イ) 被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを固定
化した担体； (ロ) 被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 本発明はまた下記の成分を含む上記ＲＮＡの検出方法に
使用するためのＲＮＡ検出用キットを提供するものであ
る。 (イ) 被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであっ
て、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ロ) 被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。
Ａの検出方法に使用するためのＲＮＡ検出用キットを提
供するものである。 (イ) 被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを固定
化した担体； (ロ) 被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 本発明はまた下記の成分を含む上記ＲＮＡの検出方法に
使用するためのＲＮＡ検出用キットを提供するものであ
る。 (イ) 被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであっ
て、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ロ) 被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。
【０００９】本発明はさらにまた下記の成分を含む上記
生物種の検出方法に使用するための生物種の同定・検出
用キットを提供するものである。 (イ) 該生物種のリボゾームＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡを固定化した担体； (ロ) 該リボゾームＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存
在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又は
ＲＮＡ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 本発明はさらにまた下記の成分を含む上記生物種の検出
方法に使用するための生物種の同定・検出用キットを提
供するものである。 (イ) 該生物種のリボゾームＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又は
ＲＮＡ； (ロ) 該リボゾームＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存
在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 これらの生物種の同定・検出用キットは、さらに溶菌液
を含んでもよい。
生物種の検出方法に使用するための生物種の同定・検出
用キットを提供するものである。 (イ) 該生物種のリボゾームＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡを固定化した担体； (ロ) 該リボゾームＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存
在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又は
ＲＮＡ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 本発明はさらにまた下記の成分を含む上記生物種の検出
方法に使用するための生物種の同定・検出用キットを提
供するものである。 (イ) 該生物種のリボゾームＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又は
ＲＮＡ； (ロ) 該リボゾームＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存
在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 これらの生物種の同定・検出用キットは、さらに溶菌液
を含んでもよい。
【００１０】本発明はさらに、下記の成分を含む上記ｍ
ＲＮＡの検出方法に使用するためのｍＲＮＡの同定・検
出用キットを提供する。 (イ) 被検ｍＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基
以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを固
定化した担体； (ロ) 被検ｍＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する
１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲ
ＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮ
Ａ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 本発明はまた、下記の成分を含む上記ｍＲＮＡの検出方
法に使用するためのｍＲＮＡの同定・検出用キットを提
供する。 (イ) 被検ｍＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基
以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであ
って、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ロ) 被検ｍＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する
１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲ
ＮＡを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。
ＲＮＡの検出方法に使用するためのｍＲＮＡの同定・検
出用キットを提供する。 (イ) 被検ｍＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基
以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを固
定化した担体； (ロ) 被検ｍＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する
１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲ
ＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮ
Ａ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 本発明はまた、下記の成分を含む上記ｍＲＮＡの検出方
法に使用するためのｍＲＮＡの同定・検出用キットを提
供する。 (イ) 被検ｍＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基
以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであ
って、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ロ) 被検ｍＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する
１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲ
ＮＡを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。
【００１１】以下本発明を詳細に説明する。一般に細胞
のＲＮＡは非常に分解されやすい物質であり、その取扱
いには細心の注意を必要とする。ＲＮＡのうち、ｒＲＮ
Ａは蛋白質合成の必須成分であり、その構造は生物の進
化の過程において比較的よく保存されている。ｒＲＮＡ
は多くの生物種でその塩基配列が同定されており、生物
間での共通領域以外に、種によって構造が異なる可変領
域の存在が知られている。この可変領域に対応するＤＮ
Ａプローブを用いてハイブリダイゼーション法により微
生物の検出・同定を行なう方法が近年開発されてきた。
しかしながら、一口にｒＲＮＡのハイブリダイゼーショ
ン法による検出といっても、その手段は様々であり、よ
り高感度の検出を行なうには、それに応じた技術レベル
が必要であり、またコストもアップする。例えば、本発
明者が先に出願している特許に於いては、検出システム
に32Ｐを用いたフィルターハイブリダイゼーション法を
用いているが、特別な設備と煩雑な手順を必要とし、必
ずしも実用的ではない。さらにｍＲＮＡはｒＲＮＡに比
べいっそう分解されやすい。その検出・同定は通常フィ
ルターハイブリダイゼーション法で行われているが、こ
れを扱うための試薬・器具類から徹底的にＲＮＡ分解活
性を除去する必要があるなど高度の熟練が必要であり、
そのためのコストも相当高いものになっている。
のＲＮＡは非常に分解されやすい物質であり、その取扱
いには細心の注意を必要とする。ＲＮＡのうち、ｒＲＮ
Ａは蛋白質合成の必須成分であり、その構造は生物の進
化の過程において比較的よく保存されている。ｒＲＮＡ
は多くの生物種でその塩基配列が同定されており、生物
間での共通領域以外に、種によって構造が異なる可変領
域の存在が知られている。この可変領域に対応するＤＮ
Ａプローブを用いてハイブリダイゼーション法により微
生物の検出・同定を行なう方法が近年開発されてきた。
しかしながら、一口にｒＲＮＡのハイブリダイゼーショ
ン法による検出といっても、その手段は様々であり、よ
り高感度の検出を行なうには、それに応じた技術レベル
が必要であり、またコストもアップする。例えば、本発
明者が先に出願している特許に於いては、検出システム
に32Ｐを用いたフィルターハイブリダイゼーション法を
用いているが、特別な設備と煩雑な手順を必要とし、必
ずしも実用的ではない。さらにｍＲＮＡはｒＲＮＡに比
べいっそう分解されやすい。その検出・同定は通常フィ
ルターハイブリダイゼーション法で行われているが、こ
れを扱うための試薬・器具類から徹底的にＲＮＡ分解活
性を除去する必要があるなど高度の熟練が必要であり、
そのためのコストも相当高いものになっている。
【００１２】ＲＮＡの検出・同定試験を汎用的なものに
するためには、上記のような熟練技術を必要としないシ
ステムを開発することが必要である。そのためには、例
えば以下のような条件が考えられる。 (1) 放射性物質を用いない。 (2) 操作は日常的に使用している試薬、器具あるいは装
置を用いて行える。 (3) 熟練技術を必要とせず、短時間で検出ができる。 これらの条件を満たすために本発明者らは様々な技法を
検討した。その結果、以下に詳細に説明する隣接プロー
ブ法を見出し、ＲＮＡの検出への応用に成功し、本発明
を完成するに至った。
するためには、上記のような熟練技術を必要としないシ
ステムを開発することが必要である。そのためには、例
えば以下のような条件が考えられる。 (1) 放射性物質を用いない。 (2) 操作は日常的に使用している試薬、器具あるいは装
置を用いて行える。 (3) 熟練技術を必要とせず、短時間で検出ができる。 これらの条件を満たすために本発明者らは様々な技法を
検討した。その結果、以下に詳細に説明する隣接プロー
ブ法を見出し、ＲＮＡの検出への応用に成功し、本発明
を完成するに至った。
【００１３】具体的には、迅速・簡便なＲＮＡの検出法
を開発するため、本発明者らは固相法を用いたハイブリ
ダイゼーション法に関して、下記の２つの方法について
検討した。 (1) 被検ＲＮＡを直接担体に固定し、標識プローブとの
ハイブリダイゼーションを行なう。 (2) ２種の核酸プローブを用意し、一方をあらかじめ担
体に固定する。これにもう一方の核酸プローブと被検Ｒ
ＮＡを混合しハイブリダイゼーションを行なう（サンド
イッチ法）。 (1) の方法では、精製したＲＮＡを用いる場合には比較
的再現性よく検出されるが、生物体の破壊処理によって
得られたＲＮＡ検体は当然のことながら不純物を多く含
んでおり、ＲＮＡの固定効率が低下する、あるいは同時
に固定された不純物がハイブリダイゼーションを阻害す
るなどの問題が生じ、検出値が大幅に低下する。更に、
バックグラウンドも高くなる傾向にある。(2) の方法で
は、被検ＲＮＡがブリッジの役目を果たす形でのハイブ
リダイゼーション反応であり、(1) の方法に比較して不
純物の影響を受けにくいが、ＲＮＡ分解酵素（以下「Ｒ
Ｎａｓｅ」という）や物理的切断などの影響を受けやす
くなる。即ち、２つのプローブで挟まれる部分が１ヶ所
でも切断されるとＲＮＡ分子は検出されなくなる。
を開発するため、本発明者らは固相法を用いたハイブリ
ダイゼーション法に関して、下記の２つの方法について
検討した。 (1) 被検ＲＮＡを直接担体に固定し、標識プローブとの
ハイブリダイゼーションを行なう。 (2) ２種の核酸プローブを用意し、一方をあらかじめ担
体に固定する。これにもう一方の核酸プローブと被検Ｒ
ＮＡを混合しハイブリダイゼーションを行なう（サンド
イッチ法）。 (1) の方法では、精製したＲＮＡを用いる場合には比較
的再現性よく検出されるが、生物体の破壊処理によって
得られたＲＮＡ検体は当然のことながら不純物を多く含
んでおり、ＲＮＡの固定効率が低下する、あるいは同時
に固定された不純物がハイブリダイゼーションを阻害す
るなどの問題が生じ、検出値が大幅に低下する。更に、
バックグラウンドも高くなる傾向にある。(2) の方法で
は、被検ＲＮＡがブリッジの役目を果たす形でのハイブ
リダイゼーション反応であり、(1) の方法に比較して不
純物の影響を受けにくいが、ＲＮＡ分解酵素（以下「Ｒ
Ｎａｓｅ」という）や物理的切断などの影響を受けやす
くなる。即ち、２つのプローブで挟まれる部分が１ヶ所
でも切断されるとＲＮＡ分子は検出されなくなる。
【００１４】これらの問題を解決するため、本発明者ら
はＲＮａｓｅの影響をできるだけ除外するように設計さ
れた２種の核酸プローブを用いたＲＮＡの検出方法（以
下、「隣接プローブ法」という）を検討し、実用化に耐
えるシステムの開発に成功した。本発明は、ＲＮＡ分子
の切断の影響を極力防ぐために、被検ＲＮＡ上で非常に
近い部位でハイブリダイズする２種の核酸プローブを用
いることを特徴とするものである。本発明に使用する第
１の核酸プローブは、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡである。この第１の核酸プローブは１０塩基
以上、好ましくは１５〜５０塩基のものが適当である。
本発明に使用する第２の核酸プローブは、被検ＲＮＡ上
で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上、好ま
しくは１５〜５０塩基の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮ
Ａ又はＲＮＡである。
はＲＮａｓｅの影響をできるだけ除外するように設計さ
れた２種の核酸プローブを用いたＲＮＡの検出方法（以
下、「隣接プローブ法」という）を検討し、実用化に耐
えるシステムの開発に成功した。本発明は、ＲＮＡ分子
の切断の影響を極力防ぐために、被検ＲＮＡ上で非常に
近い部位でハイブリダイズする２種の核酸プローブを用
いることを特徴とするものである。本発明に使用する第
１の核酸プローブは、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡである。この第１の核酸プローブは１０塩基
以上、好ましくは１５〜５０塩基のものが適当である。
本発明に使用する第２の核酸プローブは、被検ＲＮＡ上
で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上、好ま
しくは１５〜５０塩基の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮ
Ａ又はＲＮＡである。
【００１５】部分配列（Ｂ）は部分配列（Ａ）の近傍に
存在することが必要であって、部分配列（Ａ）の５’
側、３’側のどちらに存在してもよい。配列（Ｂ）の
３’末端と配列（Ａ）の５’末端が、あるいは配列
（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接
していることが好ましい。配列（Ｂ）の３’末端配列と
配列（Ａ）の５’末端配列、あるいは配列（Ｂ）の５’
末端配列と配列（Ａ）の３’末端配列が重複してもよい
が、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブ
リダイズする際に、その重複部分で被検ＲＮＡに対して
競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そ
のような重複部分はできるだけ短い方がよく、５塩基未
満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣
接していることがより好ましい。一方、配列（Ａ）と配
列（Ｂ）は重複も隣接もせず、すなわち離れていてもよ
いが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズ
した結果、被検ＲＮＡ上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間
に１本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくな
り、感度が低下する確率が高まる。従って、配列（Ａ）
と配列（Ｂ）が離れて存在する場合、配列（Ｂ）の３’
末端と配列（Ａ）の５’末端、あるいは配列（Ｂ）の
５’末端と配列（Ａ）の３’末端の距離は、できるだけ
短い方がよく、５塩基以内が好ましく、離れていないこ
と、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。
存在することが必要であって、部分配列（Ａ）の５’
側、３’側のどちらに存在してもよい。配列（Ｂ）の
３’末端と配列（Ａ）の５’末端が、あるいは配列
（Ｂ）の５’末端と配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接
していることが好ましい。配列（Ｂ）の３’末端配列と
配列（Ａ）の５’末端配列、あるいは配列（Ｂ）の５’
末端配列と配列（Ａ）の３’末端配列が重複してもよい
が、その場合、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブ
リダイズする際に、その重複部分で被検ＲＮＡに対して
競合が起こり感度が低下する確率が高まる。従って、そ
のような重複部分はできるだけ短い方がよく、５塩基未
満が好ましく、全く重複がないこと、すなわち完全に隣
接していることがより好ましい。一方、配列（Ａ）と配
列（Ｂ）は重複も隣接もせず、すなわち離れていてもよ
いが、それらの逆相補鎖核酸プローブがハイブリダイズ
した結果、被検ＲＮＡ上の配列（Ａ）と配列（Ｂ）の間
に１本鎖部分が生じ、この部分に切断が生じやすくな
り、感度が低下する確率が高まる。従って、配列（Ａ）
と配列（Ｂ）が離れて存在する場合、配列（Ｂ）の３’
末端と配列（Ａ）の５’末端、あるいは配列（Ｂ）の
５’末端と配列（Ａ）の３’末端の距離は、できるだけ
短い方がよく、５塩基以内が好ましく、離れていないこ
と、すなわち完全に隣接していることが最も好ましい。
【００１６】配列（Ａ）の逆相補鎖である特異配列ＤＮ
Ａ及び配列（Ａ）に隣接する配列（Ｂ）の逆相補鎖であ
る隣接配列ＤＮＡを化学的に合成し、いずれか一方を捕
捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識
して標識プローブとする。特異配列と隣接配列がいずれ
を捕捉プローブ（又は標識プローブ）としてもよい。標
識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン、
臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げら
れる。本発明の方法ではこの捕捉プローブを適当な担体
に固定する。担体としては、例えば、核酸との結合性が
高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレー
トなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法
は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のプ
レートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾
燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいは
グルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよ
い。次に被検ＲＮＡを含む試料と標識プローブを該担体
に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡと捕
捉プローブ及び標識プローブをハイブリダイズさせる。
次いで、被検ＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質
を検出することにより被検ＲＮＡを検出する。
Ａ及び配列（Ａ）に隣接する配列（Ｂ）の逆相補鎖であ
る隣接配列ＤＮＡを化学的に合成し、いずれか一方を捕
捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識
して標識プローブとする。特異配列と隣接配列がいずれ
を捕捉プローブ（又は標識プローブ）としてもよい。標
識物質としては、例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン、
臭化デオキシウリジン、フルオロエスセイン等が挙げら
れる。本発明の方法ではこの捕捉プローブを適当な担体
に固定する。担体としては、例えば、核酸との結合性が
高い有機ポリマーを素材とするマイクロタイタープレー
トなどを用いることができる。捕捉プローブの固定法
は、特に限定されるものではないが、例えば、上記のプ
レートに捕捉プローブＤＮＡ又はＲＮＡ溶液を入れ、乾
燥後、紫外線照射などにより固定する方法や、あるいは
グルタルアルデヒド法などの共有結合法を用いてもよ
い。次に被検ＲＮＡを含む試料と標識プローブを該担体
に固定された捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡと捕
捉プローブ及び標識プローブをハイブリダイズさせる。
次いで、被検ＲＮＡと結合した標識プローブの標識物質
を検出することにより被検ＲＮＡを検出する。
【００１７】被検ＲＮＡの調製法は、特定されるもので
はないが、安全かつ簡便に行なうためには、例えば水酸
化ナトリウム水溶液などで細胞を溶解した後、塩酸など
で中和すればよい。もしこの方法で溶出されにくい場合
には、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（ＭＲＳ
Ａ）などの場合にはリソスタフィン（Lysostaphin)など
の細胞壁溶解酵素で前処理を行なえばよい。上記の方法
で調製されたＲＮＡ溶液を、標識プローブとともに捕捉
プローブを固定した担体上に加え、１５〜６０℃で３分
〜１８時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切な溶
液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質に
酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識
化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例
えば標識プローブがビオチンで標識されている場合には
ビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの
混合物、また、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）で標識されて
いる場合には抗Ｄｉｇ免疫グロブリンと西洋ワサビペル
オキシダーゼの結合体を用いることができる。適切な溶
液（洗浄液２）で洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵
素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビ
ペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベン
ジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反
応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質
などを用いることもでき、この場合にはより高い検出感
度を得ることができる。洗浄液１、２は、特定されるも
のではないが、例えば0.05%程度の界面活性剤を含む生
理食塩水等を用いることができる。
はないが、安全かつ簡便に行なうためには、例えば水酸
化ナトリウム水溶液などで細胞を溶解した後、塩酸など
で中和すればよい。もしこの方法で溶出されにくい場合
には、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（ＭＲＳ
Ａ）などの場合にはリソスタフィン（Lysostaphin)など
の細胞壁溶解酵素で前処理を行なえばよい。上記の方法
で調製されたＲＮＡ溶液を、標識プローブとともに捕捉
プローブを固定した担体上に加え、１５〜６０℃で３分
〜１８時間ハイブリダイゼーションを行なう。適切な溶
液（洗浄液１）で洗浄し、標識化合物と結合する物質に
酵素を結合させたものを加え一定時間反応させる。標識
化合物と結合する物質は特定されるものではないが、例
えば標識プローブがビオチンで標識されている場合には
ビオチン結合西洋ワサビペルオキシダーゼとアビジンの
混合物、また、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）で標識されて
いる場合には抗Ｄｉｇ免疫グロブリンと西洋ワサビペル
オキシダーゼの結合体を用いることができる。適切な溶
液（洗浄液２）で洗浄後、適切な酵素基質を加える。酵
素基質は特定されるものではないが、例えば西洋ワサビ
ペルオキシダーゼを用いた場合には、テトラメチルベン
ジジンと過酸化水素を基質とすることによって青色の反
応産物を得ることができる。勿論、蛍光基質や発光基質
などを用いることもでき、この場合にはより高い検出感
度を得ることができる。洗浄液１、２は、特定されるも
のではないが、例えば0.05%程度の界面活性剤を含む生
理食塩水等を用いることができる。
【００１８】以下、実施例により本発明を更に具体的に
説明する。 実施例１ 隣接プローブ法によるアクチノバチルス・プ
レロニューモニエの検出 豚肺炎原因菌であるアクチノバチルス・プレロニューモ
ニエ（A.pleuropneumoniae）を対象として隣接プローブ
法を実施した。配列番号１及び配列番号２で表されるＤ
ＮＡを合成した。両者はアクチノバチルス・プレロニュ
ーモニエ１６Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、アクチ
ノバチルス・プレロニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡ塩基配
列上で配列番号２のＤＮＡは配列番号１のＤＮＡの５’
側に隣接してハイブリダイズする。 配列番号１ 5'-TCCAT GTCGC CATCT TGCTT CCCT 配列番号２ 5'-CTTAG ACGTA CTTTG TGAGA TTTGC 捕捉プローブには配列番号２のＤＮＡを、標識プローブ
には配列番号１のＤＮＡを用いた。各ＤＮＡはＤＮＡ合
成装置（ＰＣＲ−ＭＡＴＥ モデル３９１、ＡＢＩ社、
以下同じ）を用いて合成した。捕捉プローブを0.02μg/
μlになるように50mM リン酸ナトリウムバッファー,pH
8.0に溶解した。これをマイクロタイタープレート（住
友ベークライト製、MS-3608FA）の各ウエルに50μl加
え、80℃で乾燥させる。紫外線を120mJ/cm2 照射した
後、30mMクエン酸ナトリウム／300mM塩化ナトリウム
（２ｘＳＳＣ） 200μlで３、４回洗浄し乾燥させた。
得られた捕捉プローブ固定プレートは４℃で半年以上安
定であった。標識プローブは表１の組成の反応液でＤｉ
ｇ標識を行なった。
説明する。 実施例１ 隣接プローブ法によるアクチノバチルス・プ
レロニューモニエの検出 豚肺炎原因菌であるアクチノバチルス・プレロニューモ
ニエ（A.pleuropneumoniae）を対象として隣接プローブ
法を実施した。配列番号１及び配列番号２で表されるＤ
ＮＡを合成した。両者はアクチノバチルス・プレロニュ
ーモニエ１６Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、アクチ
ノバチルス・プレロニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡ塩基配
列上で配列番号２のＤＮＡは配列番号１のＤＮＡの５’
側に隣接してハイブリダイズする。 配列番号１ 5'-TCCAT GTCGC CATCT TGCTT CCCT 配列番号２ 5'-CTTAG ACGTA CTTTG TGAGA TTTGC 捕捉プローブには配列番号２のＤＮＡを、標識プローブ
には配列番号１のＤＮＡを用いた。各ＤＮＡはＤＮＡ合
成装置（ＰＣＲ−ＭＡＴＥ モデル３９１、ＡＢＩ社、
以下同じ）を用いて合成した。捕捉プローブを0.02μg/
μlになるように50mM リン酸ナトリウムバッファー,pH
8.0に溶解した。これをマイクロタイタープレート（住
友ベークライト製、MS-3608FA）の各ウエルに50μl加
え、80℃で乾燥させる。紫外線を120mJ/cm2 照射した
後、30mMクエン酸ナトリウム／300mM塩化ナトリウム
（２ｘＳＳＣ） 200μlで３、４回洗浄し乾燥させた。
得られた捕捉プローブ固定プレートは４℃で半年以上安
定であった。標識プローブは表１の組成の反応液でＤｉ
ｇ標識を行なった。
【００１９】
【表１】 ───────────────────────────────── カコジル酸カリウム緩衝液,pH7.2 0.1M 塩化コバルト 2mM ジチオスレイトール 0.2mM デオキシアデノシン３リン酸ナトリウム 1mM ジゴキシゲニン化デオキシウリジン３リン酸 0.2mM プローブ用DNA 1μg ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ 50-100U 反応液量 20μl ─────────────────────────────────
【００２０】標識反応後、1/10容の0.2M EDTA 、1/10容
の4M LiCl 、3 μg のグリコーゲン及び2.5 倍容のエタ
ノールを加え-80 ℃で、一晩放置した。遠心分離により
沈殿を集め、70% エタノールで洗浄し乾燥させた後、0.
２mlの10mM Tris-HCl,pH8/1mM EDTAに溶解した。得られ
た標識プローブの４μl を表２に示すハイブリダイゼー
ションバッファーと混合した（標識プローブ液）。な
お、標識プローブ液は４℃で半年以上安定であった。
の4M LiCl 、3 μg のグリコーゲン及び2.5 倍容のエタ
ノールを加え-80 ℃で、一晩放置した。遠心分離により
沈殿を集め、70% エタノールで洗浄し乾燥させた後、0.
２mlの10mM Tris-HCl,pH8/1mM EDTAに溶解した。得られ
た標識プローブの４μl を表２に示すハイブリダイゼー
ションバッファーと混合した（標識プローブ液）。な
お、標識プローブ液は４℃で半年以上安定であった。
【００２１】
【表２】 ハイブリダイゼーションバッファー SSC (*) 2ｘ ホルムアミド 30% ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社) 1% ドデシル硫酸ナトリウム 0.2% イーストtRNA 100μg/ml 鮭精子 DNA(**) 100μg/ml標識プローブ 適量 * 0.15M 塩化ナトリウム／0.015M クエン酸ナトリウ
ム ** あらかじめ100 ℃、10分の変性処理を行う。
ム ** あらかじめ100 ℃、10分の変性処理を行う。
【００２２】アクチノバチルス・プレロニューモニエか
らの被検ｒＲＮＡは以下のようにして調製した。菌を白
金耳などで0.005%β−ＮＡＤを含む普通寒天培地に塗抹
し、37℃で一晩培養し、得られたコロニーをつまようじ
でピックアップし、0.8ml の感受性ブイヨン培地（日
水）に15分懸濁した。なお、液体培養液を直接以下の操
作に用いてもよかった。生菌数測定のために10μl の懸
濁液をとり適当に希釈し0.005%のβ−ＮＡＤを含む感受
性ブイヨン寒天培地に塗抹し37℃、一晩培養した。残り
の液に0.02mlの2N NaOH を加え撹拌し10分放置後、0.02
mlの2N HCl-0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液，pH7 を加え
中和した（検体液）。検出感度を測定するために検体液
は感受性ブイヨン液で適当に希釈し以下の試験に供し
た。また、特異性を判定するために、種々の菌を同様の
手順で処理し以下の操作に供した。検体液50μl と標識
プローブ液50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロ
タイタープレートに入れ、37℃、１時間振盪した。な
お、ここでの振盪はわずかでも液が揺れていればよかっ
た。0.05%Tween20を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗
浄した後、ブロッキング溶液(1% ブロッキング試薬,20m
M Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl)で10000 倍に希釈した抗
Ｄｉｇヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ、ベーリンガー・マンハイム社製）を加え30分放置
後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：0.12% 3,
3',5,5'-テトラメチルベンジジン/0.1M 酢酸ナトリウ
ム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ液：0.03% 過酸化
水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１で混
合）100 μl を加え5-15分放置した。得られた青色液の
吸光度を660nm の波長で測定した。表３にその結果を示
す。
らの被検ｒＲＮＡは以下のようにして調製した。菌を白
金耳などで0.005%β−ＮＡＤを含む普通寒天培地に塗抹
し、37℃で一晩培養し、得られたコロニーをつまようじ
でピックアップし、0.8ml の感受性ブイヨン培地（日
水）に15分懸濁した。なお、液体培養液を直接以下の操
作に用いてもよかった。生菌数測定のために10μl の懸
濁液をとり適当に希釈し0.005%のβ−ＮＡＤを含む感受
性ブイヨン寒天培地に塗抹し37℃、一晩培養した。残り
の液に0.02mlの2N NaOH を加え撹拌し10分放置後、0.02
mlの2N HCl-0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液，pH7 を加え
中和した（検体液）。検出感度を測定するために検体液
は感受性ブイヨン液で適当に希釈し以下の試験に供し
た。また、特異性を判定するために、種々の菌を同様の
手順で処理し以下の操作に供した。検体液50μl と標識
プローブ液50μl を捕捉プローブが固定されたマイクロ
タイタープレートに入れ、37℃、１時間振盪した。な
お、ここでの振盪はわずかでも液が揺れていればよかっ
た。0.05%Tween20を含む生理食塩水（洗浄液）で３回洗
浄した後、ブロッキング溶液(1% ブロッキング試薬,20m
M Tris-HCl,pH7.5/0.15M NaCl)で10000 倍に希釈した抗
Ｄｉｇヒツジ抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ、ベーリンガー・マンハイム社製）を加え30分放置
後、洗浄液で３回洗浄し、発色基質液（Ａ液：0.12% 3,
3',5,5'-テトラメチルベンジジン/0.1M 酢酸ナトリウ
ム,pH5/30%ジメチルホルムアミド、Ｂ液：0.03% 過酸化
水素/0.2% リン酸、使用時にＡ液とＢ液を１：１で混
合）100 μl を加え5-15分放置した。得られた青色液の
吸光度を660nm の波長で測定した。表３にその結果を示
す。
【００２３】
【表３】生菌数 吸光度 3.0x107 >1.7 1.5x107 >1.7 3.0x106 1.287 1.5x106 0.790 3.0x105 0.142 1.5x105 0.065培地のみ 0.010 表３の結果から、3.0x105 の菌が存在していれば検出さ
れることが示される。0.5mm 径程度のコロニーを液体培
地に懸濁した場合、106 以上の菌は普通に得られるの
で、上記の結果はこのような小さいコロニーでも検出が
行なえることを示すものである。
れることが示される。0.5mm 径程度のコロニーを液体培
地に懸濁した場合、106 以上の菌は普通に得られるの
で、上記の結果はこのような小さいコロニーでも検出が
行なえることを示すものである。
【００２４】実施例２ 捕捉用プローブ及び検出用プロ
ーブの相対位置の違いによる検出値の変化と特異性試験 実施例１で用いた１セットのプローブに加え、標識用プ
ローブとして配列番号３、５で表される配列のＤＮＡ
を、及び捕捉用プローブとして配列番号４、６で表わさ
れる配列のＤＮＡを用いた。いずれもアクチノバチルス
・プレロニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖で
あり、配列番号４のＤＮＡは配列番号３のＤＮＡの、配
列番号６のＤＮＡは配列番号５のＤＮＡの、それぞれア
クチノバチルス・プレロニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡ塩
基配列上で５’側に隣接してハイブリダイズする。隣接
プローブ法の実施は実施例１に同じである。捕捉プロー
ブと標識プローブの組合わせは表４に結果と共に示す。
試験操作は実施例１に準拠した。
ーブの相対位置の違いによる検出値の変化と特異性試験 実施例１で用いた１セットのプローブに加え、標識用プ
ローブとして配列番号３、５で表される配列のＤＮＡ
を、及び捕捉用プローブとして配列番号４、６で表わさ
れる配列のＤＮＡを用いた。いずれもアクチノバチルス
・プレロニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖で
あり、配列番号４のＤＮＡは配列番号３のＤＮＡの、配
列番号６のＤＮＡは配列番号５のＤＮＡの、それぞれア
クチノバチルス・プレロニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡ塩
基配列上で５’側に隣接してハイブリダイズする。隣接
プローブ法の実施は実施例１に同じである。捕捉プロー
ブと標識プローブの組合わせは表４に結果と共に示す。
試験操作は実施例１に準拠した。
【００２５】配列番号３ 5'-CCCTT CCCGT TACCG TT 配列番号４ 5'-CACTC GTCGG CAAAG AAAGC AAGCT 配列番号５ 5'-GCACC AGACT CACAG TCCAA T 配列番号６ 5'-CCCCA AATCG ACAGC GTTTA CAGCG
【００２６】
【表４】 ────────────────────────── 標識用プローブ 補捉用プローブ 吸光度 ────────────────────────── 配列番号１ 配列番号２ >1.0 配列番号１ 配列番号４ <0.02 配列番号１ 配列番号６ <0.02 配列番号３ 配列番号２ <0.02 配列番号３ 配列番号４ >1.0 配列番号３ 配列番号６ <0.02 配列番号５ 配列番号２ <0.02 配列番号５ 配列番号４ <0.02 配列番号５ 配列番号６ >1.0 ────────────────────────── 検体あたりの菌数：>108
【００２７】表４の結果は、捕捉プローブと標識プロー
ブが隣接している場合のみ有意の値が得られることを示
している。即ち、ハイブリダイズした２つのプローブの
間に被検ＲＮＡの１本鎖部分があると、操作中に物理的
あるいは酵素的な切断が生じやすくなるため、検出され
なくなるものと推定される。このことから、サンドイッ
チ法によるＲＮＡの検出を行なうためには、捕捉プロー
ブと標識プローブとが隣接していることが好ましいと判
断される。
ブが隣接している場合のみ有意の値が得られることを示
している。即ち、ハイブリダイズした２つのプローブの
間に被検ＲＮＡの１本鎖部分があると、操作中に物理的
あるいは酵素的な切断が生じやすくなるため、検出され
なくなるものと推定される。このことから、サンドイッ
チ法によるＲＮＡの検出を行なうためには、捕捉プロー
ブと標識プローブとが隣接していることが好ましいと判
断される。
【００２８】実施例３ アクチノバチルス・プレロニュ
ーモニエ検出プローブの特異性 実施例２で示したプローブを用い各種の細菌を用いて検
出試験を行なった。なお、従来法と比較するために、配
列番号１、３、５を32Ｐで標識しフィルターハイブリダ
イゼーション法を行った結果を併記する。なお、フィル
ターハイブリダイゼーションの方法は特開平５−２１９
９５５号公報に記載されている方法に準拠した。また、
配列番号１と２、配列番号３と４、及び配列番号５と６
のセットを用い、各種菌を用いて特異性試験を行なった
結果を表５に示す。実施例２同様、奇数番号の配列のＤ
ＮＡを標識プローブとして、偶数番号の配列のＤＮＡを
捕捉プローブとして用いた。試験操作は実施例１に準拠
した。なお、試験に用いた菌数はいずれも108 以上であ
る。
ーモニエ検出プローブの特異性 実施例２で示したプローブを用い各種の細菌を用いて検
出試験を行なった。なお、従来法と比較するために、配
列番号１、３、５を32Ｐで標識しフィルターハイブリダ
イゼーション法を行った結果を併記する。なお、フィル
ターハイブリダイゼーションの方法は特開平５−２１９
９５５号公報に記載されている方法に準拠した。また、
配列番号１と２、配列番号３と４、及び配列番号５と６
のセットを用い、各種菌を用いて特異性試験を行なった
結果を表５に示す。実施例２同様、奇数番号の配列のＤ
ＮＡを標識プローブとして、偶数番号の配列のＤＮＡを
捕捉プローブとして用いた。試験操作は実施例１に準拠
した。なお、試験に用いた菌数はいずれも108 以上であ
る。
【００２９】
【表５】 測定法 フ 隣 フ 隣 フ 隣 プローブ用ＤＮＡ（配列番号） 1 1,2 3 3,4 5 5,6 菌名 A.pleuropneumoniae Shope4074 + + + + - - A.pleuropneumoniae S1536 + + + + + + A.pleuropneumoniae Hi-1 + + + + + + E.coli JM109 - - - - - - E.coli NIHJ - - - - - - P.multocida KOBE5 - - - - - - P.multocida KOBE6 - - - - - - B.bronchiseptica S1 - - - - - - B.bronchiseptica ATCC4617 - - - - - - M.hyopneumoniae ST-11 - - - - - - P.aeruginosa ATCC9721 - - - - - - K.pneumoniae ATCC10031 - - - - - - S.Typhimurium LT-2 - - - - - - S.aureus ATCC25923 - - - - - - E.cloacae ATCC13047 - - - - - - C.freundii ATCC8090 - - - - - -S.sonnei ATCC25931 - - - - - - フ：フィルター法 隣：隣接プローブ法 +：検出（吸光度1.0以上） -：未検出（吸光度0.0
2以下） P.multocida：パスツレラ・マルトシダ B.bronchiseptica：ボルデテラ・ブロンキセプチカ M.hyopneumoniae：マイコプラズマ・ハイオニューモニ
エ P.aeruginosa: シュードモナス・エアルギノーサ（緑膿
菌） K.pneumoniae: クレブジエラ・ニューモニエ S.Typhimurium: サルモネラ・ティフィムリウム S.aureus: スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブド
ウ状球菌） E.cloacae: エンテロバクター・クロアカエ C.freundii: シトロバクター・フロインディー S.sonnei: シゲラ・ゾンネ
2以下） P.multocida：パスツレラ・マルトシダ B.bronchiseptica：ボルデテラ・ブロンキセプチカ M.hyopneumoniae：マイコプラズマ・ハイオニューモニ
エ P.aeruginosa: シュードモナス・エアルギノーサ（緑膿
菌） K.pneumoniae: クレブジエラ・ニューモニエ S.Typhimurium: サルモネラ・ティフィムリウム S.aureus: スタフィロコッカス・アウレウス（黄色ブド
ウ状球菌） E.cloacae: エンテロバクター・クロアカエ C.freundii: シトロバクター・フロインディー S.sonnei: シゲラ・ゾンネ
【００３０】表５の結果は、フィルターハイブリダイゼ
ーション法と隣接プローブ法がパラレルであることを示
している。特に、配列番号５，６のＤＮＡセットを用い
た隣接プローブ法では、配列番号５の標識ＤＮＡを用い
たフィルター法同様、アクチノバチルス・プレロニュー
モニエ Shope4074は検出されていない。アクチノバチル
ス・プレロニューモニエの中で、Shope4074 は血清型１
型、S1536 は２型、Hi-1は５型である。アクチノバチル
ス・プレロニューモニエ各種野外分離株について同様の
試験を行なったところ、血清型１型の菌は、配列番号５
の標識ＤＮＡを用いたフィルター法及び配列番号５、６
のＤＮＡセットを用いた隣接プローブ法いずれの方法で
も全て検出されなかった。なお、配列番号１、３の標識
ＤＮＡを用いたフィルター法、及び配列番号１、２のＤ
ＮＡセットと配列番号３、４のＤＮＡセットを用いた隣
接プローブ法では調べたアクチノバチルス・プレロニュ
ーモニエ菌株は全て検出された。
ーション法と隣接プローブ法がパラレルであることを示
している。特に、配列番号５，６のＤＮＡセットを用い
た隣接プローブ法では、配列番号５の標識ＤＮＡを用い
たフィルター法同様、アクチノバチルス・プレロニュー
モニエ Shope4074は検出されていない。アクチノバチル
ス・プレロニューモニエの中で、Shope4074 は血清型１
型、S1536 は２型、Hi-1は５型である。アクチノバチル
ス・プレロニューモニエ各種野外分離株について同様の
試験を行なったところ、血清型１型の菌は、配列番号５
の標識ＤＮＡを用いたフィルター法及び配列番号５、６
のＤＮＡセットを用いた隣接プローブ法いずれの方法で
も全て検出されなかった。なお、配列番号１、３の標識
ＤＮＡを用いたフィルター法、及び配列番号１、２のＤ
ＮＡセットと配列番号３、４のＤＮＡセットを用いた隣
接プローブ法では調べたアクチノバチルス・プレロニュ
ーモニエ菌株は全て検出された。
【００３１】実施例４ 隣接プローブ法によるE.coliの
検出 大腸菌（E.coli）を検出するためのプローブセットを作
製し隣接プローブ法を実施した。標識プローブ用ＤＮＡ
として配列番号７で表されるＤＮＡを、捕捉プローブ用
ＤＮＡとして配列番号８で表されるＤＮＡを作製した。
ともにE.coli１６Ｓ rＲＮＡの逆相補鎖の配列であり、
配列番号８のＤＮＡはE.coli１６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上
で、配列番号７のＤＮＡの５’側に隣接してハイブリダ
イズする。検体の調製、隣接プローブ法の実施は実施例
１のアクチノバチルス・プレロニューモニエで用いた方
法に準拠した。表６に試験結果を示す。 配列番号７ 5'-TCGTC AGCAA AGAAG CAAGC TTCTT CCTG 配列番号８ 5'-ATTAC TCACC CGTCC GCCAC
検出 大腸菌（E.coli）を検出するためのプローブセットを作
製し隣接プローブ法を実施した。標識プローブ用ＤＮＡ
として配列番号７で表されるＤＮＡを、捕捉プローブ用
ＤＮＡとして配列番号８で表されるＤＮＡを作製した。
ともにE.coli１６Ｓ rＲＮＡの逆相補鎖の配列であり、
配列番号８のＤＮＡはE.coli１６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上
で、配列番号７のＤＮＡの５’側に隣接してハイブリダ
イズする。検体の調製、隣接プローブ法の実施は実施例
１のアクチノバチルス・プレロニューモニエで用いた方
法に準拠した。表６に試験結果を示す。 配列番号７ 5'-TCGTC AGCAA AGAAG CAAGC TTCTT CCTG 配列番号８ 5'-ATTAC TCACC CGTCC GCCAC
【００３２】
【表６】 表６に示されるように、大腸菌が特異的に検出されてい
る。特に、S.sonneiとは１６Ｓ rＲＮＡ全体で９５％以
上の相同性があるにもかかわらず識別が可能であった。
このことは本発明が極めて有用であることを示すもので
ある。
る。特に、S.sonneiとは１６Ｓ rＲＮＡ全体で９５％以
上の相同性があるにもかかわらず識別が可能であった。
このことは本発明が極めて有用であることを示すもので
ある。
【００３３】実施例５ 隣接プローブ法による緑膿菌の
検出 緑膿菌（P.aeruginosa）を検出するためのプローブセッ
トを作製し隣接プローブ法を実施した。標識プローブと
して配列番号９で表されるＤＮＡを、捕捉プローブとし
て配列番号１０で表されるＤＮＡを特定した。ともにP.
aeruginosa１６Ｓ rＲＮＡの逆相補鎖の配列であり、配
列番号１０のＤＮＡは緑膿菌（P.aeruginosa）１６Ｓ r
ＲＮＡ塩基配列上で、配列番号９のＤＮＡの５’側に隣
接してハイブリダイズする。検体の調製、隣接プローブ
法の実施は実施例１のアクチノバチルス・プレロニュー
モニエで用いた方法に準拠した。表７に試験結果を示
す。 配列番号９： 5'-GATCC CAACG GCTAG TCGAC 配列番号１０： 5'-TGCGC CACTA AGATC TCAAG
検出 緑膿菌（P.aeruginosa）を検出するためのプローブセッ
トを作製し隣接プローブ法を実施した。標識プローブと
して配列番号９で表されるＤＮＡを、捕捉プローブとし
て配列番号１０で表されるＤＮＡを特定した。ともにP.
aeruginosa１６Ｓ rＲＮＡの逆相補鎖の配列であり、配
列番号１０のＤＮＡは緑膿菌（P.aeruginosa）１６Ｓ r
ＲＮＡ塩基配列上で、配列番号９のＤＮＡの５’側に隣
接してハイブリダイズする。検体の調製、隣接プローブ
法の実施は実施例１のアクチノバチルス・プレロニュー
モニエで用いた方法に準拠した。表７に試験結果を示
す。 配列番号９： 5'-GATCC CAACG GCTAG TCGAC 配列番号１０： 5'-TGCGC CACTA AGATC TCAAG
【００３４】
【表７】 表７に示されるように、緑膿菌が特異的に検出されてい
る。
る。
【００３５】実施例６ 隣接プローブ法によるボルデテ
ラ・ブロンキセプチカの検出 ボルデテラ・ブロンキセプチカを検出するためのプロー
ブセットを作製し隣接プローブ法を実施した。標識プロ
ーブとして、配列番号１１で表されるＤＮＡを、捕捉プ
ローブとして配列番号１２で表されるＤＮＡを用いた。
ともにボルデテラ・ブロンキセプチカ１６Ｓ rＲＮＡの
逆相補鎖の配列であり、配列番号１２のＤＮＡはボルデ
テラ・ブロンキセプチカ１６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で、
配列番号１１のＤＮＡの５’側に隣接してハイブリダイ
ズする。検体の調製、隣接プローブ法の実施は実施例１
のアクチノバチルス・プレロニューモニエで用いた方法
に準拠した。表８に試験結果を示す。 配列番号１１： 5'-CTTTC CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA 配列番号１２： 5'-GGATA TTAGC CCGTG CCGTT T
ラ・ブロンキセプチカの検出 ボルデテラ・ブロンキセプチカを検出するためのプロー
ブセットを作製し隣接プローブ法を実施した。標識プロ
ーブとして、配列番号１１で表されるＤＮＡを、捕捉プ
ローブとして配列番号１２で表されるＤＮＡを用いた。
ともにボルデテラ・ブロンキセプチカ１６Ｓ rＲＮＡの
逆相補鎖の配列であり、配列番号１２のＤＮＡはボルデ
テラ・ブロンキセプチカ１６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で、
配列番号１１のＤＮＡの５’側に隣接してハイブリダイ
ズする。検体の調製、隣接プローブ法の実施は実施例１
のアクチノバチルス・プレロニューモニエで用いた方法
に準拠した。表８に試験結果を示す。 配列番号１１： 5'-CTTTC CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA 配列番号１２： 5'-GGATA TTAGC CCGTG CCGTT T
【００３６】
【表８】 表８に示されるように、ボルデテラ・ブロンキセプチカ
が特異的に検出されている。
が特異的に検出されている。
【００３７】実施例７ ボルデテラ・ブロンキセプチカ検出システムにおけるギ
ャップの影響 実施例６に示した配列番号１１の配列から、５’側から
１，３，５塩基ずつ短くしたＤＮＡを合成した（それぞ
れ配列番号１３、１４、１５で表される配列のＤＮＡで
ある）。さらに、配列番号１１、１３、１４、１５で表
されるＤＮＡをそれぞれ実施例１に記載された方法に従
いＤｉｇ標識を行った。なお、検出用プレートには配列
番号１２を固定している。即ち、配列番号１３、１４、
１５を用いた試験では、対象ｒＲＮＡはハイブリダイゼ
ーションの後、２つのプローブの間に、それぞれ１、
３、５塩基の１本鎖部分が生じることになる。これらの
標識プローブを用い、ハイブリダイゼーションに次いで
洗浄の後、Ｄｉｇヒツジ抗体−ＨＲＰとの反応中に、Ｒ
ＮＡ分解酵素であるリボヌクレアーゼＡ（RNase A)を添
加し、その影響を調べた。なお、この際、反応温度は37
℃で行った。結果を表９に示す。 配列番号１３： 5'-TTTCC TGCCA AAAGT GCTTT CCAA 配列番号１４： 5'-TCCTG CCAAA AGTGC TTTCC AA 配列番号１５： 5'-CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA
ャップの影響 実施例６に示した配列番号１１の配列から、５’側から
１，３，５塩基ずつ短くしたＤＮＡを合成した（それぞ
れ配列番号１３、１４、１５で表される配列のＤＮＡで
ある）。さらに、配列番号１１、１３、１４、１５で表
されるＤＮＡをそれぞれ実施例１に記載された方法に従
いＤｉｇ標識を行った。なお、検出用プレートには配列
番号１２を固定している。即ち、配列番号１３、１４、
１５を用いた試験では、対象ｒＲＮＡはハイブリダイゼ
ーションの後、２つのプローブの間に、それぞれ１、
３、５塩基の１本鎖部分が生じることになる。これらの
標識プローブを用い、ハイブリダイゼーションに次いで
洗浄の後、Ｄｉｇヒツジ抗体−ＨＲＰとの反応中に、Ｒ
ＮＡ分解酵素であるリボヌクレアーゼＡ（RNase A)を添
加し、その影響を調べた。なお、この際、反応温度は37
℃で行った。結果を表９に示す。 配列番号１３： 5'-TTTCC TGCCA AAAGT GCTTT CCAA 配列番号１４： 5'-TCCTG CCAAA AGTGC TTTCC AA 配列番号１５： 5'-CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA
【００３８】
【表９】 (*) 比吸光度: RNase A を加えないときの吸光度に対す
る比(%)
る比(%)
【００３９】表９の結果から、２つのプローブが隣接し
てハイブリダイズする場合には、RNase A を加えても、
対象ｒＲＮＡの中でハイブリダイズ部分がほとんど分解
していないことがわかる。一方、１塩基ではわずかな分
解が起こり、３塩基以上になると明らかにギャップの部
分が分解されている。即ち、ギャップの部分が長いほど
ＲＮＡ分解酵素の影響を受けやすくなることが推定され
る。
てハイブリダイズする場合には、RNase A を加えても、
対象ｒＲＮＡの中でハイブリダイズ部分がほとんど分解
していないことがわかる。一方、１塩基ではわずかな分
解が起こり、３塩基以上になると明らかにギャップの部
分が分解されている。即ち、ギャップの部分が長いほど
ＲＮＡ分解酵素の影響を受けやすくなることが推定され
る。
【００４０】実施例８ ボルデテラ・ブロンキセプチカ
検出システムにおける重複鎖の影響 実施例６に示した配列番号１１の配列の５’側に、配列
番号１２の３’側の配列を３塩基付加した配列（配列番
号１６）、５塩基付加した配列（配列番号１７）、及び
１０塩基付加した配列（配列番号１８）のＤＮＡを合成
し、実施例１の方法に従い標識プローブを作製した。な
お、検出用プレートには実施例６、７同様、配列番号１
２のＤＮＡを固定している。即ち、配列番号１６、１
７、１８を用いた試験では、対象ｒＲＮＡはハイブリダ
イゼーションの後、２つのプローブの間に、それぞれ
３、５、１０塩基の重複鎖部分が生じることになる。こ
れらの標識プローブを用い、ハイブリダイゼーションに
次いで洗浄の後、Ｄｉｇヒツジ抗体−ＨＲＰとの反応中
に、ＲＮＡ分解酵素であるリボヌクレアーゼＡ（RNase
A)を添加しその影響を調べた。実施例７同様、反応温度
は37℃で行った。結果を表１０に示す。 配列番号１６：5'-TTTCT TTCCT GCCAA AAGTG CTTTC CAA 配列番号１７：5'-CGTTT CTTTC CTGCC AAAAG TGCTT TCC
AA 配列番号１８：5'-CGTGC CGTTT CTTTC CTGCC AAAAG TGC
TT TCCAA
検出システムにおける重複鎖の影響 実施例６に示した配列番号１１の配列の５’側に、配列
番号１２の３’側の配列を３塩基付加した配列（配列番
号１６）、５塩基付加した配列（配列番号１７）、及び
１０塩基付加した配列（配列番号１８）のＤＮＡを合成
し、実施例１の方法に従い標識プローブを作製した。な
お、検出用プレートには実施例６、７同様、配列番号１
２のＤＮＡを固定している。即ち、配列番号１６、１
７、１８を用いた試験では、対象ｒＲＮＡはハイブリダ
イゼーションの後、２つのプローブの間に、それぞれ
３、５、１０塩基の重複鎖部分が生じることになる。こ
れらの標識プローブを用い、ハイブリダイゼーションに
次いで洗浄の後、Ｄｉｇヒツジ抗体−ＨＲＰとの反応中
に、ＲＮＡ分解酵素であるリボヌクレアーゼＡ（RNase
A)を添加しその影響を調べた。実施例７同様、反応温度
は37℃で行った。結果を表１０に示す。 配列番号１６：5'-TTTCT TTCCT GCCAA AAGTG CTTTC CAA 配列番号１７：5'-CGTTT CTTTC CTGCC AAAAG TGCTT TCC
AA 配列番号１８：5'-CGTGC CGTTT CTTTC CTGCC AAAAG TGC
TT TCCAA
【００４１】
【表１０】 (*) 最終１μg/mlで加えた。 (**) 重複塩基数０でRNase A を加えないときの吸光度
に対する比(%)
に対する比(%)
【００４２】表１０に示すように、重複塩基数が増える
に従って、RNase A に対する感受性が増大することがわ
かる。また、RNase A を加えない状態でも、特に５塩基
以上の重複があると明らかに感度が低下しているが、こ
れはおそらく捕捉プローブと標識プローブが被検ＲＮＡ
の同じ部位を取り合うためではないかと考えられる。な
お、３塩基程度の重複では対照に比べ検出値は増大して
いるが、おそらく、実施例６−８で規定されるボルデテ
ラ・ブロンキセプチカの検出システムにおいては、配列
の付加によって標識プローブ自体の立体構造が変化し、
よりハイブリダイゼーションを起こしやすくなったから
ではないかと考えられる。
に従って、RNase A に対する感受性が増大することがわ
かる。また、RNase A を加えない状態でも、特に５塩基
以上の重複があると明らかに感度が低下しているが、こ
れはおそらく捕捉プローブと標識プローブが被検ＲＮＡ
の同じ部位を取り合うためではないかと考えられる。な
お、３塩基程度の重複では対照に比べ検出値は増大して
いるが、おそらく、実施例６−８で規定されるボルデテ
ラ・ブロンキセプチカの検出システムにおいては、配列
の付加によって標識プローブ自体の立体構造が変化し、
よりハイブリダイゼーションを起こしやすくなったから
ではないかと考えられる。
【００４３】実施例９ 隣接プローブ法によるサルモネ
ラ菌の検出 サルモネラ菌を検出するためのプローブセットを作製し
隣接プローブ法を実施した。標識プローブとして配列番
号１９及び配列番号２１で表される２つのＤＮＡを、捕
捉プローブとして配列番号２０及び配列番号２２で表さ
れる２つのＤＮＡを用いた。上記４本のＤＮＡはいずれ
もサルモネラ・チフィミュリウム（S. Typhimurium) ２
３Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、配列番号２０のＤ
ＮＡはサルモネラ・チフィミュリウム（S. Typhimuriu
m) ２３Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で配列番号１９のＤＮＡ
の、配列番号２２のＤＮＡはサルモネラ・チフィミュリ
ウム（S. Typhimurium) ２３Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で配
列番号２１のＤＮＡの、いずれも５’側に隣接してハイ
ブリダイズする。ｒＲＮＡ測定用のサンプルの調製は実
施例１に準じた。 配列番号１９： 5'-CTTCA CCTAC GTGTC AGC 配列番号２０： 5'-CTTCA GCTCC ATGAG TAAAT CA 配列番号２１： 5'-CCTGG AACAC ACACC TACAC G 配列番号２２： 5'-GTGTT AAAGT GAACC GGATT TA 表１１に試験結果（吸光度）を示す。
ラ菌の検出 サルモネラ菌を検出するためのプローブセットを作製し
隣接プローブ法を実施した。標識プローブとして配列番
号１９及び配列番号２１で表される２つのＤＮＡを、捕
捉プローブとして配列番号２０及び配列番号２２で表さ
れる２つのＤＮＡを用いた。上記４本のＤＮＡはいずれ
もサルモネラ・チフィミュリウム（S. Typhimurium) ２
３Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、配列番号２０のＤ
ＮＡはサルモネラ・チフィミュリウム（S. Typhimuriu
m) ２３Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で配列番号１９のＤＮＡ
の、配列番号２２のＤＮＡはサルモネラ・チフィミュリ
ウム（S. Typhimurium) ２３Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で配
列番号２１のＤＮＡの、いずれも５’側に隣接してハイ
ブリダイズする。ｒＲＮＡ測定用のサンプルの調製は実
施例１に準じた。 配列番号１９： 5'-CTTCA CCTAC GTGTC AGC 配列番号２０： 5'-CTTCA GCTCC ATGAG TAAAT CA 配列番号２１： 5'-CCTGG AACAC ACACC TACAC G 配列番号２２： 5'-GTGTT AAAGT GAACC GGATT TA 表１１に試験結果（吸光度）を示す。
【００４４】
【表１１】 ────────────────────────────── プローブセット 菌名 19,20 21,22 ────────────────────────────── S. Typhimurium LT-2 >1 >1 S. Typhimurium L-417 >1 >1 S. Enteritidis L-58 >1 >1 S. aureus ATCC25923 <0.02 <0.02 E. coli JM109 <0.02 <0.02 E. coli NIHJ <0.02 <0.02 P. multocida KOBE5 <0.02 <0.02 B. bronchiseptica S1 <0.02 <0.02 A. pleuropneumoniae Shope4074 <0.02 <0.02 M. hyopneumoniae ST-11 <0.02 <0.02 P. aeruginosa ATCC9721 <0.02 <0.02 K. pneumoniae ATCC10031 <0.02 <0.02 E. cloacae ATCC13047 <0.02 <0.02 C. freundii ATCC8090 <0.02 <0.02 S. sonnei ATCC25931 <0.02 <0.02 ────────────────────────────── S. Enteritidis: サルモネラ・エンテリティディス 検体あたりの菌数：>108表１１に示されるように、サル
モネラ菌が特異的に検出されている。
モネラ菌が特異的に検出されている。
【００４５】実施例１０ 隣接プローブ法によるマイコ
プラズマ・ハイオニューモニエの検出 マイコプラズマ・ハイオニューモニエを検出するための
プローブセットを作製し隣接プローブ法を実施した。標
識プローブとして配列番号２３で表されるＤＮＡを、捕
捉プローブとして配列番号２４で表されるＤＮＡを用い
た。ともにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ１６Ｓ
rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、配列番号２４のＤＮＡ
はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡ
塩基配列上で、配列番号２３のＤＮＡの５’側に隣接し
てハイブリダイズする。検体の調製、隣接プローブ法の
実施は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの場合固
体培地上で生育しないので、下記組成の液体培地を用い
た。 ─────────────────────────── ハンクス液 ０．９８％ ラクトアルブミン水解液 ０．２ 馬血清 ２０ 新鮮酵母エキス １．２５ メチシリン ０．０１ 水を加えて １００ ─────────────────────────── 培養液を直接アルカリ・中和処理して被検ＲＮＡを調製
した。その後、実施例１のアクチノバチルス・プレロニ
ューモニエで用いた方法に準拠し検出操作を行った。表
１２に試験結果を示す。 配列番号２３： 5'-TATTC AAAGG AGCCT TCAAG CTTCA CC
AAG 配列番号２４： 5'-TAACT AATGT TGCGC ACCCC CATTT
プラズマ・ハイオニューモニエの検出 マイコプラズマ・ハイオニューモニエを検出するための
プローブセットを作製し隣接プローブ法を実施した。標
識プローブとして配列番号２３で表されるＤＮＡを、捕
捉プローブとして配列番号２４で表されるＤＮＡを用い
た。ともにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ１６Ｓ
rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、配列番号２４のＤＮＡ
はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ１６Ｓ rＲＮＡ
塩基配列上で、配列番号２３のＤＮＡの５’側に隣接し
てハイブリダイズする。検体の調製、隣接プローブ法の
実施は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの場合固
体培地上で生育しないので、下記組成の液体培地を用い
た。 ─────────────────────────── ハンクス液 ０．９８％ ラクトアルブミン水解液 ０．２ 馬血清 ２０ 新鮮酵母エキス １．２５ メチシリン ０．０１ 水を加えて １００ ─────────────────────────── 培養液を直接アルカリ・中和処理して被検ＲＮＡを調製
した。その後、実施例１のアクチノバチルス・プレロニ
ューモニエで用いた方法に準拠し検出操作を行った。表
１２に試験結果を示す。 配列番号２３： 5'-TATTC AAAGG AGCCT TCAAG CTTCA CC
AAG 配列番号２４： 5'-TAACT AATGT TGCGC ACCCC CATTT
【００４６】
【表１２】 検体あたりの菌数：>108 M.hyorhinis :マイコプラズマ・ハイオライニス M.flocculare ：マイコプラズマ・フロキュラレ M.hyosynoviae ：マイコプラズマ・ハイオシノビエ
【００４７】表１２に示されるように、マイコプラズマ
・ハイオニューモニエが特異的に検出されている。ま
た、マイコプラズマ・ハイオライニス、マイコプラズマ
・フロキュラレ、マイコプラズマ・ハイオシノビエの３
菌種は豚から検出されるマイコプラズマであるが、いず
れも検出されていない。また、２０％の血清を含む培養
液でもＲＮＡ検体の調製に特別の工夫をする必要はなか
った。
・ハイオニューモニエが特異的に検出されている。ま
た、マイコプラズマ・ハイオライニス、マイコプラズマ
・フロキュラレ、マイコプラズマ・ハイオシノビエの３
菌種は豚から検出されるマイコプラズマであるが、いず
れも検出されていない。また、２０％の血清を含む培養
液でもＲＮＡ検体の調製に特別の工夫をする必要はなか
った。
【０００４８】実施例１１ 隣接プローブ法によるパス
ツレラ・マルトシダの検出 パスツレラ・マルトシダを検出するためのプローブセッ
トを作製し隣接プローブ法を実施した。標識プローブと
して配列番号２５、２７、２９で表されるＤＮＡを、捕
捉プローブとして配列番号２６、２８、３０で表される
ＤＮＡを用いた。いずれもパスツレラ・マルトシダの１
６Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、パスツレラ・マル
トシダ１６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で、配列番号２６のＤ
ＮＡは配列番号２５のＤＮＡの、配列番号２８のＤＮＡ
は配列番号２７のＤＮＡの、配列番号３０のＤＮＡは配
列番号２９のＤＮＡのそれぞれ５’側に隣接してハイブ
リダイズする。検体の調製、隣接プローブ法の実施は実
施例１のアクチノバチルス・プレロニューモニエで用い
た方法に準拠した。表１３に試験結果（吸光度）を示
す。 配列番号２５： 5'-TGATG CTATC TATTT AACTT CATC 配列番号２６： 5'-CCTTC CTCAT TACCG AAAGA ACTTT 配列番号２７： 5'-TCTGA GCTCT TCTTA GGATG 配列番号２８： 5'-TCAAG AGTAG GTAAG GTTCT TC 配列番号２９： 5'-TCAAG CTCGC ACTCT CGCTG CCCT 配列番号３０： 5'-CTTAG ATGCA CTTTC TGAGA TTCGC
ツレラ・マルトシダの検出 パスツレラ・マルトシダを検出するためのプローブセッ
トを作製し隣接プローブ法を実施した。標識プローブと
して配列番号２５、２７、２９で表されるＤＮＡを、捕
捉プローブとして配列番号２６、２８、３０で表される
ＤＮＡを用いた。いずれもパスツレラ・マルトシダの１
６Ｓ rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、パスツレラ・マル
トシダ１６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で、配列番号２６のＤ
ＮＡは配列番号２５のＤＮＡの、配列番号２８のＤＮＡ
は配列番号２７のＤＮＡの、配列番号３０のＤＮＡは配
列番号２９のＤＮＡのそれぞれ５’側に隣接してハイブ
リダイズする。検体の調製、隣接プローブ法の実施は実
施例１のアクチノバチルス・プレロニューモニエで用い
た方法に準拠した。表１３に試験結果（吸光度）を示
す。 配列番号２５： 5'-TGATG CTATC TATTT AACTT CATC 配列番号２６： 5'-CCTTC CTCAT TACCG AAAGA ACTTT 配列番号２７： 5'-TCTGA GCTCT TCTTA GGATG 配列番号２８： 5'-TCAAG AGTAG GTAAG GTTCT TC 配列番号２９： 5'-TCAAG CTCGC ACTCT CGCTG CCCT 配列番号３０： 5'-CTTAG ATGCA CTTTC TGAGA TTCGC
【００４９】
【表１３】 プローブセット 菌名 25,26 27,28 29,30 P.multocida KOBE5 >1.0 <0.05 >1.0 P.multocida KOBE6 >1.0 >0.8 >1.0 B.bronchiseptica S1 <0.02 <0.02 <0.02 B.bronchiseptica ATCC4617 <0.02 <0.02 <0.02 A.pleuropneumoniae Shope4074 <0.02 <0.02 <0.02 A.pleuropneumoniae S1536 <0.02 <0.02 <0.02 A.pleuropneumoniae Hi-1 <0.02 <0.02 <0.02 M.hyopneumoniae ST-11 <0.02 <0.02 <0.02 E.coli JM109 <0.02 <0.02 <0.02 E.coli NIHJ <0.02 <0.02 <0.02 P.aeruginosa ATCC9721 <0.02 <0.02 <0.02 K.pneumoniae ATCC10031 <0.02 <0.02 <0.02 S.Typhimurium LT-2 <0.02 <0.02 <0.02 S.aureus ATCC25923 <0.02 <0.02 <0.02 E.cloacae ATCC13047 <0.02 <0.02 <0.02 C.freundii ATCC8090 <0.02 <0.02 <0.02S.sonnei ATCC25931 <0.02 <0.02 <0.02 検体あたりの菌数：>108 表１３に示されるように、パスツレラ・マルトシダが特
異的に検出されている。なお、配列番号２７、２８のセ
ットではパスツレラ・マルトシダのうちKOBE５株が検出
されていないが、これは本発明者らがフィルターハイブ
リダイゼーションで試験を行なった結果に一致する（特
開平５−２１９９５４号公報）。
異的に検出されている。なお、配列番号２７、２８のセ
ットではパスツレラ・マルトシダのうちKOBE５株が検出
されていないが、これは本発明者らがフィルターハイブ
リダイゼーションで試験を行なった結果に一致する（特
開平５−２１９９５４号公報）。
【００５０】実施例１２ 隣接プローブ法による黄色ブ
ドウ状球菌（S.aureus）の検出 S. aureus を検出するためのプローブセットを作製し、
隣接プローブ法を実施した。標識プローブとして配列番
号３１、３３で表されるＤＮＡを、捕捉プローブとして
配列番号３２、３４で表されるＤＮＡを用いた。いずれ
もS. aureus rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、配列番号
３２のＤＮＡはS. aureus １６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で
配列番号３１のＤＮＡの５’側に隣接してハイブリダイ
ズする。また、配列番号３４のＤＮＡはS. aureus ２３
Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で、配列番号３３のＤＮＡの５’
側に隣接してハイブリダイズする。ｒＲＮＡ測定用のサ
ンプルの調製は実施例１に準じた。しかし、菌種によっ
ては、菌の懸濁液に直接アルカリ液を加える方法では抽
出効率があまりよくない場合があるので、あらかじめ懸
濁液にリソスタフィン（Lysostaphin)溶液を最終20mU/m
lになるように加え37℃で１０分処理した後に、アルカ
リ変性を行なった。 配列番号３１： 5'-TCTAG AGTTG TCAAA GGATG TCA 配列番号３２： 5'-CCGAA GGGGA AGGCT CTATC 配列番号３３： 5'-GAGAC AACAT TTTCG ACTAC A 配列番号３４： 5'-GTACT CAGGA TCCAC TCAAG A 表１４に試験結果（吸光度）を示す。
ドウ状球菌（S.aureus）の検出 S. aureus を検出するためのプローブセットを作製し、
隣接プローブ法を実施した。標識プローブとして配列番
号３１、３３で表されるＤＮＡを、捕捉プローブとして
配列番号３２、３４で表されるＤＮＡを用いた。いずれ
もS. aureus rＲＮＡの部分逆相補鎖であり、配列番号
３２のＤＮＡはS. aureus １６Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で
配列番号３１のＤＮＡの５’側に隣接してハイブリダイ
ズする。また、配列番号３４のＤＮＡはS. aureus ２３
Ｓ rＲＮＡ塩基配列上で、配列番号３３のＤＮＡの５’
側に隣接してハイブリダイズする。ｒＲＮＡ測定用のサ
ンプルの調製は実施例１に準じた。しかし、菌種によっ
ては、菌の懸濁液に直接アルカリ液を加える方法では抽
出効率があまりよくない場合があるので、あらかじめ懸
濁液にリソスタフィン（Lysostaphin)溶液を最終20mU/m
lになるように加え37℃で１０分処理した後に、アルカ
リ変性を行なった。 配列番号３１： 5'-TCTAG AGTTG TCAAA GGATG TCA 配列番号３２： 5'-CCGAA GGGGA AGGCT CTATC 配列番号３３： 5'-GAGAC AACAT TTTCG ACTAC A 配列番号３４： 5'-GTACT CAGGA TCCAC TCAAG A 表１４に試験結果（吸光度）を示す。
【００５１】
【表１４】 プローブセット 菌名 31,32 33,34 S.aureus ATCC25923 >1.0 >1.0 S.aureus Y-7 >1.0 >1.0 S.aureus No.403 (*) >1.0 >1.0 S.aureus No.330 (*) >1.0 >1.0 S.aureus No.402 (*) >1.0 >1.0 S.epidermidis ATCC14990 0.63 <0.02 S.haemolyticus ATCC29970 0.30 <0.02 S.cohnii ATCC29974 0.27 <0.02 S.intermedius ATCC29663 0.86 <0.02 S.hyicus subsp. hyicus ATCC11249 0.30 <0.02 E.coli JM109 <0.02 <0.02 E.coli NIHJ <0.02 <0.02 P.multocida KOBE5 <0.02 <0.02 B.bronchiseptica S1 <0.02 <0.02 A.pleuropneumoniae Shope4074 <0.02 <0.02 M.hyopneumoniae ST-11 <0.02 <0.02 P.aeruginosa ATCC9721 <0.02 <0.02 K.pneumoniae ATCC10031 <0.02 <0.02 S.Typhimurium LT-2 <0.02 <0.02 E.cloacae ATCC13047 <0.02 <0.02 C.freundii ATCC8090 <0.02 <0.02 S.sonnei ATCC25931 <0.02 <0.02 (*):メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（ＭＲＳＡ） S.epidermidis: 表皮ブドウ状球菌 S.haemolyticus: スタフィロコッカス・ヘモリチカス S.cohnii: スタフィロコカッス・コーニー S.intermedius: スタフィロコッカス・インターメジウ
ス S.hyicus subsp. hyicus: スタフィロコッカス・ヒカス 検体あたりの菌数：>108
ス S.hyicus subsp. hyicus: スタフィロコッカス・ヒカス 検体あたりの菌数：>108
【００５２】表１４に示されるように、いずれのプロー
ブセットでもＭＲＳＡを含むS.aureusが全て特異的に検
出されている。但し、プローブセット３１、３２では、
調べたスタフィロコッカス属が一様に検出されたのに対
し、プローブセット３３、３４ではS.aureusだけが検出
され、他のスタフィロコッカス属細菌、表皮ブドウ状球
菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコ
カッス・コーニー、スタフィロコッカス・インターメジ
ウス、スタフィロコッカス・ヒカスが検出されなかっ
た。このことは、本実施例の２つのプローブセットのう
ち、３１、３２のセットがスタフィロコッカス属細菌全
般に、セット３３、３４が黄色ブドウ状球菌に特異的で
あることを示唆している。
ブセットでもＭＲＳＡを含むS.aureusが全て特異的に検
出されている。但し、プローブセット３１、３２では、
調べたスタフィロコッカス属が一様に検出されたのに対
し、プローブセット３３、３４ではS.aureusだけが検出
され、他のスタフィロコッカス属細菌、表皮ブドウ状球
菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコ
カッス・コーニー、スタフィロコッカス・インターメジ
ウス、スタフィロコッカス・ヒカスが検出されなかっ
た。このことは、本実施例の２つのプローブセットのう
ち、３１、３２のセットがスタフィロコッカス属細菌全
般に、セット３３、３４が黄色ブドウ状球菌に特異的で
あることを示唆している。
【００５３】実施例１３ 隣接プローブ法を用いたアク
チノバチルス・プレロニューモニエの薬剤感受性試験−
その１ 種々の抗菌薬剤の段階希釈による液体培養法で行なっ
た。一晩培養した寒天培地（感受性ブイヨン＋0.02%β
−ＮＡＤ）上のアクチノバチルス・プレロニューモニエ
のコロニーをつまようじで拾い、感受性ブイヨン液体培
地1mlに入れ15分放置した。得られた菌の懸濁液を感受
性ブイヨン液体培地で適当に希釈し試験に供した。ま
た、生菌数測定のために10μlの懸濁液をとり適当に希
釈し0.005%のβ−ＮＡＤを含む感受性ブイヨン寒天培地
に塗抹し37℃で、一晩培養した。各種薬剤を200μg/ml
になるように0.005%のβ−ＮＡＤを含む感受性ブイヨン
液体培地に溶かし、2倍希釈系列を作り、96穴マイクロ
タイタープレート（住友ベークライト社製、ＭＳ−８４
９６Ｆ）に50μlずつ分注した。これに適当に希釈した
菌懸濁液50μlを加えた。37℃で3-6時間培養した後、各
穴にアルカリ変性液12.5μlを加え混合し、10分放置し
た後、中和液12.5μlを加えた。得られた溶菌液を隣接
プローブ法に供した。なお、比較のため、同時に薬剤感
受性試験として一般に用いられているディスク法を用い
た試験も行なった。まず、対象菌株としてアクチノバチ
ルス・プレロニューモニエ Hi-1株、抗菌薬剤としてオ
キシテトラサイクリン（OTC）を用い、スタートの菌濃
度を２点とり、各種濃度下で３時間培養し隣接プローブ
法を行った結果を表１５に示す。なお、標識プローブと
して配列番号１のＤＮＡを、捕捉プローブとして配列番
号２のＤＮＡを用いた。
チノバチルス・プレロニューモニエの薬剤感受性試験−
その１ 種々の抗菌薬剤の段階希釈による液体培養法で行なっ
た。一晩培養した寒天培地（感受性ブイヨン＋0.02%β
−ＮＡＤ）上のアクチノバチルス・プレロニューモニエ
のコロニーをつまようじで拾い、感受性ブイヨン液体培
地1mlに入れ15分放置した。得られた菌の懸濁液を感受
性ブイヨン液体培地で適当に希釈し試験に供した。ま
た、生菌数測定のために10μlの懸濁液をとり適当に希
釈し0.005%のβ−ＮＡＤを含む感受性ブイヨン寒天培地
に塗抹し37℃で、一晩培養した。各種薬剤を200μg/ml
になるように0.005%のβ−ＮＡＤを含む感受性ブイヨン
液体培地に溶かし、2倍希釈系列を作り、96穴マイクロ
タイタープレート（住友ベークライト社製、ＭＳ−８４
９６Ｆ）に50μlずつ分注した。これに適当に希釈した
菌懸濁液50μlを加えた。37℃で3-6時間培養した後、各
穴にアルカリ変性液12.5μlを加え混合し、10分放置し
た後、中和液12.5μlを加えた。得られた溶菌液を隣接
プローブ法に供した。なお、比較のため、同時に薬剤感
受性試験として一般に用いられているディスク法を用い
た試験も行なった。まず、対象菌株としてアクチノバチ
ルス・プレロニューモニエ Hi-1株、抗菌薬剤としてオ
キシテトラサイクリン（OTC）を用い、スタートの菌濃
度を２点とり、各種濃度下で３時間培養し隣接プローブ
法を行った結果を表１５に示す。なお、標識プローブと
して配列番号１のＤＮＡを、捕捉プローブとして配列番
号２のＤＮＡを用いた。
【００５４】
【表１５】
【００５５】表１５に示されるように、生育阻害効果は
培養開始時の菌濃度にはあまり左右されない。仮に薬剤
なしに対し吸光度が1/3 以下になる濃度を最少阻止濃度
（MIC)とすると、最初の菌濃度が8x106 、8x107/ml で
それぞれ6.25μg/ml、3.13μg/mlとほとんど差が見られ
ない。なお、ディスク法で求められるMIC は3.13-6.25
μg/mlとほぼ一致する（ディスク法でも２倍程度の差は
日常的に生じる）。ディスク法の場合、培養開始時の菌
濃度は厳しく規定されており、データは示さないが、隣
接プローブ法と同等の濃度でディスク法の試験をする
と、即ち初発菌濃度を107/ml以上にあげると、見かけ上
のMIC が増加するか、もしくは全く測定できなくなって
しまう。また、他の薬剤を用いた場合でも、あるいはア
クチノバチルス・プレロニューモニエの他の菌株を用い
た試験でも同様の結果が得られている。初発菌濃度を一
定範囲以内に収め再現性のあるMIC値を求める方法は熟
練を必要とするが、本方法を用いれば、試験当日内に容
易に再現性のあるデータを得ることができる。また、無
菌操作の必要がないことも操作性をよくする一因であ
る。
培養開始時の菌濃度にはあまり左右されない。仮に薬剤
なしに対し吸光度が1/3 以下になる濃度を最少阻止濃度
（MIC)とすると、最初の菌濃度が8x106 、8x107/ml で
それぞれ6.25μg/ml、3.13μg/mlとほとんど差が見られ
ない。なお、ディスク法で求められるMIC は3.13-6.25
μg/mlとほぼ一致する（ディスク法でも２倍程度の差は
日常的に生じる）。ディスク法の場合、培養開始時の菌
濃度は厳しく規定されており、データは示さないが、隣
接プローブ法と同等の濃度でディスク法の試験をする
と、即ち初発菌濃度を107/ml以上にあげると、見かけ上
のMIC が増加するか、もしくは全く測定できなくなって
しまう。また、他の薬剤を用いた場合でも、あるいはア
クチノバチルス・プレロニューモニエの他の菌株を用い
た試験でも同様の結果が得られている。初発菌濃度を一
定範囲以内に収め再現性のあるMIC値を求める方法は熟
練を必要とするが、本方法を用いれば、試験当日内に容
易に再現性のあるデータを得ることができる。また、無
菌操作の必要がないことも操作性をよくする一因であ
る。
【００５６】実施例１４ 隣接プローブ法を用いたアク
チノバチルス・プレロニューモニエの薬剤感受性試験−
その２ OTC及びカナマイシン（KM）を用い、アクチノバチルス
・プレロニューモニエの代表的菌種で隣接プローブ法の
試験を行なった。隣接ハイブリダイゼーション法は実施
例１に準じた。吸光度の結果を表１６及び表１７に示
す。なお、表１５同様、薬剤なしの検出値を100 ％とし
た。
チノバチルス・プレロニューモニエの薬剤感受性試験−
その２ OTC及びカナマイシン（KM）を用い、アクチノバチルス
・プレロニューモニエの代表的菌種で隣接プローブ法の
試験を行なった。隣接ハイブリダイゼーション法は実施
例１に準じた。吸光度の結果を表１６及び表１７に示
す。なお、表１５同様、薬剤なしの検出値を100 ％とし
た。
【００５７】
【表１６】 カナマイシン 菌株名 NB001 D-1-01 HA429 S1536 Hi-1 ディスク法 でのMIC 6.3-12.5 1.6-3.2 3.2-6.3 12.5-25 6.3-8.3 (μg/ml) 最初の菌濃度 4.7 36.0 14.0 57.0 7.4 (x108/ml) 薬剤濃度 (μg/ml) 0.00 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 0.20 101 109 109 103 104 0.39 104 56 126 108 99 0.78 104 79 107 110 108 1.56 102 31 99 110 107 3.13 101 7 45 73 50 6.25 73 1 12 57 9 12.50 5 0 8 44 4 25.00 5 0 2 23 2 50.00 2 0 0 19 2 100.00 4 1 0 17 4 MIC 1/3(*) 12.5 3.13 6.25 25.0 6.25 (μg/ml) (*) MIC 1/3 ：薬剤なしに比べ値が３分の１以下になる濃度
【００５８】
【表１７】 オキシテトラサイクリン 菌株名 NB001 D-1-01 HA429 S1536 Hi-1 ディスク法 でのMIC 0.2-0.4 6.25-12.5 0.8-1.6 0.2-0.4 6.25-12.5 (μg/ml) 最初の菌濃度 4.7 36.0 14.0 57.0 7.4 (x108/ml) 薬剤濃度 (μg/ml) 0.00 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 0.20 70 98 94 3 104 0.39 20 59 83 1 99 0.78 6 68 51 0 55 1.56 3 68 15 0 62 3.13 1 55 4 1 59 6.25 0 22 3 3 31 12.50 0 10 0 0 8 25.00 0 12 2 0 3 50.00 0 12 1 0 1 100.00 0 5 0 2 0 MIC 1/3(*) 0.20-0.39 3.13-6.25 0.78-1.56 <0.2 6.25-12.5 (μg/ml) (*) MIC 1/3 ：薬剤なしに比べ値が３分の１以下になる濃度
【００５９】表１６、１７に示されるように、ディスク
法と隣接プローブ法で求めたMIC値はほぼ一致してお
り、隣接プローブ法が従来法と整合性を持っていること
を示している。また、従来法では、菌の同定を他の生化
学的試験などで行なった後に薬剤感受性試験を行なうた
めに、普通には４日以上かけて試験を行っているが、本
隣接プローブ法では菌の同定と薬剤感受性試験を同時
に、かつ１日で測定できるため、従来の方法と比較して
大幅な試験期間の短縮となる。
法と隣接プローブ法で求めたMIC値はほぼ一致してお
り、隣接プローブ法が従来法と整合性を持っていること
を示している。また、従来法では、菌の同定を他の生化
学的試験などで行なった後に薬剤感受性試験を行なうた
めに、普通には４日以上かけて試験を行っているが、本
隣接プローブ法では菌の同定と薬剤感受性試験を同時
に、かつ１日で測定できるため、従来の方法と比較して
大幅な試験期間の短縮となる。
【００６０】実施例１５ S. aureus のメチシリン感受
性試験 アクチノバチルス・プレロニューモニエ同様、薬剤の段
階希釈による液体培養法で行なった。一晩培養した寒天
培地（感受性ブイヨン）上の黄色ブドウ状球菌コロニー
をつまようじで拾い、感受性ブイヨン液体培地1mlに入
れ15分放置した。得られた菌の懸濁液を感受性ブイヨン
液体培地で適当に希釈し試験に供した。また、生菌数測
定のため10μlの懸濁液をとり適当に希釈し感受性ブイ
ヨン寒天培地に塗抹、37℃、一晩培養した。メチシリン
を200μg/mlになるように感受性ブイヨン液体培地に溶
解し、２倍希釈系列を作り、96穴マイクロタイタープレ
ートに50μlずつ分注した。これに適当に希釈した菌懸
濁液50μlを加えた。37℃で3-6時間培養した後、各穴に
アルカリ変性液12.5μlを加え混合し、10分放置した
後、中和液12.5μlを加えた。得られた溶菌液を隣接プ
ローブ法に供した。標識プローブとして、配列番号３３
のＤＮＡを、捕捉プローブとして、配列番号３４のＤＮ
Ａを用いた。結果を表１８に示す。なお、表１５同様、
薬剤なしの検出値を100 ％とした。
性試験 アクチノバチルス・プレロニューモニエ同様、薬剤の段
階希釈による液体培養法で行なった。一晩培養した寒天
培地（感受性ブイヨン）上の黄色ブドウ状球菌コロニー
をつまようじで拾い、感受性ブイヨン液体培地1mlに入
れ15分放置した。得られた菌の懸濁液を感受性ブイヨン
液体培地で適当に希釈し試験に供した。また、生菌数測
定のため10μlの懸濁液をとり適当に希釈し感受性ブイ
ヨン寒天培地に塗抹、37℃、一晩培養した。メチシリン
を200μg/mlになるように感受性ブイヨン液体培地に溶
解し、２倍希釈系列を作り、96穴マイクロタイタープレ
ートに50μlずつ分注した。これに適当に希釈した菌懸
濁液50μlを加えた。37℃で3-6時間培養した後、各穴に
アルカリ変性液12.5μlを加え混合し、10分放置した
後、中和液12.5μlを加えた。得られた溶菌液を隣接プ
ローブ法に供した。標識プローブとして、配列番号３３
のＤＮＡを、捕捉プローブとして、配列番号３４のＤＮ
Ａを用いた。結果を表１８に示す。なお、表１５同様、
薬剤なしの検出値を100 ％とした。
【００６１】
【表１８】菌株名 ATCC25923 Y-2 Y-13 No.330 No.403 メチシリン 耐性 - - - + + 薬剤濃度 (μg/ml) 0.00 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 0.20 113 81 77 74 119 0.39 92 63 72 85 102 0.78 111 56 85 64 97 1.56 61 57 67 69 88 3.13 24 37 74 57 94 6.25 15 4 8 52 82 12.50 7 4 3 47 93 25.00 2 5 2 41 95 50.00 8 8 3 62 90 100.00 7 5 5 63 95 MIC 1/3(*) 1.56-3.13 3.13-6.25 3.13-6.25 >100 >100 (μg/ml) (*) MIC 1/3 ：薬剤なしに比べ値が３分の１以下になる濃度
【００６２】表１８に示されるように、メチシリン耐性
菌と感受性菌がはっきり識別されている。本実施例にお
いて隣接プローブ法で得られたMIC 値は、ディスク法の
試験結果とほぼ一致しており、アクチノバチルス・プレ
ロニューモニエの場合と同様隣接プローブ法が従来法と
整合性を持っていることを示している。
菌と感受性菌がはっきり識別されている。本実施例にお
いて隣接プローブ法で得られたMIC 値は、ディスク法の
試験結果とほぼ一致しており、アクチノバチルス・プレ
ロニューモニエの場合と同様隣接プローブ法が従来法と
整合性を持っていることを示している。
【００６３】実施例１６ 隣接プローブ法を用いたＭＲ
ＳＡと緑膿菌の薬剤感受性試験−混合培養試験 隣接プローブ法を薬剤感受性試験に応用する場合、最も
その効果を発揮するのは複数の細菌の混合培養系であろ
う。例えば、臨床検体から病原菌の特定と薬剤感受性試
験を行なうためには一旦分離培養し同定試験を行なった
後にディスク法などで薬剤感受性試験を行なうが、本発
明の方法では、必ずしも分離培養を行なう必要はなく、
検体を直接液体培養などで、抗菌薬剤を添加して培養
し、菌の同定と薬剤感受性を同時かつ迅速に行なうこと
ができる。また、抗菌薬剤といっても、菌によって効果
が異なり、通常は複数の薬剤を投与することが多い。そ
のためには複数の菌（一例としてＭＲＳＡと緑膿菌）を
同時に培養し、単独もしくは複数の薬剤投与でその効果
を調べるなどの必要が出てくるが、このような系ではデ
ィスク法は使えず、現状では培養液中の各菌の個数を分
離培養後、何らかの方法で識別した後にその個数を数え
るなどの厄介な工夫が必要である。本発明の方法ではこ
のような問題はなく、単独培養系と全く同じシステムで
試験を行なうことができる。これを立証するため、抗菌
薬剤としてバンコマイシンを用い緑膿菌とＭＲＳＡの混
合培養による薬剤感受性試験を行なった。緑膿菌（ATCC
9721）とＭＲＳＡ（No.403）の一晩培養液を感受性ブイ
ヨン培地にそれぞれ1000倍に希釈し、バンコマイシンの
２倍希釈系列下で、混合もしくは単独で37℃、６時間培
養した。なお、隣接ハイブリダイゼーション法は実施例
１５に準じた。結果を表１９に示す。
ＳＡと緑膿菌の薬剤感受性試験−混合培養試験 隣接プローブ法を薬剤感受性試験に応用する場合、最も
その効果を発揮するのは複数の細菌の混合培養系であろ
う。例えば、臨床検体から病原菌の特定と薬剤感受性試
験を行なうためには一旦分離培養し同定試験を行なった
後にディスク法などで薬剤感受性試験を行なうが、本発
明の方法では、必ずしも分離培養を行なう必要はなく、
検体を直接液体培養などで、抗菌薬剤を添加して培養
し、菌の同定と薬剤感受性を同時かつ迅速に行なうこと
ができる。また、抗菌薬剤といっても、菌によって効果
が異なり、通常は複数の薬剤を投与することが多い。そ
のためには複数の菌（一例としてＭＲＳＡと緑膿菌）を
同時に培養し、単独もしくは複数の薬剤投与でその効果
を調べるなどの必要が出てくるが、このような系ではデ
ィスク法は使えず、現状では培養液中の各菌の個数を分
離培養後、何らかの方法で識別した後にその個数を数え
るなどの厄介な工夫が必要である。本発明の方法ではこ
のような問題はなく、単独培養系と全く同じシステムで
試験を行なうことができる。これを立証するため、抗菌
薬剤としてバンコマイシンを用い緑膿菌とＭＲＳＡの混
合培養による薬剤感受性試験を行なった。緑膿菌（ATCC
9721）とＭＲＳＡ（No.403）の一晩培養液を感受性ブイ
ヨン培地にそれぞれ1000倍に希釈し、バンコマイシンの
２倍希釈系列下で、混合もしくは単独で37℃、６時間培
養した。なお、隣接ハイブリダイゼーション法は実施例
１５に準じた。結果を表１９に示す。
【００６４】
【表１９】培養 MRSA単独 緑膿菌単独 MRSA+緑膿菌 薬剤 濁度 M P 濁度 M P 濁度 M P 濃度 (μg/ml) 0.00 0.080 0.688 0.006 0.027 0.005 0.836 0.094 0.189 0.872 0.20 0.045 0.264 0.014 0.034 0.012 0.550 0.052 0.090 0.744 0.39 -0.003 0.015 0.002 0.025 0.002 0.638 0.036 0.003 0.742 0.78 0.004 0.011 0.003 0.039 0.003 0.666 0.040 0.008 0.782 1.56 0.001 0.005 0.004 0.039 0.000 0.516 0.040 0.002 0.686 3.13 0.003 0.004 0.002 0.038 0.000 0.454 0.046 0.001 0.642 6.25 0.000 0.012 0.008 0.033 0.004 0.418 0.038 0.007 0.502 濁度：培養液のOD660nm M ：S. aureus 検出用プローブを用いた検出値 P ：緑膿菌検出用プローブを用いた検出値
【００６５】表１９の結果から、混合培養においても、
それぞれの菌の生育状態を独立して検出することができ
る。また、ＭＲＳＡの場合、全般に生育は阻害されるも
のの薬剤耐性の異種の菌が混在していても感受性の度合
には影響がない。一方緑膿菌の場合は、ＭＲＳＡが混在
していてもほとんど影響がない、などとといった事実が
見出されるが、前述したように、従来の方法ではこのよ
うな混合培養系での個々の菌の生育状態を追跡するのは
容易ではない。
それぞれの菌の生育状態を独立して検出することができ
る。また、ＭＲＳＡの場合、全般に生育は阻害されるも
のの薬剤耐性の異種の菌が混在していても感受性の度合
には影響がない。一方緑膿菌の場合は、ＭＲＳＡが混在
していてもほとんど影響がない、などとといった事実が
見出されるが、前述したように、従来の方法ではこのよ
うな混合培養系での個々の菌の生育状態を追跡するのは
容易ではない。
【００６６】実施例１７ 大腸菌プラスミド（pUC118)
にコードされるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の検出 大腸菌菌株は、JM109 株及び本株をプラスミドpUC118で
形質転換したものを用いた。検出する遺伝子は、大腸菌
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、その一部がpUC1
18に含まれているものである。配列番号３６で示される
ＤＮＡをマイクロタイタープレートに固定し、配列番号
３５で示されるＤＮＡをジゴキシゲニンで標識し、ハイ
ブリダイゼーションに供した。いずれもpUC118に含まれ
るβ−ガラクトシダーゼ部分遺伝子から転写されるｍＲ
ＮＡの逆相補鎖であり、配列番号３６のＤＮＡは該ｍＲ
ＮＡで配列番号３５のＤＮＡの３’側に隣接してハイブ
リダイズする。ＬＢ培地で一晩培養した培養液を、新し
いＬＢ培地に1/100 容加え、37℃、１時間培養する。こ
れにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（IPTG)を最終２ｍＭになるように加え、β−ガラクト
シダーゼを誘導、さらに37℃、１時間培養を続ける。な
お、pUC118で形質転換した大腸菌の培養にはアンピシリ
ンを50μg/mlになるように加えている。培養液に１N Ｎ
ａＯＨを1/8 容加え、37℃、10分処理後、実施例１に示
した方法に従い、検出試験を行った。結果を表２０に示
す。 配列番号３５： 5'-TAAGT TGGGT AACGC CAGGG T 配列番号３６： 5'-GGGAT GTGCT GCAAG GCGAT
にコードされるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現の検出 大腸菌菌株は、JM109 株及び本株をプラスミドpUC118で
形質転換したものを用いた。検出する遺伝子は、大腸菌
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、その一部がpUC1
18に含まれているものである。配列番号３６で示される
ＤＮＡをマイクロタイタープレートに固定し、配列番号
３５で示されるＤＮＡをジゴキシゲニンで標識し、ハイ
ブリダイゼーションに供した。いずれもpUC118に含まれ
るβ−ガラクトシダーゼ部分遺伝子から転写されるｍＲ
ＮＡの逆相補鎖であり、配列番号３６のＤＮＡは該ｍＲ
ＮＡで配列番号３５のＤＮＡの３’側に隣接してハイブ
リダイズする。ＬＢ培地で一晩培養した培養液を、新し
いＬＢ培地に1/100 容加え、37℃、１時間培養する。こ
れにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（IPTG)を最終２ｍＭになるように加え、β−ガラクト
シダーゼを誘導、さらに37℃、１時間培養を続ける。な
お、pUC118で形質転換した大腸菌の培養にはアンピシリ
ンを50μg/mlになるように加えている。培養液に１N Ｎ
ａＯＨを1/8 容加え、37℃、10分処理後、実施例１に示
した方法に従い、検出試験を行った。結果を表２０に示
す。 配列番号３５： 5'-TAAGT TGGGT AACGC CAGGG T 配列番号３６： 5'-GGGAT GTGCT GCAAG GCGAT
【００６７】
【表２０】 β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写産物（mRNA) の検出 ────────────────────────── 菌株 IPTG 吸光度(A655) ────────────────────────── JM109 − 0.011 ＋ 0.021 ────────────────────────── JM109 − 0.018 pUC118形質転換株 ＋ 0.177 ──────────────────────────
【００６８】pUC118は細胞内のコピー数が1,000 以上と
非常に多コピーであり、転写産物も単一遺伝子の場合に
比べ、多く生産されているものと思われる。また、転写
誘導をかけない状態では検出値がバックグラウンドレベ
ルであることから、本実施例の方法ではプラスミドＤＮ
Ａは検出されていないことがわかる。従って、誘導をか
けた形質転換株で得られた検出値は細胞内のｍＲＮＡレ
ベルを反映しているものと考えられる。
非常に多コピーであり、転写産物も単一遺伝子の場合に
比べ、多く生産されているものと思われる。また、転写
誘導をかけない状態では検出値がバックグラウンドレベ
ルであることから、本実施例の方法ではプラスミドＤＮ
Ａは検出されていないことがわかる。従って、誘導をか
けた形質転換株で得られた検出値は細胞内のｍＲＮＡレ
ベルを反映しているものと考えられる。
【００６９】実施例１８ 以下の成分を含む、５００検体分のキットを作成した。 ─────────────────────────────────── 変性液 １Ｍ水酸化ナトリウム水溶液 ５ml 中和液 １Ｍ塩酸／０．２Ｍリン酸緩衝液 ５ml 検出用プレート 捕捉プローブＤＮＡ（１μg/ウエル）を 固定したプレート ハイブリダイゼーション緩衝液 表２に記載のもの １０ml 酵素抗体 抗Ｄｉｇ抗体−パーオキシダーゼ （ベーリンガー・マンハイム社製） 0.5 ml 酵素抗体希釈液 実施例１記載のもの ５０ml 酵素基質溶液 Ａ液 実施例１記載のもの ２５ml 酵素基質溶液 Ｂ液 実施例１記載のもの ２５ml 洗浄液 実施例１記載のもの １０００ml ジゴキシデニン標識プローブ ＤＮＡ １０μｇ ───────────────────────────────────
【００７０】
【発明の効果】本発明の方法によれば、ＲＮＡを迅速・
簡便に検出することができる。またこれを利用して、生
物種の同定・検出を従来法と比較してはるかに迅速・簡
便に行うことができる。さらにまた本発明の方法は異種
の菌が混在していても感受性の度合に影響がないので、
細菌の薬剤感受性を迅速・簡便に調べることができる。
簡便に検出することができる。またこれを利用して、生
物種の同定・検出を従来法と比較してはるかに迅速・簡
便に行うことができる。さらにまた本発明の方法は異種
の菌が混在していても感受性の度合に影響がないので、
細菌の薬剤感受性を迅速・簡便に調べることができる。
【００７１】
配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCAT GTCGC CATCT TGCTT CCCT 24
【００７２】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTAG ACGTA CTTTG TGAGA TTTGC 25
【００７３】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCTT CCCGT TACCG TT 17
【００７４】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACTC GTCGG CAAAG AAAGC AAGCT 25
【００７５】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCACC AGACT CACAG TCCAA T 21
【００７６】配列番号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCCA AATCG ACAGC GTTTA CAGCG 25
【００７７】配列番号：７ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGTC AGCAA AGAAG CAAGC TTCTT CCTG 29
【００７８】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTAC TCACC CGTCC GCCAC 20
【００７９】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCC CAACG GCTAG TCGAC 20
【００８０】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCGC CACTA AGATC TCAAG 20
【００８１】配列番号：１１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTTC CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA 25
【００８２】配列番号１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGATA TTAGC CCGTG CCGTT T 21
【００８３】配列番号：１３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCC TGCCA AAAGT GCTTT CCAA 24
【００８４】配列番号：１４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCTG CCAAA AGTGC TTTCC AA 22
【００８５】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA 20
【００８６】配列番号：１６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCT TTCCT GCCAA AAGTG CTTTC CAA 28
【００８７】配列番号：１７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTTT CTTTC CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA 30
【００８８】配列番号：１８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTGC CGTTT CTTTC CTGCC AAAAG TGCTT TCCAA 35
【００８９】配列番号：１９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCA CCTAC GTGTC AGC 18
【００９０】配列番号：２０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCA GCTCC ATGAG TAAAT CA 22
【００９１】配列番号：２１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGG AACAC ACACC TACAC G 21
【００９２】配列番号：２２ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGTT AAAGT GAACC GGATT TA 22
【００９３】配列番号：２３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATTC AAAGG AGCCT TCAAG CTTCA CCAAG 30
【００９４】配列番号：２４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAACT AATGT TGCGC ACCCC CATTT 25
【００９５】配列番号：２５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGATG CTATC TATTT AACTT CATC 24
【００９６】配列番号：２６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTTC CTCAT TACCG AAAGA ACTTT 25
【００９７】配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCTGA GCTCT TCTTA GGATG 20
【００９８】配列番号：２８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCAAG AGTAG GTAAG GTTCT TC 22
【００９９】配列番号：２９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCAAG CTCGC ACTCT CGCTG CCCT 24
【０１００】配列番号：３０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核
酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTAG ATGCA CTTTC TGAGA TTCGC 25
酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTAG ATGCA CTTTC TGAGA TTCGC 25
【０１０１】配列番号：３１配列の長さ：２３配列の
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列TCTAG AGTTG TCAAA GGAT
G TCA 23
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列TCTAG AGTTG TCAAA GGAT
G TCA 23
【０１０２】配列番号：３２配列の長さ：２０配列の
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列CCGAA GGGGA AGGCT CTAT
C 20
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列CCGAA GGGGA AGGCT CTAT
C 20
【０１０３】配列番号：３３配列の長さ：２１配列の
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GAGAC AACAT TTTCG ACTA
C A 21
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GAGAC AACAT TTTCG ACTA
C A 21
【０１０４】配列番号：３４配列の長さ：２１配列の
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GTACT CAGGA TCCAC TCAA
G A 21
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GTACT CAGGA TCCAC TCAA
G A 21
【０１０５】配列番号：３５配列の長さ：２１配列の
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列TAAGT TGGGT AACGC CAGG
G T 21
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列TAAGT TGGGT AACGC CAGG
G T 21
【０１０６】配列番号：３６配列の長さ：２０配列の
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GGGAT GTGCT GCAAG GCGA
T 20
型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種
類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GGGAT GTGCT GCAAG GCGA
T 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三瀬 静男 神奈川県厚木市森の里４−25−８ (72)発明者 種田 貴至 千葉県山武郡山武町椎崎968−18 (72)発明者 阪野 哲也 千葉県佐倉市宮前２−19−６
Claims (20)
- 【請求項１】 ２種の核酸プローブを用いたＲＮＡの検
出方法において、被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的
な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又は
ＲＮＡと、被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在
する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又
はＲＮＡを用意し、一方を捕捉プローブとして担体に固
定し、他方を標識物質で標識して標識プローブとし、被
検ＲＮＡを含む試料及び標識プローブを該担体に固定さ
れた捕捉プローブと接触させて被検ＲＮＡに捕捉プロー
ブと標識プローブをハイブリダイズさせ、被検ＲＮＡに
結合した標識プローブの標識物質を検出することにより
被検ＲＮＡの存在を検出することを特徴とするＲＮＡの
検出方法。 - 【請求項２】 部分配列（Ｂ）の３’末端と部分配列
（Ａ）の５’末端が、あるいは部分配列（Ｂ）の５’末
端と部分配列（Ａ）の３’末端が完全に隣接しているこ
とを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 部分配列（Ａ）と（Ｂ）が離れていて、
部分配列（Ｂ）の３’末端と部分配列（Ａ）の５’末
端、あるいは部分配列（Ｂ）の５’末端と部分配列
（Ａ）の３’末端の距離が５塩基以内であることを特徴
とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 部分配列（Ｂ）の３’末端配列と部分配
列（Ａ）の５’末端配列、あるいは部分配列（Ｂ）の
５’末端配列と部分配列（Ａ）の３’末端配列が重複し
ていて、該重複部分が５塩基未満であることを特徴とす
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 標識物質が、ジゴキシゲニン又はビオチ
ンである請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 ジゴキシゲニン又はビオチンを、抗ジゴ
キシゲニン抗体−酵素複合体又はビオチン−アビジン−
酵素複合体を用いて検出する請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 ＲＮＡが、細菌ＲＮＡである請求項１記
載の方法。 - 【請求項８】 ＲＮＡが、細菌リボゾームＲＮＡである
請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 ２種の核酸プローブを用いた生物種の検
出方法において、該生物種のリボゾームＲＮＡの塩基配
列のうち、特異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆
相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと、該リボゾームＲＮＡ上で部
分配列（Ａ）の近傍に存在する１０塩基以上の部分配列
（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを用意し、一方を捕
捉プローブとして担体に固定し、他方を標識物質で標識
して標識プローブとし、該生物種を含む試料及び標識プ
ローブを該担体に固定された捕捉プローブと接触させて
該リボゾームＲＮＡに捕捉プローブと標識プローブをハ
イブリダイズさせ、該リボゾームＲＮＡに結合した標識
プローブの標識物質を検出することにより該生物種の存
在を検出することを特徴とする生物種の検出方法。 - 【請求項１０】 生物種が細菌である請求項９記載の方
法。 - 【請求項１１】 細菌が、大腸菌、スタフィロコッカス
属細菌、パスツレラ・マルトシダ、ボルデテラ・ブロン
キセプチカ、アクチノバチルス・プレロニューモニエ、
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、サルモネラ及び
緑膿菌からなる群から選ばれる請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである
請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 下記の成分を含む、請求項１記載の方
法に使用するためのＲＮＡ検出用キット。 (イ) 被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを固定
化した担体； (ロ) 被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項１４】 下記の成分を含む、請求項１記載の方
法に使用するためのＲＮＡ検出用キット。 (イ) 被検ＲＮＡの塩基配列のうち、特異的な１０塩基以
上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであっ
て、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲＮＡ； (ロ) 被検ＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存在する１
０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ又はＲＮ
Ａを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項１５】 下記の成分を含む、請求項９記載の方
法に使用するための生物種の同定・検出用キット。 (イ) 該生物種のリボゾームＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡを固定化した担体； (ロ) 該リボゾームＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存
在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又は
ＲＮＡ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項１６】 下記の成分を含む、請求項９記載の方
法に使用するための生物種の同定・検出用キット。 (イ) 該生物種のリボゾームＲＮＡの塩基配列のうち、特
異的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又は
ＲＮＡ； (ロ) 該リボゾームＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近傍に存
在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖ＤＮＡ
又はＲＮＡを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項１７】 生物種が細菌である請求項１５又は１
６記載のキット。 - 【請求項１８】 さらに溶菌液を含む請求項１７記載の
キット。 - 【請求項１９】 下記の成分を含む、請求項１２記載の
方法に使用するためのメッセンジャーＲＮＡの同定・検
出用キット。 (イ) 被検メッセンジャーＲＮＡの塩基配列のうち、特異
的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又
はＲＮＡを固定化した担体； (ロ) 被検メッセンジャーＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近
傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖
ＤＮＡ又はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮ
Ａ又はＲＮＡ； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。 - 【請求項２０】 下記の成分を含む、請求項１２記載の
方法に使用するためのメッセンジャーＲＮＡの同定・検
出用キット。 (イ) 被検メッセンジャーＲＮＡの塩基配列のうち、特異
的な１０塩基以上の部分配列（Ａ）の逆相補鎖ＤＮＡ又
はＲＮＡであって、標識物質で標識されたＤＮＡ又はＲ
ＮＡ； (ロ) 被検メッセンジャーＲＮＡ上で部分配列（Ａ）の近
傍に存在する１０塩基以上の部分配列（Ｂ）の逆相補鎖
ＤＮＡ又はＲＮＡを固定化した担体； (ハ) 標識物質を検出するための試薬；及び (ニ) ハイブリダイゼーション溶液。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP06146794A JP3746083B2 (ja) | 1993-05-28 | 1994-03-30 | 隣接する２種の核酸プローブを用いたｒｎａの検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12753793 | 1993-05-28 | ||
| JP5-127537 | 1993-05-28 | ||
| JP06146794A JP3746083B2 (ja) | 1993-05-28 | 1994-03-30 | 隣接する２種の核酸プローブを用いたｒｎａの検出方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0739398A true JPH0739398A (ja) | 1995-02-10 |
| JP3746083B2 JP3746083B2 (ja) | 2006-02-15 |
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ID=26402499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06146794A Expired - Lifetime JP3746083B2 (ja) | 1993-05-28 | 1994-03-30 | 隣接する２種の核酸プローブを用いたｒｎａの検出方法 |
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001501470A (ja) * | 1996-09-26 | 2001-02-06 | ダイナル エイエス | 核酸に基づくアッセイにおけるプローブまたはプライマーとしてのモジュラーオリゴヌクレオチドの使用 |
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| EP1464710A3 (en) * | 2003-04-02 | 2004-12-22 | Canon Kabushiki Kaisha | Infectious etiologic agent detection probe and probe set, carrier, and genetic screening method |
-
1994
- 1994-03-30 JP JP06146794A patent/JP3746083B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001501470A (ja) * | 1996-09-26 | 2001-02-06 | ダイナル エイエス | 核酸に基づくアッセイにおけるプローブまたはプライマーとしてのモジュラーオリゴヌクレオチドの使用 |
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| EP2116617A3 (en) * | 2000-09-26 | 2010-01-20 | Boston Probes, Inc. | Probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection, identification and/or enumeration of bacteria |
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