JPH0739400A - オリゴヌクレオチドを用いる植物品種の識別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＧＣ含量が５０％以上８０％以下で、かつ
８個以上１５個以下のヌクレオチドからなるオリゴヌク
レオチオドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼチ
ェイン反応により植物のミトコンドリアＤＮＡを増幅
し、該増幅ミトコンドリアＤＮＡを電気泳動にて分離
後、増幅ミトコンドリアＤＮＡの視覚検出を行なうこと
を特徴とする植物品種の識別方法および上記と同様に増
幅ミトコンドリアＤＮＡの視覚検出を行なうことによ
り、ミトコンドリアＤＮＡ由来の形質の有無を検定し、
該形質を有する植物を選び出すことを特徴とする植物の
選抜方法。 【効果】 本発明は、ある種のオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いて、ポリメラーゼチェイン反応に
よりミトコンドリアＤＮＡを増幅させることによって、
ミトコンドリアＤＮＡの差異に基づた植物の品種識別を
より簡便にかつ効率よく行なうことができる効果を有す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチドを
用いる植物品種の識別方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生物の形質を支配している遺伝子は、大
部分は核に存在するが、細胞質にも遺伝情報は存在し、
植物では葉緑体やミトコンドリアなどの細胞内小器官が
遺伝子をもっており、それぞれ特有の形質を支配してい
る。特に雄性不稔性や病虫害抵抗性、環境ストレス耐
性、増収性など、農業上重要な形質を支配する遺伝子が
ミトコンドリアに多く存在するのでその利用が検討され
ている。従来、植物品種の識別方法として、たとえば病
虫害抵抗性、環境ストレス耐性等の差異による方法やア
イソザイム等のタンパク質レベルの差異による方法が知
られている。一方、最近では、ＲＦＬＰ法（Restrictio
n Fragment Length Polymorphism)による植物品種の識
別方法が、たとえば Kesseliら、GENOME、第34巻、第 4
30頁から第 436頁（1991年）、H.Ichikawaら、THEORETI
CAL AND APPLIED GENETICS、第７７号、第３９頁から第
４３頁（１９８９年）等に記載されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、病虫害
抵抗性、環境ストレス耐性等の差異による方法では、実
際に前記の形質について調査可能になるまで栽培し、そ
の品種の特徴を調査するしかなかった。このため、大規
模な栽培施設や労力が要求され、栽培期間に相当する時
間がかかることになる。また、アイソザイム等のタンパ
ク質レベルの差異による方法では、品種を識別するのに
十分な差異が得られにくく、また経験や労力を要する。
一方、ＲＦＬＰ法による識別方法では、ＤＮＡの制限酵
素処理、サザンブロットハイブリダイゼーション（標識
ＤＮＡプローブとのハイブリッド形成）等に非常に労力
がかかる。特にミトコンドリアＤＮＡの場合、ゲノムＤ
ＮＡに比べて極少量しか存在しないため、ＲＦＬＰ法を
用いた、視覚検出による識別を行うためには多量の材料
が要求された。したがって、農業上重要な形質を支配す
るミトコンドリアＤＮＡの差異に基づいた植物品種のよ
り簡便なかつ効率よい識別方法の開発が待ち望まれてい
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況を鑑み、よりすぐれた植物品種の識別方法を見出すべ
く鋭意検討を重ねた結果、ある種のオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いて、ポリメラーゼチェイン反応
によりミトコンドリアＤＮＡを増幅させることによっ
て、ミトコンドリアＤＮＡの差異に基づいた植物品種の
より簡便なかつ効率よい識別方法を見い出し、本発明を
完成した。すなわち、本発明は、ＧＣ含量が５０％以上
８０％以下で、かつ８個以上１５個以下のヌクレオチド
からなるオリゴヌクレオチオドをプライマーとして用い
て、ポリメラーゼチェイン反応により植物のミトコンド
リアＤＮＡを増幅し、該増幅ミトコンドリアＤＮＡを電
気泳動にて分離後、増幅ミトコンドリアＤＮＡの視覚検
出を行なうことを特徴とする植物品種の識別方法（以
下、本発明識別方法と記す。）および上記と同様に増幅
ミトコンドリアＤＮＡの視覚検出を行なうことにより、
ミトコンドリアＤＮＡ由来の形質の有無を検定し、該形
質を有する植物を選び出すことを特徴とする植物の選抜
方法（以下、本発明選抜方法と記す。）を提供するもの
である。

【０００５】本発明は、たとえば、品種の純度検定、保
存中における変異株のチェック、係争裁定および母親鑑
定等においてきわめて有用である。すなわち、対象植物
を充分成長するまでの長期間栽培して所期の品種である
か否かを検定する手間を省略して、前記の対象植物の種
子、幼植物または培養細胞等の段階で直ちに所期の品種
であるか否かの検定を行なうことが可能であり、これは
品種の純度検査において検査の迅速・簡素化、保存中に
おける変異株のチェックにおいて原原種生産・遺伝種子
資源の保存状態の検査の迅速・簡素化、登録品種の権利
侵害があった場合の係争裁定において栽培環境等で変化
しない等の高度な証拠の提出の迅速化および母親鑑定に
おいて遺伝資源探索および純系あるいはＦ１品種の親系
統育成による品種改良の効率化、低コスト化になる。

【０００６】本発明で用いられるミトコンドリアＤＮＡ
は、たとえばL.R.DeBonte らの方法（Plant Mol. Biol.
Rep. 3:32-36(1985))によって調製することができる。
具体的には、たとえば、供試植物の培養細胞由来のプロ
トプラストを緩衝液中で細胞膜破壊を行う。該破壊物を
遠心分離によりミトコンドリア画分を回収し、これにＤ
Ｎａｓｅを処理することにより混在ゲノムＤＮＡを除去
する。精製ミトコンドリア画分にプロティナーゼを処理
してミトコンドリア膜を消化した後、フェノールとクロ
ロホルムで抽出を行い、得られたミトコンドリアＤＮＡ
とＲＮＡの混和物にＲＮａｓｅを処理する。再びフェノ
ールとクロロホルムで抽出を行うことによりミトコンド
リアＤＮＡを得る方法をあげることができる。

【０００７】本発明で用いられるオリゴヌクレオチド
は、ＧＣ含量が５０％以上８０％以下で、かつ８個以上
１５個以下のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチオ
ドである。たとえば、下記の配列群から選ばれる配列か
らなるオリゴヌクレオチオド等をあげることができる。 配列群 (1) 5'−ＴＡＣＧＧＣＴＡＧＡ−3'（以下、配列番号１
と記す。） (2) 5'−ＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧ−3'（以下、配列番号２
と記す。） (3) 5'−ＡＧＴＣＣＴＡＴＧＣ−3'（以下、配列番号３
と記す。） (4) 5'−ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡ−3'（以下、配列番号４
と記す。） (5) 5'−ＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴ−3'（以下、配列番号５
と記す。） (6) 5'−ＧＴＧＧＴＣＡＡＡＣ−3'（以下、配列番号６
と記す。） (7) 5'−ＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡ−3'（以下、配列番号７
と記す。） (8) 5'−ＡＧＧＣＡＴＴＡＣＧ−3'（以下、配列番号８
と記す。） (9) 5'−ＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴ−3'（以下、配列番号９
と記す。） なお、本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、たと
えばβ−シアノエチルホスホアミダイト法やチオホスフ
ァイト法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって得
ることができる。

【０００８】本発明において植物のミトコンドリアＤＮ
Ａの増幅は、本発明で用いられるオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いて、ポリメラーゼチェイン反応に
より行なう。ポリメラーゼチェイン反応は、変性工程、
プライマーのアニーリング工程およびＤＮＡポリメラー
ゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイクルを繰り返
して行なう反応であり、たとえばSaiki ら、Science 、
第 230巻、第1350頁から第1354頁（1985年) やWilliams
ら、Nucleic Acids Research、第18巻、第22号、第6531
頁から第6535頁（1991年) 等に通常の方法が記載されて
いる。

【０００９】本発明において上記ポリメラーゼチェイン
反応として、たとえば、あらかじめ本発明で用いられる
オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩
基（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）および植物のミトコンド
リアＤＮＡを加えた約1.0mMから約4.0mM 、好ましくは
約1.5mM から約3.0mM の塩化マグネシウム等を含有する
増幅用緩衝液中で、約２０回から約５０回、好ましくは
約２５回から約４０回ＤＮＡ複製サイクルを繰り返して
行なうことをあげることができる。さらに、ポリメラー
ゼチェイン反応における各工程は、たとえば下記の条件
等で行なうことができる。変性工程は、たとえば、通常
約９０℃から約９５℃、好ましくは約９４℃から約９５
℃で、約１分間から約３分間、好ましくは約１分間から
約２分間加熱することにより行なう。プライマーのアニ
ーリング工程は、たとえば、通常約３０℃から約５０℃
で、好ましくは約３７℃から約４７℃で、約１分間から
約３分間、好ましくは約１分間から約２分間プライマー
とインキュベートすることにより行なう。プライマーは
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドを単独で用い
る、または併用することができる。ＤＮＡポリメラーゼ
による伸長工程は、たとえば、通常約７０℃から約７３
℃、好ましくは約７２℃から約７３℃で、約１分間から
約４分間、好ましくは約２分間から約３分間耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理すること等により行なう。耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼとしては、たとえば、宝酒造株式会社
製の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の市販のものをあげる
ことができる。

【００１０】上記方法により得られた増幅ミトコンドリ
アＤＮＡは、通常ＤＮＡの分離に用いられる電気泳動法
によって分離される。一般には、1000塩基対以下の短か
いＤＮＡ断片の分離では、約３％から約２０％のポリア
クリルアミドゲルが、また、それ以上に長いＤＮＡの分
離では約 0.2％から約２％のアガロースゲルをあげるこ
とができる。好ましくは、約１％から約２％のアガロー
スゲルが適している。電気泳動に用いられる緩衝液とし
ては、Tris−リン酸系（pH7.5-8.0)、Tris−酢酸系（pH
7.5-8.0)、Tris−ホウ酸系（pH7.5-8.3)等があげられ、
好ましくはTris−酢酸系をあげることができる。また必
要に応じて、ＥＤＴＡ等を添加することもできる。電気
泳動の条件としては、たとえば、１００Ｖ、４０分間お
よび５０Ｖ、８０分間等をあげることができる。サイズ
マーカーとしては、ラムダＤＮＡを制限酵素Hind IIIに
よって完全加水分解したもの、たとえば、宝酒造株式会
社製の市販のものを用いることができる。

【００１１】本発明において増幅ミトコンドリアＤＮＡ
の視覚検出としては、たとえば、エチジウムブロミド等
のフェナントリジン系の色素で、かつ核酸と相互作用す
るような物質を用いる染色法によって、ＤＮＡを検出す
る方法をあげることができる。該染色法は、あらかじめ
電気泳動に用いられる緩衝液に、たとえば、終濃度とし
て約 0.5μg/mlのエチジウムブロミド等の物質を加えて
おくと、暗所で２５４nmまたは３６６nm等の紫外線をゲ
ルに照射することによって、電気泳動中でも、ＤＮＡと
エチジウムブロミドの結合体の赤色バンドを検出できる
が、通常、電気泳動終了後に、ゲルをエチジウムブロミ
ド等の物質の溶液に約１５分間から約６０分間浸してか
ら暗所で２５４nmまたは３６６nm等の紫外線をゲルに照
射することによって、ＤＮＡとエチジウムブロミドの結
合体の赤色バンドを検出する。結果、検出された増幅ミ
トコンドリアＤＮＡの存在有無によって植物品種を区別
することが可能となる。必要に応じて電気泳動によって
分離された各種サイズ（分子量）の増幅ミトコンドリア
ＤＮＡの存在有無を組み合せることによっても植物品種
を区別することができる。さらに、プライマーである本
発明で用いられるオリゴヌクレオチドを各種の組み合せ
により、より詳細で、正確な品種間の識別を可能にす
る。また同定の精度または品種間の識別能力をさらに高
める場合、プライマーのアニーリング工程の温度、反応
用緩衝液中のマグネシウム濃度等のポリメラーゼチェイ
ン反応の条件を変化させて同一な挙動を示すか否かを調
べることにより可能である。

【００１２】

【実施例】以下、実施例についてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。

【００１３】実施例１ （植物のミトコンドリアＤＮＡ
の抽出） ニンジン（Daucus carota L.）品種として、商品名：国
分鮮紅大長（以下、品種番号１と記す。）、商品名：長
太り金時（以下、品種番号２と記す。）、商品名：Impe
rater （以下、品種番号３と記す。）、商品名：高農鮮
紅三寸（以下、品種番号４と記す。）、商品名：Nantes
scarlet（以下、品種番号５と記す。）、商品名：菊陽
五寸（以下、品種番号６と記す。）を用いた。上記のニ
ンジン（Daucus carota L.）植物の各品種の播種７〜１
０日目の幼植物を各々３％次亜塩素酸ナトリウム水溶液
で滅菌後、無菌水で十分洗浄し、胚軸部分を約１ｃｍの
長さに切り取った。この胚軸を０．５ｍｇ／Ｌの２，４
−Ｄを含むＭＳ培地を０．８％（ｗｔ／ｖ）のアガロー
スで固めた固体培地に置床し、２５℃の温度で培養し
た。約１ヶ月後にカルスが形成された。このカルス約２
ｇを細分して０．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＭＳ培
地３０ｍｌに懸濁し、２５℃の温度で振盪培養した。細
胞密度が約１Ｘ１０⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時点
で、新しい前記培地に植継ぎ更に培養した。継代５日目
の培養細胞を遠心分離によって各品種のサスペンジョン
セルを得た。得られたサスペンジョンセル（生重量１０
ｇ）を５０ｍｌの１．０％（ｗｔ／ｖ）ドリセラーゼ、
０．５％（ｗｔ／ｖ）セルラーゼ、０．０１％（ｗｔ／
ｖ）ペクトリアーゼおよび０．１％（ｗｔ／ｖ）ＭＥＳ
〔２−（Ｎ−Morpholino)ethane-sulfonic acid,monohy
drate 〕を含む０．５Ｍマンニトール溶液に浮かべ、３
０℃で４時間酵素処理した。遊離してきたプロトプラス
トを遠心分離（６９０Ｘｇ、３分間）して集め、０．５
Ｍマンニトールで２回洗浄した。単離したプロトプラス
トを４０ｍｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−塩酸、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１％（ｗｔ／ｖ）ＢＳＡおよび０．３％（ｗｔ
／ｖ）２−メルカプトエタノールを含有する０．４Ｍソ
ルビトール溶液に懸濁し、氷上で２０分間インキュベー
トした。該懸濁物中に含まれるプロトプラストを１８ga
uge の針で１〜３回つつき、穏やかにプロトプラスト膜
を破壊した。プロトプラスト膜破砕物を３０００Ｘｇで
１０分間遠心分離し、核とプラスチッドを沈澱させた。
上清をとり、６０００Ｘｇで１０分間遠心分離し、プラ
スチッドとミトコンドリアの混合画分を沈澱させた。上
清を回収し、上記処理を１回繰り返した後、再び上清を
回収し、１５０００Ｘｇで１５分間遠心分離し、沈澱
（ミトコンドリア画分）を集めた。得られた沈澱を穏や
かにＤＮａｓｅ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ および０．３Ｍ
ショ糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で４℃で３０分間処理した。ＤＮａｓｅを取り
除くために、ミトコンドリア溶液を５ｍｌの０．０２Ｍ
ＥＤＴＡおよび０．６Ｍ ショ糖を含有する１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に上層し、１５
０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。得られた沈澱を１
００μｇのProteinase K、１％（ｗｔ／ｖ）Ｎ−lauryl
sarcosineおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３７℃、１
時間処理し、ミトコンドリア膜を消化した。これに、等
量のフェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール
（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を
加え、１５分間振とう混合した。該混合物を遠心分離
（１９４０Ｘｇ，１５分間）して得られる水層を回収し
て、これに再度、等量のフェノールとクロロホルム−イ
ソアミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコ
ール＝２４：１）を加え、１５分間振とう混合した。該
混合物を遠心分離（１９４０Ｘｇ，１５分間）して得ら
れる水層を回収して、２．５倍量のエタノールを加え、
数回振盪混合した。遠心分離（１９４０Ｘｇ，１５分
間）して得られた沈澱を回収後、該沈澱に７０％のエタ
ノールを加えて洗浄し、遠心分離（１９４０Ｘｇ，１５
分間）して得られた沈澱を減圧乾燥した。該沈澱に０．
４ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を加え、懸濁した。沈澱が完全に溶
解した後、２．５ユニットの RNase（ベーリンガーマン
ハイム社製）を加え、３７℃で、１時間インキュベート
した。さらに等量のフェノールとクロロホルム−イソア
ミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール
＝２４：１）を加え、１５分間振とう混合した。該混合
物を遠心分離（１２０００Ｘｇ、１５分間）して得られ
る水層を回収して、これに再度、等量のフェノールとク
ロロホルム−イソアミルアルコール（クロロホルム：イ
ソアミルアルコール＝２４：１）を加え、１５分間振と
う混合した。該混合物を遠心分離（１２０００Ｘｇ，１
５分間）して得られる水層を回収して、２．５倍量のエ
タノールを加え、数回振盪混合した。遠心分離（１９４
０Ｘｇ，１５分間）して得られた沈澱を回収後、該沈澱
に７０％のエタノールを加えて洗浄し、遠心分離（１９
４０Ｘｇ，１５分間）して得られた沈澱を減圧乾燥によ
りエタノールを除去して、ニンジン（Daucus carota
L.）植物の各種品種のミトコンドリアＤＮＡを約５〜１
０μｇ得た。

【００１４】実施例２ （配列番号１で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） あらかじめプライマーとして８０ピコモルの配列番号１
で示される配列からなるオリゴヌクレオチド（宝酒造株
式会社製委託合成物）、 2.5ユニットの耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造株式会社製） 1.0ナノモルの４種類
の各々塩基（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）および 0.02 μ
ｇの実施例１で得られた各種のニンジン（Daucus carot
a L.）品種のミトコンドリアＤＮＡを加えた0.01％（ｗ
ｔ／ｖ）ゲラチン、５０mMの塩化カリウム、 2.5mMの塩
化マグネシウムを含有する１０mMのTris−塩酸緩衝液(p
H8.3) 中で、ポリメラーゼチェイン反応を行なった。反
応液量は２０μｌとし、反応液の蒸発を防ぐために約２
０μｌのミネラルオイルを添加した。上記のポリメラー
ゼチェイン反応における各工程は下記の条件で行なっ
た。変性工程は９４℃で、５分間加熱し、プライマーの
アニーリング工程は４０℃で、２分間プライマーとイン
キュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は７
２℃で、３分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理する第１
サイクルを１回行なった後、変性工程は９４℃で、１分
間加熱し、プライマーのアニーリング工程は４０℃で、
２分間プライマーとインキュベートし、ＤＮＡポリメラ
ーゼによる伸長工程は７２℃で、３分間耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ処理する第２サイクルを４０回行ない、さら
に変性工程は９４℃で、１分間加熱し、プライマーのア
ニーリング工程は４１℃で、２分間プライマーとインキ
ュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は７２
℃で、１０分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理する第３
サイクルを１回行なう。得られた増幅ミトコンドリアＤ
ＮＡは、 1.5％アガロースゲルを用いて、１mMＥＤＴＡ
を含有する４０mM Tris−２０mM酢酸緩衝液(pH ８．
０) 中で、５０Ｖ、８０分間電気泳動して分離した。そ
の際にサイズマーカーとして宝酒造（株）製のｐＨＹ
ＤＮＡマーカーを用いた。分離終了後、ゲルを 0.5μg/
mlのエチジウムブロミド水溶液に３０分間浸漬してから
暗所で２５４nmの紫外線をゲルに照射することによっ
て、ＤＮＡとエチジウムブロミドの結合体の赤色バンド
を検出した。結果を表１に示した。約3100、約2860、約
2490、約2260、約2200、約1660bpの増幅ミトコンドリア
ＤＮＡが検出され、６品種のニンジン（Daucus carota
L.）植物を３タイプに識別することができた。

【００１５】

【表１】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００１６】実施例３ （配列番号２で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号２で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表２に示した。約1080、約 860、約 57
0、約 330bpの増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出され、
６品種のニンジン（Daucus carota L.）植物を４タイプ
に識別することができた。

【００１７】

【表２】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００１８】実施例４ （配列番号３で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号３で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表３に示した。約1540、約1230、約 98
0、約 250bpの増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出され、
６品種のニンジン（Daucus carota L.）植物を３タイプ
に識別することができた。

【００１９】

【表３】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００２０】実施例５ （配列番号４で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号４で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表４に示した。約2620、約2160、約197
0、約1300、約1050、約 580bpの増幅ミトコンドリアＤ
ＮＡが検出され、６品種のニンジン（Daucus carota
L.）植物を６タイプに識別することができた。

【００２１】

【表４】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００２２】実施例６ （配列番号５で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号５で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表５に示した。約4210、約3630、約310
0、約2440、約2160、約1740、約1290、約1090、約 930b
pの増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出され、６品種のニ
ンジン（Daucus carotaL.）植物を４タイプに識別する
ことができた。

【００２３】

【表５】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００２４】実施例７ （配列番号６で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号６で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表６に示した。約 550、約 450、約 37
0、約 290、約 210、約 200bpの増幅ミトコンドリアＤ
ＮＡが検出され、６品種のニンジン（Daucus carota
L.）植物を６タイプに識別することができた。

【００２５】

【表６】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００２６】実施例８ （配列番号７で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号７で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表７に示した。約4320、約3880、約380
0、約3430、約 350bpの増幅ミトコンドリアＤＮＡが検
出され、６品種のニンジン（Daucus carota L.）植物を
３タイプに識別することができた。

【００２７】

【表７】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００２８】実施例９ （配列番号８で示される配列か
らなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号８で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表８に示した。約6250、約5060、約480
0、約4440、約2840、約2100、約 230bpの増幅ミトコン
ドリアＤＮＡが検出され、６品種のニンジン（Daucus c
arota L.）植物を３タイプに識別することができた。

【００２９】

【表８】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００３０】実施例１０ （配列番号９で示される配列
からなるオリゴヌクレオチドを用いる品種の識別方法） 配列番号１で示される配列からなるオリゴヌクレオチド
のかわりに、配列番号９で示される配列からなるオリゴ
ヌクレオチドを用いた以外は実施例２と同様な試験を行
なった。結果を表９に示した。約2840、約2160、約1380
bpの増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出され、６品種のニ
ンジン（Daucus carota L.）植物を２タイプに識別する
ことができた。

【００３１】

【表９】 ＊ ＋：増幅ミトコンドリアＤＮＡが検出された。 −：増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出できなかった。

【００３２】実施例１１ （各種のオリゴヌクレオチド
を用いる品種の識別方法） 品種番号１から５の各種のニンジン（Daucus carota
L.）品種の種子からミトコンドリアＤＮＡを実施例１に
準じて抽出し、配列番号２および配列番号５で示される
配列からなるオリゴヌクレオチドを別々に用いて、前記
の実施例に準じて増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出す
る。検出される増幅ミトコンドリアＤＮＡに基づき各種
のオリゴヌクレオチドにおける品種タイプを区別し、さ
らに該品種タイプから各種品種を識別する。結果、表１
０に示すように５種類すべての品種を識別できる。

【００３３】

【表１０】

【００３４】実施例１２ （品種の純度検査） 種子生産のために栽培された品種番号４のニンジン（Da
ucus carota L.）植物から種子を得る。該種子５０粒を
育苗培土をつめたポットに１粒ずつ播種して温室内で栽
培する。健全に生育した幼植物２０個体から各々のミト
コンドリアＤＮＡを実施例１に準じて抽出し、配列番号
３で示される配列からなるオリゴヌクレオチドを用い
て、実施例２に準じて増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出
する。検出される増幅ミトコンドリアＤＮＡと品種番号
４のニンジン（Daucus carota L.）品種が本来所有する
増幅ミトコンドリアＤＮＡ（約1230bp，約 250bp）との
差異を調べる。結果、品種番号４のニンジン（Daucus c
arota L.）品種が本来所有する増幅ミトコンドリアＤＮ
Ａ（約1230bp，約 250bp）と異なる増幅ミトコンドリア
ＤＮＡが検出された供試種子は不純物であり、この数よ
り純度を算出することができる。なお、純度検査の精度
を高めるには複数の本発明で用いるオリゴヌクレオチド
を併用することにより可能である。

【００３５】実施例１３ （保存中における変異株のチ
ェック） 遺伝種子資源として保存された品種番号５のニンジン
（Daucus carota L.）品種の種子５０粒から各々のミト
コンドリアＤＮＡを実施例１に準じて抽出し、配列番号
６で示される配列からなるオリゴヌクレオチドを用い
て、実施例２に準じて増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出
する。検出される増幅ミトコンドリアＤＮＡと品種番号
５のニンジン（Daucus carota L.）品種が本来所有する
増幅ミトコンドリアＤＮＡ（約 450bp，約 370bp，約 2
90bp，約 210bp）との差異を調べる。結果、品種番号５
のニンジン（Daucus carota L.）品種が本来所有する増
幅ミトコンドリアＤＮＡ（約 450bp，約 370bp，約 290
bp，約 210bp）と異なる増幅ミトコンドリアＤＮＡが検
出された供試種子は変異株であり、この数より変異率を
算出することができる。なお、変異率の精度を高めるに
は複数の本発明で用いるオリゴヌクレオチドを併用する
ことにより可能である。

【００３６】実施例１４ （係争裁定での利用） 品種の種子２０粒を育苗培土をつめたポットに１粒ずつ
播種して温室内で栽培する。健全に生育した幼植物１０
個体からミトコンドリアＤＮＡを実施例１に準じて抽出
し、配列番号１から配列番号９で示される配列からなる
オリゴヌクレオチドを別々に用いて、実施例２から１０
に準じて増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出する。次に、
この結果に基づき品種タイプを決定するか、または実施
例１１に準じて、検出される増幅ミトコンドリアＤＮＡ
に基づき各々のオリゴヌクレオチドにおける品種タイプ
を区別し、さらに該品種タイプから品種の識別タイプを
決定する。イ号品種の種子１０粒を育苗培土をつめたポ
ットに１粒ずつ播種して温室内で栽培する。健全に生育
した幼植物５個体からミトコンドリアＤＮＡを実施例１
に準じて抽出し、配列番号１から配列番号９で示される
配列からなるオリゴヌクレオチドを別々に用いて、実施
例２から９に準じて増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出す
る。次に、この結果に基づき品種タイプを決定するか、
または実施例１１に準じて検出される増幅ミトコンドリ
アＤＮＡに基づき各々のオリゴヌクレオチドにおける品
種タイプを区別し、さらに該品種タイプから品種の識別
タイプを調べる。結果、品種の品種タイプまたは識別タ
イプとイ号品種の品種タイプまたは識別タイプの比較に
より、同一品種であるかほぼ推定する証拠を迅速に、精
度よく、かつ環境等で変化ぜずに得るこことができる。
なお、同定の精度をさらに高めるにはポリメラーゼチェ
イン反応の条件を変化させて同一な挙動を示すか否かを
調べることにより可能である。

【００３７】実施例１５ （母親鑑定での利用） 品種番号１のニンジン（Daucus carota L.）品種を母親
とし、品種番号４のニンジン（Daucus carota L.）品種
を父親として得られた植物の種子５０粒から各々のミト
コンドリアＤＮＡを実施例１に準じて抽出し、配列番号
３で示される配列からなるオリゴヌクレオチドを用い
て、実施例２に準じて増幅ミトコンドリアＤＮＡを検出
する。検出される増幅ミトコンドリアＤＮＡと品種番号
１のニンジン（Daucus carota L.）品種は本来所有する
が、品種番号４のニンジン（Daucuscarota L.）品種は
本来所有しない増幅ミトコンドリアＤＮＡ（約1540bp）
との差異を調べる。結果、約1540bpの増幅ミトコンドリ
アＤＮＡを所有する供試植物は、母親が品種番号１のニ
ンジン（Daucus carota L.）であり、母親と同様なミト
コンドリアＤＮＡ由来の形質を有することを前記の形質
について調査可能になるまで栽培し、その品種の特徴を
調査することなく、迅速に判定できる。

【００３８】実施例１６ （ミトコンドリアＤＮＡのク
ラスター分析） 配列番号１から９で示される配列からなる各種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ
チェイン反応により、品種番号１から６の各種のニンジ
ン（Daucus carota L.）品種のミトコンドリアＤＮＡを
増幅し、該増幅ミトコンドリアＤＮＡを電気泳動にて分
離後、増幅ミトコンドリアＤＮＡの視覚検出を行うこと
により、ミトコンドリアＤＮＡの分類を行った。ミトコ
ンドリアＤＮＡの分類はＷＰＧＭＡ法（weighted pair-
group method using arithmeticaverages, Peter H.A.S
neathら NUMERICAL TAXONOMY(1973)) に基づき、クラ
スター分析を行った。結果、表１１に示すように６種類
のミトコンドリアＤＮＡの分類が可能であった。これに
より、ミトコンドリアＤＮＡ由来の形質の有無を検定
し、該形質を有する植物を選び出すことが可能である。

【００３９】

【表１１】

【００４０】

【発明の効果】本発明は、ある種のオリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いて、ポリメラーゼチェイン反応
によりミトコンドリアＤＮＡを増幅させることによっ
て、ミトコンドリアＤＮＡの差異に基づた植物の品種識
別をより簡便にかつ効率よく行なうことができる効果を
有する。

【配列表】

【００４１】配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACGGCTAGA 10

【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAAACTGGTG 10

【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTCCTATGC 10

【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACGGCATGA 10

【００４５】配列番号：５ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGATCGGCAT 10

【００４６】配列番号：６ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGGTCAAAC 10

【００４７】配列番号：７ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTATCCTGA 10

【００４８】配列番号：８ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGCATTACG 10

【００４９】配列番号：９ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTACGGCAT 10

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＧＣ含量が５０％以上８０％以下で、かつ
   ８個以上１５個以下のヌクレオチドからなるオリゴヌク
   レオチオドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼチ
   ェイン反応により植物のミトコンドリアＤＮＡを増幅
   し、該増幅ミトコンドリアＤＮＡを電気泳動にて分離
   後、増幅ミトコンドリアＤＮＡの視覚検出を行なうこと
   を特徴とする植物品種の識別方法。
2. 【請求項２】請求項１記載のオリゴヌクレオチドが下記
   の配列群から選ばれる配列からなるオリゴヌクレオチド
   である請求項１記載の植物品種の識別方法。 配列群 (1) 5'−ＴＡＣＧＧＣＴＡＧＡ−3'、(2) 5'−ＣＡＡＡ
   ＣＴＧＧＴＧ−3'、(3) 5'−ＡＧＴＣＣＴＡＴＧＣ−
   3'、(4) 5'−ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡ−3'、(5) 5'−ＡＧ
   ＡＴＣＧＧＣＡＴ−3'、(6) 5'−ＧＴＧＧＴＣＡＡＡＣ
   −3'、(7) 5'−ＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡ−3'、(8) 5'−Ａ
   ＧＧＣＡＴＴＡＣＧ−3'、(9) 5'−ＡＧＴＡＣＧＧＣＡ
   Ｔ−3'
3. 【請求項３】ＧＣ含量が５０％以上８０％以下で、かつ
   ８個以上１５個以下のヌクレオチドからなるオリゴヌク
   レオチオドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼチ
   ェイン反応により植物のミトコンドリアＤＮＡを増幅
   し、該増幅ミトコンドリアＤＮＡを電気泳動にて分離
   後、増幅ミトコンドリアＤＮＡの視覚検出を行なうこと
   により、ミトコンドリアＤＮＡ由来の形質の有無を検定
   し、該形質を有する植物を選び出すことを特徴とする植
   物の選抜方法。
4. 【請求項４】請求項３記載の植物のミトコンドリアＤＮ
   Ａが幼植物または培養細胞由来のミトコンドリアＤＮＡ
   である請求項３記載の植物の選抜方法。
5. 【請求項５】下記の配列群から選ばれる配列からなるオ
   リゴヌクレオチド。 配列群 (1) 5'−ＡＧＴＣＣＴＡＴＧＣ−3'、(2) 5'−ＴＡＣＧ
   ＧＣＡＴＧＡ−3'、(3) 5'−ＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡ−
   3'、(4) 5'−ＡＧＧＣＡＴＴＡＣＧ−3'