JPH0740958B2 - 脱水素酵素又は基質の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は脱水素酵素又は基質の測定法に関し、詳細には
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD⁺）やニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（NA
DP⁺）等の補酵素を必要としない反応系の前記脱水素酵
素又は基質を正確且つ迅速に測定できると共に連続的な
自動分析においても支障なく実施できる様な方法に関す
るものである。

［従来の技術］ 酵素や基質を測定する方法としては従来から各種の方法
が実施されているが、もっとも汎用されている発色測定
方法（分光学的測定方法）としては、一般的に下記の３
通りに大別される方法が知られている。

（Ｉ）反応系内で生じた過酸化水素を酵素的又は非酵素
的に発色させて定量する方法。

（II）脱水素酵素を基質に作用させて生じたNADH（還元
型NAD⁺）やNADPH（還元型NADP⁺）の吸光度の変化から酵
素や基質を測定する方法。

（III）反応系内で生じた水素を電子伝達体を介してホ
ルマザン発色に導く方法。

上記（Ｉ）の方法は特に酸化酵素反応の様に、反応系内
において直接過酸化水素を生じる場合に一般的に用いら
れている方法であり、従って脱水素酵素又は基質を測定
する方法としては適用されていない。そこで脱水素酵素
が関与する系では（II）又は（III）の方法によるのが
一般的であり、殊に（III）の方法はNAD⁺やNADP⁺等の補
酵素を必要としない脱水素酵素を測定する場合には常識
的な方法として汎用されている。

上記（III）の方法（ホルマザン発色法）は、例えばサ
ルコシン脱水素酵素（SDH）を分光学的に測定する場合
において、下記の反応式で示す様に脱水素反応により生
じた水素を、フェナジンメトサルフェート（PMS）や１
−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェ
ート（１−mPMS）或は９−ジメチルアミノベンゾ−α−
フェナゾキソニウムクロライド（メルドラーブルー）等
の電子伝達体を介して紫色のホルマザン発色に導いて行
なわれるものである。

（但し、式中NTBはニトロテトラゾリウムブルー,NTBH₂
はNTBの還元型,1−mPMSH₂は１−mPMSの還元型であ
る。） ［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら上記ホルマザン発色法は、発色の際に生じ
る色素物質が沈着するという特性がある為チューブやセ
ルを汚染し易く、従って連続的な自動分析には適用し難
く、この方法は用手法によらざるを得ないという欠点を
有していた。

本発明はこうした従来技術のもつ技術的課題を解決する
為になされたものであって、その目的とするところは、
補酵素を必要としない脱水素酵素反応における脱水素酵
素又は基質を正確迅速に測定でき、チューブやセルを汚
染する様物質を発生させることなく、自動分析に最適な
測定方法を提供することにある。

［問題点を解決する為の手段］ 上記目的を達成し得た本発明とは、補酵素を必要としな
い脱水素酵素反応における脱水素酵素又は基質を測定す
るに当たり、脱脂素酵素反応により基質から生じる電子
を電子伝達体を経由して酸素に受容させることにより過
酸化水素を生成せしめ、生じた過酸化水素を酵素的又は
非酵素的に定量する点に要旨を有する脱水素酵素又は基
質の測定法である。

［作用］ 本発明方法は上述の如く構成されるが、要は補酵素を必
要としない脱水素酵素反応系において電子伝達系を介し
て酸素に電子を受容させることにより過酸化水素を生成
せしめ、この過酸化水素の量を酵素的又は非酵素的に定
量することによって、ホルマザン発色法が持つ欠点を解
消し（即ちチューブやセルを汚染することなく）、迅速
且つ正確に脱水素酵素又は基質を測定し得る様になった
のである。

本発明方法における代表的な反応系を例示すると下記の
如くである。

但し H₂O₂:過酸化水素 ４−AA:4−アミノアンチピリン TOOS:N−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム POD:ペルオキシダーゼ 本発明方法は前述した趣旨より明らかな様に、NAD⁺やNA
DP⁺等の補酵素を必要としない脱水素酵素を対象とした
ものであるが、この様な脱水素酵素については何ら限定
されず上記の反応系において電子伝達体を介して過酸化
水素を生成できるすべての酵素を意味する。この様な酵
素として下記の様なものが挙げられる。

（ａ）サルコシン脱水素酵素（EC1.5.99.1） （ｂ）アミノ脱水素酵素（EC1.4.99.3） （ｃ）スクシネイト脱水素酵素（EC1.3.99.1） （ｄ）コリン脱水素酵素（EC1.1.99.1） （ｅ）アルコール脱水素酵素（EC1.1.99.8） （ｆ）Ｄ−フラクトース脱水素酵素（EC1.1.99.11） （ｇ）タウリン脱水素酵素（EC1.4.99.2） （ｈ）ケトグルコネイト脱水素酵素（EC1.3.99.4） （ｉ）グルコース脱水素酵素（EC1.1.99.10） （ｊ）マレイト脱水素酵素（EC1.1.99.16） （ｋ）スペルミジン脱水素酵素（EC1.5.99.6） 又本発明方法における基質とは各脱水素酵素が特異的に
作用する物質を意味し、上述した脱水素酵素の場合は下
記の如くである。

（ａ）サルコシン （ｂ）アミン （ｃ）コハク酸 （ｄ）コリン （ｅ）アルコール （ｆ）Ｄ−フラクトース （ｇ）タウリン （ｈ）ケトグルコン酸 （ｉ）グルコース （ｊ）Ｌ−リンゴ酸 （ｋ）スペルミジン 但し、本発明方法で用いる基質は上記の様に各脱水素酵
素に対応したものに限定されるものではなく、他の基質
であっても特異的に作用する場合もあり得る。

尚本発明で様いる電子伝達体としては上記反応系で示し
た１−mPMSの他、前述したPMSやメルドラーブルー等を
用いることが好ましい。これらの電子伝達体を使用する
場合は、１種又は２種以上を混合して使用することもで
きる。又これらの電子伝達体を使用する場合の濃度につ
いては何ら限定されるものではないが、好ましくは0.00
01〜1.0mg/ml程度である。

本発明方法は上述した様に、一連の反応によって過酸化
水素を生成せしめ、この過酸化水素を酵素的又は非酵素
的に定量するものであるが、過酸化水素の定量法につい
ては何ら限定されるものではない。

過酸化水素を酵素的に定量する方法の１つとしては、過
酸化水素にペルオキシダーゼと色原体を作用させる方法
がある。色原体としては次のような組合せがある。

４−アミノアンチピリン／アニリン誘導体系 ４−アミノアンチピリン／フェノール誘導体系 ベンゾチアゾリノンヒドラゾン誘導体／アニリン誘導体
系 上記した反応系においては、生じた過酸化水素に４−ア
ミノアンチピリン（４−AA）及びＮ−メチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
ナトリウム（TOOS）等の発色剤を添加し、ペルオキシダ
ーゼ（POD）によって酵素的に発色せしめ、その後分光
学的に過酸化水素量を定量する方法について例示した。
酵素的な過酸化水素測定法の他の例としては、例えばホ
モバニリン酸（又はＰ−ヒドロキシフェニル酢酸）とPO
Dを添加することによって蛍光物質を生成させ、この蛍
光物質を測定する様な蛍光分析法を挙げることができ
る。この蛍光分析法によれば、上記の分光学的方法より
も更に高精度に過酸化水素を定量することができる。

一方過酸化水素を非酵素的に定量する方法についても何
ら限定されるものではなく、従来から知られている各種
の方法を任意に選定して実施すればよい。例えば、硫酸
チタンやチオシアン酸鉄（III）等の呈色試薬を用いる
比色法を挙げることができ、その他硫酸酸性試料溶液の
過マンガン酸塩滴定等の容量法、或はポーラログラフィ
ーによる方法等を挙げることができる。

［実施例］ 以下本発明の実施例を示すが、下記実施例は本発明を限
定する性質のものではない。

実施例１ 下記の手順でＤ−フラクトースの測定を行なった。

まずＤ−フラクトースにＤ−フラクトース脱水素酵素を
作用させて脱水素反応を進行させた。このときの反応組
成及び条件は下記の如くである。

反応組成１ マッキルバイン緩衝液（pH4.5） ……1.4ml Ｄ−フラクトース溶液（0,16,32,48mg/） ……0.3ml Ｄ−フラクトース脱水素酵素（EC1.1.99.11,200U/ml）
……0.3ml １−mPMS（0.5mg/ml） ……0.1ml 反応条件 温度:30℃ pH:4.5 時間:15分 次に下記反応組成物を添加して、過酸化水素を酵素的に
発色させた。

反応組成２ ４−AA（10mg/ml） ……0.3ml TOOS（10mg/ml） ……0.3ml POD（100U/ml） ……0.3ml 発色した各試料について、水をブランクとして波長550m
mにおける吸光度を測定した。

その結果を第１図に示すが、Ｄ−フラクトースが正確且
つ迅速にしかもチューブやセルを汚染することなく測定
された。

実施例２ 実施例１と同じ基質及び酵素並びに電子伝達体を使用
し、37℃、pH4.5の条件で下記の反応組成にてＤ−フラ
クトース脱水素酵素反応を進行させた。

反応組成１ マッキルバイン緩衝液（pH4.5） ……1.7ml Ｄ−フラクトース溶液（1M） ……0.1ml Ｄ−フラクトース脱水素酵素 ……0.1ml １−mPMS ……0.1ml 上記の組成及び条件で各時間（１〜７分間）反応させた
後、SDS溶液（300mg/ml）を0.1ml加えその反応を停止さ
せた。その後実施例１と同様にして、過酸化水素を生成
せしめると共に各試料における過酸化水素の量を定量し
た。

その結果を第２図に示すが、Ｄ−フラクトース脱水素酵
素の活性が正確に（直線的に）測定されているのが良く
分かる。

［発明の効果〕 以上述べた如く本発明によれば、既述の手順に従うこと
によって、補酵素を必要としない脱水素酵素反応におけ
る脱水素酵素又は基質を正確且つ迅速に測定できる様に
なり、しかもこの方法はホルマザン発色法の様な沈着物
質を生じることなく、連続的な自動分析にも最適な方法
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１においてＤ−フラクトースを測定した
結果を示すグラフ、第２図は実施例２においてＤ−フラ
クトース脱水素酵素を測定した結果を示すグラフであ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】補酵素を必要としない脱水素酵素反応にお
   ける脱水素酵素又は基質を測定するに当たり、前記脱水
   素酵素反応により基質から生じる電子を電子伝達体を経
   由して酸素に受容させることにより、過酸化水素を生成
   せしめ、生じた過酸化水素を酵素的又は非酵素的に定量
   することを特徴とする脱水素酵素又は基質の測定法。
2. 【請求項２】前記電子伝達体がフェナジンメトサルフェ
   ート、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチル
   サルフェート及び９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェ
   ナゾキソニウムクロライドから選ばれる１種又は２種以
   上である特許請求の範囲第１項に記載の測定法。