JPH074233B2 - 殺虫蛋白質産生枯草菌及びその製造法 - Google Patents
殺虫蛋白質産生枯草菌及びその製造法Info
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- JPH074233B2 JPH074233B2 JP61136021A JP13602186A JPH074233B2 JP H074233 B2 JPH074233 B2 JP H074233B2 JP 61136021 A JP61136021 A JP 61136021A JP 13602186 A JP13602186 A JP 13602186A JP H074233 B2 JPH074233 B2 JP H074233B2
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- Japan
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- bacillus subtilis
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- insecticidal protein
- producing
- insecticidal
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子組換えの手法により造成された、病原性
および自然界での増殖能を有せず、高い殺虫活性を有す
る蛋白質を産生する枯草菌形質転換株とその菌体の製造
法に関する。
および自然界での増殖能を有せず、高い殺虫活性を有す
る蛋白質を産生する枯草菌形質転換株とその菌体の製造
法に関する。
バチルス チュリンゲンシス（Bacillus thuringiensi
s,以後BTと略す）の芽胞嚢中に形成される結晶性殺虫蛋
白質は鱗翅目昆虫に対して強力な殺虫作用を有し、しか
もヒトを含む動物および植物に対して無害であることか
ら、農園芸用殺虫剤として欧米で広く用いられてきた。
s,以後BTと略す）の芽胞嚢中に形成される結晶性殺虫蛋
白質は鱗翅目昆虫に対して強力な殺虫作用を有し、しか
もヒトを含む動物および植物に対して無害であることか
ら、農園芸用殺虫剤として欧米で広く用いられてきた。
しかし、殺虫蛋白質を有効成分とする殺虫剤（以後、BT
剤と称す）は、BTの細胞や胞子を含むため、日本では殺
虫剤の散布後にBT菌が増殖し、養蚕に大きな被害を与え
ることが懸念された。
剤と称す）は、BTの細胞や胞子を含むため、日本では殺
虫剤の散布後にBT菌が増殖し、養蚕に大きな被害を与え
ることが懸念された。
この被害を防止するため、熱処理、化学薬品処理等によ
り、BT剤中の生細胞、胞子の殺菌が行われてきたが、激
しい殺菌条件を用いる必要があり、殺虫蛋白質の変性に
よる殺虫活性の低下がさけられず、また殺虫活性を保持
させるためには、加熱処理と化学薬品処理等の組み合わ
せが必要となり、工業的に煩雑な処理工程のために製造
コストの上昇をきたした。
り、BT剤中の生細胞、胞子の殺菌が行われてきたが、激
しい殺菌条件を用いる必要があり、殺虫蛋白質の変性に
よる殺虫活性の低下がさけられず、また殺虫活性を保持
させるためには、加熱処理と化学薬品処理等の組み合わ
せが必要となり、工業的に煩雑な処理工程のために製造
コストの上昇をきたした。
さらにBT菌自身はヒトに対して病原性を有するバチルス
セレウスと極めて近縁であるといわれている（蛋白質
・核酸／酵素 29巻444頁1984年）。
セレウスと極めて近縁であるといわれている（蛋白質
・核酸／酵素 29巻444頁1984年）。
このような事情からわが国においては、BT菌そのもの又
はその製剤を殺虫蛋白質として用いることは好ましいこ
ととは考えられない。
はその製剤を殺虫蛋白質として用いることは好ましいこ
ととは考えられない。
しかるに近年、遺伝子組換の手法が発達し、所望の有用
な性質を有する微生物を育種することが可能となってき
た。
な性質を有する微生物を育種することが可能となってき
た。
本発明者等は、先に述べたBT殺虫蛋白質を含む殺虫剤の
種々の欠点を克服するために遺伝子組換えの手法により
殺虫蛋白質を産生する枯草菌菌株の造成を試み、後述す
るように高い活性を有する殺虫性を有する枯草菌株を造
成し、本発明を完成した。
種々の欠点を克服するために遺伝子組換えの手法により
殺虫蛋白質を産生する枯草菌菌株の造成を試み、後述す
るように高い活性を有する殺虫性を有する枯草菌株を造
成し、本発明を完成した。
また、この形質転換株および親株であるBTソツトー株を
培養して得た菌体を殺虫効果試験に供試した結果、該形
質転換株はBT菌に比し優れた殺虫効果を示し、本発明の
有効性を立証した。
培養して得た菌体を殺虫効果試験に供試した結果、該形
質転換株はBT菌に比し優れた殺虫効果を示し、本発明の
有効性を立証した。
枯草菌は、古来、納豆の製造に用いられてきたことから
明らかなようにヒトに対する病原性がなく、アミノ酸、
核酸、酵素等の製造にも用いられてきたので工業用微生
物としての使用経験も長い。
明らかなようにヒトに対する病原性がなく、アミノ酸、
核酸、酵素等の製造にも用いられてきたので工業用微生
物としての使用経験も長い。
また枯草菌は大腸菌についでその遺伝的性質が明らかに
され、種々の変異株も造成されている。
され、種々の変異株も造成されている。
従って、BT製剤で問題とされた蚕に対する毒性や胞子殺
菌については、胞子欠損枯草菌や栄養要求性を有する枯
草菌を用いて殺虫蛋白質をつくらせることにより容易に
克服可能である。例えば、殺虫蛋白質を産生する胞子欠
損枯草菌は高熱で殺菌処理する必要がないので殺虫活性
の低下をまねくことはない。
菌については、胞子欠損枯草菌や栄養要求性を有する枯
草菌を用いて殺虫蛋白質をつくらせることにより容易に
克服可能である。例えば、殺虫蛋白質を産生する胞子欠
損枯草菌は高熱で殺菌処理する必要がないので殺虫活性
の低下をまねくことはない。
また殺虫蛋白質を産生する栄養要求性枯草菌は殺菌処理
をしなくても、自然界には要求する栄養源が枯草菌に利
用し得る形態ではほとんど存在し得ないので、自然界に
散布しても増殖することは出来ず、速やかに死滅する。
をしなくても、自然界には要求する栄養源が枯草菌に利
用し得る形態ではほとんど存在し得ないので、自然界に
散布しても増殖することは出来ず、速やかに死滅する。
従って本発明の成果は、今後の微生物殺虫剤の用途拡大
という面から極めて大きな意義を有する。
という面から極めて大きな意義を有する。
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明で用いられるBT菌の菌体内殺虫蛋白質遺伝子と
は、BT菌が産生する菌体内殺虫蛋白質のアミノ酸配列を
コードする領域とプロモーター領域から成る遺伝子であ
り、バチルス チュリンゲンシス ソットー（アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション（ATCCと略す）保存番
号19270）由来の遺伝子が使用可能である。
は、BT菌が産生する菌体内殺虫蛋白質のアミノ酸配列を
コードする領域とプロモーター領域から成る遺伝子であ
り、バチルス チュリンゲンシス ソットー（アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション（ATCCと略す）保存番
号19270）由来の遺伝子が使用可能である。
これらの菌体内殺虫蛋白質遺伝子を結合するベクターは
枯草菌で増殖可能なベクターであればいずれのものも使
用可能であるけれど、構造が良く知られ、広く用いられ
る等の理由によりプラスミドpUB110が使用に便利であ
る。
枯草菌で増殖可能なベクターであればいずれのものも使
用可能であるけれど、構造が良く知られ、広く用いられ
る等の理由によりプラスミドpUB110が使用に便利であ
る。
菌体内殺虫蛋白質遺伝子は適当な制限酵素で切断したベ
クターにDNA結合酵素を用いて結合される。この結合方
法は、通常の遺伝子組換えの方法で全く支障はない。
クターにDNA結合酵素を用いて結合される。この結合方
法は、通常の遺伝子組換えの方法で全く支障はない。
次に、得られた組換えDNA分子を枯草菌に導入して、組
換えプラスミドを含む枯草菌形質転換株を得る。
換えプラスミドを含む枯草菌形質転換株を得る。
組換えDNA分子の枯草菌への導入は、通常、プロトプラ
スト法（Chang,S.,and Cohen,S.N,:Mol.Gen,Genet,168
111（1978））、あるいはコンピテント細胞法（Anagnos
topoulos,C.,and Spizizen,J.:J.Bactriol.81,741（196
1））により行われる。
スト法（Chang,S.,and Cohen,S.N,:Mol.Gen,Genet,168
111（1978））、あるいはコンピテント細胞法（Anagnos
topoulos,C.,and Spizizen,J.:J.Bactriol.81,741（196
1））により行われる。
形質転換株の選択は、ベクターに含まれるマーカー（例
えば、抗生物質耐性等）により容易に実施可能である。
このようにして得られた形質転換株を微生物の培養に用
いられる通常の培地で培養することにより、殺虫蛋白質
を産生する枯草菌が容易に得られる。
えば、抗生物質耐性等）により容易に実施可能である。
このようにして得られた形質転換株を微生物の培養に用
いられる通常の培地で培養することにより、殺虫蛋白質
を産生する枯草菌が容易に得られる。
組換えDNA分子を導入する枯草菌は使用目的に応じて枯
草菌の種々の変異株を選択することが出来る。例えば自
然界で増殖出来ず、速やかに死滅する枯草菌由来の殺虫
蛋白質から成る殺虫剤の製造には枯草菌の栄養要求性変
異株（ATCC33608）、または胞子欠損株（BGSC 1S1）ま
たは二つの性質を有する変異株（ATCC35148）等が用い
られる。
草菌の種々の変異株を選択することが出来る。例えば自
然界で増殖出来ず、速やかに死滅する枯草菌由来の殺虫
蛋白質から成る殺虫剤の製造には枯草菌の栄養要求性変
異株（ATCC33608）、または胞子欠損株（BGSC 1S1）ま
たは二つの性質を有する変異株（ATCC35148）等が用い
られる。
これらの枯草菌変異株を用いることによれば、殺虫蛋白
質を含む菌体を加熱処理、化学薬品処理する必要がない
ので高い活性と安全性を有し、しかもコストの低い微生
物殺虫剤が得られる。
質を含む菌体を加熱処理、化学薬品処理する必要がない
ので高い活性と安全性を有し、しかもコストの低い微生
物殺虫剤が得られる。
組換えDNA分子を含む形質転換株が殺虫蛋白質を産生す
ることは、後述するようにBT菌由来の菌体内殺虫蛋白質
に対する抗体を用いた免疫二重拡散試験法により、また
鱗翅目昆虫の幼虫を用いた殺虫活性試験により明確に示
される。
ることは、後述するようにBT菌由来の菌体内殺虫蛋白質
に対する抗体を用いた免疫二重拡散試験法により、また
鱗翅目昆虫の幼虫を用いた殺虫活性試験により明確に示
される。
特に注目すべき点は、遺伝子組換えの手法により造成さ
れた殺虫蛋白質を産生する枯草菌が、殺虫蛋白質遺伝子
が由来した親株のBT菌よりも強い殺虫活性を示したこと
である（第一〜三表）。
れた殺虫蛋白質を産生する枯草菌が、殺虫蛋白質遺伝子
が由来した親株のBT菌よりも強い殺虫活性を示したこと
である（第一〜三表）。
このことは本発明によって得られた殺虫蛋白質を産生す
る枯草菌が殺虫剤の有効成分として極めて有用であるこ
とを示すものである。
る枯草菌が殺虫剤の有効成分として極めて有用であるこ
とを示すものである。
以下に実施例と試験例を示す。
実施例１（バチルス・チュリンゲンシス・ソットーの菌
体内殺虫蛋白質遺伝子を含む組換えDNA分子の調製） バチルス・チュリンゲンシス・ソットー（ATCC19270
株）をペンアッセイブロス（Difco社製）20を用いて3
0℃で15時間培養した後、集菌し、Hansenの方法（J.Bac
teriol,135,227（1978））に従いプラスミドを調製し
た。
体内殺虫蛋白質遺伝子を含む組換えDNA分子の調製） バチルス・チュリンゲンシス・ソットー（ATCC19270
株）をペンアッセイブロス（Difco社製）20を用いて3
0℃で15時間培養した後、集菌し、Hansenの方法（J.Bac
teriol,135,227（1978））に従いプラスミドを調製し
た。
このプラスミド50μｇを制限酵素Pst I（宝酒造製）50
単位を用い37℃で２時間インキュベートすることにより
切断した。反応系の組成は10mMトリスー塩酸緩衝液（pH
7.5）,10mM MgCl2,50mM NaCl、1mMジチオスレイトール
である。
単位を用い37℃で２時間インキュベートすることにより
切断した。反応系の組成は10mMトリスー塩酸緩衝液（pH
7.5）,10mM MgCl2,50mM NaCl、1mMジチオスレイトール
である。
本反応により切断されたDNA断片は、常法に従いフェノ
ール抽出およびエーテル抽出により精製し、エタノール
沈澱により回収した。
ール抽出およびエーテル抽出により精製し、エタノール
沈澱により回収した。
得られたPst I切断DNA断片（供与DNA断片）は、次ぎに
制限酵素Pst Iで完全に切断した後、大腸菌アルカリ性
ホスファターゼで末端リン酸エステルを加水分解したプ
ラスミドpBR322（ATCC37017）に結合した。
制限酵素Pst Iで完全に切断した後、大腸菌アルカリ性
ホスファターゼで末端リン酸エステルを加水分解したプ
ラスミドpBR322（ATCC37017）に結合した。
結合にはT4リガーゼを用い反応には供与DNA断片20μ
ｇ、pBR322 10μｇを使用した。反応系の組成はT4リガ
ーゼ（宝酒造製）10単位、6.6mMトリスー塩酸緩衝液（p
H7.6）、6.6mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM A
TPである。反応は４℃で15時間行った。
ｇ、pBR322 10μｇを使用した。反応系の組成はT4リガ
ーゼ（宝酒造製）10単位、6.6mMトリスー塩酸緩衝液（p
H7.6）、6.6mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM A
TPである。反応は４℃で15時間行った。
反応後、反応液から0.1μg DNAに相当する量を抜き取
り、0.7％アガロース電気泳動を行った結果、ベクター
であるbBR322と供与DNA断片が結合し、組換体DNA分子と
なっていることが認められた。
り、0.7％アガロース電気泳動を行った結果、ベクター
であるbBR322と供与DNA断片が結合し、組換体DNA分子と
なっていることが認められた。
このようにして得られた組換体DNA分子を大腸菌HB 101
株（ATCC33694）にカルシウム処理コンピテント細胞法
（Mandel,M.,and Higa,A,:J.Mol.Biol.53159（1970））
に従って導入した。
株（ATCC33694）にカルシウム処理コンピテント細胞法
（Mandel,M.,and Higa,A,:J.Mol.Biol.53159（1970））
に従って導入した。
得られた形質転換株は全て、バチルス・チュリンゲンシ
ス ソットーの殺虫蛋白質の抗体を用いたラジオイムノ
検定（Ehrlich et al.:Cell13,681（1978））により選
別し陽性となった株のうち１株（＃801）を選び成書に
記載される方法（“Molecular Cloning"p86.Cold Spri
ng Harbor Laboratory）に従いプラスミドを調製し
た。
ス ソットーの殺虫蛋白質の抗体を用いたラジオイムノ
検定（Ehrlich et al.:Cell13,681（1978））により選
別し陽性となった株のうち１株（＃801）を選び成書に
記載される方法（“Molecular Cloning"p86.Cold Spri
ng Harbor Laboratory）に従いプラスミドを調製し
た。
得られたプラスミドを制限酵素Pst Iで切断した後、0.7
％アガロースゲル電気泳動で調べた結果、該プラスミド
（pSP801と命名）はベクターであるpBR322のPst Iの切
断部位にサイズ約6.6Kbの供与DNA断片が挿入された組換
体DNA分子であることが判明した。
％アガロースゲル電気泳動で調べた結果、該プラスミド
（pSP801と命名）はベクターであるpBR322のPst Iの切
断部位にサイズ約6.6Kbの供与DNA断片が挿入された組換
体DNA分子であることが判明した。
プラスミドpSP801にはHpa I切断部位が２ケ所ある。そ
こで、pSP801 Hpa I分解分を得た後、T4DNAリガーゼを
用いる方法でこれを再結合し、殺虫蛋白質遺伝子を含む
さらに小型の組換プラスミドを構築した。
こで、pSP801 Hpa I分解分を得た後、T4DNAリガーゼを
用いる方法でこれを再結合し、殺虫蛋白質遺伝子を含む
さらに小型の組換プラスミドを構築した。
再結合して作成したプラスミドは前述のカルシウム処理
コンピテント細胞法で大腸菌HB101株に導入し、得られ
た形質転換株よりプラスミドを前述の常法により調製し
たところpSP801由来のサイズ約5.6Kbの断片が導入され
たプラスミドpHP1を得た。
コンピテント細胞法で大腸菌HB101株に導入し、得られ
た形質転換株よりプラスミドを前述の常法により調製し
たところpSP801由来のサイズ約5.6Kbの断片が導入され
たプラスミドpHP1を得た。
このプラスミドpHP1 100μｇを制限酵素Pst Iを用いて
前述の反応条件で切断した後、0.7％アガロースゲル電
気泳動により40V5時間泳動した。
前述の反応条件で切断した後、0.7％アガロースゲル電
気泳動により40V5時間泳動した。
泳動後、5.6Kb部分のゲルを切り出し、フェノール抽出
及びエーテル抽出により精製し、エタノール沈澱により
DNAを回収した。
及びエーテル抽出により精製し、エタノール沈澱により
DNAを回収した。
該回収DNAをTE緩衝液（10mMトリスー塩酸緩衝液（pH8.
0、1mM EDTA）100μに溶解し、そのうちDNA0.1μｇ相
当量を抜き取り、0.7％アガロース電気泳動により、該
回収DNAがサイズ約5.6Kbの断片として精製されたことを
確認し、供与DNA断片として、以下の実験に供した。
0、1mM EDTA）100μに溶解し、そのうちDNA0.1μｇ相
当量を抜き取り、0.7％アガロース電気泳動により、該
回収DNAがサイズ約5.6Kbの断片として精製されたことを
確認し、供与DNA断片として、以下の実験に供した。
実施例２（ベクター プラスミドと供与DNA断片の結合
および枯草菌への形質転換による栄養要求性形質転換株
の取得） 実施例１で得られた供与DNA断片50μを大腸菌DNAポリ
メラーゼＩのクレノーフラグメント10単位を用い、30℃
30分の反応で平滑末端化した。
および枯草菌への形質転換による栄養要求性形質転換株
の取得） 実施例１で得られた供与DNA断片50μを大腸菌DNAポリ
メラーゼＩのクレノーフラグメント10単位を用い、30℃
30分の反応で平滑末端化した。
反応系の組成は0.1mM dNTPs、ニックトランスレーショ
ン緩衝液（50mMトリスー塩酸緩衝液（pH7.2）、10mM Mg
SO4、0.1mMジチオスレイトール、５μg/mlウシ血清アル
ブミン）である。
ン緩衝液（50mMトリスー塩酸緩衝液（pH7.2）、10mM Mg
SO4、0.1mMジチオスレイトール、５μg/mlウシ血清アル
ブミン）である。
上記反応による生成物は、フェノール抽出及びエーテル
抽出により精製し、エタノール沈澱により回収した。
抽出により精製し、エタノール沈澱により回収した。
該回収DNA断片は、次ぎに制限酵素Pvu IIで完全に切断
し、大腸菌アルカリ性ホスファターゼで末端リン酸エス
テルを加水分解したプラスミドpUB110（ATCC37015）にT
4DNAリガーゼを用いて結合した。反応には回収DNA（供
与DNA断片）20μｇ、pUB110 10μｇを使用した。
し、大腸菌アルカリ性ホスファターゼで末端リン酸エス
テルを加水分解したプラスミドpUB110（ATCC37015）にT
4DNAリガーゼを用いて結合した。反応には回収DNA（供
与DNA断片）20μｇ、pUB110 10μｇを使用した。
得られた組換え体DNA分子による形質転換は、Chang等の
プロトプラスト法（Chang,S.,and Cohen,S.N.:Mol.Gen.
Genet.168111（1978））に従って実施した。プロトプラ
スト再生培地には、カナマイシンを最終濃度150μg/ml
となるように加えた。クローニングの宿主菌には栄養要
求性枯草菌1A 510株（BGSC保存株）を用いた。
プロトプラスト法（Chang,S.,and Cohen,S.N.:Mol.Gen.
Genet.168111（1978））に従って実施した。プロトプラ
スト再生培地には、カナマイシンを最終濃度150μg/ml
となるように加えた。クローニングの宿主菌には栄養要
求性枯草菌1A 510株（BGSC保存株）を用いた。
形質転換により得られたカナマイシン耐性株の全てより
プラスミドを調製した。
プラスミドを調製した。
プラスミドの調製は、カナマイシン耐性株をペンアッセ
イ培地（Difco社製）20mlを用いて37℃15時間培養後、
集菌し、集菌菌体を50mMトリスー塩酸緩衝液（pH7.
5）、5mM EDTA、50mM NaClで洗浄した後、アルカリ法
（Birnboim,H.C.,and Poly,J.:Nucleic Acid Res.７151
3（1979））に従って行った。
イ培地（Difco社製）20mlを用いて37℃15時間培養後、
集菌し、集菌菌体を50mMトリスー塩酸緩衝液（pH7.
5）、5mM EDTA、50mM NaClで洗浄した後、アルカリ法
（Birnboim,H.C.,and Poly,J.:Nucleic Acid Res.７151
3（1979））に従って行った。
得られたプラスミドを制限酵素Bcl I、Cla I、EcoR V、
Hind III、Kpn I、Pvu II、Sac IおよびXba Iをもちい
て切断し、供与DNA断片の挿入の有無を調べた。
Hind III、Kpn I、Pvu II、Sac IおよびXba Iをもちい
て切断し、供与DNA断片の挿入の有無を調べた。
次ぎに供与DNA断片が挿入されていることが確認された
プラスミドを有する株の菌体内殺虫蛋白質の産生の有無
を免疫二重拡散試験法（Ouchterlony,Oe.,and Nilsson,
L.A.“Hand book of Experimental Immunology（ed.Wei
r,P.M.）p1（1973））により調べた。
プラスミドを有する株の菌体内殺虫蛋白質の産生の有無
を免疫二重拡散試験法（Ouchterlony,Oe.,and Nilsson,
L.A.“Hand book of Experimental Immunology（ed.Wei
r,P.M.）p1（1973））により調べた。
対象としてpUB110を有する宿主菌1A510株およびDNA供与
株であるバチルス チュリンゲンシスソットーを用い
た。
株であるバチルス チュリンゲンシスソットーを用い
た。
培養には、枯草菌宿主株および形質転換株は胞子形成培
地（0.8％ニュートリエントブロス（Difco社製）、1mM
MgSO4、13.4mM KCl、0.01mM MnCl2、10-6M FeSO4、10-3
M Ca（NO3）２）を用い、バチルス チュリンゲンシス
ソットーはGYS培地（0.2％（NH4）2SO4、0.2％Yeast
extract、0.05％K2HPO4、0.1％ Glucose、0.03％MgS
O4、0.008％CaCl2、0.005％MnSO4、pH7.3）を用い、30
℃で３日間の振とう培養を行った。
地（0.8％ニュートリエントブロス（Difco社製）、1mM
MgSO4、13.4mM KCl、0.01mM MnCl2、10-6M FeSO4、10-3
M Ca（NO3）２）を用い、バチルス チュリンゲンシス
ソットーはGYS培地（0.2％（NH4）2SO4、0.2％Yeast
extract、0.05％K2HPO4、0.1％ Glucose、0.03％MgS
O4、0.008％CaCl2、0.005％MnSO4、pH7.3）を用い、30
℃で３日間の振とう培養を行った。
この時、枯草菌の胞子形成培地にはカナマイシンを最終
濃度５μg/mlとなるよう加えた。培養後、それぞれの株
の胞子形成を確認した後、遠心により集菌し、集菌菌体
をリゾチームによる溶菌および1M NaClによる洗浄を行
い遠心し沈澱物を回収した。得られた沈澱物は15mM NaO
Hに懸濁し、25℃、10時間インキュベートした後、遠心
し胞子を除いた上清を回収した。
濃度５μg/mlとなるよう加えた。培養後、それぞれの株
の胞子形成を確認した後、遠心により集菌し、集菌菌体
をリゾチームによる溶菌および1M NaClによる洗浄を行
い遠心し沈澱物を回収した。得られた沈澱物は15mM NaO
Hに懸濁し、25℃、10時間インキュベートした後、遠心
し胞子を除いた上清を回収した。
得られた上清を供試サンプルとし、バチルスチュリンゲ
ンシス ソットーの菌体内殺虫蛋白質に対する抗血清を
用いて前述した方法により免疫二重拡散試験を行った。
ンシス ソットーの菌体内殺虫蛋白質に対する抗血清を
用いて前述した方法により免疫二重拡散試験を行った。
その結果、この枯草菌形質転換株はバチルス チュリン
ゲンシス ソットー型の殺虫蛋白質を産生していること
が明らかとなった。
ゲンシス ソットー型の殺虫蛋白質を産生していること
が明らかとなった。
また、この形質転換株を位相差電子顕微鏡で観察するこ
とにより結晶性蛋白質の存在が認められた。
とにより結晶性蛋白質の存在が認められた。
以上の結果から栄養要求性枯草菌形質転換株はバチルス
チュリンゲンシス ソットーと同様の殺虫蛋白質を産
生することが認められた。そこでこの形質転換体をHBT1
と命名した。
チュリンゲンシス ソットーと同様の殺虫蛋白質を産
生することが認められた。そこでこの形質転換体をHBT1
と命名した。
実施例３（殺虫蛋白質産生枯草菌栄養要求性胞子欠損形
質転換株の取得） 実施例２で得られたHBT 1株よりプラスミド（pHBT1と命
名）を精製し枯草菌栄養要求性胞子欠損株MT-SP31株（F
ERM BP-1034）への導入を行った。
質転換株の取得） 実施例２で得られたHBT 1株よりプラスミド（pHBT1と命
名）を精製し枯草菌栄養要求性胞子欠損株MT-SP31株（F
ERM BP-1034）への導入を行った。
プラスミドpHBT1 50μｇを用いて枯草菌MT−SP31株の
形質転換をコンピテント法（Anagnostopoulos,C.,and S
pizizen,J.;J.Bacteriol.81,741（1961）に従って行な
った。
形質転換をコンピテント法（Anagnostopoulos,C.,and S
pizizen,J.;J.Bacteriol.81,741（1961）に従って行な
った。
プラスミド取込み後の培養液（1ml）は５μg/mlカナマ
イシン含有TBAB培地（Dafco社製）に100μずつプレー
ティングした。
イシン含有TBAB培地（Dafco社製）に100μずつプレー
ティングした。
得られたカナマイシン耐性株の全てよりプラスミドを調
製し、制限酵素Bcl I、Cla I、Ecor V、Hind III、Kpn
I、Pvu II、Sac I、Xba Iを用いて切断し、電気泳動を
行い、同様に切断したプラスミドpHBT Iの切断パターン
と比較した。
製し、制限酵素Bcl I、Cla I、Ecor V、Hind III、Kpn
I、Pvu II、Sac I、Xba Iを用いて切断し、電気泳動を
行い、同様に切断したプラスミドpHBT Iの切断パターン
と比較した。
その結果pHBT1と切断パターンが一致したプラスミドを
有する株が得られた。
有する株が得られた。
この形質転換株を前述の方法に従いバチルス チュリン
ゲンシス ソットーの菌体内殺虫蛋白質の抗血清を用い
た免疫二重拡散試験に供し、陽性となった本株をSPBT 1
と命名した。
ゲンシス ソットーの菌体内殺虫蛋白質の抗血清を用い
た免疫二重拡散試験に供し、陽性となった本株をSPBT 1
と命名した。
この株を前述の胞子形成培地で培養し、得られた菌体を
実施例２、試験例１の方法により検定した結果、殺虫活
性を有する蛋白質を産生しているが、胞子形成能は欠損
していることを確認した。試験例１（実施例２で得られ
た枯草菌形質転換株菌体の殺虫活性） 実施例２と同様に枯草菌には胞子形成培地を、バチルス
チュリンゲンシス ソットーにはGYS培地を用いてバ
チルス ズブチリスHBT1、バチルス チュリンゲンシス
ソットー、バチルスズブチリス1A510（pUB110）を30
℃３日間培養して遠心により集菌し、得られた菌体を培
地と同量の生理食塩水に懸濁し洗浄後、再度遠心し、沈
澱画分を凍結乾燥した。
実施例２、試験例１の方法により検定した結果、殺虫活
性を有する蛋白質を産生しているが、胞子形成能は欠損
していることを確認した。試験例１（実施例２で得られ
た枯草菌形質転換株菌体の殺虫活性） 実施例２と同様に枯草菌には胞子形成培地を、バチルス
チュリンゲンシス ソットーにはGYS培地を用いてバ
チルス ズブチリスHBT1、バチルス チュリンゲンシス
ソットー、バチルスズブチリス1A510（pUB110）を30
℃３日間培養して遠心により集菌し、得られた菌体を培
地と同量の生理食塩水に懸濁し洗浄後、再度遠心し、沈
澱画分を凍結乾燥した。
この凍結乾燥標品を供試サンプルとして、コナガ幼虫、
アオムシ幼虫、タマナギンウワバ幼虫に対する殺虫効果
を試験した。試験法は土山の方法（日本応用動物昆虫学
会誌 第22巻第４号:234〜237頁（1978））によった。
すなわち、供試サンプル200mgを脱イオン水100mlに浮遊
させホモジナイズした後、脱イオン水で希釈して所定濃
度の菌液を調製した。この菌液0.4mlを人工試料4gと均
一に混合した後、検定昆虫の幼虫に摂食させ死亡率を調
べた。
アオムシ幼虫、タマナギンウワバ幼虫に対する殺虫効果
を試験した。試験法は土山の方法（日本応用動物昆虫学
会誌 第22巻第４号:234〜237頁（1978））によった。
すなわち、供試サンプル200mgを脱イオン水100mlに浮遊
させホモジナイズした後、脱イオン水で希釈して所定濃
度の菌液を調製した。この菌液0.4mlを人工試料4gと均
一に混合した後、検定昆虫の幼虫に摂食させ死亡率を調
べた。
以上の結果から遺伝子組換えの手法によってえられた殺
虫蛋白質産生枯草菌は親株のバチルス チュリンゲンシ
ス ソットーより高い殺虫活性を示したことは明らかで
ある。
虫蛋白質産生枯草菌は親株のバチルス チュリンゲンシ
ス ソットーより高い殺虫活性を示したことは明らかで
ある。
試験例２（実施例３で得られた枯草菌形質転換株菌体の
殺虫活性） 実施例３で得られたバチルス ズブチリスSPBT1、バチ
ルス ズブチリスMTSP31（pUB110）及びバチルス チュ
リンゲンシス ソットーはGYS培地を用いて培養し、以
後試験例１と同様にそれぞれの株の殺虫効果を試験し
た。その結果、第４、５及び６表に示す通り、本発明の
殺虫蛋白質産生枯草菌は、親株であるバチルス チュリ
ンゲンシス ソットーより、鱗翅目昆虫に対して高い殺
虫活性を示した。
殺虫活性） 実施例３で得られたバチルス ズブチリスSPBT1、バチ
ルス ズブチリスMTSP31（pUB110）及びバチルス チュ
リンゲンシス ソットーはGYS培地を用いて培養し、以
後試験例１と同様にそれぞれの株の殺虫効果を試験し
た。その結果、第４、５及び６表に示す通り、本発明の
殺虫蛋白質産生枯草菌は、親株であるバチルス チュリ
ンゲンシス ソットーより、鱗翅目昆虫に対して高い殺
虫活性を示した。
図面は、実施例に示した枯草菌形質転換株を得る手順を
図示したものである。
図示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/32 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:07） (56)参考文献 特開 昭61−5098（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】以下に示すDNA塩基配列で表されるバチル
ス チュリンゲンシス ソットーの菌体内殺虫蛋白質遺
伝子を枯草菌で増殖可能なベクターに結合した後、枯草
菌胞子欠損株に導入して得られる鱗翅目昆虫に対して殺
虫作用を有する殺虫蛋白質を産生する枯草菌形質転換
株。 - 【請求項２】枯草菌胞子欠損株が栄養要求性胞子欠損株
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の枯
草菌形質転換株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61136021A JPH074233B2 (ja) | 1986-06-13 | 1986-06-13 | 殺虫蛋白質産生枯草菌及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61136021A JPH074233B2 (ja) | 1986-06-13 | 1986-06-13 | 殺虫蛋白質産生枯草菌及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62294080A JPS62294080A (ja) | 1987-12-21 |
| JPH074233B2 true JPH074233B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=15165331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61136021A Expired - Lifetime JPH074233B2 (ja) | 1986-06-13 | 1986-06-13 | 殺虫蛋白質産生枯草菌及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH074233B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7218090B2 (ja) | 2018-01-12 | 2023-02-06 | 花王株式会社 | タンパク質の製造方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652628A (en) * | 1984-02-22 | 1987-03-24 | Syntro Corporation | Methods and compositions for expression of BTI endotoxin |
-
1986
- 1986-06-13 JP JP61136021A patent/JPH074233B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62294080A (ja) | 1987-12-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |