JPH074262B2 - 真核細胞系表現ベクター、及び真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の調節可能な製法 - Google Patents

真核細胞系表現ベクター、及び真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の調節可能な製法

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JPH074262B2
JPH074262B2 JP64000167A JP16789A JPH074262B2 JP H074262 B2 JPH074262 B2 JP H074262B2 JP 64000167 A JP64000167 A JP 64000167A JP 16789 A JP16789 A JP 16789A JP H074262 B2 JPH074262 B2 JP H074262B2
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ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシュレンクテル・ハフツング
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はベクター中に調節可能なプロモーターを含有す
る真核細胞系表現ベクター並びにこのようなベクターを
使用する真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は
蛋白質含有生産物の調節可能な製法に関する。
従来の技術 酵母は人間の最も古い培養微生物の１つである。今でも
主としてアルコール醗酵（ワイン，ビール等）に及びド
ウ製品の製造の際の“ベーキング助剤（Backhilfe）”
として使われている。それと同時に、酵母は例えばNAD,
ATP及びグルタチオンのような低分子物質及び例えばDN
A,RNA及びとりわけ酵素，例えばアルコール‐デヒドロ
ゲナーゼ，アルデヒド‐デヒドロゲナーゼ，アセチル‐
CoA-シンテターゼ，α‐グルコシダーゼ，グリセリンア
ルデヒド‐3-ボスフエートデヒドロゲナーゼ，グルコー
ス‐6-ボスフエート‐デヒドロゲナーゼ及びヘキソキナ
ーゼのような高分子物質を単離するための低廉な原料源
として工業的に重要である。
酵母は簡単に培養することができかつ長年の経験から工
業的規模で簡単に醗酵させることができる。下等な真核
生物に含まれる単細胞生物の酵母は真核生物の典型的な
特徴を有するが、遺伝学的実験及び遺伝学的操作に使い
易く、特に組換え体DNA工学の点で宿主生物として好適
であり、つまり生物学的に活性なポリペプチド及び蛋白
質の相同及び非相同表現に好適である。
従来、組換体DNA工学において最も頻繁に使われる宿主
生体のE.コリ中では多数の非相同表現蛋白質は相同系
（すなわち真核細胞中での真核細胞の蛋白質のための
系）で表現されるその天然物とは多くの点で異なりかつ
生物学的に活性ではないか、あるいは不溶性の不活性蛋
白質凝集物（“レフレクタイル ボデイ:refractile bo
dies"）として析出する。多くの真核生物の蛋白質は、
E.コリ中では不活性で表現され、酵母中では溶解性かつ
活性で形成される。〔“Biotechnology and Genetic En
gineering Reviews",３,377〜416頁（1985年）〕。とり
わけこのことは、酵母が典型的な真核生物の翻訳後修飾
系，例えば蛋白質の折りたたみ，蛋白質成熟，グリコシ
ル化及びアセチル化を介して分泌可能でありかつポリペ
プチド及び蛋白質中のジスルフイド架橋の形成を可能に
することにより惹起されるのであろう。更に、酵母は病
原性ではなくかつE.コリとは異なり毒素及び発熱原性細
胞壁成分を含有していない。
酵母中での相同及び非相同ポリペプチド及び蛋白質の表
現のためには通常プロモーター、表現すべき遺伝子・タ
ーミネーター及び場合によりプロモーターに正に及び／
又は負に影響する調節遺伝子１つ又は複数からなる表現
カセツトを使用する。この表現ユニツトは酵母/E.コリ
ーハイブリツドベクター（シヤトルベクター）上に存在
する。酵母中での挙動により、YRp、YEp、YIp及びYCPと
呼ばれる４種のシヤトルベクターに類別される。YRp-プ
ラスミドは酵母中での自律複製のために酵母からの染色
体複製源（autonomous replicating sequence＝ARS）を
有し、他方YEp-プラスミドはこの機能を環状染色体外酵
母‐DNA（２μm-DNA）から受け取る。これらは通常細胞
あたり５〜40個のコピーで存在する。YCp-プラスミドは
自律複製配列の他にセントロメアを有し、このために染
色体のように挙動する。YIp-プラスミドは染色体酵母域
に相同の配列を有し、相同組換えにより酵母染色体のこ
の領域に統合されうる。しかしながら、これらのプラス
ミドは酵母細胞中には低いコピー数で存在するので、相
同又は非相同蛋白質を遺伝子操作により製造するために
あまり好適ではない。YRp-及びYEp-プラスミドは選択圧
なしに、細胞増殖の際に失なわれる（Nature、第305
巻、1983年、第391〜397頁）、すなわちプラスミドのな
い細胞は非選択性発酵の際に富化する、それというのも
これらのプラスミドを有さない細胞はその増殖において
有利であり、迅速に成長し、これにより形質転換細胞の
量は発酵の経過において常に減少するためである。従つ
て、プラスミド含有酵母細胞に関する選択のためにはプ
ラスミド中に使用した酵母細胞の必須生合成経過におけ
る酵素欠損を補なうか、もしくは細胞に培地中の薬剤及
び化学薬品（メトトレキサート（Methotrexat）、クロ
ランフエニコール、G418、ヒグロマイシンＢ）の解毒の
ための酵素活性を付与する、栄養要求性マーカー（例え
ば、URA3、LEU2、TRP1）及び耐性マーカー（例えば、DH
FR、CAT、ホスホトランスフエラーゼ）を組み込む。相
応する欠損酵母株又は一定の化学薬品を含有する培地を
使用する場合、非形質転換細胞もしくはプラスミド欠損
細胞は妨たげられて、プラスミド含有細胞の多い集団が
得られる。
酵母表現ベクターの構成のためには主に、例えばヘキソ
キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、トリオースホスフ
エートイソメラーゼ、グリセリンアルデヒド‐3-ホスフ
エート‐デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセラートキナ
ーゼ、エノラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベート‐
デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼの
ような強く表現される解糖遺伝子のプロモーター及びこ
れに属するターミネーターを使用する。しかしながら、
これらは多くの場合構成性に（すなわちこれらは一定量
の遺伝子生産物を生産する）、もしくは非常に弱く調節
されており、このことは細胞にとつて有毒なポリペプチ
ドや蛋白質の表現を強く妨げるか、もしくは不可能とす
ることができる。従つて、調節された表現のためには通
常天然の調節されたプロモーター、例えばGAL1-、GAL10
-、PHO5-、ヒートシヨツク‐蛋白質‐、MFα1-及びCUP1
-プロモーターを使用する。強い表現及び厳密な調節の
組み合わせ（抑制比に対するできるだけ大きな誘導比も
しくは抑制解除比）のために、できるだけ強く、構成性
のプロモーター、例えばGAP-DH及びCYC1-プロモーター
とのGAL1,10-もしくはADH II-プロモーターからの調節
部位（UAS、“upstream activation site"）とからなる
合成ハイブリツドプロモーターが開発された。しかしな
がら、これらのプロモーターの表現性及び誘導挙動はな
お理想的ではなく、得に、これらが高いコピー数で細胞
中に存在するプラスミド上にある場合は理想的ではな
い。これらのプロモーターの多くは工業的規模での経済
的誘導に関して欠点を示す。こうして、例えばPHO5-プ
ロモーターはポスフエート消耗により抑制解除される。
プロモーターは“GAL1,10-上方域活性化部位（upstream
activation site）”の影響下に高価な誘導物質ガラク
トースを最大誘導のために必要とする。調節されたMFα
1-プロモーターはsirts-突然変異体中37℃でのみ抑制さ
れ、24℃への温度低下により誘導される。他のプロモー
ターは例えば銅のような有毒重金属を誘導のために必要
とする。
従つて、実地においては、発酵の終わりまで安価なC-源
の使用により抑制解除されるか、又は／及び最適なバイ
オマスにおける定常期において安価な誘導物質によりな
お誘導されるようなプロモーターが特に好適である。こ
のことは、多くの細胞性遺伝子が定常期に止められ、こ
れにより表現された生産物の精製を簡単にすることがで
きる（高い比活性）という利点を有する。定常期におけ
るプロテアーゼの高められ表現は例えばプロテアーゼ欠
失酵母株の使用により扱うことができる。
良好に調節され、グルコースにより抑制され、かつマル
トースにより誘導可能な酵母プロモーターが、S.カール
スベルゲンシス（S.carlsbergensis、MAL1、２、3.4及
び６）のマルターゼ（α‐グルコシダーゼ）及びS.セレ
ビシアエ（S.cerevisiae）の、遺伝学的に詳細には特徴
付けされていないマルターゼ下に見い出された。このプ
ロモーターの利点は安いC-源（グルコース、マルトー
ス）により大規模でも安価に調節することができるとい
うことである。しかし、従来MAL6S-α‐グルコシダーゼ
だけがクローン化され、そのプロモーター配列のみが公
知である（Gene、第41巻、1986年、第75〜84頁）。
しかしながら、プロモーター、“上方活性部位（upstre
am activation site）”、構成遺伝子及びターミネータ
ーからなる、S.セレビシアエからのクローン化α‐グル
コシダーゼ遺伝子である形質転換体はマルトース及び高
めた遺伝子量（すなわち、高めたコピー数で細胞中に存
在するプラスミド上にある表現すべき遺伝子）での誘導
により、僅かな表現のみを示すことが判明した。
発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題は真核細胞中での表現のための表
現ベクターを提供することであり、該ベクターは簡単
で、かつ安価な方法でその作用を調節することができ、
かつ対数増殖期にも定常期にもできるだけ効果的な遺伝
子表現を可能とするプロモーターを含有する。
課題を解決するための手段 この課題は調節可能なプロモーターを真核細胞系DNA中
に挿入して有する真核細胞系表現ベクターにおいて、こ
のベクターがプロモーターとしてα‐グルコシダーゼpI
-プロモーター域のDNA-配列を短縮形で含有し、この際
少なくとも核α−グルコシダーゼpIの翻訳開始コドンか
ら867塩基上流の地点（ヌクレオチド−867）から全上方
域が、そして最高で該α−グルコシダーゼpIの翻訳開始
コドンから140塩基上流の地点（ヌクレオチド−140）か
ら全上方域が欠失していることを特徴とすることにより
解決する。
すなわち、完全なα‐グルコシダーゼpI-プロモーター
のかわりに短縮したα‐グルコシダーゼpI-プロモータ
ーを使用すると、同質及び非同質蛋白質又は蛋白質含有
遺伝子生産物の表現、例えば翻訳後修飾した、すなわち
例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化蛋白質
の表現を改良することができるということが意外にも判
明した。この際、α‐グルコシダーゼ‐pI-遺伝子のATG
-開始コドンのヌクレオチドＡをプロモーター配列の番
号付けのための関連点＋１とする。“上方”という語は
挙げた範囲に対してDNA-配列の５′‐末端の方向にある
配列を表わす。α‐グルコシダーゼpI-遺伝子の配列を
第1a図中のそれぞれ最上段に、それぞれ中段に示したMA
L6S-遺伝子（MAL6S-マルターゼ）と比較して示した。本
発明の有利な実施例においてはα‐グルコシダーゼ‐pI
-プロモーター域のDNA−配列においてα−グルコシダー
ゼpIの翻訳開始コドンから427塩基上流の地点（ヌクレ
オチド−427）から全上方配列、特に386塩基上6050地点
（ヌクレオチド−386）のSspI−切断位の上方域が欠失
している。この際、ヌクレオチド＋１の上方プロモータ
ー配列の残つた部分は場合により更に例えば置換、欠失
及び付加のような部分‐又は単独ヌクレオチド‐改変を
示してもよい。しかしながら、α‐グルコシダーゼ‐プ
ロモーターの最大活性を得るために、有利にはヌクレオ
チド‐103と‐109との間の範囲は変えないで（100％同
質）ヌクレオチド‐23と‐43との間の範囲でこの配列を
第1a図に示した配列に対して少なくとも95％まで同質に
すべきである。
ヌクレオチド＋１〜−140の間の範囲は相応する第1a図
中の配列に少なくとも90％まで同質であるのが特に有利
である。
本発明による表現ベクターとは複製源を有し、独立して
増殖することのできるDNA-分子を表わす必要はなく、宿
主細胞‐DNA中に組換により組込まれ、かつその転写が
宿主DNAの転写と共に行なわれる統合DNA-フラグメント
であつてもよい。
もう１つの有利な実施形においては、表現ベクターが付
加的に１つ又は複数の正の調節遺伝子を有する。これに
より、α‐グルコシダーゼpI-ブロモーターの短縮DNA-
配列のプロモーター活性を高めることができる。MAL-遺
伝子座からの正の調節遺伝子を使用するのが有利であ
る。この種のMALp-遺伝子は例えばゲネテイカ（Genetik
a）1976年、第12巻、第87〜100頁に記載されている。構
成性であるが、なおグルコース抑制可能なα‐グルコシ
ダーゼプロモーターを生成する突然変異の正の調節遺伝
子を組込むのが有利である。この種の突然変異調節遺伝
子はmalp-調節突然変異体の突然変異誘発による復帰細
胞の、すなわち再び唯一のＣ源としてマルトースで成長
する状態にある突然変異の単離により得られる。復帰細
胞の所望の表現型（構成性であるが、グルコース抑制可
能なマルターダ）はグルコース生成により測定する。引
き続き、突然変異した正の調節遺伝子を公知法によりク
ローン化し、次いで表現ベクター中に導入する。正の調
節遺伝子としてMAL2-8cp-遺伝子（第６図参照）を表現
ベクター中に挿入するのが特に有利である。この遺伝子
は典型的なMAL2p-遺伝子の突然変異体対立遺伝子に関し
てコードする。構成性であるが更にグルコース抑制可能
な遺伝子表現はこれに由来する（MGG、第134巻、1974
年、第261〜272頁;Current Genetics、第９巻、1985
年、第539〜545頁）、更に有利な実施形においては、本
発明による表現ベクターは表現の際に外来遺伝子が短縮
α‐グルコシダーゼpI-プロモーターのコントロールに
従う位置に外来遺伝子の組込みを可能とする制限切断位
を付加的に有している。更に有利な実施形においては、
本発明による表現ベクターは外来遺伝子の組込みのため
にポリリンカー域、すなわち多数の制限切断位を有する
合成DNA-域を有し、これにより外来遺伝子の組込は著し
く容易になる。この際、このポリリンカー域も、表現ベ
クター中に挿入される外来遺伝子が短縮α‐クルコシダ
ーゼpI-プロモーターのコントロール下にある表現ベク
ター中の位置にある。
真核細胞系表現ベクターへの更なる一般的で、公知の要
求に関してはヴインナツカー（E.L.Winnacker）著、ゲ
ン・ウント・クローネ（Gene und Klone）、1985年、ケ
ミー出版（Verlag Chemie）、第５及び８章に記載され
ている。
調節可能なプロモーターが挿入されている、本発明によ
る表現ベクター中の真核細胞系DNAとしては、それぞれ
の真核宿主細胞に使用可能なすべてのDNA-分子、例えば
プラスミド、ビールス、統合線状DNA分子、合成染色体
等である。DNAがプラスミド又は統合DNA-フラグメント
であるのが有利である。ここで、DNAが細胞中に高いコ
ピー数で存在するプラスミドであるのが特に有利であ
る。酵母細胞中で本発明による表現ベクターの発現を実
施する場合、ベクターとして細胞中に高いコピー数で存
在する酵母ベクターを使用するのが有利である。このよ
うなベクターの例はYEp-及びYRp-ベクターである。
この際YEp/S3、YEp/S4及びYEp/5C6b3が特に有利であ
る。この特に有利なベクターの製造は例３及び４に記載
されている。
同様に、表現すべき遺伝子としてα‐グルコシダーゼPI
に関する遺伝子を有する本発明による表現ベクターが特
に有利である。
本発明のもう１つの課題は、本発明による真核細胞系表
現ベクターの１つに所望の蛋白質又は遺伝子生産物をコ
ードするDNA-配列を挿入し、得られたベクターを形質転
換により好適な宿主細胞に入れ、該細胞を恒温保持し、
生じた蛋白質又は遺伝子生産物を細胞から又はその培地
から単離することにより、真核宿主細胞中で同質又は非
同質の蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物を調節可能に
製造する方法である。
同質又は非同質蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物を製
造するために本発明による真核細胞系表現ベクターを使
用することにより、全α‐グルコシダーゼpI-プロモー
ター域を含有する表現ベクターを使用する場合より著し
く高い蛋白質の収率が意外にも得られる。所望の蛋白質
の表現は本発明による方法において、有利にグルコース
により抑制され、マルトースにより誘導される。これに
より、所望の蛋白質の最大表現は宿主細胞の十分なバイ
オマスが形成された後はじめて誘導する可能性が生じ、
このことにより高い収率が達せられる。
真核細胞系ベクター中にDNA-配列を挿入する公知法及び
真核細胞の形質転換は例えば前記のヴインナツカー（E.
L.Winnacker）著、ゲン・ウント・クローネ（Gene und
Klone）、1985年、ケミー出版（Verlag Chemie）、特に
第３、５及び８章及びそこに記載されている文献中に記
載されている。
宿主細胞として酵母細胞を使用するのが特に有利な実施
形である。この際、真核細胞系DNAとして、細胞中に高
いコピー数で存在する酵母プラスミドを有している表現
ベクターを使用することが特に有利である。このような
有利な表現ベクターの例はYEp/S3及びYEp/S4である。
更に有利な実施形においては、プロモーター配列に付加
的に正の調節遺伝子、特に有利にMAL2-8cp-遺伝子（第
６図参照）を有する表現ベクターを使用する。このよう
な表現ベクターは例えばYEp/5C6b3である。
更に有利な実施形においては、表現ベクターに加えて、
細胞中にα‐グルコシダーゼpI-プロモーターを刺激す
る、正の調節遺伝子を含有するDNA-フラグメント又はプ
ラスミドを導入する。このような調節遺伝子は再び有利
にMAL2−8cp-遺伝子である。
更に有利な実施形においては、自体正の調節遺伝子（例
えばMALp-遺伝子）を有する宿主細胞を使用し、この際
この調節遺伝子が宿主細胞中で過剰表現されている時、
特に有利である。
他の本発明の有利な実施形においては、α‐グルコシダ
ーゼPIに関するDNA-配列を本発明による表現ベクター中
に挿入し、α‐グルコシダーゼPIを本発明による方法の
所望な生産物として単離する。
本発明により、容易で廉価な方法で調節することがで
き、所望の遺伝子生産物をコードする外来遺伝子をその
中に挿入することのできる表現ベクターを製造すること
も、本発明により達せられる。更に、相同及び非相同蛋
白質又は蛋白質含有遺伝子生産物を真核宿主細胞中、特
に酵母中で製造することを該表現ベクターの使用下に可
能とする方法を創ることが達せられ、この際宿主細胞の
増殖期における最大表現の時点は簡単なしかし効果的な
調節により決定される。
実施例 次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
S.セレビシアエ（cerevisiae）からのα‐グルコシダー
ゼpI-プロモーター DNAの操作のためには、マニアテイス（Maniatis）等に
よりモレキユラー・クローニング（Molecular Cloning;
Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbo
r、New York）中に記載されている標準法を使用した。
使用した分子生物学的試薬は製造者の記載に従つて使用
した。
S.セレビシアエをベツグス（Beggs）の形質転換法（Nat
ure、第275巻、1978年、第104〜109頁）により形質転換
を行なつた。
α‐グルコシダーゼ比活性の測定 酵母形質転換体及び酵母を最少培地＜YNB（yeast nitro
gen base、塩／ビタミン混合物、Difco社）0.67％、CAA
（カサミノ酸、蛋白質加水分解物、Difco社）0.5％、ア
デニン30mg/＞及び所望のC-源（２〜３％）中で培養
した。対数増殖期〜後期対数増殖期において培地5mlか
ら細胞をとり、燐酸塩緩衝液、pH6.8、10ミリモル／
で１回洗浄し、回転ミキサーで均質化することにより砕
解し、細胞破片を遠心分離により分離する（MGG、第145
巻、1976年、第327〜333頁）。
α‐グルコシダーゼ比活性の測定はp-ニトロフエニル‐
α‐D-グリコピラノシドの加水分解（MGG、第151巻、19
77年、第95〜103頁）及びツアーメンホーフ（Zamenho
f）による蛋白質測定（Methods in Enzymol.第３巻、19
57年、第702頁）により行なう。
例 １ S.セレビシアエからのα‐グルコシダーゼpI-プロモー
ターのクローン化及びS.カールスベルゲンシス（carlsb
ergensis）からの同質MAL6S-プロモーターとの配列比較 S.セレビシアエからのα‐グルコシダーゼpI-遺伝子を
栄養要求性マルターゼ構成遺伝子突然変異体TCY70（α
‐mall S-△ura3-57）（MGG、第200巻、1985年、第１〜
８頁）、DSM4315の相補性により酵母遺伝子プールから
公知法により単離する。α‐グルコシダーゼpI-遺伝子
を約3.5kBpの長さのDNA-フラグメントで、クローニング
のために使用した酵母‐/E.コリ‐シヤトルベクターYRU
7のBam HI-切断位中に統合した。YRU7は公知酵母ベクタ
ーYRp7（PNAS、第76巻、1979年、第1035〜1039頁;Natur
e、第282巻、1979年、第39〜43頁;Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.、第43巻、1979年、第77〜90頁;Gen
e、第10巻、1980年、第157〜166頁）から、このYRp7のP
vu II-切断位に、酵母ベクターYEp24（Gene、第８巻、1
979年、第17〜24頁;Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bi
ol.、第43巻、1979年、第77〜90頁;Gene、第29巻、1984
年、第113〜124頁;Nature、第286巻、1980年、第860〜8
65頁）からのURA3-酵母マーカー（Hind III-フラグメン
ト、クレノウ（Klenow）‐ポリメラーゼで突出した５′
‐末端を満たすことにより1.1kBp）を挿入することによ
り生じる。このα‐グルコシダーゼpI-遺伝子だけ広げ
たベクターYRp/GLUCPIを寄託し（DSM4173P）、第２図中
に示した。このα‐グルコシダーゼpI-遺伝子をチエイ
ン切断反応（Didesoxy ketten-abbruchreaktion;PNAS、
第74巻、1977年、第5463〜5467頁;J.Mol.Biol.,第143
巻、1980年、第161〜178頁）により配列決定し、S.カー
ルスベルゲンシスからのMAL6S-マルターゼ遺伝子（Gen
e、第41巻、1986年、第75〜84頁）と比較した（第1a
図）。
マルターゼ‐もしくはα−グルコシダーゼpI-プロモー
ターは、マルトースの存在でマルターゼ及びマルトース
ペルミアーゼの相関合成をひきおこす、２方向に活性な
プロモーター（分岐プロモーター）である。この分岐MA
L6S-及びα‐GLUCPI-プロモーターはマルターゼ及びマ
ルトースペルミアーゼに関するTATAボツクス、mRNA-開
始点及び翻訳開始に関して同じである。しかしながら、
分岐MAL6S-プロモーターはα‐グルコシダーゼpI-プロ
モーターの約1.2kBpと異なり、わずか約800Bpからな
る。主な差はそれぞれ147BpのDNA-部分の３回の繰り返
しである（“トリプレツト‐リピート”、関連点ATG-グ
ルコシダーゼpI＋１において位置‐427〜−867）。同質
プロモーター域において更に33個のDNA-配列差が見い出
された。ターミネーター域は非常に僅かな配列差異を示
すにすぎない（第1a図及び第1b図）。
例 ２ 完全なα‐グルコシダーゼ‐pI-表現カセツトを有する
α‐グルコシダーゼpI-表現ベクターの製造 “上方活性側（upstream activation site）”、構成遺
伝子及びターミネーターを備える分岐プロモーターから
なる完全α‐グルコシダーゼ‐pI-表現カセツトを有す
るプラスミドYRp/GLUCPI、DSM4173Pを制限エンドヌクレ
アーゼSca Iで消化し、約3.3kBpの長さのSca I-フラグ
メントを単離し、かつYEp24から単離した5.6kBp長さのP
vu II/Sma I-ベクターフラグメント（Gene、第８巻、19
79年、第17〜24頁）に結合する。生じたプラスミドYEp/
5C16及びYEp/5C17（第３図Ａ及び第３図Ｂ）はα‐グル
コシダーゼ‐pI-表現カセツトをβ‐ラクタマーゼ遺伝
子に対して同じ方向で、もしくは対向方向で有する。構
造YEp/5C12（第３図Ｃ）は２つのα‐グルコシダーゼpI
-カセツトをβ‐ラクタマーゼ遺伝子に対して同じ方向
に順に（タンデム配列に）接続して有する。このベクタ
ーはα‐グルコシダーゼpIの長さ1068Bpのプロモーター
域、構造遺伝子及びターミネーターを有し、マルトース
ペルミアーゼプロモーター及びこれに属するTATAボツク
スを有さないことを特徴とする（第1b図） これらのα‐グルコシダーゼpI表現プラスミド（“トリ
プレツト‐リピートを有するプロモーター”）を有する
酵母株TCY70、DSM4315、（αmal1S-△ura3-52）（MGG、
第200巻、1985年、第１〜８頁）及びABYSMAL81（構造は
例７参照）（ura3-52mal1S-△lys pra1 prb1 prc1 cps
1）の形質転換体は最少培地（YNB0.67％、CAA0.5％、ア
デニン30mg/）上、グルコース２％の抑制条件下に対
数増殖期〜後期対数増殖期においてわずか約0.2U/mgの
表現値（α‐グルコシダーゼ比活性）を達成する。マル
トース誘発（マルトース２％を有する最少培地中での過
剰供給）により、約1U/mgの表現値が達せられた（第７
図の表）。α‐グルコシダーゼ表現に関しては、これら
の転質転換体は高い遺伝子量（“タンデム配列”での２
コピー、“マルチコピー"-プラスミド）にもかかわらず
野生型株（酵母）とほとんど変わらない。
例 ３ 短縮α‐グルコシダーゼPI-プロモーターを有するベク
ターの製造 例１に記載したベクターYRp/GLUCPIを制限エンドヌクレ
アーゼSsp I及びHind IIIで消化し、約3.0kBpの長さのS
sp I/Hind III-フラグメントを単離し、YEp24から単離
したPvu II/Sph I-ベクターフラグメントに、Hind III-
制限切断位の突出した５′‐末端を満たし、かつSph I-
制限切断位の突出した３′‐末端を切断したあと、クレ
ノウ‐ポリメラーゼで結合する。生じたプラスミドYEp/
S3及びYEp/S4（第３図Ｄ及び第３図Ｅ）はα‐グルコシ
ダーゼpI-表現カセツトをβ‐ラクタマーゼ遺伝子に対
して同じ方向で、もしくは対向方向で含有する。これら
は、α‐グルコシダーゼプロモーターが−386位（Ssp I
-切断位、関連点ATG α‐グルコシダーゼ＋１）で開始
し、こうして“トリプレツト‐リピート”が欠失してい
ることを特徴とする。
短縮プロモーターを有するα‐グルコシダーゼpI表現プ
ラスミドを有する酵母株TCY70、DSM4315及びABYSMAL81
（例７）の形質転換はグルコースにより抑制可能であり
（グルコース２％を含有する最少培地）、かつマルトー
ス２％を含有する最少培地で最大誘導が達せられる。β
‐ラクタマーゼ遺伝子に対して対向方向において、1.5
〜２倍高い比表現値が達せられる（第７図の表参照）。
例 ４ 短縮α‐グルコシダーゼpI-プロモーターをマルターゼ
調節遺伝子MAL2-8cpと組合わせて有するα‐グルコシダ
ーゼpI-表現プラスミドの製造 ツインマーマン（Zimmermann）等により単離され（MG
G、第134巻、1974年、第261〜272頁）、直前にクローン
化されたMAL2-8cp突然変異体対立遺伝子（Curr.Gen.第
９巻、1985年、第539〜545頁、配列は第６図参照）は構
成性であるが、更にグルコースにより抑制可能なMAL2S-
マルターゼの合成に作用する。
この突然変異体対立遺伝子を含有するプラスミドpRM2、
DSM4314P（Curr.Gen.第９巻、1985年、第539頁〜545
頁）を制限エンドヌクレアーゼSal Iで消化し、突出し
た５′‐末端をクレノウポリメラーゼで満たし、Bam H1
-リンカー（ｄ（CGGGATCCCG））をつけ、Bam H1で後切
断し、約3.1kBpの長さのMAL2-8cp-遺伝子を含有するBam
H1-フラグメントを単離し、例３に記載し、Bam H1で消
化したベクターYEp/S4に結合する。このベクター構造を
YEp/5C6b3とする（第３図Ｆ）。
短縮α‐グルコシダーゼpI-プロモーターを有するプラ
スミド上のMAL2-8cp-遺伝子の存在は形質転換体の成長
に影響を与えず、すべての使用した培地上で（例２参
照）1.5〜２倍の表現値（第７図の表）に導びく。更
に、選択的にMAL2-8cp-遺伝子を共形質転換により酵母
中に取り込み、その効果を生じさせることもできる。
例 ５ 抑制性基質グルコースの使用によりプラスミドをコード
するα‐グルコシダーゼのグルコース抑制及び抑制解除 ABYSMAL81-形質転換体における最少培地中でのグルコー
ス使用によるα‐グルコシダーゼpIの抑制解除を例えば
種々の異なるα‐グルコシダーゼ表現カセツトYEp/5C1
6、YEp/S4及びYEp/5C6b3に関して抑制解除動力学（第４
図）を記録することにより測定する。550nmにおける混
濁につき、細胞成長をかつα‐グルコシダーゼｐ比活性
を約30時間の間測定した。同様にグルコース消費の時点
を調べた。
α‐グルコシダーゼpI-プロモーター構造及びMAL2-8cp
の存在に依存せずに、グルコース消費の後α‐グルコシ
ダーゼpI-比活性は20時間で５〜10のフアクターだけ上
昇する（第４図）。プロモーターの短縮又は／及びMAL2
-8cp-遺伝子の存在は達成すべき最大α‐グルコシダー
ゼpI-比活性を調節する。
例 ６ α‐グルコシダーゼpI-表現カセツトの使用下に、α‐
グルコシダーゼのN-末端部とHIV1-抗原からなる融合蛋
白質の非同質表現 α‐グルコシダーゼPI-表現ベクターYEp/5C6b3（例４）
中で、α‐グルコシダーゼPIの約80％に関してコードす
る、長さ1.4kBpのBgl II-フラグメントをHIV1-レトロウ
イルスのgp41-膜蛋白質の１部をコードする、長さ約300
BpのDNA-フラグメントと交換する。このためには長さ約
300Bp Rsa I/Hind III-フラグメント（配列比較;Cell第
45、1986年 第637〜648頁の第１図からの1638位〜1943
位のWMJ-1の配列）をHinc II及びHind IIIで消化したE.
コリ‐ベクターpUC18（M13mp18及びpUC19配列;Gene、第
33巻、1985年、第103〜119頁）中にサブクローン化する
（構造:pUC18 HRH.300）。pUC18 HRH.300から長さ約320
BpのBam H 1/Hind III-フラグメントを単離し、長さ約
5.2BpのpUR278 Bam H1/-Hind III-ベクターフラグメン
トに連結する（EMBO第２巻、1983年、第1791〜1794頁中
の配列）（構造:pUR278 HRH.300）。プラスミドpUR278
HRH.300をHind IIIで消化し、突出した５′‐末端を
“クレノウ・ポリメラーゼ”で満たし、配列ｄ（GGGATC
CC）のBam HI-リンカーをつける。その後Bam HIで後切
断し、長さ約300BpのBam HI-フラグメントを単離し、長
さ約11kBpのYEp/5C6b3-Bgl II-ベクターフラグメントに
連結する。gp41-膜ポリペプチド‐DNAの正しい方向付け
において、α‐グルコシダーゼのN-末端（アミノ酸50
個）、融合位での構造限定アミノ酸４個、gp41-膜蛋白
質のアミノ酸101個及びC-末端の構造限定アミノ酸３個
からなる分子量約18500Dの融合蛋白質が生じる。所望の
構造を、プロテアーゼ欠損酵母表現株ABYSMAL81、例７
中で表現された融合蛋白質を介して形質転換及び培養に
より（下と比較）、引き続きSDS-ゲル電気泳動及び人HI
V1-血清との免疫反応性によるウエスタンブロツトによ
り単離する。融合蛋白質は全蛋白質の約５％まで表現さ
れ、SDS-ポリアクリルアミドゲル中で支配的なバンドと
してクーマシー（coomassie）‐染色により可視となつ
た（第５図）。α‐Gluc.pI-gp41-融合蛋白質の表現の
ためには転質転換体をグルコース２％及びマルトース２
％を含有する選択培地（YNB0.67％、CAA0.5％、アデニ
ン30mg/）上で培養する。10〜20時間の誘導時間後
（グルコース消費後）、細胞を収穫する。
例 ７ サツカロマイセス株ABYSMAL81の製造のためにハプロイ
ド・サツカロマイセス・セレビシアエ（haploide Sacch
aromyces cerevisiae）株ABYSD-11（a pra1 prb1 prc1
prd1、cps1、ade lys his7）、DSM4322（これはプロテ
アーゼに関してはＡ、Ｂ及びＤを及びカルボキシペプチ
ダーゼＹ及びＳを欠失しており、かつ付加的にアデニン
‐、ヒスチジン‐及びリジン‐生合成における栄養要求
性を有する）とサツカロマイセス・カールスベルゲンシ
ス（Saccharomyces carlsbergensis）株、TCY2824-1A、
（αmal1S-△ura3-52his4）、DSM4317（これは欠失α‐
グルコシダーゼ‐構造遺伝子により及びウラシル‐及び
ヒスチジン‐生合成における栄養要求性により特徴付け
られている）とを交配した。
引き続き、胞子形成を実施し、生じた酵母‐分離体をそ
の栄養要求性に関して種々の選択培地上にぬることによ
り、かつそのプロテアーゼ欠失に関して細胞溶解物中の
プロテアーゼ活性の測定により試験した。株ABYSMAL81
（ura3-52、mal1S-△lys pra1 prb1 prc1 cps1）を次の
方法により同定する。
プロテアーゼ欠失の証明 分離体をYEPD-培地（酵母抽出物１％、ペプトン２％、
グルコース２％）5ml中で培養し、細胞を後期対数増殖
期〜早期定常期までに収穫し、水で２回洗浄し、ガラス
球と共に回転ミキサー上で均質にすることにより砕解す
る（MGG第145巻、1976年、第327〜333頁）。該細胞を20
ミリモル／トリス（Hcl）、pH7.0で抽出し、遠心分離
後の上澄を粗抽出物として、その先使用する。プロテア
ーゼの活性化のためには粗抽出物をpH5に調整し、25℃
で24時間恒温保持する。
プロテアーゼA-欠失（pra1）の証明 細胞抽出物による1.2％酸変性ヘモグロビン、pH3.0の加
水分解なし（Eur.J.Biochem.第42巻、1974年、第621〜6
26頁）。
1.2％酸変性ヘモグロビンを含有する0.1モル／乳酸塩
緩衝剤0.5mlを細胞溶解物0.1mlと共に25℃で恒温保持す
る。30分後に反応を10％トリクロル酢酸0.5mlで中止
し、遠心分離後トリクロル酢酸溶解性生成物を280nmで
吸光測定するか、又はマクドナルド（Mc Donald）及び
チエン（Chen）による改変ホリン測定（Anal.Biochem.
第10巻、1965年、第175〜177頁）により測定する。
比活性の計算のためにはツアーメンホーフ（Zehmenho
f）による蛋白質測定を実施した（Methods Enzymol.第
３巻、1957年、第702頁）。
酸変性ヘモグロビンに対する細胞溶解物の加水分解比活
性が野性型との比較において５％より低く低下する時、
プロテアーゼＡ欠失は存在する。
プロテアーゼB-欠失の証明（prb1） pH7におる2.4％アゾコール（Azocoll）の、細胞抽出物
による加水分解なし（Eur.J.Biochem.第42巻、1974年、
第621〜626頁）。
燐酸塩緩衝液、pH7.0 0.1モル／中の2.4％アゾコー
ル懸濁液0.5mlを細胞溶解物0.1mlと共に25℃で振盪下に
恒温保持する。プロテアーゼＢの活性化のために活性測
定前に粗抽出物にナトリウムドデシルスルフエート（最
終濃度0.25％）を混合する。
30分後に10％トリクロル酢酸0.5mlを添加して反応を中
止し、遠心分離の後、上澄の550nmにおける吸光度を測
定する。
アゾコールに対する細胞溶解物の加水分解比活性が野生
型との比較において５％より低くまで低下されている
時、プロテアーゼB-欠失が存在する。
プロテアーゼD-欠失（prd1）の証明 アミノペプチダーゼＭの存在において、トリス‐マレエ
ート緩衝液pH7.0 50ミリモル／中の0.5ミリモル／
Bz-Pro-Phe-Arg-NA（Benzoyl-L-Prolyl-L-phenylalan
yl-L-arginyl-p-nitroanilid）の、細胞抽出物による加
水分解なし（J.Biol.Chem.第260巻、1985年、第4585〜4
590頁）。
テスト原理： 0.5モル／トリス‐マレエート緩衝液、pH7.0、0.03ml
を10mmol/ Bz-Pro-Phe-Arg-NA（ジメチルスルホキシ
ド中に溶解）0.015ml、アミノペプチダーゼ10μ（40
μｇ、240mU）、水0.145ml及び粗抽出物0.1mlと混合
し、試薬空値に対して405nmで吸光変化を測定する。
Bz-Pro-Phe-Arg-NAに対する加水分解比活性が野性型株
と比較して10％より低く低下する時、プロテアーゼD-欠
失が存在する。
カルボキシプピチダーゼY-欠失（prc1）の証明 ベンゾイル‐L-チロシン‐4-ニトロアニリド、pH7、0.5
ミリモル／の、細胞抽出物による加水分解なし（Agr.
Biol.Chem.第35巻、1971年、第658〜666頁）。
デオキシコレートで活性化した（最終濃度0.5％）粗抽
出物0.1mlを0.1モル／燐酸塩緩衝液、pH7.0、10ml及
び３ミリモル／ベンゾイル‐L-チロシン‐4-ニトロア
ニリド（ジメチルホルムアミド中に溶解）0.2mlと25℃
で恒温保持した。10分後に反応を１ミリモル／塩化水
銀1mlで中止し、遊離したp-ニトロアニリンを410nmで測
定した。
ベンゾイル‐L-チロシン‐4-ニトロアニリドに対する加
水分解比活性が野性型株と比較して５％より低くまで低
下した時、カルボキシペプチダーゼY-欠失は存在する。
カルボキシペプチダーゼS-欠失（cps1）の証明 pH7.4におけるCbz-Gly-Leu（ベンジルオキシカルボニル
‐グリシル‐L-ロイシン）の、細胞抽出物による加水分
解、引き続くL-アミノ酸オキシダーゼ‐ペルオキシダー
ゼテストにおける遊離したロイシンの分析において加水
分解なし（Eur.J.Biochem.第73巻（1977）、第553〜556
頁） 試験液（L-アミノ酸オキシダーゼ0.25mg/ml、西洋ワサ
ビ・ペルオキシダーゼ0.4mg/ml及びMnCl20.5ミリモル／
）0.5ml、27.5ミリモル／ Cbz-Gly-Leu溶液0.4ml
（0.2モル／燐酸緩衝液、pH7.0中に溶解）、o-ジアニ
シジンジヒドロクロリド（2mg/ml、H2O中に溶解）0.05m
l、22ミリモル／フエニルメチルスルホニルフルオリ
ド0.05ml及び透析した細胞溶解物0.1ml（透析:0.1モル
／イミダゾールクロリド、pH5.3、24時間、25℃）を
混合し、405nmで吸光変化を測定。
Cbz-Gly-Leuに対する加水分解比活性が野性型株との比
較において５％より低く低下する時、カルボキシペプチ
ダーゼY-欠失が存在する。
前記の証明により、株ABYSMAL81はプロテアーゼＡ、Ｂ
及びカルボキシペプチダーゼＹ及びＳに関して欠失して
いることが確認された。
マルトース利用‐栄養要求性の証明 酵母窒素塩基（YNB、塩‐ビタミン混合物、Difco社）0.
67％、カサアミノ酸（CAA、蛋白質加水分解物、Difco
社）0.5％、マルトース２％（唯一のC-源）、ウラシル2
0mg/及びアデニン30mg/を含有する合成完全培地Ｉ
上に成長せず。
ウラシル栄養要求性の証明 YNB0.67％、CAA0.5％、グルコース２％（唯一のC-源）
及びアデニン30mg/を含有する合成完全培地II上で成
長せず。
リジン‐栄養要求性の証明 ウラシル（20mg/）を含有するがリジンは含有しない
合成完全培地II（CAA0.5％のかわりにリジンを含有しな
いアミノ酸混合物を使用）上で成長せず。
ヒスチジン‐及びアデニン‐原栄養性の証明 ウラシル（20mg/）を含有し、アデニンを含有せず、
かつヒスチジンを含有しない（CAA0.5％のかわりにヒス
チジン不含アミノ酸混合物を使用した）合成完全培地II
上での成長。
【図面の簡単な説明】
第1a図はMAL6Sマルターゼ遺伝子に比較したα‐グルコ
シダーゼpI-遺伝子のDNA配列を示す図を表わし、第1b図
はMAL6Sとの比較におけるGLUCPIのプロモーター構成を
示す（Cohen等著、MGG、第200巻、第１〜８頁、1985
年、Hong及びHarmur著、Gene、第41巻、第75〜84頁（19
86年）参照）図である。第２図はプラスミドYRp/GLUCPI
の概略図であり、第３図は例中で製造したベクター構造
を概略的に示す図であり、Ａ〜ＦはそれぞれYEp/5C16、
YEp/5C17、YEp/5C12、YEp/S3、YEp/S4及びYEp/5C6b3を
表わす。図面中の数値はEcoRI消化による制限フラグメ
ントの大きさに関連する。 第４図は（Ａ）真正α‐グルコシダーゼ‐プロモータ
ー、（Ｂ）短縮形α‐グルコシダーゼ‐プロモーター及
び（Ｃ）短縮形で、MAL2-8cp刺激α‐グルコシダーゼプ
ロモーターの調節における、グルコース最小培地中での
ABYSMAL81形質転換体のα‐グルコシダーゼpIの抑制解
除曲線を示す図である。 第５図は宿主株ABYSMAL81中で表現されたα‐グルコシ
ダーゼpI-env-融合蛋白質のSDS-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動分析を示す図であり、Ａ及びＢはそれぞれク
ーマシー染色及び免疫プロツト分析によるものである。
第６図はMAL2-8cp-遺伝子のDNA-配列を示す図である。
第７図は酵母α‐グルコシダーゼ‐形質転換体の挙動に
関する表を示す図である。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】調節可能なプロモーターを真核細胞系DNA
    中に挿入して有する真核細胞系表現ベクターにおいて、
    プロモーターとして次のα−グルコシダーゼpI−プロモ
    ーター域のDNA−配列； を短縮形で含有し、この際少なくとも該α−グルコシダ
    ーゼpIの翻訳開始コドンから867塩基上流の地点から全
    上方域が、そして最高で該α−グルコシダーゼpIの翻訳
    開始コドンから140塩基上流の地点から全上方域が欠失
    していることを特徴とする真核細胞系表現ベクター。
  2. 【請求項２】α−グルコシダーゼpI−プロモーター域の
    DNA−配列においてα−グルコシダーゼpIの翻訳開始コ
    ドンから427塩基上流の地点から全上方配列が欠失して
    いる請求項１記載の真核細胞系表現ベクター。
  3. 【請求項３】α−グルコシダーゼpI−プロモーター域の
    短縮DNA−配列においてα−グルコシダーゼpIの翻訳開
    始コドンから386塩基上流の地点から全上方配列が欠失
    している請求項１記載の真核細胞系表現ベクター。
  4. 【請求項４】付加的に正の調節遺伝子を含有する請求項
    １から３までのいずれか１項記載の真核細胞系表現ベク
    ター。
  5. 【請求項５】表現すべき外来遺伝子としてα−グルコシ
    ダーゼpIに関する遺伝子を含有する請求項１から４まで
    のいずれか１項記載の真核細胞系表現ベクター。
  6. 【請求項６】次の制限地図を有する表現ベクターYEp/S
    3; B,BamH I;E,EcoR I;H,Hind III;S,Sca I:Sm,Sma I;Ss,S
    sp Iである請求項１記載の真核細胞系表現ベクター。
  7. 【請求項７】次の制限地図を有する表現ベクターYEp/S
    4; B,BamH I;E,EcoR I;H,Hind III;S,Sca I:Sm,Sma I;Ss,S
    sp Iである請求項１記載の真核細胞系表現ベクター。
  8. 【請求項８】次の制限地図を有する表現ベクターYEp/5C
    6b3; B,BamH I;E,EcoR I;H,Hind III;S,Sca I:Sm,Sma I;Ss,S
    sp Iである請求項１記載の真核細胞系表現ベクター。
  9. 【請求項９】真核宿主細胞中で相同及び非相同蛋白質又
    は蛋白質含有遺伝子生産物を調節可能に製造する方法に
    おいて、請求項１から４までのいずれか１項記載の真核
    細胞系表現ベクター中に所望の蛋白質又は遺伝子生産物
    をコードするDNA−配列を挿入し、得られたベクターを
    形質転換により好適な宿主細胞中に導入し、該細胞を培
    養し、生じた蛋白質又は遺伝子生産物を細胞又はその培
    地から単離することを特徴とする真核宿主細胞中での相
    同及び非相同蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の調節
    可能な製法。
  10. 【請求項１０】請求項１から３までのいずれか１項記載
    の表現ベクターを使用し、かつ該宿主細胞中に、正の調
    節遺伝子を含有する、プラスミド又は統合DNA−フラグ
    メントを導入することを特徴とする請求項９記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】所望の遺伝子生産物としてα−グルコシ
    ダーゼpIのDNA−配列を挿入する請求項９又は10記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】真核細胞中で相同及び非相同蛋白質又は
    蛋白質含有遺伝子生産物を調節可能に製造する方法にお
    いて、請求項５から８までのいずれか１項記載の表現ベ
    クターを形質転換により好適な宿主細胞中に導入し、該
    細胞を培養し、生じた蛋白質又は遺伝子生産物を細胞又
    はその培地から単離することを特徴とする真核宿主細胞
    中での相同及び非相同蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産
    物の調節可能な製法。
  13. 【請求項１３】請求項６又は７記載の表現ベクターを使
    用し、かつ該宿主細胞中に、正の調節遺伝子を含有す
    る、プラスミド又は統合DNA−フラグメントを導入する
    ことを特徴とする請求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】所望の遺伝子生産物としてα−グルコシ
    ダーゼpIのDNA−配列を挿入する請求項12又は13記載の
    方法。
JP64000167A 1988-01-05 1989-01-05 真核細胞系表現ベクター、及び真核宿主細胞中での相同及び非相同蛋白質又は蛋白質含有遺伝子生産物の調節可能な製法 Expired - Lifetime JPH074262B2 (ja)

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