JPH074267B2 - 免疫グロブリンａ結合性抗体 - Google Patents
免疫グロブリンａ結合性抗体Info
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- JPH074267B2 JPH074267B2 JP59-500553A JP50055384A JPH074267B2 JP H074267 B2 JPH074267 B2 JP H074267B2 JP 50055384 A JP50055384 A JP 50055384A JP H074267 B2 JPH074267 B2 JP H074267B2
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56944—Streptococcus
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、連鎖球菌グループＢから単離可能な、免疫グ
ロブリンＡ（IgA）に結合する抗原及びこれを単離する
方法、更にナイセリア（Neisseria）属細菌の感染が起
つているか否かを知るために、哺乳動物の体液を検査す
ることを含む種々の目的に該抗体を使用することに関す
る。
ロブリンＡ（IgA）に結合する抗原及びこれを単離する
方法、更にナイセリア（Neisseria）属細菌の感染が起
つているか否かを知るために、哺乳動物の体液を検査す
ることを含む種々の目的に該抗体を使用することに関す
る。
IgAは、既に知られている様に、免疫グロブリンの１つ
であり、粘膜表面でバクテリア及びビールスの感染に対
して免疫性を示すことに関係のある１種の抗体である。
そしてそれは、すべての哺乳動物の分泌物、例えば体乳
液、唾液及び月経液（vaginal washings）中に存在す
る。
であり、粘膜表面でバクテリア及びビールスの感染に対
して免疫性を示すことに関係のある１種の抗体である。
そしてそれは、すべての哺乳動物の分泌物、例えば体乳
液、唾液及び月経液（vaginal washings）中に存在す
る。
すべての人間の抗体と同様に、IgAは重鎖と軽鎖成分か
ら成つており、結晶性分画（Fc）と抗体分画（Fab）で
特徴づけられる。IgA（免疫グロブリンＡ）には２つの
小分類IgA1及びIgA2がある。これらは重鎖の構造で異つ
ている。更に、抗体は血清中ではモノマー態（分子量約
160,000）及びダイマー態で存在するが、哺乳動物の分
泌物中ではダイマー態のみが存在する。そしてこれは分
泌片といわれるもうひとつの分子分画（moiety）に付着
している。IgA抗体は、すべての抗体と同様に、免疫組
織の中のリンパ球によつて産生される。分泌片は、例え
ば、乳房腺、消化管腺、唾液腺又は性尿器官のような体
内器官の表面を被う上皮細胞によつて産生される。リン
パ球によつて産生されたIgAは、循環血液と接触してい
る側で、上皮細胞により係留され（is picked up）、分
泌片が追補され分泌性IgAは上皮細胞の外表面で分泌さ
れる。
ら成つており、結晶性分画（Fc）と抗体分画（Fab）で
特徴づけられる。IgA（免疫グロブリンＡ）には２つの
小分類IgA1及びIgA2がある。これらは重鎖の構造で異つ
ている。更に、抗体は血清中ではモノマー態（分子量約
160,000）及びダイマー態で存在するが、哺乳動物の分
泌物中ではダイマー態のみが存在する。そしてこれは分
泌片といわれるもうひとつの分子分画（moiety）に付着
している。IgA抗体は、すべての抗体と同様に、免疫組
織の中のリンパ球によつて産生される。分泌片は、例え
ば、乳房腺、消化管腺、唾液腺又は性尿器官のような体
内器官の表面を被う上皮細胞によつて産生される。リン
パ球によつて産生されたIgAは、循環血液と接触してい
る側で、上皮細胞により係留され（is picked up）、分
泌片が追補され分泌性IgAは上皮細胞の外表面で分泌さ
れる。
細菌性及びビールス性感染に抵抗する過程で、IgAは既
知のルートで抗原の不活性化（neutralization）の働き
をする。感染によつて生起する抗原とIgAとの間の相互
作用を検出することに依る臨床的試験が感染の有無を知
るために考案され広く利用されている。
知のルートで抗原の不活性化（neutralization）の働き
をする。感染によつて生起する抗原とIgAとの間の相互
作用を検出することに依る臨床的試験が感染の有無を知
るために考案され広く利用されている。
連鎖球菌グループＢは、既に詳細に研究され分類されて
いる微生物であるが、此の物類に属する菌種（member）
でIgAに結合することが知られているものは無い。しか
しこれら連鎖球菌の或る種のもの、一般的に云つて、血
清型Ib又はIcのものがIgAに結合する能力のあることが
発見された。更に、IgA結合性蛋白（IgABP）を、結合が
生起する連鎖球菌グループＢの表面から分離する手段も
発見された。
いる微生物であるが、此の物類に属する菌種（member）
でIgAに結合することが知られているものは無い。しか
しこれら連鎖球菌の或る種のもの、一般的に云つて、血
清型Ib又はIcのものがIgAに結合する能力のあることが
発見された。更に、IgA結合性蛋白（IgABP）を、結合が
生起する連鎖球菌グループＢの表面から分離する手段も
発見された。
そのための１つの方法は、連鎖球菌を稀薄な鉱酸水溶液
中で50℃乃至60℃で、1.5乃至2.5時間加熱することであ
る。好適な酸は、例えば0.15乃至0.25Mの稀塩酸である
が、他の稀鉱酸も採用し得る。好適な方法は0.2M塩酸で
２時間、56℃の条件で加熱することである。溶液は例え
ば0.2M苛性ソーダのような稀アルカリ試薬で中和する。
所望の物質（product）はトリクロル酢酸又は他の試薬
を加えて沈殿させそれから精製することが出来る。
中で50℃乃至60℃で、1.5乃至2.5時間加熱することであ
る。好適な酸は、例えば0.15乃至0.25Mの稀塩酸である
が、他の稀鉱酸も採用し得る。好適な方法は0.2M塩酸で
２時間、56℃の条件で加熱することである。溶液は例え
ば0.2M苛性ソーダのような稀アルカリ試薬で中和する。
所望の物質（product）はトリクロル酢酸又は他の試薬
を加えて沈殿させそれから精製することが出来る。
他の代替方法は連鎖球菌を、非イオン活性剤の稀薄溶液
中に36乃至72時間、好適には40乃至50時間、浸す。蛋白
はエタノールのような選択した試薬によつて沈殿する。
中に36乃至72時間、好適には40乃至50時間、浸す。蛋白
はエタノールのような選択した試薬によつて沈殿する。
本発明に係るIgABP（IgA結合性蛋白）を単離する好適な
方法は、陰イオン活性剤中で煮沸することである。
方法は、陰イオン活性剤中で煮沸することである。
本発明に好適な非イオン活性剤としては、例えばトリト
ンＸ−100及びトウイン20がある。両者は共に既知であ
り、商業的に入手可能。前者はポリエチレングリコール
ｐ−イソオクチルフエニルエーテルであり、後者はポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエートである。此処
で選択した陰イオン活性剤は商業入手可能なドデシル硫
酸ソーダ塩（SDS）である。又他のものも既知であり、
使用可能である。
ンＸ−100及びトウイン20がある。両者は共に既知であ
り、商業的に入手可能。前者はポリエチレングリコール
ｐ−イソオクチルフエニルエーテルであり、後者はポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエートである。此処
で選択した陰イオン活性剤は商業入手可能なドデシル硫
酸ソーダ塩（SDS）である。又他のものも既知であり、
使用可能である。
本発明に係るIgABPを陰イオン活性剤を用いて分離する
に好適な方法は次の通りである。
に好適な方法は次の通りである。
連鎖球菌グループＢの菌株H36B5の10mlをトツド−ヒウ
ィツト（Todd−Hewitt）培養器で対数期後期迄培養す
る。細菌は遠心分離によつてペレツト化し、次いで２％
SDS水溶液の1ml中で10分間煮沸した。
ィツト（Todd−Hewitt）培養器で対数期後期迄培養す
る。細菌は遠心分離によつてペレツト化し、次いで２％
SDS水溶液の1ml中で10分間煮沸した。
細菌は遠心分離で除去し、上澄液中の蛋白は0.5mlの30
％トリクロル酢酸を加えて沈殿した。遠心分離で得たペ
レツトはエタノールで１回、アセトンで１回洗浄した。
％トリクロル酢酸を加えて沈殿した。遠心分離で得たペ
レツトはエタノールで１回、アセトンで１回洗浄した。
残留したペレツトは25mlの標準SDS−PAGE煮沸液中に懸
濁させて、10％ポリアクリルアミドスラブゲル中で電気
泳動に付した。コーマシブリリアントブルー（coomassi
e brilliant blue）でゲルを染色してから脱色液中にお
くと、SDS-PAGEパターンが現われた。これは分子量132,
000の蛋白に相当するSDS-PAGE移動度を示す単一バンド
から主として成っているが、分子量132,000−40,000の
分子量範囲の他の副次的バンドも多数現われた。
濁させて、10％ポリアクリルアミドスラブゲル中で電気
泳動に付した。コーマシブリリアントブルー（coomassi
e brilliant blue）でゲルを染色してから脱色液中にお
くと、SDS-PAGEパターンが現われた。これは分子量132,
000の蛋白に相当するSDS-PAGE移動度を示す単一バンド
から主として成っているが、分子量132,000−40,000の
分子量範囲の他の副次的バンドも多数現われた。
IgA結合性蛋白を得るための第２の方法は、SDS−PAGE電
気泳動を行つて後に、ニトロセルローズ ストリツプの
上にウエスタン ブロツト（Western blotting）を行う
方法である。そして此のストリツプを0.05％トウイン20
液に30分間浸漬してから、125Iで標識したIgAの１×107
cpmを4mg/mlの濃度で４時間ストリツプに付着させた。
次いでストリツプは0.05％トウイン20液で十分に洗浄
し、写真フイルムに当てて感光させる方法である。この
テクニツクによつて、示された事は、SDS−PAGEで観察
された主要な蛋白及び他の副次蛋白が125I−IgAに結合
する能力をもつていること及びそれ故写真フイルムに感
光したことであつた。
気泳動を行つて後に、ニトロセルローズ ストリツプの
上にウエスタン ブロツト（Western blotting）を行う
方法である。そして此のストリツプを0.05％トウイン20
液に30分間浸漬してから、125Iで標識したIgAの１×107
cpmを4mg/mlの濃度で４時間ストリツプに付着させた。
次いでストリツプは0.05％トウイン20液で十分に洗浄
し、写真フイルムに当てて感光させる方法である。この
テクニツクによつて、示された事は、SDS−PAGEで観察
された主要な蛋白及び他の副次蛋白が125I−IgAに結合
する能力をもつていること及びそれ故写真フイルムに感
光したことであつた。
IgABPの分子量の評価で用いた分子量マーカーは次の通
り：βガラクトシダーゼ（136K）、ヒトトランスフエリ
ン（transferrin）（80K）、オバルブミン（45K）、チ
トクロームＣ（12.5K）。
り：βガラクトシダーゼ（136K）、ヒトトランスフエリ
ン（transferrin）（80K）、オバルブミン（45K）、チ
トクロームＣ（12.5K）。
SDS−PAGEは、ドデシル硫酸ソーダ及びポリアクリルア
ミド ゲル電気泳動（ｓodium ｄodecyl ｓulfate and
ｐolyａcrylamide ｇel ｅlectrophoresis）を用いる蛋
白性物質の分離方法で、周知であり広く用いられてい
る。
ミド ゲル電気泳動（ｓodium ｄodecyl ｓulfate and
ｐolyａcrylamide ｇel ｅlectrophoresis）を用いる蛋
白性物質の分離方法で、周知であり広く用いられてい
る。
連鎖球菌グループＢから本発明のIgABPを分離する手順
は、例えば稀酸又は活性剤の様な細胞表面への蛋白の付
着を破壊する物質を含有する水溶性媒体中で、生成物の
抽出を行うことを常に含んでいる。抽出は培養が対数期
にある時に実施することが好ましい。目的物（derived
material）は、エタノールの様な蛋白沈澱試薬によつて
抽出物から沈澱分離する。目的物が連鎖球菌基質から分
離されたら、本明細書に記載の様にして単離し、精製出
来る。そうでなければ、生成物の溶液を比較的稀薄或い
は不純な状態で利用してもよい。
は、例えば稀酸又は活性剤の様な細胞表面への蛋白の付
着を破壊する物質を含有する水溶性媒体中で、生成物の
抽出を行うことを常に含んでいる。抽出は培養が対数期
にある時に実施することが好ましい。目的物（derived
material）は、エタノールの様な蛋白沈澱試薬によつて
抽出物から沈澱分離する。目的物が連鎖球菌基質から分
離されたら、本明細書に記載の様にして単離し、精製出
来る。そうでなければ、生成物の溶液を比較的稀薄或い
は不純な状態で利用してもよい。
これ迄、本発明の有用生成物を単離するための３つの方
法を記述した。最後の方法において、本発明の生成物は
SDS−PAGE電気泳動において分子量132000であることが
示された。これは本発明のIgABP生成物と特性である。
即ちSDS−PAGE電気泳動に付された時の見掛け（apparen
t）分子量は132,000である。
法を記述した。最後の方法において、本発明の生成物は
SDS−PAGE電気泳動において分子量132000であることが
示された。これは本発明のIgABP生成物と特性である。
即ちSDS−PAGE電気泳動に付された時の見掛け（apparen
t）分子量は132,000である。
もし上記の生成物をトリクロル酢酸又はエタノールで沈
澱させたまゝで２％SDS液中で煮沸し、更に好適とした
手順で処理すると、SDS−PAGE電気泳動では、他の主要
バンド及び副次バンドが現われる。これらのバンドの出
現は分子量の相違を示すものである。しかし、それらは
IgAに結合する能力を持つている。
澱させたまゝで２％SDS液中で煮沸し、更に好適とした
手順で処理すると、SDS−PAGE電気泳動では、他の主要
バンド及び副次バンドが現われる。これらのバンドの出
現は分子量の相違を示すものである。しかし、それらは
IgAに結合する能力を持つている。
従つて、本発明の生成物、即ちIgA結合性蛋白は、蛋白
と結合する固定部分及び違つた長さを持ち、結合部分に
関連している変動部分によつて特性づけられる。これは
一連の矢（arrow）があつて、その長さはすべて異る
が、同じ目的に役立つ。それは長さの異るシヤフトはす
べて１つの矢頭をもつている故であることに喩えられ
る。
と結合する固定部分及び違つた長さを持ち、結合部分に
関連している変動部分によつて特性づけられる。これは
一連の矢（arrow）があつて、その長さはすべて異る
が、同じ目的に役立つ。それは長さの異るシヤフトはす
べて１つの矢頭をもつている故であることに喩えられ
る。
連鎖球菌グループＢ由来のIgA結合蛋白は今までに報告
されていなく、その単離についても報告されていない。
されていなく、その単離についても報告されていない。
本発明の新規なIgABPの特性は次の２つの異つた固相シ
ステムに活用することが出来る。そのひとつは、結合タ
ンパクを、カラムクロマトグラフィの様の固相支持物に
吸着させること。第２の主な用途は、IgABPをプラスチ
ツクプレート、特定して云えば、試験用ウエル（well）
の様な吸着面に結合させて、酵素吸着検定（enzymu lin
kedimmunosorbent assay、ELISA）として知られている
試験に使用し得ることである。
ステムに活用することが出来る。そのひとつは、結合タ
ンパクを、カラムクロマトグラフィの様の固相支持物に
吸着させること。第２の主な用途は、IgABPをプラスチ
ツクプレート、特定して云えば、試験用ウエル（well）
の様な吸着面に結合させて、酵素吸着検定（enzymu lin
kedimmunosorbent assay、ELISA）として知られている
試験に使用し得ることである。
第１のタイプの固定相の利用は：
1. IgA結合性蛋白を固相吸着させることは、血清等他
のすべてのヒト体液からIgAを除くことに利用出来る。
溶離液にはIgAは含まれていない。従つて分泌物、血清
等からIgA属の抗体を選択的に除去することを目的とす
る場合、有効である。又一方、IgA免疫グロブリンは何
か目的があれば高純度で固相支持物から回収することが
出来る。
のすべてのヒト体液からIgAを除くことに利用出来る。
溶離液にはIgAは含まれていない。従つて分泌物、血清
等からIgA属の抗体を選択的に除去することを目的とす
る場合、有効である。又一方、IgA免疫グロブリンは何
か目的があれば高純度で固相支持物から回収することが
出来る。
2. IgA結合性蛋白が固相吸着剤として役立つことは、I
gA抗体に対する抗原の特異反応性（spcificity）を決め
ることに使用し得る。即ち放射性元素で標識を付した抗
原混合物をIgA抗体を含有する血清又は分泌物に加え
る。抗原−抗体反応を生起させてから、固体支持物を加
え、選択的にIgA抗体及びIgAと特異的に結合する抗原の
みを結合させる。固体支持物を十分洗浄し、結合した抗
原の量を放射線測定で検知する。結合抗原の本質（natu
re）はゲル電気泳動分析及び自動放射写真法（autoradi
ography）又は螢光写真法（fluorography）によつて試
験できる。
gA抗体に対する抗原の特異反応性（spcificity）を決め
ることに使用し得る。即ち放射性元素で標識を付した抗
原混合物をIgA抗体を含有する血清又は分泌物に加え
る。抗原−抗体反応を生起させてから、固体支持物を加
え、選択的にIgA抗体及びIgAと特異的に結合する抗原の
みを結合させる。固体支持物を十分洗浄し、結合した抗
原の量を放射線測定で検知する。結合抗原の本質（natu
re）はゲル電気泳動分析及び自動放射写真法（autoradi
ography）又は螢光写真法（fluorography）によつて試
験できる。
第２の固定相（プラスチツクプレート）の利用として
は： 1. IgA結合性蛋白は血清又は分泌物中のIgAの濃度の決
定に利用出来る。ひとつの方法はポリスチレン又は他の
プラスチツクプレートを用いて、その表面にIgA結合性
蛋白を吸着させることである。適当に洗浄してから、プ
レートを試験する体液の種々な稀薄液に浸し、適宜な保
温（incubation）の後に、洗浄する。IgAの結合はアル
カリフオスフターゼ酵素に結合していた（conjugate）
軽鎖に特異性のある抗体の存在によつて検知される。此
の酵素の存在、従つて軽鎖は、パラニトロフエニルフオ
スフエートからパラニトロフエノール発色団が遊離する
ことで検知される。
は： 1. IgA結合性蛋白は血清又は分泌物中のIgAの濃度の決
定に利用出来る。ひとつの方法はポリスチレン又は他の
プラスチツクプレートを用いて、その表面にIgA結合性
蛋白を吸着させることである。適当に洗浄してから、プ
レートを試験する体液の種々な稀薄液に浸し、適宜な保
温（incubation）の後に、洗浄する。IgAの結合はアル
カリフオスフターゼ酵素に結合していた（conjugate）
軽鎖に特異性のある抗体の存在によつて検知される。此
の酵素の存在、従つて軽鎖は、パラニトロフエニルフオ
スフエートからパラニトロフエノール発色団が遊離する
ことで検知される。
2. IgA結合蛋白は淋病（gonorrhea）の感染を検出する
システムとして使用出来る。原理は、病原淋菌が、サブ
クラスIgA1を包含するヒトIgAを、ヒンジ領域として知
られている領域で、分子の中央から分裂させる能力のあ
る酵素を同化することである。従つて、３つの分画片が
出来ることになる。即ち分子のFc部分と２つ同一のFab
分画片である。後者が以前の（intact）IgA1分子の軽鎖
を保有している。試験はIgA結合性蛋白でプラスチツク
プレートをコートする。洗浄後プレートをヒトIgA1免疫
グロブリンに接触させる。洗浄後、分泌物又は月経液を
プレートウエルに加え、保温する。洗浄後、プレートを
アルカリフオスフアターゼに結合した反軽鎖抗体に接触
させ、そしてフオスフアターゼ基質であるｐ−ニトロフ
エニルフオスフエートで発色させる。もし分泌物が活性
なIgA蛋白分解酵素を含有していると、Fab部分は分子か
ら引裂かれて、軽鎖はプレートウエルから消失してい
る。発色の程度が低ければ、それは、IgA1蛋白分解酵素
の存在の指標となる。
システムとして使用出来る。原理は、病原淋菌が、サブ
クラスIgA1を包含するヒトIgAを、ヒンジ領域として知
られている領域で、分子の中央から分裂させる能力のあ
る酵素を同化することである。従つて、３つの分画片が
出来ることになる。即ち分子のFc部分と２つ同一のFab
分画片である。後者が以前の（intact）IgA1分子の軽鎖
を保有している。試験はIgA結合性蛋白でプラスチツク
プレートをコートする。洗浄後プレートをヒトIgA1免疫
グロブリンに接触させる。洗浄後、分泌物又は月経液を
プレートウエルに加え、保温する。洗浄後、プレートを
アルカリフオスフアターゼに結合した反軽鎖抗体に接触
させ、そしてフオスフアターゼ基質であるｐ−ニトロフ
エニルフオスフエートで発色させる。もし分泌物が活性
なIgA蛋白分解酵素を含有していると、Fab部分は分子か
ら引裂かれて、軽鎖はプレートウエルから消失してい
る。発色の程度が低ければ、それは、IgA1蛋白分解酵素
の存在の指標となる。
3. IgA結合蛋白は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidi
s）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、D
iplococcusu pneumoniae（肺炎球菌）によつて引き起さ
れるバクテリア性髄膜炎の存在を検知することに使用出
来る。これらの微生物はすべて同様なIgA1分解性プロテ
アーゼを産生する。試験は、分解酵素（プロテアーゼ）
の存在を、髄膜炎の疑いのある患者に対して通常行う腰
部穿刺によつて得られる背柱液で行うことを除いて、前
記第２項で記述した方法と同一に行えばよい。
s）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、D
iplococcusu pneumoniae（肺炎球菌）によつて引き起さ
れるバクテリア性髄膜炎の存在を検知することに使用出
来る。これらの微生物はすべて同様なIgA1分解性プロテ
アーゼを産生する。試験は、分解酵素（プロテアーゼ）
の存在を、髄膜炎の疑いのある患者に対して通常行う腰
部穿刺によつて得られる背柱液で行うことを除いて、前
記第２項で記述した方法と同一に行えばよい。
4. IgA結合性蛋白は、IgAに属する抗体の特異反応性を
決定することに使用し得る。IgAは人間の上皮細胞表面
に存在する主要は保護抗体であるから、IgAが反応する
バクテリア性、ビールス性抗原を測定し得るということ
に重要な意味がある。そして、これは次の手順でなし得
る。即ちIgA結合性蛋白をプレートにコートする。此の
プレートを結合反応に付する。洗浄後、抗原の存在を知
る検知システムは、例えばバクテリア性産生物又は問題
のビールスに対する抗体として使用する。そして、此の
過程で酵素又は放射性検出システムを利用する。
決定することに使用し得る。IgAは人間の上皮細胞表面
に存在する主要は保護抗体であるから、IgAが反応する
バクテリア性、ビールス性抗原を測定し得るということ
に重要な意味がある。そして、これは次の手順でなし得
る。即ちIgA結合性蛋白をプレートにコートする。此の
プレートを結合反応に付する。洗浄後、抗原の存在を知
る検知システムは、例えばバクテリア性産生物又は問題
のビールスに対する抗体として使用する。そして、此の
過程で酵素又は放射性検出システムを利用する。
5. IgA結合性蛋白はその２つのサブクラスのIgA1及びI
gA2の各々に含まれるIgA抗体を決定するのに用いられ
る。これは下記の点を除けば前記４項に記した方法と同
じ試験でなし得る。即ち特定の抗原を加える以前に、プ
レートに固定されたIgA1抗体を精製した淋菌又は他のIg
A1プロテアーゼで破壊する。前出実験記録第３項と第４
項による試験の間の反応性の相違によつてサブグラスの
抗体の関与程度が決定できる。
gA2の各々に含まれるIgA抗体を決定するのに用いられ
る。これは下記の点を除けば前記４項に記した方法と同
じ試験でなし得る。即ち特定の抗原を加える以前に、プ
レートに固定されたIgA1抗体を精製した淋菌又は他のIg
A1プロテアーゼで破壊する。前出実験記録第３項と第４
項による試験の間の反応性の相違によつてサブグラスの
抗体の関与程度が決定できる。
本発明の属する技術分野に精通した者は、此処に記述し
た本発明のIgABPを単離し、同定する手順を理解すれ
ば、その生成物を利用する手段を理解することは容易で
あろう。又IgABPを本発明の種々の実施態様の実施のた
めに、単離し精製することは本質的な問題ではない。実
際、例えば結合蛋白を含有しているクロマトグラフ・カ
ラムからの溶出液のように、結合蛋白を種々の濃度に含
んでいる組成物（compositions）を利用することは、殆
どずべての場合について便宜である。このような溶液は
下記の方法で作ることが出来る。
た本発明のIgABPを単離し、同定する手順を理解すれ
ば、その生成物を利用する手段を理解することは容易で
あろう。又IgABPを本発明の種々の実施態様の実施のた
めに、単離し精製することは本質的な問題ではない。実
際、例えば結合蛋白を含有しているクロマトグラフ・カ
ラムからの溶出液のように、結合蛋白を種々の濃度に含
んでいる組成物（compositions）を利用することは、殆
どずべての場合について便宜である。このような溶液は
下記の方法で作ることが出来る。
連鎖球菌グループＢの懸濁液を先づ、これがIgAと結合
することについて確かめる試験を行う。このためには、
連鎖球菌のペレツトを放射線標識したIgAと一緒にし
て、室温で20分間保温して、次いで結合した（conjugat
ed）IgAの存在を試験する。連鎖球菌グループＢの既知
の菌株でありそして一般に入手可能であり、かつ本発明
の実施に採用し得るものは、A909、F345−３及びH36B−
５である。最初の２菌株は血清型Ic。最後のものは血清
型Ib。
することについて確かめる試験を行う。このためには、
連鎖球菌のペレツトを放射線標識したIgAと一緒にし
て、室温で20分間保温して、次いで結合した（conjugat
ed）IgAの存在を試験する。連鎖球菌グループＢの既知
の菌株でありそして一般に入手可能であり、かつ本発明
の実施に採用し得るものは、A909、F345−３及びH36B−
５である。最初の２菌株は血清型Ic。最後のものは血清
型Ib。
選択した菌株の懸濁液は対数期で抽出に付される、即ち
１％乃至10％のドデシル硫酸ソーダ水溶液中で、10分乃
至２時間、pH約６乃至９で煮沸する。pHは臨界的ではな
いが0.1Mトリス−塩酸のような適当な緩衝液で上記の範
囲に保つことが都合よい。バクテリアは例えば、遠心分
離で分離される。蛋白は溶液中に残留するので既知の方
法で沈澱せしめる。例えば硫酸アンモニウム、エタノー
ル、又は他の蛋白沈澱剤を加える。
１％乃至10％のドデシル硫酸ソーダ水溶液中で、10分乃
至２時間、pH約６乃至９で煮沸する。pHは臨界的ではな
いが0.1Mトリス−塩酸のような適当な緩衝液で上記の範
囲に保つことが都合よい。バクテリアは例えば、遠心分
離で分離される。蛋白は溶液中に残留するので既知の方
法で沈澱せしめる。例えば硫酸アンモニウム、エタノー
ル、又は他の蛋白沈澱剤を加える。
沈澱を行うに最も便利な方法は、温度約０℃乃至10℃
で、エタノールを加えて、エタノール中60％乃至90％、
好適には65％乃至75％の混合物を作ることである。沈澱
物は、例えばグリシン−塩酸、酢酸ソーダ−酢酸、又は
酒石酸緩衝液のような適宜な緩衝液で約pH5.5乃至6.5に
保つた水中に再び懸濁する。pH5.5の10mM酒石酸緩衝液
が最も便宜である。此のpHでは、負に帯電している、汚
れたDNA又はRNAを除去するため、溶液は、沈澱分を可溶
化するために用いた同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セフ
アローズ（Sepharose）カラムを通す。吸着剤は正に帯
電しているので、DNA、RNAと容易に結合する。カラムか
らの溶出液は、上記したような種々の目的に対して有効
な濃度で結合タンパクを含んでいる。
で、エタノールを加えて、エタノール中60％乃至90％、
好適には65％乃至75％の混合物を作ることである。沈澱
物は、例えばグリシン−塩酸、酢酸ソーダ−酢酸、又は
酒石酸緩衝液のような適宜な緩衝液で約pH5.5乃至6.5に
保つた水中に再び懸濁する。pH5.5の10mM酒石酸緩衝液
が最も便宜である。此のpHでは、負に帯電している、汚
れたDNA又はRNAを除去するため、溶液は、沈澱分を可溶
化するために用いた同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セフ
アローズ（Sepharose）カラムを通す。吸着剤は正に帯
電しているので、DNA、RNAと容易に結合する。カラムか
らの溶出液は、上記したような種々の目的に対して有効
な濃度で結合タンパクを含んでいる。
DEAE−セフアローズはフアーマシア フアイン ケミカ
ルズ（Pharmacia Fine Chemicals）から入手可能。これ
はアーガローズ（argarose）から成るビーズ状のゲル
で、ジエチルアミノエチル誘導体にしたもの。他の陰イ
オン交換樹脂も使用可能である。
ルズ（Pharmacia Fine Chemicals）から入手可能。これ
はアーガローズ（argarose）から成るビーズ状のゲル
で、ジエチルアミノエチル誘導体にしたもの。他の陰イ
オン交換樹脂も使用可能である。
本発明を理解するための追加的な助けとして、淋菌又は
髄膜炎菌の感染を検知する方法をより詳細に記述する。
髄膜炎菌の感染を検知する方法をより詳細に記述する。
構成性細胞外酵素、IgA1プロテアーゼはナイセリア（Ne
isseria）属の菌、淋菌及び髄膜炎菌から放出される。
此の酵素はヒトIgA1を２つの分画、Fc分画とFab分画、
に分裂させる。連鎖球菌グループＢから単離されるIgAB
Pを利用する酵素吸着検定（ELISA）は、プロテアーゼの
検知、従つてナイセリア（Neisseria）属菌の存在を見
込んで本発明により開発されたものである。
isseria）属の菌、淋菌及び髄膜炎菌から放出される。
此の酵素はヒトIgA1を２つの分画、Fc分画とFab分画、
に分裂させる。連鎖球菌グループＢから単離されるIgAB
Pを利用する酵素吸着検定（ELISA）は、プロテアーゼの
検知、従つてナイセリア（Neisseria）属菌の存在を見
込んで本発明により開発されたものである。
この検定では、IgABP（酵素吸着検定用プレートに結合
している）は、IgAのFc部分に結合させるために用いら
れる。IgA1プロテアーゼはIgAを分裂させることが出
来、軽鎖を有するFab分画を放出する。軽鎖の存否（酵
素の存否に対応する）は、適宜な試薬を用いることで検
知し得る。
している）は、IgAのFc部分に結合させるために用いら
れる。IgA1プロテアーゼはIgAを分裂させることが出
来、軽鎖を有するFab分画を放出する。軽鎖の存否（酵
素の存否に対応する）は、適宜な試薬を用いることで検
知し得る。
検定は次の通りである。
1. IgABP（１−５μg/mlのIgABPを0.1M Tris HCl pH9.
8に溶かしたもの）を、100μ／ウエルを備えたELISA
プレートの表面に塗り、pH6−11で常温（20−40℃）
に、10−16時間放置する。
8に溶かしたもの）を、100μ／ウエルを備えたELISA
プレートの表面に塗り、pH6−11で常温（20−40℃）
に、10−16時間放置する。
2. プレートを、等張力食塩水、即ち0.9％食塩水中に
0.02％及び0.2％ブリージ（Brij）を含む水溶液で６回
洗滌する。
0.02％及び0.2％ブリージ（Brij）を含む水溶液で６回
洗滌する。
3. IgA（0.2−250μg/mlのIgAを10mMトリスHCl pH7.5
＋10mM MgCl20.05％ブリージ35中に溶かしたもの）を各
ウエルに加える。pHは５−10に保つ。１時間後、IgA1プ
ロテアーゼを含有する液（例、膣分泌液）をIgAに加え
る、そして15分乃至４時間常温で反応させる。
＋10mM MgCl20.05％ブリージ35中に溶かしたもの）を各
ウエルに加える。pHは５−10に保つ。１時間後、IgA1プ
ロテアーゼを含有する液（例、膣分泌液）をIgAに加え
る、そして15分乃至４時間常温で反応させる。
4. プレートを上述の方法で洗浄する。
5. 抗ヒト軽鎖血漿（sera）と結合しているアルカリ性
ホスフアターゼを各ウエルに加える。そして少くとも30
分間好ましくは１−２時間常温に保温する。
ホスフアターゼを各ウエルに加える。そして少くとも30
分間好ましくは１−２時間常温に保温する。
6. プレートを第２項記載のように洗浄する。
7. アルカリ性ホスフアターゼの基質であるパラニトロ
フエノールホスフエートを好ましくは緩衝液で、pH最低
７、好ましくは７−９に保ち、各ウエルに加える。そし
て最低30分間、好ましくは２時間に近い時間常温に保温
保持する。
フエノールホスフエートを好ましくは緩衝液で、pH最低
７、好ましくは７−９に保ち、各ウエルに加える。そし
て最低30分間、好ましくは２時間に近い時間常温に保温
保持する。
8. 吸光度405mnを測定し求める。
IgA1プロテアーゼに対して陰性のウエルは、IgAをその
まゝ（intact）含んでいる、従つて基質との反応で黄色
を呈する。IgA1プロテアーゼに対して陽性のウエルはそ
のまゝのIgAを含んでいない、従つて基質を加えたこと
による呈色反応を示さない。
まゝ（intact）含んでいる、従つて基質との反応で黄色
を呈する。IgA1プロテアーゼに対して陽性のウエルはそ
のまゝのIgAを含んでいない、従つて基質を加えたこと
による呈色反応を示さない。
ブリージ35は脂肪酸のポリオキシエチレンエーテルより
成る非イオン活性剤である。これは吸着表面を反応に無
関係な余計な蛋白の非特異性吸着から保護するために用
いるものである。塩化マグネシウムは必要成分ではな
く、特に燐酸緩衝液を用いる場合の好適成分である。Ig
A1プロテアーゼは最適の作用を果すには微量のマグネシ
ウムイオンを必要とする。
成る非イオン活性剤である。これは吸着表面を反応に無
関係な余計な蛋白の非特異性吸着から保護するために用
いるものである。塩化マグネシウムは必要成分ではな
く、特に燐酸緩衝液を用いる場合の好適成分である。Ig
A1プロテアーゼは最適の作用を果すには微量のマグネシ
ウムイオンを必要とする。
以上に説明した方法の各段階で、濃度、温度及び保温時
間等のパラメーターについては、悪い結果を及ぼすこと
なく、改変を加えることが出来ることは当業者にとつて
は明らかなことである。等価な他の緩衝液も使用し得
る。
間等のパラメーターについては、悪い結果を及ぼすこと
なく、改変を加えることが出来ることは当業者にとつて
は明らかなことである。等価な他の緩衝液も使用し得
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
//(Ｃ１２Ｐ 21/00
Ｃ１２Ｒ 1:46）
(72)発明者 ルセル―ジヨーンズ，グレゴリー ジエ
ー.
アメリカ合衆国、10021 ニユーヨーク、
ニユーヨーク、ヨーク アベニユー 1230
ソフイー フリツク ホール アパート
511
(56)参考文献 Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．５，Ｐ.
991−993（1981)
Claims (12)
- 【請求項１】ドデシル硫酸ソーダポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による測定で分子量132,000を有し且つヒ
トIgAのFc部分と特異的に反応することで特徴づけられ
るIgA結合性連鎖球菌グループＢから単離可能な免疫グ
ロブリンＡ（IgA）結合性蛋白。 - 【請求項２】免疫グロブリンＡ（IgA）との結合性を有
する連鎖球菌グループＢの表面から免疫グロブリンＡ結
合性蛋白を分離する方法であって、対数期にある上記連
鎖球菌を、その細胞表面と免疫グロブリンＡ結合性蛋白
との間の結びつきを解く物質を含有している水性媒体で
抽出し、該蛋白を含有する溶液を作り、これに蛋白沈殿
試薬を加えて、沈殿させることを特徴とする方法。 - 【請求項３】免疫グロブリンＡ（IgA）との結合性を有
する連鎖球菌グループＢの表面から免疫グロブリンＡ結
合性蛋白を分離する方法であって、 1. 対数期にある上記連鎖球菌を陰イオン界面活性剤を
含有する水性媒体で抽出すること、 2. 得られる混合物の固体部分を分離すること、 3. 蛋白沈殿試薬を加えて、得られる溶液から固相分を
沈澱させること、 を包含することを特徴とする方法。 - 【請求項４】抽出媒体がpH6乃至９の１％乃至10％のド
デシル硫酸ソーダから成る水性緩衝溶液であり、沈殿試
薬が０℃乃至10℃のエタノールであることを特徴とする
請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項５】抽出媒体が稀薄な塩酸水溶液であることを
特徴とする請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項６】免疫グロブリンＡ（IgA）との結合性を有
する連鎖球菌グループＢの表面から免疫グロブリンＡ結
合性蛋白を分離する方法であって、 1. 対数期にある上記連鎖球菌を非イオン界面活性剤を
含有する水性媒体で抽出すること、 2. 得られる混合物の固体部分を分離すること、 3. 蛋白沈殿試薬を加えて、得られる溶液から固相分を
沈殿させること、 を包含することを特徴とする方法。 - 【請求項７】抽出媒体がpH6乃至９のポリエチレングリ
コールｐ−イソブチルフェニルエーテル１％乃至10％の
水性緩衝溶液であり、沈殿試薬が０℃乃至10℃のエタノ
ールであることを特徴とする請求の範囲第６項の方法。 - 【請求項８】体液中に免疫グロブリンＡ（IgA）プロテ
ナーゼが存在することに特徴づけられる淋菌又は髄膜炎
菌の感染を検知する方法であって、 1. ドデシル硫酸ソーダポリアクリルアミドゲル電気泳
動法による測定で分子量132,000を有し且つヒトIgAのFc
部分と特異的に反応することで特徴づけられる免疫グロ
ブリンＡ（IgA）結合性蛋白溶液に吸収面を常温pH6乃至
11で接触させ、該吸収面を該グロブリン結合性蛋白でコ
ートすること、 2. 吸収面を、非イオン界面活性剤を含有する等張食塩
水溶液で洗浄すること、 3. 吸収面を、pH5乃至10で0.2乃至250μg/mlの濃度で
免疫グロブリンＡ（IgA）を含有する水溶液に接触させ
ることにより、IgAを吸収面上の結合性蛋白と結合させ
ること、 4. 感染の疑いのある哺乳動物の分泌液を加えて常温で
15分乃至４時間保持する、 5. 上記手順２と同様に洗浄する、 6. 抗ヒト軽鎖血清と結合しているアルカリ性ホスファ
ターゼを加えて最低30分間常温に保持する、 7. 吸収面を手順２と同様に洗浄する、 8. パラニトロフェノールホスフェートの緩衝液を加
え、pH最低７で、30分間ないし２時間常温に保持する、 9. 得られた液の405nmにおける吸光度を測定する、 手順を包含することを特徴とする方法。 - 【請求項９】手順３の溶液が塩化マグネシウムを含有し
ていることを特徴とする請求の範囲第８項の方法。 - 【請求項１０】免疫グロブリンＡ（IgA）結合性蛋白質
を固定相に吸収させてなる製品であって、当該蛋白質
が、ドデシル硫酸ソーダポリアクリルアミドゲル電気泳
動法による測定で分子量132,000を有し且つヒトIgAのFc
部分と特異的に反応することで特徴づけられるIgA結合
性連鎖球菌グループＢから単離可能な免疫グロブリンＡ
（IgA）結合性蛋白であることを特徴とする製品。 - 【請求項１１】前記固定相がカラムクロマトグラフィー
に使用する固相支持物である請求の範囲第10項の製品。 - 【請求項１２】前記固定相がプラスチックプレートであ
る請求の範囲第10項の製品。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44631782A | 1982-12-02 | 1982-12-02 | |
| US446317 | 1982-12-02 | ||
| PCT/US1983/001904 WO1984002194A1 (en) | 1982-12-02 | 1983-12-01 | IgA BINDING ANTIBODY |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60500029A JPS60500029A (ja) | 1985-01-10 |
| JPH074267B2 true JPH074267B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=23772137
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59500553A Pending JPH074267B1 (ja) | 1982-12-02 | 1983-12-01 | |
| JP59-500553A Expired - Lifetime JPH074267B2 (ja) | 1982-12-02 | 1983-12-01 | 免疫グロブリンａ結合性抗体 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59500553A Pending JPH074267B1 (ja) | 1982-12-02 | 1983-12-01 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0127681B1 (ja) |
| JP (2) | JPH074267B1 (ja) |
| AU (1) | AU563317B2 (ja) |
| CA (1) | CA1221626A (ja) |
| NO (1) | NO843094L (ja) |
| WO (1) | WO1984002194A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
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|---|---|---|---|---|
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| US4888416A (en) * | 1987-03-30 | 1989-12-19 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for stabilizing somatotropins |
| ATE78513T1 (de) * | 1987-05-13 | 1992-08-15 | Hightech Receptor Ab | Immunoglobulin-a-rezeptor-protein (arp), sowie dessen klonierung und expression. |
| EP0367890A1 (en) * | 1988-11-11 | 1990-05-16 | HighTech Receptor AB | Protein Arp, with immunoglobulin A binding activity, cloning and expression thereof |
| JPH06506114A (ja) * | 1991-03-29 | 1994-07-14 | ファウルマン， エルビン | 新規な遺伝子及びＩｇＡ結合蛋白質の製造方法 |
| US6280738B1 (en) | 1996-09-06 | 2001-08-28 | Baxter International Inc. | Non-IgA Fc binding forms of the group B streptococcal β antigens |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2848965A1 (de) * | 1978-11-11 | 1980-05-22 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung von membranproteinen aus neisseria meningitidis und diese enthaltende vaccine |
| US4271147A (en) * | 1980-01-10 | 1981-06-02 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same |
| US4413057A (en) * | 1980-04-14 | 1983-11-01 | Merck & Co., Inc. | Group B streptococcal capsular polysaccharides |
-
1983
- 1983-12-01 AU AU24307/84A patent/AU563317B2/en not_active Ceased
- 1983-12-01 JP JP59500553A patent/JPH074267B1/ja active Pending
- 1983-12-01 CA CA000442393A patent/CA1221626A/en not_active Expired
- 1983-12-01 EP EP84900422A patent/EP0127681B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-01 JP JP59-500553A patent/JPH074267B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-01 WO PCT/US1983/001904 patent/WO1984002194A1/en not_active Ceased
-
1984
- 1984-08-01 NO NO843094A patent/NO843094L/no unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．５，Ｐ．９９１−９９３（１９８１） |
Also Published As
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|---|---|
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| WO1984002194A1 (en) | 1984-06-07 |
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| EP0127681A4 (en) | 1988-06-16 |
| JPH074267B1 (ja) | 1995-01-25 |
| AU2430784A (en) | 1984-06-18 |
| EP0127681B1 (en) | 1993-03-03 |
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