JPH0743377B2 - 粒子混合物中の少なくとも２つの粒子グループの同時定量方法 - Google Patents
粒子混合物中の少なくとも２つの粒子グループの同時定量方法Info
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【発明の詳細な説明】 本発明は、生物媒体に含まれるアポリポタンパク質の２
つ以上のサブユニット（以下サブアセンブリとも表記す
るが同じ意味を示す）を同時に定量する新規な方法に係
る。
つ以上のサブユニット（以下サブアセンブリとも表記す
るが同じ意味を示す）を同時に定量する新規な方法に係
る。
本発明はまた、本発明方法に使用できる既製品の形態の
新規な平坦支持体（プレート又はフィルム）に係る。
新規な平坦支持体（プレート又はフィルム）に係る。
本発明はまた、本発明方法を実施するためのアッセイキ
ットを提供する。
ットを提供する。
最後に、本発明は、リポタンパク質粒子が保有する所定
のアポリポタンパク質の濃度が健康人の生理状態に対応
する該アポリポタンパク質濃度の上限値と下限値との間
の正常範囲から逸脱することに関連するアテローム性動
脈硬化症の危険を、本発明の定量法によってin vitro診
断する方法を提供する。
のアポリポタンパク質の濃度が健康人の生理状態に対応
する該アポリポタンパク質濃度の上限値と下限値との間
の正常範囲から逸脱することに関連するアテローム性動
脈硬化症の危険を、本発明の定量法によってin vitro診
断する方法を提供する。
タンパク異常血症が動脈病変の増大及び進行の主要素因
であることは完全に明らかとなった。
であることは完全に明らかとなった。
（Lipids Research Clinic Program.The lipid researc
h clinics colonary primary prevention trial result
s.I.Reduction in incidence of coronary heart disea
se.II.The relationship of reduction in incudence o
f coronary heart disease to cholesterol lowering.J
AMA、1984、251:351〜374;Ducimetiere P.,Richard J.,
L.Claude J.R.,Warnet J.M.Les cardiopathies ischemi
ques.Incidence et facteurs de risques.In:L′Etude
Prospective Parisienne、Paris、IN SERM 1981;Frucha
rt J.C.,Bertrand M.,Parra H.,Gentilini J.L.,Bonifa
ce B.Lipoproteines et apolipoproteines plasmatique
s.Interet de leur dosage dans le depistage de l′a
therosc−lerose coronarienne.Comparaison aves les
informations fournies par la coronarographie.Nouv.
Presse Med.,1982、111:3491〜3494）。
h clinics colonary primary prevention trial result
s.I.Reduction in incidence of coronary heart disea
se.II.The relationship of reduction in incudence o
f coronary heart disease to cholesterol lowering.J
AMA、1984、251:351〜374;Ducimetiere P.,Richard J.,
L.Claude J.R.,Warnet J.M.Les cardiopathies ischemi
ques.Incidence et facteurs de risques.In:L′Etude
Prospective Parisienne、Paris、IN SERM 1981;Frucha
rt J.C.,Bertrand M.,Parra H.,Gentilini J.L.,Bonifa
ce B.Lipoproteines et apolipoproteines plasmatique
s.Interet de leur dosage dans le depistage de l′a
therosc−lerose coronarienne.Comparaison aves les
informations fournies par la coronarographie.Nouv.
Presse Med.,1982、111:3491〜3494）。
これまで生物分析検査手順の一部として使用されている
コレステロール及びトリグリセリドの定量は、これらの
脂肪の運搬するリポタンパク質のクラス次第でアテロー
ム性動脈硬化症の危険が等しくないので、これらの定量
が適切な検査方法ではないことが判明してきた（Gordon
T.,Kannel W.B.,Castelli W.P.,Dawber T.R.Lipoprote
ins cardiovascular disease and death.The Framingha
m study.Arch.Intern.Med.,1981、141:1128〜1131）。
コレステロール及びトリグリセリドの定量は、これらの
脂肪の運搬するリポタンパク質のクラス次第でアテロー
ム性動脈硬化症の危険が等しくないので、これらの定量
が適切な検査方法ではないことが判明してきた（Gordon
T.,Kannel W.B.,Castelli W.P.,Dawber T.R.Lipoprote
ins cardiovascular disease and death.The Framingha
m study.Arch.Intern.Med.,1981、141:1128〜1131）。
電荷、密度、サイズ又は多価アニオンとの相互作用のご
とき物理化学的基準によるリポタンパク質の分類を利用
すると、血漿中には組織でのコレステロール沈着を促進
するリポタンパク質（LDL）と、組織コレステロールを
補捉して肝臓に運んで排出する「防御」リポタンパク質
（HDL）とが存在することが判明した（Polonovski J.,B
eucler I.Structure et matabolisme des lipoproteine
s plasmatigues.Pathol.Biol.,1983、31:225〜234）。
とき物理化学的基準によるリポタンパク質の分類を利用
すると、血漿中には組織でのコレステロール沈着を促進
するリポタンパク質（LDL）と、組織コレステロールを
補捉して肝臓に運んで排出する「防御」リポタンパク質
（HDL）とが存在することが判明した（Polonovski J.,B
eucler I.Structure et matabolisme des lipoproteine
s plasmatigues.Pathol.Biol.,1983、31:225〜234）。
リポタンパク質のタンパク分画たる多数のアポリポタン
パク質の発見は、リポタンパク質をそれらのタンパク組
成に従って定量し分類する免疫学的方法の発展を可能に
した（Fruchart J.C.,Cla−vey V.,Vanhoutte G.Method
es d′exploration biochimique des hyperlipoprotein
emies.Pathol.Biol.,1983、31:235〜245）。例えば、HD
Lの主タンパク分画たるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びL
DLの主タンパク分画たるアポリポタンパク質Ｂの定量が
実用化されるようになった。
パク質の発見は、リポタンパク質をそれらのタンパク組
成に従って定量し分類する免疫学的方法の発展を可能に
した（Fruchart J.C.,Cla−vey V.,Vanhoutte G.Method
es d′exploration biochimique des hyperlipoprotein
emies.Pathol.Biol.,1983、31:235〜245）。例えば、HD
Lの主タンパク分画たるアポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びL
DLの主タンパク分画たるアポリポタンパク質Ｂの定量が
実用化されるようになった。
しかしながら、脂肪の運搬、リポタンパク質リセプター
相互作用（Brown M.S.,Goldstein J.L.,Lipoproteins r
eceptors in the liver.J.Clin.Invest.,1983、72:743
〜747）及びリポタンパク質の代謝に関与する酵素活性
の調節におけるリポタンパク質（アポリポタンパク質）
のタンパク分画の重要性から（Fielding C.J.,Shore V.
G.,Fiel−ding P.E.A protein cofactor of lecithin:c
ho lesterol acyltransferase.Biochem.Biophys.Res.Co
mm.,1972、46:1493〜1498;Jahn C.E.,Osborne J.C.,Sha
efer E.J.,Brewer H.B.Activation of the enzyme acti
vity of hepatic lipase by apolipoprotein A−II.Eu
r.J.Biochem.,1983 131:25〜29;Assman G.,Mensel H.J.
Apolipoprotein disorders.Ric.Clin.Lac.,1982、12:63
〜81;Catapano A.L.Apo C−II and LPL activity.Ric.C
lin.Lab.,1982、12:35〜40;Polonovski J.,Glangeaud
D.,Freundenthal M.C.La lipoproteine lipase et son
action sur les lipoproteines de tres basse densit
e.In:Exposes annuels de biochime medicale,Ed.Masso
n,1982、35:13〜37）、多数の研究者はリポタンパク質
の特性決定の特異的マーカーとしてアポリポタンパク質
を使用した（Fruchart J.C.,Puchois P.Methodes d′an
alyse des lipoproteines.Ann.Biol.Clin.,1986、44:55
1〜555;Alaupovic P.The role of apolipoproteins in
lipid transport processes.Ric.Clin.Lab.,1982、12:2
〜21:Atmeh R.F.,Shepherd J.,Packard C.J.Subpopulat
ions of apolipoproteins A−I in human high density
lipoproteins.Their metabolic properties and respo
nse to drug therapy.Bio chim.Biophys.Acta,1983、75
1:175〜188;Salmon S.,Van Wanbeke A.,Theron L.,Ayra
ultJarrier M.,Polonovski J.Apolipoproteines associ
ees aux lipo−proteines B dans les lipo proteines
de basse densite du serum humain.Biochem.Biocphys.
Acta,1982、710:297〜350）。
相互作用（Brown M.S.,Goldstein J.L.,Lipoproteins r
eceptors in the liver.J.Clin.Invest.,1983、72:743
〜747）及びリポタンパク質の代謝に関与する酵素活性
の調節におけるリポタンパク質（アポリポタンパク質）
のタンパク分画の重要性から（Fielding C.J.,Shore V.
G.,Fiel−ding P.E.A protein cofactor of lecithin:c
ho lesterol acyltransferase.Biochem.Biophys.Res.Co
mm.,1972、46:1493〜1498;Jahn C.E.,Osborne J.C.,Sha
efer E.J.,Brewer H.B.Activation of the enzyme acti
vity of hepatic lipase by apolipoprotein A−II.Eu
r.J.Biochem.,1983 131:25〜29;Assman G.,Mensel H.J.
Apolipoprotein disorders.Ric.Clin.Lac.,1982、12:63
〜81;Catapano A.L.Apo C−II and LPL activity.Ric.C
lin.Lab.,1982、12:35〜40;Polonovski J.,Glangeaud
D.,Freundenthal M.C.La lipoproteine lipase et son
action sur les lipoproteines de tres basse densit
e.In:Exposes annuels de biochime medicale,Ed.Masso
n,1982、35:13〜37）、多数の研究者はリポタンパク質
の特性決定の特異的マーカーとしてアポリポタンパク質
を使用した（Fruchart J.C.,Puchois P.Methodes d′an
alyse des lipoproteines.Ann.Biol.Clin.,1986、44:55
1〜555;Alaupovic P.The role of apolipoproteins in
lipid transport processes.Ric.Clin.Lab.,1982、12:2
〜21:Atmeh R.F.,Shepherd J.,Packard C.J.Subpopulat
ions of apolipoproteins A−I in human high density
lipoproteins.Their metabolic properties and respo
nse to drug therapy.Bio chim.Biophys.Acta,1983、75
1:175〜188;Salmon S.,Van Wanbeke A.,Theron L.,Ayra
ultJarrier M.,Polonovski J.Apolipoproteines associ
ees aux lipo−proteines B dans les lipo proteines
de basse densite du serum humain.Biochem.Biocphys.
Acta,1982、710:297〜350）。
これらの考え方によれば、リポタンパク質は１つのアポ
リポタンパク質（単純粒子）又は複数のアポリポタンパ
ク質（複合粒子）に会合した脂肪の複合粒子集合であ
る。このように定義された粒子は、リポタンパク質の台
謝基本単位を示すことができ、すべてのタンパク異常血
症の特性がリポタンパク質粒子のプロフィルの違いによ
って説明できる。
リポタンパク質（単純粒子）又は複数のアポリポタンパ
ク質（複合粒子）に会合した脂肪の複合粒子集合であ
る。このように定義された粒子は、リポタンパク質の台
謝基本単位を示すことができ、すべてのタンパク異常血
症の特性がリポタンパク質粒子のプロフィルの違いによ
って説明できる。
従って、アポリポタンパク質を定量するためにいつくか
の改良免疫分析方法が開発された。
の改良免疫分析方法が開発された。
これらの方法は免疫酵素学を使用しており従って研究用
実験にしか使用できない。
実験にしか使用できない。
これらの方法によって高密度リポタンパク質と低密度リ
ポタンパク質との機能の異質性が判明した。
ポタンパク質との機能の異質性が判明した。
例えば、HDLが２つのタイプの粒子、即ち、アポリパタ
ンパク質AIとアポリポタンパク質A IIとを含む粒子（Lp
A I:A II）と、アポリポタンパク質A Iを含みアポリポ
タンパク質A IIを含まない粒子（LpA I）とを含み得る
ことが判明した。
ンパク質AIとアポリポタンパク質A IIとを含む粒子（Lp
A I:A II）と、アポリポタンパク質A Iを含みアポリポ
タンパク質A IIを含まない粒子（LpA I）とを含み得る
ことが判明した。
また、細胞培養試験によって、LpA Iだけが組織コレス
テロールを捕捉でき従ってアテローム性動脈硬化症に対
して防御機能をもつことが判明した。
テロールを捕捉でき従ってアテローム性動脈硬化症に対
して防御機能をもつことが判明した。
更に冠状動脈疾患をもつ患者に対する遡及的検査によれ
ば、冠状動脈傷害をもつ患者では、リポタンパク質LpA
Iが有意に減少しているがリポタンパク質LpA I:A IIは
変化していないことが観察された（Puchois P.,Bertran
d M.,Lablanche J.M.,Fruchart J.C.Decrease of plasm
a apo A−I in coronary artery disease is related t
o lipoprotein particles which contain apo A−I but
not apo A−II.Circulation,1985、72:III−199）。
ば、冠状動脈傷害をもつ患者では、リポタンパク質LpA
Iが有意に減少しているがリポタンパク質LpA I:A IIは
変化していないことが観察された（Puchois P.,Bertran
d M.,Lablanche J.M.,Fruchart J.C.Decrease of plasm
a apo A−I in coronary artery disease is related t
o lipoprotein particles which contain apo A−I but
not apo A−II.Circulation,1985、72:III−199）。
最後にアルコール常用患者に関する試験では、毎週のア
ルコール消費量に従って患者を５つのグループに分けて
検査した結果、アルコール消費量に比例してリポタンパ
ク質LpA Iは減少するがリポタンパク質LpA I:A IIは増
加することが判明した。従来から判明していたアルコー
ル消費に伴うコレステロールHDLの増加は非防御性分画L
pA I:A IIの増加に対応した（Puchois P.,Ghahiml N.,D
emarquilly C.,Zylberberg G.,Fruchart J.C.Effet of
alcohol consumption on lipoprotein particles which
contain apo A−I and apo A−II（LpA I:A II）and A
−I but not apo A−II（LpA−Ｉ）.Circulation,198
6、74:II−383）。
ルコール消費量に従って患者を５つのグループに分けて
検査した結果、アルコール消費量に比例してリポタンパ
ク質LpA Iは減少するがリポタンパク質LpA I:A IIは増
加することが判明した。従来から判明していたアルコー
ル消費に伴うコレステロールHDLの増加は非防御性分画L
pA I:A IIの増加に対応した（Puchois P.,Ghahiml N.,D
emarquilly C.,Zylberberg G.,Fruchart J.C.Effet of
alcohol consumption on lipoprotein particles which
contain apo A−I and apo A−II（LpA I:A II）and A
−I but not apo A−II（LpA−Ｉ）.Circulation,198
6、74:II−383）。
低密度リポタンパク質に対しても同様の試験が行なわ
れ、アポリポタンパク質Ｂだけを含む粒子（LpB）及び
アポリポタンパク質ＢとＣ−IIIとを含む粒子（LpB:C−
III）又はＢとＥとを含む粒子（LpB:E）のアテローム原
性が判明した（Fruchart J.C.,Luyeye I.,Parra H.,Sli
mane M.,Fievet C.Les lipo proteines atherogenes et
leur detection immu nologique.Bull.Acad.Natl.Me
d.,1985、169:719〜728）。
れ、アポリポタンパク質Ｂだけを含む粒子（LpB）及び
アポリポタンパク質ＢとＣ−IIIとを含む粒子（LpB:C−
III）又はＢとＥとを含む粒子（LpB:E）のアテローム原
性が判明した（Fruchart J.C.,Luyeye I.,Parra H.,Sli
mane M.,Fievet C.Les lipo proteines atherogenes et
leur detection immu nologique.Bull.Acad.Natl.Me
d.,1985、169:719〜728）。
物理化学的基準で定義されたリポタンパク質の異質性か
らは不可能な新規な粒子分子分析方法を使用し、アテロ
ーム性動脈硬化症の危険のより早期でより正確な診断を
期待できる。同時にまた、これらの新規な方法は、リポ
タンパク異常血症治療薬（nomalipoproteinemiant）の
作用メカニズムを分子のレベルで説明できる（Douste−
Blazy P.,Fievet C,,Fruchart J.C.,Slimane M.,Drouin
P.,Puchois P.,Bernadet P.Effect of coronary Arter
iosclerosis,1986、6/5:564）。
らは不可能な新規な粒子分子分析方法を使用し、アテロ
ーム性動脈硬化症の危険のより早期でより正確な診断を
期待できる。同時にまた、これらの新規な方法は、リポ
タンパク異常血症治療薬（nomalipoproteinemiant）の
作用メカニズムを分子のレベルで説明できる（Douste−
Blazy P.,Fievet C,,Fruchart J.C.,Slimane M.,Drouin
P.,Puchois P.,Bernadet P.Effect of coronary Arter
iosclerosis,1986、6/5:564）。
リポタンパク質粒子の分子分析のためにこれまでに以下
の方法が提案されている。
の方法が提案されている。
シーケンシャル免疫沈降法（Alaupovic P.−Mapping of
the lipoprotein particles of very low and low den
sities characterized by apolipoproteins B、Ｃ−
Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−III、and E as their protein moieti
es.In:Journees du Gerli Le Touque、19−21 juin 198
4）。この方法は、リポタンパク質粒子を直接定量でき
るが極めて複雑で時間もかかるので臨床生物学には適当
でない。
the lipoprotein particles of very low and low den
sities characterized by apolipoproteins B、Ｃ−
Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−III、and E as their protein moieti
es.In:Journees du Gerli Le Touque、19−21 juin 198
4）。この方法は、リポタンパク質粒子を直接定量でき
るが極めて複雑で時間もかかるので臨床生物学には適当
でない。
また分子レベルで粒子を定量分析するために二重抗体定
量を用いる免疫酵素学的方法も開発された（Fruchart
J.C.,Puchois P.Methodes d′ananlyse des lipoprotei
nes.Ann.Biol.1986、44:551〜555;Puchois P.,Bertrand
M.,Lablanche J.M.,Fruchart J.C.Decrease of plasma
Apo A−I in coronary artery disease is related to
lipoprotein particles which contain Apo A−I but
not Apo A−II.In:58th scientific Session of the Am
erican Heart Association,Washington,11〜14 novembr
e 1985.Artriosclerosis、1985、５〜5513）。
量を用いる免疫酵素学的方法も開発された（Fruchart
J.C.,Puchois P.Methodes d′ananlyse des lipoprotei
nes.Ann.Biol.1986、44:551〜555;Puchois P.,Bertrand
M.,Lablanche J.M.,Fruchart J.C.Decrease of plasma
Apo A−I in coronary artery disease is related to
lipoprotein particles which contain Apo A−I but
not Apo A−II.In:58th scientific Session of the Am
erican Heart Association,Washington,11〜14 novembr
e 1985.Artriosclerosis、1985、５〜5513）。
この方法は、マイクロタイタープレートに固定された所
与のアポリポタンパク質の特異的抗体が該アポリポタン
パク質を含有するリポタンパク質粒子と結合するという
知見に基づく。
与のアポリポタンパク質の特異的抗体が該アポリポタン
パク質を含有するリポタンパク質粒子と結合するという
知見に基づく。
次に、結合した粒子に存在する別のアポリポタンパク質
の定量分析は、酵素標識した対応抗体を添加することに
よってプレートで直接行なうことが可能である。
の定量分析は、酵素標識した対応抗体を添加することに
よってプレートで直接行なうことが可能である。
この方法は速やかで確実であるが必要な装置をどの実験
室でも入手できるとは限らない。
室でも入手できるとは限らない。
また、所定抗原の特異的抗体を均等に含有する平板ゲル
に対応抗原を拡散させるか（Manciniの放射免疫拡散）
又は対応電場で泳動させると（Laurellの電気免疫拡
散）、夫々リング又はピークの形態の可視沈降物が形成
されることは公知である。
に対応抗原を拡散させるか（Manciniの放射免疫拡散）
又は対応電場で泳動させると（Laurellの電気免疫拡
散）、夫々リング又はピークの形態の可視沈降物が形成
されることは公知である。
沈降物で被覆された表面は抗原量に比例し、得られた結
果を既知濃度の同じ抗原と比較することによって定量す
べき抗原の量を推定することが可能である。
果を既知濃度の同じ抗原と比較することによって定量す
べき抗原の量を推定することが可能である。
この方法はまた、独立の即ち互いに結合しない２種類以
上の抗原の定量にも適用でき、その場合には各抗原に対
して特異的な２種類以上の抗体をゲルに添加する（Fruc
hart J.C.,Nora I.,Cachera C.,Clavey V.,Duthilleul
P.and Moschetto Y.Simultaneous measurement of plas
ma apolipoproteins AI and B by electrimmunoassay.C
lin Chem 28/1（1982）59〜62 et CB Laurell.A Screen
ing test for α1 antitrypsin deficiency.Scand.J.Cl
in.Lab.Invest.29（1972）247）。
上の抗原の定量にも適用でき、その場合には各抗原に対
して特異的な２種類以上の抗体をゲルに添加する（Fruc
hart J.C.,Nora I.,Cachera C.,Clavey V.,Duthilleul
P.and Moschetto Y.Simultaneous measurement of plas
ma apolipoproteins AI and B by electrimmunoassay.C
lin Chem 28/1（1982）59〜62 et CB Laurell.A Screen
ing test for α1 antitrypsin deficiency.Scand.J.Cl
in.Lab.Invest.29（1972）247）。
次に、各抗原に対する免疫沈降物を識別することが当然
必要である。この識別には例えば、抗原の固有特性を利
用してもよく又は所定抗体で標識してもよい。又は沈降
線の相対濃度に基づいて識別してもよい。
必要である。この識別には例えば、抗原の固有特性を利
用してもよく又は所定抗体で標識してもよい。又は沈降
線の相対濃度に基づいて識別してもよい。
抗原が独立でない場合（即ち抗原間に結合が存在する場
合）、同時定量は可能でないことも公知である。
合）、同時定量は可能でないことも公知である。
結合抗原と独立抗原との間の中間的状態は特にアポリポ
タンパク質によって構成される。即ち、１つの所定アポ
リポタンパク質が、別のアポリポタンパク質を種々の濃
度で保有する別々のリポタンパク質粒子に保有され得
る。
タンパク質によって構成される。即ち、１つの所定アポ
リポタンパク質が、別のアポリポタンパク質を種々の濃
度で保有する別々のリポタンパク質粒子に保有され得
る。
両方が同じ所定のアポリポタンパク質を保有する２つの
リポタンパク質粒子は、一方の粒子が、他方の粒子に任
意に保有された別のアポリポタンパク質以外のアポリポ
タンパク質を更に１つ以上含むときは、互いに異なるリ
ポタンパク質粒子である。
リポタンパク質粒子は、一方の粒子が、他方の粒子に任
意に保有された別のアポリポタンパク質以外のアポリポ
タンパク質を更に１つ以上含むときは、互いに異なるリ
ポタンパク質粒子である。
前記を要約すれば、全部が同じ所定のアポリポタンパク
質を保有する「ｎ」個のリポタンパク質粒子が互いに異
なるリポタンパク質粒子であると定義できる。
質を保有する「ｎ」個のリポタンパク質粒子が互いに異
なるリポタンパク質粒子であると定義できる。
この場合、リポタンパク質粒子は独立であるが、アポリ
ポタンパク質は独立でない。
ポタンパク質は独立でない。
アポリポタンパク質の従来の定量方法を前記に概説し
た。しかしながら、定量すべき結合抗原を含有する生物
媒体、特にアポリポタンパク質を含有する生物媒体を予
処理及び複雑な装置を要せずに慣例的臨床分析に使用で
きる簡単で確実な方法は今の処まだ開発されていない。
た。しかしながら、定量すべき結合抗原を含有する生物
媒体、特にアポリポタンパク質を含有する生物媒体を予
処理及び複雑な装置を要せずに慣例的臨床分析に使用で
きる簡単で確実な方法は今の処まだ開発されていない。
本発明の目的の１つは、不要粒子を除去するために生物
媒体を予め変性する必要なく、生物媒体に含まれたアポ
リポタンパク質の１つ以上のサブアセンブリを同時に定
量する新規な方法を提供することである。
媒体を予め変性する必要なく、生物媒体に含まれたアポ
リポタンパク質の１つ以上のサブアセンブリを同時に定
量する新規な方法を提供することである。
本発明の目的の１つは、アポリポタンパク質の１つ以上
のサブアセンブリを直接定量するために慣例的な臨床分
析において容易に使用し得る新規な方法を提供すること
である。
のサブアセンブリを直接定量するために慣例的な臨床分
析において容易に使用し得る新規な方法を提供すること
である。
本発明の別の目的は、アポリポタンパク質の１つ以上の
サブアセンブリを定量するための迅速確実な方法を提供
することである。
サブアセンブリを定量するための迅速確実な方法を提供
することである。
本発明の目的の１つは、複雑な装置の使用が不要なアポ
リポタンパク質の１つ以上のサブアセンブリの新規な定
量方法を提供することである。
リポタンパク質の１つ以上のサブアセンブリの新規な定
量方法を提供することである。
本発明の別の目的の１つは、生物媒体の予処理を要する
ことなく生物媒体に含まれたアポリポタンパク質の１つ
以上のサブアセンブリの直接定量に使用される既製のプ
レート又はフィルムのごとき平坦支持体を提供すること
である。
ことなく生物媒体に含まれたアポリポタンパク質の１つ
以上のサブアセンブリの直接定量に使用される既製のプ
レート又はフィルムのごとき平坦支持体を提供すること
である。
本発明の別の目的の１つは、アポリポタンパク質の１つ
以上のサブアセンブリを簡単、迅速且つ確実に直接定量
し得る定量キットを提供することである。
以上のサブアセンブリを簡単、迅速且つ確実に直接定量
し得る定量キットを提供することである。
上記のごとき本発明の種々の目的は、以下のごとき全く
予想外の知見に基づく。即ち、予処理されない生物媒体
中に別々の独立した２つの粒子グループ（ａ）及び
（ｂ）が存在し、粒子グループ（ａ）が抗原Ｉを保有し
粒子グループ（ｂ）が同じ抗原Ｉと抗原Ｉ以外の抗原II
とを保有するとき、これらの粒子グループは、適当な条
件下の抗Ｉ抗体と抗II抗体との混合物の存在下に維持さ
れると、粒子（ｂ）を抗II抗体の存在下及び粒子（ａ）
を抗Ｉ抗体の存在下に別々に維持したときと全く同様の
沈降挙動を示す。
予想外の知見に基づく。即ち、予処理されない生物媒体
中に別々の独立した２つの粒子グループ（ａ）及び
（ｂ）が存在し、粒子グループ（ａ）が抗原Ｉを保有し
粒子グループ（ｂ）が同じ抗原Ｉと抗原Ｉ以外の抗原II
とを保有するとき、これらの粒子グループは、適当な条
件下の抗Ｉ抗体と抗II抗体との混合物の存在下に維持さ
れると、粒子（ｂ）を抗II抗体の存在下及び粒子（ａ）
を抗Ｉ抗体の存在下に別々に維持したときと全く同様の
沈降挙動を示す。
従って全く予想外であったが、適当な条件下で、抗原Ｉ
と抗原IIとの両方を含む粒子（ｂ）は抗II抗体のみによ
って沈降し、抗Ｉ抗体の存在は粒子（ｂ）の沈降を生起
せず抗II抗体による粒子（ｂ）の沈降を妨害しない。こ
のため、粒子（ａ）が保有する抗原Ｉと粒子（ｂ）が保
有する抗原IIとを夫々定量することが可能である。
と抗原IIとの両方を含む粒子（ｂ）は抗II抗体のみによ
って沈降し、抗Ｉ抗体の存在は粒子（ｂ）の沈降を生起
せず抗II抗体による粒子（ｂ）の沈降を妨害しない。こ
のため、粒子（ａ）が保有する抗原Ｉと粒子（ｂ）が保
有する抗原IIとを夫々定量することが可能である。
より詳細には、本発明は全く予想外の以下の知見に基づ
く。即ち、予処理されない生物媒体が別々の独立した２
つの粒子グループ（ａ）と（ｂ）とを含み、グループ
（ａ）が抗原Ｉを保有しグループ（ｂ）が同じ抗原Ｉと
抗原Ｉ以外の抗原IIとを保有するとき、この生物媒体を
免疫拡散ゲル内で抗Ｉ抗体と抗II抗体との混合物の存在
下に維持し、抗II抗体を抗II抗体より過剰に存在させる
と、２つの沈降境界が形成され、拡散開始点に最も近い
境界が粒子（ｂ）の沈降に対応する。
く。即ち、予処理されない生物媒体が別々の独立した２
つの粒子グループ（ａ）と（ｂ）とを含み、グループ
（ａ）が抗原Ｉを保有しグループ（ｂ）が同じ抗原Ｉと
抗原Ｉ以外の抗原IIとを保有するとき、この生物媒体を
免疫拡散ゲル内で抗Ｉ抗体と抗II抗体との混合物の存在
下に維持し、抗II抗体を抗II抗体より過剰に存在させる
と、２つの沈降境界が形成され、拡散開始点に最も近い
境界が粒子（ｂ）の沈降に対応する。
本発明は、生物媒体に含まれた複数のリポタンパク質粒
子グループに夫々所属するアポリポタンパク質のサブア
センブリを平板ゲル内の分画免疫拡散（immunodiffusio
n diffrentielle）により同時に定量する方法を提供
する。前記複数のリポタンパク質粒子グループは、「共
通アポリポタンパク質」を含み、以下のごとく定義でき
る。
子グループに夫々所属するアポリポタンパク質のサブア
センブリを平板ゲル内の分画免疫拡散（immunodiffusio
n diffrentielle）により同時に定量する方法を提供
する。前記複数のリポタンパク質粒子グループは、「共
通アポリポタンパク質」を含み、以下のごとく定義でき
る。
−以後第一グループと指称される１つのグループは、全
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有するリポタ
ンパク質粒子から成り、第一グループの全部のリポタン
パク粒子に保有されるこの共通アポリポタンパク質が第
一サブアセンブリを構成する、 −以後中間グループと指称される少なくとも１つの任意
のグループは、一部又は全部が前記共通アポリポタンパ
ク質を保有し更に全部が第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質とは異な
るアポリポタンパク質少なくとも１つを任意に保有する
リポタンパク質粒子から成り、複数の中間グループが存
在する場合には、各中間グループを夫々構成するリポタ
ンパク質粒子は１つ以上の別の中間グループのリポタン
パク質粒子が保有するアポリポタンパク質とは異なるア
ポリポタンパク質を少なくとも１つ保有し、各中間グル
ープのリポタンパク質粒子が保有するこれらのアポリポ
タンパク質は、第一サブアセンブリを構成するアポリポ
タンパク質及び第一グループのリポタンパク質が任意に
保有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なり、
また１つ以上の中間サブアセンブリを構成する別の中間
グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別のア
ポリポタンパク質とも異なっている、 −最終グループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に第
一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別の
アポリポタンパク質及び中間グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有するアポリポタンパク質のいずれとも
異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含むリポタ
ンパク質粒子から構成され、共通アポリポタンパク質、
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質、任意の中間グループのリポタン
パク質粒子が保有する別のアポリポタンパク質とのいず
れとも異なった前記少なくとも１つのアポリポタンパク
質が最終サブアセンブリを構成するか、又は、 −一部が、前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質及び中間グループのリポタンパク
質粒子が任意に保有するアポリポタンパク質のいずれと
も異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含み、リ
ポタンパク質粒子の残りの部分が、前記共通アポリポタ
ンパク質を含まないが、リポタンパク質粒子の前記一部
が保有し且つ第一グループのリポタンパク質粒子が任意
に保有する別のアポリポタンパク質及び任意の中間グル
ープのリポタンパク質粒子が保有するアポリポタンパク
質のいずれとも異なるアポリポタンパク質を少なくとも
１つ保有するリポタンパク質粒子から構成され、第一グ
ループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別のアポ
リポタンパク質でもなく任意の中間グループのリポタン
パク質粒子がに保有するアポリポタンパク質でもないこ
との１つ以上のアポリポタンパク質が最終サブアセンブ
リを構成する。
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有するリポタ
ンパク質粒子から成り、第一グループの全部のリポタン
パク粒子に保有されるこの共通アポリポタンパク質が第
一サブアセンブリを構成する、 −以後中間グループと指称される少なくとも１つの任意
のグループは、一部又は全部が前記共通アポリポタンパ
ク質を保有し更に全部が第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質とは異な
るアポリポタンパク質少なくとも１つを任意に保有する
リポタンパク質粒子から成り、複数の中間グループが存
在する場合には、各中間グループを夫々構成するリポタ
ンパク質粒子は１つ以上の別の中間グループのリポタン
パク質粒子が保有するアポリポタンパク質とは異なるア
ポリポタンパク質を少なくとも１つ保有し、各中間グル
ープのリポタンパク質粒子が保有するこれらのアポリポ
タンパク質は、第一サブアセンブリを構成するアポリポ
タンパク質及び第一グループのリポタンパク質が任意に
保有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なり、
また１つ以上の中間サブアセンブリを構成する別の中間
グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別のア
ポリポタンパク質とも異なっている、 −最終グループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に第
一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別の
アポリポタンパク質及び中間グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有するアポリポタンパク質のいずれとも
異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含むリポタ
ンパク質粒子から構成され、共通アポリポタンパク質、
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質、任意の中間グループのリポタン
パク質粒子が保有する別のアポリポタンパク質とのいず
れとも異なった前記少なくとも１つのアポリポタンパク
質が最終サブアセンブリを構成するか、又は、 −一部が、前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質及び中間グループのリポタンパク
質粒子が任意に保有するアポリポタンパク質のいずれと
も異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含み、リ
ポタンパク質粒子の残りの部分が、前記共通アポリポタ
ンパク質を含まないが、リポタンパク質粒子の前記一部
が保有し且つ第一グループのリポタンパク質粒子が任意
に保有する別のアポリポタンパク質及び任意の中間グル
ープのリポタンパク質粒子が保有するアポリポタンパク
質のいずれとも異なるアポリポタンパク質を少なくとも
１つ保有するリポタンパク質粒子から構成され、第一グ
ループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別のアポ
リポタンパク質でもなく任意の中間グループのリポタン
パク質粒子がに保有するアポリポタンパク質でもないこ
との１つ以上のアポリポタンパク質が最終サブアセンブ
リを構成する。
本発明方法の特徴は、 −定量すべきアポリポタンパク質のサブアセンブリを含
む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持することであ
る。該抗体混合物は、 −一方で、最終サブアセンブリを構成する１つ以上のア
ポリポタンパク質に対する抗体を、（最終サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質を保有する）最終グル
ープのリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で含
み、 −他方で、任意に１つ以上の中間サブアセンブリを構成
する１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体を、
（中間サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質を
保有する）１つ以上の任意の中間グループのリポタンパ
ク質粒子を沈降させるに十分な量で含み、 −他方でまた、第一サブアセンブリを構成する前記共通
アポリポタンパク質に対する抗体を、（第一サブアセン
ブリを構成するアポリポタンパク質を保有する）第一グ
ループのリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で
含んでおり、 −（最終サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質
を保有する）最終グループのリポタンパク質粒子を沈降
させるに必要な前記抗体の量は、（１つ以上の任意の中
間サブアセブリを構成するアポリポタンパク質を保有す
る）１つ以上の任意の中間グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な任意の前記抗体の量に対して過
剰であり、 −任意の中間グループのリポタンパク質粒子を沈降させ
るに必要な１つ以上の抗体の量は、（第一サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質を保有する）第一グル
ープのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要な前記抗
体の量に対して過剰であり、複数の中間グループが存在
するときは中間グループの沈降に必要な抗体の量は所定
の順序で互いに過剰であり、 −前記過剰の割合は、免疫拡散後に少なくとも２つの明
確な境界（沈降線）が観察され、定量すべきサブアセン
ブリを含む媒体の付着（拡散開始）点に最も近い免疫拡
散境界が、最終サブアセンブリを構成するアポリポタン
パク質を保有するリポタンパク質粒子の沈降に対応し、
前記開始点から最も遠い免疫拡散境界が、第一サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質を保有するリポタ
ンパク質粒子の沈降に対応し、前記最も近い境界と最も
遠い境界との間に任意に存在する１つ以上の免疫拡散境
界が、前記中間サブアセンブリを構成する１つ以上のア
ポリポタンパク質を任意の保有するリポタンパク質粒子
の沈降に対応しており、 −拡散開始点と免疫拡散境界の各々との間の最大間隔を
夫々測定し、各間隔を各サブアセンブリの既知量のアポ
リポタンパク質を含む標準生物媒体と比較することであ
る。
む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持することであ
る。該抗体混合物は、 −一方で、最終サブアセンブリを構成する１つ以上のア
ポリポタンパク質に対する抗体を、（最終サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質を保有する）最終グル
ープのリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で含
み、 −他方で、任意に１つ以上の中間サブアセンブリを構成
する１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体を、
（中間サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質を
保有する）１つ以上の任意の中間グループのリポタンパ
ク質粒子を沈降させるに十分な量で含み、 −他方でまた、第一サブアセンブリを構成する前記共通
アポリポタンパク質に対する抗体を、（第一サブアセン
ブリを構成するアポリポタンパク質を保有する）第一グ
ループのリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で
含んでおり、 −（最終サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質
を保有する）最終グループのリポタンパク質粒子を沈降
させるに必要な前記抗体の量は、（１つ以上の任意の中
間サブアセブリを構成するアポリポタンパク質を保有す
る）１つ以上の任意の中間グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な任意の前記抗体の量に対して過
剰であり、 −任意の中間グループのリポタンパク質粒子を沈降させ
るに必要な１つ以上の抗体の量は、（第一サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質を保有する）第一グル
ープのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要な前記抗
体の量に対して過剰であり、複数の中間グループが存在
するときは中間グループの沈降に必要な抗体の量は所定
の順序で互いに過剰であり、 −前記過剰の割合は、免疫拡散後に少なくとも２つの明
確な境界（沈降線）が観察され、定量すべきサブアセン
ブリを含む媒体の付着（拡散開始）点に最も近い免疫拡
散境界が、最終サブアセンブリを構成するアポリポタン
パク質を保有するリポタンパク質粒子の沈降に対応し、
前記開始点から最も遠い免疫拡散境界が、第一サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質を保有するリポタ
ンパク質粒子の沈降に対応し、前記最も近い境界と最も
遠い境界との間に任意に存在する１つ以上の免疫拡散境
界が、前記中間サブアセンブリを構成する１つ以上のア
ポリポタンパク質を任意の保有するリポタンパク質粒子
の沈降に対応しており、 −拡散開始点と免疫拡散境界の各々との間の最大間隔を
夫々測定し、各間隔を各サブアセンブリの既知量のアポ
リポタンパク質を含む標準生物媒体と比較することであ
る。
後述するごとく、リポタンパク質粒子は、リポタンパク
質粒子が保有するアポリポタンパク質の１つと前記アポ
リポタンパク質に対する抗体との間の抗原抗体反応によ
って沈降し、定量は、該リポタンパク質粒子が保有する
アポリポタンパク質の定量である。
質粒子が保有するアポリポタンパク質の１つと前記アポ
リポタンパク質に対する抗体との間の抗原抗体反応によ
って沈降し、定量は、該リポタンパク質粒子が保有する
アポリポタンパク質の定量である。
予想外の知見によれば、（定量すべきアポリポタンパク
質の第一サブアセンブリ、定量すべきアポリポタンパク
質の１つ以上の中間サブアセンブリ及び定量すべきアポ
リポタンパク質の最終サブアセンブリが夫々所属する第
一グループのリポタンパク質粒子、１つ以上の任意の中
間グループのリポタンパク質粒子及び最終グループのリ
ポタンパク質粒子の沈降に夫々対応する）免疫拡散境界
は、生物媒体を前記抗体混合物の存在下に予め処理しな
いときは以下の条件で得られる免疫拡散境界と等しい。
質の第一サブアセンブリ、定量すべきアポリポタンパク
質の１つ以上の中間サブアセンブリ及び定量すべきアポ
リポタンパク質の最終サブアセンブリが夫々所属する第
一グループのリポタンパク質粒子、１つ以上の任意の中
間グループのリポタンパク質粒子及び最終グループのリ
ポタンパク質粒子の沈降に夫々対応する）免疫拡散境界
は、生物媒体を前記抗体混合物の存在下に予め処理しな
いときは以下の条件で得られる免疫拡散境界と等しい。
即ち、前記種々のグループのリポタンパク質粒子を分離
後に、 −一方では、第一グループのリポタンパク質粒子を、前
記第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタンパク
質に対する抗体と接触させる。接触させる抗体の量は、
第一サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質を保
有し生物媒体から分離されない第一グループのリポタン
パク質粒子を沈降させるための前記使用量に等しい、 また、他方では、 −１つ以上の中間グループのリポタンパク質粒子を、前
記１つ以上の任意の中間サブアセンブリを構成するアポ
リポタンパク質に対する抗体と接触させる。接触させる
抗体の量は、１つ以上の任意の中間サブアセンブリを構
成するアポリポタンパク質を保有し生物媒体から分離さ
れない任意の１つ以上の中間グループのリポタンパク質
粒子を沈降させるための前記使用量に等しい、 また、他方では、 −最終グループのリポタンパク質粒子を、前記最終サブ
アンセンブリを構成するアポリポタンパク質に対する抗
体と接触させる。接触させる抗体の量は、最終サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質を保有し生物媒体
から分離されない最終グループのリポタンパク質粒子を
沈降させるための前記使用量に等しい。
後に、 −一方では、第一グループのリポタンパク質粒子を、前
記第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタンパク
質に対する抗体と接触させる。接触させる抗体の量は、
第一サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質を保
有し生物媒体から分離されない第一グループのリポタン
パク質粒子を沈降させるための前記使用量に等しい、 また、他方では、 −１つ以上の中間グループのリポタンパク質粒子を、前
記１つ以上の任意の中間サブアセンブリを構成するアポ
リポタンパク質に対する抗体と接触させる。接触させる
抗体の量は、１つ以上の任意の中間サブアセンブリを構
成するアポリポタンパク質を保有し生物媒体から分離さ
れない任意の１つ以上の中間グループのリポタンパク質
粒子を沈降させるための前記使用量に等しい、 また、他方では、 −最終グループのリポタンパク質粒子を、前記最終サブ
アンセンブリを構成するアポリポタンパク質に対する抗
体と接触させる。接触させる抗体の量は、最終サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質を保有し生物媒体
から分離されない最終グループのリポタンパク質粒子を
沈降させるための前記使用量に等しい。
任意の中間免疫拡散境界は、互いに過剰な抗体の量の順
序に生じる。最終グループの沈降に対応する免疫拡散境
界に最も近い中間免疫拡散境界は、別の中間グルーブの
沈降に必要などの抗体の量よりも過剰量の対応抗体によ
って沈降する１つの中間グループに対応する。
序に生じる。最終グループの沈降に対応する免疫拡散境
界に最も近い中間免疫拡散境界は、別の中間グルーブの
沈降に必要などの抗体の量よりも過剰量の対応抗体によ
って沈降する１つの中間グループに対応する。
言い替えると、１つの中間グループの沈降を生起する抗
体の量が別の中間グループの沈降を生起する抗体の量に
対して過剰のとき、該１つの中間グループのリポタンパ
ク質粒子の沈降に対応するピークは、別の中間グループ
のリポタンパク質粒子の沈降に対応するピークより手前
に存在する。
体の量が別の中間グループの沈降を生起する抗体の量に
対して過剰のとき、該１つの中間グループのリポタンパ
ク質粒子の沈降に対応するピークは、別の中間グループ
のリポタンパク質粒子の沈降に対応するピークより手前
に存在する。
本発明は、生物媒体に含まれた複数のリポタンパク質粒
子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の３つ以
上のサブアセンブリを平板ゲル内な分画免疫拡散により
同時に定量する方法を提供する。前記３つのリポタンパ
ク質粒子グループは、「共通アポリポタンパク質」を含
み、以下のごとく定義できる。
子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の３つ以
上のサブアセンブリを平板ゲル内な分画免疫拡散により
同時に定量する方法を提供する。前記３つのリポタンパ
ク質粒子グループは、「共通アポリポタンパク質」を含
み、以下のごとく定義できる。
−以後第一グループと指称される１つのグループは、全
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し任意に別
のアポリポタンパク質Xmを保有するリポタンパク質粒子
から成る。第一グループの全部のリポタンパク粒子が保
有するこの「共通アポリポタンパク質」が第一サブアセ
ンブリを構成する、 −以後第二グループ又は中間グループと指称される別の
グループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xm以外のアポリポタンパク質Ynを
少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成り、
少なくとも１つのこのアポリポタンパク質Ynが第二サブ
アセンブリ即ち中間サブアセンブリを構成するか、又
は、 −一方で、一部が第一サブアセンブリを構成する前記
「共通アポリポタンパク質」を保有し更に第一グループ
のリポタンパク質粒子が任意に保有する別のアポリポタ
ンパク質Xm以外のアポリポタンパク質Ynを少なくとも１
つ保有しており、他方で残りのリポタンパク質粒子が、
前記「共通アポリポタンパク質」を含まないが、前記リ
ポタンパク質粒子の一部には保有されており第一グルー
プのリポタンパク質が任意に保有する別のアポリポタン
パク質Xmとは異なったアポリポタンパク質Zpを少なくと
も１つ保有する。この少なくとも１つのアポリポタンパ
ク質Zpは第二サブアセンブリ即ち中間サブアセンブリを
構成する、 −第三グループ又は最終グループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に第
一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別の
アポリポタンパク質Xm及び第二グループのリポタンパク
質粒子が任意に保有するアポリポタンパク質のいずれと
も異なったアポリポタンパク質Wqを少なくとも１つ含む
リポタンパク粒子から成り、少なくとも１つのこのアポ
リポタンパク質Wqが第三サブアセンブリ即ち最終サブア
センブリを構成するか、又は −一部が、前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xm及び第二グループのリポタンパ
ク質粒子が保有するアポリポタンパク質のいずれとも異
なったアポリポタンパク質Tlを少なくとも１つ含み、リ
ポタンパク粒子の残りの部分が、前記「共通アポリポタ
ンパク質」を含まないが、前記一部が保有するアポリポ
タンパク質Tlを１つ以上保有しており、少なくとも１つ
のこのアポリポタンパク質が第三サブアセンブリ即ち最
終サブアセンブリを構成する。
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し任意に別
のアポリポタンパク質Xmを保有するリポタンパク質粒子
から成る。第一グループの全部のリポタンパク粒子が保
有するこの「共通アポリポタンパク質」が第一サブアセ
ンブリを構成する、 −以後第二グループ又は中間グループと指称される別の
グループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xm以外のアポリポタンパク質Ynを
少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成り、
少なくとも１つのこのアポリポタンパク質Ynが第二サブ
アセンブリ即ち中間サブアセンブリを構成するか、又
は、 −一方で、一部が第一サブアセンブリを構成する前記
「共通アポリポタンパク質」を保有し更に第一グループ
のリポタンパク質粒子が任意に保有する別のアポリポタ
ンパク質Xm以外のアポリポタンパク質Ynを少なくとも１
つ保有しており、他方で残りのリポタンパク質粒子が、
前記「共通アポリポタンパク質」を含まないが、前記リ
ポタンパク質粒子の一部には保有されており第一グルー
プのリポタンパク質が任意に保有する別のアポリポタン
パク質Xmとは異なったアポリポタンパク質Zpを少なくと
も１つ保有する。この少なくとも１つのアポリポタンパ
ク質Zpは第二サブアセンブリ即ち中間サブアセンブリを
構成する、 −第三グループ又は最終グループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に第
一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別の
アポリポタンパク質Xm及び第二グループのリポタンパク
質粒子が任意に保有するアポリポタンパク質のいずれと
も異なったアポリポタンパク質Wqを少なくとも１つ含む
リポタンパク粒子から成り、少なくとも１つのこのアポ
リポタンパク質Wqが第三サブアセンブリ即ち最終サブア
センブリを構成するか、又は −一部が、前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xm及び第二グループのリポタンパ
ク質粒子が保有するアポリポタンパク質のいずれとも異
なったアポリポタンパク質Tlを少なくとも１つ含み、リ
ポタンパク粒子の残りの部分が、前記「共通アポリポタ
ンパク質」を含まないが、前記一部が保有するアポリポ
タンパク質Tlを１つ以上保有しており、少なくとも１つ
のこのアポリポタンパク質が第三サブアセンブリ即ち最
終サブアセンブリを構成する。
本発明方法の特徴は、 −定量すべきサブアセンブリを含む生物媒体を抗体混合
物の存在下に維持することである。該抗体混合物は、 −第三サブアセンブリ即ち最終サブアセンブリを構成す
る１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体を第三グ
ループ即ち最終グループのリポタンパク質粒子を沈降さ
せるに十分な量で含み、 −第二サブアセンブリ即ち中間サブアセンブリを構成す
る少なくとも１つのアポリポタンパク質に対する抗体を
第二グループ即ち中間グループのリポタンパク質粒子を
沈降させるに十分な量で含み、 −サブアセンブリの「共通アポリポタンパク質」に対す
る抗体を第一グループのリポタンパク質粒子を沈降させ
るに十分な量で含んでおり、 −第三グループ即ち最終グループのリポタンパク質粒子
を沈降させるに必要な前記抗体の量は、第二グループ即
ち中間グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必
要な量に対して過剰であり、この後者の量、即ち、第二
グループ即ち中間グループのリポタンパク質粒子を沈降
させるに必要な前記抗体の量は、第一サブアセンブリを
構成する「共通アポリポタンパク質」を保有するリポタ
ンパク質粒子を沈降させるに必要な前記抗体の量に対し
て過剰であり、前記過剰の割合は、免疫拡散後に３つの
明確な境界が生じ、定量すべきサブアセンブリを含む媒
体の拡散開始点に最も近い免疫拡散境界が第三グループ
即ち最終グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応
し、前記拡散開始点から最も遠い免疫拡散境界が第一グ
ループのリポタンパク質粒子の沈降に対応し、最も近い
境界と最も遠い境界との間に存在する中間の免疫拡散境
界が第二グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応す
るように選択され、 −拡散開始点と３つの免疫拡散境界の各々との間の最大
間隔を測定し、各間隔を３つの各サブアセンブリの既知
量のアポリポタンパク質を含む標準媒体で得られた間隔
と比較する。
物の存在下に維持することである。該抗体混合物は、 −第三サブアセンブリ即ち最終サブアセンブリを構成す
る１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体を第三グ
ループ即ち最終グループのリポタンパク質粒子を沈降さ
せるに十分な量で含み、 −第二サブアセンブリ即ち中間サブアセンブリを構成す
る少なくとも１つのアポリポタンパク質に対する抗体を
第二グループ即ち中間グループのリポタンパク質粒子を
沈降させるに十分な量で含み、 −サブアセンブリの「共通アポリポタンパク質」に対す
る抗体を第一グループのリポタンパク質粒子を沈降させ
るに十分な量で含んでおり、 −第三グループ即ち最終グループのリポタンパク質粒子
を沈降させるに必要な前記抗体の量は、第二グループ即
ち中間グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必
要な量に対して過剰であり、この後者の量、即ち、第二
グループ即ち中間グループのリポタンパク質粒子を沈降
させるに必要な前記抗体の量は、第一サブアセンブリを
構成する「共通アポリポタンパク質」を保有するリポタ
ンパク質粒子を沈降させるに必要な前記抗体の量に対し
て過剰であり、前記過剰の割合は、免疫拡散後に３つの
明確な境界が生じ、定量すべきサブアセンブリを含む媒
体の拡散開始点に最も近い免疫拡散境界が第三グループ
即ち最終グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応
し、前記拡散開始点から最も遠い免疫拡散境界が第一グ
ループのリポタンパク質粒子の沈降に対応し、最も近い
境界と最も遠い境界との間に存在する中間の免疫拡散境
界が第二グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応す
るように選択され、 −拡散開始点と３つの免疫拡散境界の各々との間の最大
間隔を測定し、各間隔を３つの各サブアセンブリの既知
量のアポリポタンパク質を含む標準媒体で得られた間隔
と比較する。
本発明方法の好ましい実施態様によれば、前記で第二グ
ループ即ち中間グループと指称されるグループは好まし
くは、全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し
更に第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有す
る別のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパ
ク質Ynを少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子か
ら成り、少なくとも１つのこのリポタンパク質粒子Ynが
第二サブアセンブリ即ち中間サブアセンブリを構成す
る。
ループ即ち中間グループと指称されるグループは好まし
くは、全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し
更に第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有す
る別のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパ
ク質Ynを少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子か
ら成り、少なくとも１つのこのリポタンパク質粒子Ynが
第二サブアセンブリ即ち中間サブアセンブリを構成す
る。
本発明は、生物媒体に含まれた２つ以上のリポタンパク
質粒子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の２
つ以上のサブアセンブリを平板ゲル内の分画免疫拡散に
より同時に定量する方法を提供する。前記２つのリポタ
ンパク質粒子グループは、「共通アポリポタンパク質」
を含み、以下のごとく定義できる。
質粒子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の２
つ以上のサブアセンブリを平板ゲル内の分画免疫拡散に
より同時に定量する方法を提供する。前記２つのリポタ
ンパク質粒子グループは、「共通アポリポタンパク質」
を含み、以下のごとく定義できる。
−以後第一グループと指称される１つのグループは、全
部が前記「共通」アポリポタンパク質を保有し任意の別
のアポリポタンパク質Xmを保有するリポタンパク質粒子
から成り、第一グループの全部のリポタンパク粒子が保
有するこの共通アポリポタンパク質が第一サブアセンブ
リを構成する、 −以後第二グループと指称される別のグループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が保有する任意の別
のアポリポタンパク質Xm以外のアポリポタンパク質Ynを
少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成り、
少なくとも１つのこのアポリポタンパク質Ynが第二サブ
アセンブリを構成するか、又は、 −一部が第一サブアセンブリを構成する前記「共通アポ
リポタンパク質」を保有し更に第一グループのリポタン
パク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質Xm
以外のアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ保有し、
残りのリポタンパク質粒子は、第一サブアセンブリを構
成する前記「共通アポリポタンパク質」を保有しない
が、前記一部が保有しており第一グループにリポタンパ
ク質が任意に保有する別のアポリタンパク質Xmとは異な
るアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ保有してお
り、この少なくとも１つのアポリポタンパク質Zpが第二
サブアセンブリを構成する。
部が前記「共通」アポリポタンパク質を保有し任意の別
のアポリポタンパク質Xmを保有するリポタンパク質粒子
から成り、第一グループの全部のリポタンパク粒子が保
有するこの共通アポリポタンパク質が第一サブアセンブ
リを構成する、 −以後第二グループと指称される別のグループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が保有する任意の別
のアポリポタンパク質Xm以外のアポリポタンパク質Ynを
少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成り、
少なくとも１つのこのアポリポタンパク質Ynが第二サブ
アセンブリを構成するか、又は、 −一部が第一サブアセンブリを構成する前記「共通アポ
リポタンパク質」を保有し更に第一グループのリポタン
パク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質Xm
以外のアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ保有し、
残りのリポタンパク質粒子は、第一サブアセンブリを構
成する前記「共通アポリポタンパク質」を保有しない
が、前記一部が保有しており第一グループにリポタンパ
ク質が任意に保有する別のアポリタンパク質Xmとは異な
るアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ保有してお
り、この少なくとも１つのアポリポタンパク質Zpが第二
サブアセンブリを構成する。
本発明方法の特徴は、 −定量すべき２つのアポリポタンパク質サブアセンブリ
を含む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持することで
ある。該抗体混合物は、 −第二サブアセンブリ（Yn又はZp）を構成する少なくと
も１つのアポリポタンパク質に対する抗体を第二グルー
プのリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で含
み、 −第一サブアセンブリを構成する「共通アポリポタンパ
ク質」に対する抗体を第一グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに十分な量で含み、 −第二グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必
要な前記抗体の量は、第一グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な抗体の量に対して過剰であり、 これらの過剰の割合は、免疫拡散後に２つの明確な境界
が生じ、定量すべき２つのサブアセンブリを含む媒体の
拡散開始点に近い方の免疫拡散境界が、第二グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応し、前記拡散開始点か
ら遠い方の免疫拡散境界が第一グループのリポタンパク
質粒子の沈降に対応しており、これらの２つの境界は夫
々、以下の場合、即ち第一サブアセンブリ及び第二サブ
アセンブリのアポリポタンパク質を夫々含む２つのリポ
タンパク質粒子グループを分離した後に、一方で第一グ
ループのリポタンパク質粒子を前記第一サブアセンブリ
を構成するアポリポタンパク質に対する抗体と接触さ
せ、この抗体は第一サブアセンブリを構成するアポリポ
タンパク質を保有し生物媒体から分離されない第一グル
ープのリポタンパク質粒子を沈降させるために使用され
る量に等しい量で使用され、他方で第二グループのリポ
タンパク質粒子を前記第二アセンブリを構成するアポリ
ポタンパク質に対する抗体と接触させ、この抗体は第二
サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質を保有し
生物媒体から分離されない第二グループのリポタンパク
質粒子を沈降させるために使用される量に等しい量で使
用された場合に得られる境界と等しく、 −拡散開始点と２つの免疫拡散境界の各々との間の最大
間隔を測定し、各間隔を２つのサブアセンブリの既知量
のアポリポタンパク質を含む標準生物媒体と比較する。
を含む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持することで
ある。該抗体混合物は、 −第二サブアセンブリ（Yn又はZp）を構成する少なくと
も１つのアポリポタンパク質に対する抗体を第二グルー
プのリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で含
み、 −第一サブアセンブリを構成する「共通アポリポタンパ
ク質」に対する抗体を第一グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに十分な量で含み、 −第二グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必
要な前記抗体の量は、第一グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な抗体の量に対して過剰であり、 これらの過剰の割合は、免疫拡散後に２つの明確な境界
が生じ、定量すべき２つのサブアセンブリを含む媒体の
拡散開始点に近い方の免疫拡散境界が、第二グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応し、前記拡散開始点か
ら遠い方の免疫拡散境界が第一グループのリポタンパク
質粒子の沈降に対応しており、これらの２つの境界は夫
々、以下の場合、即ち第一サブアセンブリ及び第二サブ
アセンブリのアポリポタンパク質を夫々含む２つのリポ
タンパク質粒子グループを分離した後に、一方で第一グ
ループのリポタンパク質粒子を前記第一サブアセンブリ
を構成するアポリポタンパク質に対する抗体と接触さ
せ、この抗体は第一サブアセンブリを構成するアポリポ
タンパク質を保有し生物媒体から分離されない第一グル
ープのリポタンパク質粒子を沈降させるために使用され
る量に等しい量で使用され、他方で第二グループのリポ
タンパク質粒子を前記第二アセンブリを構成するアポリ
ポタンパク質に対する抗体と接触させ、この抗体は第二
サブアセンブリを構成するアポリポタンパク質を保有し
生物媒体から分離されない第二グループのリポタンパク
質粒子を沈降させるために使用される量に等しい量で使
用された場合に得られる境界と等しく、 −拡散開始点と２つの免疫拡散境界の各々との間の最大
間隔を測定し、各間隔を２つのサブアセンブリの既知量
のアポリポタンパク質を含む標準生物媒体と比較する。
予想外の知見によれば、免疫拡散境界は、前記のごとく
定量すべきアポリポタンパク質サブアセンブリの各々が
所属するリポタンパク質グループの各々の沈降に夫々対
応する。
定量すべきアポリポタンパク質サブアセンブリの各々が
所属するリポタンパク質グループの各々の沈降に夫々対
応する。
３つのリポタンパク質粒子グループに所属する定量すべ
き３のアポリポタンパク質サブアセンブリの構成の一例
を以下に示す。
き３のアポリポタンパク質サブアセンブリの構成の一例
を以下に示す。
第一サブアセンブリは、第一グループの全部のリポタン
パク質粒子に保有されまた第二及び第三グループのリポ
タンパク質粒子の少なくとも一部又は第三グループのリ
ポタンパク質粒子の少なくとも一部によって保有された
アポリポタンパク質から成る。
パク質粒子に保有されまた第二及び第三グループのリポ
タンパク質粒子の少なくとも一部又は第三グループのリ
ポタンパク質粒子の少なくとも一部によって保有された
アポリポタンパク質から成る。
第二サブアンセンブリは、第三グループのリポタンパク
質粒子の少なくとも一部によって保有され第一サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質とは異なるアポリ
ポタンパク質から成る。
質粒子の少なくとも一部によって保有され第一サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質とは異なるアポリ
ポタンパク質から成る。
第三サブアセンブリは、第一サブアセンブリ及び第二サ
ブアセンブリを夫々構成するアポリポタンパク質及び第
一及び第二グループのリポタンパク質粒子が任意に保有
する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なるアポリ
ポタパク質から成る。
ブアセンブリを夫々構成するアポリポタンパク質及び第
一及び第二グループのリポタンパク質粒子が任意に保有
する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なるアポリ
ポタパク質から成る。
本発明は、生物媒体に含まれた２つのリポタンパク質粒
子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の２つの
サブアセンブリを平板ゲル内の分画免疫拡散に同時に定
量する方法を抵抗する。前記２つのリポタンパク質粒子
グループは、「共通アポリポタンパク質」を含み、以下
のごとく定義できる。
子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の２つの
サブアセンブリを平板ゲル内の分画免疫拡散に同時に定
量する方法を抵抗する。前記２つのリポタンパク質粒子
グループは、「共通アポリポタンパク質」を含み、以下
のごとく定義できる。
−以後第一グループと指称される１つのグループは、全
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し任意に別
のアポリポタンパク質Xmを保有するリポタンパク質粒子
から成り、第一グループの全部のリポタンパク粒子が保
有するこの共通アポリポタンパク質が第一サブアセンブ
リを構成する、 −以後第二グループと指称される別のグループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質
Ynを少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成
り、１つ以上のこのアポリポタンパク質Ynが第二サブア
センブリを構成するか、又は、 −リポタンパク質粒子の一部が、第一グループの前記
「共通アポリポタンパク質」と更に第一グループのリポ
タンパク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク
質Xmとは異なるアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ
保有し、リポタンパク質粒子の残りの部分が、第一サブ
アセンブリを構成する前記「共通アポリポタンパク質」
を保有しないが、前記リポタンパク質の一部が保有し第
一グループのリポタンパク質が任意に保有する別のアポ
リポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質Zpを少
なくとも１つ保有する。この少なくとも１つのアポリポ
タンパク質Zpは第二サブアセンブリを構成する。
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し任意に別
のアポリポタンパク質Xmを保有するリポタンパク質粒子
から成り、第一グループの全部のリポタンパク粒子が保
有するこの共通アポリポタンパク質が第一サブアセンブ
リを構成する、 −以後第二グループと指称される別のグループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質
Ynを少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成
り、１つ以上のこのアポリポタンパク質Ynが第二サブア
センブリを構成するか、又は、 −リポタンパク質粒子の一部が、第一グループの前記
「共通アポリポタンパク質」と更に第一グループのリポ
タンパク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク
質Xmとは異なるアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ
保有し、リポタンパク質粒子の残りの部分が、第一サブ
アセンブリを構成する前記「共通アポリポタンパク質」
を保有しないが、前記リポタンパク質の一部が保有し第
一グループのリポタンパク質が任意に保有する別のアポ
リポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質Zpを少
なくとも１つ保有する。この少なくとも１つのアポリポ
タンパク質Zpは第二サブアセンブリを構成する。
本発明方法の特徴は、 −定量すべき２のアポリポタンパク質サブアセンブリを
含む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持し、該抗体混
合物が、 −第二サブアセンブリ（Yn又はZp）の１つ以上のアポリ
ポタンパク質に対する抗体を第二グループリポタンパク
質粒子を沈降させるに十分な量で含み、 −２つのサブアセンブリに「共通のアポリポタンパク
質」に対する抗体を第一グループのリポタンパク質粒子
を沈降させるに十分な量で含み、 −第二グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必
要な前記抗体の量は、第一グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な抗体の量に対して過剰であり、
この過剰の割合は、免疫拡散後に２つの明確な境界が生
じ、定量すべき２つのサブアセンブリを含む媒体の沈降
点に近い方の免疫拡散境界が、第二グループのリポタン
パク質粒子の沈降に対応し、前記沈降点から遠い方の免
疫拡散境界が、第一グループのリポタンパク質粒子の沈
降に対応しており、これらの２つの境界は夫々、以下の
場合、即ち第一サブアセンブリ及び第二サブアセンブリ
のアポリポタンパク質を夫々含む２つのリポタンパク質
粒子グループを分離した後に、一方で第一グループのリ
ポタンパク質粒子を前記第一サブアセンブリを構成する
共通アポリポタンパク質に対する抗体と接触させ、この
抗体が第一サブアセンブリを構成するアポリポタンパク
質を保有し生物媒体から分離されない第一グループのリ
ポタンパク質粒子を沈降させるために使用される量と等
しい量で使用され、他方で第二グループのリポタンパク
質粒子を前記第二サブアセンブリを構成するアポリポタ
ンパク質に対する抗体と接触させ、この抗体が第二サブ
アセンブリを構成するアポリポタンパク質を保有し生物
媒体から分離されない第二グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるために使用される量と等しい量で使用さ
れた場合に得られる境界と等しく、 −沈降点と２つの免疫拡散境界の各々との間の最大間隔
を測定し、各間隔を２つのサブアセンブリの既知量のア
ポリポタンパク質を含む標準生物媒体と比較する。
含む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持し、該抗体混
合物が、 −第二サブアセンブリ（Yn又はZp）の１つ以上のアポリ
ポタンパク質に対する抗体を第二グループリポタンパク
質粒子を沈降させるに十分な量で含み、 −２つのサブアセンブリに「共通のアポリポタンパク
質」に対する抗体を第一グループのリポタンパク質粒子
を沈降させるに十分な量で含み、 −第二グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必
要な前記抗体の量は、第一グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な抗体の量に対して過剰であり、
この過剰の割合は、免疫拡散後に２つの明確な境界が生
じ、定量すべき２つのサブアセンブリを含む媒体の沈降
点に近い方の免疫拡散境界が、第二グループのリポタン
パク質粒子の沈降に対応し、前記沈降点から遠い方の免
疫拡散境界が、第一グループのリポタンパク質粒子の沈
降に対応しており、これらの２つの境界は夫々、以下の
場合、即ち第一サブアセンブリ及び第二サブアセンブリ
のアポリポタンパク質を夫々含む２つのリポタンパク質
粒子グループを分離した後に、一方で第一グループのリ
ポタンパク質粒子を前記第一サブアセンブリを構成する
共通アポリポタンパク質に対する抗体と接触させ、この
抗体が第一サブアセンブリを構成するアポリポタンパク
質を保有し生物媒体から分離されない第一グループのリ
ポタンパク質粒子を沈降させるために使用される量と等
しい量で使用され、他方で第二グループのリポタンパク
質粒子を前記第二サブアセンブリを構成するアポリポタ
ンパク質に対する抗体と接触させ、この抗体が第二サブ
アセンブリを構成するアポリポタンパク質を保有し生物
媒体から分離されない第二グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるために使用される量と等しい量で使用さ
れた場合に得られる境界と等しく、 −沈降点と２つの免疫拡散境界の各々との間の最大間隔
を測定し、各間隔を２つのサブアセンブリの既知量のア
ポリポタンパク質を含む標準生物媒体と比較する。
前記及び以後の記載で第一サブアセンブリと指称される
アポリポタンパク質サブアセンブリは１種類のアポリポ
タンパク質から成り、これは前記及び以後の記載におい
て第一グループのリポタンパク質粒子と指称されるグル
ープの全部のリポタンパク質に共通のアポリポタンパク
質であり、第一グループのリポタンパク質粒子がその他
のアポリポタンパク質を含んでいてもよい。
アポリポタンパク質サブアセンブリは１種類のアポリポ
タンパク質から成り、これは前記及び以後の記載におい
て第一グループのリポタンパク質粒子と指称されるグル
ープの全部のリポタンパク質に共通のアポリポタンパク
質であり、第一グループのリポタンパク質粒子がその他
のアポリポタンパク質を含んでいてもよい。
前記及び以後の記載で第二サブアセンブリと指称される
アポリポタンパク質サブアセンブリは１つ以上のアポリ
ポタンパク質から成り、これは前記の共通アポリポタン
パク質とは異なりまた第一グループのリポタンパク質粒
子が任意に保有する別のアポリポタンパク質とも異な
る。
アポリポタンパク質サブアセンブリは１つ以上のアポリ
ポタンパク質から成り、これは前記の共通アポリポタン
パク質とは異なりまた第一グループのリポタンパク質粒
子が任意に保有する別のアポリポタンパク質とも異な
る。
しかしながら、第二サブアセンブリの１つ以上のアポリ
ポタンパク質は前記共通アポリポタンパク質を少なくと
も一部に保有するリポタンパク質粒子に保有されてもよ
い。
ポタンパク質は前記共通アポリポタンパク質を少なくと
も一部に保有するリポタンパク質粒子に保有されてもよ
い。
しかしながら、第二グループのリポタンパク質粒子の少
なくとも一部に保有された前記共通アポリポタンパク質
は、第二のアポリポタンパク質サブアセンブリの一部で
はない。
なくとも一部に保有された前記共通アポリポタンパク質
は、第二のアポリポタンパク質サブアセンブリの一部で
はない。
従って、第二グループのリポタンパク質粒子は好ましく
は以下のごとく構成される。
は以下のごとく構成される。
−全部が共通アポリポタンパク質を含み更に共通アポリ
ポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質が任意
に保有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なる
アポリポタンパク質を少なくとも１つ含むリポタンパク
質粒子から構成されるか、又は、 −一部が、前記共通アポリポタンパク質を含み更に共通
アポリポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質のいずれ
とも異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含むリ
ポタンパク質粒子から構成され、リポタンパク質粒子の
残りの部分が、前記共通アポリポタンパク質を含まない
が、前記一部に含まれた共通アポリポタンパク質以外の
アポリポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質のいずれ
とも異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含む粒
子から構成される。
ポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質が任意
に保有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なる
アポリポタンパク質を少なくとも１つ含むリポタンパク
質粒子から構成されるか、又は、 −一部が、前記共通アポリポタンパク質を含み更に共通
アポリポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質のいずれ
とも異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含むリ
ポタンパク質粒子から構成され、リポタンパク質粒子の
残りの部分が、前記共通アポリポタンパク質を含まない
が、前記一部に含まれた共通アポリポタンパク質以外の
アポリポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質のいずれ
とも異なるアポリポタンパク質を少なくとも１つ含む粒
子から構成される。
本発明方法の好ましい実施態様によれば、第一サブアセ
ンブリは、第一グループを構成する互いに等しい遊離リ
ポタンパク質粒子によって保有された１つのアポリポタ
ンパク質から成る。
ンブリは、第一グループを構成する互いに等しい遊離リ
ポタンパク質粒子によって保有された１つのアポリポタ
ンパク質から成る。
遊離リポタンパク質粒子なる用語は、アポリポタンパク
質を１つだけ含む粒子を意味する。
質を１つだけ含む粒子を意味する。
本発明方法の別の実施態様によれば、第一グループは、
一方では第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタ
ンパク質を保有する互いに等しい遊離リポタンパク質粒
子から成り、他方では前記共通アポリポタンパク質に加
えて、前記共通アポリポタンパク質及び第二サブアセン
ブリを構成するアポリポタンパク質ののいずれとも異な
るアポリポタンパク質を少なくとも１つ含む複合リポタ
ンパク質粒子から成る。
一方では第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタ
ンパク質を保有する互いに等しい遊離リポタンパク質粒
子から成り、他方では前記共通アポリポタンパク質に加
えて、前記共通アポリポタンパク質及び第二サブアセン
ブリを構成するアポリポタンパク質ののいずれとも異な
るアポリポタンパク質を少なくとも１つ含む複合リポタ
ンパク質粒子から成る。
複合リポタンパク質粒子なる用語は２つ以上のアポリポ
タンパク質を保有する粒子を意味する。
タンパク質を保有する粒子を意味する。
本発明の好ましい実施態様によれば、第二サブアセンブ
リは第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタンパ
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保
有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なるアポ
リポタンパク質から成る。第二サブアセンブリを構成す
るこのアポリポタンパク質は更に全部が、第一サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質を更に含む複合リ
ポタンパク質粒子に保有されている。
リは第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタンパ
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保
有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なるアポ
リポタンパク質から成る。第二サブアセンブリを構成す
るこのアポリポタンパク質は更に全部が、第一サブアセ
ンブリを構成するアポリポタンパク質を更に含む複合リ
ポタンパク質粒子に保有されている。
本発明の好ましい実施態様によれば、第二サブアセンブ
リは第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタンパ
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意の保
有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なるアポ
リポタンパク質から成る。第二サブアセンブリこのアポ
リポタンパク質は、一方で第一サブアセンブリを構成す
るアポリポタンパク質を更に含む複合リポタンパク質粒
子によって保有され、他方で第一サブアセンブリを構成
するアポリポタンパク質を保有しない単純又は複合リポ
タンパク質粒子に保有される。
リは第一サブアセンブリを構成する共通アポリポタンパ
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意の保
有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なるアポ
リポタンパク質から成る。第二サブアセンブリこのアポ
リポタンパク質は、一方で第一サブアセンブリを構成す
るアポリポタンパク質を更に含む複合リポタンパク質粒
子によって保有され、他方で第一サブアセンブリを構成
するアポリポタンパク質を保有しない単純又は複合リポ
タンパク質粒子に保有される。
生物媒体は特に血液である。
抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体又はオリゴクローナル抗体、即ちアポリポタンパク質
の構造をコピーする合成ペプチドで免疫化して得られた
抗体を使用し得る。
体又はオリゴクローナル抗体、即ちアポリポタンパク質
の構造をコピーする合成ペプチドで免疫化して得られた
抗体を使用し得る。
免疫拡散に関しては、例えばClin.Chem.1974、20
（６）、676〜681に記載のごときLaurellの電気免疫拡
散の方法を使用してもよい。
（６）、676〜681に記載のごときLaurellの電気免疫拡
散の方法を使用してもよい。
この方法を使用した場合、免疫拡散境界はピークの形態
で得られる。沈降したリポタンパク質粒子によって被覆
された表面が定量すべきアポリポタンパク質の量に比例
しピークが実質的にすべて同じ基底をもつので、標準生
物媒体から得られるピークに比較することによって定量
すべきアポリポタンパク質の量ピークの高さに基づいて
算定できる。
で得られる。沈降したリポタンパク質粒子によって被覆
された表面が定量すべきアポリポタンパク質の量に比例
しピークが実質的にすべて同じ基底をもつので、標準生
物媒体から得られるピークに比較することによって定量
すべきアポリポタンパク質の量ピークの高さに基づいて
算定できる。
この方法の利点は特に結果が速く得られることである。
免疫拡散に関しては、例えばMancini G.,Carbonara A.
O.,Heremans J.F.Immunochemical quantitation of ant
igens by single radial immunodiffusion.Immunochemi
stry 1965、２、235に記載のごときManciniの放射（ラ
ジアル）免疫拡散法を使用してもよい。
O.,Heremans J.F.Immunochemical quantitation of ant
igens by single radial immunodiffusion.Immunochemi
stry 1965、２、235に記載のごときManciniの放射（ラ
ジアル）免疫拡散法を使用してもよい。
この方法を使用した場合、免疫拡散境界はリングの輪郭
に対応する円の形態で得られる。
に対応する円の形態で得られる。
沈降したリポタンパク質によって被覆された表面は定量
すべきアポリポタンパク質の量に比例するので、標準生
物媒体から得られたリングと比較することによって定量
すべきアポリポタンパク質の量を対応する円の直径の平
方に基づいて算定できる。
すべきアポリポタンパク質の量に比例するので、標準生
物媒体から得られたリングと比較することによって定量
すべきアポリポタンパク質の量を対応する円の直径の平
方に基づいて算定できる。
本発明の好ましい実施態様によれば、第二サブアセンブ
リの１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体の最小
使用量は、２つの明確な免疫拡散境界の出現によって決
定される。
リの１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体の最小
使用量は、２つの明確な免疫拡散境界の出現によって決
定される。
本発明の範囲内で、第二グループのリポタンパク質粒子
を沈降させるに必要な第二サブアセンブリの少なくとも
１つのアポリポタンパク質に対する抗体の量は、第一グ
ループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要な第一
サブアセンブリのアポリポタンパク質に対する抗体の量
に比較して過剰である。これにより第一グループの沈降
ピークより低い沈降ピークが生じる。
を沈降させるに必要な第二サブアセンブリの少なくとも
１つのアポリポタンパク質に対する抗体の量は、第一グ
ループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要な第一
サブアセンブリのアポリポタンパク質に対する抗体の量
に比較して過剰である。これにより第一グループの沈降
ピークより低い沈降ピークが生じる。
第二グループのリポタンパク質粒子を沈降させるために
添加すべき第二サブアセンブリの少なくとも１つのアポ
リポタンパク質に対する抗体の量の最大値は制限されな
い。
添加すべき第二サブアセンブリの少なくとも１つのアポ
リポタンパク質に対する抗体の量の最大値は制限されな
い。
しかしながら、第二サブアセンブリの１つ以上のアポリ
ポタンパク質に対する抗体の量を増加させるに伴って、
第二グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応するピ
ークの高さが減少し、第二サブアセンブリのアポリポタ
ンパク質に対する抗体が特定の量を超過すると第二グル
ープのリポタンパク質粒子が生物媒体の沈降点で沈降す
る。抗体が前記特定量以上になると、第二グループのリ
ポタンパク質粒子の拡散がもはや生じない。この場合、
第一サブアセンブリのアポリポタンパク質だけが定量さ
れる。
ポタンパク質に対する抗体の量を増加させるに伴って、
第二グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応するピ
ークの高さが減少し、第二サブアセンブリのアポリポタ
ンパク質に対する抗体が特定の量を超過すると第二グル
ープのリポタンパク質粒子が生物媒体の沈降点で沈降す
る。抗体が前記特定量以上になると、第二グループのリ
ポタンパク質粒子の拡散がもはや生じない。この場合、
第一サブアセンブリのアポリポタンパク質だけが定量さ
れる。
本発明方法の有利な実施態様によれば、第二サブアセン
ブリの１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体の量
は、２つの明確な免疫拡散境界の出現によって決定され
た最小値と第二サブアセンブリのアポリポタンパク質を
保有するリポタンパク質の拡散が停止し生物媒体の沈降
点で沈降する最大値との間の範囲で使用される。第二サ
ブアセンブリの１つ以上のアポリポタンパク質に対する
抗体の量が最小値、即ち２つの明確な免疫拡散境界の出
現が観察され始める値を上回ったとき、第一グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応する免疫拡散境界は変
化しない。
ブリの１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体の量
は、２つの明確な免疫拡散境界の出現によって決定され
た最小値と第二サブアセンブリのアポリポタンパク質を
保有するリポタンパク質の拡散が停止し生物媒体の沈降
点で沈降する最大値との間の範囲で使用される。第二サ
ブアセンブリの１つ以上のアポリポタンパク質に対する
抗体の量が最小値、即ち２つの明確な免疫拡散境界の出
現が観察され始める値を上回ったとき、第一グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応する免疫拡散境界は変
化しない。
本発明方法の別の好ましい実施態様によれば、第二サブ
アセンブリの１つ以上のアポリタンパク質に対する抗体
の使用量は、沈降点と第二サブアセンブリのアポリポタ
ンパク質を含有するリポタンパク質粒子の沈降に対応す
る免疫拡散境界との間の最大間隔が、沈降点と第一サブ
アセンブリのアポリポタンパク質を含有するリポタンパ
ク質粒子の沈降に対応する免疫拡散境界との間の最大間
隔の約1/2〜約1/8、好ましくは約1/3〜約1/4になる量で
ある。
アセンブリの１つ以上のアポリタンパク質に対する抗体
の使用量は、沈降点と第二サブアセンブリのアポリポタ
ンパク質を含有するリポタンパク質粒子の沈降に対応す
る免疫拡散境界との間の最大間隔が、沈降点と第一サブ
アセンブリのアポリポタンパク質を含有するリポタンパ
ク質粒子の沈降に対応する免疫拡散境界との間の最大間
隔の約1/2〜約1/8、好ましくは約1/3〜約1/4になる量で
ある。
本発明方法の別の好ましい実施態様によれば、標準は、
第一サブアセンブリが既知量（Ａ）のアポリポタンパク
質を含有し、第二グループのリポタンパク質粒子の少な
くとも一部が第一サブアセンブリのアポリポタンパク質
を含有し、第二サブアセンブリが第一サブアセンブリの
アポリポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質のいずれ
とも異なる１つ以上の別々のアポリポタンパクを既知量
（Ｂ）ｉで含有する媒体から作成され、 −プレート上で第二サブアセンブリのアポリポタンパク
の各々に対する抗体は第二グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な量であり、前記各抗体の量は、
第一グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要
な抗体に対して過剰であり、第一サブアセンブリのアポ
リポタンパク質に対する抗体に比較した第二サブアセン
ブリのアポリポタンパク質の各々に対する抗体の過剰は
式 ［式中、V1、T1は夫々、第一サブアセンブリのアポリポ
タンパク質に対する抗体の量及び力価を示し、V2i、T2i
は夫々、第二サブアセンブリのアポリポタンパク質の各
々に対する抗体の量及び力価を示す］ で示される。
第一サブアセンブリが既知量（Ａ）のアポリポタンパク
質を含有し、第二グループのリポタンパク質粒子の少な
くとも一部が第一サブアセンブリのアポリポタンパク質
を含有し、第二サブアセンブリが第一サブアセンブリの
アポリポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質
粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質のいずれ
とも異なる１つ以上の別々のアポリポタンパクを既知量
（Ｂ）ｉで含有する媒体から作成され、 −プレート上で第二サブアセンブリのアポリポタンパク
の各々に対する抗体は第二グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な量であり、前記各抗体の量は、
第一グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要
な抗体に対して過剰であり、第一サブアセンブリのアポ
リポタンパク質に対する抗体に比較した第二サブアセン
ブリのアポリポタンパク質の各々に対する抗体の過剰は
式 ［式中、V1、T1は夫々、第一サブアセンブリのアポリポ
タンパク質に対する抗体の量及び力価を示し、V2i、T2i
は夫々、第二サブアセンブリのアポリポタンパク質の各
々に対する抗体の量及び力価を示す］ で示される。
電気免疫拡散法を使用するときは、ピーク高さが高いほ
どピーク高さの相対測定誤差が小さいことを考慮にい
れ、プレートの有効寸法をピークのために最大限利用す
るのが好ましい。
どピーク高さの相対測定誤差が小さいことを考慮にい
れ、プレートの有効寸法をピークのために最大限利用す
るのが好ましい。
このために、以下の値を決定する。
（１）（第二グループのリポタンパク質粒子の少なくと
も一部にも保有されている第一サブアセンブリのアポリ
ポタンパク質を保有するリポタンパク質粒子を沈降させ
る）抗体の量V1をピーク高さH1が得られるように決定す
る。この決定のためには、プレート上で第一グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応する抗体量v1で高さh1
を与え、量V1を式 によって算出する。ｘ％は、媒体中の第一サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質の総量に対する該アポ
リポタンパク質の割合を示す。
も一部にも保有されている第一サブアセンブリのアポリ
ポタンパク質を保有するリポタンパク質粒子を沈降させ
る）抗体の量V1をピーク高さH1が得られるように決定す
る。この決定のためには、プレート上で第一グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応する抗体量v1で高さh1
を与え、量V1を式 によって算出する。ｘ％は、媒体中の第一サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質の総量に対する該アポ
リポタンパク質の割合を示す。
次に、以下の値を決定する。
（２）（第一サブアセンブリを構成するアポリポタンパ
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保
有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なる第二
サブアセンブリの１つ以上のアポリポタンパク質を保有
するリポタンパク質粒子を沈降させる）抗体の量V2をピ
ーク高さH2が得られるように決定する。この決定のため
には、プレート上で第二グループのリポタンパク質粒子
の沈降に対応する抗体量v2で高さh2を与え、量V2を式 によって算出する。
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保
有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異なる第二
サブアセンブリの１つ以上のアポリポタンパク質を保有
するリポタンパク質粒子を沈降させる）抗体の量V2をピ
ーク高さH2が得られるように決定する。この決定のため
には、プレート上で第二グループのリポタンパク質粒子
の沈降に対応する抗体量v2で高さh2を与え、量V2を式 によって算出する。
放射免疫拡散法を使用するときは、リングが大きいほど
相対測定誤差が小さいことを考慮してリングの直径をで
きるだけ大きくするのが有利である。
相対測定誤差が小さいことを考慮してリングの直径をで
きるだけ大きくするのが有利である。
プレートの寸法を最大限活用するために以下の値を決定
する。まず、 （１）（第二グループのリポタンパク質粒子の少なくと
も一部にも保有されている第一サブアセンブリのアポリ
ポタンパク質を保有するリポタンパク質粒子を沈降させ
る）抗体の量V1をリング直径D1が得られるように決定す
る。この決定のためには、プレート上で第一グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応する抗体量v1で直径d1
を与え、量V1を式 に従って算出する。ｘ％は、媒体中の第一サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質の総量に対する該アポ
リポタンパク質の割合を示す。
する。まず、 （１）（第二グループのリポタンパク質粒子の少なくと
も一部にも保有されている第一サブアセンブリのアポリ
ポタンパク質を保有するリポタンパク質粒子を沈降させ
る）抗体の量V1をリング直径D1が得られるように決定す
る。この決定のためには、プレート上で第一グループの
リポタンパク質粒子の沈降に対応する抗体量v1で直径d1
を与え、量V1を式 に従って算出する。ｘ％は、媒体中の第一サブアセンブ
リを構成するアポリポタンパク質の総量に対する該アポ
リポタンパク質の割合を示す。
次に、以下の値を決定する。
（２）（第一サブアセンブリを構成するアポリポタンパ
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保
有する別のアポリポタンパクのいずれとも異なる第二サ
ブアセンブリの１つ以上のアポリポタンパク質を保有す
るリポタンパク質粒子を沈降させる）抗体の量V2をリン
グ直径D2が得られるように決定する。この決定のために
は、プレート上で第二サブアセンブリのアポリポタンパ
ク質の沈降に対応する抗体量v2で半径d2を与え、量V2を
式 によって算出する。
ク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保
有する別のアポリポタンパクのいずれとも異なる第二サ
ブアセンブリの１つ以上のアポリポタンパク質を保有す
るリポタンパク質粒子を沈降させる）抗体の量V2をリン
グ直径D2が得られるように決定する。この決定のために
は、プレート上で第二サブアセンブリのアポリポタンパ
ク質の沈降に対応する抗体量v2で半径d2を与え、量V2を
式 によって算出する。
本発明方法の好ましい実施態様によれば、第一サブアセ
ンブリは、第一グループを構成するリポタンパク質粒子
LPA I及びLPA I:Eが保有するアポリポタンパク質A Iか
ら成り、第二サブアセンブリは、第二グループを構成す
るリポタンパク質粒子LPA I:A II及びLPE:A IIを保有す
るアポリポタンパク質A IIから成る。方法の特徴は、定
量すべき２つのサブアセンブリを含む媒体をアポリポタ
ンパク質A IIに対する抗体（抗AII抗体）及びアポリポ
タンパク質A Iに対する抗体（抗A I抗体）の混合物の存
在下に維持し、アポリポタンパク質A IIに対する抗体が
アポリポタンパク質A Iに対する抗体に比較して過剰で
あり、健康被検者では粒子LPA I及びLPA I:Eが保有する
アポリポタンパク質A Iの量がアポリポタンパクA IIの
総量と実質的に等しいので、この過剰は特に、プレート
上の抗A II抗体の量と抗A II抗体の力価との積が、プレ
ート上の抗A I抗体の量と抗A I抗体の力価との積よりも
大きいことに対応する。
ンブリは、第一グループを構成するリポタンパク質粒子
LPA I及びLPA I:Eが保有するアポリポタンパク質A Iか
ら成り、第二サブアセンブリは、第二グループを構成す
るリポタンパク質粒子LPA I:A II及びLPE:A IIを保有す
るアポリポタンパク質A IIから成る。方法の特徴は、定
量すべき２つのサブアセンブリを含む媒体をアポリポタ
ンパク質A IIに対する抗体（抗AII抗体）及びアポリポ
タンパク質A Iに対する抗体（抗A I抗体）の混合物の存
在下に維持し、アポリポタンパク質A IIに対する抗体が
アポリポタンパク質A Iに対する抗体に比較して過剰で
あり、健康被検者では粒子LPA I及びLPA I:Eが保有する
アポリポタンパク質A Iの量がアポリポタンパクA IIの
総量と実質的に等しいので、この過剰は特に、プレート
上の抗A II抗体の量と抗A II抗体の力価との積が、プレ
ート上の抗A I抗体の量と抗A I抗体の力価との積よりも
大きいことに対応する。
本発明方法の別の好ましい実施態様によれば、第一サブ
アセンブリは、第一グループを構成するリポタンパク質
粒子LPBが保有するアポリポタンパク質Ｂから成り、第
二サブアセンブリは、第二グループを構成するリポタン
パク質粒子LPB:E、LPB:C III、LPE:C I:C III:B、LPA
I:E及びLPE:A IIが保有する２つのアポリポタンパク質
Ｅ及びC IIIから成る。方法の特徴は、定量すべき２つ
のサブアセンブリを含む媒体をアポリポタンパク質Ｅに
対する抗体（抗Ｅ抗体）及びアポリポタンパク質C III
に対する抗体（抗C III抗体）及びアポリポタンパク質
Ｂに対する抗体（抗Ｂ抗体）の混合物の存在下に維持
し、アポリポタンパク質Ｅに対する抗体がアポリポタン
パク質Ｂに対する抗体より過剰であり、アポリポタンパ
ク質C IIIに対する抗体がアポリポタンパク質Ｂに対す
る抗体より過剰であり、抗Ｂ抗体に対する抗C III抗体
の過剰は、抗C III抗体の量と抗C III抗体の力価との積
が、抗Ｂ抗体の量と抗Ｂ抗体の力価との積の1/6よりも
大きく、抗Ｂ抗体に対する抗Ｅ抗体の過剰は、抗Ｅ抗体
の量と抗Ｅ抗体の力価との積が、抗Ｂ抗体の量と抗Ｂ抗
体の力価との積の1/12よりも大きいことである。
アセンブリは、第一グループを構成するリポタンパク質
粒子LPBが保有するアポリポタンパク質Ｂから成り、第
二サブアセンブリは、第二グループを構成するリポタン
パク質粒子LPB:E、LPB:C III、LPE:C I:C III:B、LPA
I:E及びLPE:A IIが保有する２つのアポリポタンパク質
Ｅ及びC IIIから成る。方法の特徴は、定量すべき２つ
のサブアセンブリを含む媒体をアポリポタンパク質Ｅに
対する抗体（抗Ｅ抗体）及びアポリポタンパク質C III
に対する抗体（抗C III抗体）及びアポリポタンパク質
Ｂに対する抗体（抗Ｂ抗体）の混合物の存在下に維持
し、アポリポタンパク質Ｅに対する抗体がアポリポタン
パク質Ｂに対する抗体より過剰であり、アポリポタンパ
ク質C IIIに対する抗体がアポリポタンパク質Ｂに対す
る抗体より過剰であり、抗Ｂ抗体に対する抗C III抗体
の過剰は、抗C III抗体の量と抗C III抗体の力価との積
が、抗Ｂ抗体の量と抗Ｂ抗体の力価との積の1/6よりも
大きく、抗Ｂ抗体に対する抗Ｅ抗体の過剰は、抗Ｅ抗体
の量と抗Ｅ抗体の力価との積が、抗Ｂ抗体の量と抗Ｂ抗
体の力価との積の1/12よりも大きいことである。
本発明方法の別の好ましい実施態様によれば、リポタン
パク質粒子の３つのグループに夫々所属する３つのアポ
リポタンパク質のサブアセンブリを定量する。第一サブ
アンセンブリは、第一グループを構成するリポタンパク
質粒子LPBに所属するアポリポタンパク質Ｂから成る。
第二サブアセンブリは、第二グループを構成するリポタ
ンパク質粒子LPB:Eに所属するアポリポタンパク質Ｅか
ら成る。第三サブアセンブリは、第三グループを構成す
るリポタンパク質粒子LPE:C I:C II:C III:B、LPB:C II
I、LPE:A II、LPA I及びLPA I:A IIに所属するアポリポ
タンパク質A I、A II及びC IIIから構成される。方法の
特徴は、定量すべき３つのサブアセンブリを含有する媒
体を、アポリポタンパク質C IIIに対する抗体（抗C III
抗体）とアポリポタンパク質A IIに対する抗体（抗A II
抗体）とアポリポタンパク質AIに対する抗体（抗AI抗
体）とアポリポタンパク質Ｅに対する抗体（抗Ｅ抗体）
とアポリポタンパク質Ｂに対する抗体（抗Ｂ抗体）との
混合物の存在下に維持することである。抗C III抗体、
抗A II抗体及び抗A I抗体は夫々抗Ｅ抗体及び抗Ｂ抗体
に対して過剰であり、抗Ｅ抗体は抗Ｂ抗体に対して過剰
である。
パク質粒子の３つのグループに夫々所属する３つのアポ
リポタンパク質のサブアセンブリを定量する。第一サブ
アンセンブリは、第一グループを構成するリポタンパク
質粒子LPBに所属するアポリポタンパク質Ｂから成る。
第二サブアセンブリは、第二グループを構成するリポタ
ンパク質粒子LPB:Eに所属するアポリポタンパク質Ｅか
ら成る。第三サブアセンブリは、第三グループを構成す
るリポタンパク質粒子LPE:C I:C II:C III:B、LPB:C II
I、LPE:A II、LPA I及びLPA I:A IIに所属するアポリポ
タンパク質A I、A II及びC IIIから構成される。方法の
特徴は、定量すべき３つのサブアセンブリを含有する媒
体を、アポリポタンパク質C IIIに対する抗体（抗C III
抗体）とアポリポタンパク質A IIに対する抗体（抗A II
抗体）とアポリポタンパク質AIに対する抗体（抗AI抗
体）とアポリポタンパク質Ｅに対する抗体（抗Ｅ抗体）
とアポリポタンパク質Ｂに対する抗体（抗Ｂ抗体）との
混合物の存在下に維持することである。抗C III抗体、
抗A II抗体及び抗A I抗体は夫々抗Ｅ抗体及び抗Ｂ抗体
に対して過剰であり、抗Ｅ抗体は抗Ｂ抗体に対して過剰
である。
本発明方法の別の好ましい実施態様によれば、リポタン
パク質粒子の３つのグループに夫々所属するアポリポタ
ンパク質の３つのサブアセンブリを定量する。第一サブ
アセンブリは、第一グループを構成するリポタンパク質
粒子LPA Iに所属するアポリポタンパク質A Iから成る。
第二サブアセンブリは、第二グループを構成するリポタ
ンパク質粒子LPA I:A IIに所属するアポリポタンパク質
A IIから成る。第三アセンブリは、第三グループを構成
するリポタンパク質粒子LPE:C I:C II:C III:B、LPB:
E、LPE:A II及びLPA I:Eに所属するアポリポタンパク質
Ｅから構成される。方法の特徴は、定量すべき３つのサ
ブアセンブリを含有する媒体を、アポリポタンパク質Ｅ
に対する抗体（抗Ｅ抗体）とアポリポタンパク質A IIに
対する抗体（抗A II抗体）とアポリポタンパク質A Iに
対する抗体（抗A I抗体）との混合物の存在下に維持す
ることである。抗Ｅ抗体は抗A II抗体及び抗A I抗体に
対して過剰であり、抗A I抗体は抗Ｅ抗体に対して過剰
である。
パク質粒子の３つのグループに夫々所属するアポリポタ
ンパク質の３つのサブアセンブリを定量する。第一サブ
アセンブリは、第一グループを構成するリポタンパク質
粒子LPA Iに所属するアポリポタンパク質A Iから成る。
第二サブアセンブリは、第二グループを構成するリポタ
ンパク質粒子LPA I:A IIに所属するアポリポタンパク質
A IIから成る。第三アセンブリは、第三グループを構成
するリポタンパク質粒子LPE:C I:C II:C III:B、LPB:
E、LPE:A II及びLPA I:Eに所属するアポリポタンパク質
Ｅから構成される。方法の特徴は、定量すべき３つのサ
ブアセンブリを含有する媒体を、アポリポタンパク質Ｅ
に対する抗体（抗Ｅ抗体）とアポリポタンパク質A IIに
対する抗体（抗A II抗体）とアポリポタンパク質A Iに
対する抗体（抗A I抗体）との混合物の存在下に維持す
ることである。抗Ｅ抗体は抗A II抗体及び抗A I抗体に
対して過剰であり、抗A I抗体は抗Ｅ抗体に対して過剰
である。
本発明の目的はまた、疾患、特に健康なヒト又は動物の
正常生理状態に対応する上限値と下限値との間の範囲を
逸脱したアポリポタンパク質の濃度に関連する疾患のin
vitro診断のためにこの新規な定量方法を使用すること
である。
正常生理状態に対応する上限値と下限値との間の範囲を
逸脱したアポリポタンパク質の濃度に関連する疾患のin
vitro診断のためにこの新規な定量方法を使用すること
である。
より詳細には本発明は、健康人の生理状態に対応する上
限値と下限値との間の範囲を逸脱したアポリポタンパク
質A I又はアポリポタンパク質C II又はアポリポタンパ
ク質C IIIの濃度に関連するアテローム性動脈硬化症の
危険をin vitro診断する方法に係る。
限値と下限値との間の範囲を逸脱したアポリポタンパク
質A I又はアポリポタンパク質C II又はアポリポタンパ
ク質C IIIの濃度に関連するアテローム性動脈硬化症の
危険をin vitro診断する方法に係る。
ヒト血清の種々のリポタンパク質粒子の構成は以下のご
とく要約できる。
とく要約できる。
（cf.Fruchart−Ann.Biol.Clin.1986−44−116−12
1）。
1）。
成人被検者の血清中の主要アポリポタンパク質の通常の
病理生態学的値の濃度を以下に示す。
病理生態学的値の濃度を以下に示す。
アポリポタンパク質 Apo AI 1.10〜1.60g/ Apo A II 0.27〜0.49g/ Apo B100 0.7〜1.3g/ Apo B48 無視できる濃度 Apo C−Ｉ 50〜110mg/ Apo C−II 10〜67mg/ Apo C−III 40〜140mg/ Apo E 35〜73mg/ Apo（ａ） 0.01〜2500mg/ 本発明は、本発明の定量方法を使用することによって、
リポタンパク質粒子LPA I及びLPA I:Eに保有されたアポ
リポタンパク質粒子A Iの濃度が健康人の生理状態に対
応する上限値と下限値との間の範囲を逸脱することに関
連するアテローム性動脈硬化症の危険のin vitro診断方
法に有利に使用される。
リポタンパク質粒子LPA I及びLPA I:Eに保有されたアポ
リポタンパク質粒子A Iの濃度が健康人の生理状態に対
応する上限値と下限値との間の範囲を逸脱することに関
連するアテローム性動脈硬化症の危険のin vitro診断方
法に有利に使用される。
実際、粒子LPA I:E及びLPA Iの定量がアポリポタンパク
A I総量の定量よりも有意であることが判明した。
A I総量の定量よりも有意であることが判明した。
即ち、これらの粒子は細胞内に侵入してコレステロール
と結合し肝臓に運搬する。コレステロールは肝臓で台謝
される。
と結合し肝臓に運搬する。コレステロールは肝臓で台謝
される。
これに反して、粒子LPA I:A IIは細胞に侵入せず、双方
共の粒子がLPA I及びLPA I:Eの侵入インヒビターであ
る。
共の粒子がLPA I及びLPA I:Eの侵入インヒビターであ
る。
本発明は、本発明の定量方法を使用することによって、
リポタンパク質粒子LPBに保有されたアポリポタンパク
質粒子Ｂの濃度が健康人の生理状態に対応する上限値と
下限値との間の範囲を逸脱することに関連するアテロー
ム性動脈硬化症の危険のin vitro診断方法に有利に使用
される。
リポタンパク質粒子LPBに保有されたアポリポタンパク
質粒子Ｂの濃度が健康人の生理状態に対応する上限値と
下限値との間の範囲を逸脱することに関連するアテロー
ム性動脈硬化症の危険のin vitro診断方法に有利に使用
される。
また、粒子LPBの定量はアポリポタンパク質Ｂの総量の
定量よりも確実なアテローム性動脈硬化症の危険の指標
となることが判明した。
定量よりも確実なアテローム性動脈硬化症の危険の指標
となることが判明した。
本発明はまた、アポリポタンパク質の異常濃度に関連す
る発病の危険をin vitro診断するために、定量すべき粒
子のサブアセンブリを保有するリポタンパク質粒子グル
ープを沈降させる量の抗体混合物を含む完成した定量用
平板支持体、特にフィルム又はプレートの形状の平坦支
持体に係る。
る発病の危険をin vitro診断するために、定量すべき粒
子のサブアセンブリを保有するリポタンパク質粒子グル
ープを沈降させる量の抗体混合物を含む完成した定量用
平板支持体、特にフィルム又はプレートの形状の平坦支
持体に係る。
本発明はまた、アポリポタンパク質の異常濃度に関連す
る発病の危険をin vitro診断するためのアポリポタンパ
ク質のサブアセンブリ定量用キットに係る。本発明のキ
ットは、 −定量すべきアポリポタンパク質のサブアセンブリを夫
々含むリポタンパク質粒子の沈降に対応する抗体混合物
を含むゲルフィルム又はゲルプレートのごとき平坦支持
体と、 −標準曲線又は好ましくは、生物媒体中で更に定量すべ
き既知量のアポリポタンパク質サブアセンブリを含む標
準生物溶液、好ましくは所定希釈度好ましくは所定の希
釈度３又は４の標準生物溶液と、 を含む。
る発病の危険をin vitro診断するためのアポリポタンパ
ク質のサブアセンブリ定量用キットに係る。本発明のキ
ットは、 −定量すべきアポリポタンパク質のサブアセンブリを夫
々含むリポタンパク質粒子の沈降に対応する抗体混合物
を含むゲルフィルム又はゲルプレートのごとき平坦支持
体と、 −標準曲線又は好ましくは、生物媒体中で更に定量すべ
き既知量のアポリポタンパク質サブアセンブリを含む標
準生物溶液、好ましくは所定希釈度好ましくは所定の希
釈度３又は４の標準生物溶液と、 を含む。
実際、生物媒体中に含まれるアポリポタンパク質サブア
センブリを定量するためには、好ましくは、生物媒体中
で更に定量すべきアポリポタンパク質サブアセンブリを
所定量含む標準サンプルから予め作成された標準曲線を
使用する。
センブリを定量するためには、好ましくは、生物媒体中
で更に定量すべきアポリポタンパク質サブアセンブリを
所定量含む標準サンプルから予め作成された標準曲線を
使用する。
好ましくは、各ゲルフィルム又はゲルプレート毎に１つ
の標準曲線を作成する。このためには、分析処理中に生
じ得る軽度のばらつきを考慮にいれ、生物媒体中で更に
所定すべきアポリポタンパク質サンプルを既知量含む複
数の標準溶液を準備する。
の標準曲線を作成する。このためには、分析処理中に生
じ得る軽度のばらつきを考慮にいれ、生物媒体中で更に
所定すべきアポリポタンパク質サンプルを既知量含む複
数の標準溶液を準備する。
アポリポタンパク質A I及びA IIの２つのサブアセンブ
リの定量に関する具体例を以下に説明する。第一サブア
センブリは第一グループを形成する粒子LPA II:E及びLP
A Iに保有されたアポリポタンパク質A Iから成り、第二
サブアセンブリは粒子LPE:A II及びLPA I:A IIに保有さ
れたアポリポタンパク質A IIから成る。
リの定量に関する具体例を以下に説明する。第一サブア
センブリは第一グループを形成する粒子LPA II:E及びLP
A Iに保有されたアポリポタンパク質A Iから成り、第二
サブアセンブリは粒子LPE:A II及びLPA I:A IIに保有さ
れたアポリポタンパク質A IIから成る。
寸法10.3×8.3cmのゲルプレートで試験を実施する。長
辺から1.7cm隔てて長辺に平行に一列のウェル（生物媒
体を入れる場所）を設け、各辺1cmずつを紙で覆う。ウ
ェルの上方に5.5cmの有効高さが維持される。
辺から1.7cm隔てて長辺に平行に一列のウェル（生物媒
体を入れる場所）を設け、各辺1cmずつを紙で覆う。ウ
ェルの上方に5.5cmの有効高さが維持される。
生物媒体の正常サンプルとしては、リポタンパク質粒子
LPA I:E及びLPA Iの沈降に対応するピーク高3.5cm及び
リポタンパク質粒子LPE:A II及びLPA I:A IIの沈降に対
応するピーク高1.5cmを任意に設定する。
LPA I:E及びLPA Iの沈降に対応するピーク高3.5cm及び
リポタンパク質粒子LPE:A II及びLPA I:A IIの沈降に対
応するピーク高1.5cmを任意に設定する。
これらの任意のピーク高さの値は、抗A I抗体及び抗A I
I抗体の量を決定する方法を示す例として与えられたも
ので方法がこの値に限定されるのではない（リポタンパ
ク質粒子LPE:A II及びLPA I:A IIの沈降に対応するピー
クがリポタンパク質粒子LPA I:E及びLPA Iの沈降に対応
するピークを下回っていればよい）。
I抗体の量を決定する方法を示す例として与えられたも
ので方法がこの値に限定されるのではない（リポタンパ
ク質粒子LPE:A II及びLPA I:A IIの沈降に対応するピー
クがリポタンパク質粒子LPA I:E及びLPA Iの沈降に対応
するピークを下回っていればよい）。
まず、生物媒体の標準サンプルがピーク高さ1.5cmを与
えるためにゲルに添加する抗A II抗体の量を決定する。
えるためにゲルに添加する抗A II抗体の量を決定する。
サンプルを量v2抗A II抗体を含むプレートに付着させ
る。泳動後、ピーク高さ「ｈ」が得られる。添加すべき
抗A II抗体の量は、 である。
る。泳動後、ピーク高さ「ｈ」が得られる。添加すべき
抗A II抗体の量は、 である。
抗A I抗体の量も同様に決定される。この場合には更
に、前記生物サンプル中でリポタンパク質粒子LPA I:E
及びLPA Iが保有する抗原A Iの割合が正常サンプルは抗
原A Iの総量の約25％に相当することを考慮する。
に、前記生物サンプル中でリポタンパク質粒子LPA I:E
及びLPA Iが保有する抗原A Iの割合が正常サンプルは抗
原A Iの総量の約25％に相当することを考慮する。
量v1の抗A II抗体を含むプレートにおいて、ピーク高さ
「ｈ′」が得られるとき、量V2の抗A II抗体を含むプレ
ートに添加すべき抗A I抗体の量は である。
「ｈ′」が得られるとき、量V2の抗A II抗体を含むプレ
ートに添加すべき抗A I抗体の量は である。
量V1の抗A I抗体と量V2の抗A II抗体とを含むこのプレ
ートにおいて、サンプルは２つのピークを与える。
ートにおいて、サンプルは２つのピークを与える。
−１つはサンプルの沈降点に近い側に境界をもち高さ1.
5cmのピーク（第一ピーク）である。
5cmのピーク（第一ピーク）である。
−もう１つはサンプルの沈降点から遠い側に境界をもち
高さ3.5cmのピーク（第二ピーク）である。
高さ3.5cmのピーク（第二ピーク）である。
第一ピークの高さはゲル内に存在する抗A II抗体の量と
は関係がない（第二ピークが第一ピークより低ければよ
い）。
は関係がない（第二ピークが第一ピークより低ければよ
い）。
従って、別のゲルに量V1の抗A I抗体と２倍の量V2の抗A
II抗体とを添加すると、同じ高さの第一ピークと量V2
で得られるピークの高さの1/2に等しい高さの第二ピー
クとを得る。
II抗体とを添加すると、同じ高さの第一ピークと量V2
で得られるピークの高さの1/2に等しい高さの第二ピー
クとを得る。
前記のごとき２つのアポリポタンパク質A I及びA IIの
サブアセンブリの定量を行なったプレートを第１図に示
す。
サブアセンブリの定量を行なったプレートを第１図に示
す。
第１図のプレートは、0.8mlの抗A II抗体（力価50）と
0.15mlの抗A I抗体（力価175）との混合物を含む。
0.15mlの抗A I抗体（力価175）との混合物を含む。
左側の最初の２つの第一ピークとの右側の最後の２つの
ピークとは希釈度1/20（SE/20で表示）の標準血清で得
られるたピークに対応する。
ピークとは希釈度1/20（SE/20で表示）の標準血清で得
られるたピークに対応する。
12の血清サンプルを用い、前記のごときアポリポタンパ
ク質A I及びA IIのサブアセンブリを定量すべき試験す
る。これらの12のサンプルを希釈度1/20で試験する。
ク質A I及びA IIのサブアセンブリを定量すべき試験す
る。これらの12のサンプルを希釈度1/20で試験する。
第２図は、プレートNo.1と夫々同じ力価の抗A I抗体及
び抗A II抗体の混合物を含むプレートに対応する。抗A
I抗体の量は第１図のプレートに添加した量と同じであ
り、抗A II抗体の量は第１図のプレートに添加した量の
２倍である。
び抗A II抗体の混合物を含むプレートに対応する。抗A
I抗体の量は第１図のプレートに添加した量と同じであ
り、抗A II抗体の量は第１図のプレートに添加した量の
２倍である。
各試験血清毎に、第一グループのリポタンパク質粒子の
沈降に対応するピークは変化せず、第二グループのリポ
タンパク質粒子の沈降に対応するピークは第一プレート
の第二グループのピークの高さの1/2の等しい高さを持
つことが確認される。
沈降に対応するピークは変化せず、第二グループのリポ
タンパク質粒子の沈降に対応するピークは第一プレート
の第二グループのピークの高さの1/2の等しい高さを持
つことが確認される。
本発明定量方法の信頼性を確認するために、第一ピーク
が第二サブアセンブリのアポリポタンパク質を含まない
こと及び第二ピークが第一サブアセンブリのアポリポタ
ンパク質を含むことを証明する。
が第二サブアセンブリのアポリポタンパク質を含まない
こと及び第二ピークが第一サブアセンブリのアポリポタ
ンパク質を含むことを証明する。
このために、３つのゲルプレートを使用し、0.15mlの抗
A I抗体（力価220）と1mlの抗A II抗体（力価60）とを
導入する。
A I抗体（力価220）と1mlの抗A II抗体（力価60）とを
導入する。
左側の最初の３つの第一ピークは左から右に夫々希釈度
1/20、1/10及び1/5の希釈標準血清に対応し、右側の３
つの最終ピークは右から左に夫々希釈度1/20、1/10及び
1/5の希釈標準血清に対応する。
1/20、1/10及び1/5の希釈標準血清に対応し、右側の３
つの最終ピークは右から左に夫々希釈度1/20、1/10及び
1/5の希釈標準血清に対応する。
別の10個のピークは1/10に希釈された定量すべき血清に
対応する。
対応する。
泳動後、プレートの１つを生理食塩水で洗浄し、乾燥
し、クーマシーブルーのごときタンパク質着色剤で着色
する。２つのピークが得られる。第３図はこのプレート
を示す。
し、クーマシーブルーのごときタンパク質着色剤で着色
する。２つのピークが得られる。第３図はこのプレート
を示す。
第４図は上記の３つのプレートのうちの上記プレート以
外の１つのプレートを示し、このプレートは、泳動後に
ペルオキシダーゼ標識した300μの抗A IIモノクロー
ナル抗体溶液と共にインキュベートするする。
外の１つのプレートを示し、このプレートは、泳動後に
ペルオキシダーゼ標識した300μの抗A IIモノクロー
ナル抗体溶液と共にインキュベートするする。
ペルオキシダーゼの発色基質によって発色させる。第二
グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応する唯１つ
のピークが観察される。
グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応する唯１つ
のピークが観察される。
第５図は、最後のプレートを示し、泳動後に400μの
抗A Iモノクローナル抗体溶液と共にインキュベートす
る。ペルオシダーゼの発色基質によって発色させる。第
一グループ及び第二グループの夫々リポタンパク質粒子
の沈降に夫々対応する２つのピークが観察される。
抗A Iモノクローナル抗体溶液と共にインキュベートす
る。ペルオシダーゼの発色基質によって発色させる。第
一グループ及び第二グループの夫々リポタンパク質粒子
の沈降に夫々対応する２つのピークが観察される。
また、３つの放射免疫拡散プレートを調製した。各プレ
ートは、1mlの力価（60）の抗A II抗体と0.12mlの力価
（220）の抗A I抗体との混合物を含む。
ートは、1mlの力価（60）の抗A II抗体と0.12mlの力価
（220）の抗A I抗体との混合物を含む。
第６図はクーマシーブルーによるプレートの着色に対応
し２つのリングが生じる。
し２つのリングが生じる。
第７図はペルオキシダーゼ標識した300μの抗A IIモ
ノクローナル抗体と共にインキュベートしたプレートを
示し、ペルオキシダーゼの発色基質で発色させる。第二
グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応するリング
だけが見られる。
ノクローナル抗体と共にインキュベートしたプレートを
示し、ペルオキシダーゼの発色基質で発色させる。第二
グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応するリング
だけが見られる。
第８図はペルオキシダーゼ標識した400μの抗A Iモノ
クローナル抗体と共にインキュベートしたプレートを示
し、ペルオキシダーゼの発色基質を用いて発色させる。
第一グループ及び第二グループのリポタンパク質粒子の
沈降に対応するリングが観察される。
クローナル抗体と共にインキュベートしたプレートを示
し、ペルオキシダーゼの発色基質を用いて発色させる。
第一グループ及び第二グループのリポタンパク質粒子の
沈降に対応するリングが観察される。
実施例１ 50mlの三角フラスコに29mlの脱鉱物水を導入する。250m
gの商標HGT（MCI社により市販）のアガロースと60mgの
商標HEEO（MCI社により市販の高電気浸透アガロース）
とを添加する。完全に透明な溶液が得られるまで95〜10
0℃で加熱する。恒温浴で52〜55℃で平衡させ、イオン
強度0.1（バッファの導電率）の3mlのTris Glycine Ver
onal Veronal NaバッファpH9.2を添加し、4mlの抗A II
抗体（力価60）と0.6mlの抗A I（力価220）とを添加す
る。
gの商標HGT（MCI社により市販）のアガロースと60mgの
商標HEEO（MCI社により市販の高電気浸透アガロース）
とを添加する。完全に透明な溶液が得られるまで95〜10
0℃で加熱する。恒温浴で52〜55℃で平衡させ、イオン
強度0.1（バッファの導電率）の3mlのTris Glycine Ver
onal Veronal NaバッファpH9.2を添加し、4mlの抗A II
抗体（力価60）と0.6mlの抗A I（力価220）とを添加す
る。
均質化した溶液を商標Gel bond（FMCにより市販）の寸
法10.1×8.3cmのプラスチックフィルムに9ml/フィルム
の割合で流す。ゲルの形成後、長さに平行な１つの線に
沿って直径3mmのウェルをカッターで設ける。
法10.1×8.3cmのプラスチックフィルムに9ml/フィルム
の割合で流す。ゲルの形成後、長さに平行な１つの線に
沿って直径3mmのウェルをカッターで設ける。
このようにして、（リポタンパク質粒子LPA I:E及びLPA
Iに保有された）アポリポタンパク質A Iと（リポタン
パク質粒子LPA I:A II及びLPAE:A IIに保有された）ア
ポリポタンパク質A IIとを電気免疫拡散法によって定量
するための完成フィルムが得られる。
Iに保有された）アポリポタンパク質A Iと（リポタン
パク質粒子LPA I:A II及びLPAE:A IIに保有された）ア
ポリポタンパク質A IIとを電気免疫拡散法によって定量
するための完成フィルムが得られる。
定量すべきサンプル及び一連の標準は、1/10に希釈して
３μ／ウェルの割合でプレートに導入される。150Vで
３時間泳動させ、生理食塩水で洗浄し、乾燥し、クーマ
シーブルーで着色すると各サンプル毎に２つのピークが
得られる。薄い色の大きいピーク（リポタンパク質粒子
LPA I:E及びLPA Iに保有された）アポリポタンパク質A
Iに対応し、濃い色の小さいピークは（リポタンパク質
粒子LPA I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポタ
ンパク質A IIに対応する。
３μ／ウェルの割合でプレートに導入される。150Vで
３時間泳動させ、生理食塩水で洗浄し、乾燥し、クーマ
シーブルーで着色すると各サンプル毎に２つのピークが
得られる。薄い色の大きいピーク（リポタンパク質粒子
LPA I:E及びLPA Iに保有された）アポリポタンパク質A
Iに対応し、濃い色の小さいピークは（リポタンパク質
粒子LPA I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポタ
ンパク質A IIに対応する。
実施例２ 6mlの抗A II抗体（力価60）を添加する以外は実施例１
と同様に処理する。実施例１と同じサンプルの泳動後、
実施例１と同じ高さの（リポタンパク質粒子LPA I:E及
びLPA Iに保有された）アポリポタンパク質A Iに対応す
るピークと、実施例１の1/1.5の高さの（リポタンパク
質粒子LPA I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポ
タンパク質A Iに対応するピークとが得られる。
と同様に処理する。実施例１と同じサンプルの泳動後、
実施例１と同じ高さの（リポタンパク質粒子LPA I:E及
びLPA Iに保有された）アポリポタンパク質A Iに対応す
るピークと、実施例１の1/1.5の高さの（リポタンパク
質粒子LPA I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポ
タンパク質A Iに対応するピークとが得られる。
実施例３ 4mlの力価120の抗A II抗体と0.6mlの力価330の抗A I抗
体とを添加する以外は実施例１と同様に処理する。
体とを添加する以外は実施例１と同様に処理する。
泳動後、実施例１と同じサンプルは、（リポタンパク質
粒子LPA I:E及びLPA Iに保有された）アポリポタンパク
質A Iに対応する実施例１の1/1.5の高さのピークと、
（リポタンパク質LPA I:A II及びLPAE:A IIに保有され
た）アポリポタンパク質A IIに対応する実施例１の1/2
の高さのピークとを生じる。
粒子LPA I:E及びLPA Iに保有された）アポリポタンパク
質A Iに対応する実施例１の1/1.5の高さのピークと、
（リポタンパク質LPA I:A II及びLPAE:A IIに保有され
た）アポリポタンパク質A IIに対応する実施例１の1/2
の高さのピークとを生じる。
実施例４ 実施例１と同様に処理する。泳動後、ペルオキシダーゼ
標識した抗A IIモノクローナル抗体溶液を含浸させた
紙でゲルを３時間被覆する。
標識した抗A IIモノクローナル抗体溶液を含浸させた
紙でゲルを３時間被覆する。
生理食塩水で１晩洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を発現
させる。（リポタンパク質粒子LPA I:A II及びLPE:A II
に保有された）アポリポタンパク質A IIに対応する唯１
つの小さい着色ピークが生じる。
させる。（リポタンパク質粒子LPA I:A II及びLPE:A II
に保有された）アポリポタンパク質A IIに対応する唯１
つの小さい着色ピークが生じる。
実施例25 ペルオキシダーゼ標識した抗A Iモノクローナル抗体を
含浸させた紙を使用し実施例３と同様に処理する。こ
の場合、ペルオキシダーゼ活性の発現によって（リポタ
ンパク質粒子LPA I:E及びLPA Iに保有された）アポリポ
タンパク質A I及び（リポタンパク質粒子LPA I:A II及
びLPE:A IIに保有された）アポリポタンパク質A IIに夫
々対応する２つの着色ピークが生じる。
含浸させた紙を使用し実施例３と同様に処理する。こ
の場合、ペルオキシダーゼ活性の発現によって（リポタ
ンパク質粒子LPA I:E及びLPA Iに保有された）アポリポ
タンパク質A I及び（リポタンパク質粒子LPA I:A II及
びLPE:A IIに保有された）アポリポタンパク質A IIに夫
々対応する２つの着色ピークが生じる。
実施例６ フィルム当たり12mlを流す以外は実施例１と同様に処理
する。ゲルの表面全体に直径3mmの12のウェルを等間隔
で分配する。このようにして、（リポタンパク質LPA I:
E及びLPA Iに保有された）アポリポタンパク質A Iを放
射免疫拡散法で定量するための完成フィルムが得られ
る。
する。ゲルの表面全体に直径3mmの12のウェルを等間隔
で分配する。このようにして、（リポタンパク質LPA I:
E及びLPA Iに保有された）アポリポタンパク質A Iを放
射免疫拡散法で定量するための完成フィルムが得られ
る。
５μのサンプル及び標準を希釈度1/10で導入する。48
時間拡散後、生理食塩水で１晩洗浄し、乾燥し、アミド
ブラックが着色すると、各サンプル毎に２つのリングが
得られる。薄い色の大きいリングは（リポタンパク質粒
子LPA I:E及びLPA Iに保有された（アポリポタンパク質
A Iに対応し、濃い色の小さいリングは（リポタンパク
質粒子LPA I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポ
タンパク質A IIに対応する。
時間拡散後、生理食塩水で１晩洗浄し、乾燥し、アミド
ブラックが着色すると、各サンプル毎に２つのリングが
得られる。薄い色の大きいリングは（リポタンパク質粒
子LPA I:E及びLPA Iに保有された（アポリポタンパク質
A Iに対応し、濃い色の小さいリングは（リポタンパク
質粒子LPA I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポ
タンパク質A IIに対応する。
実施例７ アガロースに1mlの抗Ｅ抗体（力価60）と2.8mlの抗C II
I（力価40）と0.11mlの抗Ｂ抗体（力価2000）とを添加
する以外は実施例１と同様に処理する。このようにし
て、リポタンパク質粒子LPBによって保有されるアポリ
ポタンパク質Ｂの免疫拡散による定量に使用するための
完成フィルムが得られる。
I（力価40）と0.11mlの抗Ｂ抗体（力価2000）とを添加
する以外は実施例１と同様に処理する。このようにし
て、リポタンパク質粒子LPBによって保有されるアポリ
ポタンパク質Ｂの免疫拡散による定量に使用するための
完成フィルムが得られる。
実施例８ 1970年４月１日付けの米国特許第2086541号及び1976年
７月27日付けのフランス特許第7622802号に従って脱水
し再水和したプレートを製造する。
７月27日付けのフランス特許第7622802号に従って脱水
し再水和したプレートを製造する。
50mlの三角フラスコに30mlの脱鉱物水を導入し、磁気撹
拌下に1.8gのＤスルビトールと90mgのSeparan NP10（MC
I＝Marine Clloids Incorporation）と45mgのSeparan M
GL（MCI社）とを添加する。完全溶解後、250mgのアガロ
ースHGTと70mgのアガロースHEEDとを添加する。
拌下に1.8gのＤスルビトールと90mgのSeparan NP10（MC
I＝Marine Clloids Incorporation）と45mgのSeparan M
GL（MCI社）とを添加する。完全溶解後、250mgのアガロ
ースHGTと70mgのアガロースHEEDとを添加する。
完全に溶解するまで溶液を95〜100℃に加熱する。温度
が53℃になると4mlの抗A II抗体（力価60）と0.6mlの抗
A I抗体（力価220）とを添加する。溶液を9ml/フィルム
の割合で分配する。ゲル化後、直径2mmの28のウェルを
カッターで設ける。
が53℃になると4mlの抗A II抗体（力価60）と0.6mlの抗
A I抗体（力価220）とを添加する。溶液を9ml/フィルム
の割合で分配する。ゲル化後、直径2mmの28のウェルを
カッターで設ける。
フィルムを層流空気中に１晩維持する。これにより、
（リポタンパク質粒子LPA I:E及びLPA Iに保有された）
アポリポタンパク質A Iと（リポタンパク質LPA I:A II
及びLPE:A IIに保有された）アポリポタンパク質A IIと
の定量に使用できる再水和可能な乾燥フィルムが得られ
る。
（リポタンパク質粒子LPA I:E及びLPA Iに保有された）
アポリポタンパク質A Iと（リポタンパク質LPA I:A II
及びLPE:A IIに保有された）アポリポタンパク質A IIと
の定量に使用できる再水和可能な乾燥フィルムが得られ
る。
実施例９ 250mgのHGTと70mgのHEEOの代わりに300mgのアガールア
ガールを使用し、塩基性ヘテロポリマーの代わりにMCI
社の市販のSeparan CP35を使用して実施例８と同様に処
理する。12mg/フィルムの割合で溶液を分配する。ゲル
の表面全体に等間隔で配置された直径2.5mmのウェルを1
2個設ける。
ガールを使用し、塩基性ヘテロポリマーの代わりにMCI
社の市販のSeparan CP35を使用して実施例８と同様に処
理する。12mg/フィルムの割合で溶液を分配する。ゲル
の表面全体に等間隔で配置された直径2.5mmのウェルを1
2個設ける。
脱水後、（リポタンパク質粒子LPA I:E及びLPA Iに保有
された）アポリポタンパク質A Iと（リポタンパク質LPA
I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポタンパク
質A IIとの定量に使用できる再水和可能な乾燥フィルム
が得られる。
された）アポリポタンパク質A Iと（リポタンパク質LPA
I:A II及びLPE:A IIに保有された）アポリポタンパク
質A IIとの定量に使用できる再水和可能な乾燥フィルム
が得られる。
第１図から第５図はゲルプレートでの免疫拡散に使用し
たプレートを示し、第６図から第８図は放射状免疫拡散
定量に使用したプレートを示す。
たプレートを示し、第６図から第８図は放射状免疫拡散
定量に使用したプレートを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ギー・バルー フランス国、75016・パリ、ブルバール・ ミユラ・37 (56)参考文献 特開 昭50−116631（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−185161（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−253871（ＪＰ，Ａ) Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．，28（１），Ｐ. 59−62，（1982)
Claims (21)
- 【請求項１】生物媒体の粒子混合物中の２つ以上の別個
のおよび独立した粒子グループの各々を、平板ゲル内で
該粒子グループの分画免疫拡散により同時に定量する方
法において、該粒子グループが： １−粒子の各々が第１の抗原を保有する第１の粒子グル
ープ；及び ２−第１グループの粒子によって保有されない第２の抗
原を粒子の各々が保有しかつ粒子の少なくともいくつか
が第１の抗原を保有する第２の粒子グループよりなり、 粒子混合物を、第１の抗原に作用する第１の抗体及び第
２の抗原に作用する第２の抗体よりなる抗体混合物であ
って、少なくとも粒子混合物中の第１のグループを沈殿
させるのに十分な量の第１の抗体を含有し及び少なくと
も粒子混合物中の第２のグループを沈殿させるのに充分
でかつ第１の抗体の量よりも過剰の量の第２の抗体を含
有する抗体混合物によって処理することからなる該方
法。 - 【請求項２】生物媒体に含まれた３つ以上のリポタンパ
ク質粒子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の
３つ以上のサブユニットを平板ゲル内の分画免疫拡散に
より同時に定量する方法において、前記３つのリポタン
パク質粒子グループは、「共通アポリポタンパク質」を
含み、 −以後第一グループと指称される１つのグループは、全
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し別のアポ
リポタンパク質Xmを任意に保有するリポタンパク質粒子
から成り、第一グループの全部のリポタンパク質粒子が
保有するこの「共通アポリポタンパク質」が第一サプユ
ニットを構成し、 −以後第二グループまたは中間グループと指称される別
のグループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が保有する任意の別
のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質
Ynを少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成
り、少なくとも１つのこのアポリポタンパク質Ynが第二
サブユニットもしくは中間サブユニットを構成するか、
又は、 −一部が、第一サブユニットを構成する前記「共通アポ
リポタンパク質」を保有し更に第一グループのリポタン
パク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質Xm
とは異なるアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ保有
するリポタンパク質粒子から成り、残りのリポタンパク
質粒子は、前記「共通アポリポタンパク質」を保有しな
いが、前記リポタンパク質粒子の一部が保有しており第
一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別の
アポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質Zp
を少なくとも１つ保有しており、この少なくとも１つの
アポリポタンパク質Zpが第二サブユニットもしくは中間
サブユニットを構成し、 −第三グループ即ち最終グループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に第
一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別の
アポリポタンパク質Xm及び第二グループのリポタンパク
質粒子が保有するアポリポタンパク質のいずれとも異な
ったアポリポタンパク質Wqを少なくとも１つ含むリポタ
ンパク粒子から成り、少なくとも１つのこのアポリポタ
ンパク質Wqが第三サブユニット即ち最終サブユニットを
構成するか、又は、 −一部が、前記「共通アポリポタンパク質」を含み更に
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xm及び第二グループのリポタンパ
ク質粒子が保有するアポリポタンパク質のいずれとも異
なったアポリポタンパク質Tlを少なくとも１つ含むリポ
タンパク質粒子から成り、リポタンパク粒子の残りの部
分が、前記「共通アポリポタンパク質」を含まないが、
リポタンパク質粒子の前記一部が保有するアポリポタン
パク質Tlを少なくとも１つ保有しており、少なくとも１
つのこのアポリポタンパク質Tlが第三サブユニット即ち
最終サブユニットを構成し、 方法が、 −定量すべきサブユニットを含む生物媒体を抗体混合物
の存在下に維持し、該抗体混合物が、 −第三サブユニット即ち最終サブユニットを構成する１
つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体を第三グルー
プ即ち最終グループのリポタンパク質粒子を沈降させる
に十分な量で含み、 −第二サブユニットもしくは中間サブユニットを構成す
る１つ以上のアポリポタンパク質に対する抗体を第二グ
ループ即ち中間グループのリポタンパク質粒子を沈降さ
せるのに十分な量で含み、 −サブユニットに「共通」で第一サブユニットを構成す
る共通「アポリポタンパク質」に対する抗体を第一グル
ープのリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で含
み、 −第三グループ即ち最終グループのリポタンパク質粒子
を沈降させるに必要な抗体の量は、第二グループ即ち中
間グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要な
抗体の量に対して過剰であり、第二グループ即ち中間グ
ループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必要な抗体
の量は第一サブユニットを構成する「共通アポリポタン
パク質」を保有するリポタンパク質粒子の沈降に必要な
抗体の量に対して過剰であり、これらの過剰の割合は、
免疫拡散後に３つの明確な境界が生じ、定量すべきサブ
ユニットを含む媒体の拡散開始点に最も近い免疫拡散境
界が、第三グループ即ち最終グループのリポタンパク質
粒子の沈降に対応し、前記開始点から最も遠い免疫拡散
境界が第一グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応
しており、これらの２つの境界の中間の免疫拡散境界が
第二グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応するよ
うな割合であり、 −拡散開始点と３つの免疫拡散境界の各々との間の最大
間隔を測定し、各間隔を３つのサブユニットの既知量の
アポリポタンパク質を含む標準生物媒体で得られる間隔
と比較することを特徴とする定量方法。 - 【請求項３】生物媒体に含まれた少なくとも２つのリポ
タンパク質粒子グループに夫々所属するアポリポタンパ
ク質の少なくとも２つのサブユニットを平板ゲル内の分
画免疫拡散により同時に定量する方法であって、前記２
つのリポタンパク質粒子グループは、「共通アポリポタ
ンパク質」を含み、 −以後第一グループと指称される１つのグループは、全
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し別のアポ
リポタンパク質Xmを任意に保有するリポタンパク質粒子
から成り、第一グループの全部のリポタンパク質粒子が
保有するこの共通アポリポタンパク質が第一サブユニッ
トを構成し、 −以後第二グループと指称される別のグループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループのリポタンパク質粒子が保有する任意の別
のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質
Ynを少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成
り、少なくとも１つのこのアポリポタンパク質Ynが第二
サブユニットを構成するか、又は、 −リポタンパク質粒子の一部が第一サブユニットを構成
する前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に第一
グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別のア
ポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質Zpを
少なくとも１つ保有し、残りのリポタンパク質粒子は、
第一サブユニットを構成する前記「共通アポリポタンパ
ク質」を保有しないが、リポタンパク質粒子の前記一部
が保有しており第一グループのリポタンパク質粒子が任
意に保有する別のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポ
リポタンパク質Zpを少なくとも１つ保有しているような
リポタンパク質粒子から成り、この少なくとも１つのア
ポリポタンパク質Zpが第二サブユニットを構成し、 方法が、 −定量すべき２つのアポリポタンパク質サブユニットを
含む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持し、該抗体混
合物が、 −第二サブユニットを構成する少なくとも１つのアポリ
ポタンパク質（Yn又はZp）に対する抗体を第二グループ
のリポタンパク質粒子を沈降させるに十分な量で含み、 −第一サブユニットを構成する前記「共通アポリポタン
パク質」に対する抗体を第一グループのリポタンパク質
粒子を沈降させるのに十分な量で含み、 −第二グループのリポタンパク質粒子を沈降させるのに
必要な抗体の量は、第一グループのリポタンパク質粒子
を沈降させるに必要な抗体の量に対して過剰であり、 この過剰の割合は次のようになっており、即ち、免疫拡
散後に２つの明確な境界が生じ、定量すべき２つのサブ
ユニットを含む媒体の拡散開始点に近い方の免疫拡散境
界が、第二グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応
し、前記開始点から遠い方の免疫拡散境界が第一グルー
プのリポタンパク質粒子の沈降に対応しており、これら
の２つの境界は夫々、第一サブユニット及び第二サブユ
ニットのアポリポタンパク質を夫々含む２つのリポタン
パク質粒子グループを分離した後に、一方で第一グルー
プのリポタンパク質粒子を前記第一サブユニットを構成
する共通アポリポタンパク質に対する抗体と接触させ、
この抗体の使用量は、第一サブユニットを構成するアポ
リポタンパク質を保有し生物媒体から分離されてない第
一グループのリポタンパク質粒子を沈降させるために前
記で使用した量に等しい量であり、他方で第二グループ
のリポタンパク質粒子を前記第二サブユニットを構成す
るアポリポタンパク質に対する抗体と接触させ、この抗
体の使用量は第二サブユニットを構成するアポリポタン
パク質を保有し生物媒体から分離されてない第二グルー
プのリポタンパク質粒子を沈降させるために前記で使用
した量に等しい量である場合に得られる境界と等しく、 −拡散開始点と２つの免疫拡散境界の各々との間の最大
間隔を測定し、各間隔２つのサブユニットの既知量のア
ポリポタンパク質を含む標準生物媒体で得られる間隔と
比較することを特徴とする定量方法。 - 【請求項４】生物媒体に含まれた２つのリポタンパク質
粒子グループに夫々所属するアポリポタンパク質の２つ
のサブユニットを平板ゲル内の分画免疫拡散により同時
に定量する方法において、前記２つのリポタンパク質粒
子グループが、「共通アポリポタンパク質」を含み、 −以後第一グループと指称される１つのグループは、全
部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し任意に別
のアポリポタンパク質Xmを保有するリポタンパク質粒子
から成り、第一グループの全部のリポタンパク質粒子が
保有するこの共通アポリポタンパク質が第一サブユニッ
トを構成し、 −以後第二グループと指称される別のグループは、 −全部が前記「共通アポリポタンパク質」を保有し更に
第一グループをリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質
Ynを少なくとも１つ保有するリポタンパク質粒子から成
り、１つ以上のこのアポリポタンパク質Ynが第二サブユ
ニットを構成するか、又は、 −リポタンパク質粒子の一部が、第一グループの前記
「共通アポリポタンパク質」と更に第一グループのリポ
タンパク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク
質Xmとは異なるアポリポタンパク質Zpを少なくとも１つ
保有し、リポタンパク質粒子の残りの部分が、第一サブ
ユニットを構成する前記「共通アポリポタンパク質」を
保有しないが、前記リポタンパク質粒子の一部が保有し
第一グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別
のアポリポタンパク質Xmとは異なるアポリポタンパク質
Zpを少なくとも１つ保有しているようなリポタンパク質
粒子から成り、この少なくとも１つのアポリポタンパク
質Zpが第二サブユニットを構成しており、 方法が、 −定量すべき２つのアポリポタンパク質サブユニットを
含む生物媒体を抗体混合物の存在下に維持し、該抗体混
合物が、 −第二サブユニットの１つ以上のアポリポタンパク質
（Yn又はZp）に対する抗体を第二グループのリポタンパ
ク質粒子を沈降させるのに十分な量で含み、 −２つのサブユニットに「共通のアポリポタンパク質」
に対する抗体を第一グループのリポタンパク質粒子を沈
降させるに十分な量で含み、 −第二グループのリポタンパク質粒子を沈降させるに必
要な抗体の量は、第一グループのリポタンパク質粒子を
沈降させるに必要な抗体の量に対して過剰であり、この
過剰の割合は以下のようになっており、即ち、免疫拡散
後に２つの明確な境界が生じ、定量すべき２つのサブユ
ニットを含む媒体の拡散開始点に近い方の免疫拡散境界
が、第二グループのリポタンパク質粒子の沈降に対応
し、前記開始点から遠い方の免疫拡散境界が、第一グル
ープのリポタンパク質粒子の沈降に対応し、これらの２
つの境界は夫々、第一サブユニット及び第二サブユニッ
トのアポリポタンパク質を夫々含む２つリポタンパク質
粒子グループを分離した後に、一方で第一グループのリ
ポタンパク質粒子を第一グループの共通アポリポタンパ
ク質に対する抗体と接触させ、この抗体が第一サブユニ
ットのアポリポタンパク質を保有し生物媒体から分離さ
れてないリポタンパク質粒子を沈降させるために前記で
使用した量と等しい量で使用され、他方で第二グループ
のリポタンパク質粒子を、第一サブユニットのアポリポ
タンパク質粒子と異なり、かつ第一グループのリポタン
パク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質と
も異なる、第二サブユニットの１つ以上のアポリポタン
パク質に対する抗体と接触させ、この抗体が第二サブユ
ニットのアポリポタンパク質を保有し生物媒体から分離
されてないリポタンパク質粒子を沈降させるために前記
で使用した量と等しい量で使用された場合に得られる境
界と等しく、 −拡散開始点と２つの免疫拡散境界の各々と間の最大間
隔を測定し、各間隔を２つのサブユニットの既知量のア
ポリポタンパク質を含む標準生物媒体で得られる間隔と
比較することを特徴とする定量方法。 - 【請求項５】第一サブユニットのアポリポタンパク質が
第一グループを構成する等しい遊離リポタンパク質粒子
に所属することを特徴とする請求項４記載の定量方法。 - 【請求項６】第一グループは、一方では第一サブユニッ
トを構成する共通アポリポタンパク質を保有する互いに
等しい遊離リポタンパク質粒子から成り、他方では前記
共通アポリポタンパク質に加えて、前記共通アポリポタ
ンパク質及び第二サブユニットを構成するアポリポタン
パク質のいずれとも異なるアポリポタンパク質を少なく
とも１つ含む複合リポタンパク質粒子から成ることを特
徴とする請求項４記載の定量方法。 - 【請求項７】第二サブユニットは、第一サブユニットを
構成する共通アポリポタンパク及び第一グループのリポ
タンパク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク
質のいずれとも異なるアポリポタンパク質から成り、第
二サブユニットを構成するこのアポリポタンパク質は更
に全部が、第一サブユニットを構成する前記アポリポタ
ンパク質を含む複合リポタンパク質粒子に保有されてい
ることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の
定量方法。 - 【請求項８】第二サブユニットは、第一サブユニットを
構成するアポリポタンパク質及び第一グループのリポタ
ンパク質粒子が任意に保有する別のアポリポタンパク質
のいずれとも異なるアポリポタンパク質の少なくとも１
つから成り、第二サブユニットのこのアポリポタンパク
質は、一方で第一サブユニットを構成するアポリポタン
パク質を更に含む複合リポタンパク質粒子によって保有
され、他方で第一サブユニットを構成するアポリポタン
パク質を保有しない単純又は複合リポタンパク質粒子に
保有されることを特徴とする請求項４から６のいずれか
に記載の定量方法。 - 【請求項９】分画免疫拡散が、Laurellの方法による電
気免疫拡散であり、２つのピークが得られることを特徴
とする請求項１から８のいずれかに記載の定量方法。 - 【請求項１０】Manciniの方法による放射状免疫拡散を
用い２つのリングが得られることを特徴とする請求項１
から８のいずれかに記載の定量方法。 - 【請求項１１】第二サブユニットの１つ以上のアポリポ
タンパク質に対する抗体の最小使用量は、２つの明確な
免疫拡散境界の出現によって決定され、この量は好まし
くは、２つの明確な免疫拡散境界の出現によって決定さ
れた最小値と第二サブユニットのアポリポタンパク質を
保有するリポタンパク質粒子の拡散が停止し生物媒体の
拡散開始点で沈降することによって決定された最大値と
の間の範囲であり、第二サブユニットの１つ以上のアポ
リポタンパク質に対する抗体の量が前記最小値より大き
いとき、第一サブユニットのアポリポタンパク質を保有
するリポタンパク質粒子の沈降に対応する免疫拡散境界
は変化しないことを特徴とする請求項４から10のいずれ
かに記載の定量方法。 - 【請求項１２】第二サブユニットの１つ以上のアポリポ
タンパク質に対する抗体の量は、拡散開始点と第二サブ
ユニットのアポリポタンパク質を含有するリポタンパク
質粒子の沈降に対応する免疫拡散境界との間の最大間隔
が、開始点と第一サブユニットのアポリポタンパク質を
含有するリポタンパク質粒子の沈降に対応する免疫拡散
境界との間の最大間隔の約1/2〜約1/8、好ましくは約1/
3〜約1/4になるように選択されることを特徴とする請求
項４から11のいずれかに記載の定量方法。 - 【請求項１３】標準が、第一サブユニットが２つのグル
ープに共通の既知量（Ａ）のアポリポタンパク質を含有
し、第二サブユニットが２つのグループに共通のアポリ
ポタンパク質及び第一グループのリポタンパク質粒子が
任意に保有する別のアポリポタンパク質のいずれとも異
なる１つ以上の別々のアポリポタンパク質を既知量
（Ｂ）ｉで含有する媒体から作成され、 −プレート上で第二サブユニットのアポリポタンパク質
の各々に対する抗体を第二グループのリポタンパク質粒
子を沈降させるに必要な量で使用し、前記各抗体の量は
夫々、第一グループのリポタンパク質粒子を沈降させる
に必要な抗体に対して過剰であり、第一サブユニットの
アポリポタンパク質に対する抗体に比較した第二サブユ
ニットのアポリポタンパク質に対する抗体の過剰は式 ［式中、V1、T1は夫々、第一サブユニットのアポリポタ
ンパク質に対する抗体の容量及び力価を示し、V2i、T2i
は夫々、第二サブユニットのアポリポタンパク質の各々
に対する抗体の容量及び力価を示す］ で示されることを特徴とする請求項４から12のいずれか
に記載の定量方法。 - 【請求項１４】−２つのグループに共通の第一サブユニ
ットのアポリポタンパク質を保有するリポタンパク質粒
子を沈降させる抗体の量V1をピーク高さH1が得られるよ
うに決定するために、プレート上で第一グループのリポ
タンパク質粒子の沈降に対応して高さh1を与えるような
抗体量v1を使用し、量V1を式 ［ｘ％は、媒体中に含まれる２つのグループに共通のア
ポリポタンパク質の総量に対する第一サブユニット中に
含まれる該アポリポタンパク質の割合を示す］によって
算出し、 次に、 −２つのグループに共通のアポリポタンパク質及び第一
グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別のア
ポリポタンパク質のいずれとも異なる第二サブユニット
の１つ以上のアポリポタンパク質を保有するリポタンパ
ク質粒子を沈降させる抗体の量V2をピーク高さH2が得ら
れるように決定するために、プレート上で第二グループ
のリポタンパク質粒子の沈降に対応して高さh2を与える
ような抗体量v2を使用して、量V2を式 によって算出することを特徴とする請求項４から13のい
ずれかに記載の定量方法。 - 【請求項１５】−２つのグループに共通の第一サブユニ
ットのアポリポタンパク質を保有するリポタンパク質粒
子を沈降させる抗体の量V1をリング直径D1が得られるよ
うに決定するために、プレート上で第一グループのリポ
タンパク質粒子の沈降に対応して直径d1を与えるような
抗体量v1を使用して、量V1を式 ［ｘ％は、媒体中に含まれる２つのグループに共通のア
ポリポタンパク質の総量に対する第一サブユニット中に
含まれる該アポリポタンパク質の割合を示す］によって
算出し 次に、 −２つのグループに共通のアポリポタンパク質及び第一
グループのリポタンパク質粒子が任意に保有する別のア
ポリポタンパク質のいずれとも異なる第二サブユニット
の１つ以上のアポリポタンパク質を保有するリポタンパ
ク質粒子を沈降させる抗体の量V2をリング直径D2が得ら
れるように決定するために、プレート上で第二サブユニ
ットのアポリポタンパク質の沈降に対応して直径d2を与
えるような抗体量v2を使用して、量V2を式 によって算出することを特徴とする請求項４から13のい
ずれかに記載の定量方法。 - 【請求項１６】第一サブユニットは、第一グループを構
成するリポタンパク質粒子LPA I及びLPA I:Eが保有する
アポリポタンパク質A Iから成り、第二サブユニット
は、第二グループを構成するリポタンパク質粒子LPA I:
A II及びLPE:A IIが保有するアポリポタンパク質A IIか
ら成り、定量すべき２つのサブユニット含む媒体を、ア
ポリポタンパク質A IIに対する抗体（抗A II抗体）及び
アポリポタンパク質A Iに対する抗体（抗A I抗体）の混
合物の存在下に維持し、アポリポタンパク質A IIに対す
る抗体がアポリポタンパク質A Iに対する抗体に比較し
て過剰であり、この過剰は特に、プレート上の抗A II抗
体の容量と抗A II抗体の力価との積が、プレート上の抗
A I抗体の容量と抗A I抗体の力価との積よりも大きいこ
とに対応することを特徴とする請求項４から15のいずれ
かに記載の定量方法。 - 【請求項１７】第一サブユニットは、第一グループを構
成するリポタンパク質粒子LPBが保有するアポリポタン
パク質Ｂから成り、第二サブユニットは、第二グループ
を構成するリポタンパク質粒子LPB:E、LPB:C III、LPE:
C I:C II:C III:B、LPA I:E及びLPE:A IIが保有する２
つのアポリポタンパク質Ｅ及びC IIIから成り、定量す
べき２つのサブユニットを含む媒体を、アポリポタンパ
ク質Ｅに対する抗体（抗Ｅ抗体）及びアポリポタンパク
質C IIIに対する抗体（抗C III抗体）及びアポリポタン
パク質Ｂに対する抗体（抗Ｂ抗体）の混合物の存在下に
維持し、アポリポタンパク質Ｅに対する抗体がアポリポ
タンパク質Ｂに対する抗体より過剰であり、アポリポタ
ンパク質C IIIに対する抗体がアポリポタンパク質Ｂに
対する抗体より過剰であり、抗Ｂ抗体に対する抗C III
抗体の過剰は、抗C III抗体の容量と抗C III抗体の力価
との積が、抗Ｂ抗体の容量と抗Ｂ抗体の力価との積の1/
6よりも大きく、抗Ｂ抗体に対する抗Ｅ抗体の過剰は、
抗Ｅ抗体の容量と抗Ｅ抗体の力価との積が、抗Ｂ抗体の
容量と抗Ｂ抗体の力価との積の1/12よりも大きいことに
よって示されることを特徴とする請求項４から15のいず
れかに記載の定量方法。 - 【請求項１８】リポタンパク質粒子の３つのグループに
夫々所属するアポリポタンパク質の３つのサブユニット
を定量する方法において、第一サブユニットは、第一グ
ループを構成するリポタンパク質粒子LPBに所属するア
ポリポタンパク質Ｂから成り、第二サブユニットは、第
二グループを構成するリポタンパク質粒子LPB:Eに所属
するアポリポタンパク質Ｅから成り、第三サブユニット
は、第三グループを構成するリポタンパク質粒子LPE:C
I:C II:C III:B、LPB:C III、LPE:A II、LPA I:E、LPA
I及びLPA I:A IIに所属するアポリポタンパク質A I、A
II及びC IIIから構成され、定量すべき３つのサブユニ
ットを含有する媒体を、アポリポタンパク質C IIIに対
する抗体（抗C III抗体）とアポリポタンパク質A IIに
対する抗体（抗A II抗体）とアポリポタンパク質A Iに
対する抗体（抗A I抗体）とアポリポタンパク質Ｅに対
する抗体（抗Ｅ抗体）とアポリポタンパク質Ｂに対する
抗体（抗Ｂ抗体）との混合物の存在下に維持し、抗C II
I抗体、抗A II抗体及び抗A I抗体は夫々抗Ｅ抗体及び抗
Ｂ抗体に対して過剰であり、抗Ｅ抗体は抗Ｂ抗体に対し
て過剰であることを特徴とする請求項２記載の定量方
法。 - 【請求項１９】疾患、特に健康なヒト又は動物の生理状
態に概ね対応する上限値と下限値との間の範囲から逸脱
したアポリポタンパク質の濃度に関連した疾患のアポリ
ポタンパク質濃度をin vitro測定するための請求項１〜
18のいずれかに記載の定量方法。 - 【請求項２０】定量すべきアポリポタンパク質を保有す
リポタンパク質粒子に夫々対応する抗体を該抗体の沈降
が得られる範囲に含む抗体混合物を含むことを特徴とす
る請求項２から19のいずれかに記載の定量方法に使用さ
れる特にプレート又はフィルムの形態の既製のゲル被覆
支持体。 - 【請求項２１】請求項20に記載の特にプレート又はフィ
ルムの形態のゲル被覆支持体と、所定の希釈度、好まし
くは所定の複数希釈度、より好ましくは３倍希釈又は４
倍希釈の少なくとも１つの標準溶液とを含むことを特徴
とするアッセイキット。
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|---|---|---|---|
| FR8703259 | 1987-03-10 | ||
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JPS60253871A (ja) * | 1984-05-30 | 1985-12-14 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | 抗アポａ−１抗体 |
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1992
- 1992-07-30 GR GR920401552T patent/GR3005318T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．，２８（１），Ｐ．５９−６２，（１９８２） |
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