JPH0745520B2

JPH0745520B2 - モノクローナル抗体およびその使用法

Info

Publication number: JPH0745520B2
Application number: JP1188172A
Authority: JP
Inventors: 忠宏梶田; 陽介太田; 康之林
Original assignee: 国際試薬株式会社
Priority date: 1988-08-31
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1995-05-17
Anticipated expiration: 2010-05-17
Also published as: JPH02150294A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、主に臨床検査の分野で利用することを目的と
した抗人膵リパーゼ酵素活性阻害モノクローナル抗体、
さらにその使用法に関する。

〔従来技術〕

膵リパーゼ（E.C.3.1.1.3）は主として膵臓に存在する
酵素であり、膵管の狭窄、閉塞や膵臓組織の炎症等の膵
疾患で血液中に逸脱し、その値が上昇する。特に、急性
膵炎においてその上昇が著しく、血液中の膵リパーゼを
定量測定することは、臨床上膵炎の診断に有用とされて
いる。

従来リパーゼは酵素化学的に測定され、その方法として
１）アルカリ滴定法、２）Copper−Soap法、３）比濁
法、４）Lipoxygenase法により測定され、その基質とし
てグリセロールやオリーブ油の様な高級脂肪酸が用いら
れる。

また、これら高級脂肪酸に代わってnaphthol esterやtr
ybutyrine等の反応性の高い基質を用いた測定法が開発
されている。

一方、免疫学的な測定も開発がすすめられた。これはポ
リクローナル抗体である抗人膵リパーゼ抗血清を用いた
もので、酵素免疫測定法（Enzymelinked immunosorbent
assay:ELISA）法として知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、リパーゼを酵素化学的に測定するアルカリ滴定
法、Copper−Soap法、比濁法およびLipoxygenase法にお
いては、その基質が疎水性であるため、その基質をemul
sionの状態にする必要性があり、またcolipaseがリパー
ゼの活性発現に大きく影響することが知られている。

その基質としてオリーブ油等の高級脂肪酸を用いた場
合、反応生成物の定量が難しく、低レベルの活性測定に
は長時間を必要とするのみならず、操作が煩雑であるう
えに低値での測定感度が低く、測定上の再現性にも大き
な問題を生じている。

また、naphtol esterやtrybutyrine等の基質を用いた場
合反応性が高い反面、リパーゼ以外のエステラーゼによ
っても加水分解を受けることから真のリパーゼの活性を
示さないことがあると言われている。

一方、抗人膵リパーゼ抗血清を用いたELISA法は、抗原
・抗体反応による高い特異性が期待されたが、ここで用
いている抗血清は、動物を免疫して調製しているためロ
ット差が大きく、品質の一定した抗血清を調製すること
が難しく、抗血清を用いたELISA法においても常に再現
性のよい試薬を提供するには至っていない。

ところが、1975年にKohlerとMilsteinは、細胞融合法に
よるモノクローナル抗体の調製方法を報告して以来、均
一でロット差が無く、ポリクローナル抗体よりも更に特
異性の高い抗体を半永久的に、しかも大量に調製するこ
とができるようになり、リパーゼ測定系においてもこの
ようなモノクローナル抗体の出現が期待されている。

従って、本発明の目的は、リパーゼを感度良く、簡易
に、迅速に測定することができる測定法に適用しうる抗
体を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は本発明、即ち（１）人膵リパーゼと特異的に反応し、人膵リパーゼの
酵素活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体（以
下、「抗人膵リパーゼ酵素活性阻害モノクローナル抗
体」ともいう）。

（２）上記（１）のモノクローナル抗体を使用すること
による人膵リパーゼの測定法。

（３）上記（１）のモノクローナル抗体を使用すること
による膵臓組織の特異染色の方法。

によって解決される。

本発明の抗人膵リパーゼ酵素活性阻害モノクローナル抗
体は、従来知られていない新規なモノクローナル抗体で
ある。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造されたハイブリドーマから製造される。即ち、
抗体産生細胞と骨髄細胞との間に、融合ハイブリドーマ
を形成させ、当該ハイブリドーマをクーロン化し、上記
特定抗原に対して特異性を示す抗体を生産するクーロン
を選択することによって製造される。その操作は、免疫
原としてヒト膵液由来のリパーゼを使用する以外は、従
来既知の手段を使用すればよい。

免疫原は、たとえば完全フロインドアジュバントと混和
後、動物の免疫用として使用される。動物としては、た
とえばマウス、ラット、ウサギ等が例示される。免疫は
動物の皮下、筋肉内、腹腔内に約５〜200μg/回を注射
することによって行われる。初回免疫から約１〜２週間
毎に１〜４度免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終
免疫を行う。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から
抗体産生細胞を分取する。抗体産生細胞としては、脾細
胞、リンパ節細胞等があげられる。

骨髄細胞としては、たとえばマウス、ラット、ヒト由来
のものが使用される。たとえばマウスミエローマP3・X6
3・Ag8・P3・X63・Ag8−U1,P3・NS1−Ag4,SP2/0−Ag14,
X63−Ag8・653等が例示される。抗体産生細胞と骨髄細
胞とは同種動物由来であることが好ましい。

細胞融合は、たとえばネーチャー、第266巻、550頁（19
77）に記載の方法またはこれに準じる方法によって行わ
れる。この際、30〜50％ポリエチレングリコール（平均
分子量1,000〜4,000）を用いて30〜40℃の温度下、約１
〜３分間程度反応させることによって行われる。

細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付され
る。即ち、当該細胞を、たとえばマイクロプレート中で
培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価
を、たとえば酵素抗体法等によって測定し、適切な抗体
を産生しているウェルを得る。このようなウェルから、
更にたとえば限界希釈法によってクローニングを行って
クローンを得る。次いで得られたクローンを人膵リパー
ゼに対する酵素活性阻害試験に付すことにより、人膵リ
パーゼと特異的に反応し、人膵リパーゼを特異的に阻害
するモノクローナル抗体を産生するクローン、および人
膵リパーゼと特異的に反応するが、リパーゼの酵素活性
を全く阻害しないモノクローナル抗体（以下、「抗人膵
リパーゼモノクローナル抗体」ともいう）を産生するク
ローンがそれぞれ得られる。本発明のモノクローナル抗
体は、当該ハイブリドーマ細胞クローンを通常の培養方
法、高密度培養培養方法あるいはスピンナーフラスコ培
養方法等の培養上清よりプロテインＡ結合担体あるいは
抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより精製することにより得ら
れる。

また、培養したハイブリドーマ細胞を、予めプレステン
処理した同系マウス腹腔に注射することにより腹水とし
て得られ、これを硫安塩析した後DEAEイオン交換クロマ
トグラフィーによりIgG画分として精製し調製すること
ができる。

本発明のモノクローナル抗体を用いて、臨床検査の分野
で有用な膵リパーゼの測定や膵臓組織の特異染色を行う
ことができる。

本発明のモノクローナル抗体を用いるヒト膵リパーゼの
測定は、通常次のようにして行われる。

即ち、当該測定にはワンステップ法とツーステップ法が
あり、ワンステップアッセイでは抗体をウェル等に固定
化した固相と検体および酵素標識抗体とを同時に反応さ
せ、一定時間後反応しなかった標識抗体を洗浄により除
去し、固相の酵素活性を測定するものである。またツー
ステップアッセイでは上記の反応においてまず抗体固定
化物と検体を反応させ、一定時間後に未反応の検体中の
抗原を洗浄により除去し、次に酵素標識抗体を反応さ
せ、一定時間後に洗浄により未反応の標識抗体を除去
し、固相の酵素活性を測定するものである。

より具体的には次の通りである。

抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体のウェル等の固
相への固定化法は本発明の目的を達成しうる限り特に制
限されるものではないが、たとえば溶媒（例えばアジ化
ナトリウムを含むリン酸緩衝液）に本発明のモノクロー
ナル抗体を溶解し、これをマイクロプレートのウェル中
に注加し、感作させる。およそ２〜48時間で感作され
る。感作した後、適当な緩衝液などでウェルを洗浄し、
さらに、ブロッキングしておくことが好ましい。

ウェル中のモノクローナル抗体と試料中の抗原との反応
は該反応が容易に進行する状態（たとえば、温度20〜40
℃、湿度70〜100％の湿潤箱内）で反応が完結するまで
約30分〜２時間反応させる。反応終了後、ウェル中の未
反応物を除去するか、除去することなく２次抗体を加
え、反応が容易に進行する状態（たとえば温度20〜40
℃、湿度70〜100％の湿潤箱内）で反応が完結するまで
約10分〜２時間反応させる。反応残査を除去し、さらに
リン酸緩衝液、蒸留水等でウェルを洗浄する。

２次抗体、例えば抗リパーゼモノクローナル抗体−酵素
標識抗体は通常の方法、即ちグルタンアルデヒド架橋
法、過ヨーソ酸架橋法、マレイミド架橋法などの方法に
て作製することができる。

抗体に結合させる標識酵素としては、パーオキシター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼな
どが例示される。

次いで、反応に関与した２次抗体を測定する。

測定方法としては２次抗体に結合させた標識に応じた自
体既知の方法が採用される。たとえば標識としてパーオ
キシダーゼを結合させた場合、ｏ−フェニレンジアミン
と過酸化水素とを作用させて発色させ、主波長492nm、
副波長690nmの波長にて吸光度を測定することができ
る。

また、本発明のモノクローナル抗体を用いて、膵臓組織
を特異的に染色することができる。当該染色は、通常酵
素抗体法によって行われる。

酵素抗体法は、組織、細胞中にある抗原物質の局在を、
それに対応する特異抗体を作製し、さらにその抗体に酵
素組織化学で局在観察が可能な酵素を標識（ラベル）
し、この酵素標識特異抗体を組織、細胞内の抗原に作用
させ、その局在を特異抗体に標識されている酵素を染色
することにより観察するものである。この観察法の実施
にあたり、事実上、直接法と間接法の２つがある。

（１）直接法：ある組織、細胞中の抗原物質に対する特
異抗体（通常IgGを精製しこれを用いる）を作製し、こ
れに西洋ワサビ由来パーオキダーゼ（POD）やアルカリ
ホスファターゼ等の様な酵素を標識した標識抗体を、直
接抗原を含む組織切片あるいは細胞の上に作用させるも
のである。この抗原抗体反応終了後、標識された酵素
を、酵素組織化学的に染色することにより、抗原の局在
は、光学顕微鏡下で観察できるようになる。標識酵素に
POD酵素を用いた場合、その染色に３−アミノ−９−エ
チルカルバゾール（AEC）や3,3′−ジアミノベンチジン
（DAB）等の基質を過酸化水素存在下に加え、呈色反応
により抗原を検出することができる。

本発明においては、上記抗原物質に対する特異抗体とし
て、本発明のモノクローナル抗体が使用される。

（２）間接法：間接法では観察目的の抗原に対応する特
異抗体、即ち第一抗体には酵素の標識を行わず、第一抗
体に対する第二抗体に標識を行うことを特徴としてい
る。

つまり、組織、細胞中の抗原に対する特異抗体を一次抗
体として反応させ、次に一次抗体に対するPOD標識抗体
を二次抗体として反応させる。さらに、結合したPODに
基質AECを過酸化水素存在下に加えて呈色反応より抗原
を検出することができる。

本発明においては、上記抗原物質に対する特異抗体およ
び／または標識抗体として、本発明のモノクローナル抗
体が使用される。

〔実施例〕

実施例１マウス近交系BALB/c系マウス雌５週令を入手し、動物飼育チェ
ンバー内（23＋１℃、湿度70％）で、標準ペレットを使
用して飼育し、給水は任意に行った。

免疫原人膵液由来の精製リパーゼを使用した。人膵リパーゼ
は、ダルベッコPBSで1mg/mlとなるように調製し、100μ
ｇずつ試験管に分注し、使用するまで−80℃で凍結保存
した。

免疫方法免疫リパーゼ100μg/0.5mlと同量のFreund′s complete
adjuvantを混合し、乳化状にした抗原20μｇを５匹の
５週令雌のBALB/cマウスの腹腔および背中の皮下十数カ
所に２週間毎に２ヶ月間投与した。２ヶ月間の免疫の
後、抗体価を測定し、抗体価の高いマウスを選んでさら
に１週間毎に50μｇ、100μｇ、200μｇを腹腔内投与し
追加投与を行った。

また、別の２匹のマウスには同様に２ヶ月の免疫の後１
ヶ月あけて100μｇを腹腔内に投与し、さらに１週間後1
00μｇを静脈注射し追加免疫を行った。上記免疫スケジ
ュールについては、表１に示した。

細胞融合最終免疫から３日後にBALB/cマウスの摘脾を行い、EMEM
培養液中で脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、脾細胞
をEMEM培養液で４回洗浄した後、細胞数を算定した。

細胞融合は、２−amino−６−oxy−8azapuraine（８−A
zaguanine）耐性のBALB/cマウス骨髄腫由来培養細胞株
（P3−X63−Ag8・653以後X63細胞と略す）を親細胞株と
して用いた。

X63細胞は、非働化したfetal calf serum（FCS）５％を
含むRPMI−1640培養液（20μg/ml、８−azaguanine含
有）で継代培養し、対数増殖期のX63細胞を用いRPMI−1
640培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定した。

細胞融合は、ポリエチレングリコール−4000をRPM1−16
40培養液で50（w/v）％濃度となるように溶解して使用
した。

脾細胞とX63細胞の比が10:1となるように混合し、1500r
pm、５分間遠心後、上清を除去し、細胞のペレットをよ
く解し、ポリエチレングリコールを用いて、KohlerとMi
lsteinの方法に準じて細胞融合を行った。その後、脾細
胞が3.5×10⁶個/mlとなるように、HAT選択培地（10％FC
Sを添加したRPMI−1640培養液に１×10^-4M hypoxanthin
e、４×10^-7M aminopterinおよび1.6×10^-5M thymidine
を含有）に浮遊した。ついで、細胞浮遊液の100μｌず
つを96穴マイクロテストプレートの各穴に分注した後、
炭酸ガスインキュベータ（37℃、湿度95％、８％炭酸ガ
ス）で培養を行った。培養開始後、１日目と２日目にHA
T培地を各穴に１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日
目にHAT培地を各穴に２滴ずつ添加してさらに培養を行
った。

スクリーニング培養開始後、10日目より細胞のクローンが出現し、抗体
産生の有無を確認するため、ハイブリドーマの培養上清
を用いて、膵リパーゼの吸収試験を行った。

すなわち、ハイブリドーマの培養上清と膵リパーゼ抗原
液（300ng/ml）とを50μｌずつＵボトムノマイクロタイ
タープレートに入れ、さらに抗マウスイムノグロブリン
抗体を結合させたsepharose4Bの20％懸濁液を50μｌを
加え室温で１時間撹拌した後10分間静置する。次に抗マ
ウスイムノグロブリン抗体結合sepharose4Bがウェルの
底に完全に沈むのを確認した後、この上清を20μｌとり
この上清中に残存する膵リパーゼの濃度を膵リパーゼEL
ISA系で測定した。

このとき、ハイブリドーマの培養上清中に人膵リパーゼ
に対する抗人膵リパーゼモノクローナル抗体が存在する
場合には、膵リパーゼと抗人膵リパーゼモノクローナル
抗体とが反応し、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体
結合sepharose4Bとが抗原抗体複合体を介して沈降し、
上清中に残存する膵リパーゼの濃度が減少し、抗人膵リ
パーゼモノクローナル抗体の存在が証明されるわけであ
る。

こうして、膵リパーゼに対して特異的に反応する抗人膵
リパーゼモノクローナル抗体がスクリーニングされたな
らば、次に膵リパーゼの酵素活性を阻害するかどうかの
試験を行った。

つまり、一定の酵素活性を有する膵リパーゼ溶液と培養
上清を等量ずつ混合し、37℃で１時間反応させた後、残
存する酵素活性をリパーゼ酵素活性測定用試薬で測定し
た。

合計２回の細胞融合の結果を表２に示した。また表３に
は、膵リパーゼの吸収試験及び膵リパーゼ酵素活性阻害
試験の結果を示した。

すなわち膵リパーゼ吸収試験で、膵リパーゼと反応する
クローンが115株得られた。このうち膵リパーゼの酵素
活性を強く阻害するクローンが10株、中程度に阻害する
クローンが13株、また、弱く阻害するクローンが12株得
られた。その他のクローンでは、リパーゼの酵素活性阻
害は全く認められなかった。

これらのクローンのうち、膵リパーゼの酵素活性を強く
阻害するクローンを９株、中程度の阻害を認めるクロー
ンを６株、膵リパーゼとは強く反応するがこの酵素活性
をまったく阻害しないクローンを10株選択し、限界希釈
法によるクローニングを96穴マイクロテストプレートを
用いて３回行った。各クローニング毎にFeeder cellと
して、BALB/cマウスより調製した胸線細胞をHT培地に浮
遊して１穴あたり１×10⁶個となるように加えた。

最終的に、膵リパーゼの酵素活性を強く阻害するクロー
ンが７株、中程度の阻害を認めるクローンが５株、膵リ
パーゼと反応するがこの酵素活性をまったく阻害しない
クローンが７株樹立することができ、その結果を表４に
示した。

マウスイムノグロブリンサブクラスの同定得られたハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル
抗体のイムノグロブリンサブクラスを決定するため、ハ
イブリドーマ細胞の培養上清を濃縮し、ウサギ由来の抗
マウスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、κ鎖およ
びλ鎖抗血清を用いてOuchterlonyの寒天内二重拡散法
で行った。

その結果、各クローンのマウスイムノグロブリンサブク
ラスは、Ｈ鎖については、Ｌ−567Mが抗マウスIgG2a抗
血清とのみ反応した以外すべて抗マウスIgG1抗血清との
み反応した。また、Ｌ鎖については、全てのクローンに
おいて抗マウスκ鎖抗血清とのみ反応した（表４参
照）。

腹水の採取高濃度のモノクローナル抗体を得るため各クローンのハ
イブリドーマ細胞をEMEM培養液で３回洗浄した後、あら
かじめ2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン（pristan
e）を７日前と４日前に0.5mlずつ腹腔内投与したBALB/c
マウスの腹腔へ注射した。ハイブリドーマ細胞を腹腔内
投与してから、７〜14日後に腹水を得た。

培養上清及び腹水中のモノクローナル抗体濃度の測定各クローンの培養上清および腹水中に含まれるモノクロ
ーナル抗体の濃度を検定するため、マウスIgG測定用ELI
SA系により測定し、その結果を表４に示した。

各クローンの培養上清中のモノクローナル抗体のIgG濃
度は、1.6〜20μg/mlの範囲であり、平均５μg/mlの濃
度であった。また、それらクローンの腹水中に含まれる
モノクローナル抗体の濃度は1.1〜5.3mg/mlの範囲であ
り、平均IgG濃度は3.7mg/mlであった。

実施例２リパーゼ測定用ELISA系の検討 1.抗リパーゼモノクローナル抗体−POD標識抗体の調製上記、実施例１に示した如くリパーゼ測定用ELISA法へ
の応用検討のためＬ−448クローンの腹水を硫酸ナトリ
ウム（20％w/v）で塩析し、DEAEイオン交換クロマトグ
ラフィーにより抗リパーゼモノクローナル抗体IgG画分
を精製した。次に、このIgG画分を約10mg/mlに濃縮し、
0.2MのNaC1を含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.3）
で透析し、ペプシン消化によってF(ab′)₂フラグメント
を得た。このF(ab′)₂フラグメントを用いてマレイミド
法により抗人膵リパーゼFab′−POD標識抗体を調製した
（以下、抗リパーゼ−POD標識抗体と略す）。

2.抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体プレートの調
製また、固相用のモノクローナル抗体として、クローンＬ
−695I腹水より同様にIgG画分を精製し、0.1％のアジ化
ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.5を用いて50μg
/mlの濃度に調製した。

次に、この溶液をELISA用96穴マイクロタイタープレー
トの各穴に100μｌずつ分注し、４℃で一晩感作した後T
ween20を0.05％含むリン酸生理緩衝液（以下洗浄液と略
す）で３回洗浄した。さらに、１％BSAを含むリン酸緩
衝液pH7.0を各穴に分注し４℃でさらに一晩ブロッキン
グし抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体プレート
（以下抗リパーゼ抗体プレートと略す）を調製した。

3.リパーゼ測定用ELISA系の検討上記のごとく調製した抗リパーゼ抗体プレートのブロッ
キング液を捨て、１％BSAを含むリン酸緩衝液200μｌを
各穴に分注した後、リパーゼをそれぞれ3.125、6.25、1
2.5、25、50、100および200ng/mlに調製した標準抗原液
をそれぞれの穴に20μｌずつ加え混和し室温で１時間反
応させた後、各穴を洗浄液で３回洗浄した。さらに、至
適濃度に調製した抗リパーゼ−POD標識抗体を100μｌず
つ添加し、室温で30分間反応させた後、洗浄液で各穴を
３回洗浄した。次に、OPD基質液（0.1Mリン酸クエン酸
緩衝液にｏ−フェニレンジアミン2mg/ml及び4mMH₂O₂を
含む）を100μｌ加え３分間反応させた後、2N H₂SO₄を
各穴に１μｌずつ加えて反応を止め、主波長492nm副波
長690nmとしてELISA用プレートリーダーにて吸光度を測
定した。

その結果、得られた膵リパーゼ検量線を第１図に示し
た。リパーゼの濃度に依存して吸光度が上昇し、この検
量線を用いることにより検体（血清）中の膵リパーゼ濃
度を正確に読み取ることができる。また、第１図からも
明らかなように膵リパーゼ濃度が、数ng/mlの低値にお
いても再現よく、その濃度を測定し得ることが判明し、
膵リパーゼ濃度測定用ELISA系に充分応用可能であるこ
とが示された。

実施例３酵素抗体法による膵臓組織の特異染色への応用例実施例１により得た抗人膵リパーゼモノクローナル抗体
は、ELISA法のみならず膵臓組織中のリパーゼの局在あ
るいは分布を間接酵素抗体法により特異的に染色するこ
とができる。また、実施例２で調製した抗リパーゼ−PO
D標識抗体を用いた場合には、直接酵素抗体法によりよ
り短時間で膵臓組織を特異的に染色することができる。

以下、間接酵素抗体法の例を示す。つまり、膵臓組織の
パラフィンまたは凍結切片をスライドグラス上に固定
し、脱パラフィンあるいはブロッキングした後、至適濃
度に調製した抗リパーゼモノクローナル抗体（IgG濃度:
5μg/ml〜100μg/ml）を１次抗体として室温で１時間、
湿潤箱中で反応させた後、リン酸緩衝生理食塩水（PB
S）で３回、５分間ずつ洗浄した。次に、抗マウスイム
ノグロブリン−POD標識抗体を２次抗体として30分間、
湿潤箱中で反応させ同様に洗浄した後、３−アミノ−９
−エチルカルバゾール基質溶液を過酸化水素存在下に加
えてさらに30分間反応させた。反応終了後、PBSでスラ
イドグラスを洗浄し、グリセロール等を用い、スライド
グラスで封入して顕微鏡で染色された部位を調べた。

その結果を写真として第２図（ａ）、第３図（ａ）、第
４図（ａ）および第５図（ａ）、ならびにそれぞれ上記
第２図（ａ）〜第５図（ａ）の概略図である第２図
（ｂ）、第３図（ｂ）、第４図（ｂ）および第５図
（ｂ）に示した。第２図（ｂ）〜第５図（ｂ）において
斜線で示した部分が、即ち膵臓組織中の膵リパーゼの局
在分布が茶褐色に染色されていることが示される。即
ち、本発明のモノクローナル抗体はELISA系のみならず
酵素抗体法による膵臓組織の組織染色にも応用可能であ
ることが判明した。

実施例４先の実施例２で抗リパーゼモノクローナル抗体−POD標
識抗体の調製に使用したリパーゼ酵素活性を全く阻害し
ないクローンであるＬ−448クローンの代わりに、リパ
ーゼ酵素活性を阻害するクローンであるＬ−695Iを用い
て同様の方法で抗リパーゼモノクローナル抗体−POD標
識抗体を調製した。

更に、ここで抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体プ
レートの調製に用いたリパーゼ酵素活性を阻害するクロ
ーンであるL695Iの代わりに、同じくリパーゼ酵素活性
を阻害するクローンであるL612Iを用いて同様の方法で
抗リパーゼモノクローナル抗体感作抗体プレートを調製
した。

これらを用いて同様にしてリパーゼ測定用ELISA系の検
討を行い、そこで得られた膵リパーゼ検量線を第６図に
示した。この結果、先の実施例２と同様のことが示さ
れ、先の実施例２ではリパーゼ酵素活性を全く阻害しな
いクローンと阻害するクローンの組合せであるが、ここ
で行ったようにリパーゼ酵素活性を阻害するクローン同
士を組合わせた場合でも同じ結果が得られることが判っ
た。

〔発明の効果〕

本発明の抗人膵リパーゼ酵素活性阻害モノクローナル抗
体は、リパーゼ抗原分子を特異的に認識しかつリパーゼ
の酵素活性部位あるいは酵素活性部位付近を認識し結合
することによってリパーゼの酵素活性を阻害するモノク
ローナル抗体である。また、抗人膵リパーゼモノクロー
ナル抗体は、膵リパーゼの抗原分子に対して反応するが
リパーゼの酵素活性を全く阻害せず酵素活性部位以外の
抗原エピトープを認識するモノクローナル抗体である。

以上のことから、これら２種類のモノクローナル抗体
は、互いにリパーゼ抗原分子上の異なる抗原エピトープ
を認識することは明らかであり、これら２種類のモノク
ローナル抗体を組合わせたEnzyme−linked immunosorbe
nt assay（ELISA）法により膵リパーゼを高感度に再現
良く測定する試薬を調製することを可能にした。

また、リパーゼ酵素活性を阻害するモノクローナル抗体
同士の組み合わせの場合でも、同様な測定試薬の調製が
可能である。

さらにまた、リパーゼ測定用ELISA系のみならず、膵臓
組織のリパーゼ局在部位あるいは分布をも組織染色にお
いて検索することができることが可能となり検討の応用
範囲がさらに広がり、臨床検査の分野に貢献することが
期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は膵リパーゼ検量線、即ち、膵リパーゼ抗原分子
の上の異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体
を用いた膵リパーゼ測定用ELISA系における検量線の一
例である。第２図（ａ）は、モノクローナル抗体として、Ｌ−695I
を使用した場合の生物の形態である膵臓組織の組織染色
像を示す写真である。第３図（ａ）は、モノクローナル抗体として、Ｌ−649
を使用した場合の生物の形態である膵臓組織の組織染色
像を示す写真である。第４図（ａ）は、モノクローナル抗体として、Ｌ−234
を使用した場合の生物の形態である膵臓組織の組織染色
像を示す写真である。第５図（ａ）は、モノクローナル抗体として、Ｌ−527M
を使用した場合の生物の形態である膵臓組織の組織染色
像を示す写真である。第２図（ｂ）は第２図（ａ）の概略図である。第３図（ｂ）は第３図（ａ）の概略図である。第４図（ｂ）は第４図（ａ）の概略図である。第５図（ｂ）は第５図（ａ）の概略図である。第６図は同一反応特性を示すモノクローナル抗体同士を
組み合わせた場合の膵リパーゼ測定用ELISA系における
検量線の一例である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】人膵リパーゼと特異的に反応し、人膵リパ
ーゼの酵素活性を特異的に阻害するモノクローナル抗
体。
【請求項２】請求項（１）記載のモノクローナル抗体を
使用することを特徴とする人膵リパーゼの測定法。
【請求項３】人膵リパーゼと特異的に反応するが、リパ
ーゼの酵素活性を全く阻害しないモノクローナル抗体を
酵素標識抗体とし、人膵リパーゼと特異的に反応し、人
膵リパーゼの酵素活性を特異的に阻害するモノクローナ
ル抗体を固相固定抗体とすることを特徴とする請求項
（２）記載の人膵リパーゼの測定法。
【請求項４】人膵リパーゼと特異的に反応し、人膵リパ
ーゼの酵素活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体
同士を組合わせて用い、その一方を酵素標識抗体とし、
他方を固相固定抗体とすることを特徴とする請求項
（２）記載の人膵リパーゼの測定法。
【請求項５】請求項（１）記載のモノクローナル抗体を
使用することを特徴とする膵臓組織の特異染色の方法。
【請求項６】請求項（１）記載のモノクローナル抗体と
当該モノクローナル抗体に対する標識抗体を使用するこ
とを特徴とする請求項（５）記載の膵臓組織の特異染色
の方法。