JPH0748265A

JPH0748265A - ネフローゼ症候群及び肝障害症状の寛解剤

Info

Publication number: JPH0748265A
Application number: JP6085871A
Authority: JP
Inventors: Kokuki Kanou; 国驥叶; Junichi Kajiwara; 淳一梶原; Kiyoshi Kirihara; 清桐原; Kazuo Kato; 和夫加藤; Hiroko Abe; 博子阿部
Original assignee: NIPPON CHEM RES KK; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: NIPPON CHEM RES KK; JCR Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1993-06-03
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 1995-02-21
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: JP3638967B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】ポリＤ−ガラクツロン酸を有効構成成分とす
る水溶性多糖類よりなるネフローゼ症候群及び肝障害症
状の寛解剤、丹参から水または水性溶媒で抽出されうる
下記の特性を有する多糖類。糖含量：６０〜１００％糖組成：ウロン酸４０〜８０％（ほとんどＤ−ガラク
ツロン酸）中性糖１０〜３０％中性糖組成：ラムノース０〜１５％グルコース０〜１５％ガラクトース２５〜５５％アラビノース３０〜６０％マンノース０〜１５％分子量１５０，０００〜３００，０００。丹参の水性抽出液を多孔性ポリマー樹脂を通過させ限外
濾過、ゲル濾外クロマトグラフィーで精製する上記多糖
類の製造法。【効果】上記の新規な多糖類は水溶性で副作用が少
く、尿蛋白の排出を抑制してネフローゼ症候群の寛解や
肝障害症状の改善に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、老人はもとより近年若
年層で増加傾向にある腎臓疾患、とりわけ慢性腎不全に
至る前段階であるネフローゼ症候群と診断された患者に
対し、あるいはウイルス性及び薬物性肝炎等の肝障害の
症状を有する患者に対し、通院可能で安全な経口及び筋
肉内投与治療剤を提供する発明に関する。

【０００２】

【従来の技術】微小変化型ネフローゼの内科的な治療薬
として、合成薬であるステロイド剤或いは抗血小板薬で
あるジピリダモールが用いられているが、長期間使用し
なくてはならず、若年層に投薬する際には特に満月様顔
貌，月経不順，めまい，頭痛，悪心，嘔吐など、重篤な
場合には感染症，消化管出血，代謝異常，骨粗症，血栓
症，副腎不全，精神障害などの副作用が懸念されてい
る。

【０００３】また、肝炎にはウイルス性、薬物性のもの
もあるがウイルス性のものが大半を占めており、それら
の治療薬としてはインターフェロン、インターロイキン
２のようなバイオロジカル・レスポンス・モディファイ
アー（ＢＲＭ）、グリチルリチンの静注用注射剤である
ネオミノファーゲンＣなどが用いられている。しかしな
がらＢＲＭには発熱等の副作用が見られることにより長
期投与には問題がある。またグリチルリチンは基本的に
は抗炎症剤であり、長期に使用する場合は血圧、電解質
濃度の管理が必要となる。この他にも生薬成分であるサ
イコサポニン、サポニン、ゴミシンなどが知られている
が、いずれも臨床応用されるには至っていない。

【０００４】一方、ポリＤ−ガラクツロン酸

【化１】〔式中のカルボキシル基はメチルエステル化されていて
もよい〕を構成成分とする水溶性多糖類としては、たと
えば水溶性ペクチン質（ｐｅｃｔｉｃｓｕｂｓｔａｎ
ｃｅ）が知られている。これは柑橘類の果皮などを酸性
水溶液で抽出し、必要に応じてさらに酸、アリカリ、酵
素で脱メチル化し、アルコール等の有機溶媒を加えて沈
澱させて得られる水溶性多糖類で、ポリＤ−ガラクツロ
ン酸を主な構成成分とする。そしてポリＤ−ガラクツロ
ン酸の構造式中のカルボキシル基のメチルエステル化率
の大小により水溶性ペクチン質はペクチンとペクチニン
酸に別けられ、また実際上メチルエステルが残っていな
いものはペクチン酸と呼ばれている。

【０００５】水溶性ペクチン質はゼリー等の材料として
主として食品工業に用いられるが、医薬としては粘膜被
覆に供される程度でほとんど用いられていない。

【０００６】本発明の一部においては、丹参の抽出成分
が用いられるが、丹参は中国では、血液循環，血行停止
の改善に良いとされ伝統的に使用されている薬草であ
る。近年、血管拡張作用（大浦彦吉：和漢医薬学会
誌．，５：２２７−２３７．，１９８８．）、降圧作用
（中山医学院論：医歯薬出版，東京．，２５７−２５
８．，１９８０．）、抗凝血作用（羅厚蔚ら：Ａｃｔａ
ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａＳｉｎｉｃａ．，２３
（１１）：８３０−８３４．，１９８８．）、細胞内コ
レステロールの合成抑制作用（ＳｕｎＸｉ−ｍｉｎ
ｇ；中草薬．，２２（１）：２０−２３．，１９９
１．）、肝細胞保護（戚心広ら：中西医結合雑誌．，１
１（２）：１０２−１０４．，１９９１．）及びラジカ
ル消去作用（胡天喜：上海中医薬雑誌，９：２８−３
０．，１９８８．）などの多彩な生理活性作用があるこ
と、また腎機能の改善（大浦彦吉：第二回和漢薬の医学
薬学的研究に関する日中シンポジウムｐｐ．１４８−１
５７，１９８８．）、慢性腎疾患及び尿毒症の患者に対
して有効（張鏡人：上海中医薬雑誌．，１．１７−１
８．，１９８１．）であることが内外において報告され
ているが、その本質については何等言及されていない
か、言及されていても本願発明とは全く異なる低分子物
質である。

【０００７】また、丹参を原料とする腎疾患への治療薬
の研究も盛んに行われていて、低分子のフェナントレン
キノン類であるタンシノン類似物並びにカフェイン酸４
量体であるマグネシウムリトスペルミン酸Ｂ等が単離さ
れているが（Ｔ．Ｙｏｏｚａｗａ，Ｈ．Ｙ．Ｃｈｕｎ
ｇ，Ｈ．Ｏｕｒａ，Ｇ．Ｎｏｎａｋａ，ａｎｄＩ．Ｎ
ｉｓｈｉｏｋａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，
３６，３１６（１９８８））、何れも有機溶媒含有下で
抽出される脂溶性の高い物質だけであり、まだ臨床応用
には至っていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】腎疾患は大別して、糸
球体由来の原発性とそれ以外の疾患に由来する続発性に
分類され、前者が約８０％以上を占め、しかも低年齢層
ほど多くて約９０％に達する。病理組織所見からは微小
変化群，単状糸球体硬化症，膜性腎症，メサンギゥム増
殖性腎症（ＩｇＡ腎症，非ＩｇＡ腎症），膜性増殖糸球
体腎炎，半月体形成糸球体腎炎などに分類される。蛋白
尿は臨床所見の特徴として、いずれの組織学的病型にも
共通して認められ、重篤な場合にはネフローゼ症候群と
して診断されている。また近年腎臓疾患、特に腎臓の器
質的な衰えにより誘発される疾患は老人にとどまらず若
年層に増加しつつあるため、器質を改善して疾患を治療
する副作用発現の少ない植物成分で水溶性のある経口或
いは筋肉内に投薬し治療する薬剤の開発が望まれてい
る。

【０００９】また、肝炎は大別して、ウイルス性のもの
とアルコール等の薬物によるものがあるが、Ｂ型及びＣ
型肝炎ウイルスによるものが圧倒的に多い。近年治療薬
として特にインターフェロンがＣ型肝炎に対して有効で
あることが報告されており、使用頻度も高まってきてい
る（飯野司郎ら：基礎と臨床．２６：３３９，１９９
２；鈴木宏ら：肝・胆・膵・２３：１０６５，１９９
１）。しかしながら、短期投与で発熱等のインフルエン
ザ様症状が表れ、長期投与でも体重減少、下痢、嘔吐、
不整脈、脱毛、自己免疫異常等の副作用が見られる。ま
たこれらの薬剤はすべて注射剤であることからより簡便
に使用できる新たな治療薬あるいはインターフェロン等
との併用補助薬として副作用発現の少ない生薬、漢方薬
成分で水溶性のある経口或いは筋肉内に投与し治療する
薬剤の開発が望まれている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、広く繁用
されている蛋白尿排泄を顕著に起こし、さらに腎臓の器
質変化を示すことで良く知られるピューロマイシンで惹
起したラットのネフローゼ症候群モデルを利用して鋭意
検討した結果、丹参の水抽出物より上記モデルに対して
有効な多糖類が存在すること、その多糖類がポリＤ−ガ
ラクツロン酸を主要構成成分とすることを見い出した。

【００１１】本発明はこの知見を発展させたもので、
（Ｉ）ポリＤ−ガラクツロン酸を有効構成成分とする水
溶性多糖類よりなるネフローゼ症候群及び肝障害症状の
寛解剤、（II）丹参から水または水性溶媒で抽出されう
る下記の特性を有する多糖類Ａ．糖含量：６０〜１００％（１）糖組成：ウロン酸４０〜８０％（ほとんどＤ−
ガラクツロン酸）中性糖１０〜３０％（２）中性糖組成：ラムノース０〜１５％グルコース０〜１５％ガラクトース２５〜５５％アラビノース３０〜６０％マンノース０〜１５％Ｂ．分子量１５０，０００〜３００，０００、および（III)丹参を水または水性溶媒で抽出し、抽出液から残
渣を除去した液を無極性多孔性ポリマー樹脂を通過さ
せ、限外濾過で濃縮し、ついでゲル濾過クロマトグラフ
ィーに付することを特徴とする上記の多糖類の製造法で
ある。

【００１２】ポリガラクツロン酸を有効構成成分とする
水溶性多糖類としては、一般に植物から抽出される水溶
性ペクチン質が用いられ、それはガラクツロン酸のカル
ボキシル基が約７．５％以上メチルエステル化されてい
るペクチンでも、メチルエステル化率がそれよりも低い
ペクチニン酸でも、実際上メチルエステルがすべて加水
分解されているペクチン酸でもよい。水溶性ペクチン質
は一般に少量のアラバン、ガラクタン、ラムノースなど
を伴う場合が多いが、そのまま用いることができる。

【００１３】本発明の水溶性多糖類としては、たとえば
丹参から抽出される水溶性ペクチン質も用いられる。

【００１４】丹参は植物丹参（Ｓａｌｖｉａｍｉｌｔ
ｉｏｒｒｈｉｚａＢｕｎｇｅ）の根および根状の茎で
あるが、同属植物の南丹参（Ｓ．ｂｏｗｌｅｙａｎａ
Ｄｕｎｎ）、甘粛丹参（Ｓ．ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ
Ｍａｘｉｍ）、雲南丹参（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ
Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）等の根も用いられ、本発明で
はこれらを総称して丹参という。

【００１５】本発明で用いられる丹参の産地は特に限定
されるものではないが、好ましくは中国，四川地区産の
丹参が本発明の多糖類を効率よく抽出精製することがで
きる。

【００１６】丹参はできるだけ小片にして抽出するのが
望ましい。抽出溶媒として水または水性溶媒が用いら
れ、水性溶媒としてはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の緩
衝液または食塩等の塩類水溶液を用いるのが好ましい。

【００１７】抽出溶媒のｐＨは約２〜約９に調整するの
が好ましい。抽出は約５０〜約１００℃で行うのが好ま
しく、さらに好ましくは７０〜９０℃である。たとえ
ば、丹参を予め５０〜１００℃好ましくは７０〜９０℃
にした温水或いはｐＨ２〜９の範囲にある緩衝液または
塩類溶液に入れるか、入れたあと温浴中などで所定の温
度になるまで加温して抽出する。

【００１８】かくして、１〜８時間、好ましくは３〜５
時間抽出すれば粗出液が得られる。抽出液中に混在する
丹参の残渣は目の粗い濾布やヌッチェなどで濾去するこ
とができる。

【００１９】残渣を除去した抽出液は水で平衡化した無
極性の多孔性ポリマー樹脂を充填材とするカラムクロマ
トグラフィーによりさらに精製する。このポリマー樹脂
としては、たとえばＨＰ−２０およびＭＣＩ−ゲル（三
菱化成社製）やアンバーライトＸＡＤ−２（オルガノ社
製）などが挙げられる。

【００２０】丹参の活性成分についてＭＣＩ−ゲルの吸
着分画で、５０％メタノール溶液で溶出される低分子物
質であるマグネシウムリトスペルミン酸Ｂが報告されて
おり、発明者らも、同様の分画に蛋白尿排泄を抑制する
活性のあることを確認した。しかし、非吸着部分を含め
溶出された全画分について、詳細に蛋白尿排泄を抑制す
る作用を試験した結果、当初の予想に反して、素通り画
分にも上記作用を示す成分のあることが判明した。この
時点で、この処理からの素通り画分は、極性が低いこと
が予想され、又、蛋白質に固有の紫外部吸収スペクトル
を示さないから蛋白質以外の成分であろうと思われた。

【００２１】素通り画分の一部を、次いで２枚の限外ろ
過膜（カットオフ，分子量３００，０００及び５０，０
００の）システムに通し、濃縮且つ精製ステップの検討
を行った。実際には分子量３００，０００以上、５０，
０００〜３００，０００及び５０，０００以下の各物質
群に分け、各成分についてピューロマインシン惹起ラッ
トモデルを用いて、蛋白尿排泄を抑制する活性を試験し
た。その結果、強い活性が分子量５０，０００〜３０
０，０００に範囲のある分画に見られ、５０，０００以
下にも弱い活性が見られた。

【００２２】そこで、先の素通り画分の濃縮に分子量３
０００のカットオフ，限外ろ過膜を用いた。この工程で
の限外ろ過膜はカットオフのサイズが同じであれば何れ
の種類のものでも本発明の物質の濃縮に用いることが可
能である。

【００２３】次に濃縮液中の活性成分をより狭い分子量
範囲に限定するために、ゲルろ過カラムクロマトグラフ
ィーによる精製を行った。一般に蛋白質などの場合に
は、ゲルろ過クロマトグラフィーの担体としては、セフ
ァデックス及びセファロース類（ファルマシア社製），
セルロファイン（生化学工業社製），バイオゲル（バイ
オラッド社製）などが使用されており、本発明の物質の
クロマトグラフィーにも上記のものが使用できるが、好
ましくは合成手段によって調製された材質によるクロマ
ト材、例えばバイオゲルが本発明の物質の精製に適して
いる。クロマト材には編目サイズ、即ち排除限界により
各種のものがあるが、分画範囲として１００００〜３０
０，０００のものであればいずれでも構わない。発明者
らは、好んでバイオゲルＰ−３０，−６０，−１００、
中でもバイオゲルＰ−６０を使用した。そこで、濃縮液
を水で平衡化したバイオゲルＰ−６０を充填したカラム
に通した。モニターは暫定的に２８０ｎｍの吸収で行
い、吸収のある分画と吸収のない分画をカラム容量の２
倍量まで数分画に分け、次いでピューロマイシン惹起ラ
ットモデルでの蛋白尿排泄の抑制作用を試験したところ
高分子領域に活性を有する多糖類が溶出されていること
がわかった。

【００２４】この多糖類は過ヨウ素酸酸化あるいは還元
処理すると活性を失う。また本物質は血小板凝集抑制作
用，赤血球膜保護作用を有することがｉｎｖｉｔｒｏ
の実験結果より明らかになった。さらにピューロマイシ
ン惹起ネフローゼモデルラットまたは四塩化炭素誘発肝
障害モデルラットにおいてはラジカルが関与することが
知られているが、本物質には直接ラジカルを消去する作
用はないことがＥＳＲを用いた実験により示された。丹
参の抽出液を無極性ポーラスポリマー樹脂及びゲルろ過
クロマトグラフィーで精製（精製画分）した多糖類の特
性を下記のように試験した。

【００２５】（１）全糖含量：フェノール硫酸法（Ｈｏ
ｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄＨｏｆｒｅｉｔｅｒ，Ｂ．
Ｔ．（１９６２）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣａｒｂｏｈ
ｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）．Ｖｏｌ．１，ｐ．３３８）試験溶液０．５ｍｌを試験管にとり５％（ｗ／ｖ）フェ
ノール液０．５ｍｌを加え、濃硫酸２．５ｍｌを速やか
に液面に直接に加えよくまぜ、室温に２０分保った後、
４８０ｎｍの吸光度を測定する。標準溶液にはグルコー
ス（１０〜９０μｇ／ｍｌ）水溶液を用いた。

【００２６】（２）ウロン酸含量：メタヒドロキシジフ
ェニル法（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄＡ
ｓｂｏｅＨａｎｓｅｎ，Ｇ．（１９７３）Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，４８４−４８９．）試料溶液０．２ｍｌに０．０１２５Ｍホウ酸ナトリウム
の濃硫酸溶液１．２ｍｌを添加し、氷冷後攪はんする。
１００℃で５分間処理した後氷冷し、０．１５％メタヒ
ドロキシジフェニルの０．５％水酸化ナトリウム溶液２
０μｌを加え、５２０ｎｍの吸光度を測定する。標準溶
液にはガラクツロン酸溶液を用いた。

【００２７】（３）中性糖含量（アルジトールアセテー
ト−ＧＣ−ＭＳ法）（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｇ．ａ
ｎｄＰｉｐｅｒ，Ｃ．Ｖ．（１９７０）Ｔａｐｐｉ．
５３，２５７−２６０．）丹参の精製画分５０ｍｇを７２％（ｖ／ｖ）硫酸３ｍｌ
に溶かし、３０℃，１時間処理したものに蒸留水８４ｍ
ｌを加え、１２０℃で１時間オートクレープする。内部
標準としてイノシトール４ｍｇを加え、その３０ｍｌを
水酸化バリウムを加えてｐＨ５．５に調整した後、遠心
分離して上清を得る。その２５ｍｌに水素化ホウ素ナト
リウム８０ｍｇを添加し、室温で２時間処理後、酢酸で
反応をとめる。濃縮乾燥後、蒸留水に溶かしＤＥＡＥセ
ファデックスカラムにかけ素通り画分を集める。濃縮乾
燥後、無水酢酸とピリジンによりアセチル化した後、ジ
クロルメタンと１Ｎ塩酸の混液で抽出する。有機層を蒸
留水で洗った後、濃縮し、アセトンに溶かしてガスクロ
マトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）
にて定量した（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ糖分析用キャピ
ラリーカラムを使用）。また標品は上記の還元操作によ
り処理して同様に分析した。

【００２８】（４）分子量の測定トーソーＨＰＬＣシステム（トーソー社製）にアサヒパ
ックＧＳ−５２０（旭化成社製）カラム（７．６ｍｍＩ
Ｄｘ５００ｍｍ）を接続し、ミリＱ水を用いて、本願物
質試料溶液１０μｌをカラムに付加して分子量を測定
（温度：室温、流速：０．５ｍｌ／分、検出：ＲＩＤ）
した。分子量マーカーにはアミロースキット（中埜酢店
社製）：分子量１０２００，３０１００，７５２００，
１１１４００，３６４２００を用い、これらの溶出パタ
ーンから得た検量線より、本願物質の分子量を算出し
た。

【００２９】（５）ピューロマイシン惹起ネフローゼ症
候群モデルラットによる評価１）ネフローゼ症候群モデルラットの作製：ウィスター
系雌性ラット（約９週令、体重約１５０ｇ）にピューロ
マイシンアミノヌクレオシド（：以下ピューロマイシ
ン、シグマ社製）６０ｍｇ／ｋｇを１回、頸静脈内投与
してネフローゼ症候群モデルラットを作製した（東條静
夫ら：ネフローゼ症候群京極方久編，ソフトサイエ
ンス社出版，４７９−４８８，１９８４）。

【００３０】２）試料溶液の投与：ピューロマイシン投
与の開始の日から１日１回各試料溶液を胃カニューレを
通じて２１日間経口或いは筋肉内投与した。陰性対照群
には注射用水を、陽性対照群にはジピリダモール溶液を
用いた。

【００３１】３）尿蛋白質量の測定：尿蛋白質量は、ピ
ューロマイシン投与終了後５日目から、２〜３日おきに
２４時間尿をラット代謝ケージを用いて採尿し、尿量を
計測した。次いで遠心分離（３０００ｒｐｍｘ１０分）
して得た上清１ｍｌにスルホサリチル酸３ｍｌを加え、
室温で１０分間放置した後、波長６６０ｎｍの吸収を測
定し、検量線より尿中のタンパク質濃度を求め、更に尿
容量を乗じて尿中への総蛋白質排泄量を算出した。検量
線作成に当たっては牛血清アルブミン（シグマ社製）を
標準タンパク質に用いた。

【００３２】４）血清コレステロール，血清アルブミ
ン，血清中の総蛋白質量及び血清過酸化脂質の測定：ピ
ューロマイシン投与終了後７日目，１４日目，２１日目
に各群のラットをエーテル麻酔を施した後、静脈より採
血し、血清中のコレステロール，アルブミン，総蛋白質
量及び過酸化脂質量を測定した（いずれも和光純薬工業
社製）。

【００３３】（６）四塩化炭素誘発肝障害モデルによる
評価１）肝障害モデルの作成：Ｗｉｓｔａｒ系雌性ラット
（９−１１週令、体重１６０ｇ前後）に対し、オリーブ
油に等量の割合で混合した四塩化炭素（和光純薬製）溶
液１．５ｍｌ／ｋｇを腹空内に１回投与することにより
作成した。（炎症学書：炎症炎症動物実験法、実験的肝
繊維症．医学書院出版，２５３−２７７）

【００３４】２）資料溶液の投与：四塩化炭素投与３日
前から投与前日まで試料を１日１回筋肉内投与あるいは
７日前から投与前日まで経口投与を行った。陰性対象群
には注射用水を投与した。

【００３５】３）血清生科学的検査：四塩化炭素投与２
４時間御にエーテル麻酔下で回胸、心臓より２ｍｌの血
液を採血し、常温に１時間放置後、遠心分離して血清を
得た。血清トランスアミナーゼ（ＧＯＴ：ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａ
ｓｅ，ＧＰＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃｐｙｒｕｖｉｃｔｒ
ａｎｓａｍｉｎａｓｅ）活性の測定は和光純薬製キット
を用いて行った。

【００３６】４）統計解析：それぞれの測定データはす
べて平均±Ｓ．Ｅで示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定
により統計解析した。

【００３７】下記の実施例に示されるように、本発明の
多糖類は動物実験でネフローゼ症候群の寛解や肝障害症
状の改善に有効であり、ネフローゼ症候群の寛解剤また
は肝障害症状改善剤として、通常成人１人当たり１日
量、経口的に約１０〜１５０ｍｇ、筋肉内注射として約
０．５〜１０ｍｇ投与することができる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例および試験例を挙げて本発明を
さらに説明する。実施例１中国，四川地区産の丹参の根部の小片１０ｋｇに水８０
Ｌを加え、投げ込みヒーターを投じ８０℃にした後、３
時間攪はんしながら抽出した。抽出液中の根部残渣はヌ
ッチェでろ過して取り除き、回収した根部残渣に更に水
８０Ｌを加えて１回目と同様に処理して再抽出液を得
た。１回目と２回目の抽出液（１３０Ｌ）を合わせ、減
圧下、４０℃でエバポレーターを用いて濃縮し濃縮液
（１０Ｌ）を得た。

【００３９】次に、濃縮液をＨＰ−２０（４Ｌ，三菱化
成社製）を充填したカラム（１１×４５ｃｍ）に負荷し
た。平衡化液及び展開液には水を用い、室温下でクロマ
トグラフィーを行い、素通り分画及び水洗浄分画（非吸
着）液を回収した。カラムは５０％メタノール及びアセ
トニトリルで洗浄した後、最後に水に完全に置換して再
使用した。上記非吸着画分は繰り返し３回程同様に処理
して完全に非吸着分画の液（５５Ｌ）を得た。この全非
吸着液は分子量カットオフ３０００の限外ろ過膜を装備
した限外ろ過装置ＳＥＰ−１０１３（旭化成）を用いて
限外ろ過濃縮し、通過液（分子量約３０００以下，Ｓ
ＥＰ−ＯＵＴ）と非通過液（分子量約３０００以上，
ＳＥＰ−ＩＮ）を得た。濃縮した非通過液（ＳＥＰ−Ｉ
Ｎ）を水で平衡化したバイオゲルＰ−６０を充填したカ
ラム（１．５×１００ｃｍ）に付加し、水を展開液とし
て用いクロマトグラフィーを行った。モニターは暫定的
に波長２８０ｎｍで吸収を測定し、横軸に分画番号を、
縦軸に各分画液の吸収を記載したグラフを作成し、吸収
を示さない分画を中心に全糖の測定を行い、その測定結
果を同じグラフに記載した（図１）。

【００４０】目的の多糖類成分は分画番号１１から２２
の分画液（ＡＦ）に得られ、ついで凍結乾燥して粉末
（３０ｇ，ロットＡ）を得た。ここで得た精製多糖類の
特性を前述した試験法により試験した結果、以下の持性
を得た。

【００４１】１）糖含量（フェノール硫酸法）：７９％（１）糖組成：ウロン酸含量（６２％、メタヒドロキシ
ジフェニル法）中性糖含量（１７％、アルジトールアセテート−ＧＣ−
ＭＳ法）（２）中性糖組成（アルジトールアセテート−ＧＣ−Ｍ
Ｓ法）グルコース含量（５．５％）ガラクトース含量（３９．７％）アラビノース含量（４４．６％）マンノース含量（５．５％）ラムノース含量（４．７％）（３）その他の糖：アミノ糖、アルドヘキソース、２−
デオキシ糖は含まない。

【００４２】２）分子量：２５９０００（標準多糖：ア
ミラーゼキット、分子量１００〜３６０Ｋ）

【００４３】３）ネフローゼ症候群モデルラットによる
評価精製試料１０ｍｇ／ｋｇ，４０ｍｇ／ｋｇを経口投与、
０．５ｍｇ／ｋｇ，２．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与した
ところ、図２，図３に示したようにいずれの場合も尿蛋
白排泄が有意に抑制された。また、表１，表２に示した
ように血清コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）
値，血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）値及びＡ／Ｇ
比，血清過酸化脂質（ＭＤＡ）値においても有意な改善
効果が認められた。

【表１】

【表２】

【００４４】４）四塩化炭素誘発肝障害モデルによる評
価製糖試料（ＡＦ）７ｍｇ／ｋｇ，３５ｍｇ／ｋｇを経口
投与、０．３ｍｇ／ｋｇ，１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投
与したところ、表３に示したようにいずれの場合もＡＦ
前投与群では血清ＧＯＴ，ＧＰＴ値の上昇が用量異存的
に抑制された。

【００４５】

【表３】

【００４６】実施例２実施例１に記載の方法によりロットの異なる丹参原料よ
り各々精製を行い、１に記載した以外に計３ロット（ロ
ットＢ，Ｃ，Ｄ）の精製品を取得し、同様の特性評価を
行った。１）糖含量（フェノール硫酸）：ロットＢ（６５％），
ロットＣ（８０％），ロットＤ（９３％）（１）糖組成

【００４７】

【表４】

【００４８】（２）中性糖組成（アルジトールアセテー
ト−ＧＣ−ＭＳ法）

【表５】

【００４９】（３）その他の糖：ロットＢ，Ｃ，Ｄのい
ずれもアミノ糖、アルドヘキソース、２−デオキシ糖は
含まない。

【００５０】２）分子量：（標準多糖：アミロースキャ
ット、分子量１００〜３６０Ｋ）ロットＢ（１５０，０００），ロットＣ（２８０，００
０），ロットＤ（２５０，０００）

【００５１】３）ネフローゼ症候群モデルラットによる
評価薬効評価についてはいずれの精製品も実施例１で得られ
たものとほぼ同等の効果が得られた。

【００５２】実施例３活性の本体が糖であること及びウロン酸の薬効に対する
関与について調べる目的で本精製品を以下の操作によっ
て酸化及び還元し、それらの効果について調べた。投与
量はネフローゼ症候群ラットにはそれぞれ４０ｍｇ／ｋ
ｇを経口投与し、肝障害ラットにはそれぞれ１．５ｍｇ
／ｋｇを筋肉内投与した。（１）酸化（Ｎｏｂｌｅ，Ｄ．Ｗ．ａｎｄＳｔｕｒｇ
ｅｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９７０）Ｃａｒｂｏｈｙｄ，Ｒｅ
ｓ．１２，４４８による）精製試料６００ｍｇを蒸留水
１５０ｍｌに溶かし、０．２Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶
液１５０ｍｌを加えて３７℃で２４０時間反応させる。
エチレングリコール１５０ｍｌを加えて反応を止めた
後、水素化ホウ素ナトリウム５００ｍｇを加えて室温２
４時間処理する。酢酸で反応を止め、水に透析した後、
凍結乾燥する。

【００５３】（２）還元（Ｔａｙｌｏｒ，Ｒ．Ｌ．ａｎ
ｄＣｏｎｒａｄ，Ｈ．Ｅ．（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ．１１，１３８３−１３８８による）精製
試料５０ｍｇを蒸留水に溶かし、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙ
ｌ−３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙ
ｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）２４９ｍｇを加えた
後、０．１Ｎ塩酸でｐＨ４．７５に保ちながら１９時間
反応させる。その後、２Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液
１０ｍｌを１時間かけて滴下し、その間ｐＨ７に保つ。
さらに１時間攪はんした後、水に透析し凍結乾燥する。

【００５４】結果を図４ならびに表６、７に示したが、
酸化及び還元した試料については全く効果が認められな
かった。このことは精製試料中の活性物質は確かに多糖
類であり、中でも特にウロン酸が薬効に大きく寄与して
いることが示された。また還元前後の中性糖含量の比較
から本試料に含まれるウロン酸のほとんどはガラクツロ
ン酸であることがわかった。

【００５５】

【図４】

【表６】

【表７】

【００５６】実施例４実施例３の結果より多糖中のＤ−ガラクツロン酸が活性
に重要であることがわかったので次にポリＤ−ガラクツ
ロン酸の構造を有する植物由来のペクチン酸を用いてピ
ューロマイシン惹起ネフローゼ及び四塩化炭素誘発肝障
害モデルに対する効果を調べた。ネフローゼモデルに対
しては１０，４０ｍｇ／ｋｇを経口投与、２．５ｍｇ／
ｋｇを筋肉内投与し、尿蛋白排泄量及び血清コレステロ
ール、アルブミン量を測定した。肝炎モデルに対しては
１．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与し、血清ＧＯＴ，ＧＰＴ
値を測定した。

【００５７】結果を表８，９，１０に示したが、ネフロ
ーゼにおける尿蛋白排泄はペクチン酸の筋肉内投与で有
意に抑制され、経口投与でも改善傾向を示した。また血
清パラメータについても経口、筋肉内投与で明きらかな
改善が見られた。ただ経口投与の場合はいずれの指標に
おいてもＡＦの方が高い有効性を示した。肝炎に対して
はペクチン酸はＡＦと同等の効果を示し、血清ＧＯＴ，
ＧＰＴ値を有意に抑制した。

【００５８】これらの結果から丹参由来の多糖類（Ａ
Ｆ）に限らず由来の異なるポリＤ−ガラクツロン酸の構
造を有する多糖類でもＡＦとほぼ同様の効果を示すこと
がわかった。

【００５９】

【表８】

【００６０】

【表９】

【００６１】

【表１０】

【００６２】

【発明の効果】本発明によれば、ポリＤ−ガラクツロン
酸を有効構成成分とする水溶性多糖類がネフローゼ症候
群及び肝障害症状の寛解剤として提供される。

【００６３】

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１におけるゲルろ過クロマトグラフィーに
より展開された分画の波長２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）および
４８０ｎｍ（Ａ₄₈₀）の吸光度、図２および図３は実施
例１においてネフローゼ症候群モデルラットに本発明の
多糖類（ＡＦ）を種々の投与量で経口投与した場合の尿
蛋白排泄量、図４はＡＦを酸化または還元して同様に投
与した場合の尿蛋白排泄量、をそれぞれ示すグラフであ
る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年６月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４３】３）ネフローゼ症候群モデルラットによる
評価精製試料１０ｍｇ／ｋｇ，４０ｍｇ／ｋｇを経口投与、
０．５ｍｇ／ｋｇ，２．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内投与した
ところ、図２，図３に示したようにいずれの場合も尿蛋
白排泄が有意に抑制された。また表１，表２に示したよ
うに血清コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）
値，血清アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）値及びＡ／Ｇ
比，血清過酸化脂質（ＭＤＡ）値においても有意な改善
効果が認められた。

【表１】

【表２】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４５】

【表３】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５５】

【図４】

【表６】

【表７】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５９】

【表８】

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６０】

【表９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者加藤和夫兵庫県神戸市垂水区桃山台六丁目10−３ (72)発明者阿部博子大阪府堺市向陵西町四丁目10−８サンライズガーデン三国ケ丘406号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリＤ−ガラクツロン酸を有効構成成分
とする水溶性多糖類よりなるネフローゼ症候群及び肝障
害症状の寛解剤。
【請求項２】多糖類が水溶性ペクチン質である請求項
１記載の寛解剤。
【請求項３】多糖類が丹参から水または水性溶媒で抽
出され、下記の特性：Ａ．糖含量：６０〜１００％（１）糖組成：ウロン酸４０〜８０％（ほとんどＤ−
ガラクツロン酸）中性糖１０〜３０％（２）中性糖組成：ラムノース０〜１５％グルコース０〜１５％ガラクトース２５〜５５％アラビノース３０〜６０％マンノース０〜１５％Ｂ．分子量１５０，０００〜３００，０００を有するものである請求項１記載の寛解剤。
【請求項４】筋肉内または経口投与される請求項１、
２または３記載の寛解剤。
【請求項５】丹参から水または水性溶媒で抽出されう
る下記の特性を有する多糖類Ａ．糖含量：６０〜１００％（１）糖組成：ウロン酸４０〜８０％（ほとんどＤ−
ガラクツロン酸）中性糖１０〜３０％（２）中性糖組成：ラムノース０〜１５％グルコース０〜１５％ガラクトース２５〜５５％アラビノース３０〜６０％マンノース０〜１５％Ｂ．分子量１５０，０００〜３００，０００
【請求項６】丹参を水または水性溶媒で抽出し、抽出
液から残渣を除去した液を無極性多孔性ポリマー樹脂を
通過させ、限外濾過で濃縮し、ついでゲル濾過クロマト
グラフィーに付することを特徴とする請求項５記載の多
糖類の製造法。
【請求項７】丹参の抽出をｐＨ約２〜約８で行う請求
項６記載の製造法。
【請求項８】水性溶媒が緩衝液または塩類水溶液であ
る請求項６記載の製造法。
【請求項９】丹参の抽出を約４０〜約１００℃で行う
請求項６、７または８記載の製造法。