JPH0748277A - Ａ型肝炎ウィルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 安定なＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）を製造す
るための完成した工業規模の高度に再現性のある方法の
提供。 【構成】 蛋白に基づき＞９５％純度のＨＡＶを精製さ
せるべく最適化された増殖、収穫および抗原精製条件か
らなっている。さらに処理工程は、悪性ＨＡＶによる感
染の保護にて免疫原性であり、充分耐性かつ効果的であ
る失活ＨＡＶワクチン組成物を与える。蛋白、炭水化
物、脂質、ＤＮＡおよびＲＮＡの生成物含有量につき解
析する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高度に精製されたＡ型
肝炎ウィルスワクチンの製造に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】１９７３年、ファインストン等［Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ１８２，ｐ１０２６］は後にＡ型肝炎ウィルス
として知られることとなった感染性肝炎の病因原を免疫
電子顕微鏡により確認した。

【０００３】Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）のインビトロ
培養は先ず最初にプロボスト等［Ｐ．Ｓ．Ｅ．Ｂ．Ｍ．
１６０，ｐ２１３，１９７９］によって報告され、この
方法はＨＡＶ感染したキヌザルからの肝臓を肝臓体外移
植培養および胎児アカゲザル腎臓（ＦＲｈｋ６）細胞培
養の接種物として使用した［米国特許第４，１６４，５
６６号］。その後の発明においては、予め下等霊長動物
で処理されていないＨＡＶの直接的接種を用いてインビ
トロでのＨＡＶの増殖を開始させることに成功した［Ｐ
ｒｏｖｏｓｔ等，Ｐ．Ｓ．Ｅ．Ｂ．Ｍ．１６７，ｐ２０
１（１９８１）；米国特許第５，０２１，３４８号］。

【０００４】この研究からインビトロ培養によるＨＡＶ
の減毒が示された。さらに、インビトロでの反復処理に
際しＨＡＶ培養物はウィルスが培養細胞に適合性となる
につれ一層生産性となりかつ複製速度が加速されること
も示された。他の発展は、減毒された生ウィルス［Ｐｒ
ｏｖｏｓｔ；等，Ｊ．Ｍｅｄ Ｖｉｏｌ．２０，ｐ１６
５（１９８６）］およびホルマリン失活のＨＡＶ［米国
特許第４，１６４，５６６号；米国特許第５，０２１，
３４８号；Ｐｒｏｖｏｓｔ等，ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｈｅ
ｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ，ｐ８３−８６，１９８８−Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ］の両者につき下等霊長動物における保護効
果が示されたことであった。上記研究から、失活または
減毒された免疫原性ＨＡＶは可能なワクチン候補である
ことも明かになった。しかしながら、人間に使用するの
に安全なＨＡＶワクチンを産業的に入手するには再現性
のある工業規模の高純度抗原の製造方法が必要とされ
る。

【０００５】研究および初期のビリオン特性化につき全
ＨＡＶビリオンを部分精製するための種々の方法が記載
されている。たとえば文献［Ｈｏｒｎｂｅｃｋ，Ｃ．
Ｌ．等、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ６；３０９−３
１４（１９７５）；Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，Ｓ．Ａ．等、
Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ １０；３００−３０８
（１９７８）；Ｓｉｅｇｌ，Ｇ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
２６，４０−４７（１９７８）；Ｓｉｅｇｌ，Ｇ．等、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．５７，３３１−３４１（１９
８１）；Ｓｉｅｇｌ，Ｇ．等、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ ２２，２１８（１９８４）；Ｈｕｇｈｅｓ，Ｊ．
Ｖ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２，４６５（１９８４）；
およびＷｈｅｅｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，
５８，３０７（１９８６）］が参照される。

【０００６】これら方法は全て、たとえば蔗糖濃度勾配
遠心分離またはＣｓＣｌ−密度濃度勾配遠心分離のよう
な面倒かつ非実用的であると共に極めて高価な工程を用
いる。さらに、これら方法は比較的小さい生産規模に適
し、或る研究者はその生成物が高度に精製されたと報告
しているが、この研究を慎重に分析すると絶対的な純度
レベルの主張を支持するには不充分なパラメータしか試
験されなかったことが示される。たとえばルイス等［１
９８９年２月８日公開のヨーロッパ特許出願第０３０２
６９２号］は、（ａ）ＨＡＶ感染細胞の破壊、抽出およ
び濃縮；（ｂ）核酸汚染物を除去すべく高い塩濃度にお
ける陰イオン交換クロマトグラフィーへの流過；および
（ｃ）ゲル濾過クロマトグラフィーからなる方法を開示
した。その後の研究において、ルイス等［１９８９年７
月１８日公開のヨーロッパ特許出願第０４６８７０２
号］は、汚染性炭水化物を除去すべくイオン交換吸着／
脱着工程を設けることにより上記方法を改変した。これ
ら公開された両研究において、ＨＡＶが生産される規模
は比較的小さく、大規模の工業的規模拡大という本発明
により解決された問題には遭遇しなかった。さらに、生
成物の純度はゲル電気泳動にかけた生成物のクーマシー
染色もしくは銀染色により測定された。この分析法は蛋
白純度の一尺度を与えるが定量的でなく、たとえば脂
質、炭水化物、核酸または低分子量有機物のような他の
汚染物の存在もしくは不存在に関し情報を与えない。

【０００７】ＥＰＯ−４６８７０２Ａ２号およびＥＰＯ
−３０２６９２Ａ２号の両公報には、ＨＡＶの従来の収
穫および精製方法は洗剤もしくは外生酵素の使用のため
食物薬品局による承認が妨げられると思われる１つもし
くはそれ以上の工程を用いると記されている。本発明に
おいては洗剤および外生酵素の両者を用いるが、これら
有用な薬剤の除去方法をも開示し、しかも生成物が検出
限界未満しかこれら添加物質を含有せず、公開公報に記
載されたＨＡＶ精製物と同等またはそれ以上の純度であ
ることを示す。

【０００８】同様にモリツグ等［１９８９年１１月２日
公開のヨーロッパ特許出願第０３３９６６８号］は （ａ）可溶化、抽出、濃縮、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼお
よびプロティナーゼ処理； （ｂ）蔗糖密度分画（これはＲＮＡ含有および空のカプ
シドを分離する）；および （ｃ）ゲル濾過クロマトグラフィー からなる方法を記載している。ここでも、この方法は特
に蔗糖密度分画工程に関し生産規模が制限された。さら
に生成物の純度も予測困難であって、この公報には絶対
的尺度で報告されていない。

【０００９】リノ等［Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ＃１０，
ｐ５−１０（１９９２）］はモリツグ法に対する改良に
つき報告している。この方法の生成物はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動および密度測定法により分析
されて、その精製ＨＡＶには１．９％未満の残留外生蛋
白が存在することを示した。さらに０．５μｇの精製Ｈ
ＡＶには５ｐｇ未満の残留宿主細胞核酸が存在すること
も結論された。しかしながら、その製造法の限界により
ＨＡＶの大規模製造は非実用的であり、しかも複数パラ
メータによる絶対純度も報告されていない。

【００１０】他の報告においてクソフ等［Ｖａｃｃｉｎ
ｅ，９，５４０（１９９１）］はＶｅｒｏ様細胞にてＨ
ＡＶを培養し、有機抽出とＤＮアーゼ処理と多孔質シリ
カビーズでのクロマトグラフィーとによりウィルスを精
製した。この場合も、生成物の絶対純度が示されず、ま
た生産規模についても示されていない。

【００１１】ＨＡＶワクチンの純度に関する発展データ
の不確実性にも拘らず、相対的抗原性に基づきワクチン
製品を比較することはでき（表１、実施例１１参照）、
その製造業者により報告された各種の製品におけるＨＡ
Ｖの対応量を本発明の生成物と対比して示すことができ
る。

【００１２】本発明の生成物は、ＨＡＶ純度のレベルと
従来は単に熱望されていただけの生産規模との下の本明
細書に記載した絶対的純度特性を有する免疫原である。
本発明はＨＡＶワクチンを作成するため報告された小規
模およびパイレットレベルの方法から長い道を経て、初
めて再現性のある高品質かつ高純度の安全なＨＡＶワク
チンの工業的製造を実現させた。

【００１３】

【発明の要点】本発明によれば、大規模の静置表面生物
反応器におけるＨＡＶの培養、ウィルスの洗剤収穫、ヌ
クレアーゼ処理、濃縮、有機溶剤抽出、イオン交換クロ
マトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーから
なる方法は、＞９５％のＨＡＶ蛋白純度を有する安定な
ＨＡＶワクチン製品を製造するための再現性ある工業規
模の手段を与える。ＤＮＡ、炭水化物、ＲＮＡおよび脂
質のレベルがワクチンにつき特性化される。

【００１４】本発明の工業的に適用しうる精製法は、減
毒ＨＡＶまたは有毒ＨＡＶのいずれから得られるにして
もＨＡＶによる感染を受けうる任意の細胞株、ラインも
しくは培養物で生産された任意のＡ型肝炎ウィルス（Ｈ
ＡＶ）の精製を含む。さらに、空（ウィルス核酸なし）
であっても或いは完全（ウィルス核酸を含有する）であ
ってもＨＡＶカプシドは全て本発明の方法に包含され
る。

【００１５】２８回の処理におけるＨＡＶ（Ｐ２８ＣＲ
３２６Ｆ′；たとえばストレインＣＲ３２６ＦおよびＣ
Ｒ３２６Ｆ′のようなＣＲ３２６から生ずる変種の分
類、および絶対的処理レベルに対するこの命名の関係に
ついては文献［Ｐｒｏｖｏｓｔ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，２０：１６５−１７５，１９８６）参照］）を
単に例示の目的で本発明におけるＭＲＣ−５細胞に感染
させるべく使用し、この生産材料をＰ２９で培養した。
Ｐ２８ＣＲ３２６Ｆ′は減毒されたＨＡＶストレインで
ある。慣用技術により減毒しうるＨＡＶストレインを包
含する他のＨＡＶストレインも本発明に包含される。Ｈ
ＡＶ増殖に適する他の細胞ラインはＶｅｒｏ、ＦＬ、Ｗ
Ｉ−３８、ＢＳＣＩおよびＦＲｈＫ６細胞を包含する。
細胞培養におけるＨＡＶ増殖のためのこれらおよび他の
系については文献［Ｇｅｒｅｔｙ，Ｒ．Ｊ．“Ａｃｔｉ
ｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈ
ｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ，”ｉｎ Ｇｅｒｅｔｙ，Ｒ．
Ｊ．（ｅｄ．）Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８４，ｐｐ．２６３−２７６；
及びＴｉｃｅｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ
ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ６，４６−５５
（１９８６）］に検討されている。原則として、たとえ
ばヒト二倍体繊維芽細胞ラインのような任意の細胞ライ
ンをＨＡＶ用の宿主細胞として用いることができ、ただ
しこれはＨＡＶ感染を受けうるものとする。ワクチン製
造用の好適細胞ラインはＭＲＣ−５である。

【００１６】本発明の工業規模の方法は次の工程からな
っている： （ａ）適する培養容器および培地における多量のＡ型肝
炎ウィルス（ＨＡＶ）の培養 これを行なうのに好適な方式は限定はしないが、ワクチ
ン製造に適するヒト二倍体肺細胞における増殖に適する
ようにしたＨＡＶの使用を包含する。ＷＩ３８細胞また
はＭＲＣ−５が許容できる。これら細胞はミクロキャリ
ヤ上で或いはフラスコもしくはローラボトルにおけるセ
ルシート（付着細胞層）として増殖させたものである。
本発明の方法は、たとえば米国特許第４，２９６，２０
４号、第４，４１５，６７０号に記載された或いはさら
にここに記載したヌンク・セル・ファクトリー（NUNC C
ELL FACTORY ）、コスター・キューブ（COSTAR CUBE
S）、静的表面反応器（ＳＳＲ）、または静的ミキサー
反応器のような大表面積のマルチラメラ生物反応器を、
所望の生産規模に応じステンレス鋼、金網、静的表面混
合器にて用いる。たとえば本発明の好適具体例において
は、ＭＲＣ−５細胞を８５，０００ｃｍ² コスター・キ
ューブＳＳＲにて或いはそれよりずっと大きい表面積の
金網ＳＳＲにてセルシートで増殖させ、効率的な細胞培
養感染を達成するのに充分なＨＡＶの複数回の感染（Ｍ
ＯＩ）にて感染させる。約０．０１〜１０のＭＯＩが許
容される。便利には、約２８日間にわたり培養したＳＳ
Ｒの上澄フラクションからのＨＡＶを用いて保存種菌を
得る。

【００１７】好適具体例においては、ＨＡＶをステンレ
ス鋼金網で増殖させたＭＲＣ−５細胞にて培養する（実
施例１４参照）。この具体例によれば、細胞が増殖しう
る適する無毒性材料で作成されたメッシュ部材を用いる
生物反応器が使用される。この種の部材はステンレス
鋼、チタン、プラスチックなどの材料で作成することが
でき、標準三次元配列で設けることができる。好ましく
は、たとえばスルツァー・バイオテク・システムス社か
ら入手しうるような３１６ステンレス鋼メッシュ部材
（特にＳＭＶ、ＳＭＸ、Ｅ−パックＥＸ、ＤＸ、ＢＸ、
ＣＹ）が用いられる。各部材は、細胞が増殖しうるメッ
シュ層の均一列で構成される。標準メッシュワークの各
部材を、無菌反応器系内に互いに０〜９０°の角度で配
向させる。配置は、メッシュ部材を収容すると共に容積
を効率的に使用するようにした線状カラムまたは他の任
意の幾何学的形状とすることができる。次いで細胞をシ
ーディングし、メッシュにより与えられた大表面積に付
着させる。培養物中に細胞が充分確立した後、これらの
栄養交換を維持すると共に廃棄物を除去するのに充分な
灌流速度で供給することができる。適する細胞密度に
て、細胞にはさらに下記するようにしてＨＡＶを感染さ
せる。

【００１８】メッシュ部材の利点は、繊維質ベッドが単
位容積当り大きい表面積を可能にすることである。幾何
学上精密なメッシュは、表面から既知の一定深さまで繊
維芽細胞の均一増殖を可能にして栄養供給の制御を可能
にする。メッシュの均一性はさらに、繊維ネットワーク
を覆うため急速に細胞移動させうる繊維間の接触点を予
測することができる。静的ミキサーの形状は、増殖表面
の相対的な接近を抑制して自然の生物学的増殖および反
応器の「汚染」を回避する。これはランダム充填の床反
応器で遭遇する重大な問題であり、充填の不均一性は細
胞増殖の局部領域をもたらし、次いで栄養物流の損失お
よびその後の細胞飢餓をもたらす。

【００１９】本発明の範囲は、減毒または有毒のいずれ
であっても、ＨＡＶのストレインＣＲ３２６Ｆのパッセ
ージ１８、Ｐ１８、Ｐ２８、Ｐ２９、Ｐ７２の他に、任
意の他のＨＡＶ変種もしくはストレインを包含すること
が了解されよう。減毒された変種もしくはストレインは
細胞、動物における順次の処理により或いは他の方法に
より分離することができる。たとえば文献［Ｐｒｏｖｏ
ｓｔ，Ｐ．Ｊ．等、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｍｅｄ．１７０，８（１９８２）；Ｐｒｏｖｏｓ
ｔ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２
０，１６５（１９８６）：］並びに減毒に関する詳細に
ついては米国特許第４，１６４，５６６号および第５，
０２１，３４８号が参照される。本発明の精製法は、減
毒もしくは有毒のＨＡＶストレインに容易に適用され
る。

【００２０】ＨＡＶはウィルス生産のピークまでＳＳＲ
にて複製させる。減毒された細胞培養に適するＨＡＶの
ストレイン、たとえばＣＲ３２６ＦＰ２８については、
初期のＭＯＩおよび細胞密度に応じて７〜３５日間を要
し、その間に栄養培地をループ中に絶えず循環させてガ
ス交換を与える。細胞培地は、ＭＲＣ−５細胞の活発な
増殖およびＨＡＶ複製を支える任意の媒体とすることが
できる。好ましくは、培地を約０．０１０〜０．３ｍｌ
／ｃｍ² ／日の速度にて補充すると共に除去する。この
速度は、細胞発生速度が培地に対する全露出であるため
柔軟である。

【００２１】たとえば本発明の好適具体例においては、
ＭＲＣ−５細胞を３４０，０００ｃｍ² ＳＳＲ（たとえ
ば８５，０００ｃｍ² の４個の部材を用いる）またはそ
れよりずっと大きい表面積の金網ＳＳＲにてセルシート
で増殖させ、約０．１〜１．０のＨＡＶの複数感染（Ｍ
ＯＩ）にて感染させ、ＨＡＶをウィルス抗原の生産ピー
クまで複製させる。これには約２８日間を要し、その間
に栄養培地を補充すると共に培養容器およびループに循
環させてガス交換を与える。培地はＭＲＣ−５細胞の増
殖もしくは維持およびＨＡＶ複製を支える任意の媒体と
することができる。たとえばウィリアムス・メジウムＥ
のような基礎培地に適する生長因子を補充してなる培地
が好適であると判明した。生長因子の原料としては鉄補
充した子牛血清が好適であることも判明した。

【００２２】（ｂ）培養したＨＡＶの収穫 培養したＨＡＶの収穫方法は、培養容器の形状によって
或る程度支配される。一般に、栄養補給しながら約２８
日間培養した後、培地を抜き取ってＨＡＶを収穫する。
従来、小規模のウィルス増殖にはウィルスを掻き取り、
次いで凍結、解凍および必要に応じ音波処理を行なって
細胞結合したウィルスの放出を最適化させていた。本発
明の方法においては、細胞結合したＨＡＶを最小容積の
収穫溶液に放出させる。好ましくは収穫溶液は、細胞を
ＨＡＶに対し浸透性にするのに効果的な成分を含有す
る。この種の成分は当業界にて公知である。好ましく
は、たとえばトリトンＸ−１００、ＮＰ−４０などの洗
剤を、その後の除去を容易化させるため最小可能な有効
濃度で供給する。約０．０５〜０．５％、好ましくは
０．１％のトリトンＸ−１００の供給にてヌンク・セル
・ファクトリー、コスター・キューブまたは他の任意の
セルシート培養にて培養された細胞から効率的なＨＡＶ
の抽出を達成するのに充分であると判明した。特にたと
えばコスター・キューブのようなＳＳＲからの洗剤抽出
を用いる利点は、通常は培養上澄に存在するＨＡＶを抜
き取ってＨＡＶを濃縮しかつ回収しうるだけで、培養容
器の形状が機械的手段による収穫を可能にしないことで
ある。しかしながら、培養上澄液に存在するＨＡＶの比
率は一般に、細胞から回収しうる全ＨＡＶの小割合に過
ぎない。培養細胞からのＨＡＶの洗剤収穫は極めて効率
的である。

【００２３】（ｃ）収穫したＨＡＶの処理 ＨＡＶが実質的に細胞フリーの形態で培養上澄液、細胞
またはその両者から収穫された後、ＨＡＶを濃縮してそ
の後の処理および精製を容易化させることが望ましい。
ＨＡＶが機械的手段により収穫されて極く少量の物質が
精製される従来技術のＨＡＶの精製方法においては、Ｈ
ＡＶをたとえば塩化メチレンまたは塩化メチレン：イソ
アミルアルコール（２４：１、ｖ／ｖ）のような有機試
薬で抽出し、次いで水相をたとえばポリエチレングリコ
ールのような水溶性の合成ポリマーを添加して濃縮し
た。今回、添加物質を精製された生成物にて微量も検出
しえない点まで除去すれば、全ＨＡＶワクチンの工業規
模の製造方法に洗剤および外生酵素を用いうることが突
き止められた。

【００２４】本発明の１具体例においては、たとえばＨ
ＡＶ収穫に用いるトリトンＸ−１００のような洗剤を濃
縮／透析濾過によって除去し、次いで残留洗剤をたとえ
ばＸＡＤのようなアンバライト非イオン型高分子吸着剤
で除去する。約１０μｇ／ｍｌまでのトリトンＸ−１０
０の除去を示す有用な方法が文献［Ｈｕｒｎｉ，Ｗ．
Ｍ．およびＭｉｌｌｅｒ Ｗ．Ｊ．［Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５５９，３３７
−３４３（１９９１）］に報告されている。ＨＡＶ収穫
で用いた洗剤は、本発明によるこの具体例の生成物に
て、この分析により検出できない。さらに、他の多くの
汚染物を除去して部分精製されたＨＡＶ生成物を与え
る。

【００２５】本発明の他の具体例においては、濃縮／透
析濾過でなく、洗剤収穫の後にＸＡＤ処理とヌクレアー
ゼ処理とを行ない、次いで陰イオン交換捕獲工程を用い
て濃縮する。

【００２６】この具体例においては、好ましくは非特異
性、高特異活性および高均質のヌクレアーゼが使用され
る。非特異性はＤＮＡおよびＲＮＡの両者の切断を確保
し、酵素の均質性は他の蛋白汚染物の添加なしに一種の
酵素のみが添加されるよう確保する。さらに本発明の方
法においては、洗剤収穫されたＨＡＶに対し直接添加し
うるようヌクレアーゼを洗剤耐性にすることが好まし
い。多数のヌクレアーゼがこれら基準を満たしうる。し
かしながら、ニコメド・ファルマＡ／Ｓ社（デンマー
ク）により組換蛋白として製造されたベンゾナーゼがこ
の目的に特に好適であると判明した。収穫ＨＡＶに対し
て０．１〜１００μｇ／リットル、好ましくは約１０μ
ｇ／リットルの添加が、汚染性遊離核酸を除去するのに
許容しうると判明した。

【００２７】最少量の酵素の添加が、その後の処理工程
における酵素の除去を容易化させて検出しえないレベル
の残留酵素（約１０ｐｇ／ｍｌ未満）を有する生成物を
得るのに重要である。

【００２８】ヌクレアーゼ処理は比較的薄い溶液で行な
われるので、薄い（９０〜１５０ｍＭ）塩溶液にて陰イ
オン交換クロマトグラフィーによりＨＡＶを捕獲し、次
いで約１．５カラム容積のより高イオン強度（≧約０．
３Ｍ）の溶液を段階的に添加してＨＡＶを溶出させるの
が便利であると判明した。ＨＡＶはこの捕獲工程により
実質的に濃縮され、さらに洗剤、ベンゾナーゼの大部分
および他の多くの汚染物はカラムから流出する。したが
って、捕獲カラムから溶出するＨＡＶは部分的に精製さ
れる。当業界で知られた多数のイオン交換樹脂をこの工
程に用いることができ、たとえばＥＰＯ−４６８７０２
Ａ２号に記載されたものを包含する。この目的に特に好
適な樹脂はＤＥＡＥ トヨパール６５０Ｍ（トソハー
ス）であることを突き止めた。

【００２９】（ｄ）ＨＡＶ濃縮 ＨＡＶ収穫および濃縮／透析濾過／ＸＡＤもしくはヌク
レアーゼ処理／捕獲の後、ＨＡＶを蛋白を濃縮するのに
有効な水溶性の合成ポリマーで濃縮する。約２，０００
〜１２，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）がこの目的に効果的である。典型
的には、ＮａＣｌを部分精製されたＨＡＶに約１５０〜
５００ｍＭの最終濃度まで添加する。次いでＰＥＧを約
２〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約４％の最終濃度ま
で添加する。得られた４％ＰＥＧ沈澱の部分精製された
ＨＡＶを遠心分離し、上澄液を捨て、ペレットをさらに
処理すべく再懸濁させる。主たる汚染物は、この工程で
捨てた上澄液にて除去されることが突き止められた。プ
ロテアーゼの除去は、残余の精製によりＨＡＶ生成物の
収率、安定性および純度を向上させる。再懸濁したＰＥ
Ｇペレットを必要に応じ音波処理して、下記する有機抽
出の前に溶解性を促進する。

【００３０】（ｅ）有機抽出 上記からの再懸濁したＰＥＧペレットを、１〜６個の炭
素原子を有するたとえば塩化メチレン、クロロホルム、
テトラクロルエタンなどのハロゲン化低級アルカンと、
たとえばイソアミルアルコールのような消泡剤との混合
物を添加して抽出する。ハロゲン化低級アルカンと消泡
剤との容量：容量の比は約１５：１〜５０：１であり、
好ましくは約２０：１〜３０：１である。この有機抽出
は最終ＨＡＶ生成物の純度を相当増大させることが突き
止められた。この工程における有機抽出には塩化メチレ
ンよりもクロロホルムが優れている。

【００３１】この抽出は、各種汚染物の中でも脂質およ
び脂質様物質を除去する。したがって、再懸濁したＰＥ
Ｇペレットを燐酸塩緩衝塩水、トリス、炭酸塩、重炭酸
塩もしくは酢酸塩緩衝剤を包含する各種の緩衝剤の１種
で希釈する。ＨＡＶカプシドは弱酸性条件下にて安定で
あるため、弱酸性ｐＨ範囲の緩衝剤が許容される。１種
の好適緩衝剤は［ＴＮＥ（１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）］である。トリス−ＨＣｌの代りに燐酸塩も使用
することができる。

【００３２】好ましくは、再懸濁したＰＥＧペレットを
クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１、ｖ／
ｖ）の添加により約０．５：１〜３：１の有機／水相の
比にて激しく回動しながら有機抽出する。次いで、この
抽出物を４，０００ＸＧにて２０℃で１０分間にわたり
遠心分離することにより清澄させる。水相を保存し、界
面および有機相を初期試料容積の約０．３〜０．６に等
しい容積のＴＮＥもしくは均等な緩衝剤で再抽出し、両
水相を合して抽出ＰＥＧペレットを得る。

【００３３】この溶剤抽出工程は、界面にて蛋白不純物
を沈澱させると共に脂質を溶剤相に抽出することにより
Ａ型肝炎の精製工程にて重要な役割を演ずる。製造保証
ロットでこの抽出により達成される相当な精製が図１７
におけるＨＰＳＥＣクロマトグラムから見られ、２３分
時点の不純物ピークはこの工程における不純物除去を検
討するための有用な指標となる。これに対し、より小規
模のパイロット試験においては、このピークのかなりの
部分が抽出生成物にも保持されていた（図１８）。規模
拡大に際し、この工程を理解しかつ制御すべく数種の変
動要因を検討した。すなわち溶剤と水との容積比、浸透
の種類、混合時間および混合強度を幾つかのチューブ寸
法およびボトル寸法で試験した（実施例１５参照）。

【００３４】（ｆ）イオン交換クロマトグラフィー 上記からの抽出物を樹脂、ゲルもしくはマトリックスに
おける陰イオン交換クロマトグラフィーにかける。典型
的な陰イオン交換マトリックスは限定はしないが次のも
のを包含する： ＤＥＡＥセルロース； ＤＥＡＥアガロース； ＤＥＡＥバイオゲル； ＤＥＡＥデキストラン； ＤＥＡＥセファデックス； ＤＥＡＥセファロース； アミノヘキシルセファロース； エクテオラセルロース； ＴＥＡＥセルロース； ＱＡＥセルロース； モノ−Ｑ；または ベンゾイル化ジエチルアミノエチルセルロース。

【００３５】１種の好適な陰イオン交換マトリックスは
ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（トソハース）である。イ
オン交換クロマトグラフィーに関する背景となる一般的
情報は、たとえば次の文献［Ｅ．Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｏ
ｎ，“ＣｅｌｌｕｌｏｓｉｃＩｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ
ｒｓ”ｉｎ Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．等、Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｐａｒｔ ＩＩ，ｐａｇｅｓ
２２３以降、Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ １９７０］
に見ることができる。

【００３６】有機抽出した再懸濁ＰＥＧペレットを必要
に応じ１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．
５）または均等な緩衝液で希釈し、必要ならばＮａＣｌ
を添加して約０．３Ｍ〜約０．３５ＭのＮａＣｌ濃度に
することにより、汚染性の遊離核酸を除去する。ＨＡＶ
はこれら条件下で濾過モードにてカラムを通過する。し
かしながらＨＡＶ調製物を予めヌクレアーゼで処理した
場合には、有機抽出物を０．１Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣ
ｌとする。次の工程の関係からすれば０．１２ＭのＮａ
Ｃｌが好適である。

【００３７】上記ＮａＣｌのモル濃度にてＨＡＶカプシ
ドは陰イオン交換マトリックスに付着する一方、たとえ
ば炭水化物のような或る種の残留汚染物はマトリックス
を通過する。カラムをカラムの数倍容積の０．１２Ｍ
ＮａＣｌで洗浄して、残留汚染物をさらに除去する。次
いでＨＡＶカプシドを約１カラム容積プラス初期試料容
積の０．３５Ｍ ＮａＣｌにより陰イオン交換カラムか
ら溶出させる。代案として好ましくは、ＨＡＶを約１Ｍ
までのＮａＣｌもしくは均等の塩の濃度勾配溶出によっ
て溶出させる。この際、ＨＡＶは約０．３Ｍ ＮａＣｌ
にて溶出する。

【００３８】（ｇ）ゲル濾過 ゲル濾過クロマトグラフィーの最終工程を陰イオン交換
クロマトグラフィーに続いて行なう。典型的にはセファ
ロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社）を用いるが、他の
多くの種類のゲル濾過マトリックスを代用することもで
きる。たとえば文献［Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｌ．，“Ｇｅｌ
Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ”ｉｎ Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．等、Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８０）］が参照される。サ
イズ・エクスクルージョン・クロマトグラフィーをこの
工程にてＨＡＶの精製に適用する特に好適な方法を見出
だした。これは、できるだけ少試料容積の陰イオン交換
精製されたＨＡＶをトヨパールＨＷ５５ＳおよびＨＷ６
５Ｓの直列カラムで溶出させることからなっている。

【００３９】陰イオン交換に続くゲル濾過のクロマトグ
ラフ工程の特定順序が本発明におけるＨＡＶカプシドの
精製につき典型的な方式であるが、この順序は変化させ
うることが了解されよう。たとえばゲル濾過を陰イオン
交換工程に先行させることもできる。前者の順序が好適
であると判明した。

【００４０】（ｈ）ＨＡＶ沈澱 ウィルスの溶解性に関しＨＡＶの大規模製造の過程にお
ける全く予想外の知見が、本発明で製造される多量のＨ
ＡＶの結果として生じた。ＨＡＶをイオン交換カラムか
ら溶出させる０．２５〜０．３Ｍの塩濃度にて、ウィル
スの沈澱はＨＡＶ濃度が約１０〜２０μｇ／ｍｌより高
ければ生ずることを突き止めた。

【００４１】これは、クロロホルム抽出された水相（Ａ
ＱＸ）およびサイズ・エクスクルージョン生成物（ＳＥ
Ｃ）が４℃での貯蔵に際し極めて安定であることを示し
た代表的試料のＨＰＳＥＣ分析により突き止められた
が、陰イオン交換生成物（ＩＥＸ）は４℃での貯蔵に際
しＡ型肝炎の顕著な損失を示した。

【００４２】この知見を確認するため、第２群の試料に
より安定性試験を開始した。ＡＱＸ、ＩＥＸ生成物、並
びにＳＥＣ生成物をそれぞれ発生の直後にＨＰＳＥＣに
より分析した（３反復）。次いでＡ型肝炎濃度を、得ら
れたピーク面積とＳＥＣのＡ型肝炎検量標準との比較に
より決定した。さらに、ＩＥＸ生成物の１部を１：５に
て燐酸塩緩衝塩水（０．１２Ｍ ＮａＣｌ、６ｍＭ燐酸
ナトリウム、ｐＨ７．２）で希釈し、直ちに定量した。
４℃におけるこれら４種の試料の安定性を数日間にわた
りＨＰＳＥＣで監視した。

【００４３】これらＡ型肝炎の精製工程試料の数種につ
き初期のＡ型肝炎濃度と４〜５日後に得られた数値とを
下記に示す。

【００４４】 試料 初期Ａ型肝炎 ４日目のＡ型肝炎 濃度（ｕｇ／ｍｌ） 濃度（ｕｇ／ｍｌ） ＡＱＸ ２３ ２１ ＩＥＸ生成物 ５９ ５０ １：５で希釈したＩＥＸ生成物 １２ １０ ＳＥＣ生成物 １２ １２ 中間時点を含む完全な結果を図２６に示す。

【００４５】最初のロットにつき見られるように、ＩＥ
Ｘ生成物はＡ型肝炎の顕著な損失を示し、約２５％の損
失が１晩の貯蔵で生じた（Ａ型肝炎濃度は５９μｇ／ｍ
ｌから４５μｇ／ｍｌまで低下した）。

【００４６】希釈したＩＥＸ生成物およびＡＱＸ生成物
はずっと高い安定性を示し、最初の１００時間の貯蔵に
てＡ型肝炎の損失は約１０％に過ぎなかった。ＳＥＣ生
成物は最初のロットにつき得られたとほぼ同じ結果であ
ってＡ型肝炎の損失を示さなかった。

【００４７】これら２種のロット間における１つの相違
点は、第２ロツトでは眼に見える沈殿物が生じたことで
ある。沈殿物の存在は、ＳＥＣ工程に先立ち全ＩＥＸ生
成物の遠心分離を必要とする。この遠心分離は沈澱Ａ型
肝炎の大きい損失をもたらした。遠心分離後の濃度は２
９μｇ／ｍｌであった。ＨＰＳＥＣデータから計算した
収率の表を下記に示す。

【００４８】 サンプリング後の 試料 Ａ型肝炎の全ｍｇ数 工程収率 Ａ型肝炎のｍｇ数 ＡＱＸ生成物 １２．９ １１．７ ＩＥＸ生成物 １２．３（初期量）１０５％ ８．７ 遠心分離したＩＥＸ生成物 ４．２ ４８％ ４．２ ＳＥＣ生成物 ２．０ ４９％ １．４ 予想外に低いＳＥＣ収率は、凝集もしくは沈澱がＳＥＣ
カラムで生じうることを示唆した。事実、ＨＰＳＥＣに
より或る程度の凝集が観察された。より小さい組の直列
ＳＥＣカラムでクロマトグラフにかけた（製造ＩＥＸを
終了した直後）７ｍｌのＩＥＸ生成物の試料は７１％の
Ａ型肝炎回収率を示し、これはこの工程につき典型的で
ある。この試料は遠心分離に際しＡ型肝炎の損失を受け
なかったので（沈澱しなかったので）、７１％の収率は
ＩＥＸからＳＥＣ生成物まで進行する際に生産規模で得
られる収率の約３倍である。より小規模の直列ＳＥＣ
は、より高い収率の原因となるずっと高い希釈ファクタ
を与えた。

【００４９】ＨＰＳＥＣによるウィルスの損失と一致す
るこれらロットの精製に際し観察された沈殿物は、低イ
オン強度の水溶液（たとえば６ｍＭ燐酸ナトリウム）に
可溶性であって沈澱が可逆的であると予想外に判明し
た。６ｍＭの燐酸ナトリウムを添加して急速な溶解を与
えることにより、沈殿物を再溶解させた。これに対し、
６ｍＭの燐酸ナトリウムを含む１２０ｍＭの塩化ナトリ
ウムまたは高イオン強度の溶液における沈殿物の再懸濁
は殆ど変化を与えなかった。ＨＰＳＥＣ保持時間に基づ
き、６ｍＭ燐酸ナトリウムに溶解した沈殿物はモノマー
Ａ型肝炎と同一寸法であったのに対し、銀染色したＳＤ
Ｓ−Ｐａｇｅは溶解沈殿物が最終ＳＥＣ生成物に見られ
る同一の蛋白バンドを有することを示した。このデータ
に基づきＡ型肝炎の精製を、沈殿物の損失を防止すべく
イオン交換生成物の希釈を含むよう改変し（実施例１６
参照）、１：１の希釈が塩濃度を約０．１５Ｍもしくは
それ以下にするようにした。さらに約２０μｇ／ｍｌ未
満のＨＡＶ濃度を得ることも望ましい。

【００５０】（ｉ）ＨＰＳＥＣコンシステンシー分析 Ａ型肝炎精製工程からの試料におけるＡ型肝炎濃度およ
び不純物レベルを定量するため高性能サイズ・エクスク
ルージョン・クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）分析を
開発した。

【００５１】本発明にしたがって作成した全部で１４ロ
ットからのＡ型肝炎処理試料を分析した。得られたデー
タベースを用いて各精製工程につきＡ型肝炎レベルおよ
び汚染物プロフィルを特性化した。ＨＰＳＥＣ分析条
件、分析の精度を示す確認データ、ＨＰＳＥＣデータと
ＥＩＡデータとの比較、および１０ロットのＨＰＳＥＣ
分析からの結果を実施例１７および図２９〜４６に示
す。

【００５２】（ｊ）ワクチンの失活および処方 慣用かつ周知の性質を有する他の処理工程が、ワクチン
用途のための精製ＨＡＶカプシドを作成するのに必要と
される。たとえばホルマリンでの処理、無菌濾過、およ
びキャリヤもしくはアジュバントに対する吸着がホルマ
リン失活ワクチンを作成するための典型的な基本工程で
ある。たとえば文献［Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｐ．Ｊ．等、Ｐ
ｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１６０，
２１３（１９７９）；Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｐ．Ｊ．等、
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１９，２３（１９８６）］が
参照される。ＨＡＶは熱、ｐＨ変化、照射、たとえばホ
ルマリンもしくはパラホルムアルデヒドのような有機溶
剤での処理によって失活させることができる。典型的に
は、ＨＡＶ失活は１／４０００のホルマリンの比にて行
なわれる。ホリマリン失活は標準濃度の４倍にて急速か
つ効率的に進行し、１／１０００のホルマリン濃度は免
疫性に悪影響を与えずに失活時間を４分の１に短縮す
る。次いで、失活したＨＡＶを水酸化アルミニウムに吸
着させ或いはこれと共沈させてアジュバントおよびキャ
リヤ効果を与える。

【００５３】この生成物の免疫学的効果に必要な投与量
は極めて低いので、失活ＨＡＶをキャリヤに複合化させ
或いは吸着させるのが便利である。この目的には、ＨＡ
Ｖとの緊密な錯体を形成すると共に容器壁部に対するウ
ィルスの損失を防止するため、水酸化アルミニウムが極
めて好適であると判明した。

【００５４】したがって本発明は、９５％より高いＨＡ
Ｖ蛋白純度を有するＡ型肝炎ウィルスを製造するに際
し： （ａ）Ａ型肝炎ウィルスを大表面積の静的表面反応器に
てセルシートで多量に培養し； （ｂ）Ａ型肝炎ウィルスを細胞培養物から、Ａ型肝炎ウ
ィルスがセルシート培養物の実質的除去、溶解もしくは
破壊なしにセルシートから放出されるようにセルシート
へ洗剤を浸透させて除去し； （ｃ）必要に応じこの段階にて非Ａ型肝炎ウィルス特異
性核酸を核酸のヌクレアーゼ処理またはイオン交換吸着
のいずれかにより収穫ＨＡＶから除去し； （ｄ）細胞培養物から除去されたＡ型肝炎ウィルスを膜
および透析濾過により或いはイオン交換での捕獲により
濃縮し； （ｅ）残留の非Ａ型肝炎ウィルス特異性蛋白を工程
（ｄ）の濃縮Ａ型肝炎ウィルスから有機抽出とＰＥＧ沈
澱とイオン交換との組合せ［工程（ｃ）にて予め完結し
ていなければ汚染性核酸の除去を含む］によって除去
し、次いで最終仕上工程としてゲル透過クロマトグラフ
ィーにかけ； （ｆ）精製されたＡ型肝炎ウィルスを工程（ｅ）から回
収する 工程からなる産業規模のＡ型肝炎ウィルスの製造方法を
開示する。

【００５５】本発明の好適具体例において、失活Ａ型肝
炎ウィルスワクチンの工業規模の製造方法は： （ａ）多量のＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）を、ＭＲＣ−
５細胞のセルシートが中実ステンレス鋼、チタンもしく
はチタン−ステンレス鋼メッシュの標準列で確立された
ヌンク・セル・ファクトリース、コスター・キューブス
またはずっと大表面積の静的表面生物反応器にて培養
し； （ｂ）培地を除去すると共に約０．０５〜０．５％、好
ましくは０．１％のトリトンＸ−１００を含有する収穫
溶液を添加して培養ＨＡＶを収穫し； （ｃ）収穫したＨＡＶをヌクレアーゼで処理して汚染性
の細胞核酸を消化させ； （ｄ）イオン交換カラムに捕獲すると共に捕獲されたＨ
ＡＶを約０．３５ＭのＮａＣｌで溶出させ、次いでポリ
エチレングリコールで沈澱させることにより、ヌクレア
ーゼ処理されたＨＡＶを濃縮し； （ｅ）濃縮したＨＡＶをクロロホルム／イソアミルアル
コール（２４：１、ｖ／ｖ）で激しく撹拌しながら抽出
すると共に水相を分離保持し； （ｆ）有機抽出からの水相を約０．１２Ｍ ＮａＣｌに
てイオン交換マトリックでクロマトグラフにかけ、ＨＡ
Ｖを高ＮａＣｌ濃度までの濃度勾配（１Ｍにて充分であ
る）で溶出させ、その直後に溶出ＨＡＶの保存物を約
０．１５Ｍもしくはそれ以下の塩濃度および好ましくは
約２０μｇ／ｍｌもしくはそれ以下のＨＡＶ濃度まで希
釈し； （ｇ）イオン交換から溶出されたＨＡＶをサイズ・エク
スクルージョン・クロマトグラフ樹脂、好ましくはトヨ
パールＨＷ５５ＳおよびＨＷ６５Ｓの直列配置にてクロ
マトグラフにかけ、ここでＨＡＶはマトリックスの内部
容積に導入し； （ｈ）ゲル濾過されたＨＡＶを１／１０００のホルマリ
ンでの処理により失活させ、次いで無菌濾過、水酸化ア
ルミニウムとの共沈および１回投与当り約２５〜１００
ｎｇの失活された精製ＨＡＶに均等な単位投与量への配
分を行なう工程からなっている。

【００５６】本発明で得られるＨＡＶは高度に精製さ
れ、極めて抗原性である。この生成物はＡ型肝炎ウィル
スの精製調製物であって、蛋白の９５％より多くがＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥおよび銀染色分析に基づきＡ型肝炎ウィル
ス特異性であると共に、調製物の量の０．１％未満が非
ＨＡＶ核酸であり、４％未満が脂質である。加水分解し
た生成物の試料でグルコースとして検出しうる炭水化物
の量は、存在する蛋白の量の約０〜２００％であり、非
グルコース炭水化物は蛋白量の１５％未満で存在する。
好適具体例において、グルコースおよび非グルコース炭
水化物（たとえばリボース）は蛋白量の約２０％未満で
存在する。調製物は、ホルマリン失活した場合にもその
抗原性を保持する。

【００５７】保護免疫反応を説明するには少量の失活ウ
ィルスにて充分である。好ましくは、２５〜１００ｎｇ
の量を高度の抗−ＨＡＶ免疫反応を促進すべく必要に応
じ数か月にわたって１回、２回もしくは３回投与する。

【００５８】Ａ型肝炎ウィルスの精製調製物は下記する
特性を有し、各特性は蛋白μｇ当りの基準で示される。
括弧内の方法を、特性を決定すべく用いた。

【００５９】（ａ）脂質含有量（ガスクロマトグラフィ
ー） ＜０．１μｇ （ｂ）グルコースとして検出された炭水化物 ＜０．
１〜２．５μｇ （ＴＦＡ加水分解、ジオネックス） （ｃ）非グルコース炭水化物 ＜０．
２μｇ （ＴＦＡ加水分解、ジオネックス） （ｄ）Ａ型肝炎ウィルス特異性蛋白 ＞０．
９５μｇ （アミノ酸分析およびウエスタンブロット） （ｅ）Ａ型肝炎ウィルス特異性ＲＮＡ ０．１
〜０．２μｇ （ｆ）汚染性ＤＮＡ ＜０．
０００４μｇ。

【００６０】精製物における主としてグルコースよりな
る炭水化物成分の存在は、失活したアジュバントワクチ
ンの耐性、免疫性および保護効果に関し有意でないと思
われる。しかしながら、非グルコース炭水化物（恐らく
ＨＡＶ特異性ＲＮＡの分解から生ずるリボース）のレベ
ルは生成物中に極めて低いことが重要である。ここに記
載した特性を規定することは、適切な分析を行ないうる
よう充分多量の生成物を製造しうる方法が開発されて以
来、初めて可能になったことに注目することも重要であ
る。

【００６１】本発明の特定の１処方において、Ａ型肝炎
ウィルスワクチンは２５〜１００単位／０．１〜１ｍｌ
投与量につき次の公称組成を有する：

【００６２】

【表３】 他の特定処方において、Ａ型肝炎ウィルスワクチンは２
５単位／０．５ｍｌ投与量につき次の公称組成を有す
る：

【００６３】

【表４】 本発明の精製された失活Ａ型肝炎ウィルスは、アミノ酸
分析により特性化された比較標準に対しＥＩＡ分析に基
づき２５ｎｇ（上記処方の１種の２５単位量に相当）試
料を投与した際に、感染を予防するのに効果的であるこ
とが判明した。ワクチンに関連すると考えうる重大な悪
影響は健康な成人、未成年または子供にて全く観察され
ない。６〜５０単位の範囲の量が成人、未成年および子
供に投与される。成人における一層迅速かつ高い免疫変
換率が投与量を増加するにつれ観察された。この現象は
子供においてはあまり顕著でない。

【００６４】１回の２５単位量にて１か月の後、成人
（≧１８歳）の８３％並びに子供および未成年（２〜１
７歳）の９７％が血清変換した。２週間離して２５単位
を２回投与すると、成人にて９３％まで血清変換率が増
大した。第２回もしくは第３回の２５単位投与の後７か
月の血清変換率は両年齢群にて９９％より高い血清変換
を与える。血清陽性の持続は両年齢群にて１２か月およ
び３６か月まで約１００％である。すなわち１回の２５
単位投与にて免疫化の１か月以内に接種者の少なくとも
８０％で血清変換を達成するのに充分であることは明瞭
である。より多量による免疫化は、より高い接種者の比
率で血清変換を与える。

【００６５】２５ｎｇの投与量に基づき、単一のコスタ
ー・キューブを本発明の方法により収穫して約５，００
０〜１０，０００回分もしくはそれ以上を得ることがで
きる。さらに、この方法は数個のコスター・キューブを
同時に収穫すると共に処理するためにも推奨される。表
面積を増大させるための金網を用いた或いは用いない１
回のＳＳＲは、１回の製造で顕著に多数の投与量を与え
る。

【００６６】

【実施例】以下、限定はしないが特定実施例により本発
明をさらに説明する。

【００６７】実施例１ Ａ型肝炎ウィルス保存シードの製造 ウィルスシードを製造するための大規模な手順は、６０
００ｃｍ² のヌンク・セル・ファクトリースにおけるＭ
ＲＣ−５細胞単層の感染を含む。ＭＲＣ−５細胞をファ
クトリーで増殖させて単層に融合させ、次いで約０．１
のＭＯＩにてウィルスを感染させる。感染の後、細胞を
１週間毎に１０％ｖ／ｖの胎児牛血清を含有する培地で
置換して２８日間にわたり培養する。高濃度の血清（２
〜１０％ｖ／ｖ）は、低レベル（０．５〜２％ｖ／ｖ）
よりも大きいウィルス生産を可能にすることが判明し
た。このサイクルが終了した後、上澄液は多量（この実
施例では１ｍｌ当り１０^7.3 ＴＣＩＤ₅₀）の感染性ウィ
ルスを含有し、これを細胞溶解なしにＮＣＦから直接に
収穫し、ウィルス保存シード源として使用する。このよ
うにして製造に必要な多量の感染性ウィルスが、ローラ
ボトルもしくはフラスコよりも再現性のある便利な大規
模の方法により或いは細胞の機械的収穫により得られ
る。

【００６８】実施例２ ワクチン製造の規模拡大 相ＩＩＩの臨床試験を支持するため、実験室過程の規模
拡大がＡ型肝炎ワクチンの製造につき重要な考慮となっ
た。製造工程まで規模拡大を容易化するため、ＨＡＶに
つき従来公知の増殖および精製工程に対する改変が必要
とされた。細胞増殖の主たる２つの方法、すなわちヌン
ク・セル・ファクトリースおよび静的表面反応器、たと
えばコスター・キューブを使用した。この実施例はヌン
ク・セル・ファクトリー法を説明する。実施例３はコス
ター・キューブＳＳＲ法を説明する。

【００６９】モンロー効果試験に使用したヌンク・セル
・ファクトリース 従来可能であったよりも多量の減毒Ａ型肝炎ウィルスを
生産させる、改善された規模拡大を可能にする改良方法
を開発した。これは、先ず最初に標準的ローラボトルの
代りにヌンク・セル・ファクトリース（ＮＣＦ）を用い
て達成された。ヌンク・セル・ファクトリー（ＮＣＦ）
の基礎ユニットは６００ｃｍ² の培養面積を有するトレ
ーである。ＮＣＦを構成するトレーをポリスチレンから
作成し、最適な細胞付着および拡大のため処理した［Ｍ
ａｒｏｕｄａｓ，１９７６，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．５１１−５２０］。ここに
記載した１０枚のトレーユニットは６，０００ｃｍ² の
全表面積を有する１０枚の同一の培養ユニット（トレ
ー）を有する。２つの隅部には特殊設計の開口部を設け
て、複数層としたトレーを相互接続するための垂直チュ
ーブを形成する。これら垂直チューブは、空気フィルタ
と特殊設計のテフロンコネクタとを収容する２個のアダ
プタに通ずる。ユニットは全て照射により滅菌し、製造
業者により直ちに使用しうるようにして供給された。

【００７０】ＮＣＦにおけるＭＲＣ−５細胞の環境は、
ローラボトルで得られる環境と極めて類似する。細胞を
静的培養で増殖させると共に、これら細胞を液体媒地で
覆われた固体基質に付着させ、栄養物と酸素との細胞に
対する供給は拡散によって行なう。ＮＣＦの使用は、操
作の再現性を向上させると共にローラボトルでの製造に
使用する条件を模倣する。しかしながら、収穫およびそ
の後の処理工程は下記するように異なる。

【００７１】実施例３ 工業規模の製造法に用いたコスター・キューブ静的表面
反応器 １反応器当りできるだけ大きい表面積を得ると共に生物
反応器全体にわたり良好な環境制御を可能にすべく、さ
らに規模拡大試験を行なった。ヌンク・セル・ファクト
リースはこの試験に対し部分的解決を与えた。より良好
な解決がコスター・キューブおよび静的ミキサーの静的
表面反応器（ＳＳＲ）によって得られた。前者は滅菌し
うるプラスチックキューブにおける密充填ポリスチレン
プラスチックシートで構成する（コスターＣＳ２００
０）。全部で８５，０００ｃｍ² の可使増殖表面が単一
キューブで得られる（１０枚トレーのヌンク・セル・フ
ァクトリーの６，０００ｃｍ² と対比）。米国特許第
４，２９６，２０４号および第４，４１５，６７０号に
記載された後者の反応器においては、金属、セラミッ
ク、ガラスもしくはプラスチックの静的混合部材が密充
填増殖表面を形成する。これら部材を、大規模製造法の
ための単一反応器におけるコスター・キューブよりも大
きい表面積を与えるよう加工すると共に配置することが
できる。ＨＡＶは両種類の反応器で培養することに成功
した。ＳＳＲは培地循環と通気装置を介する栄養物の補
充とを可能にする循環ループを備えて、培地におけるｐ
Ｈおよび溶存ガスレベルを制御し、培養物の酸素要求を
満し、かつ培地灌流を達成する。この最適化は、ローラ
ボトルまたはＮＣＦでは可能でない。さらに、多量の重
要な原料の利用性を改善すべく培地変化を行なった。鉄
補充の牛血清［Ｃａｔ．Ａ−２１５１，Ｈｙｃｌｏｎｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，
ＵＴ又は相当品］を用いて胎児牛血清の代用に成功し
た。

【００７２】実施例４ ヌンク・セル・ファクトリースまた静的表面反応器から
のトリトン溶解によるＡ型肝炎ウィルスの収穫 機械的に掻取ってＭＲＣ−５感染セルシートを遊離させ
るのは、ヌンク・セル・ファクトリーでも静的表面反応
器でも推奨できない。細胞結合したＡ型肝炎ウィルスを
トリトン細胞溶解により効率的に回収すると共に、新規
な方法を用いて精製した。トリトン溶解法で得られた溶
液は、ローラボトルの機械的掻取りで得られる調製物よ
りも稀薄であった。トリトン収穫物を透析濾過によって
濃縮し、次いで吸着剤ＸＡＤで処理して残留トリトンを
除去した。１０μｇ／ｍｌ未満までのトリトンの浄化
が、工程内の毛細管ゾーン電気泳動分析で示された。次
いでＨＡＶをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で沈澱
させ、クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し
た。汚染性ＤＮＡをＤＮＡフィルタカラムで除去し、次
いで陰イオン交換およびサイズ・エクスクルージョン・
クロマトグラフィーを行なった。ＮＣＦ増殖とトリトン
溶解との両者を含む工程は、精製されたホルマリン失活
のＡ型肝炎ウィルスの免疫性に悪影響を与えなかった。

【００７３】実施例５ ヌクレアーゼ処理および捕獲クロマトグラフィー この方法の規模、生産性および信頼性をエンドヌクレア
ーゼでのトリトン収穫物の処理に続くウィルスを濃縮す
るための陰イオン交換クロマトグラフィーでの捕獲によ
って増大させた（図１参照）。この改変により、濃縮／
透析濾過工程とＸＡＤ処理とＤＮＡフィルターカラムが
不要となった。

【００７４】ＲＮＡとＤＮＡとの両者に対し活性である
非特異性エンドヌクレアーゼを選択した。このエンドヌ
クレアーゼであるベンゾナーゼはセラチア・マルセッセ
ンス（Serratia marcescens ）から分離し、大腸菌でク
ローン化させた。これは極めて高純度の充分特性化され
た組換蛋白としてニコメド・ファルマＡ／Ｓ社（デンマ
ーク）により製造される。この特定のエンドヌクレアー
ゼを選択した理由は、１つには極めて高い比活性を有す
ると共に極めて少量（１０ｍｃｇベンゾナーゼ／リット
ル収穫物）にて粗製トリトン収穫物に直接添加しうるか
らである。ベンゾナーゼ特異性蛋白のためのウエスタン
ブロットおよび酵素活性のための速度分析を用いる試験
法を開発して、精製工程による酵素の除去を測定した。
添加エンドヌクレアーゼ活性の大部分（＞９０％）が陰
イオン交換クロマトグラフィー捕獲工程の洗液および流
過液フラクションにつき認めることができる（下記）。
ベンゾナーゼ量は捕獲カラム生成物にて１００分の一以
下に減少した。

【００７５】実施例６ 追加工程 （ａ）捕獲工程 Ａ型肝炎ウィルスを、ヌクレアーゼ処理されたトリトン
収穫物から陰イオン交換カラムにて低イオン強度で充填
すると共に燐酸塩緩衝液における０．３５〜０．５Ｍ塩
化ナトリウムでの段階的溶出により濃縮する。Ａ型肝炎
ウィルスはこの捕獲工程により３０倍に濃縮され、トリ
トンを工程内ＣＺＥ分析により測定して検出しえないレ
ベルまで減少させる。

【００７６】（ｂ）ＰＥＧ沈澱およびクロロホルム抽出 濃縮／透析濾過／ＸＡＤからのＡ型肝炎ウィルスまたは
捕獲カラムから溶出されたものをポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）で沈澱させる。適切な条件下でこの工程は
極めて選択性であり、ウィルスと共に同時精製する主た
る汚染物は可溶性に留まって上澄分として捨てられる。
ウィルスを含有するＰＥＧ沈殿物を再懸濁させ、次いで
クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽
出して水相と有機相との界面に残るクロロホルムにより
変性された可溶性脂質および蛋白を除去する。

【００７７】（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーお
よびサイズ・エクスクルージョン・クロマトグラフィー クロロホルム抽出工程の水性抽出物を低塩濃度にて陰イ
オン交換カラムに充填し、次いで１．０Ｍの塩濃度まで
のＮａＣｌ濃度勾配により溶出させる。最終的なサイズ
・エクスクルージョン・クロマトグラフィー工程は高度
に精製されたウィルス調製物を与える（図２参照）。

【００７８】（ｄ）失活 Ａ型肝炎ウィルスのホルマリン失活を予め９３μｇホル
ムアルデヒド／ｍｌ（１：４０００のホルマリン）およ
び３７℃の温度を用いて投与レベルに近い抗原濃度につ
き行なった。これら条件下で、ウィルスの失活は１日当
り約３．５ ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀（５０％組織培養感染
投与量）の損失に相当する約２時間の半減期を以て一次
減衰速度に従った。約２日間でウィルス感染性は１０⁷
減するが、失活の時間を２０日間まで延長してウィルス
が完全に失活するよう安全を見た。

【００７９】小規模の実験は、ホルムアルデヒド濃度の
増加がＴＣＩＤ₅₀の損失により測定される失活の速度を
増大させることを確認した。失活速度は、失活の見掛一
次速度につき予想されるようにホルムアルデヒド濃度と
共に比例的に変化した。２００投与当量ウィルスを３７
０μｇ／ｍｌのホルムアルデヒド（１：１０００のホル
マリン）と共に３７℃にて５日間培養すると完全失活す
ることを確認した。かくして、これら失活の改変条件は
従来用いられたと同じ安全性の限界を与えた。これは、
同一条件下で行なわれ次いで水酸化アルミニウム吸着を
行なって臨床試験のためワクチンを得た３種の大パイロ
ット規模の失活で確認された。失活速度は低ホルムアル
デヒド濃度で従来観察された速度の約４倍であって、小
規模の試験と良く一致した。これら２種の水酸化アルミ
ニアム吸着ワクチンの試料をマウスにおける免疫性につ
き試験し、それぞれのＥＤ₅₀は従来のワクチンの数値
（２ｎｇ未満）と同様であった。

【００８０】（ｅ）水酸化アルミニウム吸着 水酸化アルミニウムへの吸着を、ホルマリン失活された
ウィルスを水酸化アルミニウムと共沈させることにより
行なった。全臨床調製物につき用いた方法は実質的に同
じであり、ただし唯一の変化はホルマリン失活したバル
ク溶液におけるウィルスの濃度である。水酸化アルミニ
ウムへの失活ウィルスの直接的沈澱を、先ず最初にホル
マリン失活したバルク溶液へ硫酸カリウムアルミニウム
を添加して行なった。最後に沈殿物を水酸化ナトリウム
の添加によって生成させた。懸濁物から上澄液を除去し
てホルムアルデヒドと残留塩とを除去し、これを生理食
塩水で置換した。

【００８１】実施例７ ＨＡＶ生成物の純度 分析サイズ・エクスクルージョン・クロマトグラフィー
（ＨＰＳＥＣ）、ＥＩＡおよび蛋白、並びにＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを精製工程に用いて高純度ワクチンの一貫した収
率を確保すべく監視した。ＨＰＳＥＣは、ヌクレアーゼ
処理の間の核酸の損失を監視する手段および後の処理工
程における純度の評価を与える。図２におけるクロマト
グラムは、Ａ型肝炎に対応するピークがＰＥＧ沈殿物に
出現することを示す。Ａ型肝炎ウィルスは溶剤抽出工程
で富化し、次いでイオン交換工程で濃縮される。最終ゲ
ル濾過は高度に精製（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色に
より＞９５％）されたＡ型肝炎調製物を与える。純度の
別の尺度としては、ＨＡＶ生成物がＨＰＳＥＣ分析にて
単一の対称ピークを含むことがある（図２、３７および
３８参照）。

【００８２】ＩＩ．不純物の浄化 工程内試料のＣＺＥ分析は、モンロー法における濃縮／
透析濾過工程および製造工程における捕獲カラムにより
トリトンが除去されることを示す。さらに、ベンゾナー
ゼは捕獲カラムを流過する。陰イオン交換生成物段階で
存在するベンゾナーゼの量は検出レベルよりも低い（＜
１８フェムトグラムのベンゾナーゼ活性および１３ｐｇ
未満のベンゾナーゼ量／２５単位投与Ａ型肝炎；この分
析における検出限界は１２．５ｐｇである）。

【００８３】実施例８ トリトン溶解によりヌンク・セル・ファクトリースまた
は静的表面生物反応器から収穫されたＡ型肝炎ウィルス
の精製：モンロー試験 ＨＡＶを、実施例２に記載したと実質的に同様にＮＣＦ
を用いて増殖させた。ＭＲＣ−５細胞を６０個の６００
０ｃｍ² ＮＣＦのバッチにて３７℃で７日間にわたり
増殖させ、その際１０％ｖ／ｖ胎児牛血清とネオマイシ
ン硫酸塩とが補充されたウィリアムス・メジウムＥから
なる培地を用いた。７日目に、細胞に約０．１ ＭＯＩ
にて培養物に感染させるのに充分なウィルスを含有する
新たな培地を再供給し、３２℃の環境に移した。さらに
培養物を１週間毎に再供給しながら３２℃にて２１日間
にわたり培養した。０．１％トリトンＸ−１００と１０
ｍＭトリスと１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ とを含有する溶解緩衝
液（ｐＨ７．５）でセルシートを処理することによりＨ
ＡＶを収穫した。ＮＣＦから得られた溶解物を集め、さ
らに処理すべく凍結させた。

【００８４】トリトンＸ−１００での処理によりヌンク
・セル・ファクトリー培養物から収穫した４リットルの
凍結Ａ型肝炎ウィルスを２０〜３０℃の水浴にて４時間
解凍させ、次いで濾過した。濾過した溶解物をペリコン
装置で分子量３００，０００カットの膜により１０倍濃
縮した。濃縮した溶解物の約４００ｍｌを、次いで１５
０ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡとを含有する１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対し透析濾
過した。トリトンをアンバライトＸＡＤ−４（ローム・
アンド・ハース社）ポリマー樹脂（３０ｍｇ／ｍｌ溶解
物）における回分処理によって除去した。濾過してＸＡ
Ｄ−４を除去した後、溶解物を５１０ｍＭ ＮａＣｌに
調整し、次いでポリエチレングリコール（ＰＥＧ８００
０、シグマ社）を５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加し
て沈澱させた。混合物を激しく振とうし、４℃にて１時
間培養し、次いで１０００×Ｇにて４℃で１０分間にわ
たり遠心分離した。遠心分離の後、上澄液を除去して捨
てた。

【００８５】次いで沈殿物を、１２０ｍＭのＮａＣｌと
１ｍＭのＥＤＴＡとを含有する６．２ｍＭの燐酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解させた。この再懸濁し
たペレットを同容積のクロロホルム：イソアミルアルコ
ール（２４：１、ｖ／ｖ）の混液で抽出した。この混合
物を激しく振とうし、次いで３０００×Ｇにて２０℃で
１０分間にわたり遠心分離した。不溶性物質を含有する
界面を初期容量の３０％を用いて同じ有機溶剤混合物で
再抽出した。遠心分離の後、２つの水相を合した。次い
でクロロホルム抽出物を３５０ｍＭのＮａＣｌに調整
し、濾過モードにおけるＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６
Ｂ（ファルマシア社）でクロマトグラフにかけてＤＮＡ
を吸着させた。ＨＡＶを含有するカラム流過フラクショ
ンを集め、６．２ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）により３倍希釈し、１ＭまでのＮａＣｌの濃度
勾配溶出によりトヨパールＤＥＡＥ６５０Ｍ（トソハー
ス）でクロマトグラフにかけた。Ａ型肝炎は、１５〜３
０ｍＳに対応する１５〜３０％の１Ｍ緩衝液で溶出し
た。この領域から集めたフラクションを次いで、１２０
ｍＭのＮａＣｌを含有する６．２ｍＭの燐酸ナトリウム
緩衝液でセファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社）によ
りクロマトグラフにかけた。このカラムに対する充填量
は、カラム容積の１％より大であるが５％未満となるよ
うにした。生成物は全カラム容積の４６〜６４％の間で
溶出した。

【００８６】最終の精製されたバルクを０．２２μｍで
滅菌濾過し、１：４０００のホルマリン試薬（ホルマリ
ンは３７〜４０重量％ホルムアルデヒドである）により
３７℃で２０日間にわたり失活させた。これら条件は２
時間の半減期および約３．５ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀／２４
時間の損失に相当する一次減衰速度を示した。失活期間
を２０日間まで延長したのは、安全性の限界を遥かに上
まわるようにするためである。硫酸カリウムアルミニウ
ムを失活Ａ型肝炎に添加し、次いで溶液をｐＨ６．６〜
６．８までの水酸化ナトリウムの添加により沈澱させ
た。ホルムアルデヒドと残留塩とを遠心分離により除去
し、ここで上澄液を除去すると共に生理食塩水で置換し
た。

【００８７】実施例９ ヌクレアーゼ処理および捕獲クロマトグラフィーを用い
るトリトンＸ−１００でのコスター・キューブから収穫
したＡ型肝炎の精製、生産規模の方法 ウィルス増殖のためＳＳＲ法を用いて生産規模の材料を
作成した。この方法においては、コスター・キューブを
細胞用の増殖表面として用いた。キューブを、実施例３
に記載したように培地流を駆動させる外部ループとポン
プとを用いコスターＣＳ２０００通気装置に接続した。
ＭＲＣ−５細胞をコスター・キューブＳＳＲに接種し、
３７℃にて７日間培養した。灌流を細胞導入の２日後に
開始した。反応器には、１０％ｖ／ｖ鉄補充牛血清とネ
オマイシン硫酸塩とが絶えず補充されたウィリアムス培
地Ｅを連続灌流させた。反応器のｐＨを６．９〜７．６
に調整し、反応器内の溶存酸素を培地における１５〜１
００％空気飽和の範囲にした。細胞増殖を全部で７日間
にわたり進行させ、実施例１の方法により作成したウィ
ルス保存物を用い約０．１のＭＯＩにてウィルスを反応
器中へ導入した。ＳＳＲ温度を３２℃まで低下させ、２
１日間にわたり供給を続けた。次いでＳＳＲから培地を
排液し、０．１％ｗ／ｖのトリトン（登録商標）と１０
ｍＭのトリス（登録商標）（ｐＨ７．５）緩衝液とを再
充填してＨＡＶを遊離させた。コスター・キューブ系に
て実施例１０に示すようにしてこの方法により作成され
た４ロットのウィルスにつき、ＨＡＶＡｇの生産は、表
面積基準でモンロー繁殖法を用いてＮＣＦ反応器で得ら
れる従来の平均の２．８倍であった。増大したＳＳＲ生
産性は、繁殖工程の規模を製造規模まで容易に拡大させ
た。

【００８８】粗製溶解物をベンゾナーゼで処理してウィ
ルスを核酸アダクトから放出させ、次いで陰イオン交換
クロマトグラフ上にウィルスを捕獲した。ベンゾナーゼ
処理の採用により、濃縮／透析濾過工程とＸＡＤ−４処
理とＤＮＡフィルタカラムとが不要となった（実施例８
参照）。

【００８９】２５リットルのコスター・キューブ・トリ
トンＸ−１００収穫物を、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ の存在下
に５〜２５μｇのベンゾナーゼ／リットル溶解物で処理
し、次いで０．２２μｍフィルターで濾過した。この混
合物を２５℃にて１８時間培養した。酵素処理された溶
解物を、９０ｍＭのＮａＣｌを含有する４．７ｍＭの燐
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化させたトヨ
パールＤＥＡＥ６５０Ｍ陰イオン交換カラムに充填し
た。Ａ型肝炎を、０．３５ＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤ
ＴＡとを含有する６．２ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液
（約８００ｍｌ）で溶出させた。酵素活性の動的分析を
用いる試験法を開発して、この工程における酵素の除去
を監視した。結果は、エンドヌクレアーゼ活性の＞９０
％が捕獲カラムの洗浄フラクションおよび流過フラクシ
ョンに認めうることを示した。さらに捕獲カラム生成物
における添加ベンゾナーゼの活性を含む全ヌクレアーゼ
活性は、溶解物中に最初に存在した量と比較して＞１０
０倍で減少した。

【００９０】捕獲カラムからのＡ型肝炎生成物のＮａＣ
ｌ濃度を４２０ｍＭに調整し、ウィルスを４．５％の最
終濃度になるようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ８
０００、シグマ社）で沈澱させた。混合物を激しく撹拌
し、次いで４℃にて１時間培養した。培養の後、沈殿物
を１０００×Ｇにて４℃で１０分間にわたり遠心分離し
て回収した。上澄液を除去して捨てた。ＰＥＧ沈殿物
を、１２０ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡとを含有
する６．２ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
に再懸濁させた。再懸濁したＰＥＧ沈殿物の有機抽出
を、１．５倍容積のクロロホルム：イソアミルアルコー
ル（２４：１、ｖ／ｖ）の添加により行なった。３００
０×Ｇにて２０℃で１０分間にわたり遠心分離すること
により相分離を促進させ、上部の水相を保持した。界面
を初期容積の３０％の有機液で再抽出し、遠心分離し、
次いで第２の水相を第１の水相と合した。

【００９１】水性抽出物をトヨパールＤＥＡＥ６５０Ｍ
（トソハース）陰イオン交換マトリックスでクロマトグ
ラフにかけ、１Ｍ ＮａＣｌまでの濃度勾配で溶出させ
た。Ａ型肝炎ウィルスは１５〜３０ｍＳに対応する１５
〜３０％の１Ｍ濃度勾配で溶出した。この領域からフラ
クションを集め、サイズ・エクスクルージョン・クロマ
トグラフィーにかけた。サイズ・エクスクルージョン工
程は２種のカラム、すなわちトヨパールＨＷ５５Ｓおよ
びＨＷ６５Ｓを直列で用いた。これら条件下で、Ａ型肝
炎ウィルスは両マトリックス内に止まるが、直列カラム
配置を用いて、より高い分子量およびより低い分子量の
不純物をＡ型肝炎ウィルスから分離させた。これらカラ
ムを、１２０ｍＭのＮａＣｌを含有する６．２ｍＭの燐
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化させた。Ａ
型肝炎は対称ピークにて溶出し、生成物フラクションを
集めた。

【００９２】サイズ・エクスクルージョン・クロマトグ
ラフィーからの０．２２μｍ滅菌濾過生成物を３７０μ
ｇ／ｍｌのホルマリン（３７〜４０重量％ホルムアルデ
ヒドであるホルマリンの１：１０００希釈物）を有する
約５００単位／ｍｌ（１単位は約１ｎｇのウィルス蛋白
に相当）で３７℃にて５日間にわたり失活させた。失活
したＡ型肝炎ウィルスを０．２２μｍ滅菌濾過した。水
酸化アルミニウムでの共沈を硫酸カリウムアルミニウム
の最初の添加および次いで水酸化ナトリウムでのｐＨ
６．６〜６．８への滴定によって行なった。残留塩とホ
ルムアルデヒドとを沈降／デカント法により除去し、上
澄液を除去すると共に生理食塩水で置換した。

【００９３】実施例１０ 上記の方法で製造された生成物を次の成分につき分析し
た：アミノ酸分析による蛋白（気相加水分解に続きＰＩ
ＴＣ標識および逆相高性能液体クロマトグラフィー）；
ＨＡＶ抗原固相酵素免疫分析によるＨＡＶ抗原（ヒトポ
リクローナル抗体調製物を用いる抗原捕獲に続くマウス
モノクローナル抗体およびヤギ−抗マウス抗体／ペルオ
キシダーゼ結合体を用いる検出）；炭水化物（グルコー
スおよび非グルコース炭水化物の検出を含み、非グルコ
ース炭水化物は高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー
およびパルス電流計検出（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ、２ＮＴ
ＦＡを用いる酸加水分解に続くＨＰＬＣ分析）によって
生成蛋白１μｇ当り約０．１μｇ未満のレベルで生成物
中に存在する）；ＤＮＡハイブリッド化による宿主細胞
ＤＮＡ（ハイブリッド化プローブとしてＡｌｕＤＮＡ断
片を用いるドット−ブロット法）；ガスクロマトグラフ
ィーによる脂肪酸（脂肪酸のメチルエステル化に続く毛
細管ガスクロマトグラフィー）；加水分解およびリボヌ
クレオチドの逆相ＨＰＬＣ分析によるＲＮＡ。

【００９４】上記方法により得られた下記するデータの
他に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および銀染色または抗−Ｈ
ＡＶ抗体でのウエスタンブロットによる蛋白検出は、５
０〜３００ｎｇの蛋白を充填した際にＨＡＶ特異性蛋白
の存在のみを示した。さらに完全ＨＡＶカプシドの存在
が、ＨＡＶ特異性ＤＮＡプローブとのハイブリッド化、
蔗糖密度濃度勾配および逆相ＨＰＬＣによるＨＡＶ特異
性ＲＮＡの分析により示された。ＨＡＶ特異性ＲＮＡは
蛋白１μｇ当り約０．１〜０．２μｇにて生成物中に存
在することが判明した。ＨＡＶ特異性ＲＮＡのこのレベ
ルは、約１／３完全カプシド：約２／３空ＨＡＶカプシ
ドの比と一致した。最後にＨＡＶ純度の独立した測定を
図２に示した分析し、そのＨＰＬＣ分析は単一のＨＡＶ
生成物ピークを示した。

【００９５】蛋白、炭水化物、脂質およびＤＮＡの絶対
濃度を下記セクションＡに示す。セクションＡのデータ
を蛋白のμｇ数に基準化して下記セクションＢに換算
し、さらに蛋白の重量％としてセクションＣに示す（こ
れはたとえば存在する炭水化物の量と存在する蛋白の量
との比に１００を掛けた数値を意味する）。

【００９６】これら分析の結果を、本発明による工業規
模の方法にしたがって製造されたＨＡＶの８種の調製物
につき下記に示す。

【００９７】

【表５】 ＊：第１試料の検出限界（ＬＯＤ）は０．００４５μｇ
／ｍｌであった。その後の試料については感度をＬＯＤ
が０．００３μｇ／ｍｌになるよう増大させた。

【００９８】失活および水酸化アルミニウム共沈に先立
つ段階で、上記データは本発明の生成物が１μｇ当りの
蛋白基準で次の特性を有するＨＡＶ調製物であることを
示す（蛋白はＳＤＳ ＰＡＧＥおよび銀染色により９５
％より高い純度のＨＡＶである）： グルコースで構成される炭水化物 ０．１〜２．５μ
ｇ 非グルコース炭水化物 ＜０．２μｇ ＤＮＡ ＜０．００４μｇ 脂質 ＜０．１μｇ ＨＡＶ・ＲＮＡ ０．１〜０．２μ
ｇ 好ましくは、ＨＡＶ生成物が最も濃縮される失活および
処方の前に、本発明の精製ＨＡＶ生成物につき上記分析
を行なう。しかしながら充分量の失活または最終処方し
たワクチンがあれば、これら分析は恐らく実質的に同様
な結果を与える。特に好適な１具体例において、本発明
のワクチンは２５単位／０．５ｍｌ投与量につき次の公
称組成を有する：

【００９９】

【表６】 ＊：精製ウィルスバルクの分析から外挿 ＃：例示ロット試料の分析から ＆：活性分析に基づく。

【０１００】実施例１１ 種々異なるＨＡＶ調製物の比較 本発明の精製されたＨＡＶ生成物を、製造業者により説
明された他のＨＡＶ生成物の記載と比較した。この比較
の結果を表１に示す：

【０１０１】

【表７】 ａ．ケモ・セロ・テラピューチック・リサーチ・インス
チチュートとチバ・セルム・インスチチュートとデンカ
・バイオリサーチ・インスチチュートとの共同産品 ｂ．アミノ酸分析（ＡＡＡ）データに基づく ｃ．ＨＡＶ抗原酵素免疫分析により規定；検量標準はＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色により純度＞９０％の精製ウィ
ルスであり、蛋白はＡＡＡにより規定される ｄ．ＨＡＶ抗原酵素免疫分析により規定；検量標準は不
確定 ｅ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により規定 ｆ．ＨＡＶ抗原と全蛋白との比により規定。

【０１０２】このデータおよび実施例１０で上記した情
報から明らかなように本発明の生成物は、分析データを
入手しうる従来報告された全ゆる生成物よりも純粋（Ｈ
ＡＶ抗原と全蛋白との比およびアミノ酸分析に基づく）
であり、より完全に解析され、さらに血清変換および保
護をうるのに有効な最少量のウィルス蛋白を含有する。

【０１０３】実施例１２ ワクチン効果：モンロー試験 ヌンク・セル・ファクトリースで培養したＭＲＣ−５セ
ルシートにＣＲ３２６Ｆ ＨＡＶを感染させてワクチン
を作成した。培養物を定期的培地供給により数週間にわ
たり維持した。適当な時点で感染ＭＲＣ−５単層を洗剤
処理により収穫し、ＨＡＶをＮＣＦにつき図１に示した
本発明の方法により精製した。水性ウィルスを水酸化ア
ルミニウムに吸着させ、２〜８℃で貯蔵した。０．６ｍ
ｌの量はそれぞれ、精製ウィルス比較標準に対する放射
線免疫分析に基づき２５単位のＡ型肝炎ウィルス抗原と
３００μｇの水酸化アルミニウムとを含有した。プラセ
ボは３００μｇの水酸化アルミニウムと１：２０，００
０の希釈におけるチメロサールとを含有した。ＨＡＶ感
染を受ける高い危険性のある健康な血清陰性のワクチン
接種者に、１回の０．６ｍｌ量のプラセボまたはワクチ
ンを接種した。血液試料をワクチン接種の当日および１
か月後に採取した。ワクチン接種者のほぼ１００％は、
５０日間の潜伏期を考慮してワクチン接種前にＨＡＶ感
染を受けていた個人を除外すると、ＨＡＶ感染がなかっ
た。他方、プラセボ接種者の相当は、５０日間選別期間
の後にＨＡＶ感染を受けていた。ワクチン接種者の保護
が統計的に有意となるよう試験者数を充分大きくした。

【０１０４】実施例１３ 静的ミキサー反応器におけるウィルス生産 Ａ型肝炎ウィルスを、外部ループおよびポンプ系（チャ
ールス・リバー・バイオロジカル・システムスＣＲＢＳ
５３００）により通気装置に接続された静的ミキサーカ
ラムよりなるＳＳＲで増殖させた。静的ミキサー反応器
は、合計して約２６０，０００ｃｍ² の表面積を有する
直径８インチ×長さ４０インチのカラムにおける金属チ
タン部材で作成した。ＭＲＣ−５細胞を反応器に導入す
ると共に、１０％ｖ／ｖ胎児牛血清とネオマイシン硫酸
塩とが補充されたウィリアムス培地Ｅにて３７℃で７日
間増殖させた。細胞増殖を７日間にわたり進行させ、培
地の１部を１週間に３回交換して、ＮＣＦモンロー法に
等しい培地供給割合を与えた。ウィルスを約０．１のＭ
ＯＩにて反応器に導入した。ＳＳＲ温度を３２℃まで低
下させ、供給を上記したように２２日間にわたり継続し
た。次いでＳＳＲから培地を排液し、０．１％ｗ／ｖの
トリトン（登録商標）緩衝液を再充填してＨＡＶを遊離
させた。この反応器は、同じ物質を用いて接種し、同様
に培地供給し、増殖させかつ収穫したＴ−フラスコ比較
よりも、表面積基準で約５０％多いＨＡＶＡｇを与え
た。さらにこの反応器のＨＡＶ生産は実施例２のヌンク
・セル・ファクトリーよりも好結果であった。

【０１０５】実施例１４ ステンレス鋼ガーゼ（金網）静的ミキサー部材でのＨＡ
Ｖ生産 １４．１材料および方法 細胞培養 ＰＤＬ≦４０におけるＭＲＣ−５細胞を全ての試験に用
いた。細胞を、１０％鉄補充した牛血清と２ｍＭのグル
タミンと５０ｍｇ／リットルのネオマイシン硫酸塩とを
含有するウィリアムスＥ培地にて３７℃で培養した。
０．１％のプルロニックＦ−６８を、吹込撹拌タンク反
応器を用いる試験で培地に添加した。１０，０００個の
細胞／ｃｍ² の細胞密度を用いて新たな培養表面に接種
した。クールター・カウンタおよび／またはトリパン・
ブルー染色でのヘマチトメータを用いて細胞計数を行な
い、生存率を試験した。

【０１０６】金属クーポンにおける細胞培養 約５ｃｍ×５ｃｍの密実またはガーゼの金属クーポンを
ガラス製の１５０ｃｍ² ペトリ皿に入れて滅菌した。冷
却した後、９０ｍｌの培地をペトリ皿に入れ、次いで細
胞接種物を添加した。この培地量は金属表面を完全に覆
うことができる。３７℃にて１日間の後、金属片を滅菌
ピンセットで取り出し、９０ｍｌの培地を含有する新た
な滅菌ペトリ皿に入れた（ガラス表面における細胞増殖
を差引くため）。団体シートを燐酸塩緩衝塩水（ＰＢ
Ｓ）で２回洗浄すると共に２ｍｌのトリプシンを金属に
添加してトリプシン処理した。細胞の放出を観察した
後、トリプシンをゆっくり表面上に数回ピペットで添加
して、完全な除去を確保した。

【０１０７】ウィルス保存および感染 Ａ型肝炎ウィルス保存物ＣＲ３２６Ｆ Ｐ２８（１０⁸
ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの力価を有する）を全試験に用いた。
ここに示したＭＯＩ値はＴＣＩＤ₅₀／細胞として計算
し、ＰＦＵ／細胞ではない。培養物には、ウィルス保存
物を新鮮培地に添加すると共にこれを培養物に添加して
感染させた。感染の後、培養物を３２℃にて培養した。

【０１０８】ガーゼクーポンにて染色する生存率 フルオレセンジアセテート（ＦＤＡ）および臭化エチジ
ウム（ＥＢ）染色を用いて細胞生存率を監視した。生存
細胞では、細胞質におけるエステラーゼによりＦＤＡが
分解し、緑色に発光する遊離フルオレシンが生ずる。Ｅ
Ｂは非生存細胞の核ＤＮＡに急速に侵入して赤色蛍光を
発する。細胞を両染料により同時に標識した。染色溶液
は、１００μｌのＦＤＡ保存液（アセトン中５ｍｇ／ｍ
ｌ）および２００μｌのＥＢ保存液（ＰＢＳ中１０ｍｇ
／ｍｌ）を５０ｍｌのＰＢＳに溶解して構成した。次い
でガーゼ材料をこの溶液の５ｍｌにて５〜６分間培養し
た。標識の後、支持体をＰＢＳで２回洗浄し（１回の洗
浄当り２０ｍｌ）、次いでスライドとカバーグラスとの
間に挿入した。次いで試料をバイオラドＭＲＣ−６００
共焦顕微鏡により観察した。

【０１０９】静的ミキサー反応器 ガーゼ（「Ｅ−パック」として知られる）および密実シ
ートの３１６ステンレス鋼静的ミキサー部材（ＳＭＶ配
置）をコッホ・エンジニアリング社（ウィチタ、ＫＳ）
から得た。全部材は約２インチ×２インチであって、３
１６ステンレス鋼もしくはチタンで作成した。密実部材
の表面積は１３００ｃｍ² と推定され、ガーゼ部材は２
３００ｃｍ² と推定された。これら部材の表面積と液体
容積との比は約２６ｃｍ² ／ｍｌ（全反応器容積に基づ
き約２４ｃｍ² ／ｍｌ）であった。一般に５個の部材を
ＰＴＦＥ末端取付部によりネジ付き５ｃｍ×２６．５ｃ
ｍガラスカラムに設置した。これら部材を、順次垂直な
混合方向をなすような配置で設置した。部材を有するカ
ラムは細胞増殖用の反応器を構成する。電子制御器に連
結した撹拌タンク付随容器を用いて、培地ｐＨを７．２
〜７．３およびＤＯを８０〜９０％に制御した。培地を
撹拌タンクから反応器に蠕動ポンプを用いて循環させ
た。

【０１１０】細胞付着を可能にする低い循環速度を与え
て反応器移植を行なった。接種物を系に入れ、典型的に
は１００ｍｌ／ｍｉｎにて５分間循環させて細胞と培地
とを混合した。この急速循環期には、極めて僅かの細胞
付着しか生じなかった。次いで流速を約２ｍｌ／ｍｉｎ
に低下させて、反応器に対する見掛速度を細胞の沈降速
度にほぼ等しくした。細胞沈降速度に近い速度は、細胞
付着速度および反応器に対する細胞の分配につき最適で
あると判明した。

【０１１１】細胞溶解過程 細胞を、０．１％のトリトンＸ−１００と１０ｍＭのト
リスと１ｍＭのＭｇＣｌ₂ とを含有するトリトン分解緩
衝液で溶解させた。Ｔ−フラスコを０．３ｍｌ／ｃｍ²
のＰＢＳで２回洗浄し、０．１ｍｌ／ｃｍ² の溶解緩衝
液で１時間にわたり２回溶解させた。溶解反応器の詳細
については本文で説明する。

【０１１２】分析法 細胞代謝物をコダック・エクタチェムＤＴ６０分析器を
用いて測定した。Ａ型肝炎ウィルス抗原（ＨＡＶＡｇ）
についてはモノクローナル抗体系の酵素免疫分析により
分析した。細胞溶解物の全蛋白は、牛血清アルブミン標
準に対するクーマシー・ブルー・バイオラド蛋白分析
（Ｃａｔ．＃５００−０００１）を用いて定量した。

【０１１３】結果および検討 密実金属クーポンにおけるＭＲＣ−５細胞の増殖 この試験に先立ち静的ミキサー試験をチタン部材で行な
った。種々異なる合金の表面にて細胞増殖を検討するこ
とが望ましく、これはチタンよりも安価であるだけでな
く静的ミキサー製造の容易さにつき大きい従順性を与え
る。２種類のそれぞれステンレス鋼およびハステロイに
つき検討した。すなわち３１６および３１６Ｌステンレ
ス鋼とハステロイ級ＢおよびＣとした。金属クーポンに
約１０，０００個の細胞／ｃｍ² を接種した。４日間の
後、細胞をトリプシン処理すると共に最終の細胞密度を
記録した：材料 細胞数ｃｍ² チタン １．４×１０⁵ ３１６ステンレス １．６×１０⁵ ３１６Ｌステンレス １．２×１０⁵ ハステロイＢ ２．２×１０³ ハステロイＣ １．３×１０⁴ 両種類のステンレス鋼における増殖はチタンにおける増
殖と同様であった。細胞はハステロイＢでは増殖せず、
またハステロイＣでは増殖が貧弱であった。ステンレス
鋼およびチタンにつき認められた細胞密度の差は一方が
優秀である証明として考えてはならない。これら相違は
分析の変動による可能性がある。

【０１１４】Ａ型肝炎ウィルス処理に関する殆どのデー
タは、従来プラスチック支持体（たとえばポリスチレン
組織培養フラスコ）で増殖させた細胞につき得られてい
る。比較のためポリスチレン、ガラスおよび３１６ステ
ンレスにおけるＭＲＣ−５細胞の増殖曲線を図３に示
す。細胞は全ての表面にて同等に増殖する。最大の比増
殖速度も同様である（プラスチックにつき０．０３４ｈ
^-1、ガラスにつき０．０３２ｈ^-1および３１６ステンレ
ス鋼につき０．０３９ｈ^-1）。プラスチックにつき得ら
れた低い最終細胞密度は栄養不足によるものと思われ
る。プラスチックにおける増殖をＴ−フラスコで行なう
一方、ガラスおよびステンレス鋼における増殖をペトリ
皿で行なった。各系にて１ｃｍ² 当りに用いた培地の容
積差に基づき、利用しうる栄養物の不均衡が生じた。ス
テンレス鋼クーポンに関する細胞増殖およびグルコース
の消費を図４に示す。

【０１１５】ガーゼ金属クーポンにおけるＭＲＣ−５の
増殖 単位容積当りの表面積を最大化する努力において、金属
ガーゼ材料をＭＲＣ−５細胞増殖につきペトリ皿で検討
した。ワイヤの直径および間隔の或る種の組合せにつ
き、密実クーポンと同じ突出面積を有するガーゼ片は細
胞増殖につき一層大きい全表面積を与えることができ
る。次いでガーゼのシートを、反応器単位容積当りの可
使表面積を最大化するよう反応器に形成し或いは配置す
ることができる。ガーゼ表面における細胞の増殖を試験
するため、ＭＲＣ−５の培養を材料および方法のセクシ
ョンで説明した技術により行なった。

【０１１６】ＭＲＣ−５細胞の増殖を、３１６ステンレ
ス鋼もしくはチタンで作成したガーゼで示した。１００
〜４００μｍの範囲のワイヤ直径と１インチ当り１４×
１００、１２０×１１０、４０×２００および１０７×
５０本の織密度を有するガーゼクーポンを検討した。全
試料にて細胞は多かれ少なかれ増殖した。初期段階で細
胞はワイヤ表面にて増殖する。その直後に細胞は間隙部
を架橋し始め、特に隅部で架橋した。時間と共に細胞は
間隙部を完全に埋めて多重層を形成する。肉眼検査によ
り、ガーゼは表面積を尺度とした予測値よりも極めて高
い細胞密度を支持する。直接的細胞表面濃度は、ガーゼ
における多重層増殖がトリプシン処理には推奨しえない
ため不明である。予備データは、間隙寸法が重要な問題
であることを示した。何故なら、細胞は大きい間隙部を
架橋することができず、小さい間隙部を有するガーゼは
平滑プレートと同じになってしまうからである。作成素
材は細胞増殖に影響を与えず、ガーゼシートに織込みう
る任意の生物適合性材料が使用に推奨しうると結論され
る。使用した金属ガーゼは、下記するように多サイクル
の細胞増殖のため容易に清浄および再使用しうるという
利点を有する。

【０１１７】１インチ当り１０７本ワイヤ×５９本ワイ
ヤの織密度と１６０μｍのワイヤ直径とを有する３１６
ステンレス鋼ガーゼ（７７μｍ×２７０μｍのワイヤ間
隔を与える）のみを、この点につき例証する。下記する
ガーゼ静的ミキサー部材をこの材料で作成した。増大し
た表面積を与えるだけでなく、ガーゼは細胞を多重層で
増殖させることができる。このガーゼで増殖した多重層
細胞の顕微鏡図を図５に示す。各層の全体にわたり細胞
が全て生存するかどうか、即ち多重層の中心における細
胞が壊死性であるかどうかを決定することに興味が持た
れた。フルオレセンジアセテートおよび臭化エチジウム
を、材料および方法のセクションで詳述したようにこの
目的に使用した。レーザー共焦顕微鏡を用いてガーゼの
断面を走査することにより、細胞の大多数は臭化エチジ
ウムが核ＤＮＡに浸入せずかつフルオレセンジアセテー
トが分解して遊離フルオレセンを生成するという事実に
基づき、生存しうることが証明された。図６Ａは細胞層
における一連の断面につきフルオレセン信号を示す。図
６Ｂは同じセクションにつき臭化エチジウム信号を示
す。メタノールで処理して非生存性にした別の細胞のク
ーポンを、臭化エチジウムの陽性比較としておよびフル
オレセンジアセテートの陰性比較としてこれら実験に用
いた。この比較を図７に示す。

【０１１８】ガーゼ静的ミキサー部材における移植細胞 最適培養性能のため並びに生物学的製造につき低い均一
な細胞二倍化レベルを維持するためには均一移植が重要
である。上記で検討したと同じ材料で構成されたガーゼ
静的ミキサー部材を得た。円筒状反応器を、軸線を垂直
にして配向させた。増殖表面に対する細胞沈降を促進す
るため反応器軸線を水平にして初期の試験を行なった
が、垂直表面に対する付着の方が効率的であつて好適な
操作モードであると判明した。この試験の全体にわたり
細胞を約１０，０００ｃｍ² で移植した。細胞は、個々
の部材の混合軸線が互いに平行または９０°であるよう
な複数部材の反応器に移植した。液体混合および最適な
反応器操作の観点で垂直配置が好適である。

【０１１９】５ｃｍ／ｍｉｎの見掛速度を与える循環速
度を用いた最初の試験では細胞は増殖しなかった。反応
器を満たすと共に細胞を重力沈降により２時間にわたり
移植させることにより移植効率が増大した。これは９０
％より大の移植効率（移植効率＝移植細胞の個数／接種
物における細胞の全数×１００％）を一般に与えたが、
移植物は不均一であった。図８に示すように、底部部材
が大部分の細胞を含有したのに対し、頂部部材は殆ど含
有しなかった。これらデータから、ＭＲＣ−５細胞調製
物の平均沈降速度は６ｃｍ／ｈであると計算された。４
個の部材を用いる次の実験においては、培地をこの沈降
速度にほぼ等しい速度で移植すべく循環させた。この条
件につき９０％より高い移植効率にて均一な移植物が再
現性を以て得られた（図８）。上記の結果は、反応器に
対する培地の見掛速度が細胞の付着速度と反応器におけ
る細胞の最終的分布との両者に影響を与えることを示し
た。

【０１２０】密実シートおよびガーゼ静的ミキサー部材
における細胞増殖の比較 密実シートとガーゼ部材との間の差を説明するため、２
種の反応器を作成すると共に同時に試験した。密実部材
はチタンで作成する一方、ガーゼ部材はステンレス鋼で
作成した。表面積は密実部材につき１３００ｃｍ² であ
り、ガーゼにつき２３００ｃｍ² であると推定され、
１．８のガーゼと密実との表面積比を与えた。ガーゼ部
材と組合せて操作する密実シート部材が全実験の比較を
与えた。反応器には約１０，０００〜２０，０００個の
細胞／ｃｍ² を移植した。次いで反応器をバッチモード
にてグルコース濃度が１２０ｍｇ／ｄＬ未満に低下する
まで行ない、この時点で培地灌流を開始した。両反応器
には同じＭＲＣ−５細胞の収穫物を接種すると共に、共
通の培地貯槽から培地供給してこれら変動要因による差
を排除した。

【０１２１】各反応器につきグルコース吸収速度（ＧＵ
Ｒ）を図９に示す。図９Ａは、上記の面積を用いｃｍ²
当りで反応器を比較する。これら表面積は近似値である
と考えられる。図９Ｂは、反応器の培地容積を基準とし
て系を比較する。何故なら、各反応器は同じ寸法、すな
わち１リットルの付随培地容器を含む５個の２インチ×
２インチの部材を有するからである。図９Ｂは表面積に
関し何ら近似値を示さない。グルコース吸収速度を細胞
増殖の尺度として用いると共に、定常期の開始を推定す
べく用いた。図９における最終点は、反応器がトリトン
溶解により収穫された時点を示す。細胞は肉眼的に密実
マシリックス上では融合しており、メッシュにおける間
隙部は殆どガーゼ部材で満されて、より大きい増殖が可
能であることを示唆した。この時点で培地を密実反応器
につき０．１９リットル／ｈの速度で灌流し、この時点
における培地中のグルコース濃度は１．１６ｇ／リット
ルであった。ガーゼ反応器につき灌流速度は０．２６リ
ットル／ｈであり、培地のグルコース濃度は０．６９ｇ
／リットルであった。これらの結果は、細胞増殖期に関
しガーゼ反応器が密実反応器よりも優秀な代謝活性を有
することを示す。

【０１２２】反応器を排液すると共に、細胞を洗剤緩衝
液により溶解させて細胞蛋白を抽出し、これは反応器に
おける細胞量の尺度である。これら実験のため、各反応
器から細胞結合蛋白を収穫するための溶解手順は同一と
した。すなわち２リットルの室温ＰＢＳを１００ｍｌ／
ｍｉｎにて５分間にわたり反応器に循環させ、次いで排
液した。培地蛋白を除去するためのこの洗浄を２回反復
した。次いで材料および方法のセクションに記載した１
リットルの溶解緩衝液を４００〜５００ｍｌ／ｍｉｎに
て３７℃で１時間にわたり反応器に循環させた。これを
もう１回反復し（溶解物１および２）、その後の溶解物
ではより長く、すなわち溶解物３につき２時間および溶
解物４につき４時間にわたり循環させた。各溶解物で除
去された蛋白の比率を図１０に示す。全ての蛋白計算値
を付録１に示した係数により細胞密実に変換した場合、
密実静的ミキサー部材は３×１０⁵ 個の細胞／ｃｍ² を
含有したのに対し、ガーゼ部材は６×１０⁵ 細胞／ｃｍ
² を含有した。前者の数値は密実シート反応器につき代
表的であると思われる。何故なら、部材をこすってその
綿棒を顕微鏡下で観察するとわかるように、細胞は全て
溶解の際に除去されたからである。しかしながら、細胞
残骸は顕微鏡で観察するとガーゼ部材からは全部は除去
されず、したがって後者の数値は低いものと考えられ
る。反応器基準で、ガーゼ部材は密実部材よりも３倍大
きい細胞濃度を支持した。表面積の計算が正確とすれ
ば、全蛋白におけるこの相違は表面積の比を越えるもの
で、多重層細胞増殖の証明となる。

【０１２３】ガーゼ静的ミキサー部材におけるＨＡＶＡ
ｇの生産 ガーゼ静的ミキサー部材を用いる反応器につきＨＡＶＡ
ｇ生産を示した。この実験の目的は、多重層増殖を支持
するステンレス鋼ガーゼ部材にてウィルス繁殖が生じて
いるかどうかを決定することである。これはＨＡＶＡｇ
の生産につき最適系でなかった。この試験のため、培地
灌流でなく完成培地置換を用いた。この試験のＧＵＲプ
ロフィルを図１１に示す。この図面で計算したＧＵＲは
培地を再供給した翌日に得られたグルコース値に基づ
く。細胞には７日目に約１のＭＯＩで感染させた。ＭＯ
Ｉ計算に要する細胞密度は、感染の時点におけるグルコ
ース消費速度に基づいて推定した。たとえば実施例９の
ような方法で得られるように、グルコース吸収速度は感
染直後に平坦となり、次いで低下して細胞感染と一致す
る。図１０における観察された低下は実施例９の方法で
観察された低下よりも顕著であり、より均一な感染程度
に基づくと思われる（実施例９は０．１のＭＯＩを用い
た）。ウィルス抗原を感染の２１日後にトリトン洗剤溶
解によって収穫した。細胞を溶解させる方式については
下記に要約する。

【０１２４】溶解物１：溶解緩衝液を３７℃にて１時間
にわたり静的ミキサーに循環させる。 溶解物２：溶解緩衝液を３７℃にて１時間にわたり静的
ミキサーに循環させる。 溶解物３：０．７リットルの溶解緩衝液を含有するブラ
ンソン音波処理浴にて１時間にわたり音波処理する。

【０１２５】溶解物４：１リットルの溶解緩衝液で１２
時間にわたり部材を凍結させ、解凍し次いで１時間にわ
たり音波処理する。

【０１２６】これら洗浄で遊離された全蛋白およびＨＡ
ＶＡｇの比率を図１２に示す。循環を用いた最初の２種
の溶解物は、細胞からＨＡＶＡｇを除去するのに極めて
効率的であった。この実験は溶解前に僅か２回のＰＢＳ
洗浄を用い、完全には効率的でなく、したがって溶解物
１の全蛋白％は見掛け上高くかつ溶解物２、３および４
の全蛋白比率は低い。単一の保存試料を、凍結に先立ち
ＥＩＡによりＨＡＶＡｇについて分析した。その後に測
定した各溶解物の比率に基づき、これは実施例９の収率
の２倍である表面積当りの抗原収率に相当した。この実
験の目的は、ＨＡＶＡｇ収率により示されるようなウィ
ルス増殖が生じた点で達成された。この実験は、ＨＡＶ
の生産につきガーゼ静的ミキサー反応器の有用性を示
す。

【０１２７】反応器をＧＵＲプロフィルによれば遅く収
穫したと思われるが、抗原収率は比較的高く、感染に対
する多重層の感受性を示した。このデータは、ＨＡＶ生
産におけるＭＯＩの重要性をも示す。１のＭＯＩにて感
染させることにより処理持続時間は１週間以上短縮さ
れ、２０日目に収穫できると思われる。各種のデータに
基づき、感染の時間およびＭＯＩは製造過程に関し重要
な変動因子である。これらパラメータは培養の長さを短
縮するのに重要である。細胞増殖実験は、ＣＲ３２６Ｆ
Ｐ２８を高ＭＯＩで感染させた培養物でさえ感染細胞
が未感染細胞と同程度の速度で増殖し続けることを示す
（図１３）。これは感染および３２℃の温度（すなわち
この種類のウィルスにつき増殖を可能にする温度）にも
拘らず生じた。これら曲線から計算した最大の比増殖速
度は０．０１５ｈ^-1であり、３７℃における未感染細胞
の増殖速度の約半分である。細胞がＨＡＶ感染の第１週
に類似の挙動をするという事実は、これが感染時間およ
びＭＯＩとは無関係に最大可能な細胞濃度を実現すると
思われる点において、反応器の操作面にて重要である。
この実験は細胞増殖継続時間、感染持続時間およびＭＯ
Ｉの最適化が相関することを示す。

【０１２８】静的ミキサー部材の清浄 廃棄物処分を排除し、反応器処理の自動化を可能にし、
かつ培養再現性を増大させるには、生物学的製造につき
再使用しうる増殖表面を有することが望ましい。現在で
はガーゼ部材を蒸留水で洗浄して培地塩類を除去し（１
時間にわたり５００ｍｌ／ｍｉｎ）、１リットルの５％
（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ溶液に入れて４５分間オートクレー
ブ処理する。冷却の後、部材をＮａＯＨがなくなるまで
蒸留水で洗浄する（洗浄液のｐＨにより決定）。この手
順は顕微鏡検査により細胞残骸を除去するのに極めて有
効である。ずっと弱い処理でも同様の清浄効果を与え、
製造用反応器に直ちに組立てるのに一層適すると思われ
る。この方法で処理されたガーゼ部材を少なくとも１０
サイクルにわたり使用したが、細胞増殖特性に何ら変化
を与えなかった。上記ウィルス増殖試験における部材
を、このように作成したが、ＨＡＶ増殖につき使用され
た清浄部材の有用性を示した。

【０１２９】結論 これら試験は、ステンレス鋼ガーゼで作成された静的ミ
キサー部材がＭＲＣ−５細胞の多重層増殖を支持しうる
ことを示した。多重層は、壊死の徴候を示さずに生存し
うることを示した。感染試験は、これら多重層がＡ型肝
炎の感染を受け易く、たとえば実施例９におけるように
密実支持体を用いて現在実現されるよりも多量の抗原を
非最適系で生産できることを示す。ミクロキャリヤ培養
により細胞凝集は明確でない多重層をもたらすのに対
し、ガーゼ静的ミキサーは充分明確な多重層を精巧な形
状に基づいて与え、したがって栄養不足および廃棄物蓄
積の問題はない。メッシュの各間隙部における細胞増殖
はこれら間隙部を閉塞すると共に、密実シート部材と同
様な栓流パターンを形成する。したがって、この系は静
的ミキサー技術における混合の利点を獲得し、細胞に対
し予測しうる均一な栄養供給を与える。これは、たとえ
ば繊維のランダム充填床、ガラスビーズの充填床、中空
繊維反応器またはセラミックモノリス反応器のような他
の充填床反応器とは対照的である。これら種類の反応器
において細胞増殖は培地流パターンの悪化をもたらし、
細胞の栄養貧弱ポケット部を形成する。要するに、ステ
ンレス鋼ガーゼの静的ミキサー部材を有する再使用可能
な反応器は、ＭＲＣ−５細胞の培養およびＡ型肝炎抗原
の生産につき高い能力を実現する。

【０１３０】実施例１４：付録１ 要点 ＭＲＣ−５細胞溶解物からの全蛋白を定量すると共に直
接的な細胞計数（ヘマチトメータおよびコールタ・カウ
ンタの使用による）と比較した。初期対数増殖期、後期
の対数増殖期および定常増殖期における健全細胞、並び
に感染の１週間後、２週間後および３週間後の細胞は、
各培養溶解物からの全蛋白測定値が単一プロットの使用
により細胞密度に直接関連することを示した。この単純
な相関関係は、直接的計数技術を適用しえない反応器に
て細胞密度を推定する手段を与える。

【０１３１】検討 蛋白分析および試料作成 バイオラド蛋白分析（Ｃａｔ．＃５００−０００１）
は、全蛋白を定量すべく使用される迅速かつ敏感な分析
である。初期の実験は、現在の溶解緩衝液（０．１％ト
リトンＸ−１００、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ ）がクーマシーブルー系分析を阻害しな
いことを示した。一貫性のため標準蛋白（牛血清アルブ
ミン）の希釈を含め全ての希釈をトリトン溶解緩衝液で
行なった。トリトン細胞溶解物がしばしば羽毛状の性質
であるため、試料分析前にさらに処理を必要とする。大
きいフロックは高い蛋白測定値を与える。しかしながら
２サイクルの急速凍結（−７０℃のエタノールにおけ
る）および解凍の後、フロック寸法は均質懸濁物が得ら
れる程度まで減寸した。さらに、単一試料の数種の希釈
物を分析することにより、作成の下手な試料からでもそ
れと無関係に点が容易に検出される。これら試料をさら
に遠心分離し透明な上澄液を使用した。この処理により
結果は変わらず、不必要であると思われた。ここに示し
たデータは、少なくとも２回凍結すると共に分析に先立
ち充分回動させた細胞溶解物に関するものである。

【０１３２】細胞密度の関数としての蛋白濃度 全蛋白から比細胞数への変換を可能にする単一の標準曲
線を得るため、処理全体にわたる細胞をほぼ同量の蛋白
で構成せねばならない。これを試験するため、Ｔ−フラ
スコには同数の細胞を接種した。この方法にて特定間隔
で２個ずつのフラスコを使用にした。一方のフラスコは
トリプシン処理し、ヘマチトメータおよびコールター・
カウンタにより細胞を計数したが、他方のフラスコは洗
剤溶解にかけ、すなわち０．３ｍｌ／ｃｍ² ＰＢＳで２
回洗浄し、０．０８ｍｌ／ｃｍ²の溶解緩衝液で２回溶
解させた。これを初期対数増殖期と後期対数増殖期と定
常期との培養物、並びに感染の１週間後、２週間後およ
び３週間後の培養物につき行なった。これら実験の積算
データを図１４に示す。最良の適合直線は式Ｙ（１
０⁴ ）＝−０．０９＋０．４２Ｘによって示される。こ
の図面は、１本の曲線が細胞の「状態」とは無関係に全
蛋白測定による細胞数の推定手段を与えることを示す。

【０１３３】この実験における細胞には１のＭＯＩにて
ＨＡＶ ＣＲ３２６Ｆ Ｐ２８を感染させた。感染の３
週間後に、トリプシン処理は細胞の収穫に有効でなかっ
た。しかしながら、感染の１週間後および２週間後にお
ける細胞密度はほぼ等しく、さらに３週間後における可
視的細胞溶解は存在しないと思われたので、３週間につ
き用いた細胞密度は２週間で得られたデータに基づい
た。図１４を再プロットして、各特定データ点の時間を
示した。感染の３週間後におけるデータを割引いて曲線
の傾斜および交点は大して影響を受けない（図１５参
照）。

【０１３４】上記の相関関係を用い、実施例９で作成し
た数種の培養溶解物に関する全蛋白データは平均して４
９０μｇ／ｍｌの蛋白を与えた。これは約３．３×１０
⁵ 細胞／ｃｍ² に相当し、一般に比較Ｔフラスコにてヘ
マチトメータで測定された細胞密度に一致する。要する
に、トリトン細胞溶解物の全蛋白はウィルス収穫の時点
における細胞密度の有用な近似値を与えると思われる。

【０１３５】実施例１５ 溶剤抽出工程の混合試験 要点 Ａ型肝炎を精製する際、溶剤抽出工程はＰＥＧペレット
段階でまだ存在する不純物を除去するのに重要であっ
た。この工程を充分理解すると共に制御するため、一連
の実験を行なって溶剤抽出の重要なパラメータを決定し
た。２種の重要な変動因子が確認された。すなわち混合
の持続時間および使用瓶の寸法により決定される振とう
の強度である。溶剤と水容積との比は検討した範囲にわ
たり重要な因子でなく、手振とうまたは回動とは異なり
機械的振とう機の使用も重要なファクターでない。

【０１３６】材料および方法 再懸濁したＰＥＧ沈殿物の試料をクロロホルムおよびイ
ソアミルアルコール（２４：１のＣＨＣｌ₃ ：ＩＡＡ）
と０．５：１〜３：１（溶剤と水相との比）の種々の比
率で混合した。激しく手振とうもしくは回動（１５ｍｌ
チューブにつき）または３Ｄ機械振とう機（グラス−コ
ル、テレ・ハウテ、インダストリース社）のモータ速度
１００（１５ｍｌおよび５０ｍｌチューブにつき水平で
止めたチューブ）により混合を行なった。混合時間は２
０秒〜１時間の範囲とした。

【０１３７】混合の後、試料を遠心分離して相を分離さ
せた。５０ｍｌチューブおよび５００ｍｌ瓶につきＪＳ
４．２揺動バケットロータで遠心分離するベックマンＪ
６−ＭＩを３８００ｒｐｍにて１０分間用いた。小型チ
ューブについては先ず最初にダイナックＩＩ型遠心分離
器を１０００ｒｐｍにて５分間用い、次いでその後の実
験には試料を５０ｍｌチューブに移して上記のように遠
心分離した。

【０１３８】水相をガラスピペットで除去すると共に次
の条件下でサイジングＨＰＬＣにより分析した。２本の
ＴＳＫ Ｐ４０００×１型カラム（トソハース）を直列
配置し、移動相をＲＣＭ８（ＣＭ５６３とも呼ばれ、
６．２ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）における１５
０ｍＭのＮａＣｌである）の０．３２ｍｌ／ｍｉｎとし
て２１４および２６０ｎｍにて監視した（８０分間の操
作時間）。結果をピーク面積比、即ち２１４ｎｍのＵＶ
吸光度に基づくピーク面積の比として現す。１５ｍｌチ
ューブにおける最初の実験については、単一のＴＳＫカ
ラムを使用した（４０分間の操作時間）。次いで２本の
カラムを用いると、ＨＥＰ Ａと不純物ピークとの間に
一層良好な分離を得た。

【０１３９】最初に実験を２〜６ｍｌ規模で１５ｍｌチ
ューブにて行ない、試料を手振とうもしくは回動によっ
て混合した。最初の数ロットの結果がばらつく場合は、
混合を機械振とう機にて大きい容積（５０ｍｌチュー
ブ、最高２４ｍｌまで充填）にて行なった。この場合も
試料は製造ロットの処理に際し５００ｍｌ瓶から採取し
た。これら瓶を短時間（たとえば２０秒間）振とうし、
相を約１分間の静置によって分離させ、６００μｌの試
料を上相から除去した。瓶を再び短時間にわたり振とう
機に戻し、次いで再び試料採取した。これら試料をその
後にミクロ遠心分離器で最大速度にて２分間遠心分離し
た。

【０１４０】結果 １．混合時間 １５ｍｌチューブにおける予備的な小規模実験から、混
合時間は重要な変動因子で、混合時間を長くすると良好
な不純物の除去をもたらすと考えられた。図19から明ら
かなように、Ａ型肝炎と不純物との比は混合時間を長く
すると増大する。さらに、図２０から見られるように不
純物のピーク面積は混合時間と共に顕著に減少する。

【０１４１】５０ｍｌチューブの場合も、混合時間は重
要であると結論的に示され、この実験では不純物を最大
除去するのに３分間を要した（図２０）。この場合、分
析は良好な分離を与える直列カラムで行なったが、Ａ型
肝炎の領域における減少は僅かなことが観察された。

【０１４２】混合時間の効果を生産用の５００ｍｌ瓶に
おいても試験した。試料を全部で２分間の混合時間にわ
たり２０秒毎に採取した。この実験を２つの異なる溶剤
比、すなわち２：１および３：１にて行ない、これらは
瓶における２種の異なる水容積に対応する（約６０ｍｌ
および９０ｍｌ、溶剤容積は１８０ｍｌの一定に保っ
た）。図２１は、不純物レベルが混合時間と共に低下
し、１分４０秒の後に完全に除去されたことを示す。生
産用に採用された時間は２分間であり、これは不純物の
顕著な除去を確保する。一層完全な除去には３分間まで
延長される。容積および溶剤の比における差は、使用し
た範囲にわたり僅かの作用しか示さないと思われる。

【０１４３】この実験を５０ｍｌチューブおよび１５ｍ
ｌチューブの両者にて一層長い混合時間まで延長した。
図２２は、同程度の純度が使用した全チューブにて最終
的に得られるが、より小型のチューブでは６〜８分間を
必要とし、５００ｍｌの遠心瓶では２分間未満を要する
ことを示す。これらの差を後記セクション３でさらに検
討する。ウィルスが延長した振とうにより影響を受ける
かどうかを決定するため、５０ｍｌチューブを機械振と
う機で１時間混合した。ＨＰＳＥＣの結果はＡ型肝炎の
ピーク面積がもはや減少しないことを示し、ＥＩＡの結
果（表１）は抗原性が１時間のものでも２分間の混合と
同一であったことを示す。同じロットの工程流の結果も
同様なＥＩＡ値を示す。したがって、製造における不純
物の完全除去を確保するには、グラフで見られるように
最小混合時間はウィルス収率を減少させることなく延長
することができる。

【０１４４】

【表８】 ２．容積比 １回の抽出につき溶剤と水相との容積比はパイロット区
分（磁気攪拌棒にて単一瓶で撹拌）の場合は１．５、例
示ロット（５２０ｍｌ瓶で振とう）については２〜３と
なっている。したがって０．５〜３の容積比が純度に及
ぼす作用を検査した。最初に小規模実験（１５ｍｌチュ
ーブ、１分間の混合）を、出発ＰＥＧ沈殿物の４種の異
なる製造バッチを用いて行なった。図２３は溶剤：水相
比と不純物除去との間に明瞭な相関関係が観察されなか
ったことを示す。データのばらつきは恐らく出発材料の
変動と振とうの不均一性とに基づくと思われる。サンプ
ル寸法を５０ｍｌチューブまで規模拡大し、機械振とう
機を水平方向に止めたチューブで２分間用いた。結果を
図２４に示す。ここでもデータは分散したが、溶剤と水
相との比に基づく明瞭な結果は存在しない。これは、
２：１および３：１の溶剤比にて５００ｍｌ瓶における
混合時間の実験により確認され（図２１）、不純物除去
にて極めて僅かな差しか示さなかった。したがって、溶
剤比は重要な変動因子でないと思われる。溶剤比の増加
は一貫したロットでも純度の向上に貢献しなかった。

【０１４５】３．混合の型式および容器の寸法 小型（１５ｍｌ）チューブでは手振とうと回動との作用
につき傾向は見られなかった。何故なら、結果は異なる
製造ロットからの実験につき変動したからである（図２
３）。図１９に示した単一のデータ点も手振とうと回動
との間で良好な一致を示した。より大型のチューブにお
いて、手振とうと機械振とうとを比較した。図２５にお
いては、手振とうがチューブの同寸法および充填につき
振とう機とは極く僅か異なる差しか生じないことを見る
ことができる。表２は５００ｍｌ瓶における実験からの
結果を示す。６本の瓶のロットから１本を手で混合する
一方、残りを機械的に振とうした。試料を各型式の混合
につき採取し、ＨＰＬＣ分析はこれらが極めて類似して
いずれも高い純度を与えることを示し、振とうの型式は
臨界的でなく、使用した瓶の寸法が極めて重要であり、
しかも５００ｍｌ瓶は振とう機における同じ混合時間に
つき５０ｍｌチューブよりも優秀であることを確認し
た。これについても図２２のデータによって示す。

【０１４６】

【表９】 チューブの充填レベルについても考慮した。１０．５ｍ
ｌ（溶剤＋水相）のレベルまで充填した５０ｍｌチュー
ブは、２１ｍｌの典型的充填と極めて類似した結果を与
えた。同様に、２４０ｍｌもしくは２７５ｍｌを充填し
た５００ｍｌ瓶も同等量の不純物除去を示した（図２
１）。全混合実験にわたり、１５ｍｌチューブをその全
容量の０．１３もしくは０．４倍まで充填した。５０ｍ
ｌチューブについては殆ど容量の０．５３まで充填し
（１つの実験では０．２６）、さらに５００ｍｌ瓶は全
容量の０．４８〜０．５７まで充填した。３種類のチュ
ーブにつき同様なレベルを用いたが、得られた結果は充
填レベルに関連づけることができなかったので、これは
恐らくこの範囲にわたり大した作用を示さないと思われ
る。しかしながら、チューブを完全に満せば、ヘッドス
ペースが存在しなくなり、その混合が困難になると思わ
れる。その結果、これは不純物除去の効率を低下させ
る。

【０１４７】変動すると共に重要となりうる他の因子は
チューブの幅と高さとの比であり、１５ｍｌチューブに
ついては０．１３、５０ｍｌチューブについては０．２
６および５００ｍｌ瓶については０．５８である。より
大きい幅と高さとの比は、得られる振とうパターンがよ
り大きい界面領域を与えるので良好な混合を与えること
ができる。

【０１４８】ＰＥＧペレット中に存在するこの同じ不純
物を持った初期のパイロット試験ロット試験のデータも
検査した。４種のロットを、磁気撹拌棒即ちスピナーを
装着した単一フラスコで１分間にわたり溶剤抽出した。
次いで溶液を遠心分離瓶に分配して遠心分離により相分
離させた。溶剤と水相との比は１．５であった。Ａ型肝
炎と不純物との得られた比は０．４８〜２．７の範囲で
あった。他のパイロット試験用ロットを２５０ｍｌ三角
形遠心分離瓶内で溶剤と水相との比を１にして振とうし
た。得られた純度比（Ａ型肝炎／不純物）は０．８７で
あった。これらの結果は同様な条件下にて１５ｍｌもし
くは５０ｍｌチューブで得られた結果と全て匹敵する
が、フルスケールの例示ロットで得られた４〜２１の典
型的範囲（８バッチにつき）よりもずっと低い。これは
製造規模で混合すべく使用した長い混合時間および大き
い瓶と一致する。

【０１４９】結論 このデータから、フルスケールの例示ロットと初期のパ
イロット試験用ロットとの間における純度の差は振とう
を大型（５００ｍｌ）瓶にて長い時間（２分間対１分
間）にわたり行なった点にあると結論することができ
る。容積効果は恐らく、これら瓶での振とうから生ずる
大きい界面領域に基づくと思われる。５００ｍｌ瓶は典
型的には３００ｍｌ未満のレベルまで満たすに止め、大
きいヘッドスペース領域を残し、これは混合に際し充填
されて広い溶剤／水相／空気の界面領域をもたらし
た。。界面領域の減少は小チューブで得られる溶剤抽出
生成物の低い純度の原因となりうる。しかしながら、混
合時間も重要な変動要因であるため、５０ｍｌチューブ
における純度は最終的に５００ｍｌ瓶におけると同じレ
ベルに達する。

【０１５０】検討した他の変動要因（すなわち溶剤と水
相との比および振とうの型式）は試験した範囲にわたり
重要でないと判明した。

【０１５１】実施例１６ Ａ型肝炎ウィルスの溶解性 上記したように、Ａ型肝炎の顕著な損失が製造ロットか
らの処理流のＨＰＳＥＣ分析に基づいて観察された。精
製に際し、ＨＰＳＥＣでの定量を用いウィルスの５０％
以上が精製のイオン交換カラムクロマトグラフィー工程
とサイズ・エクスクルージョン・クロマトグラフィー工
程との間で１晩に損失したと推定され、この損失と同時
に沈殿物が出現したので、これを遠心分離により除去し
た。

【０１５２】沈殿物がＡ型肝炎であると仮定して、イオ
ン交換カラムからウィルスを溶出させる際により高イオ
ン強度の緩衝液により沈殿を行なわせた。沈澱物を溶解
させる試みを塩化ナトリウムおよび燐酸ナトリウムの水
溶液で行なった。ＨＰＳＥＣ定量を用いるウィルスの損
失に基づき、沈殿物（正確には沈殿物のスラリー）の濃
度は数ｍｇ／ｍｌと推定された。沈殿物スラリーの１部
を６ｍＭの燐酸ナトリウム、０．１５Ｎの塩化ナトリウ
ムと６ｍＭの燐酸ナトリウム中で或いは０．３Ｎの塩化
ナトリウムと６ｍＭの燐酸ナトリウム中で或いは０．５
Ｎの塩化ナトリウムと６ｍＭの燐酸ナトリウム中で或い
は１Ｎの塩化ナトリウムと６ｍＭの燐酸ナトリウム中で
それぞれ混合した。

【０１５３】６ｍＭ燐酸ナトリウムと混合した場合、た
とえ少量でも沈殿物は数秒間以内に溶解した。しかしな
がら塩化ナトリウムを含有する溶液と混合した場合、外
観上の大きい変化は観察されなかった（明瞭な希釈を除
く）。Ａ型肝炎の保存溶液を、０．３５ｍｌのスラリー
を５．６５ｍｌの６ｍＭ燐酸ナトリウムで溶解して作成
した。僅か約０．５ｍｌの燐酸ナトリウム溶液を添加す
ると、眼に見える粒子の完全な溶解が生じたことが注目
された。保存溶液の試料を種々異なる量の１Ｎ塩化ナト
リウムと６ｍＭ燐酸ナトリウム中で混合して０．１５
Ｎ、０．３Ｎもしくは０．５Ｎの塩化ナトリウムの目標
濃度に達せしめた（表Ｉ）。

【０１５４】

【表１０】 次いで、これら溶液の濃度をＨＰＳＥＣにより定量し、
次いでその２週間後にＨＰＳＥＣにより定量した。これ
らデータを表ＩＩに示すと共に図２７および２８にプロ
ットする。

【０１５５】図２７は、塩を添加してから約１日後に溶
液で測定したＡ型肝炎の初期濃度を示す。保存溶液はＨ
ＰＳＥＣにより約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度を有すると
推定され、これは沈澱スラリーにおける約２ｍｇ／ｍｌ
に相当する（このスラリーにおけるＡ型肝炎の量は、製
造に際し観察された損失に大凡相当する。沈殿物は極く
少量の燐酸塩溶液の添加でも溶解することが観察された
ので、僅かな塩水を含む溶液における溶解度は約１ｍｇ
／ｍｌより大またはそれに等しいと推定される）。塩化
ナトリウムを含有する溶液における抗原の濃度は、保存
溶液を塩水で希釈して得られるよりもずっと低かった。
さらに、塩水を含有する溶液のＨＰＳＥＣ分析は、凝集
した物質が塩含有の溶液に大比率で存在することを示し
た（表ＩＩ）。

【０１５６】

【表１１】 これは、Ａ型肝炎が凝集し、次いで５０ｍｃｇ／ｍｌ未
満の濃度においても塩水中に存在する場合には溶液から
沈澱することを示す。図２７はさらにイオン交換カラム
から溶出させた生成物の大凡の組成を示す（点ＩＥＰと
して示す）。これは１日でさえ溶液中に維持しうる抗原
のレベルよりも顕著に高く、したがって精製工程に顕著
な変化をなすことなく、生成物をイオン交換カラムから
溶出した直後に希釈する必要がある。希釈を最小化させ
ると共に製造用サイズ・エクスクルージョン・カラムに
充填する容積を最少化させるには、希釈を６ｍＭの燐酸
ナトリウムで行なって公称ｐＨ制御を維持すると共にイ
オン強度および抗原濃度を減少させねばならない。１：
１の希釈は抗原濃度をＩＥＰ^* により示される図２７の
曲線の下にて燐酸塩における約２５ｍｃｇ／ｍｌおよび
１５０ｍＭの塩化ナトリウムとなるような点まで減少さ
せうると推定された。このデータに基づき、精製工程に
希釈を追加した。

【０１５７】図２８は１日目および１４日目に上記した
溶液で測定した濃度を示す。抗原の濃度は１日目と１４
日目との間に低下し、さらに１：１の希釈は抗原を溶解
度曲線以下に希釈せず、ウィルス溶液を安定化させて凝
集および沈澱の開始を遅延させるよう作用することが明
かである。さらに希釈の最適化により生成物収率をさら
に増大させることが可能である。

【０１５８】最後に、保存溶液がＡ型肝炎を含有するが
ＨＰＳＥＣで同時溶出する他の物質を含有しないことを
検査するため、保存溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染
色にかけた。ＳＥＣ生成物と比較して、同じ蛋白バンド
が出現した。

【０１５９】実施例１７ Ａ型肝炎精製試料を監視するための高性能サイズ・エク
スクルージョン・クロマトグラフィー 序論 Ａ型肝炎の精製に際し工程性能を解析すると共に監視す
る方法を開発した。２１４ｎｍおよび２６０ｎｍにおけ
るＵＶ検出を伴う分析用の高性能サイズ・エクスクルー
ジョン・クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）は、Ａ型肝
炎ウィルスと重要な不純物（凝集物、核酸−Ａ型肝炎ア
ダクト、および６６０ｋＤａの不純物）の工程試料にお
ける相対量の分析を与える。さらに、ＨＰＳＥＣを用い
て最後の３精製工程（抽出、イオン交換および製造用Ｓ
ＥＣ）からの試料におけるＡ型肝炎の濃度を定量する。
この分析を用いてベンゾナーゼ消化の性能を監視すると
共に、その後の操作指標として各処理工程におけるＡ型
肝炎不純物プロフィルの識別特徴を与える。

【０１６０】１０種の製造用ロットからのＡ型肝炎処理
試料をＨＰＳＥＣにより分析して、全精製段階につき処
理性能データを与えた。これら分析からのデータは他の
安定性およびスパイク試験と共に、ＨＰＳＥＣ分析の有
効性とＡ型肝炎処理コンシステンシーの明瞭な指標との
両者を与える。

【０１６１】この実施例は、ＨＰＳＥＣ分析のための確
認データと１０種の製造用ロットの分析結果との両者を
要約する。その説明を以下のセクションに要約する： セクションＩ ：装備およびクロマトグラフ条件 ＨＰＳＥＣカラムおよびＨＰＬＣ装備と操作条件の説明 セクションＩＩ ：分析および検量手順 検量標準の作成および分析手順の説明 セクションＩＩＩ：直線性、精度および再現性 統計評価 セクションＩＶ ：結果の解析 １ロットから１組のクロマトグラムを示すと共に、各処
理試料につき得られる警告限界につき推奨されるデータ
の説明 セクションＶ ：試料貯蔵条件 貯蔵試験を各種類の処理試料につき行なって４〜６℃の
安定性を決定した セクションＶＩ ：ＥＩＡの結果とＨＰＳＥＣの結果の
比較 セクションＶＩＩ：処理性能コンシステンシー 付録Ａ ：１０ロットからの処理試料のＨＰＳ
ＥＣ分析に関する結果。 セクションＩ：装備およびクロマトグラフ条件 材料および試薬 ６ｍＭの燐酸ナトリウムと１２０ｍＭの塩化ナトリウム
とを含有するＣＭ８０（ＭＭＤ）燐酸塩緩衝塩水、ｐＨ
７．２。

【０１６２】装備 （カラムを除いては均等物で置換することもできる） ＨＰＬＣ系：１０ｍｌの塩洗浄ヘッドを装着したＲＡＩ
ＮＩＮラビットポンプ；自動サンプリング装置：試料ラ
ックを２〜６℃に維持するための循環冷凍機を装着した
ＲＡＩＮＩＮ ＡＩ−１； 検出器：ＲＡＩＮＩＮ ＵＶ−Ｍ２チャンネルＵＶ検出
器； データ獲得システム：ダイナマックスＨＰＬＣ法マネー
ジャ、バージョン１．１、アプル・マッキントッシュＳ
Ｅで操作； カラム：トソハースＴＳＫ ＰＷ４０００×１、７．８
×３００ｍｍＬ； ＨＰＬＣ微小瓶：ガラスもしくはポリプロピレン。

【０１６３】クロマトグラフ条件 カラム：トソハースＴＳＫ ＰＷ４０００×１、７．８
×３００ｍｍＬ； 移動相：ＣＭ８０（６ｍＭ燐酸ナトリウム、１２０ｍＭ
塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）； 流速：０．３２ｍｌ／ｍｉｎ； 検出：ＵＶ２１４ｎｍおよび２６０ｎｍ、＠１Ｖ検出器
出力； 注入容積：５０μｌ； 注入間の操作時間：５５分間。

【０１６４】ＴＳＫ ＰＷ４０００×１カラム 用いたカラムはＴＳＫ ＰＷ４０００×１であって、メ
タクリレート系の５μｍ支持体を内蔵する。酸化ポリエ
チレン（ＰＥＯ）標準から作成した検量曲線を以下に示
す。破線は興味ある３種の溶質、すなわちＡ型肝炎凝集
体、Ａ型肝炎および６６０ｋＤａ汚染物の保持時間を示
す。さらに破線により２種の低分子量疎水性化合物、す
なわちビタミンＢ１２およびアセトンの保持時間をも示
す。両化合物は検量線の右側に位置し、これら化合物が
保持されるということはこの高分子支持体の疎水性を示
す。保持されたピークが数種の処理試料で観察される
（図２９参照）。これらは一般に塩ピークの近くで溶出
し、低分子量化合物であると推定される。

【０１６５】セクションＩＩ：分析および検量手順 検量標準の作成 ６レベルの検量線を用いてＡ型肝炎を定量する。検量標
準は、精製されたＡ型肝炎生成物を希釈して作成され
る。１２μｇ／ｍｌの濃度を有するＳＥＣ生成物を標準
として使用した。０．７５〜１２μｇ／ｍｌの濃度範囲
を包含する６種の検量標準を、下表に示したＣＭ８０で
のＳＥＣ生成物の希釈により作成する。

【０１６６】

【表１２】 Ａ型肝炎溶液およびＣＭ８０をＨＰＬＣ微小瓶に直接添
加して標準を作成する。Ａ型肝炎の検量曲線は、Ａ型肝
炎ピーク面積の対数を濃度の対数に対しプロットして作
成される。典型的な検量線を図３０に示す。

【０１６７】検量線データの対数−対数変換を行なった
のは、高濃度の検量標準に対する検量線の依存性を減少
させるためである。生物学的高分子のクロマトグラフィ
ーに関し、データの変動は濃度の増加と共に増大する傾
向を有する。ＨＰＬＣ検量線については回帰線の傾斜を
主として最高濃度標準により決定し、これも極めて変動
しやすい。

【０１６８】１３本のＡ型肝炎の標準曲線（２か月間に
わたり上記のように作成）のグラフを図３１に示す。左
側には１３本の曲線の線状グラフを示し、右側には同じ
１３本の曲線の対数−対数変換を示す。線状グラフは共
通始点からの顕著な曲線の「拡開」を示し、これは明か
に濃度が増大するにつれＡ型肝炎ピーク面積の変動も増
大することを示す。その結果は曲線間の勾配変動であ
る。

【０１６９】これら検量曲線の対数−対数変換は、全濃
度範囲にわたり変動（ＲＳＤ）を一定にする。その結
果、図３１Ｂに示したように曲線間の勾配変動が減少す
る。

【０１７０】試料作成手順 Ａ．Ａ型肝炎処理試料： 次の工程からの処理試料を分析する： １．濾過溶解物 ２．ヌクレアーゼ処理した濾過溶解物 ３．再懸濁したＰＥＧ沈殿物 ４．クロロホルム抽出した水相 ５．陰イオン交換生成物 ６．サイズ・エクスクルージョン生成物。

【０１７１】濾過溶解物と、ヌクレアーゼ処理した濾過
溶解物と、サイズ・エクスクルージョン生成物との試料
は注入前に希釈してはならない。再懸濁したＰＥＧ沈殿
物試料は、注入前に残留微粒子を除去すべく遠心分離せ
ねばならない（１０，０００×Ｇ、５分間）。再懸濁し
たＰＥＧ沈殿物試料を注入前にＣＭ８０にて１：４（ｖ
／ｖ）に希釈する。クロロホルム抽出した水相および陰
イオン交換生成物は未希釈で分析し、さらに注入前にＣ
Ｍ８０により１：１（ｖ／ｖ）で希釈して分析し、濃度
を検量曲線の範囲内にする。全試料につき分析を３反復
で行ない、これら３回の分析の結果を平均する。試料は
２〜６℃にて自動サンプリング装置に貯蔵して注入を待
つ。

【０１７２】トリトンはＴＳＫ ＰＷ４０００×１カラ
ムに弱く保持され、これを除去するにはさらに溶出液を
必要とする。したがって、トリトンを含有する試料（濾
過溶解物およびヌクレアーゼ処理した濾過溶解物）には
次いでＣＭ８０ブランクを注入して、次の試料の注入前
に除去を確保せねばならない。試料は、ＳＥＣ生成物か
ら開始して逆順序で行ない、後の溶出妨害ピークを避け
ることができる。

【０１７３】分析手順 １．６種の検量標準のそれぞれ５０μｌを注入する。Ａ
型肝炎の保持時間は１９．０±１分間とすべきである。

【０１７４】２．上記したように試料を作成し、５０μ
ｌを注入する。各試料を３反復で分析する。

【０１７５】セクションＩＩＩ：直線性、精度および再
現性 ０．７５〜１２．０μｇ／ｍｌの範囲を包含する１３本
の検量線を５週間にわたり１３の異なる日に作成した。
各曲線につき得られた回帰式を用いて、その曲線を含む
検量標準のそれぞれの濃度を計算する。１３本の曲線か
ら計算された結果をこれら６種の検量標準の公称濃度と
比較して下表１に示す。

【０１７６】

【表１３】 日付間の再現性は６種の全検量レベルにつき極めて良好
であり、全濃度範囲にわたりＲＳＤ値は３％未満であ
る。精度も極めて良好である。１２、９、６、３、１．
５および０．７５μｇ／ｍｌの標準につき、測定濃度は
全て公称濃度の５％以内であった。

【０１７７】スパイク試験 ＨＰＳＥＣ分析の特異性および精度をさらに評価するた
め、スパイク実験を行なった。

【０１７８】陰イオン交換生成物およびクロロホルム抽
出した水相試料を、同一ロットからの同容積のＳＥＣ生
成物で補強した。その結果を下表２に示す。試料は全て
３反復で分析した。

【０１７９】

【表１４】 両試料につき、ＨＰＳＥＣ濃度測定のための特異性およ
び精度を示す完全なスパイク回収が見られた。

【０１８０】セクションＩＶ：結果の解析 要約 シリーズとしてＨＰＳＥＣクロマトグラムはＡ型肝炎精
製処理の状況を示す。濾過溶解物とヌクレアーゼ処理し
た溶解物との比較はベンゾナーゼ活性の確認を与える。
これら試料につき、２１４ｎｍおよび２６０ｎｍの両者
におけるクロマトグラムを得ると共に積分する。

【０１８１】最後の４種の処理試料、すなわち再懸濁し
たＰＥＧペレット、クロロホルム抽出した水相、陰イオ
ン交換精製物およびＳＥＣ生成物の比較は、２種の主た
る工程汚染物、すなわち凝集物質および６６０ｋＤａの
蛋白汚染物の浄化状況を示す。これら試料に関するＡ型
肝炎面積％の計算は、各処理工程がこれら汚染物を除去
すべく設計したように機能することを確認する。最後に
ＨＰＳＥＣ分析を用いて最後の３処理工程におけるＡ型
肝炎の濃度を計算する。

【０１８２】ＭＭＤにて製造した１０種のＡ型肝炎ロッ
トからの濾過溶解物、ヌクレアーゼ処理溶解物、再懸濁
ＰＥＧペレット、クロロホルム抽出水相、陰イオン交換
生成物およびＳＥＣ生成物の試料をＨＰＳＥＣにより分
析した。各処理試料に関するクロマトグラフプロフィル
は、これら１０ロットにわたり極めて再現性良好であっ
た。

【０１８３】このセクションにおいては、６処理試料の
それぞれにつきクロマトグラムを示すと共に、各試料か
ら得られた情報および３反復の分析の典型的な結果を説
明する。

【０１８４】濾過溶解物およびヌクレアーゼ処理溶解物 各ロットからの濾過溶解物およびヌクレアーゼ処理溶解
物試料のクロマトグラムを２１４ｎｍおよび２６０ｎｍ
の波長で得た。これら試料のそれぞれにつき、２１４ｎ
ｍで得られたクロマトグラフプロフィルは２６０ｎｍで
得られたプロフィルと完全に異なる。これらクロマトグ
ラムの比較解析は、これら試料のＨＰＳＥＣ分析の目的
を反映する。その目的は、ベンゾナーゼ消化の完全性を
示す濾過溶解物とヌクレアーゼ処理溶解物との間の定量
可能な差を見出だすことにある。したがって、このセク
ションでは濾過溶解物とヌクレアーゼ処理溶解物とのプ
ロフィルを先ず最初に２１４ｎｍにて比較し、次いで２
６０ｎｍで同じ比較を行なう。各試料から得られた特性
データを、ベンゾナーゼ活性の完全性を定量するため推
奨されるものとして示す。

【０１８５】２１４ｎｍにおける濾過溶解物およびヌク
レアーゼ処理溶解物 ２１４ｎｍにおける濾過溶解物およびヌクレアーゼ処理
溶解物のクロマトグラムを図３２に示す。２１４ｎｍに
て、両試料は一連の部分的に別れたピークを示す。これ
ら試料では区分が不良のため、Ａ型肝炎領域における個
々のピークの積分は不可能である。２１４ｎｍにてこれ
ら試料から得られる唯一の情報は全ピークに関するＵＶ
面積合計である。これら試料の３反復分析の結果を下表
に示す。このＵＶ_214nm 面積合計は３６分時点の保持ピ
ークを含まない。ヌクレアーゼ処理溶解物試料のＵＶ
_214nm 面積合計は、ベンゾナーゼ消化の結果として濾過
溶解物試料よりも１５％低い。さらに２種のクロマトグ
ラムの肉眼比較（図３２）はＡ型肝炎領域における吸光
値の損失を示す。しかしながら、この消化の明確な測定
は関与するピークの別れ方が悪いため不可能である。Ｕ
Ｖ_214nm 面積合計が９ロットにつき得られ、これら数値
を実施例１７：付録Ａに示す。これらＵＶ_214nm 面積合
計は直接的または独特な処理性能情報を与えず、その使
用は単に試料の安定性を監視するに過ぎず、したがって
ＵＶ_214nm 面積合計を計算することは日常の記録には必
要でない。

【０１８６】

【表１５】 ２６０ｎｍにおける濾過溶解物およびヌクレアーゼ処理
溶解物 ２６０ｎｍにおける濾過溶解物およびヌクレアーゼ処理
溶解物のクロマトグラムを図３３に示す。２６０ｎｍで
は、濾過溶解物は５〜６個の別れたピークを示して一層
明確なプロフィルとなる。１７．２分および１９．１分
の保持時間を有する最初の２つのピークはＡ型肝炎−核
酸アダクトおよびＡ型肝炎からなっている。両ピークは
これらに付加した或る程度の核酸を有するので、これら
は２６０ｎｍのＨＰＳＥＣプロフィルを支配する。

【０１８７】２６０ｎｍにおける濾過溶解物試料とヌク
レアーゼ処理溶解物との比較（図３３Ａおよび３３Ｂ）
は、ベンゾナーゼ活性を明瞭かつ明確に確認する。濾過
溶解物試料に見られる顕著なピークはベンゾナーゼ消化
により完全に除去され、図３３Ｂは１７〜１９分にて識
別可能なピークを示さない。

【０１８８】ベンゾナーゼ消化の確認 ９ロットからの濾過溶解物およびヌクレアーゼ処理溶解
物試料の分析を表１７−３に示す。これら試料に関する
１７分および１９分のピークのＵＶ_260nm 面積は、ベン
ゾナーゼ添加が全試験ロットにつきこれらピークの完全
除去をもたらすことを示す。したがって、この試料につ
きベンゾナーゼ活性を確認するため推奨される基準は、
ヌクレアーゼ処理溶解物における１７＋１９分ピークＵ
Ｖ_260nmが濾過溶解物におけるピークの１０％未満まで
減少することである。

【０１８９】

【表１６】

【０１９０】

【表１７】 再懸濁ＰＥＧペレット試料 図３４には２１４ｎｍにおける再懸濁ＰＥＧペレット試
料のクロマトグラムを示す。この試料の特徴的プロフィ
ルは数個の部分的に別れたピーク、すなわち凝集物質、
Ａ型肝炎ピーク、６６０ｋＤａ汚染物、他の低分子量汚
染物および塩ピークで構成される。

【０１９１】Ａ型肝炎面積％をこの試料につき計算（Ａ
型肝炎ピーク面積／ピーク面積合計×１００）するが、
面積合計に塩ピークは含まない。再懸濁ＰＥＧペレット
試料の３反復の分析結果を下記に示す。

【０１９２】

【表１８】 この試料の典型的なプロフィルは主成分として６６０ｋ
Ｄａ汚染物を有し、凝集物の量はこれら成分のうち最も
変動が大きい。典型的ロットにおける凝集物の量は見ら
れるよりも低い。１０ロットからの再懸濁ＰＥＧペレッ
ト試料におけるＨＰＳＥＣ分析の結果を付録Ａの表Ａ２
に示す。Ａ型肝炎面積％の数値は１８．５％〜３２．０
％の範囲である。これらは全て次の処理工程により精製
することに成功した。

【０１９３】したがって、この試料には厳密な警告限界
は必要でない。１８％より大の所定の面積％値も許容し
うるが、より低い面積％値を示すものについてはこれら
にＡ型肝炎プロセスで遭遇するまで判らない。

【０１９４】クロロホルム抽出水相試料 クロロホルム抽出水相試料のクロマトグラムを図３５に
示す。この試料ではＡ型肝炎ピークが主たるピークであ
り（塩ピークを除く）、これは６６０ｋＤａ汚染物およ
び少量の凝集物とよく別れている。

【０１９５】この試料につきＡ型肝炎濃度を測定し、Ａ
型肝炎面積％を計算する。面積％の計算には塩ピークを
含めない。クロロホルム抽出水相試料の３反復分析の結
果を下記に示す。

【０１９６】

【表１９】 １０ロットからのクロロホルム抽出水相試料のＨＰＳＥ
Ｃ分析結果を付録Ａの表Ａ２に示す。全ロットに関する
Ａ型肝炎面積％値は６０．０〜７２．８％の範囲であ
り、２つの半量ロットは顕著に高く面積％値がそれぞれ
７９．４および８５．２％であった。Ａ型肝炎濃度は１
４．４〜２９．７μｇ／ｍｌの範囲で一層変動が大であ
った。Ａ型肝炎濃度の変動性は、コンシステンシーロッ
トにおける上流試料容積の変動に関連するやもしれな
い。

【０１９７】ＰＥＧペレット（図３４）とクロロホルム
抽出水相（図３５）とのＨＰＳＥＣプロフィルの比較
は、Ａ型肝炎プロセスに対するこの抽出工程の重要性を
明瞭に示す。この工程は、Ａ型肝炎の顕著な収率損失な
しに多量の６６０ｋＤａ汚染物を選択的に除去する。６
６０ｋＤａ汚染物はその後の２回のクロマトグラフィー
工程でも除去しうるが、いずれにおいても６６０ｋＤａ
が供給溶液の主成分である場合は、Ａ型肝炎の収率低下
を伴うピーク削減手法が必要とされる。さらに広範な最
適化実験が示したところでは、抽出効率は混合時間の変
化に対し極めて敏感である（実施例１５）。クロロホル
ム抽出水相に関するＡ型肝炎面積％値は、抽出および不
純物除去の成功を工程内で定量的に証明する。

【０１９８】したがって、＞６０％のＡ型肝炎面積％値
の警告限界がクロロホルム抽出水相試料につき推奨され
る。６０％未満の面積％値は、特にこれが定期的に生ず
る場合には、処理（たとえば処理混合装置）に大きい問
題があると考えるべきである。

【０１９９】陰イオン交換生成物 図３６には陰イオン交換生成物試料を示す。Ａ型肝炎ピ
ークがこの試料の主たる成分であって、少量の凝集物と
６６０ｋＤａ汚染物と低分子量汚染物も存在する。

【０２００】この試料につきＡ型肝炎濃度を測定すると
共に塩ピークおよび保持ピークを除きＡ型肝炎面積％も
測定する。Ｒｘ２００９８５４からの陰イオン交換生成
物試料における３反復分析の結果を下記に示す。

【０２０１】

【表２０】 １０ロットからの陰イオン交換生成物試料のＨＰＳＥＣ
分析結果を付録Ａの表Ａ２に示す。得られた面積％値は
全ロットにつき７８．６〜８７．４％の範囲であり、半
量ロットでは９０％より大である。半量ロットにつき見
られる増大した面積％値は、これらロットに対する供給
物の純度増大を考慮すれば驚くに当らない。

【０２０２】濃度値はこれらロットにつき相当な範囲
（２倍以上）にわたっており、抽出工程につき観察され
た数値と同様にこの変動は恐らくこれらロットのサンプ
リング変化に基づくものと思われる。

【０２０３】Ａ型肝炎プロセスにおいて、陰イオン交換
クロマトグラフィーは仕上工程として機能する。これは
或る程度の６６０ｋＤａ汚染物と他の低分子量化合物と
を除去するが、陰イオン交換生成物の純度はこの工程に
対する供給物の純度に依存し、ピーク削減に基づく収率
ロスなしに多量の６６０ｋＤａを除去することができな
い。したがって、この工程は上流処理における欠陥を補
うことができない。典型的にはＡ型肝炎面積％は陰イオ
ン交換クロマトグラフ工程にわたり１０〜２０％増大
し、供給物純度が高いほど得られる生成物純度も高くな
る。この試料につき推奨される警告限界は＞７５％の面
積％値およびこの工程にわたる＞１０％の面積％増加で
ある。両基準が満される場合、処理および陰イオン交換
工程は両者とも予期したように機能する。上流工程が失
敗した場合には、陰イオン交換工程それ自身で＞７５％
の面積％値を得られないことがありうる。＞１２％の面
積％増加が得られないようなときには、恐らくたとえば
ピーク収集の間違い或いはカラムにチャンネリングが起
こるような陰イオン交換工程に極めて特異的な処理問題
を示す。

【０２０４】サイズ・エクスクルージョン・クロマトグ
ラフィー（ＳＥＣ）生成物 ＳＥＣ生成物プロフィルは、たとえばＳＥＣ生成物につ
き図３７に示したように高度精製されたＡ型肝炎を示
す。

【０２０５】この試料につきＡ型肝炎の濃度を測定す
る。ＳＥＣ生成物の２反復分析の結果を下記に示す。

【０２０６】

【表２１】 １０ロットからのＳＥＣ生成物のＨＰＳＥＣ分析結果を
付録Ａの表Ａ２に示す。この試料につき面積％値は計算
しなかった。図３７に示したプロフィルは明らかに高純
度の生成物を示し、検出しうる量の凝集物および６６０
ｋＤａの汚染物を含まない。しかしながら、６０分まで
のＳＥＣ生成物の分析は、図３８に示すように約４９分
における少量の保持ピークの存在を示した。このピーク
の大きさはロット毎に異なり、図３８に示したロットが
現在まで観察された最高量を示す。この保持ピークの確
認を、この試料の面積％値の計算がその純度を示す前に
行なうべきである。この同定がなされるまでは、この試
料の面積％値は排除容積と包含容積との間のピークのみ
（１６〜３２分の保持時間）を対象とする。これらの制
限内でいう限り、現在まで試験した全ロットの面積％値
は１００％である。

【０２０７】セクションＶ：試料安定性 工程内試料はＨＰＳＥＣおよびＥＩＡにより測定して数
か月まで安定であることが証明された。イオン交換工程
にて少ない損失（一般に１０％未満）が２週間にわたり
観察されうる。しかしながら、この初期の減少の後、こ
れら試料でさえ安定に留まる。さらに、最終ＳＥＣ生成
物は少なくとも１年間まで安定である。

【０２０８】セクションＶＩ：ＥＩＡとＨＰＳＥＣとの
結果の比較 ３種の試料（クロロホルム抽出水相、陰イオン交換生成
物およびＳＥＣ生成物）につき１１ロット（ロット２〜
１２）から得られたＥＩＡおよびＨＰＳＥＣの結果を比
較した。

【０２０９】これら３３種の試料につきＥＩＡ濃度の対
数に対しプロットしたＨＰＳＥＣ濃度の対数を示すグラ
フを図３９に示す。このデータに適合する回帰線は０．
８８の勾配および０．９４の相関係数（ｒ）を与える。
１に近い勾配値および０．９４のｒ値は、特に各測定の
固有の変動を考慮して、これら２種の分析の間に極めて
良好な相関関係が存在することを示す。

【０２１０】セクションＶＩＩ：処理性能コンシステン
シー ロット２〜１４のＨＰＳＥＣ分析は極めて安定かつ再現
性のある処理を示す。製造に際し生成したバッチから採
取された工程内試料の徹底的なＨＰＳＥＣ分析に基づ
き、精製処理は主たる汚染物の浄化につき優秀な再現性
を示す。図４０はこの一尺度を与え、ここでモノマーウ
ィルスの面積％を各バッチに対しプロットした。最後の
４精製工程に関するこの流れ組成の尺度は、これらバッ
チでよく傾向が一致していることを示す。抽出工程およ
び陰イオン交換工程にて高純度を示すロット１０および
１１は両者とも半量サイズのロットである。

【０２１１】実施例１７：付録Ａ 表１７−Ａ１ 溶解物およびヌクレアーゼ処理溶解物試料のデータ要約 試料は全て３反復で分析し、これら３回の分析結果を平
均した。

【０２１２】

【表２２】

【０２１３】

【表２３】 表１７−Ａ２ 再懸濁ＰＥＧペレット、クロロホルム抽出水相、陰イオ
ン交換生成物 およびＳＥＣ生成物試料のデータ要約 試料は全て３反復で分析し、これに３回の分析結果を平
均した。

【０２１４】

【表２４】 実施例１８ 臨床試験結果 本発明の精製ワクチンを健康な人間に投与した。重大な
ワクチン由来の副作用は認められなかった。

【０２１５】ワクチンを２５単位で１回投与したときの
効果をモンロー試験にて子供で示し、その結果をニュー
・イングランド・ジャーナル・オブ・メジスンの１９９
２年８月１３日版［Ｗｅｒｚｂｅｒｇｅｒ等、ＮＥＪＭ
３２７（ｎｏ．７）；４５３−４５７（８月１３日，１
９９２）］にて公表した。モンロー試験材料と生産材料
との間の相違（いずれも本発明の１部を構成する）を図
１に示し、いずれもローラボトルで製造され機械的手段
により収穫された相Ｉ／ＩＩ試験で使用された材料とは
異なり、生産規模に関する制約がその処理に示唆されて
いる。本発明によるＡ型肝炎ウィルスの精製調製物の２
５単位投与量（２５ｎｇ ＨＡＶ蛋白）は、４週間の免
疫化にて２〜１６歳の子供および未成年につき９５％以
上の血清変換を達成するのに充分である。この同じ量
が、１回のワクチンを接種してから僅か２１日間で子供
および未成年にて１００％の保護を与えることが示され
た。

【０２１６】成人における反応変数として体重および年
齢を検討した。２５単位を１回投与してから１か月に
て、成人（≧１８歳）の８３％並びに子供および未成年
（２〜１７歳）の９７％が血清変換される。２週間離し
て投与した２５単位の２回の投与は成人における血清変
換率を９３％まで増大させる。第２回もしくは第３回の
２５単位を投与してから７か月後における血清変換は、
両年齢群とも９９％より高い血清変換を与える。血清陽
性の持続期間は両年齢群とも１２か月まで、および３６
か月までで約１００％である。したがって、接種者の少
なくとも８０％に１か月以内の免疫化で血清変換を達成
するには、１回の２５単位投与にて充分であることが明
かである。このデータを表１８−１に要約する（処方は
０および２４週間または０、２および２４週間にて投与
した２５単位投与を示し、ＧＭＴ＝幾何平均抗−ＨＡＶ
抗体力価である）。より多量投与による免疫化はより高
比率の接種者にて血清変換を誘発する。

【０２１７】

【表２５】 上記データの他に、４週間にて血清陰性であると判明し
た１群の患者（全部で２３例）を２４週間で再試験し、
さらに２８週間にて既往症反応の顕現につき試験した
（抗体力価における＞１０倍の増加）。２名は６か月の
投与後における約６倍の力価増加を示した。残り２１名
（９１％）は血清変換と既往症反応とを示した。したが
って、これら個人は難解な血清変換体であって、免疫化
後の長期にわたり見掛上は血清陰性であっても本発明の
ワクチンで免疫化して保護されると思われる。

【図面の簡単な説明】

【図１】臨床試験用のＡ型肝炎ウィルスワクチンの製造
に用いた主工程の複合流れ図。左側列はローラボトル法
を用いた相Ｉ／ＩＩ臨床試験につき用いられた従来技術
の方法を示す。モンロー効果試験［Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．，３２７：４５３−４５７
１９９２）］につき用いた新規な方法を右側列に示し、
本発明の製造方法を中央に示す。

【図２】燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）で溶出させるＨＰＳ
ＥＣ−ＴＳＫ ＰＷ４０００カラムを用いる工程内サイ
ジング分析。この分析は、高分子量の標準物質に対し検
量されてＡ型肝炎ウィルス希釈に対する直線面積応答を
示す。この分析は精製の後期段階で特に有用である。製
造法の最後の４工程から４種のクロマトグラムをここに
示す。クロマトグラフィーは、それぞれ２１４ｎｍ（上
側の曲線）および２６０ｎｍ（下側の曲線）における二
重のＵＶ検出で監視した。この分析を用い、Ａ型肝炎ウ
ィルスに対応するピークがＰＥＧペレットの再懸濁後に
初めて見られる（パネルＡ）。クロロホルム抽出工程は
高分子量ＵＶ吸収性物質の多くを除去する（パネル
Ｂ）。陰イオン交換クロマトグラフィーはウィルスを濃
縮するよう作用し（パネルＣ）、さらに製造用サイズ・
エクスクルージョン・クロマトグラフィーは高度に精製
されたウィルス調製物を生成する（パネルＤ）。精製さ
れたＡ型肝炎ウィルスは２６０ｎｍもしくは２８０ｎｍ
範囲では吸光度が低く、したがって２１０ｎｍの曲線の
みを示す。この分析の条件下にてＨＡＶ生成物は単一の
対称的ピークであり、したがって分析はＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅによる分析とは無関係にＨＡＶ純度の尺度を与える。

【図３】ガラス、ポリスチレンおよび３１６ステンレス
鋼でのＭＲＣ−５細胞の増殖。細胞表面濃度を時間の関
数としてプロットする。細胞を各材料のクーポン上に約
１０，０００個／ｃｍ² の密度で接種し、毎日１枚のク
ーポンを用いて細胞を計数した。ガラススライドおよび
３１６ステンレス鋼クーポンにおける細胞は、９０ｍｌ
の培地を含有する１５０ｃｍ² のペトリ皿（０．６ｍｌ
／ｃｍ² ）で培養し、２５ｃｍ² のＴ−フラスコで増殖
した細胞を７．５ｍｌの培地（０．３ｍｌ／ｃｍ² ）で
培養した。

【図４】３１６ステンレス鋼クーポンで増殖させた細胞
に関するＭＲＣ−５細胞増殖および残留グルコース濃
度。細胞表面濃度（細胞個数／ｃｍ² ）およびグルコー
ス濃度（ｍｇ／ｃｍ² ）を、２５ｃｍ² ステンレス鋼ク
ーポンで増殖させた細胞につき時間（日）の関数として
プロットする。

【図５】ステンレス鋼ガーゼで増殖するＭＲＣ−５細胞
の光学顕微鏡図。細胞を５，０００〜１０，０００個細
胞／ｃｍ² にて接種し、２週間以上にわたり培養した。
倍率４０倍。

【図６】３１６ステンレス鋼ガーゼで増殖させたＭＲＣ
−５細胞の生存および非生存染色。細胞を実施例１４の
材料および方法のセクションに記載した手順によりフル
オレセンジアセテート（ＦＤＡ）および臭化エチジウム
（ＥＢ）で染色し、次いで走査型レーザー共焦顕微鏡で
観察した。材料を５７μｍの増分にて走査した。図６Ａ
はフルオレセンからの蛍光に対応し、生存細胞を示す。
図６ＢはＤＮＡの臭化エチジウム染色による蛍光を示
し、細胞のほぼ完全な生存性を示す。臭化エチジウムの
プラス比較を図７に示す。

【図７】非生存ＭＲＣ−５細胞の臭化エチジウム染色。
３１６ステンレス鋼ガーゼで増殖させた細胞を１００％
メタノールでの処理により非生存性にした。ＰＢＳで充
分洗浄すると共に乾燥させた後、細胞をＦＤＡ／ＥＢに
より染色してＦＤＡ用のマイナス比較および臭化エチジ
ウム用のプラス比較として用いた（写真）。マイナス比
較となるフルオレセン生成による蛍光は検出されなかっ
た。

【図８】重力沈降または培地循環を用いる方法につき、
ガーゼ静的ミキサー反応器における各部材に関し植菌効
率をプロットする。部材には１〜５の番号を付し、１は
頂部部材であり、４もしくは５は底部部材である（４個
の部材を重力沈降実験に用い、５個の部材を循環実験に
用いた）。ここに示した植菌効率は全植菌の％であり、
全植菌効率は９０％の程度であった。循環のデータは３
実験の平均であり、重力沈降のデータは１回の実験の結
果である。循環速度は約６ｃｍ／ｈとした。

【図９】密実チタンおよびガーゼ３１６ステンレス鋼の
部材を内蔵する反応器につき時間の関数としてのグルコ
ース吸収速度（ＧＵＲ）。時間（日）に対するｃｍ² 基
準（μｇ／ｃｍ² −日）のＧＵＲを図９Ａに示す一方、
反応器容積基準のＧＵＲを図９Ｂにプロットする。図９
Ａにおけるデータは部材の推定表面積に依存し、図９Ｂ
は両反応器が同一容積であるため推定値ではない。

【図１０】密実およびガーゼの静的ミキサーにつき順次
の溶解物で観察された全蛋白の％。溶解物１〜４に関す
る取得手法は本文中に説明する。顕微鏡観察により、密
実部材は細胞残骸を含まない一方、ガーゼ部材は第４回
の溶解後にも相当な細胞残骸を含有していた。

【図１１】３１６ステンレス鋼ガーゼ静的ミキサー反応
器につき時間の関数としてのグルコース吸収速度。反応
器には７日目に１のＭＯＩを感染させ、２８日目に収穫
した。

【図１２】図１１で示したガーゼ静的ミキサーにつき順
次の溶解物における全蛋白およびＨＡＶＡｇの％。溶解
物１〜４に関する取得手法は本文中に説明する。溶解物
１の全蛋白は、非効率的なＰＢＳ洗浄により意識的に高
くした。

【図１３】細胞増殖およびグルコース消費に対するＭＯ
Ｉの効果。細胞には０、１および１０のＭＯＩにてＨＡ
Ｖ ＣＲ３２６Ｆ Ｐ２８を感染させた。細胞密度（１
３Ａ）および残留グルコース（１３Ｂ）とも、この系に
つき感染後の８日間まで差が観察されない。完全な培地
再供給は８日目に行なった。

【図１４】ＢＳＡ標準に対し測定した細胞蛋白と細胞個
数との関係。最良の適合直線は式：Ｙ（１０⁴ ）＝−
０．０９＋０．４２Ｘ、ｒ＝０．９９によって示され
る。この図面は、単一の曲線が細胞の「状態」とは無関
係に全蛋白によりＭＲＣ−５細胞の個数を測定する手段
を与えることを示す。

【図１５】図１４を再プロットして各データ点の採取時
間を区分する。

【図１６】全蛋白から細胞数への変換は、コールター・
カウンタを用いて得られる細胞密度によく一致する。Ｔ
−２５ｓを収穫する際に用いた溶解緩衝液が少量である
ことにより差が生ずると思われる（一貫性のため２×
０．０８ｍｌ／ｃｍ² を用いた）。

【図１７】溶剤抽出工程での精製効果。ＨＰＳＥＣプロ
フィル（生産用コンシステンシーロット）。

【図１８】溶剤抽出工程での精製効果。ＨＰＳＥＣプロ
フィル（パイロット用ロット）。

【図１９】Ａ型肝炎／不純物の比に対する混合時間の効
果。

【図２０】Ａ型肝炎および不純物面積に対する混合時間
の効果（シェーカー、５０ｍｌ瓶、６分間）。

【図２１】Ａ型肝炎および不純物の面積に対する混合時
間の効果（シェーカー、５００ｍｌ瓶、２分間）。

【図２２】Ａ型肝炎および不純物の面積に対する混合時
間とチューブ容積との効果（シェーカー）。

【図２３】Ａ型肝炎ウィルス／不純物の比に対する溶剤
／水比の効果。

【図２４】Ａ型肝炎および不純物の面積に対する溶剤／
水比の効果（シェーカー）。

【図２５】Ａ型肝炎／不純物の比に対する混合時間およ
び種類の効果。

【図２６】ＨＰＳＥＣにより測定されたＡ型肝炎試料の
安定性。

【図２７】Ａ型肝炎の溶解度（４℃）に対する塩の効
果。

【図２８】Ａ型肝炎の溶解度（４℃）に対する塩の効
果。

【図２９】分子量検量線、ＰＷ４０００×１。

【図３０】Ａ型肝炎ピーク面積の対数とＡ型肝炎濃度の
対数との関係。

【図３１】Ａ型肝炎検量線。

【図３２】濾過溶解物試料とヌクレアーゼ処理溶解物試
料との比較、２１４ｎｍにおけるＵＶ。

【図３３】濾過溶解物試料とヌクレアーゼ処理溶解物試
料との比較、２６０ｎｍにおけるＵＶ。

【図３４】ＰＥＧペレット再懸濁試料、２１４ｎｍにお
けるＵＶ。

【図３５】Ｒ×２０１１００８からのクロロホルム抽出
した水相試料、２１４ｎｍにおけるＵＶ。

【図３６】Ｒ×２００９８５４からの陰イオン交換生成
物試料、２１４ｎｍにおけるＵＶ。

【図３７】サイズ・エクスクルージョン・クロマトグラ
フィーの生成物、２１４ｎｍにおけるＵＶ。

【図３８】Ｒ×２０１１００８からのＳＥＣ生成物試
料、２１４ｎｍにおけるＵＶ。約４９分に保持ピークが
見られる。

【図３９】１１ロットからの試料につきＥＩＡおよびＨ
ＰＳＥＣの結果の相互関係。

【図４０】１３種のＡ型肝炎ロットから４種の試料につ
き面積％値。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】 ステンレス鋼ガーゼで増殖するＭＲＣ−５細
胞の光学顕微鏡図に基づく生物の形態を示す写真。細胞
を５，０００〜１０，０００個細胞／ｃｍ^２にて接種
し、２週間以上にわたり培養した。倍率４０倍。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】 ３１６ステンレス鋼ガーゼで増殖させたＭＲ
Ｃ−５細胞の生存および非生存染色に基づく生物の形態
を示す写真。細胞を実施例１４の材料および方法のセク
ションに記載した手順によりフルオレセンジアセテート
（ＦＤＡ）および臭化エチジウム（ＥＢ）で染色し、次
いで走査型レーザー共焦顕微鏡で観察した。材料を５７
μｍの増分にて走査した。図６Ａはフルオレセンからの
蛍光に対応し、生存細胞を示す。図６ＢはＤＮＡの臭化
エチジウム染色による蛍光を示し、細胞のほぼ完全な生
存性を示す。臭化エチジウムのプラス比較を図７に示
す。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】 非生存ＭＲＣ−５細胞の臭化エチジウム染色
に基づく生物の形態を示す写真。３１６ステンレス鋼ガ
ーゼで増殖させた細胞を１００％メタノールでの処理に
より非生存性にした。ＰＢＳで充分洗浄すると共に乾燥
させた後、細胞をＦＤＡ／ＥＢにより染色してＦＤＡ用
のマイナス比較および臭化エチジウム用のプラス比較と
して用いた（写真）。マイナス比較となるフルオレセン
生成による蛍光は検出されなかった。

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨン・ジー・オーニンス アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07090、スコツチ・プレインズ、ドツグウ ツド・ドライブ・2069 (72)発明者 バリー・シー・バツクランド アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07090、ウエストフイールド、ブールバー ド・626 (72)発明者 ピーター・エイ・デフイリツプス アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19406、 キング・オブ・プラシア、ヒドウン・バレ ー・ロード・577 (72)発明者 アンナ・ジエイ・ヘイゲン アメリカ合衆国、ペンシルバニア・18901、 ドイルスタウン、ベルモント・スクエア・ ４ (72)発明者 ジヨン・ピー・ヘネシー・ジユニア アメリカ合衆国、ペンシルバニア・18917、 ダブリン、フオツクス・ホロー・ロード・ 114 (72)発明者 ベス・ジヤンカー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07090、ウエストフイールド、クランフオ ード・アベニユー・1009 (72)発明者 ジヨン・エイ・ルイス アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19403、 ノリスタウン、スキツプパツク・パイク・ 2610 (72)発明者 シンシア・ニユウエル・オリバー アメリカ合衆国、メリーランド・20854、 ポトマツク、アンブルサイド・ドライブ・ 12220 (72)発明者 チヤールズ・ジエイ・オレラ アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19438、 ハーレーズビル、ストアー・ロード・646 (72)発明者 ロバート・デイー・シトリン アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19444、 ラフアイエツト・ヒル、エマーソン・ドラ イブ・237

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
   および銀染色分析により蛋白に関し９５％より高い純度
   を有するＡ型肝炎ウィルスを工業規模で製造するに際
   し、 （ａ）Ａ型肝炎ウィルスを大表面積の静的表面反応器
   （ＳＳＲ）におけるセルシートで多量に培養し； （ｂ）Ａ型肝炎ウィルスを細胞培養物から遊離させるよ
   うに感染セルシートへ洗剤を浸透させてＡ型肝炎ウィル
   スをセルシート培養物から除去し； （ｃ）必要に応じ、この段階にて非Ａ型肝炎ウィルス特
   異性核酸を収穫されたＡ型肝炎ウィルスからヌクレアー
   ゼ処理によって除去し； （ｄ）細胞培養物から除去されたＡ型肝炎ウィルスを膜
   および透析濾過により、またはイオン交換での捕獲によ
   り濃縮し； （ｅ）工程（ｄ）の濃縮されたＡ型肝炎ウィルスから非
   Ａ型肝炎ウィルス特異性蛋白を有機抽出とＰＥＧ沈澱と
   イオン交換［工程（ｃ）にて予め完了していなければ汚
   染性遊離核酸の除去を含む］とゲル透過クロマトグラフ
   ィーとの工程の組合せにより除去し； （ｆ）精製されたＡ型肝炎ウィルスを工程（ｅ）から回
   収することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法により得られる精
   製されたＡ型肝炎ウィルス。
3. 【請求項３】 工程（ａ）が、ＨＡＶ感染したＳＳＲの
   上澄液から得られたＡ型肝炎ウィルスを静的表面反応器
   に接種してＭＲＣ−５細胞をセルシートで培養すると共
   に、培地を絶えず静的表面反応器およびループに循環さ
   せて反応器制御と通気と培養成分の補充とを行なうこと
   からなる請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 工程（ｂ）が、Ａ型肝炎ウィルス感染し
   たセルシートをトリトンＸ−１００の約０．０５〜１％
   溶液で処理してＡ型肝炎ウィルスを放出させることによ
   りＡ型肝炎ウィルスを収穫することからなる請求項１に
   記載の方法。
5. 【請求項５】 工程（ｃ）がベンゾナーゼによる消化か
   らなる請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 蛋白に基づき９５％より高い純度のＨＡ
   Ｖである失活したＡ型肝炎ウィルスワクチンを工業規模
   で製造するに際し： （ａ）多量のＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）を、ＭＲＣ−
   ５細胞のセルシートが確立されたヌンク・セル・ファク
   トリース（NUNC CELL FACTORIES ）、コスター・キュー
   ブス（COSTAR CUBES）または静的表面反応器（ＳＳＲ）
   ［細胞が単位容積当り高密度で増殖しうる標準メッシュ
   部材からなるＳＳＲを含む］にて培養し； （ｂ）培地を除去すると共に０．１％のトリトンＸ−１
   ００を含有する収穫溶液を添加することにより培養ＨＡ
   Ｖを収穫し； （ｃ）収穫したＨＡＶをベンゾナーゼで処理して感染性
   遊離核酸を消化させ； （ｄ）イオン交換カラムに捕獲すると共に捕獲されたＨ
   ＡＶを約０．３５ＭのＮａＣｌで溶出させ、次いでポリ
   エチレングリコールで沈澱させることにより、ベンゾナ
   ーゼ処理されたＨＡＶを濃縮し； （ｅ）ＰＥＧ沈澱したＨＡＶを再懸濁させると共に濃縮
   ＨＡＶをクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：
   １、ｖ／ｖ）で激しく撹拌しながら抽出し、さらに水相
   を分離して保持し； （ｆ）有機抽出の際の水相をＤＥＡＥトヨパール６５０
   Ｍ陰イオン交換マトリックスにて約９０〜１５０ｍＭの
   ＮａＣｌでクロマトグラフにかけ、約１Ｍ ＮａＣｌま
   での濃度勾配にてＨＡＶを溶出させると共に集めたピー
   クＨＡＶフラクションを約１５０ｍＭ未満の塩濃度およ
   び約２０μｇ／ｍｌのＨＡＶ濃度まで希釈してＨＡＶ沈
   澱を最小化または回避し； （ｇ）ピークＨＡＶフラクションを工程（ｆ）から集め
   ると共にＨＡＶをトヨパールＨＷ５５ＳおよびＨＷ６５
   Ｓの直列サイズ・エクスクルージョン・カラムでクロマ
   トグラフにかけ； （ｈ）ゲル濾過されたＨＡＶを１／１０００の濃度のホ
   ルマリンで５日間にわたり処理して失活させ、次いで無
   菌濾過し、水酸化アルミニウムに吸着または水酸化アル
   ミニウムで共沈させ、さらに失活した精製ＨＡＶの１回
   投与当り２５〜１００ｎｇに等しい単位投与量に分配す
   ることを特徴とする方法。
7. 【請求項７】 免疫学上有効量の請求項６に記載の方法
   の生成物で免疫化することを特徴とするＨＡＶ感染の予
   防方法。
8. 【請求項８】 請求項６に記載の方法により作成される
   ＨＡＶワクチン。
9. 【請求項９】 ＨＡＶを、必要に応じチタンもしくはス
   テンレス鋼の金網よりなる標準メッシュ部材を含むコス
   ター・キューブもしくは静的表面反応器で増殖させるこ
   とを特徴とするＨＡＶの培養方法。
10. 【請求項１０】 ９５％より高い純度のＨＡＶよりなる
    失活ＨＡＶの１回投与当り２５ｎｇのワクチンを単一の
    コスター・キューブ培養容器から約５，０００〜５０，
    ０００回分製造することからなる請求項９に記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 蛋白の９５％より多くがＡ型肝炎ウィ
    ルス特異性であり、さらに調製物における蛋白量の７％
    未満が非ＨＡＶ核酸もしくは脂質でありかつ調製物の約
    ０〜１８０％がグルコースで構成された炭水化物である
    ことを特徴とするＡ型肝炎ウィルスの精製調製物。
12. 【請求項１２】 Ａ型肝炎ウィルスがホルマリン失活さ
    れてなる請求項１１に記載の調製物。
13. 【請求項１３】 約１００〜１０００μｇの水酸化アル
    ミニウムと共に蛋白に基づき２５〜１００ｎｇのＨＡＶ
    投与量として処方した請求項１２に記載の調製物。
14. 【請求項１４】 次の特性［ここで各特性は蛋白１μｇ
    当りの基準で示され、さらに括弧内の方法を用いて特徴
    を決定した］： （ａ）脂質含有量（ガスクロマトグラフィー） ＜０．
    １μｇ （ｂ）グルコースとして検出された炭水化物 ０．１
    〜２．５μｇ 非グルコース炭水化物 ＜０．１μ
    ｇ （ＴＦＡ加水分解、ジオネックス） （ｃ）Ａ型肝炎ウィルス特異性蛋白 ＞０．
    ９５μｇ （アミノ酸分析およびウエスタンブロット） （ｄ）Ａ型肝炎ウィルス特異性ＲＮＡ ０．１
    〜０．２μｇ （ｅ）汚染性ＤＮＡ ＜０．
    ００１μｇ を有するＡ型肝炎ウィルスの精製調製物。
15. 【請求項１５】 Ａ型肝炎ウィルスがホルマリン失活さ
    れてなる請求項１４に記載の調製物。
16. 【請求項１６】 水酸化アルミニウムに吸着された請求
    項１５に記載の調製物。
17. 【請求項１７】 アミノ酸分析に基づき約２５ｎｇのＡ
    型肝炎ウィルス蛋白に相当する１回の２５単位投与にて
    年齢２〜１６歳の子供および未成年における９５％もし
    くはそれ以上の血清変換を４週間以内の免疫化で達成す
    るのに充分である失活Ａ型肝炎ウィルスの精製調製物。
18. 【請求項１８】 アミノ酸分析に基づき約２５〜１００
    ｎｇのＡ型肝炎ウィルスに相当する１〜３回の２５〜１
    ００単位投与にて接種者の８０〜９５％血清変換を４〜
    ２８週間以内の免疫化で達成するのに充分である失活Ａ
    型肝炎ウィルスの精製調製物。
19. 【請求項１９】 Ａ型肝炎ウィルスを静的表面反応器で
    培養すると共に、適する培地を補充して約０．０１０〜
    ０．３ｍｌ／ｃｍ² ／日の割合で除去する請求項１に記
    載の方法。
20. 【請求項２０】 Ａ型肝炎ウィルスを静的表面反応器で
    培養すると共に、培地を補充して一定速度で除去する請
    求項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ２５〜１００単位／０．１〜１ｍｌ投
    与量につき次の公称組成： 【表１】 を有するＡ型肝炎ウィルスワクチン。
22. 【請求項２２】 ２５単位／０．５ｍｌ投与量につき次
    の公称組成： 【表２】 を有するＡ型肝炎ウィルスワクチン。
23. 【請求項２３】 アミノ酸分析に基づき約２５ｎｇのＡ
    型肝炎ウィルス蛋白に相当する１回の２５単位投与にて
    年齢２〜１６歳の子供および未成年における９５％もし
    くはそれ以上の保護を免疫化の後の２１日間以内という
    短期間で達成するのに充分である失活Ａ型肝炎ウィルス
    の精製調製物。