JPH07500244A

JPH07500244A - 多型遺伝子座

Info

Publication number: JPH07500244A
Application number: JP5507166A
Authority: JP
Inventors: エヴァンス，グレン　エイ．; セレリ，リシア; ユーバンクス，ジェームズ　エイチ．
Original assignee: ザ　ソーク　インスティチュート　フォア　バイオロジカル　スタディーズ
Priority date: 1991-10-09
Filing date: 1992-10-07
Publication date: 1995-01-12
Also published as: CA2120525A1; EP0666864A4; DE69230345D1; US5891627A; WO1993007166A1; EP0666864A1; ATE186946T1; EP0666864B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】冬型遺伝子座本発明は一般に、ある種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の個体の同定に用いることができる冬型遺伝子座のヌクレオチド配列の検出に関する。

２、関連技術哺乳動物のゲノムは、中頻度にかつ高頻度に反復するＤＮＡ配列が散在しているユニークＤＮＡ配列（ｕｎｉｑｕｅ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）からなるものである。従来、減数分裂連鎖分析による遺伝子地図の作成は、ユニーク配列ＤＮＡ中の変異、例えば制限断片長多型（ＢｏｔｓＬｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　３２：３１４−３３１．１９８０）を遺伝マーカーとして用いて行なわれてきた。最近では、反復配列要素、例えばミニサテライトまたはＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔ　）配列（Ｊｅｆｆｒｅｙｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１４＋６７−７３．１９８５；　Ｎａｋａｍｕｒａ、　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｔｅｎｃｅ、　２３５：１６１６−１６２２．　１９８７）およびマイクロサテライトまたはＶ　Ｓ　Ｓ　Ｍ　（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｓｉｍｐｌｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｍｏｔｉｆｓ　）　（Ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｌｕｔｙ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　４４：３９７−４０］、１９８９；　Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍａｙ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　４４：３８８−３９６．１９８９）における変異が連鎖研究のために有用であることが分かっている。ユニーク配列変異よりも反復配列変異を利用する一つの利点は、制限断片長多型（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）と比較したときに、正常な集団に、明らかに多数の対立遺伝子が存在することである。第二の利点は多数のＤＮＡ試料の迅速かつ安価な分析を可能にするポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　ＣＲ，ｐｏｌｙｗｌｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）を用いて配列の鎖長変異を容易に検出できることである。

マイクロサテライト要素は、対立遺伝子が一つ以上の反復単位で異なっている単純なモノ−、ジー、またはトリーヌクレオチド配列からなる（Ｌｕｔｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　４６：７７６−７８３゜１９９０；　Ｔａｕｔｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２２：６５２−６５６．１９８６；　Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄＭａｙ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　４４：３８８−３９６．１９８９　）　ｏ　ミニサテライトまたはＶＮＴＲ配列は典型的には２０〜数百ヌクレオチドの反復単位を有しており、対立遺伝子はわずかに１反復単位だけが異なっている。単純な配列の中で、（ＴＧ）　ｎまたは（ＣＡ）　ｎの反復要素は最近になって減数分裂マツピングにたいへん有用であることが証明されたが、それは（１）これらの要素がゲノム中に豊富に存在し、（２）多数の異なる対立遺伝子を示し、そして（３）ポリメラーゼ連鎖反応を用いて迅速に検定できるためである（ｌｉｊｔ　ａｎｄしｕｔｙ、Ａｍ、Ｊ、）ｌｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、４４：３９７−４０１．　１９８９；　Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍａｙ。

Ａｍ、　Ｊ、　ｔ（ｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　４４：３８８−３９６．１９８９）。

他の多くの短鎖配列モチーフが哺乳動物０（ｅｌｌｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　６８：９３−１００．１９８８；　Ｋｎｏｔｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１４：９２１５−９２１６．１９８６；　Ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｌｕｔｙ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　４４：３９７−４０１、１９８９：　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２：６５２３−６５３５゜１９８４；　５ｔｏｋｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３：４６１３−４６２１．１９８５；Ｖａｓｓａｒｔ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３：６８３−６８４．　１９８７；　ａｎｄ　Ｖｅｒｇｎａｕｄ。

Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１７：７６２３−７６３０．１９８９　）およびトリ類（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１７：２２０３−２２１４．１９８９；　Ｌｏｎｇ＋ｎｉｒｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、　２：１４−２４．１９８８）のゲノム中に発見されており、これらのものは、複製中（Ｔａｕｔｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２２：６５２−６５６．１９８６）または不等組換えの場合（Ｗｏｌｆｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｏｗ＋ｉｃｓ、　５：３８２−３８４．１９８９）にＤＮＡのすべり（Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓｌｉｐｐａｇｅ）により蓄積すると考えられている。これら多くの反復要素は高度な遺伝的変異を示すために減数分裂マツピングにも有用である。

Ｊｅｆｆｒｅｙｓにより単離されたＶＮＴＲ配列は不変のコア配列ＧＧＧＣＡＧＧＡＸＧを含み、この配列はファージ・ラムダのｃｈｉ配列に対し１９８９）　、バクテリオファージＭ１３の制限断片により検出される（Ｖａｓｓａｒｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３：６８３−６８４．１９８７　）　。同様な反復要素はＮａｋａｍｕｒａらにより検出され（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２３５：１６１６−１６２２゜１９８７）　、これは類似しているが区別される共通のコア単位ＧＧＧ−ＧＴＧＧＧＧを含んでいる。このタイプの要素は、βグロビン遺伝子座を含むいくつかの既知遺伝子配列内に存在する。アポリポタンパク質Ｂ　（Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６：２１２−２１６．　＋９８９；　Ｋｎｏｔｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１４：９２１５−９２１６、１９８６）およびコラーゲンタイプ１１遺伝子（Ｓｔｏｋｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３：４６１３−４６２１．１９８５　）内の類似のＶＮＴＲ要素が記載されており、これらには明確なＡＴに富むモチーフが含まれている。この種の反復要素の生理学的機能は定まっていないが、染色体組換えの潜在的なホットスポット（ｈｏｔ　５ｐｏｔ）　（ＤｅＢｕｓｔｒｏｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８５：５６９３−５６９７．１９８８　）または遺伝子発現制御の重要な要素（Ｈｅｌｌｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　６８：９３−１００．１９８８；　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２：６５２３−６５３５．１９８４　”）として示唆されている。

連鎖分析に加えて、高度に可変なプローブは実父確定の科学的検査や（法廷で用いる）犯罪の科学的検査などの実用的応用における同定試験に有用である。ＶＮＴＲプローブの使用に対する一つの欠点は、対立遺伝子検出のためにサザンプロット分析を行なう必要があることである。これらに用いられるＤＮＡ試料はしばしば低品質であって、分量が少ない。

上記の要素は短いこともあり、しかも対立遺伝子はわずかに２ヌクレオチドのみが異なることもあるために、（ＣＡ）　ｎ冬型性の分析は困難で、ＤＮＡ配列決定用ゲルと対立遺伝子検出用の放射能標識の使用が必要とされる（Ｌｉｔｔ　ａｎｄ　Ｌｕｔｙ、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、　４４：３９７− ４０１．１９８９；　Ｗｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｍａｙ、　Ａ＋ｎ、　Ｊ、　）Ｉｕｍ、　ＧｅｎｅＬ、。

４４：３８８−３９６．１９８９）。したがって、アイソトープ検出に頼る必要なしに、低品質または少量である試料中のユニークＤＮＡ配列を検出することのできる技術に対する必要性があるが、これはまだ達成されてはいない。本発明はそのような技術を提供するものである。

発明の概要本発明はある種の個体の同定に用いることのできる冬型遺伝子座を規定する新規なりＮＡ配列の発見によるものである。この冬型遺伝子座のポジティブ鎖は以下の６ヌクレオチド配列を含む：［Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）　）　ｎ、ここでＴはチミンであり、Ｐｕは独立してプリンであり、そしてｎは１〜約１０００である。

冬型遺伝子座を発見する過程で、プライマーとして用いることのできる（複数の）オリゴヌクレオチドを同定した。これらのオリゴヌクレオチドは該遺伝子座のユニークフランキング領域と整合することでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの技術により該遺伝子座の増幅を可能にする。これらのオリゴヌクレオチドは、これまで調べられたすべての個体に見られた高度に保存されている配列を表す。

本発明は試料からのＤＮＡの検出または［フィンガープリント（指紋法）」に用いられる他の技術にまさる主要な改良を提供するものである。本発明がもたらす主な利点は、放射性標識が必要のないことである。例えば、各個体はわずかに１つのゲノム冬型遺伝子座を有しているが、「普遍的な」オリゴヌクレオチドブライマーにより該遺伝子座の増幅が可能となるために放射性標識の使用の必要がない。さらに、冬型遺伝子座のみが増幅されかつそれは一般的にはかなり大きいので、配列決定用ゲルよりも単純なアガロースゲルを用いて分析することができる。該遺伝子座はゲノム中において唯一（ユニーク）であるために、他の遺伝子座の他の類似要素との交差反応等の面倒な問題はほとんど起こらない。

図面の簡単な説明図１．稀な制限配列の位置と冬型反復要素の配置を示すコスミド４Ｆ７および７１−１１２の物理的地図。制限地図は複数の多重制限酵素による組合せ消化ならびにオリゴ末端標識化を用いて決定した（Ｅｖａｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：５０３０−５０３４、１９８９　）　。−ｙスミド４Ｆ７のＡｐａ　ｌ−３ａｃ　Ｉ断片は調製用アガロースゲル電気泳動を用いて精製し、ＤＮＡ配列決定のためにプラスミドベクターＢＩｔｌｅＳＣｒｉｐｔ中にサブクローン化した。冬型反復配列の位置を陰影をつけた領域で示す。ＰＣＲ検出に用いられるオリゴヌクレオチド配列の位置は黒の棒線で示す。これらは、ヒトＤＮＡ挿入物に隣接するＴ３およびＴ７バクテリオフアージプロモーターを有するベクター５Ｃｏｓ−１中に構築しくＢｖａｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：５０３０− ５０３４．１９８９　）　、そしてベクター内の挿入物の配向も示しである。

図２．Ａ、４Ｆ７反復要素の一部のＤＮＡ配列分析。この個体では４１２塩基対にわたって伸びている反復要素の位置を下線を付けて示す。対立遺伝子検出のためのＰＣＲ増幅の開始部位として働くユニークフランキング配列には二重下線が付してあり、反復単位内に位置するＡｃｅ　ｌ制限部位にも二重下線が付しである。ＹＡＣスクリーニングのためのＰＣＲプライマーの位置は点線の下線で示す。２つの開始配列（ｐｒｉ＋ｎｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　）のうち一つが対立遺伝子検出に用いられる配列と重複している。Ｂ、冬型性要素の構造を［Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）　］　ｎの形の反復６ヌクレオチド配列として図式化したものである。

図３．４Ｆ７コスミドに由来し、反復要素を含むユニークなプローブを用いて、ヒトゲノムＤＮＡのサザンプロット分析によりゲノム断片を検出した。ＤＮＡは図示した制限酵素により消化し、ハイブリダイゼーションを「方法」の項に記載の通りに行なった。

決定されたバンドのサイズは以下の通りである：　Ａｐａ　ｌ、　５．７　ｋｂ；Ｂａ５ＨＩ、　６．６　ｋｂ；　Ｂｃｏ　Ｒ１，１８ｋｂ；　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、　２６　ｋｂ；　Ｋｐｎ　Ｉ。

２２　ｋｂ；　そしてＳ■ａ　Ｉ　＞　２５　ｋｂ　ｏサイズマーカーはバクテリオファージラムダの旧れｄｌｌｌ断片である。

図４．４Ｆ？反復要素に関する多数の個体のＰＣＲ分析は多数の対立遺伝子を示している。レーン１〜７とレーン９〜１５は異なる個体から調製したＤＮＡの増幅産物を示している。２０　ｗ＋１の血液試料を用いてゲノムＤＮＡを調製し、これを図３Ａに示すＰＣＲプライマーを用いて分析した。増幅産物は２％アガロースゲルで分析し、増幅された産物は臭化エチジウムによる染色で可視化した。

レーン８は、ブランクコントロールであり、レーン２６はコスミド４Ｆ７から増幅した産物である。この分析は１５個体に少なくともｌＯの異なる対立遺伝子が存在することを示している。

図５．４Ｆ７対立遺伝子の遺伝が３家系のＤＮＡ分析により示された。ＤＮＡは各々の個体からの２０　ｍｌの末梢血液試料から調製したもので、図２Ａに示すプライマーによるＰＣＲ増幅を用いて対立遺伝子の分析を行なった。この分析は、各々の個体には２対立遺伝子が存在することを示し、さらに各家系を通して対立遺伝子のメンデルの分離を示している。増幅産物は１％アガロースゲルを用いて分析し、サイズマーカーはバクテリオファージφｘ１７４のＨａｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片である。

図６．　蛍光ｉｎ　５ｉｔｕ抑制ハイブリダイゼーシヨンによる染色体１１ｑ１３に対するコスミド４Ｆ７の位置確認。Ａ、ランダムヘキサマープライミングを用いてビオチニル化ヌクレオチドでコスミドＤＮＡを標識し、反復配列をヒト反復ＤＮＡを用いてブロックし、そして蛍光ｉｎ　５ｉｔｕ抑制ハイブリダイゼーシヨンを以前に記載されたように行なった（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９゜１９９０；　５ｅｌｌｅｒｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８：８８７−８９１、１９９０；　５ｅｌｌｅｒｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　８：５９−６６、１９９１　）　ｏ正常なヒト核型を有するリンパ芽球細胞系から染色体を調製し、染色体の位置確認をＬｉｃｈｔｅｒらの方法を用いて決定した（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９．１９９１）。

Ｂ、すでにマツピングされている他のコスミドマーカー（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９．１９９０）に対する多重マーカー４Ｆ７の位置を示すヒト染色体１１のイデイオグラム。

図７．４Ｆ？マーカーを囲んでいる広範囲の制限地図を示す。この地図は４Ｆ？多型遺伝子座からのプローブに基づくコスミドクローン単離物とＹＡＣを用いて作成した。ＹＡＣクローン８２１５ＢＩＯは、ヒトゲノムＹＡＣライブラリーのＰＣＲスクリーニングにより得て（Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　０１ｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：１２１３−１２１７．１９９０　）　、制限部位の位置は部分的な消化により決定した。多重分析によって以前に検出されている付加的なコスミドコンテイーク（ｃｏｓａ＋ｉｄ　ｃｏｎｔｉｇ）　（Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｌｅｗｉｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：５０３０−５０３４．１９８９　）もこの物理的地図上に示す。

好適な実施態様の詳細な説明本発明はゲノム中に単一コピーとして存在するユニークなゲノム多重遺伝子座を規定するこれまで知られていないヌクレオチド配列に関する。この多重遺伝子座は、核酸を含む試料を用いである種の個体を同定するのに非常に有用である。そうしたものとして、本発明は、例えば犯罪の科学的分析に基づいて個人を同定する新規な方法を提供する。

一般に、多重遺伝子座のポジティブ鎖は、６ヌクレオチド配列［Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）　］　ｎ　（ここでＴはチミンであり、Ｐｕは独立してプリンであり、そしてｎは１〜約１０００である）を含むものとして特徴付けることができる。さらにここに記載するように、個体によってこの６ヌクレオチド中のプリンの性質に関して異なり、さらに多重遺伝子座に存在する６ヌクレオチドの数に関しても異なることが研究により明らかとなった。したがって、ある個体はその個体の多重遺伝子座のサイズに基づいて特性付けることができる。本発明においては、以下に記載するオリゴヌクレオチドブライマーを用いてこの６ヌクレオチド多型遺伝子座配列を増幅させて検出を容易にする。増幅後、多重遺伝子座の分子量を例えばゲル分離により分析する。増幅された多重遺伝子座は当業者に公知の多様な標識と技法を用いて検出してもよいが、本発明は例えば臭化エチジウムによる染色によるような非同位体による検出の使用が適している。

ゲノム多重遺伝子座を構成する６ヌクレオチド配列は、Ａｃｅ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位などのエンドヌクレアーゼの制限部位を含んでいてもよい。このような制限部位の存在は、多重遺伝子座をさらに特性付けることとなり、その多重遺伝子座の分析を向上させる。したがって、２個体は適当な制限酵素による処理がなければ同じ分子量を持つ多重遺伝子座を有するとみえながらも、１個体の増幅された多重遺伝子座が感受性のある制限部位を含む場合にはこれら２個体を区別することができる。

多重遺伝子座の検出はゲノム多重遺伝子座の増幅用プライマーであるオリゴヌクレオチドにより達成される。これらのユニークなオリゴヌクレオチドブライマーは多重遺伝子座に隣接するフランキング領域の同定に基づいて作られたものである。これらのオリゴヌクレオチドブライマーは、フランキングヌクレオチド配列ＧＣＣＴＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＣおよび／またはＧＧＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣおよびそれに相補的な配列とハイブリダイズし得る配列を含む。

本発明のプライマーは、多重遺伝子座において有意な数の核酸に特定の重合開始域を提供するように十分な長さと適当な配列のオリゴヌクレオチドを含んでいる。具体的には、ここで用いる「プライマー」という用語は２個以上（好適には３個以上）のデオキシリボヌクレオチドまたはりボヌクレオチドからなる配列を指し、この配列はプライマー伸長産物の合成を開始することができ、かつ多重遺伝子座のＤＮＡ鎖に実質的に相補的である。合成の助けとなる環境条件としては、ヌクレオシド三リン酸および重合用試薬（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在、そして適当な温度とｐＨが挙げられる。プライマーは最大の効率で増幅を行うには一本鎖が好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、伸長産物の調製に用いる前に、最初にプライマーを処理してその鎖を分ける。好適には、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは重合用誘導試薬の存在下に伸長産物の合成を始められるように十分に長いものでなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、緩衝液、およびヌクレオチド組成に依存する。オリゴヌクレオチドブライマーは代表的には１５〜２２またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それ以下のヌクレオチドを含んでいてもよい。

本発明のプライマーは増幅される冬型遺伝子座の各部に「実質的に」相補的であるように設計する。このことは、重合用試薬が働く条件下でプライマーはそれぞれの鎖とハイブリダイズし得るように十分に相補的でなければならないことを意味する。言いかえると、プライマーはフランキング配列とハイブリダイズして冬型遺伝子座を増幅させるためにフランキング配列と十分な相補性を有している必要がある。プライマーはフランキング配列鎖との厳密な相補性を有していることが望ましい。

本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、関与する反応工程数に対して指数的な量の冬型遺伝子座をもたらす酵素的連鎖反応である増幅プロセスに用いられる。一般的には、一方のプライマーは冬型遺伝子座のネガティブ（−）鎖に相補的であり、他方のプライマーはポジティブ（＋）鎖に相補的である。プライマーを変性核酸にアニールして、次にＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ）の大きい断片等の酵素とヌクレオチドを用いて伸長させると、目的の字型遺伝子座配列を含む新しく合成された十鎖および一部がもたらされる。これらの新しく合成された配列は鋳型でもあるので、変性、プライマーアニーリング、そして伸長反応の反復サイクルにより、プライマーが定める領域（すなわち、目的とする字型遺伝子座配列）の指数的な生産がもたらされる。連鎖反応の産物は、用いられる特定のプライマーの末端に対応する末端を有する核酸の二本鎖（ｄｕｐｌｅＸ）である。

本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、慣用のホスホトリエステル法またはホスホジエステル法などの適当ないかなる方法を用いて調製してもよいし、それらを自動化した態様を用いて調製してもよい。そのような自動化した態様において、ジエチルホスホルアミダイトを出発材料として用いることができ、この化合物はＢｅａｕｃａｇｅらが記載しているように合成され得る（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ。

ｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２２：１８５９−１８６２．１９８１　）　、修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する一つの方法は米国特許第４．４５８．０６６号に記載されている。

精製または未精製の形のいかなる核酸試料も、それが冬型遺伝子座を含む特定の核酸配列を含有するか、または含有すると推測されるのであれば、出発核酸（または複数の核酸）として利用することができる。したがって、そのプロセスは例えばＤＮＡまたはＲＮＡを用いてもよく、これらにはメツセンジャーＲＮＡ等があり、ここでＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であってよい。ＲＮＡを鋳型として用いる場合は、鋳型をＤＮＡに逆転写する酵素および／または最適条件が利用されるであろう。さらに、各々の一方の鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを利用してもよい。核酸混合物を用いてもよく、または前増幅反応で同じあるいは異なるプライマーを用いて作られた核酸をここで前記のように用いてもよい。増幅される特定の核酸配列、すなわち、冬型遺伝子座は、比較的大きい分子の一部であってもよいし、またはその特定配列が全核酸を構成するように、個々の分子として最初に存在してもよい。増幅される配列は最初に純粋な形で存在する必要はない。全ヒトＤＮＡに含まれるような複合混合物のマイナーフラクションであってもよい。

ここで用いられるＤＮＡまたはＲＮＡは、生体試料例えば血液、組織材料例えば絨毛膜の絨毛、または羊膜細胞から多様な方法例えばＭａｎｉａｔｉＳらにより記載された方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　２８０：２８１．１９８２）を用いて抽出してもよい。抽出された試料が純粋ではない場合（例えば血漿、血清、または血液）、増幅前に試料の細胞、液体、組織、または動物細胞膜を開き、核酸鎖を露出および／または分離するのに効果的な量の試薬で該試料を処理する。

核酸鎖の露出と分離のためのこの溶解と核酸変性工程により、増幅をさらに容易に実施することができよう。

試料の目的とする核酸配列が２本の鎖を含む場合、核酸の２本の鎖を分離することが必要であって、その後にそれを鋳型として用いることができる。２本の鎖の分離はプライマー伸長産物の合成とは別の工程として行なうか、または同時に行なうことができる。この鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む適当な種々の変性条件を用いて達成することができ、「変性」という言葉はそのような全ての手段を含むものである。核酸鎖を分ける一つの物理的方法は核酸が変性するまで加熱することである。

典型的な熱変性は約８０〜１０５℃の範囲の温度で約１−１０分間で行なう。鎖の分離はヘリカーゼとして知られる酵素クラスからの酵素によるか、またはヘリカーゼ活性を有し、かつリボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性することが知られている酵素ＲｅｃＡにより誘導してもよい。ヘリカーゼによる核酸鎖の分離に適する反応条件はＫｕｈｎ　Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇにより記載されており（Ｃ３Ｈ−Ｑｕａｎ　ｔ　ｆ　ｔａ　ｔ　ｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　４３：６３．１９７８　）　、ＲｅｃＡを利用するための技術はＣ，Ｒａｄｄｉｎｇにより概説されている（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１６：４０５ −４３７゜１９８２）。

増幅される配列を含む核酸が一本鎖である場合は、その相補体を１〜２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを添加することにより合成する。１種類のプライマーを利用する場合、プライマー、重合用試薬、および下記の４種のヌクレオシド三リン酸の存在下でプライマー伸長産物を合成する。その産物は一本鎖核酸に部分的に相補的であり、一本部核酸とハイブリダイズして不等長鎖の二本鎖を形成上これを次に分離させて一本鎖とし、２本の分離相補鎖を作ることができる。別の方法としては、２種類のプライマーを一本鎖の核酸に加えて、反応を前記のように行なってもよい。

一つまたは複数の核酸の相補鎖を互いに分離したとき、その核酸が元々は二本鎖または一本鎖であったかにはかかわらず、分離された鎖はさらに別の核酸鎖合成の鋳型としてすぐに用いられる。

この合成はプライマーと鋳型とのハイブリダイゼーションを起こさせる条件下で行なう。一般に合成は緩衝性のある水溶液中で、好適にはｐＨ７〜９、最も好適には約８で起こる。好適には、分離された鋳型鎖を含む緩衝液にモル過剰（ゲノム核酸に対しては、通常約１０’：ｌのプライマー二鋳型）の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを加える。しかし、本発明の方法が診断用途に用いられる場合、相補鎖の量は不明であり得るので、相補鎖の量に対するプライマーの量を確実には決めることができないことに注意されたい。しかし、実際的には、増幅される配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含まれる場合、添加されるプライマー量は一般的には相補鎖（鋳型）の量に対してモル過剰で存在するだろう。

大過剰モル量がプロセス効率の向上に望ましい。

デオキシリボヌクレオシド三リン酸のｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰをプライマーとは別に、あるいは−緒に十分な量でこの合成混合物に添加し得られた溶液を約９０〜！００℃に約１−１ｏ分間、好適には１〜４分間加熱する。この加熱期間の後に、溶液をプライマーのハイブリダイゼーションに望ましい室温まで冷却する。

冷却された混合物にプライマー伸長反応を実施するのに適した試薬（以下「重合用試薬」と記す）を加えて公知の条件下で反応させる。重合用試薬はそれが熱安定性のものであれば他の試薬とともに加えてもよい。この合成（または増幅）反応は、室温から重合用試薬が働く温度までで反応させることができる。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを試薬として用いる場合、温度は通常約４０℃ 以下とする。室温で反応させるのが最も簡便である。

重合用試薬はプライマー伸長産物の合成を達成させるように働く化合物または系であればいずれでもよく、例えば酵素がある。

この目的に適する酵素は、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ！、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手できるＤＮＡポリメラーぜ、ポリメラーゼムティン、逆転写酵素、および他の酵素があり、これには熱安定酵素（すなわち、変性を起こすまで十分に上げた温度に供した後でもプライマー伸長反応を行なう酵素）を含む。適当な酵素は各々の冬型遺伝子座の核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成させるような適当な方法で、ヌクレオチドの結合を容易にするものである。一般に、合成は各プライマーの３° 末端で開始され、合成が終了するまで５゛方向で鋳型鎖に沿って進行し、異なる長さの分子を作る。しかし、上記方法と同じ方法を用いて、合成を５°末端で開始させて他方向に進行させる重合用試薬があるかも知れない。

新しく合成された冬型遺伝子座の核酸鎖とその相補的な核酸鎖はハイブリダイゼーションの上記条件下で二本鎖分子を形成し、このハイブリッドをそのプロセスの後続の工程で用いる。その次の工程において、新しく合成された二本鎖分子を上記のいずれかの手順を用いる変性条件に置いて一本鎖分子を得る。

上記プロセスは一本鎖分子上で繰り返される。必要であれば、上記の条件下で反応が進むように重合用試薬、ヌクレオチド、およびプライマーをさらに加えてもよい。合成を各オリゴヌクレオチドプライマーの一端で再び開始させて、鋳型鎖に沿って進行させてさらに核酸を作る。この工程後は伸長産物の半分がその２つのプライマーによってはさまれた特定の核酸配列からなるであろう。

変性工程と伸長産物合成工程は必要なだけ何度でも繰り返し、目的とする冬型遺伝子座の核酸配列を検出に必要とされる程度まで増幅することができる。得られる特定の核酸配列の量は指数的に蓄積するであろう。

増幅された産物は、サザンプロットによる分析により放射性プローブを用いずに検出することができる。例えば、そのプロセスにおいて、ごく僅かな量の冬型遺伝子座の核酸配列を含む小量のＤＮＡ試料（例えば、末梢血リンパ球由来のもの）を増幅させ、これをサザンプロット法により分析する。この高レベルの増幅シグナルは非放射性のプローブまたは非放射性標識の使用を容易にするものである。

本発明の方法により増幅された配列の評価、検出、クローン化、配列決定等は、溶液中か固体支持体上に結合させた後に、特定ＤＮＡ配列の検出に通常用いられている任意の方法、例えばＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３：１００８−１０１２゜１９８５）　、対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド（Ａ　Ｓ　Ｏ＞プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０：２７８．１９８３）　、オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（ＯＬＡ）　（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１：１０７７、１９８８）等によりさらに行なうことができる。

ＤＮＡ分析の分子的手法は概説されている（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４２：２２９−２３７．１９８８）。

ゲノムコスミドクローンは、ベクター５ｃｏｓ−１中に構築された染色体１１ｑ特異的コスミドライブラリーから単離しくＥｖａｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　７９：９−２０．１９８９）　、ニートロセルロースフィルター上に並置した（［！ｖａｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８６：５０３０−５０３４．１９８９　）　。このライブラリーは１１ｑ１２−１１ｑｔｅｒを代表するものであって、コスミド・コンティーク（ｃｏｓｍｉｄ　ＣＯｎｔｉｇ　）の構築（Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｌｅｗｉｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：５０３０−５０３４、１９８９　）ならびにランドマークマツピングクローン（ｌａｎｄｍａｒｋｍａｐｐｉｎｇ　ｃｌｏｎｅ）の単離（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９゜１９９０　＞　に用いられている。コスミドクローンを増幅し、ＤＮＡをＥｖａｎｓとＷｈａｌにより記載されたように調製した（Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５２：６０４−６１０．１９８７）。

オリゴヌクレチドブローブオリゴヌクレオチドはＰＣＲ−ＭＡＴＥ　オリゴヌクレオチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いて合成した。ラットＤ２ドーパミンレセプターｃ　ＤＮＡ　（Ｂｕｎｚｏｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３６：７８３−７８７．１９８８　＞のＤＮＡ配列部分に対応する６０塩基のオリゴヌクレオチド（ＣＣＡＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＡＣＡＡＣＣＣＡＣＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧ）をＧタンパク質レセプター様モチーフを含むコスミドの最初の単離に用いた。ＰＣＲ分析のためにさらに別のオリゴヌクレオチドを合成し、これは図２Ａに示されているように、反復要素に隣接するユニーク配列に対応している。ＰＣＲによるＹＡＣスクリーニングのために用いたオリゴヌクレオチドも図２Ａに示す。

クローンの単離並置したコスミドのコロニーはニトロセルロースまたはナイロンフィルター上に分散させ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎの方法を用いて固定化しくＥｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｌｅｗｉｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８６：５０３０−５０３４、１９８９；　［！ｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｗａｈｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５２：６０４−６１０．１９８７　）　、これを６０℃で一晩プレハイブリダイズさせた。ポリ、ヌクレオチドキナーゼとガンマ２１ｐヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドプローブを放射能標識し、前記のフィルターに４２℃で１２時間ハイブリダイズさせた。洗浄は０．４　Ｘ５ＳＣ中５５℃で行い、次にこのフィルターを１晩−７０℃でコダックＸＡＲフィルムに感光させた。

ＰＣＲ反応静脈穿刺により得られた２０　ｍｌの新鮮な全血、または染色体１１のこの領域に関して核型では正常であることが知られている３細胞系の一つからゲノムＤＮＡを調製した。反復配列要素に隣接するユニーク配列に特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応を用いて反復遺伝子座の特異的な増幅を行なった。次に、増幅産物を２％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ＤＮＡを臭化エチジウムによる染色で可視化した。この増幅操作は４５秒間９２℃ での熱変性、１分間６６℃でのアニーリング、そして７２℃で３０秒間の伸長というサイクルを３５回繰返すものであった。反応条件は、３０μｍの反応液中、最終濃度で各オリゴヌクレオチドプライマーをそれぞれ０．５　μＭ　、　１　ｍＭのｄＮＴＰ、　Ｉ　ＸＴａｑＩ緩衝液、および１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　ＣＡ　）を用いた。増幅はＢｅ１ｌｃｏ　ＤＮＡ　Ｐａｃｅｒサーマル・サイクラ−を用いて行なった。

サザンブロットハイブリダイゼーションヒーラ（ＨｅＬａ）細胞から得られたＩＯμｇのヒトゲノムＤＮＡを２５単位の制限酵素を用いて１２時間消化し、０．８％アガロースゲル上で１５時間３０ボルトで分離した。ＤＮＡを標準的なサザン法を用いてニトロセルロースフィルターに移し、主に反復要素を含む５００塩基対のＡｃｃ　１−Ｐｓｔ　１断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは最終濃度で２゜６　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、４３％ホルムアミド、４．２５　Ｘ　ＳＳＣ，１，０ｍｇ／＋＋＋１のサケ精子ＤＮＡおよび１０％デキストラン硫酸を用いて４２℃で１２〜１８時間実施した（ＥＶａｎＳ　ａｎｄＷｈａｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５２：６０４−６１０．１９８７）。

ＤＮＡ配列の分析ＤＮＡ配列は、”Ｓ　ｄＣＴＰで標識した二本鎖ジデオキシ配列決定反応物を用いて決定した。コスミドクローンからの制限断片を精製してＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミドベクター中にサブクローン化した。ＤＮＡ配列決定は、修飾Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍ）ならびに旧ｕｅｓｃｒｔｐｔベクター中のＴ７またはＴ３プロモータ配列に特異的なプライマーを用いて行なった。電気泳動は標準的な配列決定装置（ＣＢＳ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて尿素を含む６％アクリルアミドゲル上で実施した。

ＤＮＡ配列を読み取り、ＷＡＸ　８６００コンピユータで作動するライスコンシン大学ジエネティックス・コンピュータ・グループ・バージョン６．０パツケージのプログラム（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２：３８７−３９５．１９８４）を用いて解析した。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン蛍光ｉｎ　ｓｏｕ抑制ハイブリダイゼーションは以前に記載されたように実施した（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９．１９９０；５ｅｌｌｅｒｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８：８８７−８９１゜１９９０）。正常なヒト核型を有することが既に示されているヒトＢリンパ芽球細胞から中期染色体を調製した。コスミドＤＮＡは［ミニブレツブＪ法（Ｂｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｗａｈｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｂｎｚｙｎ＋ｏ１．、１５２：６０４−６１０．１９８７）を用いて調製するか、または塩化セシウム「バンド法」により調製し、ＲＮａｓｅで処理し、ビオチニル化ｄＣＴＰとｄＵＴＰで標識した（Ｓｅｌｌｅｒｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８８：８８７−８９１．１９９０；　５ｅｌｌｅｒｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　８：５９−６６、１９９１）　Ｏハイブリダイゼーション反応は標準的な条件を用いて行い（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−８９．１９９０　）　、Ａｒガスレーザーを備えたＢｉｏＲａｄ　ＭＲＣ５００同焦点顕微鏡を用いて像を得た。ｔ、ｔｃｈｔｅｒらにより記載されたように（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９．１９９０）　、少なくとも３０の染色体ｌｌ上のｔｔｐ末端小粒（ＦＬｐｔｅｒ）からの距離を測定することにより位置決定を行なった。９５％以上の標識染色体が両姉妹染色分体上に明確なハイブリダイゼーションシグナルを示した。

パルスフィールドゲル電気泳動ユニバーサル消化緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で平衡化したヒトＢリンパ芽球細胞系のＷｌ−Ｌ２−７２９と曲Ｗ１０６９　（Ｈｅ！ｔｘｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、、　Ｉ：２３５−２４３．１９８３　）から高分子量ＤＮＡを含有するアガロースプラグ（ｐｌｕｇ）を調製し、ＩＯ〜５０単位の制限エンドヌクレアーゼを用いて一晩消化した。次に、消化されたプラグを１％アガロースゲル上に負荷し、２２〜２５時間１６℃でＨＥＸ−ＣＨＥＦ　（Ｃｈｕ。

ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３４：１５８２−１５８５．１９８６　）の電極構成を用いて電気泳動を行なった。

酵母の人工染色体Ｍ、　０１ｓｏｎ　（セントルイスのワシントン大学）により入手可能となったｐＹＡＣ−４（Ｂｕｒｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８：８０６−８１２．１９８７　）中に構築したヒトゲノムＹＡＣライブラリーから４Ｆ７多型遺伝子座を含む酵母の人工染色体（ＹＡＣ）を単離した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる改良プールストラテジー（Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４：１３４８−１３５１．１９８９；　Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　０１ｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：１２１３−１２１７．１９９０）を用いてスクリーニングを行なった。単離したＹＡＣクローンの特性はパルスフィールドゲル分析、制限地図作成およびコスミドクローンに対するハイブリダイゼーションにより決定した。

以下の実施例は本発明の例示のためであって、その限定を意図するものではない。実施例は用いることのできる代表例であって、その代わりに当業者に公知の他の方法を用いてもよい。

ラットＤ２ドーパミンレセプターｃＤＮＡの予想される第二のトランスメンプラン・ドメインに対応する６０ヌクレオチドの配列を用いる過程で（Ｂｕｎｚｏｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３６：７８３−７８７．１９８８；Ｍｏｎｓｍａ、　ｅｔ　ａｌｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４２：９２Ｂ−９２９，１９８９）　、配列された染色体特異的コスミドライブラリー（ｆｉｖａｎｓ、　Ｇ、Ａ、、　Ｂｉｏｔ！５ｓａｙｓ、　１３：３９−４４．１９９１；　Ｅｖａｎｓ　ａｒｉｄ　Ｌｅｗｉｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：５０３０−５０３４．１９８９）中でいくつかのコスミドクローンを同定したが、これらは、Ｇタンパク質結合レセプター遺伝子ファミリ −ならびに交差ハイブリダイズする配列を含む染色体１１上のいくつかの遺伝子座に対して潜在的な構造関連性を有する。４Ｆ７と７Ｈ１２（図１）と名付けた２つのコスミドはこのオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションの強いシグナルを示し、Ｄ２ドーパミンレセプターのトランスメンブラン・ドメインと交差ハイブリダイズする配列を含んでいる。この配列に加えて、高頻度反復要素をこれら２つのコスミドの重複領域に検出し、さらにその特性決定を行なった（図１）。

この反復要素は遺伝マーカーとして有用である可能性があったために、さらに特性決定を行なった。この反復配列を含む１．１ＪｋｂのＡｐａ　１−５ａｃ　ｌ制限断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣＡ　）中にサブクローン化し、反復要素のＤＮＡ配列を決定した（図２Ａ）　、このＤＮＡ配列は、［Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）　］　ｎの形の７３の繰り返しからなる４３８塩基対にわたる高度に縮重した反復ヘキサマーモチーフ、およびＡｃｃ１部位に関与する単一のジヌクレオチド挿入物を明らかにした。

この要素中に見られる最も共通するモチーフはＴＡＴＡＴＧ　（４１％）であった。ＴＧＴＡＴＧ　（２９％）とＴＡＴＧＴＧ　（１２％）とともに、これら３種類のモチーフはユニーク配列に隣接する大部分の反復要素を構成していた。このヘキサマーの繰返しの上にさらに複合高次反復が重なっており、ここでは反復単位のＴＡＴＡＴＧ（Ａタイプ）　、ＴＧＴＡＴＧ　（Ｂタイプ）、またはＴＡＴＧＴＧ　（Ｃタイプ）がＡＡＡＢＡＣかＡＡＡＢＡＢのパターンで繰返されている（図２Ｂ）。

この高次反復単位はこの要素の３′末端において最も容易に観察される。

気ス種々の個体における多型遺伝子座の検出この要素がヒトゲノムにおいて高度に反復的であるかどうか、またはそれが多重部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　５ｉｔｅｓ）を示すものかどうかを決定するために、Ａｐａｔ−ｓａｃｔ制限断片を多数の供給源からのヒトＤＮＡについてのサザンプロット分析用プローブとして用いた。

この複合反復要素にもかかわらず、ユニークな単一バンドのハイブリダイゼーシヨンシグナルが中程度のストリンジエンシーで得られ、このことはヒトゲノム中の単一コピー提示を示すものである（図３）。どの個体においてもユニーク（非反復性）であるのに、異なる個体からのＤＮＡ試料を用いるサザンプロットの制限パターンの比較は、この要素が多型性であって、そのために地図作成用プローブとして有用であることを示唆した。

多型性の存在と程度を分析するために、また多数の試料のＤＮＡ遺伝子型の迅速で効率的な分析を提供するために、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる増幅に基づくこのユニークな反復要素のアッセイ系が案出された（Ｓａｋａｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０：１３５０−１３５４゜１９８５　’Ｉ。４Ｆ７反復要素に隣接するユニーク配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを調製した（図２Ａ）。これらのプライマーを用いるＰＣＲ増幅によりユニークなりＮＡ断片長が得られることが分かり、これらは簡単なアガロースゲル上で容易に検出できた。この反復要素の多型性を評価するために、関連性のない１５個体からＤＮＡを得て、これをＰＣＲ増幅に供した（図４）。各々の場合に、おそらく４Ｆ７反復要素の二つの対立遺伝子を示すと思われる二つの増幅産物をアガロースゲル上で検出し容易に区別することができた。試験された１５個体のうち少なくともＩＯ対立遺伝子が３００〜９００　ｂｐのサイズ範囲で検出された。３００　ｂｐ未渦の対立遺伝子は検出されず、１個体はホモ接合性か、サイズの区別できない二つの対立遺伝子を有するように思われた。この分析から、この配列の長さが高度に多型性であって、両対立遺伝子を検出できることが示唆される。

反復要素の高度に可変的な性質はおそらく分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）ではなく迅速な体細胞変異により生じたと考えることができるので、この配列要素が関連個体から単離されたＤＮＡに遺伝しているかを調べた。３家系の個体からＤＮＡを得て、それらの４Ｆ？反復要素の対立遺伝子をＰＣＲ増幅により分析したところ、メンデルの分離と一致する結果が示された。図５に示すように、各々の個体は親のものと大きさが同じである２つの異なる増幅産物を示したが、これはメンデルの分離を明確に示しており、頻繁に起こる体細胞変異とは一致していなものである。したがって、この遺伝子座の増幅産物は、メンデルの法則で遺伝する反復要素の対立遺伝子を表すものと結論することができよう。

さらに、このマーカーは遺伝子連鎖の研究に有用である可能性があるので、（１）正確な染色体の位置決定および（２）該遺伝子座の広範囲の地図を決めることは意義があろう。このコスミドは染色体特異的ライブラリーから単離されたが、このライブラリーでは一部のものが同位体によらない蛍光ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンにより既に特徴付けられている。ＬｉＣｈｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９．　１９９０）と５ｅｌｌｅｒｉ　ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８：８８７−８９１．１９９０；　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　８：５９−６６、１９９１　）の方法を用いて、コスミド４Ｆ７からのＤＮＡをランダムヘキサマープライマーによりビオチニル化ヌクレオチドで標識し、プレアニール化して反復ＤＮＡ配列を除去し、そして中期のヒト染色体に対してハイブリダイズさせた。

ハイブリダイゼーションシグナルはＦＩＴＣ−アビジンとＦＩＴＣ−抗アビジン抗体を用いて可視化して、同焦点レーザー走査顕微鏡を用いて像を集めた（図６）。二つの異なるハイブリダイゼーションシグナルが試験した染色体１１の９５％に見られ、交差ハイブリダイズする他のシグナルは観察されなかった。染色体位置はｔ、＋ｃｈｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９．１９９０）を用いて決定し、そして４Ｆ７クローンはＦＬｐｔｅｒＯ，６（ｐｔｅｒからの部分染色体長（ｆｒｉｃｔｉ。

ｎａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｌｅｎｇｔｈ）　）±０．０２に位置していることが分かった。染色体１１のイディオグラムとの比較により、１ｌｑ１３に位置していることが示され、１ｔｑｔａ、ａ−１１ｑ１３．４が最もありそうな位置である。このプローブは、以前にｔｎ　５ｔｔｕハイブリダイゼ一シ日ンで１１ｑ１３に位置付けられた一部のコスミドマーカー内にさらに局限化された（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：６４−６９．１９９０　）。

この遺伝子座を囲んでいる広い範囲の物理的地図は、パルスフィールドゲル電気泳動および酵母の人工染色体の単離と特徴付けを用いて確立された（Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４：　１３４８−１３５１．１９８９；　Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　０１ｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７：１２１３−１２１７．１９９０）。２つのヒトＢリンパ芽球細胞系から単離されたＤＮＡを数種の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そのパルスフィールドゲル電気泳動を行なった。４Ｆ？コスミドのＡｐａ　１−３ａｃ　ｌ制限断片を用いた、一連のＣｐＧの豊富な制限酵素に対する断片サイズを表１に示す。コスミド内のプローブ配列の位置を図１に示す。

Ｂｓｓ旧＋　２００　２００Ｃ１ａ　１　２８０　２８０Ｂｃｏ　５２１　２４０　１８０Ｍ１ｕ　１　５８０　５８ＯＮｏｔ　ｌ　ＮＤ　”　４４０Ｓａｃ　ＩＩ　２６０　２００Ｘｈｏ　ｌ　２００　２００ａ決定されていない４Ｆ７多型性を検出するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応でヒトＹＡＣライブラリーをスクリーニングすることにより、酵母の人工染色体を単離した。

ＹＡＣスクリーニングはプール選択ストラテジーの改良法を用いて実施しくＧｒｅｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７＋１２１３−１２１７．１９９０　）　、ＹＡＣクローンをパルスフィールドゲル電気泳動で特徴付けを行なった。４Ｆ７の反復要素を含む３２０　ｋｂの１つのＹＡＣクローンを単離し、このＹＡＣクローンの制限地図を作成した。さらに、コスミド・コンティーク（ｃｏｓｍｉｄ　ｃｏｎｔｉｇ　）をハイブリダイゼーション多重分析により構築した以前の研究で（Ｅｖａｎｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：５０３０−５０３４．１９８９　）　、４　Ｆ　７と７Ｈ１２クローンを含むコンティークが同定された。物理的地図中のこのコンティークの位置を図８に示す。パルスフィールドゲルデータと組み合わせると、得られた物理的地図は反復要素付近の４００　ｋｂの領域にわたるもので（図７）、少なくとも２つの可能なＨＴＦアイランドの位置を示しており、遺伝子の位置を示唆している（　Ｂｉｒｄ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ、、　３：３４２−３４７．１９８７　）。

以上、本発明を詳細に記載してきたが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく多様な変更と改良ができることは当業者にとって自明であるだろう。

配列の要約配列番号１は本発明のゲノム断片の核酸配列である。

配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：　工ヴアンス　Ｐｈ、　Ｄ、　、グレンＡ。

セレリＰｈ、　Ｄ、　、リシアヨーバンクス、ジェームスＨ１（ｉｉ）発明の名称：多型遺伝子座（ｉｉｉ）配列の数：１（ｉｖ）宛て名：（Ａ）名称：　５ｐｅｎｓｌｅｙ　Ｈｏｒｎ　Ｊｕｂａｓ　＆　Ｌｕｂｉｔｚ（Ｂ）通り＋４２２５　エグゼクティブ　スクエア。

スート　ｌ　４００ＣＣ’）都市ニラホヤ（Ｄ）州：カリフォルニア州（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：９２０３７（ｖ）コンピュータ読取り可能形態：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン　リリーズ＃１．０バージョン＃１．　２５（ｖｉ）先行出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ（Ｂ）出願日：　０９−ＯＣＴ−１９９１（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）代理人の情報（Ａ）名称：　Ｗｅｔｈｅｒｅｌｌ、　Ｊｒ、　Ｐｈ、Ｄ、、　Ｊｏｈｎ　Ｒ。

（Ｂ）登録番号：３１，６７８（Ｃ）整理番号：ＰＤ−１５１２（ｉｘ）通信先の情報（Ａ）電話：　（６１９）４５５−５１００（Ｂ）ファクシミリ：　（６１９）４５５−５１１０（２）配列番号ｌの情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ二８７０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本部（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：４ｆ７（ｘｉ）配列の記載：配列番号ｌ：＾τＡＴＡＣ八ＡＧＧ　へＣＣ丁ττＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＴ　ＧＡ？ＧＧＡＧＡＧＧ　ＣＣＧＧＣτＧＣＣＡ　ＣＣＴＴＧＡＧＣbＡ６〇八ＴＧＴＧτＡτＧＴ　ＧＴ八へＧτＡ、ＴＡτ　ＧτＧＴＡＴＧ？Ａτ　ＣＧＧＧＴｈＣＣＧτ　Ａ（、τＣＣＣＣＣτＴＡτＣＣＡＣτfＧＧＦＩＧ、　３ＦＩＧ、　４ＦＩＧ、　６ＡＦＬＰＴＥＲＦＩＧ、　６ＢＹＡＣコスミド一一一一１　−一−１日石団Ｃ７フロントページの続き（７２）発明者　セレリ、リシアアメリカ合衆国　９２０１４　カリフォルニア州　デル　マー、アパートメント　ナンバー１１４　フォース　ストリート　２０１（７２）発明者　ユーバンクス、ジェームズ　エイチ。

アメリカ合衆国　９２１２２　カリフォルニア州　サン　ディエゴ、ポーリング　アベニュー　４７３１

Claims

【特許請求の範囲】

１．１つの種の個体の同定用プライマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、同定がゲノムの多型遺伝子座の増幅を含むものである、上記のオリゴヌクレオチド。
２．多型遺伝子座のポジティブ鎖が６ヌクレオチド配列：［Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）］ｎ（ここでＴはチミンであり、Ｐｕは独立してプリンであり、そしてｎは１〜約１０００である）を含む請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
３．多型遺伝子座が制限部位ＧＴＭＫＡＣ（ここでＭはＡまたはＣであり、ＫはＧまたはＴである）を含む請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
４．種がヒトである請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
５．【配列があります】または【配列があります】から選択されるブランキング配列およびそれに相補的な配列とハイブリダイズし得る請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
６．【配列があります】または【配列があります】およびそれに相補的な配列である請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
７．１つの種の個体の同定方法において、（ａ）ゲノムの多型遺伝子座のブランキング領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを用いて個体の核酸を増幅させ、そして（ｂ）増幅された多型遺伝子座の存在を検出することからなる方法。
８．多型遺伝子座が１１ｑ１３上に存在している請求項７記載の方法。
９．多型遺伝子座のポジティブ鎖が６ヌクレオチド配列：［Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）］ｎ（ここでＴはチミンであり、Ｐｕは独立してプリンであり、そしてｎは１〜約１０００である）を含む請求項７記載の方法。
１０．多型遺伝子座が制限部位ＧＴＭＫＡＣを含み、ここでＭはＡまたはＣであり、そしてＫはＧまたはＴである請求項９記載の方法。
１１．種がヒトである請求項８記載の方法。
１２．フランキング領域のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドが【配列があります】または【配列があります】およびそれに相補的な配列から選択される請求項８記載の方法。
１３．オリゴヌクレオチドが【配列があります】または【配列があります】およびそれに相補的な配列である請求項１２記載の方法。
１４．増幅された多型遺伝子座がゲル電気泳動により同定される請求項７記載の方法。
１５．増幅された核酸を制限部位ＧＴＭＫＡＣ（ここでＭはＡまたはＣであり、ＫはＧまたはＴである）を認識する酵素で処理することを含む請求項７記載の方法。
１６．多型遺伝子座を定めているＤＮＡ配列であって、該遺伝子座のポジティブ鎖が６ヌクレオチド配列：［Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）Ｔ（Ｐｕ）］ｎ（ここでＴはチミンであり、Ｐｕは独立してプリンであり、そしてｎは１〜約１０００である）を含むＤＮＡ配列。