JPH07501206A - 前駆肝細胞の増殖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞、特にその後代が成熟肝細胞に分化可能な細胞の増殖成長（ｅｘ ｐａｎｓｉｏｎ）または増殖（ｐｒｏｌ　１ｆｅｒａｔｉｏｎ）に関する。より 詳細には、本発明はそのような細胞の、間質細胞、細胞外マトリツクスおよび／ または成長因子の存在下における、集積ならびに増殖成長または増殖に関する。

別の側面において、本発明は、肝細胞に分化し得る遺伝的に設計された細胞に関 する。

本発明の一側面によれば動物細胞集団を含む組成物が提供される。この細胞集団 は、（ｉ）その少なくとも一部またはその後代の少なくとも一部が肝細胞に分化 可能であり、そして（ｊ　ｉ）アルファ胎児蛋白とアルブミンの本質的な分泌を 欠くことまたはアルファ胎児蛋白を分泌することにより特徴付けられ、かつその 少なくとも一部またはその後代の少な（とも一部がアルブミンを発現する細胞に 分化可能な未熟細胞を含有する。一般的に、アルブミンを発現する分化細胞は成 熟肝細胞の形態学的および生理学的特徴を有している。この細胞集団は前記未熟 細胞の増殖成長を育す条件下に培養される。本明細書において、以後そのような 細胞は”前駆肝細胞′として記載されることがある。　前駆肝細胞はどの動物種 からでも誘導し得るが哺乳類から誘導することが好ましい。前駆肝細胞が誘導さ れ得る哺乳類は、これらに限られるものではないが、ヒト、（例えばラット、マ ウス、ハムスター等の）げっ歯頚、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタおよびヒツジを包 含する。好ましくは、前駆肝細胞はヒトから誘導される。

前駆肝細胞は肝臓組織から得ることが好ましいが、そのような細胞は、これらに 限られるものではないが、例えば膵臓、腸、肺、および骨髄等の他の採取源から 得ることもできる。

一般的に、そのような前駆肝細胞は肝臓の切片から得ることができる。次に、こ の肝臓切片は標準的な方法により、解離した単細胞に解離することができる。

そのような方法は、酵素解離および機械解離を包含する。酵素解離は、コラゲナ ーゼ等のプロテアーゼおよび／またはＤＮアーゼ等のヌクリアーゼの存在下に実 施することができる。場合により、プロナーゼも使用されることができる。その ようなプロナーゼも前駆肝細胞の集積に寄与する。肝臓細胞の酵素解離の一例が 、ブレドロウらの文献［Ｐｒｅｔｌｏｗ、ｅ＋　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｃｅ１ ｌ　５ｅｐａｒｅｔｉｏｎ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＳｅｌｅｃｔｅｄ　Ａｐ ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　ｐｇｓ、　４５−７７、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８V）］に記 載されている。次いで、これらの細胞に対して集積処理を行い、この細胞集団か ら成熟肝臓細胞を排除する。集積の為の種々の方法が存在している。そのような 方法は、これらに限られるものではないが、プロナーゼ、ＤＮアーゼおよびコラ ゲナーゼを用いた酵素的消化；成熟肝細胞よりも小さい細胞のための遠心水ひ（ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｅｌｕｔｒｊａｔｉｏｎ）　；および１０％グリセロ ールの存在下における液体窒素中での細胞凍結を包含する。しかしながら、本発 明の主題は特定サイズ範囲のまたは特定形態の細胞に限られるものではないこと を理解されたい。

あるいはまた、前駆肝細胞を含有し得る肝臓組織または他の組織の切片に由来す る細胞を、前駆肝細胞のエピトープを認識する七ツクローナル抗体と接触させる ことにより、未熟細胞を集積することもできる。次に、そのような細胞は周知技 術により組織切片の別の細胞から分離されることができる。

集積方法の一例においては、肝臓切片を入手すること、ならびにその肝臓切片を 緩衝液、グルコースおよび／または抗生物質を含有していてもよい水冷生理食塩 水中に設置することが含まれる。次いで、この肝臓切ハは細かく分割され、そし て引き続いて、Ｃａ　Ｃｌ　２を添加した生理食塩水を基に調製された、コラゲ ナーゼ、プロナーゼおよびデキシリポヌクレアーゼを含有する溶液により消化さ れる。この消化は、振盪水浴中、３７℃で約２０分間？ｊ才つれることが好まし い。次に、部分的に消化された組織は重力により組織篩で漉され、そして未消化 の残部は上記に記載の手順で２回にわたり再度消化される。次いで、収集された 細胞は生理食塩水にて洗浄され、その数を４測され、そして活性を検定される。

集積された前駆肝細胞集団は、次に、前駆肝細胞の増殖成長または増殖を肩す条 件下に培養されることができる。以上のことがら、本発明の別の側面によれば、 上記記載の如（特徴付けられる未熟細胞の増殖成長方法または増殖方法が提供さ れる。この方法は、未熟細胞の増殖成長を提供するための条件下における未熟細 胞の培養を含む。好ましくはこの方法は、（ｉ）細胞外マトリックスおよび（ｉ Ｄ肝臓間質細胞の存在下における未熟細胞の培養を含む。前記肝臓間質細胞は、 胚性肝臓間質細胞または胎児性肝臓間質細胞であることが好ましい。一般的に、 間質細胞は、生体内において上皮細胞と密接に協働しかつバラクリン関係にある 、間葉織由来の細胞である。また、間質細胞は血清添加培地を用いた組織培養用 プラスチック容器での培養で容易に成長する。一般的に、そのような細胞はまた 繊維性コラーゲンを産生ずる。

本明細書において使用される“増殖成長する（ｅｘｐａｎｄｉｒ＋ｇ）”という 術語は、未熟細胞の成長または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を冑す条件 下で未熟細胞または前駆肝細胞が培養されることを意味する。

細胞外マトリックス成分の例は、これらに限られるものではないが、例えば、Ｉ Ｖ型コラーゲン等のコラーゲン、または接着性蛋白であるフィブロネクチンおよ びラミニンをも包含する。好ましい細胞外マトリックス成分はＩＶ型コラーゲン である。コラーゲンが用いられる際には、該コラーゲン単独でも、アミニンまた はフィブロネクチンと組み合わせても、プロテオグリカンと組み合わせても、あ るいは細胞外マトリックス材料の集積された組織抽出物と共にも使用されること ができる。　細胞外マトリックス成分は多孔質固体支持体上に被覆されることが 好ましい。使用され得る多孔質支持体の例は、これらに限られるものではないが 、ミリセル（ＭｉｌｌｉｃｅＬｌ）膜支持体、フィルター、スポンジ、および中 空繊維系等の多孔質支持体を包含する。あるいはまた、細胞外マトリックスは多 孔質固体支持体に未装着であってもよい。そのようなマトリックスの例は、浮遊 コラーゲンゲル、ゲル泡沫、合成材料の球体、あるいはデキストラン、ポリスチ レンおよびアガロース等の合成材料の繊維を包含する。

前駆肝細胞は適切な基礎培地、好ましくは血清無添加培地中で培養される。より 好ましくは、培地のカルシウム含量は０．４ｍＭ未満である。そのような培地の 例は、これらに限られるものではないが、ハムズ（Ｆｌａｗ’　ｓ）　Ｆ　１０ 、ハムズＦ１２、およびＲＰＭ１１６４０を包含する。好ましい態様において、 基礎培地はさらに少なくとも１種類の成長因子を包含していてもよい。使用され 得る成長因子は、これらに限られるものではないが、インターロイキン−１およ びインターロイキン−３等のインターロイキン：繊維芽細胞成長因子；プロラク チン：成長ホルモン；形質転換成長因子−α等の形質転換成長因子、ＩＧＦ−１ およびＩＧＩ−１１等のインスリン様成長因子：グルカゴン；インスリン；血小 板由来成長因子；Ｔ３等の甲状腺ホルモン：へパトポイエチン（ｈｅｐａｔｏｐ ｏｊｅｔｊｎ）　ＡおよびヘパトポイエチンＢ等のへバトポイエチン：上皮細胞 成長因子（ＥＧＦ）；デキサメタシン、ノルエピネフリン：およびトランスフェ リンを包含する。そのような成長因子の１２種類またそれ以−Ｌが、ホルモン定 義培地（ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｉ３またはＩ（Ｄ Ｍと称される血清無添加培地中に含有されることができる。ＨＤＭの例は、エナ らの文献［Ｅｎａｔ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、。

Ｖｏｌ、　８１．　ｐｇｓ、　１４１＋、−１４］５　（１９８４）］により詳 細に述べられている。ＲＰＭＩＩ６４０、ハムズＦＩＯ、ハムズＦ１２またはそ の池の基礎培地を用いて調製され得るホルモン定義培地（ＩＩＤＭ）の代表例は 、下記の濃度で下記成分を包含している。

ＨＤＭ 成分　濃度 インスリン１０　ｌ１ｇ／ｍｌ 成長ホルモン　１０μＵ／ｍｌ プロラクチン２０ｍＵ／ｍｌ グルカゴン　１０μｇ／ｍ＋ ＥＧＦ　５０　ｎｇ／ｍｌ デキサメタシン　１０−ＩＩＭ Ｔ３　１０−９Ｍ セレニウム　３Ｘ１０”Ｍ 銅　１０−７Ｍ 亜鉛　１０−ｌ０Ｍ 基礎培地は、例えば、ウシ血清アルブミン、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）等のリボ 蛋白、および／または遊離脂肪酸等の補助剤をさらに包含することができる。

補助剤に含有され得る遊離脂肪酸は、これらに限られるものではないが、バルミ チン酸、パルミトール酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリルン 酸、あるいはそれらの混合物を包含する。

そのような補助剤を含有する培地の例は、０．４％ウシ血清アルブミン、ならび に下記の割合で下記遊離脂肪酸を有する遊離脂肪酸混合物を１リツトル当たり７ ．６ｍＥｑ添加されたハムズＦ１２培地を含む。

パルミチン酸　３１％ パルミトール酸　２．８％ ステアリン酸　１１．６％ オレイン酸　１３．４％ リノール酸　３５６％ リルン酸　５．６％ このような培地は、以下の本文中においてＨＢＦ培地と称されることがある。

さらなる代表例として、ハムスＦ１２培地またはＨＧＦ培地が、下記の濃度で補 助剤として使用される下記の成長因子、ホルモンまたは他の化学物質を包含して いてもよい。

成分　濃度 デキサメタシン　１０−’Ｍ インスリ７　０．１〜１００　μｇ／ｍｌマルチースチムレイティング アクティビティ　（ＭＳΔ）　＊　５０　ｎｇ／ｍ１ＥＧＦ　２５−１００　ｎ ｇ／ｍｌ ノルエピネフリン　１０′□４Ｍ ヘパトポイエチン　２５μｌ／ｍｌ ＦＧＦ　１０ｎｇ／ｍｌ ＊）シグマケミカル（Ｓｉｇ＋ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　１ ．ｏｕｉｓ、　Ｉｌｏ、）の商標であり、同社より入手した。ＭＳＡはインスリ ン様成長因子−■およびインスリン様成長因子−ＴＩを含有している。

上記の如き条件下に培養される未熟細胞の数は、種々の方法によりモニターする ことができる。一般的に、そのような培養未熟細胞の数は１週間の期間内に少な くとも約３倍、好ましくは少なくとも約１０倍の割合で増加することができる。

好ましい聾様の一例において、前駆肝細胞に関して集積されたヒト肝臓細胞集団 が、該細胞が分極しかつミリセル支持体等の基底表面を通じて給餌し得る条件下 に、ＩＶ型コラーゲンのマトリックス中またはその」−に置かれる。マトリック スに結合した前駆肝細胞は、胚性肝臓由来間質細胞の給餌層を備えていてもよい 。

これらの細胞は０．４ｍＭ未満のカル７ウムを有し、かつ遊離脂肪酸に富む血清 無含有培地中で培養される。そのような条件下で前駆肝細胞の増殖成長がいくら か行われる。前駆肝細胞の増殖成長を加速したい場合には、培地に成長因子を添 加することができる。培地にインターロイキン−３またはインターロイキン−１ 等のサイ［・カインを添加すれば、より活発な成長または増殖成長を得ることが できる。例えば、」１皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、、繊維芽細胞成長因子（ＦＧ Ｆ）またはＩＧＦ−１１等の成長因子の添加は、前駆肝細胞の高い割合での増殖 成長を誘導する。

本発明者らは前記未熟細胞の増殖成長のための好ましい聾様の例をここに開示す るが、本発明は、本発明の主題の範囲内でそのような細胞の増殖成長のために別 の方法を採用し得ることをも意図している。

本発明者らは、肝臓間質細胞と細胞外マトリックスを含有する培地中で前駆肝細 胞を成長させることで、前駆肝細胞を支持する、または増殖成長させる、もしく は増殖させることが可能であることを見いだした。細胞の全体的な成長、（即ち 、広範な増殖的成長）が得られた場合、またはある種の場合には、クローン性成 長において知られているそのような未熟細胞のコロニーの成長、ならびに細胞の 延長された期間に亙る生存を可能にする。

前駆肝細胞の増殖成長において、そのような増殖成長させた前駆肝細胞を前駆肝 細胞の少なくとも一部または該前駆肝細胞の後代の少なくとも一部が成熟肝細胞 に分化することを可能とする条件下に培養してもよく、あるいはまた、そのよう な増殖成長させた前駆肝細胞を患者に、好ましくは患者の肝臓組織内に移植して 、その部位で前駆肝細胞の少なくとも一部または該前駆肝細胞の後代の少なくと も一部を成熟肝細胞に分化させてもよい。

また、本発明は、本発明の主題の範囲内で、そのような前駆肝細胞を遺伝的に設 計してあらゆる広範な種類の蛋白またはポリペプチドを発現させることをも意図 している。

前駆肝細胞またはその細胞に由来して分化した細胞により発現され得る設計対象 遺伝子は、これらに限られるものではないが、（１）正常な肝臓細胞内に存在し かつ該細胞により生物学的に効果的なレベルで発現されるが、設計対象遺伝子を 壱畜または患者に移植する前には治療されるべき彼らの肝臓細胞内に存在はして も正常な量よりも少ない量発現される遺伝子、（２）正常な成熟肝臓細胞内では 発現されない遺伝子、または（３）正常な肝臓細胞内で発現はするが、治療され るべき患畜または患者においてはその構造が欠陥を有しており、為に単独または そのあらゆる組み合わせにおいて機能性を有しない蛋白の産生を膚ず遺伝子を包 含する。

設計対象遺伝子は、（例えばゲノムＤＮＡ等の）細胞性遺伝材料内に組み込まれ たり、または染色質性に存在する（即ちエピソームの一部として残存し、エピソ ームにより発現される）こともてきる。設Ｊ１対象の遺伝材料はＤＮＡまたはＲ ＮＡであることができ、このＤＮＡは設計対象遺伝子（即ち成熟肝臓細胞におい てその発現が望まれる遺伝子）の全てまたは一部を構成することもできる。

前駆肝細胞またはそれに由来する分化した細胞に組み込まれてそれらの細胞によ り発現される遺伝子は、さらに、設計対象遺伝子を発現する細胞が同定されかつ 選択されることを可能にする手段を提＋１１−する、選択可能なマーカーをコー ドする遺伝材料（例えばＤＮＡ）を包含することができる。遺伝材料（即ち設計 対象遺伝子、および場合により、選択可能なマーカーをコードする遺伝材料）が 組み込まれた前駆肝細胞は、導入前駆肝細胞または遺伝設ＪＩ前駆肝細胞と称さ れてい前記遺伝子は、適切なベクターにより、分離および／または培養され、そ の後患者に移植される前駆肝細胞に組み込まれることができる。さらにはまた、 前駆肝細胞を標的として認識するベクターが被移植者に注入され、それによりそ のベクターが前駆肝細胞に組み込まれることもてきる。

生体外で遺伝的に改変されるべきそのような前駆肝細胞はヒトまたはヒト以外の 動物から獲得され、改変さオ］、そして移入または移植により同一のヒトまたは ヒト以外の動物に戻されることができ、あるいはまた、提供者（即ち最終被移植 者以外の採取源）から獲得され、改変されて、被移植者の体内にやはり移入また は移植により置かれることもてきる。

本発明の遺伝的に段重された細胞は、前駆肝細胞またはそれに由来する分化した 細胞内の正常遺伝子の発現によりｖ１復可能な単一遺伝子障害の結果であるあら ゆる疾患の治療に用いられることができる。本発明の遺伝的に設＃１された細胞 は、例えば、肝細胞（肝臓）機能における後天的または先天的障害の予防または 治療に有用なポリペプチドまたは蛋白を供給するために用いられることができる 。例えば、それらは、低密度リポ蛋白（Ｌ　Ｄ　Ｌ　）受容体先天性欠乏症の修 復、および／または先天性アンモニア血症を引き起こすオルニチントランスカル バミラーゼ（ＯＴＣ）先天性欠乏症の修復に用いられることができる。

そのような遺伝的に設計された細胞は、また、ＶＨＩ因子またはＩＸ因子の欠乏 による血友病、アルファ１抗トリプンン欠乏症、フェニールケトン尿症（Ｐ　Ｋ Ｕ）、あるいはウレアサイクルにおける不全またはその他の代謝経路における不 全から生ずる他の病気の治療に用いられることもてきる。

遺伝的に段重された前駆肝細胞は、蛋白およびペプチドが通常産生されると本質 的に同様の手段により所望の治療蛋白またはペプチドを供給するために使用さ第 １ることがてき、そして自己移植の場合には免疫応答および移植拒否反応の危険 も殆ど無い。さらに、通常単離ペプチドては必要な、ポリペプチドの個体投与に 先立つ余分な（そして往々にして費用のかさむ）ポリペプチドの純化を必要とし ５ない。そのような遺伝的に設計された前駆肝細胞は、通常そ第１が産生される が如くポリペプチドを産生ずる。

設計対象のポリペプチドまたは蛋白をコードする遺伝子および／または優性な選 択可能なマーカーをコードする遺伝材料を包含する遺伝材料を有する導入前駆肝 細胞に、レトロウィルスベクターを用いることができる。

遺伝子はレトロウィルスベクターにより前区肝細胞内に取り入れられることがで きるので、遺伝子は通常ベクターの管理下にある（管理下に入れられる）ことが でき；そのような場合には、設計対象遺伝子はレトロウィルスのプロモーターに より転写される。プロモーターとは、ＲＮΔ合成を開始するＲＮＡポリメラーゼ 分子により認識される特別なヌクレオチド配列のことである。さらにはまた、（ 通常のレトロウィルス遺伝子の転写を行うプロモーターに加えて、）設計対象遺 伝子の転写を行う付加的なプロモーターおよび調節要素を有するレトロウィルス ベクターが用いられることもてきる。この分類は、これらに限られるものではな いが、プロモーター、エンハンサ−１または肝臓内で通常発現される遺伝子のた めの池の調節要素を包含する。例えば、外部因子または外部信号により修飾され る付加的プロモーターを有する構造を使用して、その外部因子または外部信号を 提供することにより、改変された前駆肝細胞またはそのような前駆肝細胞から分 化した成熟肝細胞により産生されるポリペプチド１ノベルの管理を可能にするこ とができる。例えば、熱シヨツク蛋白はそのプロモーターが温度により調節され る遺伝子によりコードされる蛋白である。別の例では、金属含有蛋白であるメタ ロチオニンをコードする遺伝子のプロモーターは、カドニウム（Ｃｄ）イオンに 応答する。さらなる例は、サイクリック八ＭＰまたはグルコロルチコイド、ある いはインターフェロンに応答することが知られているプロモーター類を包含する 。

こイ１らのプロモーターまたは外部信号により影響される他のプロモーターもま た、遺伝的に段重された前駆肝細胞またはそれらから分化した成熟細胞によるポ リペプチドの産生の調節を可能とする。

前駆肝細胞の遺伝的な設計または改変にし１−ロウイルス以外のウィルスを用い ることもできる。設ま］対象遺伝子はそのような細胞内でそのような遺伝子を発 現する全てのウーｆルスまたはそれらに由来するベクターにより組み入第１られ ることがてきる。例えば、ＳＶ４０、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデ ノ関連ウィルス、エブスタ・ｒンーバーウイルス、およびパピローフウイルスを この目的で使用することができる。ＤＮＡウィルスまたはそれに由来するベクタ ーもまた、設計対象遺伝子ならびに選択可能なマーカーをコードする遺伝子をそ のような未熟細胞に組み入れるために用いられることができる。

本発明は、前駆肝細胞が、例えばプラスミド等のＤＮＡ構造体または非ウィルス 性発現ビヒクルにより導入される場合をも意図している。

設計対象遺伝子を発現する前駆肝細胞は、組織培養容器内でも：培養容器から離 されても；そして生体内に導入されても生育することができる。例えば、生体内 への導入は手術により行われる。このような場合、設計対象核酸配列を発現し得 る導入前駆肝細胞からなる組織が生体内に移植または移入される。例えば、その ような組繊は、肝臓に移植してまたは肝臓に接して、あるいは肝臓に非常に近接 して、腹腔内に設置される。あるい（ツまた、遺伝的に設計された前駆肝細胞は 、例えばマイクロキャリアビード等の、（例えば注入により）被移植者の腹腔内 に導入される支持体に装着されることもできる。遺伝的に設計された前駆肝細胞 の肝臓または他の部位への直接的な注入もまた、本発明は意図している。さらに はまた、遺伝的に設計された前駆肝細胞は、門脈系に注入されることも、または 腹腔内に注入されることもできる。そのような細胞の肝臓内への注入の後、細胞 は循環系により肝臓内へ運ばれることができる。一旦それらの細胞が肝臓内には いれば、細胞は設計対象遺伝子を発現および／または設計対象遺伝子を発現する 成熟肝細胞に分化する。

遺伝的に設計された前駆肝細胞の一部またはその後代の一部は、一旦個体の体内 に導入されれば、段組対象遺伝子によりコードされた蛋白、ポリペプチド、ホル モン、酵素または薬剤の連続的な供給を行う成熟肝細胞に分化する。成熟肝細胞 への分化前に、または分化無しに、前駆肝細胞によりそのような蛋白、ポリペプ チドまたはホルモンが供給され得ることをも本発明は意図している。このように して供給される蛋白、ポリペプチド、ホルモン、酵素、または薬剤の量は、必要 に応じて改変または調節され得る。

即ち、前駆肝細胞は、（例えばポリペプチドまたは蛋白等のン設計対象遺伝産物 を生物学的に十分な量で産生するような方法で遺伝的に設計される。このように して形成される前駆肝細胞またはそれに由来する成熟肝細胞後代は、必要物質特 表千７−５０１２０６　（５） の（経口摂取、注入、その他の方法による）長期投与を必要とする現在の生活規 制にとってかわる連続薬剤供給系として機能することができる。

遺伝的に設計された前駆肝細胞は、先天的疾患の治療および後天的疾患の治療針 された前駆肝細胞またはそれから分化した成熟肝細胞を提供するために用いられ る。本発明の前駆肝細胞はまた、通常は肝臓により産生される（例えばＬＤＬ受 容体等の）産物が産生されないかまたは不十分な量で作られる遺伝的疾患の治療 にも用いられることができる。失われた物質または不適当に産生される物質をコ ードするＤＮＡが導入された前駆肝細胞は、十分な量でそれを産生ずるために使 用されることができる。この場合、導入前駆肝細胞の少なくとも一部またはその 後代の一部は、ＬＤＬ受容体を産生じ得る成熟肝細胞に分化し、それにより家族 性高コレステロール血症の予防または治療手段を提供する。この疾患は、根源的 な遺伝的不全が低密度リポ蛋白のための受容体の発現または機能における異常で ある先天的疾患であり、血清コレステロールレベルの上昇および冠状動脈疾患の 未熟な発達を賓す。導入前駆肝細胞およびそれから分化した成熟肝細胞は、原因 となる不全に打ち勝つに十分な量のＬＤＬ受容体を生産するために使用されるこ とができる。この解決策は、また、高脂血症によるアテローム硬化症に対する疾 病素質を有する全ての患者に適用範囲を広げることができる。

遺伝的に設計された前駆肝細胞の使用によりその治療方法が提供され得る後天的 疾患も存在する。遺伝的に設計された前駆肝細胞は、ウィルス性肝炎、特にＢ型 肝炎または非Ａ非Ｂ型肝炎を、遺伝子移入により治療するために用いられること もできる。例えば、アンチセンス遺伝子をコードする遺伝子を前駆肝細胞に導入 してウィルスの複製を阻害することができる。この場合には、逆方向または逆位 置の肝炎構造遺伝子を含むベクターを前駆肝細胞に導入して、遺伝的に設計され た前駆肝細胞およびそれから分化する全ての成熟肝細胞の、肝炎ウィルスまたは そのＲＮＡ転写を不活性化し得るアンチセンス遺伝子の産生を齋す。さらにまた 、前駆肝細胞は、例えば、肝炎ウィルスに対する抵抗性を授は得るα−インター フェロン等の蛋白をコードする遺伝子を導入されることができる。

本発明の前駆肝細胞を採用する利点は、前駆肝細胞の生育および／またはそのよ うな前駆肝細胞の成熟肝細胞への分化のための暫定モデル系を包含する。前駆肝 細胞のそのようなモデル系は、成熟肝細胞の培養よりも大きな生育能力を有して おり、それにより毒物学研究、癌腫研究およびワクチン生産等の肝臓細胞の種々 の研究により適している。また、そのような前駆肝細胞は肝臓組織から獲得して 集積および増殖成長させることができ、一つの肝臓から得たそのような前駆肝細 胞は、後に、治療的に複数の患者に投与することができる。そのような未熟細胞 の投与は、成熟肝細胞の注入よりも免疫拒否を刺激しない可能性がある。さらに 、成熟肝細胞の生存期間は限られ、そして細胞分裂回数も限られているかもしれ ないが、前駆肝細胞は娘細胞を生産する能力により秀でている。このことから、 そのような系の生存期間は顕著に延長され、そして無限でさえある可能性がある 。

前駆肝細胞の非治療的使用の例は、肝臓発生学、肝臓細胞系列、および分化経路 ：遺伝子発現研究；障害および修復を含む肝臓機構：炎症性および感染性の肝臓 疾患の研究；病原性機構の研究；ならびに肝臓細胞の形質転換および肝臓癌の病 因の研究を包含する。さらなる治療的使用は、アルコール性、感染性および先天 的肝硬変等による肝不全患者のための肝臓移植、例えばウィルソン病、グルコー ゲン貯蔵障害、ウレアサイクル酵素不全およびクレイガーーナジャ症候群（Ｃｒ ｅｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｉｒ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）等の遺伝的な肝臓疾患の遺伝子 治療：ならびに、（例えば肝臓癌等の）化学療法、肝臓内で生育するウィルスの ためのワクチン生産、およびアルコール性チロースの研究のための、そのような 前駆肝細胞およびそれに由来する成熟細胞の全ての系列の使用を包含する。前駆 肝細胞はまた、“人工肝臓”の一部として使用されること、即ち前駆肝細胞が容 器または装置内に設置され、その中で前駆肝細胞が肝臓系列を生み出して生体外 の肝臓として機能することもできる。この容器または装置は治療対象であるヒト または他の動物の循環系と接続される。

本発明の他の側面によれば、肝臓から誘導される動物細胞集団を含む組成物が提 供される。この細胞集団は、アルファ胎児蛋白とアルブミンの本質的な分泌を欠 くことまたはアルファ胎児蛋白を分泌することにより特徴付けられる未熟細胞を 含み、かつそのような細胞またはその後代の少なくとも一部は成熟肝臓細胞に分 化可能である。これらの細胞は、未熟細胞の増殖成長を寵す条件下に培養される 。そのような未熟細胞は、既述の如（ヒトまたはヒト以外の動物の肝臓から得る ことができる。そのような細胞の後代は肝細胞に分化し得るが、そのような未熟 細胞は、例えば、胆管細胞、肝臓内皮細胞および伊東細胞として知られている脂 肪含有肝臓細胞等の肝細胞以外の成熟肝臓細胞に分化し得る。

肝臓から誘導されたそのような未熟細胞は、肝臓から獲得され、そして上記前駆 肝細胞の集積および増殖成長のための既述の条件下に集積または増殖成長される ことができる。そのような未熟細胞が既述の如き技術により遺伝的に設計され、 そのような遺伝的に設計された細胞が治療対象の動物またはヒトに投与され、そ の際この遺伝的に設計された細胞および／またはその分化した後代が設計対象遺 伝子を発現することも、本発明は意図している。

しかしながら、本発明の主題は上記した特定の態様に制限されるものではないこ とを理解されたい。本発明は既述の特定の態様以外以外の態様にても実施可能で あり、また、その主題は添付特許請求の範囲に記載されている通りである。

フロントページの続き （７２）発明者　オクス、アンドレアスアメリカ合衆国、ニューヨーク州　１０ ４６１、ブロンクス、ラインランダー・アベニュー１５７９、アパートメント　 ２−ジェイ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １． アルファ胎児蛋白およびアルブミンの本質的な発現を欠くことまたはアル ファ胎児蛋白を発現することにより特徴付けられ、かつその少なくとも一部また はその後代の少なくとも一部がアルブミンを発現する細胞に分化可能であり、そ の少なくとも一部またはその後代の少なくとも一部が肝細胞に分化可能である朱 熟動物細胞を含有し、該未熟動物細胞の増殖成長を■す条件下に培養されている 動物細胞集団を含む組成物。
2. ２． アルファ胎児蛋白およびアルブミンの本質的な発現を欠くことまたはアル ファ胎児蛋白を発現することにより特徴付けられ、かつその少なくとも一部また はその後代の少なくとも一部がアルブミンを発現する細胞に分化可能であり、そ の少なくとも一部またはその後代の少なくとも一部が肝細胞に分化可能である遺 伝的に設計された未熟動物細胞。
3. ３．アルファ胎児蛋白およびアルブミンの本質的な発現を欠くことまたはアルフ ァ胎児蛋白を発現することにより特徴付けられ、かつその少なくとも一部または その後代の少なくとも一部がアルブミンを発現する細胞に分化可能であり、その 少なくとも一部またはその後代の少なくとも一部が肝細胞に分化可能である未熟 動物細胞の増殖成長方法であって、（ｉ）細胞外マトリックスおよび（ｉｉ）肝 臓間質細胞の存在下に、該未熟動物細胞を培養することを含む増殖方法。
4. ４．前記肝臓間質細胞が胚性肝臓間質細胞である、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記肝臓間質細胞が胎児性肝臓間質細胞である、請求項３に記載の方法。
6. ６．　前記細胞外マトリックスがコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニン からなる群から選択された材料より形成されている、請求項３に記載の方法。
7. ７．前記細胞外マトリックスがコラーゲンより形成されている、請求項６に記載 の方法。
8. ８．前記コラーゲンがコラーゲンＩＶ型である、請求項７に記載の方法。
9. ９．前記細胞外マトリックスが多孔質固体支持体上に被覆されている、請求項３ に記載の方法。
10. １０．前記未熟動物細胞の培養が、さらに少なくとも１種類の成長因子が存在す る条件下に実施される、請求項３に記載の方法。
11. １１．前記成長因子が、インターロイキン；繊維芽細胞成長因子：プロラクチン ；成長ホルモン；形質転換成長因子；インスリン様成長因子；グルカゴン；イン スリン；血小板由来成長因子；甲状腺ホルモン；ヘパトポイエチン；上皮細胞成 長因子；デキサメタゾン；トランスフェリン；およびノルエピネフリンからなる 群より選択される、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記請求項３の方法により培養され増殖成長した未熟動物細胞。
13. １３．アルファ胎児蛋白およびアルブミンの本質的な発現を欠くことまたはアル ブミン胎児蛋白を発現することにより特徴付けられ、かつその少なくとも一部ま たはその後代の少なくとも一部が成熟肝臓細胞に分化可能である未熟動物細胞を 含有し該未熟動物細胞の増殖成長を■す条件下に培養されている細胞集団を含む 、組成物。
14. １４．アルファ胎児蛋白およびアルブミンの木質的な発現を欠くことまたはアル ファ胎児蛋白を発現することにより特徴付けられ、かつその少なくとも一部また はその後代の少なくとも一部が成熟肝臓細胞に分化可能である、肝臓由来の遺伝 的に設計された未熟動物細胞。