JPH07501334A - パスツレラ・マルトサイダ・トキソイドワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 パスツレラ・マルトサイダ・トキソイドワクチン発明の分野 一般的には、本発明は、家畜用ワクチン、ワクチン組成物およびその製法の分野 に属する。より詳細には、本発明は、パスツレラ・マルトサイダ（Ｐａｓｔｅｕ ｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）毒素産生株による感染に関連した疾患から動 物を防御するためのワクチン組成物および防御方法に関する。 発明の背景 パスツレラ・マルトサイダは、ヒト、ウシ、ヒツジおよびブタを初めとする多種 の動物の疾患に関連している。典型的には、動物の鼻咽頭部および肺に影響を及 ぼす。例えば、ボルデテラ・ブロンキセブティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏ ｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）毒素産生性株とビー・マルトサイダ（莢膜タイプＡま たはＤ）との混合感染は、ブタにおいて萎縮性鼻炎を引き起こす。萎縮性鼻炎（ ＡＲ）は、ブタの鼻甲介の萎縮および鼻と顔の変形を引き起こす。 ビー・マルトサイダの病原性は、大部分は、強力な壊死前（皮膚壊死前（ＤＮＴ ）とも呼ばれる）の産生による。以後、これを「毒素」という。該毒素は、分子 量約１４０．０００ないし１６０．０００の熱不安定蛋白として特徴づけられて いる。 ビー・マルトサイダは、以下に示すその増殖特性により、他の種のパスツレラか ら区別できる。溶血性・ネガティブ（９０％）；マツコンキー（ＭａｃＣｏｎｋ ｅｙ）寒天上での増殖、ネガティブ、インドール生成：ポジティブ、ウレアーゼ 生成：ネガティブ：マンニトール代謝：ポジティブ。ジンサー（Ｚｉｎｓｓｅｔ ）　、マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　（ジョクリク（Ｊ ｏｋｌｉｋ）ら編’）　（＝！−ヨークのアブルトンーセンチュリーークロフツ （Ａｐｐｌｅｔｏｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ−Ｃｒｏｆｔｓ、　１９８０年）参照。こ れを出典明示により本明細書に一体化させる。 ビー・マルトサイダ感染関連疾患から動物を防御するための、最近利用可能なワ クチンは、不活性化毒素産生性ビー・マルトサイダ細胞、部分精製ビー・マルト サイダ毒素不活性化棟品、およびピー・マルトサイダ無細胞標品と他の不活性化 ピー・マルトサイダ株またはビー・ブロンキセプティカ株との混合物を包含する ［例えばエム・コピシュ（Ｍ、　Ｋｏｂｉｓｃｈ）ら、ペテリナリー・レコード （ｖｅｔ。 Ｒｅｃｏｒｄ）　、第１２４巻＝５７〜６１頁（１９８９年）；およびエヌ・テ ィー・フォーゲド（Ｎ、　Ｔ、　Ｆｏｇｅｄ）ら、ベテリナリー・レコード、第 １２５巻＝７〜１１頁（１９８９年）参照］。しかしながら、毒素を中和するの に有効な量の抗体（「抗毒素」として知られる）を誘導できないために、これら のワクチン標品は疾患に対して十分には防御的ではない。 獣医学の分野において、ビー・マルトサイダによる動物の感染に対する有効なワ クチンが必要である。 発明の概要 本発明は、毒素産生性ビー・マルトサイダによる感染に関連した疾患から動物を 防御する新規ワクチン組成物および成分を提供する。これらのワクチン組成物は 、有意な量の循環性抗毒素を誘導する能力により特徴づけられる。 １番目の態様において、本発明は、細胞結合性トキソイドを伴った全パスツレラ ・マルトサイダ死菌（バクテリン）を含有する新規ワクチン組成物を提供する。 遊離の可溶性トキソイドと比較して、この組成物は、以前ワクチン投与されてい ない動物において、優れた抗毒素応答を誘導する。この組成物を、内用に適する 担体（好ましくは水酸化アルミニウムゲル）と会合させる。 もう１つの態様において、本発明は、（１）細胞結合性トキソイドを伴った全パ スツレラ・マルトサイダ・バクテリン（動物に内用された場合、抗毒素応答を誘 導する）、および（２）ピー・マルトサイダの遊離の可溶性トキソイドからなる 新規ワクチン組成物を提供する。このワクチン組成物は、２成分それぞれの効果 の和よりもずっと大きい予期し得ない相乗的抗毒素応答を生じさせる。好ましく は、担体をこの組成物と会合させる。 種々のｐＨおよび温度に毒素をさらす方法により、ビー・マルトサイダの可溶性 無細胞トキソイドを調製する。この方法も本発明の新規態様である。「トキソイ ド」なる語は、特異的な中和抗毒素の産生を誘導する能力を失わせずにその毒性 を除去する方法により不活性化（「トキソイド化」）された毒素標品をいう。 さらなる態様において、免疫原量の１種またはそれ以上の付加的抗原と組み合わ せることにより、上記ワクチン組成物を変化させてもよい。好ましい抗原は、ビ ー・ブロンキセブティヵ・バクテリン、エリシペロスリクス・ルシオバシアエ（ Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）　・バクテリン 、マイコプラズマ・ヒオニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｈｙｏｐｎｅ ｕｍ６ｎｉａｅ）抽出ワクチンを包含する。しかしながら、他の慣用的なワクチ ン成分を本発明ワクチン組成物に添加してもよい。 本発明ワクチン組成物を投与単位として内用する。１の具体例において、ワクチ ン投与量は、免疫原量の細胞結合性トキソイドを伴ったパスツレラ・マルトサイ ダバクテリン（動物に内用された場合、抗毒素応答を誘導する）よりなる滅菌懸 濁液０．５ないし３ｍｌからなる。もう１つの具体例において、服用単位は、ピ ー・マルトサイダの細胞結合性および遊離トキソイドの滅菌混合物０．５ないし ３ｍｌからなる。さらにもう１つの具体例において、服用単位は、免疫原量の遊 離および細胞結合性トキソイドおよび１種またはそれ以上の付加的抗原成分より なる滅菌混合物０．５ないし３ｍｌからなる。 さらに別の態様において、本発明は、無血清がっ実質的に細菌細胞を含まないエ リシペロスリクス・ワクチン成分の製法を提供する。 本発明のさらなる態様は、萎縮性鼻炎に対する動物へのワクチン投与法である。 該方法は、上記有効量の１種またはそれ以上のビー・マルトサイダ・トキソイド ワクチン成分を動物に内用することからなる。 本発明の他の態様および利点は、以下の好ましい具体例の詳細な説明中にさらに 記載されている。 発明の詳細な説明 本発明は、毒素産生性ピー・マルトサイダおよびエリンペロスリクス・ルンオパ シアエ、ビー・ブロンキセブティヵならびにエム・ヒオニューモニアエをはじめ とする他の病原性生物による感染がら生じる疾患の予防に有用なワクチン組成物 を提供する。かかる疾患は、萎縮性鼻炎（ＡＲ）　、胸膜炎および肺のパスツレ ラ症、丹毒ならびに肺炎を包含する。 本発明の１の具体例は、細菌細胞内に封じ込められた安定なトキソイドを含有す るビー・マルトサイダの全バタテリンートキソイドを提供する。この細胞結合性 トキソイドを、実施例１記載の既知方法、または好ましくは下記ワクチン用グラ ム陰性細菌液の調製法のいずれかにより調製する。まだ対数増殖期にあり、まだ 増殖培地中に毒素を放出していないピー・マルトサイダ培養物に、不活性化剤を 添加する。そのことにより、トキソイドが細菌細胞内に封じ込まれる。トキソイ ドをその中に隔離した死菌（すなわちバクテリン）は、免疫プロセスを成立させ る宿主細胞に与えるには理想的な抗原粒子である。このことは、特に、これまで 毒素またはトキソイドにさらされておらず、全体的に抗毒素に欠ける動物にとっ て重要である。本発明ビー・マルトサイプ細胞結合性トキソイドは著しく安定で ある。４℃において２年以上保存しても抗原性の低下は見られなかった。 本発明の目的のために、上記細胞結合性トキソイドを、毒素産生性ピー・マルト サイダのいかなる株から誘導してもよい。例えば、メリーランド州ロックビルの アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｊｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌ ａｎｄ）または種々の獣医学の大学あるいは研究室から入手できるかかる幾つか の株が利用できる。後者の例は、ピー・マルトサイダ・タイプＤ・８および４６ ７７株である。 現在のところ、ピー・マルトサイダ・タイプＤ・４６７７株か細胞結合性トキソ イドの調製に好ましい。等しい数の個々の細胞を用いた場合、４６７７株は８株 （以前最も良好な毒素産生株として知られていた）の２倍の毒素を産生ずるため 、この株は特に有利である。２倍量の毒素を産生ずる４６７７株のこの能力は、 同量の毒素を８株で産生させる場合の半分の４６７７株の培養物、すなわち半数 の細胞しか必要としないため、２倍量の毒素を産生ずるという４６７７株のこの 能力は有利なものである。さらに、混合ワクチンの体積が例えば２ｍｌ用量に制 限されているため、４６７７株の液体は株の液体の半分しか占めないという事実 は、従来技術のワクチンよりも有意に有利である。したがって、ビー・マルトサ イダ・４６７７株は、従来用いられていた株では達成できない処方上の利益を与 える。 ピー・マルトサイダの培養に用いる適当な培地は、当業者により選択されつる。 しかし、ヘリオツド（Ｈｅｒｒｉｏｔｔ）ら、ジャーナル・オブ・バタテロオリ ジー（Ｊ。 Ｂａｃｔ、　）　、第１０１巻：５１３〜５１６頁、［ディファインド・メディ ウム・フォー・グロウス・オブ・ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｄｅｆｉｎ ｅｄ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒＧｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈｅｍａｐｈｉｌｕｓ　Ｉｎ ｆｌｕｅｎｚａｅ）　Ｊ　（１９７０年）記載の培地が好ましいが、これに限定 されない。萎縮性鼻炎の特徴を示す病理学的変化を防止する抗毒素応答の誘導す るために、上記の新規な全細胞結合性トキソイドをワクチン組成物中に別々に用 いてもよい。好ましくは、哺乳動物、特にブタに注射するためには、ワクチン組 成物中において、免疫原量の細胞結合性トキソイドを、適当な慣用的なワクチン アジュバントおよび医薬用担体と混合する。 ビー・マルトサイダの遊離トキソイド（下記）および細胞結合性トキソイド（上 記）の相乗的混合により、より好ましいワクチン組成物が得られる。免疫量の遊 離トキソイドおよびかかる混合ワクチンを調製する。免疫量の細胞結合性トキソ イドを適当なアジュバントおよび哺乳動物注射用医薬用担体と混合することによ り、かかる混合ワクチンを調製する。好ましいアジュバントは、水酸化アルミニ ウムゲルを包含する。 前記のごとく、遊離の可溶性ビー・マルトサイダトキソイドは、ピー・マルトサ イプ細胞結合性トキソイドとの相乗的混合において有用である。該遊離の可溶性 トキソイドは、同時係属している米国特許出願第０７１５３７．４５７号の主題 である。これを出典明示により本明細書に一体化させる。いがなる毒素産生性ピ ー・マルトサイダ株も可溶性トキソイドの調製に用いられるが、下記実施例で用 いる株はピー・マルトサイダ・タイプＤ・８株である。この株は、申し出により 、イリノイ大学から入手できる。一般的には、可溶性トキソイドを、細菌細胞か ら毒素を抽出し、無細胞毒素をｐＨ９以上、約１２℃ないし１９℃で約１２ない し２４時間インキュベーションすることにより部分的に変性させることにより調 製する。 より詳細には、遊離トキソイドを以下のようにして調製する。選択された毒素産 生性ピー・マルトサイダ株を適当な培地中で増殖させる。増殖サイクルの終点に おいて、例えばフレンチプレスまたは超音波破壊のごとき慣用的な物理・化学的 手段により、毒素を細胞から遊離させ、細胞残渣を遠心分離まＩ；は濾過により 除去する。大規模生産には、以下のｐＨサイクル法をインキュベーションに適用 するのが望ましい。ついで、少なくとも２１時間の期間中、ｐＨ約１０．５ない し６．８０の間を３回サイクルさせて無細胞抽出物中の毒素をインキュベーショ ンする。上で引用した特許出願に記載された同様の方法を用いて研究室的生産を 行う。この方法により毒素を完全に無毒化することができ、水溶液（例えばリン 酸緩衝化セイライン、トリス緩衝化セイライン）に可溶なトキソイドが得られる 。 可溶性ビー・マルトサイダ・トキソイド標品は、抗原性および免疫原性の両方の 性質を有する。詳細には、該可溶性トキソイドは、毒素と結合して、その毒性を 中和できる抗体を誘導しつる。さらに、本発明可溶性トキソイドは４℃で２４力 月安定であるという特徴を有し、このワクチンを後日の使用のために保存するこ とができる。 後記実施例１１記載の動物を用いたワクチン投与実験において、単一のワクチン 標品において、遊離および細胞結合性トキソイドが相乗的に作用することが見い だされた。すなわち、該ワクチンは、ワクチン投与された動物において、それぞ れの成分を別々に投与した場合の効果に比べてはるかに大きな効果を生じる。 この混合ワクチンは、試験動物において、抗毒素産生を著しく刺激する。この混 合の効果は、連続した細胞結合性トキソイドワクチン投与、ついで可溶性ワクチ ン注射によっても生じる。 理論に限定されることを望むのではないが、細胞結合性ワクチンが、動物、詳細 には可溶性トキソイドに応答できない免疫学的にネイティブな動物に、初回抗原 刺激を与えると現在考えられている。細胞結合性トキソイドの２回目の投与は、 穏やかな二次免疫応答を誘導する。トキソイドの豊富な細胞により一旦初回抗原 刺激が与えられると、動物は遊離トキソイドに対して非常に応答しやすくなる。 あたかも細胞結合性トキソイドが優れた初回抗原刺激剤のごときもので、可溶性 トキソイドが優れたブースターのごときものである。 本発明のさらに他の好ましいワクチン組成物は、本発明細胞結合性トキソイド（ 遊離トキソイドと混合しても、しな（でもよい）を他のワクチン剤と混合するこ とにより得られる。典型的な例は、全ビー・ブロンキセブティカ・バクテリンを ビー・マルトサイダの細胞結合性トキソイドと混合することにより得られる。 別法として、上記組成物が、さらにビー・マルトサイダの遊離トキソイドを含有 していてもよい。この遊離トキソイドを、莢膜タイプのビー・マルトサイダ（細 胞結合性トキソイドの調製に用いるタイプとは異なる）から誘導してもよい。さ らに、本発明ワクチン組成物が、イー・ルシオパシアエ成分を含有していてもよ い。よって、もう１つの態様において、本発明は、エリシペロスリクス・ワクチ ン成分の調製法を提供する。 本発明ワクチン組成物と混合できる他の有効なワクチン剤は、ニジエリシア・コ リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、肺炎ビー・マルトサイダ、ストレ プトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ｕｉｓ）　、アクチノ バチルス・ブレウロニューモニアエ（＾ｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕ ｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　、クロストリジウム・ベルフリンゲンス（Ｃｌｏ ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）　・タイプＣおよびＤトキソイド 、シュードラビエス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｊｅｓ）ウィルスワクチン（修飾生ウ ィルスおよび／または死ウィルス）、ロタライスル（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）ワク チン（修飾生ウィルス）、コロナウィルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）ワクチン （修飾生ウィルス）であるが、これらに限定されない。１の好ましい具体例にお いて、マイコプラズマ・ヒポニューモニアエもまた、少なくともビー・マルトサ イプ細胞結合性トキソイドと混合されて、本発明ワクチン組成物に包含される。 本発明ワクチンの調製に有用なエム・ヒポニューモニアエ株を、ブタにおいてマ イコプラズマ肺炎を引き起こす野生型または他の既知株により感染したブタから 単離することができる。エム・ヒボニューモニアエの他の既知株（ビルレントお よび非ビルレント両方）も、本発明組成物において有用である。有用な株を、市 販経路または大学から得てもよい。本発明具体例にとり特に好ましいエム・ヒポ ニューモニアエ株は、Ｐ−５７２２−３株（１９９０年５月３０日に寄託され、 米国特許商標局の要請により利用可能となっているＡＴＣＣ＃５５０５２株）で ある。エム・ヒポニューモニアエワクチン成分の調製法を、後記実施例１０に記 載する。これらのワクチンに関するより詳細な情報は、同時係属の米国特許出願 第０７／６３４．２３７号に記載されている。出典明示によりこれを本明細書に 一体化させる。 本発明ワクチンを、無毒で滅菌された医薬上許容される担体中に、有効な免疫原 量の細胞結合性トキソイドを活性成分として含有する医薬組成物として調製して もよい。本発明ワクチンの好ましい具体例は、細胞結合性トキソイド含有水性懸 濁液または溶液からなり、好ましくは、約ｐＨ６，５に緩衝化されているものと し、容易に注射できる形態とする。 さらに、細胞結合性トキソイド（それのみ投与してもよく、遊離トキソイドとと もに投与してもよい）を慣用的なアジュバントと混合または吸着させて本発明ワ クチン組成物に添加してもよい。アジュバントを、特異的抗毒素応答を増強させ るための非特異的試薬として用いる。かかるアジュバントは、アムフィゲン（＾ ｍｐｈｉｇｅｎ）　［ヒドロニクス・インク（）Ｉｙｄｒｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ 、　）社製］または他の望ましい油、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド およびキルＡ　（ＱｕｉｌＡ）のごときサポニンを包含する。 さらにもう１つの具体例において、細胞結合性トキソイド（それのみ投与しても よく、遊離トキソイドとともに投与してもよい）を、ビー・ブロンキセブテイカ ・バクテリン、イー・ルシオパンアエ・バクテリンまたはエム・ヒポニューモニ アエのごとき別の抗原標品（既知方法により、好ましくは、本明細書記載の方法 により調製された）とともに投与することができる。 本発明の細菌成分の好ましい調製法の１つは、ワクチン処方のためのグラム陰性 細菌の新規調製法である。この方法を適用、使用して、いかなる種類の抗原濃縮 物（グラム陰性細菌の全細胞懸濁液および無細胞抽出液を包含するが、これらに 限定されない）をも調製しうる。この新しい方法は、共同出願の、同時に受理さ れた特許出願の主題であり、以下に記載されている。 本発明によれば、選択されたグラム陰性細菌（例えばパスツレラのごとき本明細 書記載のグラム陰性細菌）を慣用的条件下（いかなる慣用的な適当な培地あるい はそれ以外の培地であっても）で増殖させる。適当な培地は、当業者の通常の知 識により選択されつる。好ましくは、細菌培養温度は３５ないし３８℃の範囲で ある。 得られるワクチン成分に細菌全体を用いる場合には、増殖が遷移期または対数増 殖期にある間に、不活性化剤を添加する。好ましくは、不活性化剤は、細胞構造 を結合し、細胞壁の分解を防止することのできる固定化剤である。１の固定化剤 はホルマリン（米国局方ホルムアルデヒド溶液）であって、一般的には約０゜３ ％（Ｖ／Ｖ）ないし約１．０％、（Ｖ／Ｖ）の濃度で用いる。合成培地を用ＬＳ る場合に有用なもう１つの固定化剤はグルタルアルデヒドである。例えば、２５ ％グルタルアルデヒド溶液を約０．５ないし１％（Ｖ／Ｖ）で用いることができ る。 ベータプロピオラクトンのごとき他の適当な不活性化剤もまた、有用であること がわかっており、当業者により適当な濃度が容易に決定される。 不活性化剤を添加する場合には、通気および自動ｐＨコントロールのスイ・ソチ を切る。所望により、ｐＨを不活性化に最適な値に合わせてもよい。撹拌を最小 にし、ついで、速度を上げて混合を有効ならしめる。不活性化条件は個々の細菌 種に依存し、当業者により容易に決定されるが、典型的には、不活性化を約２８ ないし３８℃の間で行う。 別法として、得られるワクチン組成物用に細胞抽出物を調製する場合には、不活 性化を必要としない。かかる場合、培養物を冷却（通常は２０℃以下）して増殖 を阻止する。抽出を下記濃縮ステップの前に行っても後に行ってもよＧ１゜細胞 を遠心分離または濾過することにより細菌を濃縮して水性濃縮懸濁液を得るかま たは抽出を行う。好ましくは、遠心分離を約１０．０００ｇの力で行う。 培養液が遠心機を通過する流速を、はぼ１００％の細胞回収率が得られるように 調節する場合は、適当な強い力または弱い力を用いるが、それは細菌の種類に依 存する。当業者が上清（捨てる）の吸光度を測定することにより、適当な流速を 決定することもできる。遠心分離の代わりに限外濾過のごとき他の濃縮法を用Ｌ ）でもよい。はとんどすべての細胞の回収を可能にするために必要な条件および 装置のみならず方法も、当該分野の範囲内である。選択された濃縮法に力）力１ わらず、次々とバッチ中の細胞をできるだけ小さな体積中に集める。好ましくは 、細胞濃度を約１０９ないし約１０′１個／ｍｌ培養液とする。濃縮細胞抽出物 を調製するために、抽出前にこれと同じ濃度の細胞濃縮物を用いてもよい。 得られた細胞濃縮物を、少量の水、セイラインまたは緩衝液で希釈して選択され た標準濃度（濃縮方法により異なる）にする。標準濃度は、個々の細菌に依存し 、上記教示を与えられた当業者により選択されつる。 ついで、水性濃縮懸濁液または抽出液を、適当な無機担体に吸着させる。本発明 に有用な担体は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アラム（通常はポ タツシュ・アラム（硫酸アルミニウムカリウム））またはリン酸カルシウムを包 含してもよい。これらの化合物はエンドトキシンと固く結合しつる。現在のとこ ろ、好ましい担体は、高結合力を有する水酸化アルミニウムゲルである。かかる 水酸化アルミニウムゲルは、例えば、レヒドラゲル・ロウ・ビスコシティ−・ゲ ル（Ｒｅｈｙｄａｇｅｌ　１０１　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　ｇｅｌ）またはレヒド ラゲルＨＰＡ（ハイパワー）ゲル［ニューシャーシー州バークレイ・ハイツ（Ｂ ｅｒｋｅｌｅｙ　Ｈｅｉｇｈｔｓ）のレヘイス・ケミカル・カンパニー（Ｒｅｈ ｅｉｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）社製コのように市販されている。 好ましくは、担体を、前辺て希釈された細菌細胞懸濁液または細胞抽出液に、通 常１５ないし６０％（Ｖ／Ｖ）の間の濃度になるよう添加する。この濃度を滴定 により決定して担体が最適結合力を発揮するようにし、エンドトキシンおよび免 疫原性細菌抗原両方を最適に結合させる。滴定終点は、遊離エンドトキシン濃度 が約２ないし約５０ｎｇ／ｍｌとなる点である。滴定法は当業者によく知られて いる。 レヒドラケル担体を用いる場合、吸着を室温（２０〜２５°Ｃ）で、好ましくは 、ｐＨ約６．５で約１時間撹拌しながら行う。当業者は、本発明方法を用いる場 合にこれらの条件を変更することができる。例えば、より低い温度（例えば４℃ ）で吸着を行うが、混合時間を長くすることもできる。同様に、より高い温度（ 例えば３７°Ｃ）で吸着を行うが、この温度での抗原の安定性により混合時間を 短くすることもできる。 吸着完了後、得られた吸着懸濁液または抽出液をワクチン組成物用に希釈する。 選択した懸濁液または抽出液の標準濃度により、約５ないし約５０倍の範囲で希 釈を行って適当なワクチン組成物を得る。この上記方法は、グラム陰性細菌濃縮 物中に存在するエンドトキシンが選択担体に強く結合することを用いる。濃縮細 胞または抽出液中のエンドトキシンの結合は、希釈後、動物へのワクチン使用に 関して得られた液体を安全なものにする。この結合により、ワクチン投与動物に おけるワクチンの全身的反応性が除去される。同時に、最終ワクチン製品中にお ける無機担体の濃度が低いことにより、慣用的濃度（例えば１０％以上）の担体 の使用に関連する不利な注射部位での反応を回避できる。 本発明方法に関しては、理論に限定されるつもりはないが、本発明者は、注射部 位におけるエンドトキシン放出が大幅に遅れるため、本発明によるグラム陰性細 菌細胞懸濁液または抽出液を含有する製品は全身的に安全であると確信している 。系への急激なエンドトキシンの取り込みはショックを引き起こす。本発明方法 により担体ゲルの結合力を修飾または最適化する場合、いくつかの抗原（例えば 細菌細胞）は結合しない。他のもの（例えばエンドトキシンのごとき重要な蛋白 抗原）は、十分に結合力のあるゲルの場合よりもよりゆるやかに（より強固でな く）結合し、マクロファージによる取り込みが可能となる。よって、良好な免疫 原性が保持される。 ついで、上記のごとく処理され希釈されて得られた細菌液だけをワクチン標品と して用いてもよく、また、他のワクチン成分と混合してもよい。好ましくは、グ ラム陰性細胞または細胞抽出液を含有する得られたワクチン組成物が、約０゜１ ないし１０％（ｖ／ｖ）　、より好ましくは約０．５ないし５％（ｖ／ｖ）のア ルミニウム担体を含有していてもよい。本発明により調製されたワクチン組成物 が、吸着後、希釈前において、約２ないし２５０ナノグラム／ｍｌ好ましくは２ ないし５０ｎｇ／ｍｌの濃度のエンドトキシンを有意に含有していてもよい。 本発明方法により調製されたワクチン組成物のｐＨを約６．５±０．５、好まし くは±０．２に調節する。ワクチン液中の遊離エンドトキシン濃度を、好ましく は、ＬＡＬ法［レビン（Ｌｅｖｉｎ）ら１ビユレチン・オブ・ンヨーンズ・ホブ キンス・ホスピタル（Ｂｕｌｌ、　Ｊｏｈｎｓ　ｎａｐｋｉｎｓ　Ｔｌｏｓｐ、 　）　、第１１５巻　２６５頁（１９６４年）およびレビンら、トロムポシス・ エト・ディアテンス・ハエモラジカ（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅｍ ｏｒｒｈ、　）　、第１９巻：１８６頁（１９６８年）］によりアッセイする。 他の方法を用いてエンドトキシンレベルをアッセイしてもよい。 本発明によれば、活性成分が細胞結合性トキソイドのみ、細胞結合性トキソイド と遊離トキソイドの混合であってもよく、また、これら２種の処方がさらに活性 成分を含有していてもよく、好ましくは、医薬組成物（免疫量の活性成分からな る滅菌標品）を、０５ないし３ｍｌの、より好ましくは２ｍｌの単位用量として 提供する。 本発明の目的のためには、免疫量のビー・マルトサイプ細胞結合性トキソイドを 、不透明度または吸光度と呼ばれる単位（０，Ｕ、またはＡ、Ｕ、）で測定する 。 これらの単位はスペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）　２０分光光度計に て６２５ｎｍの波長で測定した１ｍｌ当たりの光学密度（０，Ｄ、　）である。 細胞結合性トキソイドの免疫原量は、好ましくは、１ないし５　Ａ、　Ｕ、であ り、より好ましくは、遊離トキソイドが約２Ａ、Ｕ、て投与する。 本発明の目的のためには、遊離トキソイドの免疫量は、本発明ビー・マルトサイ プ細胞結合性トキソイドと混合して投与する場合には、約６５ないし８．１マイ クログラム／用量である。対照的に、遊離トキソイドのみを免疫学的にネイティ ブな動物に投与する場合には、抗毒素を誘導しない。このことにより、遊離毒素 と細胞結合性トキソイド間の相互作用が示される。 これらの免疫原量の遊離トキソイドを、相対トキソイド単位（ｒＲＵＪ　）で定 義してもよい。望ましくは、遊離トキソイド／細胞結合性トキソイドワクチン組 成物が、８０ないしｌ０００ＲＵ／用量、より好ましくは８０ないし１５０ＲＵ ／用量を含有するものとする。ＲＵ値は、ＬＤ、。が約３０である精製毒素をマ ウスに非経口的に投与した場合の致死的効果から半数のマウスを防御する抗毒素 応答を誘導するトキソイドの推定量に基づいて実験的に決定される。よって、Ｒ Ｕ値はマウスのＰＤ、。値にほぼ等しい。 本発明ビー・マルトサイダの細胞結合性トキソイド（ビー・マルトサイダの遊離 トキソイドとともに投与してもよく、これと−緒に投与しなくてもよい）が、さ らなる活性成分を含有していてもよい。現在のところ、最も好ましいさらなる活 性成分は、ビー・ブロンキセブテイカ成分、イー・ルンオパンアエ成分およびエ ム・ヒポニューモニアエ成分である。 本発明の目的のためには、イー・ルシオバシアエを後記実施例７記載のごとく調 製する場合、この成分の最小免疫原量は３，４０．Ｕ、である。Ｏ，Ｄ、の読み を６５０ｎｍの波長で行う以外は、不透明の度単位は上記定義と同じである。 本発明の目的のためには、後記実施例８記載のごとく調製したビー・ブロンキセ ブティカの免疫原量を、比濁単位と呼ばれる単位で測定する。不活性化されてい るが免疫性のある形態のこの成分の所要免疫原量は、それを得るための方法に左 右される。例えば、ビー・ブロンキセブティカをベータプロピオラクトン（ＢＰ Ｌ）により不活性化する場合、免疫原性を発揮するためには少なくとも１５００ 比濁単位が必要である。グルタルアルデヒド法により不活性化する場合、少なく とも３０００比濁単位が必要である。ホルムアルデヒドにより不活性化する場合 、少なくとも４５００比濁単位が必要である。他の不活性化方法を用いる場合、 当業者は、他の適当な免疫原量を決定することができる。この成分は本発明ワク チン中に含有されて萎縮性鼻炎に対する防御を行う。 本発明の目的のためには、後記実施例１０記載のごとく調製したエム・ヒポニュ ーモニアエの免疫量を、色変化単位（ＣＣＵ）［ロドウエル（Ｒｏｄｗｅｌｌ） およびホワイトコーム（Ｗｈｉｔｅｃｏｍｂ）　、　ｒメソ・マイコブラズモロ ジ−（Ｍｅｔｈ。 ＭｙｃｏｐｌａｓｍｏｌｏｇＹ）　Ｊ　、第１巻、１８８頁以降にューヨークの アカデミ・ツク・プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　（１９８３年）］ で測定する。好ましくは、本発明ワクチン組成物が、約５Ｘ１０’ＣＣＵを含有 するものとする。しかしながら、条件を最適化してこの量を約５Ｘ１０’まで減 少させることも考えられる。 望ましい投与規則は、所望のワクチン組成物を２度投与することを包含する。 個々のフラクションの抗原量は上述のとおりである。本発明ワクチンの投与方法 は、ワクチンを宿主に送達できるいかなる適当な方法であってもよい。しかしな がら、好ましくは、ワクチンを皮下注射または筋肉注射により投与する。所望な らば、皮内または静脈注射のごとき他の投与方法を用いてもよい。 ブタを用いた現在の研究においては、２週間間隔で２度ワクチンを筋肉的注射す る。これらの研究により、上記ワクチン組成物のそれぞれに関して、新生動物の −次免疫が生後１週間においてうまく開始されることが示されている。ついで離 乳時に追加免疫する。妊娠しているメス豚に対する一次免疫に関しては、２回投 与が推奨され、出産約２週間前に２度目のワクチンを投与する。出産に続いて追 加免疫することが推奨される。オス豚には半年ごとの再ワクチン投与が推奨され る。後記インビトロ動物試験により示されるように、本発明ワクチン組成物によ り誘導されるピー・マルトサイダに対する防御の特異的機構は、ワクチン投与さ れた動物における毒素中和抗体（抗毒素）の誘導である。 本発明細胞結合性トキソイドの調製および本発明新規成分を含有する種々のワク チンの調製および試験のための好ましい方法を実施例により以下に説明する。 これらの実施例は、単に説明的なものであって、本発明の範囲を限定するもので 本組成物の具体例には、トキソイドが細菌細胞内で安定化されているピー・マル トサイダの細胞結合トキソイドが包含される。 ピー・マルトサイダＤ型４６７７株は、イリノイ・アニマル・ディシーズ・ラボ ラトリ−（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙＸイリノイ州ゲイルズバーグ（Ｇａｌｅｓｂｕｒｇ）　）の感染ブタから 単離された（ドグラス・ヘフリング（ＤｏｕｇｌａｓＨｏｅｆｌｉｎｇ）博士） 。該株を寒天上で２回継代培養した。二次継代培養からの細胞を、１０％ＮＺア ミン、１％ゼラチンおよび１０％グリセロールの無菌溶液に懸濁した。該懸濁液 のアンプルを液体窒素中で凍結した。このマスターノードを、スミスクライン・ ビーチャム・アニマル・ヘルス（ＳｍｉｔｈＫ］ｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ　Ａｎ ｉｍａｌＨｅａｌｔｈ）　（イリノイ州ホワイト・ホール（Ｗｈｉｔｅ　１ｌａ ｌｌ）　）で保存する。 ピー・マルトサイダＤ型４６７７株の種および生産培養を、以下の培地中で増殖 させる。デキストロース（ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）　）無しの３０ｇ）リブシン 大豆ブロスおよび脱イオン水（これで１リツトルに調整）、種培養にはｐＨ７， ５、生産培養にはｐＨ７，０゜１２１℃で少なくとも２０分間高圧滅菌すること により培地を滅菌する。高圧滅菌後、５Ｑｍｌの濾過滅菌酵母エキス溶液（１０ ％Ｗ／Ｖ）および４ｍｌの高圧滅菌デキストロース溶液（５０％ｗ　／　ｖ　） を加える。 インキュベーションの間、必要に応じて、さらにデキストロース溶液を加えても よい。 有効な種（上記のとおり得られるマスターシードから継代培養したもの）を解凍 し、その内容物を上記の種培地の容器に移す。該種培養を３７℃で１２〜２４時 間、撹拌しながらインキュベートする。グラム染色による測定で該培養が滴定な ものであれば、生産培養の接種にこれを用いる。あるいは、二次種培養の接種に これを用いてもよい。接種物は培養容量の２〜１０にである。生産培養を３７℃ で２〜６時間インキュベートする。溶解酸素を飽和の約３５％に維持する。温度 は３７℃、ｐＨは必要に応じて１ＯＮＮａＯＨを加えることにより７に維持する 。増殖は、６２５ｎｍの周期的光学濃度（ＯＤ）表示により監視する。 指数的増殖の終了（ＯＤ、□、が約２になる時）近くに、通気を中止し、ホルム アルデヒド溶液を最終濃度０．５％Ｖ／Ｖまで加える。静かにまたは断続的に撹 拌しながら、不活性化を３７℃で４日間継続する。２士１５のＯＤおよび少なく とも６単位／ｍｌのし十値を有する純粋培養（グラム染色により測定した）は、 生産に使用するに十分なものと考えられる。マウスにおける毒素−抗毒素滴定に より示されるとおり、毒素のＬ千単位は、標準抗毒素の１単位と等価である［ロ サンプルを取り、該ザンプルをモルモットに投与することにより不活性化が完全 かどうかを調べる。該培養の４ｍｌ容量を皮下注射した後７日目に、モルモット は生きていて、かつ、健康でなければならない。この時点で、細胞内毒素はトキ ソイドに完全に変化しており、この）・キソイドは、安全であり、大変安定であ り、かつ、動物に注射した場合に中和抗毒素の生産を誘導する能力を有する。 不活性化期の終了時に該培養を冷却し、ついで無菌的に受容器に移す。該培養を 、滅菌連続フロー遠心分離により、細胞画分および液体画分に無菌的に分離する 。百両分を無菌容器に集め、さらに加工する。不活性化時のＯＤに応じて、細胞 画分を算出０Ｄ１２．５まで希釈する。これは、液体画分の一部分および一定容 量の無菌食塩水（０，８５％ＮａＣ１）により行い、最終液体画分が、４０容量 ％培養液体、または１％ｗ／ｖペプトンおよび酵母エキスを含有する液体に懸濁 した細菌細胞を含有するようにする。 該培養の不活性化および濃縮が完了した後、無菌水酸化アルミニウムゲルを最終 濃度が２５％ｖ　／　ｖとなるように加える。該液体の遊離ホルムアルデヒド含 量を定量し、これを亜硫酸水素ナトリウムで０．２％またはそれ未満に減少させ る。 チメロサールーＥＤＴＡ溶液（または他の適当な保存剤）を保存剤として、最終 チメロサール濃度が０．０１％ｗ／ｖとなるように加える。ｐＨを調べ、必要に 応じて、６．５±０．２に調整する。 この生成物を、不活性化時のＯＤから算出した１、８７５吸光度単位を含有する ように標準化する。この標準化された量は、内的に単独で投与する０、２ｍｌ用 量で、または他のワクチン成分と組み合わせて得てもよい。かかる組み合わせワ クチンは、通常、合計投与量が２ｍｌである。 実施例２　ピー・マルトサイダ細胞結合トキソイドの調製また、本発明の細胞結 合トキソイドは、上記実施例１記載の４６７７株以外のピー・マルトサイダ毒素 生産性株から調製してもよい。 例えば、ピー・マルトサイダＤ型８株を用いて、上記方法により細胞結合トキソ イドを調製することができる。しかし、４６７７株に比べてより低度の８株のト キソイド生産能に適合させるためには、幾つかの小さな変更をしなければならな い。 ピー・マルトサイダ、Ｄ型、８株の培養は、以下の培地で増殖させる　デキスト ロース（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）　）無しの３０ｇトリプシン大豆ブロス、酵母 エキス（ディフコ）５ｇ：デキストロース４ｇ；脱イオン水（これで１リツトル に調整）、ｐＨ約７；１２１℃で高圧滅菌する。ついで、該培養を増殖させ、不 活性化し、濃縮し、ＯＤ４．２　（６２５ｎｍの光学濃度、スペクトロニック（ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）　２０分光計中で測定）の懸濁液を作るのに十分な上清 に取り、本質的に上記のとおりにアジュバント化する。 この生成物を、不活性化時のＯＤから算出した３、７５吸光度単位を含有するよ うに標準化する。この標準化された量は、単独で投与することも、また他のワク チン成分と組み合わせて投与することもできる。典型的には、かかる組み合わせ ワクチンは、通常、約２ｍｌの用量を有する。 ピー・マルトサイダＤ型（８型）［ロス・コワート（Ｒｏｓｓ　Ｃｏｖａｒｔ） 博士、イリされた合成培地中で１日継代培養する。該集合培地のｐＨを無菌Ｎａ ＯＨで７．３±１２に調整する。この培養からの細胞を新鮮な合成培地に移し、 増殖したら、この培養を凍結保存物と合わせ、−７０℃で保存する。接種後、生 産培養を増殖させて、約３６″±１℃、３〜２４時間のインキュベーション中に 収穫する。無菌空気を通気し、かつ、撹拌することにより、該培養の溶解酸素含 量を維持する。 無菌消泡溶液を用いて、泡を制御する。該培養のｐＨを７３±０．２に維持する 。 増殖周期の終了時に、ピー・マルトサイダ培養を調べ、６５０ｎｍの吸光度で細 胞密度を測定する。ついで、撹拌を弱め、通気およびｐＨ制御を中止する。 該溶菌液の毒素含量を、マウス致死率（ＬＤ、。）により、また、以下の実施例 ６に記載のとおり、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳ＾）により測定 する。 Ｂ　前解毒処理 該生物の増殖後、０．０１％重量／容量未満またはこれと等しい量の無菌メルチ オラートを該培養に加える。培養液は、閉鎖連結を通して無菌閉鎖容器に無菌的 に移してもよい。物理的に溶菌し細胞内容物を遊離するのに使用する装置、例え ば「ガラリン（ＧＡＵＬＩＮ）　Ｊモデル１５Ｍラボラトリ−・ホモジナイザー に、該容器を閉鎖器具により連結する。 該ホモジナイザーの圧力室内を連続的に通過させることにより、培養液中の細菌 細胞を溶菌する。これにより、細胞は、最初の圧力である約２０００〜約５００ ０ｐｓ　ｉから外界圧力である１５ｐｓｉへ直ちに圧力が低下する。溶菌細胞を 無菌的に他の閉鎖容器に入れる。 遠心分離および／または細孔濾過の連続１稈により該溶解産物を清澄化する。 濾過滅菌の前または後に清澄化溶液を濃縮してもよい。濃縮および濾過滅菌の前 に、最終濃度５ｍＭ以下の量のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および最終 濃度１．０％（容量／容量）以下の量のグリセロールを加えて、濃縮タンパク質 の凝集を防ぐ。 Ｃ１解毒 無菌５Ｎ　ＮａＯＨを無菌毒素にゆっくり、無菌的に加えて、ｐＨを約１０．５ ５±０．１０ｐＨ単位に上昇させる。該混合物を約１５±１℃で少なくとも７時 間、ゆっくり撹拌すると、このｐＨにて解毒が起こる。ついで、無菌５ＮＨＣ１ をゆっくり、無菌的に加えて、ｐＨを６．８０±０．２０ｐＨ単位に調整する。 アリコートを取るのに十分な間、ｐＨをこのより低い値で維持する。各アリコー トの残留毒性を測定し、ｍ１当たりのマウスＬ　Ｄ　ｓ　ｏで表す。 ついで、上記のとおり、該混合物をｐＨ約１０．５５±０．１０ｐＨ単位に再調 整し、７時間維持する。この時間の終了時、アリコートを取るのに十分な時間、 該混合物を再びｐＨ約６，８０±０．２０ｐＨ単位に調整する。ついで、該混合 物をもう一度これらの工程中を循環させる。 通常、このｐＨ循環工程の開始の２１時間後に、定量可能な抗原含量をあきらか に減少させることなく、約１０．０００ＬＤｓｏ／ｍＩの初期値を有する調製物 を解毒する。ついで、他の成分と合わせてワクチン組成物にするまで、該トキソ イドを２６〜７℃で保存する。 実施例４　遊離トキソイドを含有するワクチンの処方上記実施例３に記載の可溶 遊離トキソイドを調製することにより、例示的な遊離トキソイドワクチンを処方 した。 ワクチンを製造するために、中性ｐＨの無菌緩衝食塩水中に該トキソイドを希釈 する。無菌水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして用い、トキソイドを吸 着させるのに十分な量、一般には１２％±１％（容量／容量）加える。完全に混 合し、ついで指示量のトキソイドおよび水酸化アルミニウムゲルを５００ｍ１ビ ーカーに取ることにより、ワクチン組成物を調製する。ついで無菌食塩水を加え る。この混合物を撹拌し、４°Ｃで保存する。２ｍｌ／投与の投与量が好ましく 、これは約４５０相対投与単位／投与を与える。表■は２種類の遊離トキソイド ワクチンの組成を示す。 表１ 実験ロット　成分　合計容量 Ａ　トキソイド濃縮物　１．５０．０ｍｌ水酸化アルミニウムゲル　３６．　Ｏ ｍ　ｌ無菌食塩水　１１４．０ｍ１ 合計　３００．０ｍ　ｌ Ｂ　トキソイド濃縮物　２３５．０ｍ　ｌ水酸化アルミニウムゲル　４１．Ｏｍ ｌ無菌食塩水　３０４．０ｍ１ 合計　５８０．０ｍｌ これらの遊離トキソイドワクチン製剤は、ピー・マルトサイダ感染により起こる ブタの萎縮性鼻炎の予防の一助として有用である。遊離トキソイドワクチンの典 型的な試験は、下記のとおり、該製剤をブタ（子ブタおよび親ブタ）に注射する ことにより行う。 実施例５　遊離トキソイドワクチンを用いた実験実施例４の製剤を用いて、以下 の方法に従い、任意に選んだ子ブタおよび親ブタにワクチンを筋肉的投与する。 それぞれの試験においては、ワクチン投与後、ブタの萎縮性鼻炎の臨床的兆候を 不変的に誘導することが知られている用量にて、該動物を精製トキノンで攻撃す る。マウスにおいて、攻撃の前および後で、ＤＮＴの毒性を評価した。各ブタに 投与した１−キシンの合計用量は８．４μｇ１すなわち５０マウスＬＤ、。であ った。３個の等しい用量にて、ワクチン投与の約２週間後から３日間にわたり毒 素を投与した。 最初の毒素投与から約２８日後に攻撃の結果を評価した。攻撃の２８日後の増加 ポンド数を攻撃時の重量（ポンド）で割ることにより、重量％増加を算出した。 篤−小臼歯における鼻の断面により、鼻甲介萎縮を以下のとおり評価した：得点 ０、正常：得点１、最小萎縮：得点２、中低度の萎縮、得点３、実質的な萎縮： 得点４、はぼ完全な萎縮；および得点５、完全な萎縮。 プロトコール■：上記実施例４に記載のピー・マルトサイダ遊離トキソイド（Ａ ）の２ｍｌ用量を、４頭の苦難ブタ（ｇｉｌｔ）にワクチン投与した。２頭の苦 難ブタは、ブタパルボウイルスに感染していたため分娩しなかった。疾病が明ら かになると直ちにこれらを施設から出した。残りの２頭の苦難ブタから生まれた 子ブタ（ｐｉｇ）に、１３日齢（苦難ブタ６３７．７頭の子ブタ）および９日齢 （苦難ブタ６３８．４頭の子ブタ）で、実施例４に記載のピー・マルトサイダ遊 離トキソイド（Ｂ）の２ｍｌ用量をワクチン投与した。２週間後にすべての子ブ タに二次ワクチン投与を行った。二次ワクチン投与の２週間後に、一定用量の毒 素で子ブタを攻撃した。ワクチン投与された苦難ブタと同様の分娩日を有する同 一群からの苦難ブタは、同時期のワクチン投与していない対照の子ブタを与えた 。 攻撃後、層殺して最終得点を出すまで、ワクチン投与した対照の子ブタおよびワ クチン投与していない対照の子ブタを混ぜ合わせた。表ＩＩは、ワクチンＡを２ 度投与した親ブタから生まれ、それ自体遊離トキソイドワクチンＢを２度ワクヂ ン投与（ｖｘ）　１．た子ブタに対する、ワクチン投与していない（ＮｏｎＶＸ ）ブタと比較した場合の、攻撃の効果を示す。これらの結果は、ワクチン投与群 における有意により低い鼻得点および有意により優れた重量増加を示す。 表ＩＩ 攻撃時　屠殺時　重量増加　重量増加　平均鼻群　番号　重量　重量　（ポンド ）　％　得点ＶＸ　１０　２６．２０　３９．６０　１３．４０　５４．２７　 ］、、０ＯＮｏｎ−ＶＸ　８　２２．８８　３１．５６　８．６９　３５．３０ 　２゜３４プロトコールＩＩ・４頭の苦難ブタに２ｍｌ用量のワクチン八をワク チン投与した。１頭の苦難ブタは、ブタバルホウイルスに感染していたため分娩 しなかった。 疾病が明白になると直ちにこれを施設から出した。残りの苦難ブタからの子ブタ を、以下のとおり、毒素で攻撃した：１頭の苦難ブタからの９頭の子ブタ（１０ 日齢）：第２の苦難ブタからの２頭の子ブタ（１２日齢）；および第３の苦難ブ タからの６頭の子ブタ（４日齢）。ワクチン投与された苦難ブタと同様の分娩日 を有する同一群からの苦難ブタは、同時期のワクチン投与をしていない対照の子 ブタを与えた。 ワクチン投与した対照の子ブタおよびワクチン投与していない対照の子ブタを、 離乳前に攻撃し、ついで、層殺して最終得点を出すまで混ぜ合わせた。ワクチン Ａを２度投与した親ブタから生まれた子ブタに対する、攻撃の効果を表ＩＩＩに 要約する。データは、（ａ）同腹ブタから独立して、および（ｂ）同腹ブタの平 均により与える。 これらの結果は、ワクチン投与群における、有意により低い鼻得点および有意に より優れた重量増加を示す。これらの観察は、親ブタに対するワクチンＡの２度 の投与が抗毒素（これは、これがなければ感染しゃすい子ブタに受身伝達された ものである）の生産を誘導したことを示す。さらに、受身防御の持続は少なくと も１０〜１２日であった。 表ＩＩＩ （ａ） 攻撃時　屠殺時　重量増加　重量増加　平均鼻群　番号　重量　重量　（ポンド ）　％　得点ＶＸ　１５　６．８７　２１．００　１４．１３２０５．８３　３ ．０２ＮｏｎＪＸ　５　８．２０　１６．４０　ｇ、２０　１００．００　３． ７０（ｂ） Ｖｘ 苦難ブタ ６２９　７　８．７１　２１．５０　１２．７９１４７．０９　３．６ｇ若苦難 タ ６３９　２　ｇ、００　２９．２５　２１．２５２６８．６５　２Ｊ８若雌ブタ ６３３　６　４．３３　１７．６７　１３．３３３１０．２８　２．４６若雌ブ タ 平均　６７．０２　２２．８１　１５．７９　２４２．０１　２．８４ＮｏｎＪ Ｘ　５　８．２０　１．６，４０　８．２０　１００．００　３．７０実施例５ の実験からの子ブタの血清および初乳サンプルを、速度論的ＥＬＩＳＡにより、 毒素に対する抗体について試験した。簡単に言えば、０．１Ｍホウ酸ナトリウム （ｐＨ９，１）中の精製毒素（２５０ｎｇ／ウェル）を、４℃で一夜、平底９６ ウエルのヌンク（Ｎｕｎｃ）マイクロタイター・プレートに吸着させた。ついで 、３７℃で３０分間、０．０５％ツイーン−２０（ブロッキング用緩衝液）含有 ＰＢＳ中の１０％乾燥脱脂乳でブロッキングした。ブロッキング用緩衝液を、Ｐ ＢＳｌｏ、０５％ツイーン−２０（ＰＢＳ／ツイーン）で２回、プレートからす すぎ、ついでＰＢＳですすいだ。血清をブロッング緩衝液中、１　：　１００に 希釈し、４個のウェルのそれぞれに５０μｌのサンプルを加えた。３７℃で６０ 分間、プレートをインキュベートし、ついで上記と同様にしてすすいだ。 ヤギ抗ブタＩｇＧ（重鎮および軽鎖特異的）−西洋わさびペルオキシダーゼ（キ ルケガード・アンド・ぺり−・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ 　ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ガイザースバーグ（Ｇ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）　）をブロッキング用緩衝液中、１：５００に希釈し 、各ウェルに加えた（５０μｌ）。３７℃で６０分間インキュベート後、プレー トを上記のとおりすすいだ。ＡＢＴＳ基質（２，２’−アキシノージー３−エチ ルベンゾチアゾリンスルホナート）（キルケガード・アンド・ぺり−（Ｋｉｒｋ ｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ）を加え、４０５ｎｍにてブイマックス（Ｖ ｍａｘ）　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ・リーダー［モレキュラー・デバイシーズ・コー ポレーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ）　、カリフォルニア州バｏ−アルド（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）　］で直ちにプレ ートを読み取った。１分間隔で各ウェルを８回読み取り、酵素反応の速度を算出 した。 速度は、分当たりの光学濃度（ｍＯＤ）のミリ単位の変化として算出した。した がって、分当たりの１００ｍ０Ｄの読み取りは、１０分間の○Ｄ１．０と等しく なる。ついで、用いた血清のウェル当たりの量についての値に補正し、ｍｏＤＺ 分／ｍ＋血清として示した。例えば、５０μｍの血清が１００ｍ０Ｄ／分を示す 場合は、示された値は２．０００ｍ０Ｄ単位／分／ｍｌとなる。 各ＥＬＩ　ＳＡプレート上に以下の対照を含ませる。（１）血清対照：それぞれ の希釈された子ブタ血清を、抗原を含有しないウェルに入れ、ついで後のすべて の試薬にさらして、該プレートに対する非特異的吸着を調べた。用いた子ブタ血 清（１：　１００）の希釈の際、陰性の血清対照で得られる色より強い色は見ら れなかった。（２）陰性子ブタ血清・各プレートは、ブロッキング用緩衝液中で １１００に希釈された公知の陰性子ブタ血清の３個のウェルを含んでいた。（３ ）陽性子ブタ血清対照　毒素に特異的な抗体を含有する血清を陰性子ブタ血清中 で希釈して、高濃度、中程度濃度および低濃度の特異的抗体を含有する血清を得 た。 これらの３個の血清を、ブロッキング緩衝液中で１：１００に希釈し、各プレー トに三重に入れた。子ブタ血清以外のすべての試薬を含有するウェル中で、バッ クグランド、すなわち非特異的反応性を測定した。 プロトコールＩＩ（実施例６）により、それぞれトキソイドワクチンＡおよびＢ をワクチン投与した親ブタおよび子ブタのＥＬＩ　ＳＡ力価を、以下の表ＩＶに 要約する。この表は、ワクチン投与していない対照（Ｎｏｎ−Ｖｘ）と比較した 場合の、−次および二次の親ブタワクチン投与の前に取った血清の幾何平均力価 、初乳の幾何平均力価、および−次および二次の子ブタワクチン投与、攻撃およ び屠殺前に取った血清の幾何平均力価を与える。 −次親ブ　ニ次親ブ　−次子ブ　ニ次子ブ群　タ　ＶＸ　タ　ＶＸ　初乳　夕　 ＶＸ　夕　ＶＸ　攻撃　屠殺１’Ｘ　２１．７１　０　１７３．００　０．９９ 　１．７３　１０９．０３　１３９．０７Ｎｏｎ２５．３５　１２．３４　８３ ．３８　１．４５　１．７２　．３８　８．６４Ｘ これらの結果が示すところによると、親ブタへのワクチンへの２度の投与、その 後のそわらの子ブタへのワクチンＢの２度の投与が、そうしなければ感染しやす い子ブタにおける毒素に対する免疫を誘導した。 同じ研究（プロトコールＩＩ、実施例６）から、ワクチン投与した（ワクチンＡ ）、まｔＪワクチ゛／投与していない親ブタおよびワクチン投与していないそれ らの子ブタのＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ力価を表■に要約する。 表Ｖ 幾何平均ＥＬＩＳＡ力価 一次親ブ　ニ次親ブ ー次親ブ　ニ次親ブ された 苦難ブタ６２９　２１．８０　５．８０　７０．６０　１．６６　２９．１５若 雌ブタ６３９　２９．２０　−　１８．６０　２６．０？　２５．３９されてい ない 苦難ブタ６３６　２３．４０　１０．８０　６６．８０　−　１２．４０若雌ブ タ６３１　３０．６０　１１．９０　１３５．９０　−　０．２０若雌ブタ６２ ６　１９．８０　１７．６０　７６．７０　−　９．４０若雌ブタ６３５　４０ ．６０　２０．４０　一種々の用量（相対トキソイド単位、ＲＵで示す）の遊離 トキ゛ノイド製剤書二よりワクチン投与した親ブタおよび子ブタについての免疫 攻撃の研究を、表ＶＩＩ：要毎すする。 表ＶＩ 投与ＲＵ　有意の　鼻甲介萎縮 親ブタ　子ブタ　番号　重量減少　に対する防御８７６ｔｈ３２　３０７±７０ １０　有り　有り８７６±３２　０　１５　有り　有り ３９１土５２　０　１．０　無し　無し０３９１±５２　９　無し　無し データは、８７６±３２ＲＵの遊離トキソイドを含有するワクチンにより２度ワ クチン投与した親ブタから生まれた子ブタの有意の防御を示す。子ブタまたは妊 娠中の苦難ブタにおいては、３００〜４００ＲＵ／用量を含有する実験ロットの ２度の投与は、防御の誘導を示さなかった。 実施例７−イー・ルジオバチェ（Ｅ、　ＲＨＵＳＩＯＰＡＴＨＩＡＥ）ワクチン 成分の調製エリジペロスリックス・ルジオパチェ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉ ｘ　ｒｈｕｓｉｐａｔｈｉａｅ）は、単独もしくは、好ましくは、前記のビー・ マルトザイダ（Ｐ、　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）成分と組合わせてワクチン組成物に 使用するために調製する。該イー・ルジオパチェ（Ｅ、　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈ ｉａｅ）成分は、全てのイー・ルジオバチェ（旦ｌ捜旦卵蛙旦些）血清型に共通 な最も豊富な免疫原収量の血清型２由来が好ましい〔アール・エル、ウッド（Ｒ ，Ｌ、Ｗｏｏｄ）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ベタリナリー・メディカル ・アソノエーション（Ｊ、ＡｍｅｒｖｅｔＪ４ｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、）、工８４： ９４４−９４８頁（１９８４）］。現在、好ましい菌株は、ＣＮ３３４２［スミ スクライン・ビーチャム社（Ｓ＋＋１ｔｈＫ１ｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）コであ る。 Ａ、細胞カルチャー 以下のカルチャー培地は、エリジベロスリックス・カルチャーに通常用いられる ２つの成分である血清およびつ／胆汁のような、粗有機物質フリーである。これ は、有害な反応の頻度および症状の重度を減じる効果を有する。また、細菌細胞 を除去するための遠心分離の段階も、有害な反応の数および強度を減じるのに一 助をなし、通常の免疫原は上清の流体に存在する。 イー・ルジオバチェ（Ｅ、　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）を、脱イオン水中の 、［ディフコ社（Ｄｉｆｃｏ）製もしくはそれ相当の１２．０−３．０％のプロ テアーゼ・ベプ［・ン、［ディフコ社（Ｄｉｆｃｏ）製もしくはそれ相当のコ０ ．２５−０．７５％の酵母エキス、０．１−〇　３％のトウィーン−８０（Ｔｗ ｅｅｎ−８０）［ポリオキシエチレンーソルビタンモノオレエ−１・］、１．０ −２．０％のに２ＨＰＯ４がら成るシード培地中で培養する。 １ＯＮ　ＮａＯＨで、ｐＨを約７．０＋０．２１ニ−ｍ整する。該培地を、１２ １℃で３０分間のオートクレーブにより滅菌する。オートクレーブ処理の後、無 菌の５０％デキストロース溶液を添加して最終濃度］、、Ｏ−２，０％ｖ／ｖと する。 当業者であれば、前記のカルチャー培地の成分および各々の用いる量を変更する ことができるであろう。例えば、前記の培地で、プロテアーゼ・ペプトン以外の タンパク質分解物を用いてもよいし、トウィーン８０は、例えばトウィーン８５ のような他の可溶性化合物で置き代えてもよいし：あるいは、成長因子を補充し たり、または酵母エキスを例えばエルミツトに置き代えてもよい。種菌（ｖｏｒ ｋｉｎｇｓｅｅｄ）のアンプルを融解し、その内容物を種培地の容器に移す。該 種カルチャーを、攪撹しながら３７°Ｃで１２ないし２４時間インキュベートす る。グラム染色したスライドの顕微鏡検査が満足のいくカルチャーであることを 示したら、該カルチャーを製造カルチャー（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｃｕｌｔｕ ｒｅ）の接種に用いる。別法として、次に製造カルチャーの接種に用いる第２の 種カルチャーの接種にそれを用いてもよい。接種源は、カルチャー容積の２ない し１０％である。 製造カルチャーを、攪撹しながら、３０−３９℃で、平均５ないし８時間インキ ュベートする。無菌のＩＯＮ水酸化ナトリウム溶液を、インキュベートの間を通 して該カルチャーに添加し、ｐＨを７．０−７．６に維持する。必要に応じて、 無菌の５０％デキストロース溶液を添加してもよい。最大○Ｄに達したら（静止 期）、以下に記載するように、不活化剤を該カルチャーに添加する。別法として 、不活化は、さらに早期の増殖の対数期もしくは移行期の間に行ってもよい。 Ｂ　細菌の不活化 不活化は、以下のように行う。イー・ルジオバチェ（Ｅ　、　ｒｈｕｓｉｏｐａ ｔｈｉａｅ）の試料をカルチャーから採取し、グラム染色する。もし、これが純 粋カルチャーと判明したら、十分量のホルムアルデヒド溶液を、最終濃度０．５ 容積％になるよう添加する。該カルチャーを無菌槽に移し、一定に攪撹しながら ３７°Ｃの恒温槽に２４時間装＜（ホルムアルデヒド濃度は、減少もしくは増加 させてもよい；しかじ、インキュベート時間は、満足するよう調整しな（ブれば ならない）。不活化は、９　ＣＦＲ書１１３．２６に準じるバルク増殖不能試験 （ｂｕｌｋ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ　ｔｅｓｔ）Ｉ：：よって測定する。該生成物 は、さらなる処理の準備まで４−１０℃で保存する。 Ｃ，ワクチン流体の調製 不活化の後、該カルチャーを凛却し、無菌的に据え付は容器に移す。次いで、該 カルチャーを連続フロー遠心分離機（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｆｌｏｗ　ｃｅｎ ｔｒｊｆｕｇｅ）に通して無菌清澄化する。清澄化の後、流体画分を限界濾過に より計算ＯＤ値コロ　６７まで濃縮する。得られたものは、無菌の免疫原性流体 である。 この濃度の度合、すなわち、０Ｄ１６．６７まで濃縮して得られた度合は、（水 酸化アルミニウムゲルを最終濃度２５％で添加した後に）混合物領３ｍｌ中に３ ．７５不透明ユニツト（ｏｐａｃｉｔｙ　ｕｎｉｔ）（１不透明ユニツトは、１ ｍｌ中にＯＤｌを含有する）の抗原用量を含有することになる。この０．３ｍｌ は、全用量２ｍＬの混合ワクチンに用いるイー・ルジオバチェ（Ｅ、　ｒｈｕｓ ｉｏｐａｔｈｉａｅ）容量である。 実施例８−ビー・ブロンキセブチ力（Ｂ、　ＢＲＯＮＣＩ’１ＩＳＥＰＴＩＣ＾ ）ワクチン成分の調製より、本明細書に記載した他の有効成分と組合わせてワク チン組成物に使用するのに調製する。該ビー・ブロンキセブチ力（Ｂ、ｂｒｏｎ ｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）種菌（謔、萎縮性鼻炎にかかったブタ由来のものが好ま しい。現在、好ましい菌株は、２−９　ＮＡＤＣ株［ナショナル・アニマル・デ ィシーズ・でンター（ＮａｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｅｎ ｔｅｒ）、エームズ、アイオワ州（ＡＩｌｌｅｓ、　Ｉ　ｏｖａ）］である。し かし、１４４株スミスクライン・ビーチャム社（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅ ｃｈａｍ）］を用いてもよい。 Ａ、細胞カルチャーおよび製造 ボルデテラ・ブロンキセブチ力（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐ ｔｉｃａ）の増殖に用いるカルチャー培地は、修飾スタイナーースコルト合成最 小培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｓ　ｔａｉｎｅｒ−８ｃｈｏＬｔｅ　ｄｅｆｉｎｅ ｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）である。１リツトル の合成基培地２．４ｇのＬ−プロリン、領６７ｇのＬ−グルタミン酸、２．５ｇ のＮａＣｌ。 ０．５ｇのＫＨ２ＰＯ４，０，２ｇのＫＣＩ、６．０７５ｇのトリツマ・ベース （Ｔｒｉｚ＋ｏａｂａｓｅ）　Ｃシッフ社（Ｓ　ｉｇｍａ）　＃　Ｔ　１５０３ ］を調製するために以下の操作を用いる。これらの成分を、１０１００Ｏの蒸留 水または脱イオン水に撹拌しながら順次溶解する。ＨＣＩでｐＨを７．０＋０． ２ユニツトに調整し、該培地をオートクレーブ処理によって滅菌する。 ３つのＩＯＸストック溶液の各々の１．００ｍＬを以下のように調製する。Ｌ− ７ステイン溶液は、０．４ｇのＬ−７ステインを４ｍＬの４ＮＨＣ１に溶解し、 次いで蒸留水または脱イオン水で１００ｍＬの容量にして調製する。硫酸鉄（Ｉ ［）、塩化カルシウム、塩化マグネシウム溶液は、０．１２５ｇの硫酸鉄（ＩＩ ）七水和物、０．３ｇの塩化カルシウムニ水和物、および１．０ｇの塩化マグネ シウム六水和物を１００ｍＬの蒸留水または脱イオン水に溶解して調製する。こ れらの成分は、次の成分を添加する前に撹拌しながら各々順次に溶解する。アス コルビン酸、ニコチンアミド、酢酸ナトリウム溶液は、１．００ｍＬの蒸留水ま たは脱イオン本当たり０．２ｇのアスコルビン酸、０．１０ｇのニコチンアミド 、および２．０ｇの酢酸ナトリウムを溶解して調製する。 次いで、これらの三溶液を濾過滅菌し、Ｌ−システィンおよびビタミン溶液は、 ２６ないし７℃で保存する。これらのストック溶液を、前記の最少塩溶液に１を 当たり１０ｍＬの容量添加してカルチャー培地を調製する。 復元した凍結乾燥マスター種菌（ｍａｓｔｅｒ　５ｅｅｄ）または解凍した種菌 の１ないし５％の懸濁液を、前記のカルチャー培地を含有するフラスコに接種す る。該カルチャーを、給気しながら３６℃±１℃で１６ないし３０時間インキュ ベートする。 十分に増殖させた後、このカルチャー培地を、新しい培地を含有するシーディン グ・フラスコ（ｓｅｅｄｉｎｇ　ｆｌａｓｋ）に、１ないし５％の接種源を用い て移す。この第二のサブカルチャーを前記のようにインキュベートする。製造カ ルチャー（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ）を、第二の活発に増殖する サブカルチャーで１ないし５％の接種源を用いて接種する。 ビー・ブロンキセブチカ（Ｂ、　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）の製造カルチ ャーは、発酵槽で増殖させる。該カルチャーを、３６℃±１℃で接種後１６ない し４０時間インキュベートする。溶存酸素の設定値は、最大平衡（飽和）の８０ ％に設定する。溶存酸素の設定値は、４０％に設定するのが好ましい。これは、 迅速であり、よって６ないし１６時間の間の短時間インキュベート期間とするこ とができる。 溶存酸素含量は、無菌の空気の給気および撹拌により維持する。該培地を接種す る前に、無菌の消泡溶液を添加する。該カルチャーのｐＨを、プロピオン酸を添 加することにより７．２−７．４に維持する。 Ｂ、流体の不活化および調製 以下に記載のように、ベータープロピオラクトン（Ｂ　Ｐ　Ｌ）またはホルムア ルデヒドいずれかを、カルチャーの不活化に用いることができる。ＢＰＬを用い る場合、それを増殖期の終わりにカルチャーに添加する。第二のさらなるＢＰＬ の添加は、２ないし１８時間経つてから行う。ＢＰＬの最終濃度は、１：５００ （０，２％）を超えるべきではない。該カルチャーを、一定に撹拌しながら、２ ０℃未満で少なくとも１２時間インキュベートする。別法として、増殖期の終わ りに、ホルマリン（ホルムアルデヒド溶液ＵＳＰ）を、全容量の最終濃度０．４ ％で該カルチャーに添加する。該カルチャーを、一定に撹拌しながら、３５°な いし３７℃で少なくとも２４時間インキュベートする。 不活化させた後、代表的な試料を採取し、３プレートの各々に０．５ｍＬの接種 源を用いたトリブチカーゼ・ソイ寒天プレート（ｔｒｙｐｔｉｅａｓｅ　ｓａｙ 　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ）上の直接プレートカウント（ｄｉｒｅｃｔ　ｐｌａｔ ｅ　ｃｏｕｎｔ）によって不活化の完了を試験する。バルク試料を、３７°Ｃの チオグリコール酸および２２℃のトリプシン処理ソイブロス（ｔｒｉｐｔｉｃ　 ｓａｙ　ｂｒｏｔｈ）中で増殖不能を試験する。不活化カルチャーは、無菌の保 存容器に移し、集めるまで２℃ないし７℃で保存してもよい。 無菌の水酸化アルミニウムゲル（２％Ａｌｔｏ３等量）を、５％容量／容量の濃 度で該不活化カルチャーに添加して、遊離の内毒素を制御する。吸着した全カル チ＋　−（ｗｈｏｌｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ）が得られる。 Ｃ流体調製の別法 好ましい一利法として、ＢＰＩ、で該カルチャーを不活化するよりもむしろ、ブ ラウン（Ｂ　ｒｏｖｎ　）らの米国特許第４．８８８，１６９号に記載のグルタ ルアルデヒド法により、ワクチンに使用する該カルチャーを調製することができ る。この方法は、グルタルアルヒトを該カルチャー培地に添加することにより該 カルチャーを不活化することを包含する。ビー・ブロンキセブチ力（Ｂ、　ｂｒ ｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ｍ体を、グルタルアルデヒド濃度を０．２ないし０ ．２５％Ｖ／Ｖに増量し、３７℃で約２４時間インキュベートして調整する。 グルクルアルデヒドは、内毒素に結合するように作用し、該カルチャーが前記の 水酸化アルミニウムに吸着する必要性をなくする。 Ｄ　抗原濃度の標準化 ＢＰＬで不活化する場合には用量当たり１５００比濁ユニツト（ｎｅｐｈｅＬｏ ＋ａｅｔｒｉｃυｎ１ｔ）以上をニゲルタルアルデヒド法で不活化する場合には ３０００比濁ユニ・ット以上を；ホルムアルデヒドで不活化する場合には用量当 たり４０００比濁ユニツト以上を含有するようにビー・ブロンキセブチ力（Ｂ　 、　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）を標準化する。該比濁ユニットは、収穫時 の測定値に基づく。 この成分を数種の他の抗原成分を含有する（２ｍＬ用量を有する）ワクチン組成 物に用いる場合、それは２ｍＬのワクチン用量の約０．２ないし１．ＯｍＬを構 成する。 実施例９−混合ワクチン 混合ワクチンは、他の不活化微生物、例えば、ビー・ブロンキセブチカ（Ｂ、ｂ ｒｏｎｃｈｊｓｅｐｔｉｃａ）、ビー・マルトサイダ（Ｐ、　ｍｕｌｔｏｃｉｄ ａ）の他の株、エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ）のような随意の成分と一緒に、実施例１または２の細胞結合トキソイドおよび ／または実施例３の可溶性トキソイドを含有してもよい。 一つの具体的な効果的なワクチン組成物は、前記したビー・マルトサイダＣＰ、 ｍυ１ｔｏｃｉｄａ）Ｄ型の遊離トキソイドおよび細胞結合トキソイドを、実施 例８に記載のビー・ブロンキセブチがＢ　、　ｂｒｏｎｃｈｊｓｅｐｔｉｃａ） 成分と共に含有する。 混合ワクチンの一つの具体的な処方は、以下の成分から構成されている。 成　分　容量／用量（ｍｌ）　容量（ｍｌ）Ｐ、ｍ細胞結合トキソイド　０．２ ００　２５．００遊離トキソイド（６５０Ｕ／ｍｌ）　’　０．２４２　３０． ２５Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ　Ｏ，３００３７，５０オイルルンチン 　０．１００　１２．５０トウイーン　８０　０．　Ｏ５６７，００スパン８０ 　０．０２４　３．００ 失星」」江−１−更り影−−−−−−二しトＬユｌ全量　２．０００　２５０． ００ 乳化では、これらの成分を、単一バッチとして合わせ、２分間乳化した。製造規 模では、バッチ配合よりもライン内で計量することが好ましいのは予想される。 他の成分を、前記の特別処方に、添加しても、あるいは存在する成分に置き代え てもよい。オイル／レクチンに加え、細胞結合トキソイドが吸着された水酸化ア ルミニウムゲルもアジュバントとして供する。各画分の一つまたはそれ以上の完 全または部分バルクロット（ｐａｒｔｉａｌ　ｂｕｌｋ　１ｏｔ）を、アジュバ ントおよび希釈生理食塩水と合わせ、標準的な抗原濃度にする。 実施例１０−エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｆｌＹＯＰＮＥｔｌｌｉＯＮＩ ＡＥ）ワクチン成分マイコプラズマ・ヒユーニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ ａ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチン成分は、本発明の混合ワクチンにお いて、ブタにおけるマイコプラズマ性肺炎の予防に有用である。現在、不活化生 物の望ましい免疫原量は、約１０９変色ユニット（ｃｏｌｏｒ　ｃｈａｎｇｉｎ ｇ　ｕｎｉｔＸＣＣＵ）である。しかし、この用量を最高の条件下で約５Ｘ１０ ”ないし５Ｘ１０’ＣＣＵに減少してもよいことが予想される。通常、必要な用 量を得るには約０．１ないし０．３ｍＬを要する。 典型的には、エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ） 成分を含有する混合ワクチンの調製では、このカルチャーを単に液体バルクワク チン処方に添加する。 Ａ、エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の増殖お よびカルチャーエム・ヒューニューモ、＝ｘ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅ＋ｍｏｎｉａ ｅ）　Ｐ　−５７２２−３株は、パデュー大学のチャールズ・アームストロング 博士から親切にも提供して頂いたものであり、受託番号５５０５２でアメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクシジンに寄託している。この菌株は、マンノース 陽性、アルギニン陰性、およびウレアーゼ陰性という免疫学的および生化学的な 特性を有する。該菌株は、抗−エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅ ｕｍｏｎｉａｅ）抗血清による増殖阻害に陽性で、抗−肺炎菌フルオレセイン結 合抗体による直接蛍光抗体試験により陽性である。この菌株は、以下のように増 殖させた。 以下の操作によりカルチャー培地を調製した。ブロスを陰イオン交換樹脂はンバ ーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）ＩＲＡ４００−塩素 型］で、毎１０４のブロスに対して５００ｇの樹脂の比率にて１ないし４時間処 理することにより、クリスタルバイオレット［ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉ ｆｃ。 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト、ミシガン州（Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ ｉｃｈｉｇａｎ）］を含有しない８３％ＰＰＬ○ブロスをＩＪＲｖシた。 酵母エキスは、５００ｇの活性酵母顆粒（ａｃｔｊｖｅ　ｙｅａｓｔ　ｇｒａｎ ｕｌｅ）を３１の脱イオン水に添加し、室温で撹拌して調製した。完全に混合さ せた後、該懸濁液に１６．２ｍｌのＩＯＮ　ＮａＯＨを滴下添加し、その後さら に１５−４５分間撹拌した。次いで、スラリーを１２１℃で１．５−４５分間オ ートクレーブ処理した。 上清を容器にデカントシ、遠心分離または精密濾過の一方で清澄化した。清澄化 した上清に、ｌＮＨＣｌを１００ｍ１のエキス当たり２ｍｌの比率で添加した。 該エキスを室温で少なくとも１５分間撹拌し、次いで、前記のごとく清澄化した 。 清澄化したエキスを、前記のオートクレーブ処理または精密濾過により滅菌した 。 前処理したブロスに、以下の培地成分：ｏ、ｏｉ％の酢酸タリウム；０．００５ ％のアンピンリン＋０．０１２５％の塩酸システィン；６．２５％の酵母エキス 、１％のデキストロース、１０％のブタ血清（ジブコ社（Ｇｉｂｃｏ））熱不活 化物；および所望により、０．００２６％のフェノール・レッドを添加した。カ ルチャー培地のｐＨを、ｐＨ７，５±０２に調整し、濾過滅菌した。 連続製造を開始するために、凍結エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ）マスター種菌を解凍し、５−２０％の懸濁液を１．００００ −３Ｏ００の前記のカルチャー培地に接種した。該カルチャーを３０℃ないし３ ９℃で３６ないし１６８時間インキュベートした。十分に増殖させた後、該カル チャーを、５−２０％の接種源を用いて新しい培地の入ったンーディング容器に 移した。このカルチャーを、３７℃±１℃で３６ないし９６時間インキュベート した。 エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の製造カルチ ャーは、発酵槽で増殖させ、接種後に３７℃±１℃で３６ないし９６時間インキ ュベートする。カルチャーの溶存酸素含量は、無菌の空気の給気および撹拌によ り２０−４０％に維持する。無菌の消泡剤を用いて、泡を制御してもよい。 増殖期の終わりに、該カルチャーのｐＨは、７６±０．２に上昇し、そのｐＨは 約１時間この範囲に維持される。該生物を不活化するために、２−ブロモエチル アミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）の濾過滅菌水溶液を最終濃度約４．０ｍＭとなる よう添加した。ＢＥＡは、上昇したｐＨの該カルチャー中で不活化剤バイナリ− ・エチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ　ｅｔｈｙｌｅｎｅｊｍｉｎｅＸＢ　Ｅ　Ｉ　 ）に変換される。該カルチャーを、一定に撹拌しながら、３７℃±１℃で少なく とも２４時間インキュベートした。 ２４時間インキュベートルた後、チオ硫酸ナトリウムの濾過滅菌水溶液、標準的 な中和剤を最終濃度約４ｍＭで添加し、過剰量のＢＥＩを中和した。 該カルチャーを、３７℃±１℃でさらに２４時間インキ、ベートし、完全に不活 化させた。 Ｂ　ワクチンの調製 前実施例のワクチン成分の不活化後、不活化エム・ヒユーニューモニエ　（Ｍ。 ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）をピー・マルトサイダ（Ｐ、　ｍｕｌｔｏｃｉｄ ａ）細胞結合トキソイドおよび／または本発明の他のワクチン成分に添加するこ とにより処方化した。十分量の不活化エム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、バルクの液体ワクチンロフトと合わせ、２ｍｌ用量 当たり約１０’ＣＣＵの最少抗原濃度を得た。 無菌の１０％メルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）および１０％エチレン ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、二ナトリウムまたは四ナトリウム塩）溶液を保存剤 として添加した。５％ないし４０重量％のレンチン（セントラル・ツイヤ（Ｃｅ ｎｔｒａｌ　５ｏｙａ））を含有する無菌のミネラルオイル［ドラケオール（Ｄ ｒａｋｅｏｌ）］を、リン酸緩衝液生理食塩水中で乳化し、バルクのワクチン流 体に最終濃度５％ｖ／ｖで添加する。このオイル／シンチン混合物をアジュバン トとして供する。最終濃度０．７％ないし３．２％のトウィーン８０および０３ ないし１８％のスパンを乳化剤として添加した。選抜したパラベン（ｐ−ヒドロ キシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香 酸ブヂル）を、オイルおよび乳化剤用のさらなる保存剤として添加してもよい。 実施例１１−動物におけるワクチン試験−ピー・マルトサイダ（Ｐ　、　ＭＬＩ ＬＴＯＣＩＤ＾）の可溶性および細胞結合トキソイド間における相乗効果ワクチ ン試験の間に、ブタの抗体反応の評価において、ピー・マルトサイダ（Ｐ　、　 ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）の細胞結合トキソイドおよび遊離トキソイドの混合は、細 胞結合トキソイド単独あるいは遊離トキソイド単独の使用に比して、抗毒素の誘 導で、相加的効果よりも大きな効果を有するという驚（べき事実が判明した。　 −実験しくは可溶性トキソイドを添加した細胞結合トキソイドを含有する混合ワ クチンで、一群のブタをワクチン化した。表■は、遊離トキソイド単独での、細 胞結合トキソイド単独で、およびこれら２つのワクチン組成物を組合わせた物で のワクチン接種に対する抗体反応を示している。ＥＬＴＳＡ力価は、この混合ワ クチンの相乗効果を示している。この混合ワクチン組成物は、ブタに最高の免疫 を誘導するものと考えられる。 ワクチン接種後の血清を、ロバーツ（Ｒ（＋ｂｅｒｔｓ）およびスウエアリンジ ン（Ｓ　ｗｅａｒｉｎｇｉｎ）の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・ベタリ ナリー・リサーチ（ＡＯｌ、　Ｊ　、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　）、４９：２１６ ８頁（１９８８）］により抗毒素中和、実際の防御抗体についてアッセイした。 抗毒素値は、遊離トキソイドおよび細胞結合トキソイドの強い相乗性を示してい る（表■）。（水酸化アルミニウム含量は、１２％ｖ／ｖ；アンフィゲン（Ａｍ ｐｈｉｇｅｎ）含量は５％ｖ／ｖ）。 全細胞（Ｂｂ）を含有するワクチンを、モルモットに用いて血清の抗体レベルを ＥＢＬ組織カルチャーアッセイ［ジェイ・エム、ルック−（Ｊ　、　Ｍ、　Ｒｕ ｔｔｅｒ）ら、ベタリナリー・レコード（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅｃｏｒｄ ）、１１４：３９３−３９６頁（１９８４）コにより測定したー実験の結果を示 している。この実験では、該混合ワクチンの投与量ユニットは、２ｍ１／用量で ある。この実験においては、６００ＲＵの遊離トキソイドは、観察可能な抗−毒 素反応を誘導しなかった。対照的に、６００トキソイド）と組合わせた遊離トキ ソイドは、１２８の抗毒素反応レベルを誘導ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）の不活化カル チャーの免疫学的相乗性のさらなる一例を供している。 表■ ブタ数　結合トキ１任　遊離トキン任　アジュバント　血清抗体レベル　中和抗 毒素（ｍｌ）　（ＲＵ）　ワクチン接種　ワクチン接種　ユニット／ｍ１前　後 　ワクチン接種前 ８　０ｍｌ　２０ＯＡ４０Ｈ３〈１０　１３　＜１８　０ｍｌ　２００　７ンフ イジｘ７−ＡｂＯＨｓ　＜ｌ　０　１６　＜１８　２ｍｌ　ＯＡＩｔｏ）１３　 ＜ｉｏ　９３　２０８　２ｍｌ　Ｏアンブイジエン−ＡｉｔＯＨｓ＜１０　４６ 　２０８　２ｍｌ　１２ＯＡ４０Ｈｓ　＜１０　２５２　４０嚢−！ 結合トヰ７４Ｆ　遊離）＋７４Ｆ　用量画分　アジュバント　血清抗体レベル（ ＲＵ）　ワクチン接種前　ワクチン接種後Ｂｂ＋ＰｍＤ　６００　１／２５　ア ンフィシエン−Ａｌ＊ＯＨｓ　＜２　１２８Ｂｂ＋ＰｍＤ　３００　１／２５　 アンフィシエン−ＡｂＯＨｓ　＜２　４Ｂｂ＋ＰｍＤ　０　１／２５　アンフィ シｚｙ−Ａｌ、ＯＨ，＜２　＜２Ｂｂ　６００　１／２５　アンフィシエン−Ａ ｌｘＯＨｓ　＜２　４Ｂｂ　３００　１／２５　アンフィシエンーＡｊ’、ＯＨ ，＜’２　（２本発明の膨大な修飾および変形は、前記に明らかにした明細書に 含まれ、当業者には明白であると予想される。例えば、ビー・ブロンキセブチカ （Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、イー・ルジオパチェ（Ｅ、　ｒｈｕｓ ｉｏｐａｔｈｉａｅ）またはエム・ヒユーニューモニエ（Ｍ、　ｈｙｏｐｎｅｕ ｍｏｎｉａｅ）よりも他の適当な不活化病原菌を本発明の混合ワクチンに用いて もよい。同様に、他の通常のアジュバントおよび不活化ワクチン成分を該処方に 用いてもよいし、当業者により選択されてもよい。これらワクチン組成物の投与 量および投与プロトコルも、ワクチン接種する動物、予防が望まれる疾病および 他の関連要因に基づく当業者によって調整されてもよい。本発明の組成物および 操作に対するかかる修飾および変更点は、本明細書に記載した請求の範囲の範囲 中に包含されると考えられる。 フロントページの続き （７２）発明者　口パーツ、ディピッド・ニスアメリカ合衆国ネブラス力州６８ ５１０、リンカーン、ロックバースト・ドライブ１０２０番（７２）発明者　ス ウェリンジン、リロイ・エイアメリカ合衆国ネブラス力州６８５１０、リンカー ン、サウス・サーティサード９あ番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物に内用した場合、毒素に対する中和抗体を誘導する細胞結合性トキソイ ドを伴うパスツレラ・マルトサイダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉ ｄａ）・タイプＤ・４６７７株のバクテリン、および内用に適した担体からなる ワクチン組成物。 ２．対数増殖期にあるピー・マルトサイダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）生物を、 ホルムアルデヒドで十分な時間処理して細胞内毒素を不活性化することにより製 造される請求項１記載のワクチン組成物。 ３．さらに免疫原量の１種またはそれ以上の付加的抗原からなる請求項３記載の ワクチン組成物。 ４．該付加的抗原がボルデテラ・プロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　 ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）・バクテリンからなる請求項３記載のワクチン 組成物。 ５．該付加的抗原がエリシペロズリクス・ルシオパシアエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ ｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）・バクテリンからなる請求項１記載 のワクチン組成物。 ６．該付加的抗原がパスツレラ・マルトサイダの可溶性遊離トキソイドからなる 請求項３記載のワクチン組成物。 ７，免疫原量の細胞結合性トキソイドを伴うパスツレラ・マルトサイダ・タイプ Ｄ・４６７７株のバクテリンの滅菌懸濁液０．５ないし３ｍｌからなるワクチン 投与単位。 ８．動物に内用した場合、中和抗毒素の産生を誘導する細胞結合性トキソイドを 伴うパスツレラ・マルトサイダ・タイプＤ・４６７７株のバクテリン。 ９．免疫原量の細胞結合性トキソイドを伴うパスツレラ・マルトサイダ・タイプ Ｄ・４６７７株のバクテリンを動物に内用することからなる、ピー・マルトサイ ダに対する動物へのワクチン投与法。 １０．請求項１ないし６に記載のワクチン組成物を動物に内用することからなる 、ピー・マルトサイダに対する動物へのワクチン投与法。 １１．（１）動物に内用した場合、毒素に対する抗毒素の産生を誘導する細胞結 合性トキソイドを伴うパスツレラ・マルトサイダ・バクテリンおよび（２）ピー ・マルトサイダ・可溶性遊離トキソイドならびに内用に適する担体からなるワク チン組成物。 １２．該遊離トキソイドｍＬ当たり少なくとも１５０相対トキソイド単位を含有 する請求項１１記載のワクチン組成物。 １３．さらに免疫原量の１種またはそれ以上の付加的抗原からなる請求項１１記 載のワクチン組成物。 １４．該付加的抗原がボルデテラ・ブロンキセブティカ・バクテリンからなる請 求項１３記載のワクチン組成物。 １５．該付加的抗原がエリシペロスリクス・ルシオバシアエ・バクテリンからな る請求項１３記載のワクチン組成物。 １６．免疫原量のピー・マルトサイダ・遊離トキソイドおよび細胞結合性トキソ イドを伴ったピー・マルトサイダ・バクテリンからなる滅菌溶液０．５ないし３ ｍｌよりなるワクチン投与単位。 １７．（１）細胞結合性トキソイドを伴うパスツレラ・マルトサイダ・バクテリ ンおよび（２）ビー・マルトサイダ・可溶性遊離トキソイドならびに内用に適す る担体よりなるワクチン組成物を動物に内用することからなる、ピー・マルトサ イダに対する動物へのワクチン投与法。 １８．内用した場合、該動物において抗毒素応答が誘導され、該抗毒素応答が、 細胞結合性トキソイドに対する抗毒素応答および可溶性遊離トキソイドに対する 抗毒素応答の和以上である、請求項１７記載の方法。 １９．ピー・マルトサイダの細胞結合性トキソイド、ピー・マルトサイダの遊離 トキソイド、ビー・プロンキセプティカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ） ・バクテリンおよびイー・ルシオパシアエ（Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ） ・バクテリンからなるワクチン組成物。 ２０．さらにアジュバントからなる請求項１９記載のワクチン組成物。 ２１．該アジュバントが、水酸化アルミニウム、サポニン、水酸化マグネシウム 、リン酸アルミニウム、リン酸マグネシウムおよびカルシウム化合物からなる群 より選択される請求項１９記載のワクチン組成物。 ２２．請求項１９記載のワクチン組成物を動物に投与することからなる、萎縮性 鼻炎および丹毒に対する動物へのワクチン投与法。