JPH07501449A - 少なくとも１つの突然変異スクリーンの選択方法，その多型系の対立遺伝子の迅速同定法への応用とそれの実施装置 - Google Patents
少なくとも１つの突然変異スクリーンの選択方法，その多型系の対立遺伝子の迅速同定法への応用とそれの実施装置Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
少なくとも１つの突然変異スクリーンの選択方法、その多型系の対立遺伝子の迅
速同定法への応用とそれの実施装置この発明は、多量遺伝子の一組の対立遺伝子
配列からの少なくとも１つの突然変異スクリーンの選択方法、多型遺伝子配列の
対立遺伝子変動（対立遺伝子又は対立遺伝子配列）の迅速同定法、特にデータバ
ンクの形にされた突然変異スクリーンから得られたヌクレオチドプローブ並びに
これらの方法の実施装置に関する。
この発明は、また多量遺伝子の対立遺伝子の同定キットに関する。
現在のところ、特に天然の複対立遺伝子系、例えば遺伝子が多数の対立遺伝子形
並びに多型性の他の形に存在できる主要な組織適合系（ＨＬＡ） 、特に免疫グ
ロブリン及びＴ細胞レセプターのような体細胞突然変異によるもの、又は嚢胞性
繊維症やデュシェーヌ筋ジストロフィーのようなある種の多発性突然変異遺伝子
疾患に特にみられる複対立遺伝子系に等しい系にみられるものにおいて、遺伝子
のヌクレオチド配列の少なくとも１つの塩基の突然変異によって相違する、同じ
遺伝子の異なる対立遺伝子を同定することは非常に困難で、繁雑である。
例えば、主要な組織適合性コンプレックス（ＨＬＡ Ｃｏｍｐｌｅｘ）遺伝子は
、染色体６の短いアームに密接に結合し、約５０００ｋｂに伸びている。これら
の遺伝子は、３つのタイプの蛋白、クラス■、■、■の蛋白をコードしており、
ＨＬＡ系の主な特徴は、その莫大な多型性にある。この系の多型性は、多数の遺
伝子とこれら遺伝子の各々について可能な多数の異なる対立遺伝子によるもので
、多型性は、個体がその両親から同じ対立遺伝子を受ける （同型接合）又は２
つの異なる対立遺伝子を受ける（異型接合）ことがありうる事実を考慮すると、
さらに増加する。
その上、ＨＬＡコンプレックスに対し、遺伝子当り１０〜１００の対立遺伝子か
あること、ＨＬＡコンプレックスの蛋白をコートする１５〜２０の遺伝子が現在
特徴付けられていることを考えると、現在利用できる方法で、このコンプレック
スの完全な型別（又は同定）を実施することは実際上不可能なことである。なお
、この型別は特に移植において重要である。
実際に、異なる多型系の型別は、免疫化学的方法か又はＤＮＡ／ＤＮＡハイブリ
ダイゼーシタン法の何れかで現在行うことができるが、これらの技術は次の欠点
を有する。
十分に特異的ではなく、そのため非常に類似構造を有する対立遺伝子の区別化が
できず、かつ多数のオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とし〔例えば、Ｈ
ＬＡ系のＤＲβ遺伝子の場合には（［ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、３１．１３
１−１４０（１９９０）のＨＬＡ系の因子の命名参照）、５６の対立遺伝子から
なる約５０〜６０のプローブ〕、かつ従来技術の分子生物学ベースの通常の型別
法である限り、結果を解釈しうるためには対立遺伝子当り１つのプローブのオー
ダーを同意することが実際上必要である。
さて、この同定は、予防理由か又は治療理由（特に治療、手術、移植）上の何れ
かで必要になることがよくある。すなわち、より詳しくは、ＨＬＡコンプレック
スの場合には、信頼できる型別系のコントロールが、ある疾患に対する感受性と
あるＨＬＡ対立遺伝子の頻度との間の相関関係の存在による予防目的のため、上
記のごとき移植の場合に、提供者と被移植者との間でのＨＬＡの適合性を有する
ことを必要する治療目的のため、かつ固体を同定する目的（特に犯罪学と父系の
探索）のために必要である。
結果として、本出願人は、対象者の完全な対立遺伝子マツプの同定を可能にし、
かつ多数のオリゴヌクレオチドプローブ（このプローブは、生産か困難でコスト
が高い）の使用を必要としない利点を有する対立遺伝子の迅速かつ信頼できる同
定法を提供する目的を設定するものである。
この発明の主題は、
（ａ）多量遺伝子の公知の共通配列の全部又は一部を選択し、（ｂ）公知の対立
遺伝子に対応する配列用の突然変異マトリックスを作成し、
（Ｃ）対立遺伝子〔（ａ）で選択された配列における同じ突然変異プロフィルを
有する対立遺伝子〕を比較することによって必須配列を同定し、かつ対のメンバ
ーの１つを除外し、（ｅ）絶対的突然変異（Ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ ｍｕｔａｔ
ｉｏｎｓ）又は所謂対立遺（立子マーカー突然変異、すなわちさもなくば同一で
ある２つの対立遺伝子を区別するのに必要かつ適切なもの（絶対的突然変異のセ
ット０）を同定して計算し、かつ（ｆ）工程（ｅ）の少なくとも絶対的突然変異
からなる最小の突然変異スクリーンを得る工程からなることを特徴とする全対立
遺伝子を区別化するのに適切な少なくとも１つのヌクレオチドプローブを特定化
することを意図した、多量遺伝子の一連の対立遺伝子配列から、少なくとも１つ
の突然変異スクリーンを選択する方法である。
この発明の有利な具体例によれば、絶対的突然変異を同定して計算する工程（ｅ
）の前に、その方法は、（ｄ）非重複でありかつ有用な突然変異のセットＵを構
成する突然変異のみを次の工程で処理するように、工程（ｂ）の対立遺伝子の配
列の各々において類似の突然変異を同定し、この工程（ｄ）に続いて、次のごと
く修正した工程（ｅ）と（ｆ）、すなわち（ｅ）セットＵの有用な突然変異から
、絶対的突然変異又は所謂対立遺伝子マーカー突然変異、すなわちさもなくば同
一である２つの対立遺伝子を区別するのに必要でかつ適切であるもの（絶対的突
然変異のセラｈｏ’ ）を同定して計算し、かつ（ｆ）工程（ｅ）の絶対的突然
変異が、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突然変異スクリーンを直接的に
得させないとき、工程（ｄ）の最小数の有用な突然変異（有用な突然変異のセッ
トＵ由来のサブセットＵ１）（この突然変異は、工程（ｅ）の絶対的突然変異に
関連して、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突然変異スクリーンを形成す
る〕を選択することからなる。
この具体例の有利な変形によれば、工程（ｆ）の前に、その方法は、全対立遺伝
子の区別化に用いるのに適切なオリゴヌクレオチドプローブを作成するのに最も
適切な一群の有用な突然変異を形成するために、工程（ｄ）の有用な突然変異（
有用な突然変異のセットＵ由来のサブセットＵｔ）を選択する工程（Ｘ）と、こ
の工程（Ｘ）の次に、以下のように修正した工程（ｆ）、すなわち絶対的突然変
異が、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突然変異スクリーンの直接的な選
択をしないとき、工程（Ｘ）の最小数の有用な突然変異〔その突然変異は、工程
（ｅ）の絶対的突然変異に関連して、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突
然変異スクリーンを形成する〕が選択される、工程を行うものである。
このような突然変異スクリーンは、冬型遺伝子の全対立遺伝子の区別化に用いる
のに適切な限定数のオリゴヌクレオチドプローブの選択と作成に特に有利である
。
また、この発明の主題は、次の工程。
■−前に定義したごとき少なくとも１つの突然変異スクリーン（異なる変形を含
む）を選択する方法である（ａ）〜（ｆ）の工程、次いで前記突然変異スクリー
ン選択法の工程（ｆ）で選択されたスクリーンから、全対立遺伝子の区別化に用
いるのに適切なオリゴヌクレオチドプローブを選択して作成するのに最も適切で
ある突然変異スクリーンを選択する工程（ｇ）において、冬型遺伝子の一連の対
立遺伝子配列から作成された少なくとも１つの突然変異スクリーンを選択し、
Ｉ［−（ｈ）前記対立遺伝子Ｘを、工程（ａ）〜（ｇ）で得られた突然変異スク
リーンから選択されたオリゴヌクレオチドプローブで適切にハイブリッド化し、
かつ
（１）工程（ｈ）で形成されるハイブリッドを検出することにより対立遺伝子Ｘ
を同定することからなることを特徴とする冬型遺伝子の対立遺伝子（又は対立遺
伝子配列）を同定する方法である。
突然変異スクリーン選択方法が上記の工程（ｄ）のとき、その工程（ｄ）は、突
然変異の第１のサブセット（重複する突然変異）を除外することにより、次の工
程で考えられる突然変異の第一の減少をもたらす利点を存し、かつそのため対立
遺伝子の特徴化に有用な突然変異のセットＵを構成する利点を有している。
工程（ｅ）〜（ｇ）は、セットＵの有用な突然変異から、任意に有用な突然変異
のセットＵ由来のサブセットＵ、（セットＵ。
は、絶対的突然変異に関連して、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突然変
異スクリーンを形成する最小数の有用な突然変異に対応する）、又は有用な突然
変異のセットＵ由来で、かつ適切なオリゴヌクレオチドプローブを作成するのに
より適切な一群の有用な突然変異を形成するために選択されたサブセットＵ、の
何れかに関連して、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突然変異スクリーン
を形成する絶対的突然変異のサブセットの選択を可能にし、かつ特殊なオリゴヌ
クレオチドプローブの選択のために、未知の対立遺伝子の迅速な同定を可能にす
る利点を有する。
実際に、この発明を構成する方法は、限定数のオリゴヌクレオチドプローブの選
択に加えて、以下の有利な特徴、すなわち−共通配列との最大の対合、
一非特異的ホモ又はヘテロダイマーを生ずる配列の形成かないこと、
−ＧＣ塩基か高含量であること、かつ
−ポリプリン又はポリピリミジン繰返し配列かないことを存するプローブを選択
することかできる。
その上、この発明を構成する方法は、同型接合二重じまの直接的同定と異型接合
二重しまからのそれらの区別を可能とする。
後者の場合に、純粋に突然変異スクリーンを得るには、各位置での二重しまの各
配列を分析することからなる上記と同じ方法か用いられる。従って、対立遺伝子
の二重じまは、全ての他の対立遺伝子の二重じまと比較される。
所定の主題で行われた対立遺伝子についての正確な知識に予防的かつ治療的なも
のが含まれていることは重要であり、この発明による方法は、ごく短期間でこの
問題を解決することができる。
この発明の主題は、また、一連の冬型遺伝子の対立遺伝子配列からの少なくとも
１つの突然変異スクリーンの選択法を、上記方法で得られかつ全対立遺伝子の区
別化に用いるのに適切なオリゴヌクレオチドプローブの作成を意図した一連の突
然変異スクリーンからなるデータバンクの作成に応用することである。
また、この発明の主題は、一連の冬型遺伝子の対立遺伝子配列からか又は上記の
データバンクからの少なくとも１つの突然変異スクリーンの選択法から由来する
少なくとも１つの突然変異スクリーンの使用を構成し、１５塩基と５０塩基の間
からなり、冬型遺伝子の対立遺伝子の同定用の対立遺伝子配列とハイブリッド化
するのに最も適切であることを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブにも関す
る。
そのようなプローブは、放射性同位元素、適当な酵素、蛍光色素、抗体又は塩基
類似体のような標識によって任意に標識化できる。またこのようなプローブは、
本出願人のヨーロッパ特許出願第４１２８８３号に記載した核酸配列中に存在す
る特定のヌクレオチド塩基（突然変異）を検出及び／又は同定する方法に使用す
ることもてきる。
この発明の有利な具体例によれば、それらは、選択された共通配列由来の配列で
、その３′末端に位置するヌクレオチド塩基が、選択された突然変異スクリーン
の１つの変異塩基の上流の塩基に相当するものからなる。
さらにこの発明の主題は、少なくとも、この発明によるオリゴヌクレオチドプロ
ーブの貯蔵品の適量と、同定されるハイブリッドを形成することができるプロー
ブ配列の検出用試薬の適量及び／又は選択された突然変異スクリーンの関数（ｆ
ｕｎｃｔｉ。
ｎ）として、得られたハイブリッド化の結果の解析表とを組合せてなることを特
徴とする冬型遺伝子の対立遺伝子の同定キットに関する。
この発明のキットの有利な具体例によれば、そのプローブは、選択された共通配
列由来の配列からなり、その３′末端に位置するヌクレオチド塩基が選択された
突然変異スクリーンの１つの変異塩基の上流の塩基に相当するものである。
このキットの他の宥和な具体例では、それは、さらにプライマーとして用いたプ
ローブの波長製品中に、その拡張製品の伸長をブロックしながら導入できるよう
修飾された、４つのヌクレオチド塩基の適量からなる。
このような具体例は、本出願人のヨーロッパ特許出願第４１２８８３号に記載の
方法を使用可能とする。
加えて、この発明の主題は、少なくともデータ入力手段、突然変異スクリーンを
発生するためのプログラム化された計算手段、そのスクリーンの記憶手段及び記
憶されたスクリーンからの対立遺伝子の同定を可能にしつる手段とからなること
を特徴とするこの発明による方法実施用の装置に関する。
上記の変形に加えて、この発明は、この発明の主題である方法の実施例に関する
下記の記述ならびに添付図面から明らかになる他の変形も含む。
図１は、絶対的突然変異のセット０から直接的に得られる突然変異スクリーンの
選択法の具体例を示す。
図２は、突然変異スクリーンが有用な突然変異のセットＵ由来の絶対的突然変異
のセットＯ′から得られ、セット０′は、上記のごとく、任意に有用な突然変異
のサブセットＵ、又はＵ、と関連している、他の具体例を示す。
図３は、この発明による方法（創性フェーズと実施フェーズ）を実施する装置を
示す。
図４は、Ａｌｌと称す、７対立遺伝子の配列用突然変異マトリックスを示す。
図５は、Ａｌｌ配列の一対の同型接合対立遺伝子を同定するセラ１−Ｕ（１！ｒ
用な突然変異）を示す。
図６は、Ａｌｌの同型接合対立遺伝子の全ての対についての一義的な同定に適切
な突然変異スクリーンを示す。
図７は、Ａｌｌ遺伝子の同型接合対立遺伝子の一対を同定するためのセットＵ（
＊用な突然変異）を示す。
図８は、Ａｌｌの異型接合対立遺伝子の全ての二重じまの一義的な同定に適切な
突然変異スクリーンを示す。
図９は、ＤＱβｌ遺伝子の同型接合対立遺伝子の一対を同定するためのセットＵ
（有用な突然変異）を示す。
図１Ｏは、ＤＱβｌ遺伝子の同型接合対立遺伝子の全ての対を同定するのに適切
な突然変異スクリーンのセットを示す。
これらの実施例は、この発明の対象を例証するためにのみ挙げられたもので、こ
れによって限定されないと理解されるべきである。
この発明による装置は、創生フェーズ（スクリーンの構成）及び実施フェーズ（
対立遺伝子の同定）の両者で上記したような選択・同定法の実施ができる。
創生フェーズでは、対立遺伝子の突然変異マトリックスが、（１）で適当なマイ
クロプロセッサ−（Ａ）に導入され、（４）でこの発明の少なくとも１つの突然
変異スクリーンを選択する方法によって、データバンクの（３，３’ ）に記憶
された１組のスクリーンを発生する。
実施フェーズでは、同定される配列が、少なくとも１つの突然変異スクリーンの
使用のために構成された適切なプローブの貯蔵品とハイブリッド化される。得ら
れたハイブリッドから、配列が同定される〔（２）に導入された実験データ〕。
得られた結果が、（５）でスクリーンと比較され、問題の対立遺伝子を特定する
ことができる。
実施例１
全遺伝子の同型接合対立遺伝子用の突然変異スクリーンの構成
・配列ＡＬＬ＠０５０１が、図４にみられるような共通配列として選択され、そ
の中の第１配列が共通配列と考えられ、他の配列中、上記共通配列に関する突然
変異のみが示される。
・対立遺伝子が比較され、各ペアの対立遺伝子を区別するのに有用な突然変異が
同定される。この発明による方法で見出された有用な突然変異は、図５に一致す
る５、８．１４．１９．２０．２１、３６．４８．４９の９つである。
この実施例では対立遺伝子の１対が必須（Ａｌｌ ”０２０１とＡｌｌ’０２０
２）である。対立遺伝子Ａｌｌ”０２０２は、残りの分析のために結果的に削除
される。
・次いで、絶対的突然変異の探索を行う。Ａｌｌ ”０４０１とＡｌｌ＠０５０
１は３６のみが異なる。
この研究から、唯一つの絶対的位置、すなわち位置３６のみか有用な突然変異に
存在する。
・この場合に、絶対的突然変異のみでは、全部の可能な対立遺伝子の対を区別す
ることはできず、“解決（ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）“は存在しない。すなわち、ス
クリーンは、３以下の突然変異の数（すなわち、２つの付加的突然変異）で、考
えられる全対立遺伝子の一義的な同定を可能にする。
３つの突然変異を有する全ての可能な突然変異スクリーンは、１）３６．５．２
０．
２）３６．８．２０及び
３）３６．１４．２０（図６．１〜６．３に一致する）であり、これらの突然変
異スクリーンの何れか１つの助けで、全遺伝子の対立遺伝子を同定することがで
きることを示す。
実施例２
全遺伝子の異型接合対立遺伝子用の突然変異スクリーンの構成
この実施例では、実施例１に記載の方法を行った後で、図７に示す有用な突然変
異の同定が得られるもので、探索は対立遺伝子の全ての二重じまの区別ができる
絶対的突然変異について行われる。
対立遺伝子：
Ａｌｌ”０４０１． Ａｌｌ”０４０１ と Ａｌｌ＠０５０１． Ａｌｌ”０
４０１は、３６のみで異なる；
Ａ１１”０４０１． Ａ１１”０４０１ と Ａｌｌ”０５０１． Ａｌド０５
０１は、３６のみで異なる；
Ａｌｌ”０３０２． Ａｌｌ”０４０１ と Ａｌビ０５０１． Ａｌｌ”０３
０２は、３６のみで異なる：
Ａｌｌ”０３０１． Ａｌｌ”０４０１ と Ａｌｌ”０５０１． Ａｌｌ”０
３０１は、３６のみで異なる：
Ａｌｌ”０２０１． Ａｌビ０４０１ と Ａｌビ０５０１． Ａｌｌ”０２０
１は、３６のみて異なる：
Ａｌビ０５０２． ＡＩｌ”０４０１ と Ａ１ビ０５０１． Ａｌビ０５０２
は、３６のみで異なる：
Ａ１ビ０５０１． Ａｌｌ＠０４０１ と Ａｌｌ”０５０１． Ａ１１”０５
０１は、３６のみて異なる。
この探索から、有用な突然変異の中で、唯一つの絶対的位置、すなわち位置３６
が存在することが分る。
この実施例では、この単一の絶対的突然変異は、対立遺伝子の全ての二重じまを
区別を可能としない。３以下、すなわち２つの付加的突然変異の数で、解決“５
ｏｌｕｔｉｏｎｓ”は存在しない。
対立遺伝子の全ての二重じまの区別を可能にする突然変異スクリーンの１つは、
図８に一致する３６．５．２０である。
実施例３
Ａｌｌ異型接合固体のタイプ化
実施例２の突然変異スクリーンが、対立遺伝子を同定するために選択される。そ
れは、上記の選択基準に対応する（共通配列との最大の対合、ホモ又はヘテロダ
イマーの形成を生ずる配列の不存在、ＧＣ塩基の高含量及びポリプリン又はポリ
ピリミジン繰り返し配列の不存在）プローブの作成に最も適するからである。
２０オリゴヌクレオチドのプローブは、そのプローブの位置３′が上記スクリー
ンのその位置の丁度１つ上流に位置する塩基に相当するように、かつ上記のヨー
ロッパ特許出願の条件下でハイブリッド化及び拡張を行ったとき、塩基がハイブ
リッド化するのを証明できるように合成される。このようなパネルのプローブを
使用すると、固体１において、選択されたスクリーンに関して対立遺伝子Ａ１ピ
０２０１． Ａｌビ０３０２の対を同定することを可能にする配列ＣＣＣＴ Ｃ
Ｃ１及び試験される個体２において、選択されたスクリーンに関して対立遺伝子
Ａｌｌ”０５０２、 Ａ１．ｌ ”０２０１の対を同定することを可能にする配
列ＣＣＣＴ ＣＧを同定することが可能となる。
実施例４
ＨＬＡ−ＤＱβｌ遺伝子の同盟接合対立遺伝子用の突然変異スクリーンの構成
ＨＬＡ系の因子の命名は、１９９０年の［ｍｍｕｎｏｇｅｔｉｃｓ、 ３１．１
３１〜１４０に発表されており、次の実施例は、この文献で定義されたＨＬＡ−
ＤＱβｌの対立遺伝子用の突然変異スクリーンの構成を例示するものである。
・配列ＤＱβビ０５０１ （位置１〜位置３００）を共通配列として選択する。
・類似の突然変異の位置を、一度のみと考えられるように同定し、次の結果を得
る。
突然変異 ２５は７に類似する。
突然変異 １４０は１１０に類似する。
突然変異 １８６は１６７に類似する。
突然変異 ２６６は２５０に類似する。
突然変異 ２６９は２５９に類似する。
突然変異 ２８０は２７７に類似する。
結果として、突然変異２５．１４０．１８６．２６６．２６９及び２８０は、方
法の次の工程で無視される（数字は、配列上の突然変異の位置に対応する）。
対立遺伝子を比較し、各部の対立遺伝子を区別化するのに有用な突然変異を同定
する。この発明の方法で見出された有用な突然変異は、
１０５ １０９ ＋１０ １１３ １１４ １３４ １３７ １４１ １４４
１４７ １５３＋５５ １５８ １６４ １６７ １６９ １７０ １７１ １
９８ １９９ ２０８ ２０９２５３ ２５７ ２５９ ２６０ ２６５ ２７
１ ２７７の５４個である（図９に一致する）。
この実施例では、全ての対立遺伝子の対が区別できる。
次いて、絶対的突然変異の探索を行う。
ＤＱβビ０４０２とＤＱβピ０４０１は６８のみで異なる。
ＤＱβビ０３０３２とＤＱβビ０３０３１は６３のみで異なる。
ＤＱβビ０３０３２とＤＱβピ０３０２は１７０のみで異なる。
この探索から、有用な突然変異中の絶対的位置が、６３．６８及び１７０である
ことが分る。
この場合に、３つの絶対的突然変異は、全ての可能な対立遺伝子の対の区別化を
可能にしない。７つ以下の突然変異（すなわち、４つの付加的突然変異）で、解
決は存在しなし）。７つの突然変異を有する全ての可能な突然変異スクリーン（
よ、１− ６３． ６８． １７０、７． ７６、 ８８． １７１２− ６３
． ６８． １７０． ７． ７７、 ８８． １７１３− ６３． ６８．
１７０． ２６． ７６、 ８８． １７１゜４− ６３． ６８． １７０．
２６． ７６、 ８８． ２３１゜５− ６３． ６８． １７０． ２６．
７７、 ８８． １７＋。
６− ６３． ６８． １７０． ２６． ７７、 ８８． ２３１゜７− ６
３． ６８． １７０． ５７． ７６、 ８８． １７１゜８− ６３． ６
８． １７０． ５７． ７７、 ８８． １７１゜９− ６３． ６８． １
７０． ７６、 ８８． １０９． １７１゜１０− ６３． ６８． １７０
． ７６、 ８８． １１３． １７１゜＋１− ６３． ６８． １７０．
７６、 ８８． １１４． １７１゜１２− ６３． ６８． １７０． ７６
、 ８８． １１４． ２３１゜１３− ６３． ６８． １７０． ７６、
８８． １３４． １７１゜１４− ６３． ６８． １７０． ７６、 ８８
． １４１． １７１゜１５− ６３． ６８． １７０． ７６、 ８８．
１４１． ２３１゜１６− ６３． ６８． ＋７０． ７６、 ８８． １５
３． １７１゜１７− ６３． ６８． １７０． ７６、 ８８． １５８．
１７１゜１８− ６３． ６８． １７０． ７６、 ８８． １５８． ２
３１゜１９− ６３． ６８． １７０． ７６、 ８８． １６４． １７１
゜２０− ６３． ６８． １７０． ７６、 ８８． １６４． ２３１゜〔
図１０． １−１０．２０ （対立遺伝子ＤＱβｌは、ＤＱβｌとして示されて
いる）に一致する〕であり、これらの突然変異スクリーンの何れか１つの助けで
、ＤＱβ１遺伝子の対立遺伝子を同定することができることを示す。
上記から明らかなように、この発明は、発明をより明白にするために記載した具
体例、方法及び応用に限定されるものでなく、この発明の範囲から離れることな
く、この分野の当業者に分る全ての変形も含まれる。
図１
図２
日ｉｉＭ＋Ｈ
図６
図７
図８
図１０
１−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−−
−，−−−−１１Ｘ）８１”０４１ｎ ｌ ＣＴ 入 Ｔ Ｇ Ｔ ｅ ｌｔｏ
、２ＤＱＢｌ”０６０１ １ＣＣＡ ＣＡ Ｔ ０１図１０
図１０
図１Ｏ
図１０
図１０
図１０
ｍ Ｉ＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋
＋＋−＋＋＋＋＋１＋ ６３ ６１！ １７０ ７６ ８８ ＬＳＩ１ｌ Ｌ７
１１ＤＱＢ１”０２０１ ＩＡ に ＣＣＡ Ｔ ＣＩＤＱＢｌ”０３０コ１
１ＣＧ Ａ ＣＴ Ｔ ＣＩＤ０Ｂ１’０４０２ ＩＣＧ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ
ＩＤ０Ｂｌ”０３０１ １Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ ＣＩＤ０Ｂ１”Ｏ］０２
ＩＣＧ ＣＣＴ Ｔ Ｃ１閃Ｂ１９０５０２１ＣＧ Ｇ Ｇ ＣＡ Ｃ＋１−一
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−一−
−−−ｌｌ ６３ ６８ １７０ ７６ ８８ １５８ ２３１１ＤＯＢ１”０
２０１ ＩＡ Ｇ ＣＣＡ Ｔ ＣＩＤＱＢｌ”０３０３１１ＣＧ Ａ ＣＴ
Ｔ ＧＩＤＯＢＩ豐０４０２１ＣＧ Ａ ＣＴ Ｔ ＣＩＤ０ＢＩ豐０４（ＩＩ
Ｉｃ Ｔ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ１１ｏ、ＩＢＤＯＢＩ會０６０３１０ Ｇ Ａ
ＣＣ入 ＧＩＤＯＢＩ脅０６０２１ ＣＧ Ａ ＣＴ 入 ＣＩＤ０ＢＩ豐０５
０２１Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ ＣＡ ＾ ＩＤＱＢＩ豐０５０４１０ Ｇ Ｇ Ｇ ’
？’ Ａ ＧＩＤＯＢｌ”０６０４ １Ｇ Ｇ Ｔ ＣＣＡ Ｇ１１−−−−−
−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
１図ｉ。
国際調査報告 ｏｒｔｔ。。、／１１＋１１１国際調査報告 ＦＲ９２０１１４
１
フロントページの続き
（７２）発明者 ドーセー、シャン
フランス国、パリ ７５００７、リュ ビレセフセル ７
Claims (11)
- １．（ａ）多型遺伝子の公知の共通配列の全部又は一部を選択し、 （ｂ）公知の対立遺伝子の対応する配列用の突然変異マトリックスを作成し、 （ｃ）対立遺伝子〔（ａ）で選択された配列における同じ突然変異プロフィルを 有する対立遺伝子〕を比較することによって必須配列を同定し、かつ対のメンバ ーの１つを除外し、（ｅ）絶対的突然変異又は所謂対立遺伝子マーカー突然変異 、すなわちさもなくば同一である２つの対立遺伝子を区別するのに必要かつ適切 なもの（絶対的突然変異のセット０）を同定して計算し、かつ （ｆ）工程（ｅ）の少なくとも絶対的突然変異からなる最小の突然変異スクリー ンを得る工程からなることを特徴とする全対立遺伝子の区別化に用いるのに適切 な少なくとも１つのヌクレオチドプローブを特定することを意図した、多型遺伝 子の一連の対立遺伝子配列からの少なくとも１つの突然変異スクリーンの選択方 法。
- ２．絶対的突然変異を同定して計算する工程（ｅ）の前に、（ｄ）非重複であり かつ有用な突然変異のセットＵを構成する突然変異のみを次の工程で処理するよ うに、工程（ｂ）の対立遺伝子の配列の各々において類似の突然変異を同定し、 この工程（ｄ）に続いて、次のことく修正した工程（ｅ）と（ｆ）、すなわち（ ｅ）セットＵの有用な突然変異から、絶対的突然変異又は所謂対立遺伝子マーカ ー突然変異、すなわちさもなくば同一である２っの対立遺伝子を区別するのに必 要かつ適切なもの（絶対的突然変異のセット０′）を同定して計算し、かつ（ｆ ）工程（ｅ）の絶対的突然変異が、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突然 変異スクリーンを直接的に得させないとき、工程（ｄ）の最小数の有用な突然変 異（有用な突然変異のセットＵ由来のサブセットＵ１）〔この突然変異は、工程 （ｅ）の絶対的突然変異に関連して、全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突 然変異スクリーンを形成する〕を選択することからなる請求項１による選択方法 。
- ３．工程（ｆ）の前に、全対立遺伝子の区別化に用いるのに適切なオリゴヌクレ オチドプローブを作成するのに最も適切な一群の有用な突然変異を形成するため に、工程（ｄ）の有用な突然変異（有用な突然変異のセットＵ由来のサブセット Ｕ２）を選択する工程（Ｘ）と、この工程（Ｘ）に次いで、修正した工程（ｆ） 、すなわち絶対的突然変異が全対立遺伝子の一義的な区別化に適切な突然変異ス クリーンの直接的な選択をしないとき、工程（Ｘ）の最小数の有用な突然変異〔 その突然変異は、工程（ｅ）の絶対的突然変異に関連して、全対立遺伝子の一義 的な区別化に適切な突然変異スクリーンを形成する〕を選択する工程からなるこ とを特徴とする請求項２による選択方法。
- ４．１．請求項１〜３の何れか１つによる選択法（ａ）〜（ｆ）の工程と、次い で前記突然変異スクリーン選択工程（ｆ）で選択されたスクリーンから、全対立 遺伝子の区別化に用いるのに適切なオリゴヌクレオチドプローブを作成するのに 最も適切である突然変異スクリーンを選択する工程（ｇ）において、多型遺伝子 の一連の対立遺伝子配列から作成された少なくとも１つの突然変異スクリーン限 選択し、 ｉｉ．（ｈ）前記対立遺伝子Ｘを、工程（ａ）〜（ｇ）で得られた突然変異スク リーンから選択されたオリゴヌクレオチドプローブで適切にハイブリッド化し、 かつ （ｉ）工程（ｈ）で形成されるハイブリッドを検出することによって対立遺伝子 Ｘを同定することからなることを特徴とする多型遺伝子の対立遺伝子の同定方法 。
- ５．上記の方法で得られ、全対立遺伝子の区別化に用いるのに適切なオリゴヌク レオチドプローブの作成を意図した一連の突然変異スクリーンからなるデータバ ンクの製造への請求項１〜３の何れか工つによる方法の応用。
- ６．請求項１〜３の何れか１つによる選択方法由来又は請求項５により得られた データバンク由来の少なくとも１つの突然変異スクリーンの使用のために構成さ れ、１５〜５０の間の塩基からなり、多型遺伝子の対立遺伝子の同定用の対立遺 伝子配列とハイブリッド化するのに最の適切であることを特徴とするオリゴヌク レオチドプローブ。
- ７．選択された共通配列由来の配列からなり、その３′末端に位置するヌクレオ チド塩基が、選択された突然変異スクリーンの１つの変異塩基の上流の塩基に相 当することを特徴とする請求項６によるプローブ。
- ８．請求項６又は７によるオリゴヌクレオチドプローブの貯蔵品の適量と、同定 されるハイブリッドを形成することができるプローブ配列の検出用試薬の適量及 び／又は選択された突然変異スクリーンの関数として、得られたハイブリッド化 の結果の解析表とを組合せてなることを特徴とする多型遺伝子の対立遺伝子の同 定用キット。
- ９．プローブが、選択された同型配列由来の配列からなり、その３′末端に位置 するヌクレオチド塩基が、選択された突然変異スクリーンの１つの変異塩基の上 流の塩基に格当することを特徴とする請求項８によるキット。
- １０．さらに、プライマーとして使用した前記プローブの拡長製品中に、その拡 長製品の伸長をブロックしながら導入できるよう修正された、４つのヌクレオチ ド塩基の適量からなることを特徴とする請求項８又９によるキット。
- １１．少なくとも、データ入力手段（１、２）、突然変異スクリーンを発生する ためにプログラム化された計算手段（４）、そのスクリーンの記憶手段（３、３ ′）及び記憶したスクリーンから対立遺伝子を同定させることができる手段（５ ）からなることを特徴とする請求項１〜４の何れか１つによる方法の実施用装置 。
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