JPH07501526A - 有害な免疫応答の改善において有用なｍｈｃサブユニット結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有害な免疫応答の改善において有用なＭＭＣサブユニット結合体関連出願のクロ ス−リファレンス 本出願は、１９９１年１１月１９日に出願された米国特許逐次番号０７／７９３ ．９３８号の一部係属である。それは、以下の同時係属中の及び放棄された米国 特許出願：　（１９９１年４月２３日に出願された）逐次番号０７／６９０／８ ４０　：　（１９９０年１２月１２日に出願された）逐次番号０７／６３５．８ ４０　；　（１９８８年６月２３日に出願された）逐次番号０７／２１０．５９ ４に関連する。これらのすべてを、全体として、引用により本明細書中に取り込 む。

発明の背景 本発明は、有害な免疫応答に関する疾患の治療に、そしてそのような疾患の治療 及び診断において有用な材料及び方法に関する。特に、Ｔ細胞に選択的に結合し 、そしてこれらの疾患に関係する抗原からのペプチド断片と複合体化する主要組 織適合複合体（ＭＨＣ）糖蛋白からのサブユニットを含んで成る複合体に関する 。この複合体それ自体は、治療的に有用であり、又はそれらは、診断目的のため にラジオアイソトープ又は他の標識に、又は標的細胞を特異的に除去するために 毒素又は他の物質に、さらに結合されることがてきる。

ＭＨＣ分子は、より上位やを椎動物の細胞上に発現されたヘテロダイマー糖蛋白 （ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）てあり、そして 免疫応答において役割を演している。ヒトにおいては、＾ＩＨＣ分子は、それら が白血球内で最初に同定されたので、ＨＬＡ（ヒト−白血球−付随）といわれる 。マウスにおいては、それらは、Ｈ−２抗原と名付けられている。

ＭＨＣ分子は、２つの群、クラスＩとクラス１１に分けられ、これは、互いに構 造的に及び機能的に異なっている。一般的には、ＭＭＣ分子の主要な機能は、抗 原性ペプチドに結合することであり、そして細胞の表面上にそれらを現している 。これらのペプチドは、ペプチド断片であって８〜２０アミノ酸程短いものであ ることができる断片に抗原をプロセシングする抗原呈示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ　 ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ）から生しる。

クラスＩ　ＭＨＣ分子は、はとんどすべての核のある細胞上で発現され、そして 細胞毒性Ｔリンパ球により認識され、これは、次に、抗原含有細胞（ａｎｔｉｇ ｅｎ−ｂｅａｒｉｎｇ　ｃｅ目Ｓ）を破壊する。クラス［［ＭＨＣ分子は、免疫 応答の開始及び持続に関係する細胞、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロ ファージ等上に主に発現される。クラスＩｆＭＨＣ分子は、ヘルパーＴリンパ球 により認識され、そしてヘルパーＴリンパ球の増殖を、そして現れた特定の抗原 性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。ＭＨＣ分子の機能の一般的討議 については、Ｇｒｅｙ、　Ｈｌｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ、　１９８９：５６−６４（これを、引用 により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

抗原性ペプチドに結合することに加えて、ＭＨＣ分子は、自己の（ａｕｔｏｌｏ ｇｏｕｓ）、又は”自己の（ｓｅｌｆ）”ペプチドと結合することもできる。次 にＴリンパ球が゛自己の（ｓｅｌｆ）”ペプチドを現す細胞に応答する場合には 、自己免疫の症状が生じる。Ｂｕｕｓ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４２：１０４５−１０４７　（１９８８）；　Ｄｅｍｏｔｚ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４２：６８２−６８４（１９８９）を参照のこと。

（これらの刊行物を、引用により本明細書中に取り込む。）。３０を超える自己 免疫疾患が、現在知られており、重症性筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ　ｇｒ ａｖｉｓ（ＭＧ））　、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ （ＭＳ））、全身性紅斑性狼ｆｆｉ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　１ｕｐｕｓ　ｅｒｙｔ ｈｅｍａｔ。

５ｉｓ（ＳＬＥ））　、リウマチ様関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒ ｉｔｉｓ（ＲＳ乃、インシュリン依存性真性糖尿病（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅ ｎｄｅｎｔ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ（ＩＤＤＭ））　、等を含む 。これらの疾患の特徴は、犠牲者の組織に対するその免疫系による攻撃である。

疾患のない個体においては、このような攻撃は起こらない。なぜなら、その免疫 系か“自己（ｓｅｌｆ）“に抵抗性であり、すなわち、それが、外来のものとし て“自己の（Ｓｅｌｆ）“組織を認識せず：しかしながら、自己免疫疾患を患う 患者においては、このような抵抗性は起こらず、そして組織成分が外来のものと して認識される。自己免疫疾患の一般的レビューについては、５ｉｎｈａ　ｅｔ 　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：１３８０−１３８７（１９９０にこれを 、引用により本ＥＡ細書中に取り込む。）を参照のこと。

自己免疫疾患におけるＭＨＣクラス１１蛋白の掛かり合いは、多数のインビトロ における及び動物のモデルにおいて示されてきた。例えば、ＭＨＣクラスｌ［蛋 白それ自体又はＭｌ（Ｃクラス【１遺伝子の発現を誘導する剤に対する抗体のい ずれかに対する抗体の投与が、自己免疫状態の発展を妨害する。ヘルパーＴ細胞 の役割も、特徴的なヘルパーＴ細胞表面分子であるＣＤ４に対するモノクロナー ル抗体を使用して動物モデルにおいて証明されてきた（Ｓｈｉｚｕｒｕ、　Ｊ、 Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４０：６５９−６６ ２）。さらに、インビトロにおける検定は、アネルギ−（ａｎｅｒｇｙ）又は増 殖性非応答性（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅ ｓｓ）が不完全に特徴付けされた同時刺激性シグナル（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏ ｒｙ　ｓｉｇｎａｌ）の非存在中にＬｌＨＣクラスＩＩ分子によりリンパ球内で 誘導されることができるということを、証明した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｃｅ１ ｌ（＋９８９）　＋０７３−１０８１及びＱｕｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、　（１９８７）　１３８：３７０４−３７１２（これを、引用に より本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。

不所望の免疫応答に関係する多数の他の病因学的応答が、知られている。例えば 、多数のアレルギー性疾患は、特定の＆ＩＨＣ対立遺伝子と関係しており又は自 己免疫成分をもつと示唆されてきた。本発を、引用により本明細書中に取り込む 。）を参照のこと。例示的なアレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎｓ）は、ブタフサ（ ｒａｇｗｅｅｄ）　、ネコ・アレルゲン、及び草花扮（ｇｒａｓｓ　ｐｏｌｌｅ ｎ）を含む。

他の有害なＴ細胞仲介応答は、同種の（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）宿主から移植片 （ｇｒａｆｔｓ　ｏｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ）としてその体内に意図的に導 入された外来細胞の破壊を含む。“同種移植片拒絶（ａｌｌｏｇｒａｆｔ　ｒｅ ｊｅｃｔｉｏｎ）”として知られるこの過程は、宿主Ｔ細胞と外来ＭＢＣ分子と の相互作用を含む。かなりしばしば、広いレンジのＭＨＣ対立遺伝子が、同種移 植片に対する宿主の応答に関係している。

自己免疫疾患及び他の免疫病理のための最近の治療は、その症状を治療すること てあり、その病気の病因論において干渉することではない。多数の不所望の副作 用をもつ広スペクトルの化学療法剤が、典型的に使用される。ヘルパーＴ細胞に おいて自己免疫応答を選択的に抑制することができる化合物は、より安全で、よ り有効な治療を提供する。さらに、このような免疫抑制化合物は、非自己免疫疾 患、例えば、移植片対宿主疾患（ｇｒａｆｔ　ｖｅｒｓｕｓ　ｈｏｓｔ　ｄｉｓ ｅａｓｅ（ＧＶＨＤ））又は様々なアレルギ一応答の治療において有用である。

例えば、慢性ＧＶＨＤ患者は、しばしば、特定の自己免疫疾患に類似した症状及 び兆候を現す。

現在利用できる不適切な治療は、ＭＨＣ限定免疫応答を抑制するが、不所望の副 作用、例えば、個体の免疫応答の全体の非特異的抑制を避ける、新たな剤を同定 するための緊急の必要性を示している。

発明の概要 本発明は、不所望の免疫応答の原因である免疫系の上記の態様を同定し且つ抑制 するために使用することができる方法及び組成物に向けられている。本発明の組 成物は、ＭＨＣエンコード抗原呈示糖蛋白の１本鎖サブユニット及び抗原性ペプ チドの有効部分を含んで成る精製組成物である。これらの２つの成分は、共有結 合性又は非共有結合性の会合により結合されることができる。第３成分、すなわ ち、エフェクター成分も、同様に含まれることができる。エフェクター成分は、 その複合体が例えば、自己免疫疾患を診断するために使用される場合に、標識さ れることができる。また、このエフェクター成分は、その複合体が障的化された Ｔ細胞集団を選択的に除去するために使用される場合に、毒素であることがてき る。

他の態様においては、医薬組成物であって本発明の複合体が活性成分であるもの に向けられている。この組成物は、例えば、自己免疫疾患と関係する特定の自己 抗原と反応性のある免疫系の部分を、ダウン−レギュレート（ｄｏｗｎ−ｒｅｇ ｕｌａｔｅ）又は除去するために使用されることができる。

図面の簡単な説明 図１は、ヒトＨＬＡ−Ａ２抗原（クラスＩ）の３次元構造を示している。

図２は、好ましい第二世代のＭ）ＩＣ蛋白デザインを示している。

図３は、アセチルコリン・レセプタ蛋白のαサブユニットのためのアミノ酸配列 及びｍＲＮＡを示している。

図４は、ミニリン塩基性蛋白（ｍｙｅｌｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ア ミノ酸配列を示している。

図５は、［−Ａ　ｂ−α鎖をコートしているヌクレオチド配列を示している。

図６は、Ｉ−Ａ　”−β鎖をコードしているヌクレオチド配列を示している。

図７は、ヒトにおけるＤＱ／ＤＲハブロタイブ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ）のリス ト及び自己免疫疾患とのそれらの関係を表している。

図８は、自己免疫疾患の診断及び／又は治療のための本発明の複合体の利用に好 適な手順を示している。

図９Ａは、９５°Ｃにおける５分間の加熱により解離したαとβ鎖の分離を示す ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルである。

図９Ｂは、低いｐＨにより解離したαとβ鎖の分離を示すＳＯＳポリアクリルア ミド・ゲルである。

図９０は、２−吐による還元の後の１本鎖調製物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析である 。

図１０Ａは、ソリ力・ゲルＴＬＣを使用したペプチド結合検定の結果を表してい る。

図１０Ｂは、ＣＡＥを使用したペプチド結合検定の結果を表している。

図１１は、本発明の、１本鎖：ペプチド複合体の安定性を示している。

図１２Ａは、クローン化細胞へのα鎖複合体の結合について示している。

図１２Ｂは、Ｔ細胞への、ヘテロダイマー複合体と１本鎖複合体の両方の優先的 結合を示している。

図１２Ｃは、抗−ＴＣＰモノクロナール抗体を使用したブロッキング実験により 証明されるような、本発明の複合体がＴＣＰに結合する能力を示している。

図１３Ａは、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ） により測定されるような、本発明の複合体とＴ細胞との間の相互作用により誘導 される培地の酸性化における持続性の増加について示している。

図１３Ｂは、非特異的複合体が酸性化において有意な増加を誘導しないことを示 している。

図１４は、本発明の複合体によるＴ細胞におけるアネルギーの有意な誘導につい て示している。

図１５は、［１−２生産により測定されるようなアネルギーの誘導について示し ている。

図１６は、本発明の複合体により処理されたマウスにけるＥＡＥの弱まりを示し ている。

図１７は、ダイマーのＭｌ（Ｃペプチド複合体が凝集体として存在することを示 している。なぜなら、それらは、空隙容量をもつカラムを通過し、そしてそれ故 、６００．、ＯＯＯより大きな分子量をもつからである。

好ましい態様の説明 本発明は、少なくとも２つの成分：免疫系に対する関連した効果をもつ抗原性ペ プチド又は他の抗原性配列及び抗原表象に関係するλｔＨｃエンコード糖蛋白の サブユニットの有効部分を、含む。このペプチド抗原とＬＩＨＣサブユニットの 抗原結合部位との間の結合は、共有結合性又は非共有結合性であることができる 。

他の態様においては、複合体は、一般的に毒素又は標識であるエフェクター成分 を含むこともてきる。このエフェクタ一部分は、ＭＨＣサブユニット又は抗原性 ペプチドのいずれかに結合されることができる。系の成分のそれぞれを、以下に 別々に記載し：その後、それによりこれらの複合体が調製、評価及び使用される ことができるところの方法について記載する。

ＭＨＣ誘導成分 において広く研究されてきた。一般的には、それらは、すべての細胞の表面上に 見られ、そして主に細胞毒性Ｔ細胞により認識される、クラス］糖蛋白：及び付 随的細胞、例えば、マクロファージを含むいくつかの細胞の表面上に見られ、そ してヘルパーＴ細胞に対する抗原の表象に関係する、クラス１１、として分類さ れている。組織適合性蛋白の多くが、単離され、そして特徴付けされてきた。Ｍ Ｈにれを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

ヒトにおけるクラスｌ　＆ＩＨＣは、染色体６上に位置し、そして３つの座、Ｈ ＬＡ−１ＨＬＡ−８、及びＨＬＡ−Ｃをもつ。最初の２つの座は、アロ抗原をエ ンコードしている多数の対立遺伝子をもつ。すべての抗原特異性に共通な、４４ Ｋｄ重鎮サブユニット及び＋２Ｋｄβ２−マイクログロブリン・サブユニットか ら成ることが見つかっている。これらの洗剤溶解性ＨＬＡ抗原の単離については 、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（＋９７６）　７６ ：２４８１−２４８５：　Ｃｌｅｍｅｎｔｓｏｎ。

Ｋ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、ｉｎ″Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ａｚｚ ｉ、Ａ、、ｅｄ：　Ｂｊｏｒｋｍａｎ。

Ｐ、、　Ｐｈ、Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ　Ｈａｒｖａｒｄ　（１９８４）（これらの すべてを、引用により本明細書中に取り込む。）により記載されている。

さらなる研究が、ＨＬＡ−Ａ２、クラス［ヒト抗原の３−Ｄ構造の詳細な写真を もたらした（Ｂｊｏｒｋｍａｎ、　Ｐ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 　（１９８７）　３２９：５０６−５１８これを、引用により本明細書中に取り 込む。）。図１においては、β２−マイクログロブリン蛋白と重鎮のα、上セグ メントか会合していることを見ることかできる。重鎮のＣ１及びα２領域は、ｃ ｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：６１３−６１４．これを、引用により本明細書 中に取り込２５２　：　７５５５−７５６７（これを、引用により本明細書中に 取り込む。）により記載されるように、ホモ接合性ヒト・リンパ芽球様細胞系Ｊ −Ｙから、原形質膜のパパイン消化の後に、精製されることができる。パパイン は、トランスメンブラン領域に近い４４Ｋｄ重鎖を解裂させ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ２ 、及びβ２マイクログロブリンを含んで成る分子を作り出す。

クラスＩＩＭＨｃ抗原における抗原結合部位の３次元構造は、ＭＨＣ１における もの程詳細に知られていない。しかしながら、クラス■］糖蛋白は、クラス１の ものと類似の一般的ドメイン構造をもっている。

クラス１１　ＭＨＣの抗原結合部位は、２つのサブユニット（α及びβ鎖）のＮ −末端ドメイン部分上に位置する。別々の抗原結合部位が、それぞれのサブユニ ット上に位置する（ｌｕｅｓｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６５：１１１７７−１１１８４（＋９９０）（これを、引用によ り本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。この２つのサブユニットは、非 共有結合の力により一緒になり、そしてそれぞれが、２つの球状ドメイン（それ ぞれ、Ｃ１、α、とβ１、β２）を含み、それらは、すべて、α、ドメインを除 き、ジスルフィド結合により安定化されている。

ＭＨＣ糖蛋白を、適当な細胞から単離することができ、又は組換えにより生産す ることができる。ネズミ［−Ａ（クラスＩ［）組織適合性蛋白を精製する方法は 、よく知られており、そしてＴｕｒｋｅｗｉｔｚ、　Ａ、Ｐ、。

ｅｔ　ａｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（１９８３）　２ ０：１１３９−１１４７　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）によ り開示されている。Ｉ−Ａ及び［−Ｅサブ領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎｓ）により エンコードされている単離された抗原は、２つの非共有結合により結合されたペ プチド鎖：３２−３８Ｋｄのα鎖及び２６−２９Ｋｄのβ鎖、から成ることが示 された。第３の、不変の、３１Ｋｄペプチドは、これらの２つのペプチドと非共 有結合により会合されているが、それは、多形態ではなく、そして細胞表面上の 抗原の成分ではないようである（Ｓｅｋａｌｙ、　Ｒ，Ｐ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｅｄ。

（１９８６）　１６４：１４９０−１５０４これを、引用により本明細書中に取 り込む。）。

（Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｔ、前記、　Ｃｈａｐｔｅｒｓ　１６−１８により記載さ れているような）ＭＨＣ遺伝子のクローニングは、以下に記載するように、ＭＨ Ｃサブユニットの容易な操作を可能にする。特に、［−Ａ領域の７つの対立遺伝 子の変異体のα及びβ鎖が、クローン化され、そして配列決定された（Ｅｓｔｅ ｅｓ、　”Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｃ１ｏｎｅｓ”、　ｐｐ、　３−１９）。

本明細書中で使用するとき、用語”単離されたＭＨＣサブユニット成分”は、Ｍ ＨＣ糖蛋白サブユニット（すなわち、Ｍｌ（ＣＩ［のα若しくはβ鎖又はＭＨＣ ［の重鎖）であって、その生来の状態以外にあり、例えば、ＭＨＣを正常に発現 する細胞の細胞膜と会合していないものをいう。この用語は、完全長のサブユニ ット鎖、並びにＭＨＣサブユニットの有効部分を包含する。有効部分は、適当な Ｔ細胞レセプタによる認識のために必要な、抗原結合部位及び配列を含んで成る ものである。それは、典型的には、完全長鎖の配列の、少なくとも約６０−８０ ％、典型的には、９０−９５％を含んで成る。以下に詳細に記載するように、＆ ＋ＨＣサブユニット成分は、適当な細胞源から組換えにより作られ又は可溶化さ れることがてきる。＾ＩＨｃ成分は、インビボにおいて可溶性であるけれども（ すなわち、それらは、インビボにおいて作用するのに十分な溶鮭性を保持してい る。）、それらは、特定の態様において、洗剤と会合してミセルを形成し、又は 脂質と会合してリポソームを形成する。

”成熟”ＡＩＨＣ糖蛋白及びサブユニットの生来の形態がその配列内の１以上の アミノ酸の欠失、置換、及び挿入又は付加によりいくぶん変化するであろうこと は、よく知られている。それ故、＆ｌＨＣサブユニット成分は、実質的に天然の 修飾を受けているが、未だ、それらのそれぞれの活性を保持することができる。

修飾された蛋白鎖は、当業者によく知られ、そして以下に詳細に記載されている 様々な組換えＤＮＡ技術を使用して容易に設計され、そして製造されることもて きる。例えば、鎖は、アミノ酸の置換、付加、欠失、等により、その１次構造レ ベルにおいて天然の配列から変化することかできる。

これらの修飾は、多数の組み合わせにおいて使用され、最終的に修飾された蛋白 鎖を作り出すことができる。

一般的には、ＭＨＣサブユニット成分をエンコードしている遺伝子の修飾は、様 々なよく知られた技術、例えば、部位特異的突然変異８７）を参照のこと、これ を、引用により本明細書中に取り込む。）。当業者は、多くの突然変異の効果が 予言するのが困難であることを理解するであろう。したかって、はとんとの修飾 は、所望の特徴についての好適な検定法における定例的なスクリーニングにより 評価される。例えば、サブユニットの免疫学的特徴は、適当な抗体による競合的 免疫検定により検出されることができる。サブユニットがＴ細胞を活性化する能 力に対しての修飾の効果は、標準的なインヒドロにおける細胞検定法又は以下に 実施例のセクションにおいて記載する方法を使用してテストされることができる 。他の性質、例えば、酸化還元の又は熱的な安定性、疎水性、蛋白分解の受けや すさ、又は凝集傾向についての修飾は、すへて、標準的な技術に従って検定され る。

本発明は、抗原性ペプチド及び／又はＴ細胞レセプタについてのサブユニットの アフィニティーの増加、サブユニットの安定性、精製及び調製の促進を含む、問 題の様々な目的を伴って調製されたＭＭＣサブユニットのアミノ酸配列変異体を 提供する。この修飾されたサブユニットは、血漿半減期を修正し、治療的効果を 改善し、そして本発明の複合体の治療的使用の間の副作用の重さ又は発生を少な くするために、有用である。サブユニットのアミノ酸配列変異体は、普通には、 天然に又は天然の対立遺伝子において見られない所定の変異体である。この変異 体は、典型的には、天然の同族体と同し生物学的活性（例えば、抗原性ペプチド 結合性）を示す。しかしながら、それらのリガンドと結合することができない変 異体及び誘導体は、それてもなお、（ａ）ＭＨＣハブロタイブ又はＭｌ（Ｃに対 する抗体についての診断検定における試薬として、（ｂ）公知の方法に従って不 溶化されるときに、抗血清又はハイブリドーマ培養物の上澄から抗−ＭＭＣ抗体 を精製するために試薬として、そして（Ｃ）少なくとも１つのＭＭＣエピトープ が活性で残る限り、（生来のＭＨＣ／＼プロタイプのための競合的試薬として標 識された、又はＭＨＣ検定のための標準として標識されていない）ＭＨＣに対す る抗体を作るための免疫源として又は免疫検定キットの成分として、有用である 。

本発明の挿入変異体は、１以上のアミノ酸残基がＭＨＣサブユニット内の所定の 部位に導入されており、そして前に存在した残基を置き換えられているものであ る。例えば、挿入変異体は、異種の蛋白又はポリペプチドの、サブユニットのア ミノ又はカルボキシル末端への融合物であることができる。

免疫学的融合物は、インビトロにおける架橋により、又は適当なＭＨＣサブユニ ット遺伝子に結合された免疫原性ポリペプチドをエンコードしているＤＮＡを使 用した組換え細胞培養により、生産される。

これらの免疫原性融合物は、例えば、当業者によく知られた免疫アフィニティー 技術によるＭＨＣの診断又は精製において有用な抗体を作るために、有用である 。

免疫学的に活性であることができ又はそうてないこともできる、他の融合物は、 そのサブユニットと異種のシグナル配列との融合物及びそのサブユニットと強化 された血漿半減期（普通には〉約２０時間）をもつポリペプチド、例えば、免疫 グロブリン鎖又はそれらの断片との融合物を含む（同時係属出願米国逐次番号０ ７／７８３．９３８（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこ と。）。

置換変異体は、少なくともｌの残基が取り除かれ、そしてその場所において異な る残基が挿入されているものである。非天然アミノ酸（すなわち、天然の蛋白に おいては正常には見られないアミノ酸）並びに等配電子（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ） 同族体（アミノ酸又はその他）も、本発明における使用に好適である。

機能又は免疫学的識別性における実質的な変更は、ポリペプチド骨格の構造（例 えば、シート又はヘリカルの立体配置）、標的部位における分子の電荷又は疎水 性、又は側鎖の嵩を維持することに対するそれらの効果において異なる置換残基 を選ぶことにより、行われる。一般的に、機能におけるより大きな変更を作り出 すと予想される置換は、その中で、（ａ）親水性残基、例えば、セリン又はスレ オニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、 バリン又はアラニンと置換されているもの：（ｂ）システィン又はプロリンが他 のいずれかの残基と（又は、により）置換されているもの、（Ｃ）電気的に陽性 の側鎖をもつ残基、例えば、リジン、アルギニン、又はヒスチジンが電気的に陰 性な残基、例えば、グルタミン又はアスパラギン（ａｓｐａｒｔ　１ｎｅ）と（ 又は、により）置換されているもの：又は（ｄ）嵩高い側鎖をもつ残基、例えば 、フェニルアラニンが、側鎖をもたないもの、例えば、グリシンと（又は、によ り）置換されているもの、である。

サブユニットの置換変異体は、他の蛋白の機能的に相同な（少なくとも約７０％ の相同性をもつ）ドメインが１以上のＭＨＣサブユニ・ノドドメインと、定例的 な方法により置換されているところの変異体。

を含む。この目的のために特に好ましい蛋白は、免疫グロブリン・スーパー・フ ァミリーの他のメンバーである。

変異体の他のクラスは、欠失変異体である。欠失は、ＭＨＣサブユニット配列か ら１以上のアミノ酸残基を除去することにより特徴付けされる。典型的には、ト ランスメンブラン及び細胞質のドメインが欠失されている。システィン又は他の 化学変化を起こしゃすい残基も、例えば、ＭＨＣ複合体の酸化安定性を増加させ ることにおいて、望ましいものであることができる。可能性のある蛋白分解部位 、例えば、Ａｒｇ　Ａｒｇの欠失又は置換は、塩基性残基の中の１つを欠失させ 、又はグルタミン残基又はヒスチジン残基によ引つを置換することにより、行わ れる。

好ましいクラスの置換又は欠失変異体は、サブユニツトのトランスメンブラン領 域を含むものを含んで成る。ＭＨＣサブユニ・ノドのトランスメンブラン領域は 、細胞膜の脂質二重層に拡がるための適当なサイズをもつ高く疎水性な又は疎油 性なドメインである。それらは、細胞膜内においてＭｌ（Ｃ分子を繋ぎ止めると 信しられている。

典型的には、トランスメンブラン・ドメインのヒドロキシル化残基の欠失又は置 換による、トランスメンブラン・ドメインの不活性化は、その細胞又は膜の脂質 アフィニティーを減少させ、そしてその水溶性を改善することにより回収及び配 合を容易にするであろう。

あるいは、トランスメンプラン及び細胞質ドメインは、可能性のある免疫原性エ ピトープの導入を避けるために欠失されることができる。膜結合機能の不活性化 は、その部位において実質的に親水性の水治療法プロフィール（ｈｙｄｒｏｐａ ｔｈｙ　ｐｒｏｆｉｌｅ）を作り出すのに十分な残基を欠失させることにより、 又は同一の結果を達成する異種の残基による置換により、行われる。

トランスメンブラン不活性化ＭＨＣの基本的な利点は、それが組換え体宿主の培 養基中に分泌されることができるということである。

この変異体は、体液、例えば、血液中で可溶性であり、そして細胞膜脂質へのは っきりと感知できるほどのアフィニティーをもたず、それ故、組換え細胞培養液 からのその回収をかなり単純化している。

典型的には、本発明のサブユニット変異体は、機能的なトランスメンプラン・ド メインをもたないであろうし、そして好ましくは、機能的な細胞質の配列をもた ないであろう。このような変異体は、ＭＨＣサブユニットの細胞外ドメインの有 効部分から本質的に成るであろう。ある情況においては、サブユニットは、溶解 性が存意に影響されない限り、（約ＩＯアミノ酸までの）トランスメンブラン領 域からの配列を含んで成る。

例えば、トランスメンブラン・ドメインを、いずれかのアミノ酸配列、例えば、 ５〜５０のセリン、トレオニン、リシン、アルギニン、グルタミン、アルバラギ ン酸、等の親水性残基のランダムな又は所定の配列であって一緒になって親水性 の水治療法プロフィールを示すものにより、置換することかできる。欠失された （切り詰められた）サブユニットのように、これらの変異体は、組換え宿主の培 養基中に分泌される。

グリコジル化変異体（Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｖａｒｉａｎｔｓ）は、本 発明の範囲内に含まれる。それらは、グリコジル化を完全に欠いている（非グリ コツル化）変異体及び少なくともｌの生来の形態よりもより少なくグリコジル化 された（脱グリコジル化）部位をもつ変異体並びにその中でグリコジル化が変更 されているところの変異体を、含む。

生来の非修飾アミノ酸配列をもつ脱グリコジル化（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ ｄ）及び非グリフノル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）サブユニットが、含 まれる。

例えば、置換又は欠失突然変異が、サブユニットのＮ−若しくは膜結合グリコジ ル化部位を除去するために使用され、例えば、アスパラギン残基が、欠失され、 又は他の塩基性残基、例えば、リジン又はヒスチジンと置換される。あるいは、 グリコジル化部位を作り上げるフランキング残基が、置換又は欠失される。但し 、そのアスパラギン残基は、そのグリコジル化認識部位を除去することによりグ リコジル化を防止するために、変更されない。さらに、生来のサブユニットのア ミノ酸配列をもつ非グリコジル化サブユニットが、組換え原核細胞培養において 作られる。なぜなら、原核生物は、グリコジル化をポリペプチド中に導入するこ とができないからである。

グリコジル化変異体は、便利には、適当な宿主細胞を選ぶことにより又はインビ トロにおける方法により、作られる。例えば、酵母は、哺乳類の系のものからか なり変化したグリコジル化を導入する。

同様に、ＭＨＣ源から、異なる種（例えば、ハムスター、ネズミ、昆虫、ブタ、 ウシ又はヒツジ）又は組織起源（例えば、肺、肝臓、リンパの、間充織の（ｍｅ ｓｅｎｃｈｙｍａ　ｌ）又は表皮の（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ））をもツ唾乳類細胞 が、例えば、増加したレヘルのマンノース又は増加した割合のマンノース、フコ ース（ｆｕｃｏｓｅ）、ンアル酸、並びに哺乳類の糖蛋白において典型的に見ら れる他の糖により特徴付けされるようなグリコジル化を変異体に導入する能力に ついて、定例的にスクリーニングされる。サブユニットのインビトロにおけるプ ロセシングは、酵素による加水分解、例えば、ニューラミニダーゼ（ｎｅｕｒａ ｍｉｎｉｄａｓｅ）消化により行われる。

本発明における使用に好適な＆ＩＨＣ糖蛋白は、パパインによる処理による、３ ！Ｊ　ＫＣＩによる処理による、及び洗剤による処理による、可溶化を含む様々 な技術を使用して多様な細胞から単離されている。

好ましい方法においては、リンパ球からのクラスＩＩ蛋白の洗剤抽出、その後の アフィニティー精製を使用する。次に、洗剤を、透析又は選択的結合ビーズ、例 えば、Ｂｉｏ　Ｂｅａｄｓにより、除去することができる。この分子を、ＭＨＣ 含有細胞のいずれかから、例えば、標的化された自己免疫疾患を患う個体からの Ｂリンパ球から単離することにより、得ることができる。特に、好適なＭＨＣ分 子を、本分野において知られた技術を使用して、複製不全Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａ ｒｒウィルスによる形質転換により不朽化されたＢ細胞から、単離することがで きる。

単離されたＭＨＣ糖蛋白からの個々のサブユニットの単離は、当業者に知られた 標準的な技術を使用して容易に達成される。例えば、クラス［分子の場合におい ては、重鎮を、５ＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離し、そしてゲルからその重鎮を 電気溶出させる（例えば、Ｄｏｒｎｍａｉｒｅｔ　ａｌ、、煎Ｅ及びＨｕｎｋａ ｐｉｌｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、９ １：２２７−２３６（１９８３）　（これを、引用により本明細書中に取り込む 。））。

ＭＨＣＩ＋分子からのα及びβサブユニットの分離物も、以下に記載し、１６（ ＋９８９）（これを、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されたよう な、５ＤＳ−ＰＡＧＥその後の電気溶出を使用して、単離する。

当業者は、分子を分離する多数に他の標準的方法、例えば、イオン交換クロマト グラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又はアフィニティー・クロマトグラ フィーを、使用することができるということを認めるであろう。

あるいは、多数のクラスＩｔ蛋白のアミノ酸配列か知られており、そしてその遺 伝子がクローン化されたきた。それ故、サブユニットを、組換え法を使用して作 ることができる。これらの技術は、本発明のＭＨＣサブユニットの多数の修飾を 可能にする。例えば、組換え技術は、疎水性のトランスメンブラン・ドメインを 欠失させるカルボキシ末端の切り詰めのための方法を提供する。また、このカル ボキン末端は、例えば、その分子中にンステイン及び／又はリジン残基を導入す ることにより、毒素又は標識の結合を容易にするように任意に選ばれることがで きる。合成遺伝子は、典型的には、発現ベクターへの挿入及び遺伝子配列の操作 を援助する制限部位を含むであろう。適当なサブユニットをエンコードしている 遺伝子を、次に、発現ベクターに挿入し、適当な宿主、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）、酵母、又は他の好適な細胞の中で発現させ、そしてその組換え蛋白を 得る。

遺伝子の利用可能性は、その配列の手早い操作を可能にするので、好ましい構築 物の第二世代は、図２中に例示するような、ハイブリッドのクラス［及びクラス ＩＩの特徴を含む。ここで、クラス［［ＭＨＣのα１及びβ１　ドメインは、端 から端までのβ−シートの接触をもたらすこれらのドメイン間の分子間ダイマー 化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔ　１ｏｎ）を許容する柔軟性の部分を通して結合されて いる。次に、β、上セグメント、その複合体を安定化するために同時発現された β、マイクログロブリンを持つクラス］のα２　ドメインに融合される。クラス ］遺伝子のトランスメンプラン及び細胞間ドメインが含まれることもてきるが、 リポソームが複合体を透過させるために使用されない場合には、そのようなこと を行うことにおける点は存在することができない。より単純な変異体は、毒素結 合のためのＣ−末端をもつα１及びβ１　ドメインのみを含む（図２）。

適当なりＮＡ配列からの発現ベクター及び組換え体の構築は、本分野において知 られた方法により、行われる。ＤＮＡ及びＲＮＡ単離、増幅、及びクローニング のために、標準的な技術を使用する。一般的に、ＤＮＡ　リガー七、ＤＮＡポリ メラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、等を含む酵素反応か、製造者の指示に従っ て行われる。これらの技術及び様々な他の技術が、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 　ｅｔ　ａｌ、、　ＡｌｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ　１ａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９　（ これを、引用により本明細書中に取り込む。）に従って、行われる。他の一般的 な文献を、本書類にわたり提供する。その中ての手順は、本技術分野においてよ く知られていると信じられており、そして読者の便宜のために提供されている。

発現は、原核生物又は真核生物の系において在ることができる。

原核生物は、しばしば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の様々な株により代表される。

しかしながら、他の微生物株、例えば、バチルス（ｂａｃｉｌｌｉ）、すること かできる。このような原核生物系では、宿主と適合性のある種から得られた複製 部位及び制御配列を含むプラスミドベクターを使用する。例えば、大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）は、典型的には、Ｉ）ＢＲ３２２、すなわち、Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ（１９７７）２：９５により大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）種か ら得られたプラスミド、の誘導体を使用して、形質転換される。

一般的に使用されるものは、原核生物の制御配列であって、本明細書中で、転写 開始のためのプロモーターを、場合によりオペレーターを伴って、リポソーム結 合部位配列と一緒になって、含むように定められ、これらは、β−ラクタマーゼ （ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（＋９７７）１９８：１０５６）及びトリプト ファン（ｔｒｐ）ブ０−Ｅ−−ター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８０）８：４０５７）及びラムダ誘導体Ｐ 、プロモーター及びＮ−遺伝子リホソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）２９２・１２８）のような一般的に使 用されるプロモーターを含む。

原核生物と適合性のいずれかの入手可能なプロモーター系を、使用することがで きる。前記又は下記のいずれかで本明細書中に引用するすへての文献を、ここで 、引用により本明細書中に取り込む。

真核生物宿主において有用な発現系は、適当な真核生物遺伝子から得られたプロ モーターを含んで成る。酵母において有用なプロモーターのクラスは、例えば、 ３−ホスホグリセレート・キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８０）２５５：２０７３）のためのプロモ ーターを含む、解糖酵素の合成のためのプロモーターを含む。他のプロモーター は、エノラーゼ（ｅｎｏｌａｓｅ）遺伝子（Ｈｏｌｌａｎｄ、　Ｍ、Ｊ、、　ｅ ｔａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８１）２５６：１３８５）又 はＹＥｐ１３から得られたＬｅｕ２遺伝子（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｇｅｎｅ（＋９７８）８：１２１）からのものを含む。

好適な哺乳類プロモーターは、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター（Ｆｉ ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）２７３：１１３）又は他 のウィルス・プロモーター、例えば、ポリオーマ（ｐｏｌｙｏｍａ）　、アデノ ウィルス１■、ウシ乳頭腫ウィルス又はトリ肉腫ウィルスから得られたものを含 む。

好適なウィルス及び哺乳類のエンハンサ−は、先に引用されている。

発現系を、本分野においてよく理解されている標準的なリゲーション及び制限技 術を使用した標準法を使用してＭＨＣ配列に作用可能な状態で結合されている先 の制御要素から構築する。圭離したプラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成オリゴヌ クレオチドを、解裂させ、あつらえ、そして必要な形態に再すゲートする。

部位特異的ＤＮＡ解裂を、本分野において一般的に理解され、その中の特定のも のが製造者により特定されている条件下での好適な制限酵素（又は複数の酵素） 又はこれらの商業的に入手可能な制限酵素による処理により行う。例えば、Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　ＰｒｏｄｕｃｔＣａｔａｌｏｇを参照 のこと。一般的に、約ｌμｇのプラスミド又はＤＮＡ配列を約２０μｍのバッフ ァー溶液中の１ユニツトの酵素により解裂させ３本明細書中の実施例においては 、典型的には、過剰の制限酵素を、ＤＮＡ基質の完全消化を確保するために使用 する。約３７°Ｃにおける約１時間〜２時間のインキュベーション時間が、実行 できる。

但し、変化が許容されることができる。それぞれのインキュベーションの後、蛋 白を、フェノール／クロロホルムによる抽出により取り出し、そしてエーテル抽 出をその後の行うことかでき、そして核酸を、エタノールによる前沈降、その後 の５ｈｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピン・カラム上を走らせることにより水面分 から回収する。所望にいより、解裂断片のサイズ分離を、標準的な技術を使用し てポリアクリルアミド・ゲル又はアガロース・ゲル電気泳動により行うことがで きる。

サイズ分離の一般的な記載は、＆Ｉｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 　（１９８０）６５：４９９−５６０中に見られる。

制限解裂断片を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，６，５０ｍ＆Ｉ　ＮａＣｌ　、 ６ｍＭ＾ＩｇＣＩ、、６ｍＭ　ＤＴＴ及び５−１０μＭ　ｄＮＴＰｓ中で２０〜 ２５°Ｃにおいて約１５〜２５分間のインキュベーション時間を使用して４デオ キシヌクレオチド・とり１（Ｋｌｅｎｏｗ）の大きな断片による処理によりプラ ント末端化することかできる。このフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片は、５゛付着 末端をフィルインするが、４つのｄＮＴＰｓが存在するにもかがわらず、突き出 した３゛単一ストランドを、チューハック（ｃｈｅｗｓ　ｂａｃｋ）する。所望 により、選択的修復を、その付着末端の性質により命じられた制限内でｄＮＴＰ ｓの中の１つのみ、又は選択されたｄＮＴＰｓを供給するりことにより、行うこ とができる。フレノウによる処理後、混合物を、フェノール／クロロホルムによ り抽出し、そしてエタノール沈降、その後の５ｈｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピ ン・カラム上で走らせる。

合成オリゴヌクレオチドを、商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成装 置を使用して合成する。アニーリングに先立つ又は標識付けのための一本鎖のキ ナーゼ処理を、過剰の、例えば、０．１ｎｍｏｌｅの基質に対して約１ユニツト のポリヌクレオチド・キナーゼを使用して、５０ｎｔｌ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，６ ，１０ｍ！Ｊ　ＭｇＣ１２，５ｍ１Ｊジチオトレイトール、ｌ−２ｍＭ　ＡＴＰ 　、　１．．７μｍｏｌｅ　”　Ｐ−ＡＴＰ（２，９ｍＣ１／ｍｍｏｌｅ）　、 ０．　［ｍＭスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄ　１ｎｅ）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ の存在中で、行う。

リゲーンヨンを、以下の標準条件及び処理・２０ｎｔｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ Ｈ７゜５．１０ｍＭ　ｈｌｇｃｌ　２　、　ｌ０ｍＭ　ＤＴＴ　、　３３μｇ／ ｍｌ　ＢＳＡ、　１０ｍＭ−５０ｍＭ　ＮａＣｌ、及び０°Ｃにおける４０μＭ 　ＡＴＰ　、０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）−ＬニットＴ４　ＤＮＡリガー ゼ（゛付着末端“リゲーンヨンのためのもの）又は１４°ＣにおけるＩｎｔｌ　 ＡＴＰ　、０．３−０．６（ＷｅｉＳｓ）−Ｌ−：　ットＴ４　ＤＮＡリガーゼ （“プラント末端°リゲーノヨンのためのもの）のいずれか、の下、１５−３０ μｌ容量中で行う。分子間の゛付着末端′リゲーションは、普通には、３３−１ ００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５−１００ｎＭ全末端濃度）において行われる 。

分子間のプラント末端リゲーション（普通には、１０〜３０倍のモルの過剰のリ ンカ−を使用して）は、１μ八１の全末端濃度において行われる。

“ベクター断片−を使用したベクター構築においては、ベクター断片は、一般的 には、５′ホスフエートを除去し、そしてそのベクターの再すゲーションを防止 するために、バクテリア・アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）により処理され る。ＢＡＰ消化は、約１時間６０″Ｃにおいてベクターμｇ当たり約１ユニツト のＢＡＰを使用してＮａ”及びＭｇ２−の存在中、やり＜　１５０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ中で、ｐＨ８において、行われる。

核酸断片を回収するために、調製物を、フェノール／クロロホルムにより抽出し 、そしてエタノール沈降させ、そして５ｈｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピン・カ ラムへの適用により脱塩する。あるいは、再すゲーションを、不所望の断片の追 加の制限酵素消化により二重消化されたベクターにおいて防止することができる 。

配列修飾が要求されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから得られたベクターの部分の ために、部位特異的プライマー特異的突然変異誘発を、使用することができる。

これは、限定されたミスマツチングを除き突然変異されるへき一重鎖ファージＤ ＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを使用して行われ、所望の突 然変異を現す。簡単に言えば、合成オリゴヌクレオチドを、プライマーとして使 用し、ファージに相補的なストランドの合成に向け、そして得られた二本鎖ＤＮ Ａを、ファージ支持宿主バクテリア中に形質転換させる。形質転換されたバクテ リアの培養物を、トップ寒天内にブレーティングし、ファージを宿している単一 細胞からのプラーク形成を可能にさせる。

理論的には、新たなプラークの５０％が、単一ストランドとして突然変異形態を もつファージを含むであろうし１５０％は、元の配列をもってあろう。得られた プラークを、正確なマツチ（ｍａｔｃｈ）のハイブリダイゼーションを許容する が、その温度においては、元のストランドによるミスマツチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｅｓ）かハイブリダイゼーションを防ぐのに充分であるような温度において、キ ナーゼ処理合成プライマーとハイブリダイズさせる。このプローブとハイブリダ イズするプラークを、次に、拾い上げ、培養し、そしてＤＮＡを回収する。

しかしながら、本発明の蛋白においては、合成遺伝子を、便利には使用する。こ の遺伝子のデザインは、これらのエンコード同族体んいよりコード配列部分を置 き換えるための遺伝子の容易な操作を可能にする制限部位を含むことができる。

プラスミド構築のための二のリゲーション混合物により、最初に形質転換させる ことにより確保されることができる。成功した形質転換細胞は、アンピシリン、 テトラサイクリン又は他の抗生物質耐性により、又は本分野において理解されて いるような、プラスミド構築のモードに依存した他のマーカーを使用することに より、選択される。形質転換細胞からのプラスミドを、次に、Ｃｌｅｗｅ１１． 　Ｄ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９６９）　６２：１１５９に従って、場合により、クロラ ムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅ１１．　Ｄ、Ｂ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ、　（１９７２）１１０：６６７）に従って、調製する。単離したＤＮＡを、 制限酵素処理により分析し、及び／又はＳａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９７７）７４ ：５４６３のジブオキソ法により、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ配列決定する。

構築したベクターを、次に、蛋白の生産のために好適な宿主中に形質転換させる 。使用する宿主に依存して、形質転換を、そのような細胞に適当な標準技術を使 用して行う。Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ塩化力ウソラムを 使用するカルシウム処理、又はＭａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　＆Ｉａｎｕａｌ　（ １９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、　２ ５４中に記載されているＲｂＣｌ法を、実質的な細胞壁バリアを含む原核生物又 は他の細胞のために使用する。このような細胞壁をもたない哺乳類細胞のために は、Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　ＶｉｒｏｌｏｇＹ　（１ ９７８）　５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿法又ハエレクトロボレーション が、好ましい。酵母への形質転換は、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇ形質転換した細胞を 、次に、ＭＨＣ配列の発現に好都合である条件下で培養し、そしてその組換えに より作られた蛋白をその培養液から回収する。

抗原性ペプチド 多数の有害な免疫応答のための抗原性蛋白又は組織が知られている。例えば、実 験的に誘導された自己免疫疾患においては、病因に関連する抗原が特徴付けされ ている　ラット及びマウスにおける関節炎においては、生来のタイプ−ＩＩコラ ーゲンがコラーゲン誘導関節炎において同定されており、そしてアジュバント関 節炎において微生物熱シヨツク蛋白が同定されており（Ｓｔｕａｒｔ　ｅｔ　ａ ｔ、、　（１９８４）。

ける実験的アレルギー性甲状腺炎（ＦＡＴ）において同定されており（＾１ａｒ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（＋９８８）、　Ｊ、　ＥＸＰ、　Ｍｅｄ、　＋５２：１ １１５−１１２０）：実験的アレルギー性重症筋無力症（ＥＡ＾ＩＧ）における アセチル・コリン・レセプタ（Ａマウス及びラットにおける実験的アレルギー性 脳を髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌ。

ｍｙｅｌ山５（ＥＡｊ））におけるミニリン塩基性蛋白（ＭＢＰ）おおよびプロ テオリピト蛋白（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＬＰ））（Ａｃ ｈａ−Ｏｒｂｅａ　ｅｔ　ａｌ、、前記を参照のこと）。さらに、例えば、襟的 抗原がヒトにおいて同定されている・ヒト・リウマチ様関節炎におけるタイプ− ］Ｉコラーゲン（Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）、　Ｌａｎ ｃｅｔ　比３０５−３０９）：及び重症筋無力症におけるアセチル・コリン・レ セプタ（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、前記）、これらの すへてを、本明細書中に引用により取り込む。

抗原表象細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ（ＡＰＣｓ ））の表面上のＭＨＣ糖蛋白による抗原の表象は、抗原性蛋白のより小さなペプ チド・ユニットへの加水分解に続いて起こると信じられている。抗原性蛋白内の これらのより小さなセグメントの位置は、経験的に決定されることができる。こ れらのセグメントは、長さ約８−２ｏ残基であると考えられており、そして（＆ ｌＨＣ分子により認識された）アレルー性（ａｇｒｅｔｏｐｅ）と（Ｔ細胞上の Ｔ細胞レセプタにより認識された）エピトープとの両方を含むと考えられている 。このエピトープは、抗原特異的Ｔ細胞レセプタを認識する５−６アミノ酸の連 続又は非連続配列である。このアレルー性は、ＭＨＣ糖蛋白とのペプチドの会合 の原因である連続又は非連続配列である。

関連の８−１５アミノ酸サブユニツトを決定する経験的な方法は、骨格筋のアセ チルコリン・レセプタのαサブユニットを使用して説明されている。重症筋無力 症（ＭＧ）においては、自己免疫応答が、このサブユニットの領域に向けられて いる。神経と筋肉の接合のシナプス後（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔ　ｉｃ）膜上のア セチルコリンの損失は、＆ＩＧ兆候を引き起こす。

＾ＩＧにおいては、アセチルコリン・レセプタ（ＡＣｈｌ？）のαサブユニット に対する自己抗体が、ＡＣｈＲに向けられた自己免疫応答と関係している。＾ｆ Ｇ患者の８５パーセントがαサブユニットと反応する自己抗体をもっている。こ れらの中では、６０％が、残基６ｏと８０との間に配置された主要免疫原＠［（ 酊ｆＲ）といわれるαサブユニットのペプチド・セグメントと結合する抗体をも っている（Ｔｚａｒｔｏｓ　ａｎｄ　Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＣ１９８０）７７：７ ５５）。自己反応性ヒトＴ細胞により認識されるペプチド・セグメントも、この αサブユニット上に位置する（ｔ（ｏｈｆｉｅｌｄ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒａ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ（１９８７）。これらのＴ 細胞により認識されるエピトープは、残基１−３０．１２５−１４７　、１６９ −１８１　、２５７−２７１及び３５１−３６８の闇に横たわる。さらに、ヒト においては、ＡＣｈＲペプチド１９５−２１２及び２５７−２６９が、それぞれ 、ＨＬＡ−１）Ｉ’？５及びＮＬＡ−１）Ｒ３、ＤＱＷ２＾ｆＨｃハブロタイブ の重症筋無力症患者において、エピトープとして部分的に特徴付けされている（ Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ　（＋９８９）、前記を参照のこと。）。

このレセプタのαサブユニットと会合するエピトープの表象を可能にするアレル ー性を担持するペプチドは、容易に決定される。

例えば、マウス・モデルにおける適当なペプチドの決定は、以下のように行われ る。シビレエイ（Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）のＡＣｈＲによ り免疫化されたとき、ヒト重症筋無力症の多くの特徴を伴った病気に発展するマ ウスの株か、モデルとして使用される。ＭＨＣクラス１１糖蛋白か、レクチン及 びモノクロナール抗体のアフィニティー支持体を使用してこの株のマウスの膵臓 細胞から単離される。精製された＾（ＨＣクラス１１蛋白は、洗剤透析によりリ ン脂質小胞中に取り込まれる。得られた小胞は、次に、それぞれの平面上にＭＨ Ｃ分子を含む脂質二重層を作るために、きれいなガラス・カバーガラス（ｃｏｖ ｅｒ　ｓｌｉむ。））。

二の癒着性平面脂質膜内に埋め込まれたＭＨＣクラス【１分子を含む１つのカバ ーガラスを、いくつかの２４−ｗｅｌ　ｌ培養プレートのそれぞれのｗｅｌｌ内 に入れた。αサブユニット配列に対応した２０−残基の合成ペプチドが重複し、 そして（以下に記載するように調製した）１以上の放射ラベルされたアミノ酸残 基を含む約４０の中の１のそれぞれを、カバーガラス及びＰＢＳを含むｗｅｌｌ 内に入れ、そして数日間インキュベートする。＾Ｉ）ＩＣ２９７１１ｗ１蛋白抗 原結合部位内におけるペプチドの結合の程度を、平面脂質膜単独に対する、カバ ーガラス上のＡＩＨＣクラス１１一平面脂質膜へ取り込まれた放射能の量により 、測定する。放射能の特異的な取り込みは、結合したペプチドが平面脂質膜内に 存在するＡＩＨＣクラス目分子のいくつかの種の中の１つのアレルー性（ＭＨＣ クラス１１ペプチド結合部位）を含むことを示している。

この方法で、ＡＣｈＲのαサブユニットのためのアレルー性のセットを、ＡｆＪ Ｒ又は精製αサブユニットによる免疫化の間にＭＧの兆候を示すマウス株につい て定めた。

次に、アレルー性を含むαサブユニット合成ペプチド・セグメントのそれぞれを 、再び、カバーガラス上の平面脂質膜内に埋め込まれた単離されたλＩＨＣクラ ス１１蛋白の抗原結合部位に、取り込む。

１つのカバーガラスを、２４−ｗｅｌｌの培養プレートのそれぞれのｗｅｌｌに 添加し、そしてＡＣｈＲに対して免疫化されたマウスからの膵臓細胞（そしてそ の株から、癒着性＆ＩＨＣクラスＩＩ蛋白が単離された。）を、照射された同系 （ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）抗原表象細胞と一緒に、それぞれのｗｅｌｌに添加する 。増殖により測定されるような、Ｔ細胞の活性化は、ＭＨＣクラスＩＩ蛋白−結 合ペプチドが、Ｔ細胞への結合のためのアレルー性とエピトープの両方を含むこ とを示している。また、Ｔ細胞の活性化は、リンホカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−３ ）生産を測定することにより測定されている（Ｑｕｉｌｌ　ｅｔ　ａｔ、、前記 を参照のこと。）。

速い多数のペプチド合成（ｒａｐｉｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＲＡ＆ＩＰＳ））のためのＤｕｐｏｎの装置及び技術を、シ ビレエイ（Ｔｏｒｐｅｄｏ　ｃａｔｉｆｏｒｎｉｃｕｓ）ＡＣｈＲのαサブユニ ットからの、多数の重複した（１０残基重複）、２叶残基ペプチドを合成するた めに、使用する。このペプチドの配列は、公知てあり、そして図３中に示されて いる。１以上の放射性アミノ酸を、それぞれの合成ペプチド中に取り込む。側鎖 を保護されたＦＮＩＯＣアミノ酸のペンタフルオロフェニル活性エステルを、標 準的な段階的固相ペプチド合成法、その後の標準的な側鎖の脱保護及び固体支持 体からのペプチド・アミドの同時脱離を適用しながら、ペプチドを合成するため に使用する。

あるいは、抗原性蛋白、例えば、アセチルコリン・レセプタ蛋白の８−１５アミ ノ酸の推定セグメントを含む重複配列を、Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｈ，Ｍ、。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈ、　（１９８７）　１０２：２７ ４（これを、引用により本明細書中に取り込む。）の方法により合成することか てきる。この合成した放射標識されたペプチドを、上記のような脂質膜二重層中 に配合された精製＆ｌＨＣ蛋白と共に、それらを別々に（プレート上で）インキ ュベートすることにより、テストする。

中枢神経系内のミニリン鞘の破壊をもたらす多発性硬化症（ＭＳ）においては、 ミニリン塩基性蛋白（ｋｌＢＰ）　、すなわち、ミニリンの主要蛋白成分か、基 本的な自己抗原である。また、ＭＢＰ蛋白の直接関係のあるセグメントも。ウシ ・ミニリン塩基性蛋白により免疫化されるときに実験的アレルギー性脳炎（ｅｎ ｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）に発展するマウスの株を使用して、経験的に測定される 。＾ＩＢＰの配列を、図４中に示す。

全身性紅斑性狼癒（ＳＬＥ）は、複雑なｓｙｓｔｅｍｏ＋ｏｇｙをもつか、赤血 球細胞を含むいくつかの組織への自己免疫応答を原因としている。

この疾患の抗原エフェクターであるペプチドが、例えば、赤血球細胞の表面上の 蛋白内において見つかっている。

リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ　ｆｌｕｉｄ）内で見つ かった蛋白に対する免疫応答から生しる慢性炎症疾患である。

インシュリン−依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インシュリンの分泌に責任を 負うランゲルハンス島内のβ細胞に対する自己免疫攻撃から生じる。島細胞表面 抗原への、そしてインツユリンへの抗体の循環は、［ＤＤＭに先行することが知 られている。ＩＤＤＡ［における免疫応答を顕在化させることにおいて決定的な ペプチドは、β細胞膜表面蛋白の部分であると信じられている。

関連する抗原性ペプチド・サブユニットは、それらが比較的短いので、ペプチド 合成のための標準的な自動法を使用して容易に合成されることができる。他方に おいて、それらは、単離された又は合成のＤＮＡ配列を使用して組換えにより作 られることができる。しがしながら、これは、この長さのペプチドのために最も 有効なアプローチではない。

したがって、要約すれば、１セツトの標識テスト・ペプチドが、調製され、そし てＭＨＣ蛋白を含む平面脂質膜内のＵＨＣに結合するものが、アイソトープを含 むことが示されている。

同定されたペプチドを、次に、慣用の固相合成により合成し、そして疾患誘導ヘ ルパーＴ′ｍ胞クローンのためのエピトープを含むサブセットを、その候補ペプ チドを、抗原表象細胞（ＡＰＣ）　（又は単離された＾］ＨＣ複合体）及び完全 長蛋白により免疫化された＃臓又はリンパ節Ｔ細胞と共にインキュベートするこ とにより決定する。成功した候補は、この系においてＴ細胞の増殖を刺激するで あろう。二の第二のより小さなサブセットは、好適なペプチド成分を現す。

エフェクター成分 １つの態様においては、本発明の複合体は、問題のペプチドに対する免疫応答を 破壊するように設計される。この場合においては、分子のエフェクタ一部分は、 例えば、毒素、化学療法剤、細胞毒性Ｔ細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、 又は゛透過能の大きい（ｈａｒｄ）”例えば、β照射を放射するラジオアイソト ープであろう。例えば、多数の蛋白毒素が本分野においてよく知られており、こ れらは、リノン（ｒｉｃｉｎ）　、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ゲロ ニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ツユ−トモナス毒素、及びアブリン（ａｂｒｉｎ）を 含む。化学療法剤は、例えば、ドクソルヒシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）　、 ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏ ｔｒｅｘａｔｅ）、細胞毒素、及びアンチセンスＲＮＡを含む。抗生物質を使用 することもできる。さらに、ラジオアイソトープ、例えば、イツトリウム−９０ 、リン−３２、鉛−２１２、ヨウ素−１３１、又はバランラム−１０９を使用す ることができる。放射された照射は、憚的Ｔ細胞を破壊する。

ある場合においては、毒素又は他のエフェクター成分が、デリバリ−系、例えば 、リポソーム又はデキストラン担体内に包まれ、このような場合には、活性成分 又は担体のいずれかが複合体内で結合されることができる。

また、エフェクター成分は、標識付は部分であることもできる。

本発明の標識複合体を、様々なインビボ又はインビトロにおける用途にいおいて 使用することかできる。これらの目的のいずれかのために、複合体を、直接に標 識付けすることができる。多種多様な標識、例えば、放射ヌクレオチド（例えば 、γ−照射ラうオアイノトーブ、例えば、テクネチウム−９９又はインジウム− ＩＩ＋）　、蛍光剤（例えば、フルオレセイン）、酵素、酵素基質、酵素補因子 、酵素阻害剤、化学発光化合物、生物発光化合物、等を、使用することかてきる 。当業者は、複合体に結合する他の好適な標識を知るであろうし、又は定例的な 実験を使用してこのことを確認することができるであろう。これらの標識の結合 は、当業者には一般的な標準技術を使用して行われる。

インビトロにおける使用は、診断用途、Ｔ細胞のタイプ分け、特異的細胞の単離 又は標識付け、等を含む。例えば、本発明の複合体を、ＭＨＣ−Ｔ細胞の相互作 用の可能性のある阻害剤について検定するために使用することができる。可能性 のある阻害剤は、先に記載したマイクロフィジオメーター装置内で、本発明の複 合体の、Ｔ細胞への結合を阻害する能力を検定するために使用されることができ る。

インビボにおける診断的画像形成のために、ラジオアイソトープが、典型的には 、よく知られた技術に従って使用される。このラジオアイソトープは、本特許出 願の出願時に当業者によく知られた中間体官能基を使用して、直接的又は間接的 にのいずれかにより、本蛋白に結合されることかできる。例えば、キレート剤、 例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミンテ トラ酢酸（ＥＤＴＡ）並びに類似の分子が、金属イオン・ラジオアイソトープに 蛋白を結合させるために使用されてきた。

また、本複合体を、磁気共鳴画像形成（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ 　ｉｍａｇｉｎｇ（ＭＲ［））又は電子スピン共鳴（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　５ｐｉ ｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＥＳＲ））（これらの両方が、本特許出願の出願時に 当業者によく知られたていた。）におけるような、インビボにおける診断の目的 のために、常磁性アイソトープにより標識することもできる。例えば、これらの 及び関連の技術は、リウマチ疾患の診断において使用されてきた（Ｎａｍｅｙ、 　ｉｎ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、　Ｋｅｌｌｅｙ 　ｅｔ　ａｔ　（ｅｄｓ、）　５ａｕｎｄｅｒｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ 、１９８５．（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。） 。一般的には、診断的画像形成の可視化のだめのいずれかの慣用法を、使用する ことができる。普通には、ガンマ−及びポジトロン−照射ラジオアイソトープを 、カメラの画像形成のために使用し、そして常磁性アイソトープを、ＭＲＩのた めに使用する。したがって、本発明の複合体を、個体における自己免疫応答の改 善の経過を監視するために使用することができる。探的Ｔ細胞の数における増加 又は減少を計測するために、自己免疫疾患の改善を目的とした特定の治療的養生 法が有効であるかどうかを決定することができる。

このエフェクター成分は、ＭＨＣサブユニットに、又はその性質が好適である場 合には、ペプチド部分に付着されることができる。例えば、ヨウ素−１３１又は 他のラジオアイソトープ標識は、しばしば、そのペプチドの決定基の配列内に含 まれることができる。このエフェクター成分を、複合体に付着させる方法を、以 下に詳細に記載する。

複合体の形成 本複合体の要素を、本分野において知られた標準的な手段により会合させること ができる。抗原性ペプチドは、例えば、２つの成分を混合することにより、ＭＭ Ｃサブユニットの抗原結合部位と非共有結合的に会合することかできる。また、 それらは、標準的な手順を使用して、例えば、フォト・アフィニティー探識付け （ｐｈｏｔｏ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）（例えば、Ｈａｌｌ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４：５７０２−５７ＩＩ　（１ ９８５）　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）に より、共存結合的に結合されることができる。この方法は、ペプチド内の抗原を 抗原結合ポケットに共有結合させることにおいて有効であることか先に示されて いる。例えば、Ｌｅｕｓｃｈｅｒ　ｅａｌ、、　Ｃ旦１．５９：２４７−２５５ （＋９８９）　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

結合の他の方法は、当業者に明らがであり、そして例えば、糖蛋白上のカルボヒ トレート基であって、例えば、α−及び／又はβ−鎖のカルボヒトレート部分を 含むものを介しての結合を含むことができる。

蛋白エフェクター成分は、カルボジイミドを使用した標準的な脱水反応により、 聞Ｃサブユニット又はペプチドに結合されることができる。ヘテロの２官能基の リンカ−１例えば、５ＰＤＰ、グルタルアルデヒド等を使用することもできる。

複合体を調製する配列は、それぞおれの場合においてその成分に依存する。例え ば、特定の手順においては、ペプチド部分及びＭＨＣサブユニット成分は、その ペプチドをＭＨＣサブユニット成分と、例えば、混合により接触させることによ り、非共有結合的に会合させる。次に、このエフェクターを、所望により、商業 的に入手可能なリンカ−１例えば、５ＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ）を使用して、ＭＨＣに共有結合的に結合させる。あるいは、エフェクターと ＭＨＣサブユニットを、脱水反応を使用して第一結合させ、そしてその結合体を 、ペプチド成分と複合体形成させることができる。

エフェクターがそｎ自体、蛋白である場合には、完全な複合体が、組換え法を使 用してＤＮＡを適当なエンコードＤＮＡから直接的に作られることができる。例 えば、ＡＣｈＲペプチド＋９５−２１５であってヒト及びマウスにおいてＲＩＧ 内のエピトープとして特徴付けされているものを、ＭＧと会合した＆ＩＨＣ抗原 から得られたポリペプチドのＮ−末端の抗原結合部位に結合することができる。

１文字アミノ酸コードにおけるＡＣｈＲペプチドのアミノ酸配列は：ＤＴＰＹＬ Ｄ　［ＴＹＨＦ　Ｉ九ＩＱＲＩＰＬＹＦＶである。ペプチドをエンコードしてい るオリゴヌクレオチドは、アミノ酸のための公知のコドンを使用して合成され、 好ましくは、使用されるへき生物において好ましい用途をもつようなコドンが、 オリゴヌクレオチドの設計において使用される。様々な生物及び細胞のタイプの ために好ましいコドンの使用は、本分野において公知である。例えば、発現が、 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）におけるものである場合には、ＡＣｈＲ１９５−２ １５をエンコードしている好適なオリゴヌクレオチド配列は ５’　ＧＡＣＡＣＣＣＣＧ　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＴ ＴＣＡＴＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＡＴＣＣＣＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＴｉｃ　Ｃ ＴＧ　３゜であることができた。この配列は、次に、本分野において知られた技 術を使用して、ＭＨＣ抗原から得られたサブユニットをエンフートしている配列 中に、（ペプチド・ループ領域をエンコードしている配列を伴って又は伴わずに ）取り込まれることができる。この取り込み部位は、サブユニットが発現され、 そして折り畳まれたとき、ＡＣｈＲペプチド抗原が標的Ｔ細胞のためのエピトー プとして利用できるであろうようなものである。

１つの手順においては、ＡｃｈＲ１９５−２１５ペプチドは、適当な鼎Ｃサブユ ニット分子のＮ−末端の端に付着される。組換え複合体がマウスにおいて使用さ れる場合には、例えば、ＡＣｈＲペプチドが［−Ａ　Ｉ′−α又はＩ−Ａ　”− β鎖のいずれかをエンコードしている配列に取り込まれることができる。これら の鎖をエンコードしている配列は、公知であり、そして図５（α鎮）、及び図６ （β鎖）中に示される。ＡＣｈＲペプチドがβ鎖中に取り込まれる場合には、例 えば、オリゴヌクレオチドがリーダー・ペプチドのための置換基として挿入され ることができる。ポリヌクレオチド内の配列を置き換える方法は、本分野におい て知られており、それらの例は、プラスミドの構築についてのセクション中に記 載されている。

類似の手順を、適当なヒトＨＬＡ抗原から得られたペプチドをエンコードしてい る配列中にＡＣｈＲペプチドを取り込むために使用することかできる。例えば、 ヒトにおいては、ハブロタイブＤＲ２Ｗ２が、＾ＩＧと会合される。これ故に、 ＡＣｈＲペプチドは、例えば、ＤＲ２対立遺伝子のβ−鎖をエンコードしいてい る配列中に取り込まれることができる。主要血清学的特異性ＤＰＩ−９のための ＤＲサブ領域における構造的基礎は、多数のＤＲハブロタイブからのＨＬＡ−Ｄ Ｒ−β鎖をエンコードしている配列と同しように、公知である。例えば、Ｂｅ１ ｌ　ｅｔ　ａｌ、　８１により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

複合体の評価 本発明の複合体を、インビトロ系又はインビボ系を使用して検定することができ る。１つのインビボ系においては、複合体を、複合体のペプチドと関連する症状 の原因である蛋白又は抗原により免疫化され、又はこれに免疫性を示す患者から の末梢血液Ｔ細胞と共にインキュベートする。成功した複合体は、同系Ｔ細胞と 選択的に結合し、そして追加の抗原による刺激の間にさえＴ細胞の増殖を防ぐで あろう。あるいは、Ｔ細胞の活性化は、３Ｈ−チミジンの取り込み、又は３−（ ４，５−ジメチル−チアゾール−２−７’　）−２，５−ジフェニルテトラゾリ ウム・ブロマイド（＆ＩＴＴ）の取り込みにより、測定されるような［Ｌ−２生 産又はＴ細胞増殖を検出することにより、測定されることができる。

複合体を評価する好ましい方法は、Ｔ細胞内の酸性代謝物の生産速度を測定する ためのマイクロフィジオメーターの使用である。この装置を使用により、複合体 とＴ細胞レセプタとの相互作用を、より速く且つより容易に検出する二とかでき る。この装置の生理学的基礎は、哺乳類細胞における基本的な代謝産物、乳酸及 び二酸化炭素の酸性度である。細胞の小サンプルを入れた培養基の酸性度を、光 を届けることができる電位差計センサー（ｌｉｇｈｔ−ａｄｒｅｓｓａｂｌｅ　 ｐａｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ　５ｅｎｓｏｒ）により測定されることができる 。酸性化の速度は、検定されるべき細胞の代謝速度の測定値として、使用される 。

標的細胞の代謝速度における変化を測定するためのこの技術の討議これを、引用 により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

インビボ系においては、ＡＰＣの存在中、単離されたエピトープに対する又は完 全長の抗原に対する応答において増殖するＴ細胞をクローン化する。このクロー ンを、自己免疫疾患を減少させるために免疫化されていないＭ織適合性動物中に 注射する。関連複合体に関連した兆候は、その疾患の兆候を改善し、又は取り去 るはずである。

上記タイプの複合体のいずれをも、すなわち、エフェクター成分をもつもの又は もたないものを使用することができる。１つの態様においては、その処理は、２ 倍である。個体を、免疫系をダウン−レギュレートする抗原の有効部分を含む＆ ＩＨＣサブユニットの複合体により、処理する。さらなるダウン〜レギュレーノ ヨンが、ＭＭＣサブユニット、治療されている自己免疫疾患に特異的な抗原の有 効部分、及びエフェクター成分、による処理により達成される。さらに、複合体 のパネルが、治療のｔ−めに使用されることができる。例えば、抗原の１以上の ペプチドか自己免疫応答に関係する疑いか在る場合に、及び／又は１以上の抗原 か関係する疑いか在る場合に、その個体を、幾つかの複合体により処理すること ができる。この複合体を、適当な＆ｌＨＣサブユニットの有効部分、及び抗原の 有効部分を含むパネルから選択する。この複合体は、所望により、エフェクター 成分を、さらに含んて成ることがてきる。

治療及び／又は診断のためのＭＨＣ複合体の選択疾患のための個体の診断又は治 療において使用されるべき本発明のＭＩ（Ｃサブユニット複合体の選択のために 、抗原又はアレルゲンの表象に関係するＬＩＨＣ抗原のタイプを、同定する。

例えば、特異的自己免疫不全は、特異的なＭＨＣタイプと相関がある。ヒトにお けるＤＱ／ＤＲハロタイプのリスト及び自己免疫疾患とのそれらの関係を、図７ 中に示す。対立遺伝子のいずれが、モしてＭＩＣエンコード・ポリペプチドのい ずれが疾患に関係しているかを同定するための方法は、本分野において公知であ る。

ＥＰ　２８６４４７　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載 されている方法が、好適である。この方法においては、幾つかの段階が、続く。

第一に、ＭＨＣ抗原と疾患との間の関係を、遺伝子研究に基づき決定する。これ らの研究を行うための方法は、当業者に知られており、そしてヒトにおけるすべ ての知られた関連ＨＬＡ疾患についての情報が、ＣｏｐｅｎｈａｇｅｎのＨＬＡ 及びＤｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙにおいて維持されている。疾也に関係す るポリペプチドをエンコードしている座は、疾患と最も強い関係をもつであろう ものである（図７を参照のこと。）。

第二に、ＬＩＨＣ抗原／ポリペプチドに関係する疾患をエンコードしている特異 的対立遺伝子を、同定する。対立遺伝子の同定においては、感受性対立遺伝子が 優勢であると推定される。対立遺伝子の同定は、特異的サブタイプと疾患との強 い陽性の関係を測定することにより、行われる。これは、多数の方法であってそ のすべてが当業者に知られている方法で行われることができる。例えば、サブタ イプ分けは、混合リンパ球応答タイプ分け（ｍｉｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ 　ｒｅｓｐｏｎｓｅ（八ＩＬＲ）　ｔｙｐｉｎｇ）により、及びプライム・リン パ球テスト（ｐｒｉｍｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｔｅｓｔｉｎｇ（ＰＬＴ） ）により、行われることカテキル。両方ノ方法が、Ｗｅｉｒ　ａｎｄ　Ｂｌａｃ ｋｗｅｌｌ、　ｅｄｓ、、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　（これを、引用により本明細書中に取り込む。） の中に記載されている。また、それは、検査されているＭＨＣ座に特異的なりＮ Ａプローブを使用してＤＮＡの制限断片長子形感（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆ ｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を分析する二とに より、行われれることもてきる。例えば、Ｎｅｐｏｍ（１９８６）、　Ａｎｎａ ｌｓ　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　４７５．１（これを、引用により本明 細書中に取り込む。）。ＭＨＣ座のためのプローブを作る方法は、当業者に知ら れている。例えば、Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：５９６６；　Ｗｅ ｉｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｉｔｉ ｏｎ：　ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 　ｏｆ　１ｌｌｉｎｏｉｓ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅ、Ｐ 、　Ｃｏｈｅｎ、　ｅｄ、１９８１）（これらのすべてを、引用により本明細書 中に取り込む。）を、参照のこと。

疾患感受性を与えるサブタイプの最も完全な同定は、座のゲノムＤＮＡの、又は 庫内てエンコードされているｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの配列決定により、行わ れる。配列決定されたＤＮＡは、ＭＨＣエンコートポリペプチドの超可及領域を エンコードしているセクションを含む。

望ましい領域の増幅のための、プローブにより所望のＤＮＡを特異的に同定する ための技術は、本分野において知られており、そして例えば、ポリメラーゼ連鎖 反ｒｔ　（ＰＣＲ）技術を含む。

一旦、特異的な自己免疫応答、に対する感受性を与える対立遺伝子が同定される と、その対立遺伝子内でエンコードされているポリペプチドも、同定可能である 。すなわち、ポリペプチド配列は、それをエンコードしている対立遺伝子内のＤ ＮＡ配列がら導き出されることができる。診断及び／又は治療のために使用され る本発明の＾ＩＨＣサブユニット複合体は、自己免疫疾患の症状と関係するＭＨ Ｃサブユニットの有効部分から、そして同じ疾患の症状と関係する自己免疫抗原 から得られる。

次の段階は、適当な抗原を同定する二とである。自己免疫疾患に関係する幾つか の自己抗原が、広く研究されている。同定された自己抗原は、重症筋無力症にお けるアセチルコリン・レセプタ、多発性硬化症におけるミニリン塩基性蛋白。原 発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）に おけるミトコンドリアのジヒドロリポアミド・アセチルトランスフェラーゼ、リ ウマチ様関節炎におけるタイプ１１コラーゲン、自己免疫甲状腺炎におけるサイ ログロブリン、自己免疫性ブドウ膜炎（ｕｖｅｉｔｉｓ）におけるＳ抗原、及び 腫瘍随伴性の天府［（ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ）に おけるデスモブラキンｌ　（ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎ　ｆ）を含む。はとんどの 自己免疫疾患においては、巨大分子の自己抗原の小さな自己抗原性ペプチド断片 （エピトープ）が、ヘルパーＴ細胞の定められたサブセットにより認識されるこ とが示されている。

一旦、巨大分子の抗原が、免疫病因学的応答の標的として同定されれば、幾つか の頒布された技術が、そのエピトープを同定し、そして特徴付けするために使用 される。これらの方法は、一般的には、全自己抗原の酵素消化により、又は自己 抗原をエンコードしている遺伝子の断片のクローニング及び発現により、生した 自己抗原性断片を使用する。自己抗原性ペプチド断片のアミノ酸配列が知られた とき、重複ペプチドのセットを、次に合成する。これらの方法は、その断片又は 合成ペプチドが同系抗原−表象系において疾患関連Ｔ細胞クローン又はハイブリ トーマを刺激する能力により、エピトープ配列を同定する。例えば、Ｌｉｖｉｎ ｇａｔｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎ（これらのすへて を、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

例えば、リウマチ様関節炎患者の９０％以上が、ＤＲ４（０ｗ４）、ＤＲ４（Ｄ Ｗ１４）又はＤＰＩのハブロタイブをもっている（図７を参照のこと。）。ヒト ・リウマチ様関節炎における標的抗原かタイプＩ＋コラーゲンであることも、知 られている。これ故に、リウマチ様関節炎をもつ患者の治療又は診断のために使 用される本発明の複合体は、疾患の誘導のための抗原表象を可能にし、又は疾患 抑制のための抗原表象を不可能にする、ＤＲ４（０ｗ４）、ＤＲＩ及び／又はＤ Ｒ４（Ｄｗ１４）から得られたポリペプチドであって、タイプ−１１コラーゲン の有効部分と複合体を形成するものを、含むであろう。

自己免疫疾患の診断及び／又は治療のための本発明の複合体の利用に好適である ことがてきる手順を、図８に示す。簡単に言えば、自己免疫疾患をもつ（又は受 けやすい）個体を同定し、そして自己免疫不全を同定する。同定は、徴候学及び ／又は家系病歴の調査である二とができる。個体のＭＨＣタイプは、本分野にお いて知られている幾つかの方法の中の１以上、例えば、ＭＬＲによる、血清学的 検定による、そしてＤＮＡ分析（ＲＦＬＰ及びＰＣＲ技術を含むもの）による、 細胞タイプ分けを含むものにより、測定される。個体Ｔ細胞を、自己反応性Ｔ細 胞により認識される自己ペプチドを決定するために、インヒドロにおいて検査し 、これは、先に記載したように、本発明の標識複合体を使用して達成される。複 合体かＴ細胞を標的にすることか測定された後、個体を、特異的な自己反応性Ｔ 細胞複製を抑制することができる本発明の複合体及び／又は自己反応性Ｔ細胞を 殺すものにより、処理する。（残存する自己反応性Ｔ細胞により測定されるよう な）治療を、先に記載したように、本発明の標識複合体を使用してＴ細胞結合研 究により監視する。

本明細書中で使用するとき、用語“個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）“は、すべて の哺乳動物及びすべてのを椎動物であって基本的に等価なＭＨＣ系を有するもの を包含する。

インビボにおけるテストのためのモデル系以下のものは、上記の症状に対する本 発明の複合体の効果を評価するために使用されることができる自己免疫疾患のた めのモデル系である。

全身性紅斑性狼唐（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕ ｓ（ＳＬＥ））自己免疫性Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｂｌａｃｋ　（ＮＺＢ）　 マウス及び表現型として正常なＮｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　（ＮＺＷ ）　？ウス株のｐ　、　ハイブリッドは、親ＮＺＢ株において見られるよりもよ り劇症（ｆｕｌ制ｎａｎｔ）な、重症な全身性自己免疫疾患に発展する。これら のマウスは、幾つかの免疫異常性であって、核抗原に対する抗体及びその後の死 病の発展、ヒトにおけるＳＬＨに著しく類似する、雌優勢をもつ免疫複合体−仲 介糸球体腎炎（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）を含むものを明らかに 示す。Ｋｎｉｇｈｔ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　（＋９７８）　１４７：１６５３ ．（これを、引用により本明細書中に取り込む。）。

本疾患のヒト及びネズミの両方において、ＮＩＨＣ遺伝子産物との強い会合が報 告されている。ＨＬＡ−ＤＲ２及びＨＬＡ−ＤＲ３個体は、ＳＬＥに発展する一 般的集団よりも高い危険性にあり（Ｒｅ　ｉ口ｅｒｔｓｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎ。

Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ（１９７０）　２９９：５１５）、一方、ＮＺＢ／Ｗ 　Ｆ　＋　マウス（Ｈ−２””）　、ＮＺＷ親から得られたｈ−２・ハロタイプ に結合する遺伝子は、狼癒様腎炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）の発展に貢献する。

本発明の複合体の効果は、生存率により、そして徴候、例えば、蛋白尿及び抗− ＤＮＡ抗体の出現、の発展の進行により、測定されることができる。

蛋白尿は、Ｕｒｉｓｔｉｘ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、 、　Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）の使用により熱量測定法により測定され、蛋白尿の 近似値を、以下の微量、　ｌｏｍｇ／ｄｌ；　Ｉ＋、　３０ｍｇ／ｄｉ：　２＋ 、　１００ｍｇ／ｄｌ：　３＋、　３００ｍｇ／ｄｌ：及び４＋、　１０００ｍ ｇ／ｄｌ　、のように与える。高い段階の蛋白尿の発展は、複合体によるマウス の処理により、有意に遅延化される。

ＮＺＢ／Ｗ　Ｆ　、　ｖウスニおける抗−ＤＮＡ特異的抗体の存在は、Ｚｏｕａ ｌｉ　ａｎｄ　５ｔｏｌｌａｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（ １９８６）　９０：ＩＯ２（これを、引用により本明細書中に取り込む。）によ り記載されるように、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）の修飾を使 用することにより、測定される。

重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ　Ｇｒａｖｉｓ（ＭＧ））重症筋無力症は 、ＨＬＡ−Ｄに関連した幾つかのヒト自己免疫疾患の中の１っである。Ｓａｆｅ ｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　（１９７８ ）　１２１３６：　ＭｃＤｅｖｉｔｔ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｒｔｈ、　Ｒｈｅ ｕｍ、　（１９７７）　２０：５９　（これを、引用により本明細書中に取り込 む。）。ＭＧにおいては、アセチルコリン・レセプタ（ＡｃＣｈｏＲ）に対する 抗体が、シナプス後膜におけるＡｃＣｈｏＲの損失を仲介することによる神経筋 伝達を、減する。

ＳＪＬ／Ｊ雌マウスは、ヒトＭＧのためのモデル系である。これらの動物におい ては、実験的な自己免疫性重症筋無力症（ＥＡＭＧ）が、他の種からの可溶性Ａ ｃＣｈＲ蛋白によりマウスを免疫化することにより、誘導される。ＥＡＧに対す る感受性は、部分的にＭＨＣに関係し、そしてＨ−２内の領域にマツプされてい る。Ｃｈｒｉｓｔａｄｏｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕ３（これを、引 用により本明細書中に取り込む。）に従って検定される。Ｆｒｅｕｎｄ完全アジ ュバント中の１５μｇの乳化ＡｃＣｈＲを、背中、後ろ足、及び尻尾の基の上の ６つの部位の間に皮膚内に注射する。

動物を、４週間後にこれと同じ養生法により再免疫化する。

評価を、抗−ＡｃＣｈｏＲ抗体の測定により行うことができ、抗−ＡｃＣｈ。

Ｒ抗体のレベルを、Ｗａｌｄｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、前記中に記載されているよ うに、マイクロタイターＥＬＩＳＡ検定により測定する。標準的な試薬容量は、 ｗｅｌｌ当たり５０μｌである。試薬を、普通には、ｗｅｌｌ内で２時ＩＳｌ！ ＲＴＩ：おいてインキュベートする。、２炭酸塩バツフアー、ｐＨ９，６中に希 釈した５μｇのＡｃＣｏＲを、それぞれのｗｅｌｌに添加する。ＡｃＣｈｏＲと のインキュベーションの後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ及び０．０５％ 　ＮａＮ　）を含むリン酸塩バッファー生理食塩水から成る洗浄溶液により４回 濯ぐ。マウス血清を、０．ＯＥ　ＰＢＳ　（ｐｉ（７，２）、１．５ｍＭ　Ｍｇ Ｃｌ２．２．Ｏｎ＋ＡＩ　２−メルカプトエタノール、０，０５％Ｔｗｅｅｎ− ８０，０，０５％ＮａＮ　３（Ｐ−Ｔｗｅｅｎバッファー）中に希釈し、そして プレート上でインキュベートする。プレートを洗浄した後、Ｐ−Ｔｗｅｅｎバッ ファー中に希釈されたβ−ガラクトンダーセー結結合ヒツジ−マウス抗体を、そ れぞれのｗｅｌｌに添加する。最後の洗浄の後、酵素基質、ｐ−ニトロフェノー ル−ガラクトピラノシトを、プレートに添加し、そして基質の触媒作用の程度を 。１時間後に４０５ｎｍにおける吸光度から測定する。

抗−ＡｃＣｏｈＲ抗体は、非免疫化マウスと比へたとき、ＡｃＣｏｈＲによる免 疫化マウスにおいて存在することが予測される。複合体による処理は、免疫化マ ウスにおいて抗−ＡｃＣｏｈＲ抗体の力価を有意に減少させることが期待される 。

臨床的ＥＡ＆ｌＧに対する複合体による治療の効果も、評価されることができる 。筋無力症の徴候は、頭及び首のうなだれを伴う特徴的な背を曲げる姿勢、背中 の悪化したアーチ形、脱臼した四肢、異常な歩行、及び直立にける困難性を、含 む。穏やかな徴候が、標準的なストレス・テストの後に存在し、そして抗体力価 が下がった後の期間の後における複合体の投与により改善されるはずである。

リウマチ様関節炎（ＲＡ） ヒトにおいては、リウマチ様関節炎に対する感受性は、ＨＬＡ　Ｄ／ＤＲと関係 している。生来のタイプ［１コラーゲンに対するマウスにおける免疫応答は、ヒ １−ＲＡに類似する多数の組織学的及び病因学的特徴をもつ関節炎のための実験 的モデルを確立するために使用されてきた。マウスにおけるコラーゲン誘導体関 節炎（ＣＩＡ）に対する感受性は、Ｈ−２１領域、特に［−Ａサブ領域にマツプ されている。ｆ（ｕｓｅ、　ｅｔ感受性株、ＤＢＡ−１からのマウスは、Ｗｏｏ ｌｅｙ　ａｎｄ　Ｌｕｔｈｒａ、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　（１９８５）　、 １３４・２３６６（これを、引用により本明細書中に取り込む。

）中に記載されている技術を使用して、生来のタイプ【ｌコラーゲンによりマウ スを処理することによりＣ［Ａもつようにされる。

他のモデルにおいては、ラットにおけるアジュバント関節炎が、ヒト関節炎のた めの実験モデルであり、そしてバクテリア抗原により引き金を引かれる自己免疫 関節炎の原型である。Ｈｏ１ｏｓｃｈｉｔｚ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｓｐｅｃ ｔｓ　ｏｆ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（ＣＲＣＰｒｅｓｓＸ１９８６）：　Ｐｅ ａｒｓｏｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、　（１９６４）　７：８０　ｏ 　この疾患は、アジ、／＜シト（ＭＴ）に対して反応生であるＴ細胞のクローン によるその遺伝性（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）により証明されるよう な、細胞仲介免疫応答の結果であり。

同一クローン細胞による研究に基づけば、疾患における標的自己抗原は、軟骨（ ｃａｒｔｉ　Ｉａｇｅ）のプロテオグリカン分子の一部であるよってある。

ラットにおけるアジュバント疾患は、Ｐｅａｒｓｏｎ、前記に記載されているよ うに、すなわち、幾つかの貯蔵部位、好ましくは皮下的に、又は足又は尻尾の基 に与えられるＦｒｅｕｎｄ’　ｓアジュバント（死んだ結核菌又はその化学的画 分、鉱物油、及び乳化剤）の単一注射により、作り出される。このアジュバント は、他の抗原の非存在において与えられる。

上記疾患の顕現の複合体治療の効果を、監視する。これらの顕現は、組織病因学 であり、そして滑液系細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ　ｌｉｎｉｎｇ　ｃｅｌｌＳ）の 増殖による急性及びサブ急性の滑膜炎（ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ）　、優勢には、関 節及び特定組織の単核浸潤、接続組織パンヌス（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓ ｕｅ　ｐａｎｎｕｓ）による骨及び関節の軟骨の進入、及び特に感染関節に隣接 した、骨膜性の（ｐｅｒｉ○５ｔｅａｌ）の新たな骨形成、を含む。重症又は慢 性の場合においては、繊維の又は骨の硬直症（ａｎｋｙｌｏｓｉｓ）が起こるの で、破壊的変化が生しる。これらの組織病因学的徴候は、Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓア ジュバントに対する過敏化の約１２日後に対照動物において現れることが予測さ れる。

インシュリン依存性真性糖尿病（（ｎｓｕｌｉｎ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｄｉａ ｂｅｔｅｓ＾ｌ１１１ｉｔｕｓ（［ＤＤＭ）） ｒＤＤＬ＋は、膵臓のランゲルハンス島内のインシュリン分泌細胞の選択的破壊 の結果として観察される。この疾患における免疫系の関わりは、単核細胞による 島の初期浸潤の形態学的証拠により、抗−高細胞抗体の検出により、ＩＤＤ＆Ｉ 集団におけるＨＬＡ−ＤＲ３及び−ＤＲ４対立遺伝子の高い頻度により、そして ＩＤＤＡＩと様々な自己免疫疾患との間の臨床的関連により、示唆される。同時 発生のＩＤＤＭ及び甲状腺炎のための動物モデルは、Ｂｅラットにおいて開発さ れてきた。ヒトにおけるように、ラット疾患は、部分的に、＆ｌＨＣ抗原をエン コードしている遺伝子により制課され、島の浸潤により特徴付けされ、そして抗 −島抗体の存在と関連している。ｌ−Ｅ等価のクラスＩＩＭＨｃ抗原は、Ｂｅラ ットにおける自己免疫疾患の顕在化に関連するよってある。Ｂｉｏｔａｒｄ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（ １９８５）　８２：６６２７゜形態学的評価において、インシュリン炎（ｉｎｓ ｕｌｉｔｉｓ）は、島内の単核炎症性細胞の存在により特徴付けされる。甲状腺 炎（Ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）は、最小の基準として、甲状腺の腺（ｔｈｙｒｏ ｉｄ　ｇｌａｎｄ）内の病巣介在性リンパ球浸潤（ｆｏｃａｌ　１ｎｔｅｒｓｔ ｉｔｉａｌ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ　１ｎｆｉｌｔｒａｊｅ）により特徴付け される。最も重症な事件は、広汎性の、拡がったリンパ球浸潤、豚房（ａｃｉｎ ｉ）の破壊、繊維症（ｆ　１ｂｒｏｓｉｓ）、及び病巣Ｈｕｒｔｈｌｅ細胞の変 化、を示す。

本発明の複合体による８Ｂラツトの治療は、ＩＤＤＡＩ及び甲状腺炎に関連する 臨床的及び形態学的徴候の顕現を改善し又は防ぐことが期待される。

他の自生モデルの中では、ＮＯＤマウス株（Ｈ−２Ｋ　’　Ｄ　”　）が、自己 免疫［ＤＤ＾１のだめのネズミ・モデルである。これらの動物における疾邑は、 抗−高細胞抗体、重症なインツユリン炎、及びβ−細胞の自己免疫性破壊につい ての証拠、により特徴けけされる。Ｋａｎａｚａｗａ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９８４）２７：１１３゜この疾 患は、リンパ球により受動的に転移され、そしてシクロスポリン−Ａによる治療 により防止される（ｌｋｅｈａｒａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（＋９８５）　８２７７４３：＾１ｏｒｉ、 　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　（１９８６）　２９：２４４ 　、未処理動物は、深いグルコース不耐性及びケトン症及びこの疾患の開始の数 週Ｍ以内の死（ｓｕｃｃｕｍｂ＞に発展する。雌の７０〜９０パーセント及び雄 の動物の２０〜３０％か、生後の最初の６力月以内に糖尿病に発展する。

ｇＪ養班研究、疾患感受性の原因である少なくとも２の遺伝子座を定め、その中 の１つが、λＩＨＣをマツプしている。血清学及び分子的レベルの両方における ＮＯＤクラスＩＩ抗原の特徴付けは、自己免疫疾患に対する感受性か、ＩＡ　ｌ ｌに関係することを示唆している。Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ　ａｎｄ　ＭｃＤｅｖ ｉｔｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７ ０）８４：２３５゜複合体によるｆｌＮＯＤマウスの治療は、糖尿病の開始の前 の時間を長くし、及び／又はその病気を改善し又は防ぐことを期待されている。

実験的アレルギー性脳を髄炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｌｌｅｒｇｉｃ　 Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ（ＥＡＥ）） 実験的アレルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症（ＭＳ）のヒト疾患に 多くの点て類似する中枢神経系の自己免疫疾患を引き起こす。

この疾患は、マウス及びラットを含む多くの種において引き起こされることかで きる。

二の病気は、麻痺（ｐａｒａｌｙｓｉｓ）の急性の始まりにより特徴付けされる 。ＣＮＳにおける単核細胞による脈管周囲の浸潤が、マウス及びラットの両方に おいて観察される。疾患の誘導方法、並びに徴候学は、Ａｒａｎｓｏｎ（１９８ ５）　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　（ｅｄｓ、　Ｒ ｏｓｅ　ａｎｄ　Ｎ１ａｃｋａｙ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、 ）　ｐｐ、　３９９−４２７．及びＡｃｈａ−Ｏｒｂｅａ　ｅｔａｌ、　（＋９ ８９）、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、１ｍｍ、　７：３７７−４０５中にレビューされて いる。

感受性を仲介する遺伝子の中の１つは、ＭＨＣクラス１１領域内に位置するＱｌ ｏｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２４： １８１５−１８２０）。最もよく分析された脳炎誘発性の（ｅｎｃｅｐｈａｌｉ ｔｏｇｅｎｉｃ）蛋白は、ミニリン塩基性蛋白（＆１ＢＰ）であるが、他の脳炎 誘発性蛋白が、脳内で見つかっている。免疫原性エピトープは、マツプされてい る（Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａｅｔ　ａｌ、、前記を参照のこと。）。ＰＬマウス株 （Ｈ−２”）においては、ＭＢＰ中の２つの脳炎誘発性蛋白が、特徴付けされて いるＭＢＰペプチドｐ３５−４７（八ＩＢＰ　３５−４７）　、及びアセチル化 （八ＩＢＰ　１−９）。

ＥＡＥが誘発されるところの個体における疾患の症状を改善することに対する本 発明の複合体の効果は、生存率により、そして徴候の発展の進行により、測定さ れることができる。

配合及び投与 ＭＭＣサブユニットのトランスメンブラン領域が含まれる場合に、本発明の複合 体は、便利には、脂質単層又は二重層内に取り込まれた後に、投与される。典型 的には、この目的のために使用されるが、脂質膜のいずれかの形態、例えば、平 面脂質膜又は細胞の細胞膜（例えば、赤血球細胞）が使用されることができる。

また、複合体は、便利には、ミセル中に取り込まれることができる。以下の例２ 中に表したデータは、ダイマーのＭｌ（Ｃ分子を含んで成るＭｌ−ＩＣ−ペプチ ド複合体か、主に、凝集体として存在することを示している。

リポソー１４は、以下に記載するような、標準的な方法に従って調製されること ができる。しかしながら、トランスメンブラン領域が欠失される場合には、この 複合体は、ペプチド−含有医薬のために便利に使用されるやり方で投与されるこ とができる。

投与は、全身的であり、そして好ましくは、静脈内の注射により行われ、それ故 、投与の注射経路に適合した配合が、使用される。

好適な配合は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ、　＆１ａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｐｈ １ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ、　１７ｔｈ　ｅｄ、　（１９８５）　（これを 、引用により本明細書中に取り込む。）中に見られる。本発明の複合体及び医薬 として有効な担体を含んで成る様々な医薬組成物が、調製されることができる。

この医薬組成物は、様々な医薬デリバリ−系において好適である。医薬デリバリ −の現在の方法の簡単なレビューについては、Ｌａｎｇｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ 　２４９：１５２７−１５３３（１９９０）　（これを、引用により本明細書中 に取り込む。）を参照のこと。

本発明の医薬組成物の調製においては、本発明の複合体を修正し、それらの薬埋 動懸及び生体分配（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を変更すること生態分配 を変更するための多数の方法は、当業者に知られている（例えば、Ｌａｎｇｅｒ 、前記を参照のこと。）。例えば、複合体の血清半減期を増加させるのに好適な 方法は、血流から複合体を除去することに関係する炭水化物を除去するために処 理を含む。好ましくは、炭水化物部分の実質的にすべてが、この処理により除去 される。炭水化物部分の実質的にすへてか、その炭水化物部分の少なくとも約７ ５％、好ましくは約９０％、及び最も好ましくは約９９％が除去される場合に、 除去される。可溶性巨大分子、例えば、蛋白、多糖類、又は合成ポリマー、例え ば、ポリエチレン・グリコールへの結合も、存効である。他の方法は、物質、例 えば、蛋白、脂質（例えば、リポソーム）、炭水化物、又は合成ポリマーから成 る小胞内での複合体の保護を含む。

本発明のリポソームは、典型的には、複合体かＴｗＪ胞レセプタとの相互作用に 利用できるようなやり方で、リポソームの表面上に位置するＮＩＨｃ−ペプチド 複合体を、含む。トランスメンブラン領域は、普通には、膜の形成の時に、その 膜中に、第−取り込みされる。このリポソームは、所望の医薬（例えば、毒素又 は化学療法剤）を特定の自己反応性Ｔ細胞に対し標的化するために使用されるこ とができる。あるいは、リポソーム内に埋め込まれた複合体は、標的細胞内でア 不ルギーを誘導するために使用されることができる。

リポソームの電荷は、血液からのリポソームのクリアランスにおいて重要な決定 要素であり、負電荷のりボノームは、網内皮糸によりより速く取り込まれ（Ｊｕ ｌｉａｎｏ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　６３：６５１（ １９７５））、そしてそれ故、血流内でより短い半減期をもつ。遅延化された循 環半減期をもつリポソームは、典型的に、治療的及び診断的用途に望ましいもの である。例えば、血流中、８．１２から、又は２４時間まで、維持されることか できるリポソームか、特に好ましい。

典型的には、リポソームは、約５−１５モル・パーセントの負に帯電したリン脂 質、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン又はヒスファ チシルイノシトールにより調製される。また、追加の負電荷のリン脂質、例えば 、ホスファチノルグリセロールは、自発的リポソーム凝集の防止に役立ち、そし てそれ故、不所望のりポノーム凝集形成の危険を最小化する。膜−硬化剤（＾Ｉ ｅｍｂｒａｎｅ−ｒｉｇｉｄｉｆｙｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ）　、例えば、モノシ アリルガングリオシド（ｍｏｎｏｓｉａｌｙｌｇａｎｇｌ　１ｏｓｉｄｅ）の少 なくとも約５０モル・パーセント、及び５−１５モル・パーセントの濃度におけ る、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉ口ｇｏｍｙｅｌｉｎ）又は鉋和天然リン脂質 が、一般的に、米国特許第４，８３７゜０２８号（これを、引用により本明細書 中に取り込む。）中に記載されているように、血流中でリポソーム調製物の増加 された循環を、提供することができる。

さらに、リポソーム懸濁液は、保存の間のフリー−ラジカル及び脂質−過酸化の 損傷に対して脂質を保護する脂質−保護剤を含むことができる。親油性フリー− ラジカル消火剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）　、例えば、αトコフェロール及び水溶 性の鉄特異的キレート、例えば、フェリオキシアニン（ｆｅｒｒｉｏｘｉａ旧口 ｅ）が、好ましい。

例えば、５ｚｏｋａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 　Ｂｉｏｅｎｇ、　９：４６７（＋９８０）、米国特許第４．２３５．８７１号 、第４．５０１．７２８号及び第４．８３７．０２８号（これらのすべてを、引 用により本明細書中に取り込む。）の中に記載されているように、様々な方法を 、リポソームを調製するために利用することができる。１つの方法は、不均一サ イズの多ラメラ小胞を作り出す。この方法においては、小胞形成脂質は、好適な 有機溶媒又は溶媒系中に溶解され、そして真空下又は不活性ガス中で乾燥され、 薄い脂質層を形成する。所望により、フィルムを、好適な溶媒、例えば、第三ブ タノール中に再溶解させ、そして次に、凍結乾燥させ、より均一な脂質混合物で あってより容易に水和される粉体様形態であるものを形成する。このフィルムは 、標的化された医薬及び標的化成分の水溶液により被覆され、そして典型的には 、攪拌を伴って＋５−６０分間の期間にわたあり、水和される。得られた多ラメ ラ小胞のサイズ分布は、より激しい攪拌条件下で脂質を水和することにより、又 は可溶化洗剤、例えば、デオキシコレートの添加により、より小さなサイズの方 ヘノフトされることがてきる。

水和媒質は、標的化された医薬を、最終的なリポソーム懸濁液中のリポソームの 内部容量において要求されるところの濃度において、含む。典型的には、この医 薬溶液は、バッファー化生理食塩水溶液中１０−］００ｍｇ／ｍ、ｌの間の複合 体を含む。

リポソーム調製後、所望のサイズ・レンジを、そして比較的狭い分布のリポソー ム・サイズを達成するように、リポソームを、サイジングすることかできる。１ つの好ましいサイズ・レンジは、約０゜２−０．４　ミクロンであって、これは 、リポソーム懸濁液が慣用のフィルター、典型的には０．２２ミクロンのフィル ターを通しての濾過により滅菌されることを可能にする。このフィルター滅菌法 は、そのリポソームが約０．２−０．４　ミクロンにまでサイジングされた場合 には、高い処理量に基づいて行われることができる。

幾つかの技術を、所望のサイズへのサイジングのために利用することがてきる。

１つのサイジング法が、米国特許第４．７３７．３２３号（これを、引用により 本明細書中に取り込む。）中に記載されている。

浴又はプローブ音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の音波処理は、サイ ズ約０．０５ミクロンよりも小さい、小さな単ラメラ小胞までの、漸進的サイズ 減少を、作り出す。均一化は、大きなリポソームラヨリ小さなリポソームに断片 化するための剪断エネルギーにたよる他の方法である。典型的な均一化手順にお いて、多ラメラ小胞か、典型的には約０．１と０．５ミクロンの間の、選択され たリポソーム・サイズが、観察されるまで、標準的なエマルジョン・ホモゲナイ ザーを通して、再循環される。両方の方法において、粒子サイズの分布を、慣用 のレーサー・ビーム粒子サイズ分別により、監視することができる。

小孔性ポリカーボネート膜又は不斉セラミック膜を通してのリポソームの押し出 しも、比較的より細がいサイズの分布にリポソーム・サイズを減少させるための 有効な方法である。典型的には、懸濁液を、所望のリポソーム・サイズ分布が達 成されるまで、１回以上その膜を通して循環させる。このリポソームは、連続的 により小さな孔の膜を通して押し出され、リポソーム・サイズの段階的な減少を 達成することができる。

最も有効なカプセル化方法の下でさえ、最初にサイジングされたリポソーム懸濁 液は、遊離（非カプセル化）形態で、５０％以上までの複合体を含むことができ る。

幾つかの方法は、リポソーム懸濁液から非拘束化合物を除去するために、利用さ れることができる。１つの方法においては、懸濁液中のリポソームが、高速遠心 分離によりベレット化され、その上澄液中に遊離の化合物及非常に小さなリポソ ームを残す。他の方法は、限外濾過により懸濁液を濃縮し、次に置き換え媒質中 に濃縮されたリポソームを再懸濁させることを、含む。あるいは、ゲル濾過か、 溶解分子から大きなリポソーム粒子を分離するために使用されることができる。

以上の処理の後、リポソーム懸濁液を、静脈内投与における使用のための所望の 濃度に、もっていく。これは、好適な容量の注射媒質中にリポソームを再懸濁す ることを含むことができ、そこでは、リポソームが例えば、遠心分離又は限外濾 過、又は医薬の除去段階が全懸濁液容量を増加させたところの懸濁液を濃縮する ことにより、濃縮されている。次に、この懸濁液は、先に記載したような濾過に より、滅菌される。ＭＨＣ−ペプチド複合体を含んで成るリポソームを、例えば 、投与のやり方に従って変化する投与量において、その医薬を配達しながら、特 定の疾患を治療しながら、等を行いながら、非経口的に又は局所的に、投与する ことができる。

ミセルは、非極性領域をもつ分子の溶解性を増加させるために本分野において一 般的に使用される。それ故、当業者は、ミセルか本発明の組成物において有用で あることを認めるであろう。本発明の複合体を含んで成るミセルは、当業者によ く知られた方法に従って調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、前記Ｃｈａｐ、　２０を参照のこ と。）。本発明の複合体を含んで成るミセルは、典型的には、標準的な界面活性 剤又は洗剤を使用して調製される。

ミセルは、水溶液中の界面活性剤（疎水性部分及び１以上のイオン性又は他の強 く親水性の基を含む分子）により、形成される。固体界面活性剤の濃度が増加す るとき、空気／水又はガラス／水の界面において吸着されたその単層は、さらな る占有が２つの単層内に既にある界面活性剤分子の過剰の圧縮を要求するように 、よりきつく詰められるようになる。その濃度を超える溶解した界面活性剤の量 におけるさらなる増加は、ミセル中に集合するだめの新たな分子に等価な量を、 生じさせる。この過程は、”限界ミセル濃度（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｍ１ｃｅｌｌ ｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）”　といわれる特徴的な濃度において開始す る。

希釈界面活性剤溶液中で形成されたミセルの形態は、たいたい球状である。界面 活性剤分子の極性の頭の基は、外側の球殻内で配列され、一方、それらの炭化水 素鎖は、中心の方を向き、ミセルの球のコアを形成している。炭化水素鎖は、ラ ンダムにコイルし且つ絡みあっており、そしてミセル内部は、非極性の、液体様 の特徴をもつ。ポリオキシエチレン化非イオン洗剤のミセルにおいては、ポリオ キシエチレン部分は、外側の方に向いており、そして水により透過される。この 配列は、エネルギー的に好ましい。なぜなら、親水性の頭の基は、水に接してお り、そして炭化水素部分は、水性媒質から離されており、そしてその極性の頭の 基により水との接触から部分的に遮蔽されているからである。ミセルの内部に配 置された、界面活性剤分子の炭化水素の尾は、弱いファン・デル・ワールスカに より互いに相互作用している。

ミセルのサイズ又はその集合数は、幾何学的要素により広く左右される。炭化水 素コアの半径は、界面活性剤分子の伸長した炭化水素鎖の長さを超えることがで きない。それ故、鎖長の増加又は相同なシリーズの増加は、球状ミセルの集合数 を増加させる。その炭化水素部分が１本のノルマル・アルキル鎖である界面活性 剤については、球形態をもつ最大集合数構酸は、Ｃ＝、Ｃ＋。、Ｃａ２、ＣＩ４ 及びｃｐｓについて、それぞれ、約２７．３９．５４．７２、及び９２である。

界面活性剤濃度が数パーセントを超えて増加する場合、そして電解質が添加され （イオン界面活性剤の場合）又は温度が上昇された（非イオン界面活性剤の場合 ）場合には、ミセルのサイズが増加する。これらの条件の下で、ミセルは、余り 大きくなると、球状ではなくなり、そして長円体状、円筒状又は最終的にはラメ ラの形状になる。

当業者によく知られた一般的な界面活性剤を、本発明のミセルにおいて使用する ことができる。好適な界面活性剤は、ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリ ウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オクタオキシエチレン・グリコール・モノデシ ル・エーテル、オクトキンノール９　（ｏｃｔｏｘｙｎｏｌ　９）及びＰＬＬＩ ＲＯＮＩＣＦ−１２７０（Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃａｒｐ 、）を含む。好ましい界面活性剤は、静脈内注射に適した非イオン性ポリオキシ エチレン及びポリオキンプロピレン界面活性剤、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＦ− １２７■、ローオクチル−β−叶グルコピラノシド、等である。さらに、リン脂 質、例えば、リポソームの調製における使用のために記載したようなものが、ミ セル形成のために使用されることもてきる。

本発明のＭＨＣサブユニットが親油性トランスメンプラン領域及び比較的親水性 の細胞外ドメインを含んで成るので、混合されたミセルは、一般的な界面活性剤 又はリン脂質及びサブユニットの存在中で形成される。本発明の混合されたミセ ルは、サブユニット、リン脂質及び／又は界面活性剤のいずれかの組み合わせを 含んで成ることができる。したがって、このミセルは、ザブユニット及び界面活 性剤、リン脂質と界面活性剤との又はサブユニットとリン脂質との両方の組み合 わせにおけるサブユニット、を含んで成ることができる。

本発明の複合体を含んで成る医薬組成物については、その投与量は、例えば、特 定の複合体、投与のやり方、治療される特定の疾患及びその重症度、患者の全体 的な健康及び症状、処方する内科医の判断、に従って、変動する。ネズミ検体の ための投与量レベルは、一般的に、約ＩＯμｇと約５００μｇとの間にある。約 ５０μｇと約３００μｇとの間の全投与量が、好ましい。例えば、疾患の経過に わたり提供される治療においては、３回の２５μｇ又は１００μｇの投与量が有 効である。全投与量は、約０．５と約２５ｍｇ／ｋｇとの、好ましくは、約３と 約１５ｍｇ／ｋｇとの間の範囲にある。

医薬組成物は、予防的及び／又は治療的な処理のための、非経口的な、局所的な 、経口的な又は局所的な投与、例えば、エアロゾルによる又は経皮的なもの、に ついて意図されている。この医薬組成物は、投与の方法に依存して様々な単位投 与形態において、投与されることかてきる。例えば、経口投与に好適な単位投与 形態は、粉剤、錠剤、ビル、及びカプセルを含む。

好ましくは、医薬組成物は、静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容 される担体、好ましくは水性担体中に溶解又は懸濁された複合体の溶液を含んで 成る静脈内投与のための組成物を提供する。様々な水性担体、例えば、水、バッ ファー水、０．４％生理食塩水、等を使用することがてきる。例えば、リン酸バ ッファー生理食塩水（ＰＢＳ）が、本発明の可溶性複合体の投与に特に好適であ る。これらの組成物は、慣用の、よく知られた滅菌技術により、滅菌され　。

ることができ、又は滅菌濾過されることができる。得られた水性溶液を、それ自 体としての使用のために包装し、又は凍結乾燥調製物を投与に先立ち滅菌水溶液 と一緒にするように、凍結乾燥することができる。この組成物は、医薬として許 容される補助的物質であって生理学的条件に合わせるために必要なもの、例えば 、ｐＨ調整及び緩衝化剤、浸透圧調整剤、水和剤、等、例えば、酢酸ナトリウム 、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ッルビタ ン・モノラウレート、トリエタノールアミン・オレエート等を含むことができる 。

複合体の濃度は、広く、すなわち、約０．０５重量％未満、普通には約１重量％ において又は少なくとも約１重量％においてから、１０〜３０重量％と程まで、 変動することができ、そして選ばれた投与の特定の方法に従って、主に、液体容 量、粘度、等により、選ばれることができる。静脈内投与のために好ましい濃度 は、ＰＢＳ中約０．０２％〜約０．１％である。

固体組成物のためには、慣用の非毒性固体担体であって、例えば、医薬グレード のマニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナ トリウム、タルク、セルロース、グルコース、ンユクロース、炭酸マグネシウム 、等を含むものを、使用することができる。経口投与のためには、医薬として許 容される非毒性組成物は、正常に使用される賦形剤のいずれか、例えば、先に列 記したようなものを、そして一般的に活性成分の１０−９５％を、取り込むこと により、形成される。

エアロゾル投与のためには、複合体は、好ましくは、界面活性剤及び推進剤とと もに、細かく砕かれた形態において、供給される。

界面活性剤は、もちろん、非毒性であり、そして好ましくは、推進剤中に溶解性 でなければならない。このような剤の代表は、６から２２まての炭素原子を含む 脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステア リン酸、リノール酸、リルン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ　ａｃｉ ｄ）及びオレイン酸と、脂肪族ポリヒドロ・アルコール又はその環状無水物、例 えば、例えば、エチレン・グリコール、グリセロール、エリスリトール、アラビ トール、マニトール、ソルビトール、ソルビトールから得られたヘキシトール無 水物とのエステル又は部分エステル、並びにこれらのエステルのポリオキシエチ レン及びポリオキシプロピレン誘導体である。混合エステル、例えば、混合又は 天然のグリセリドを、使用してもよい。二の界面活性剤は、その組成物の０．１ 重量粁２０重量％を、好ましくは、０．２５−５重量％を構成することができる 。組成物の平衡体は、普通には、推進剤である。液化推進剤は、周囲温度におい て、典型的には気体であり、そして圧力下で結露する。好適な液化推進剤の中に 、５炭素原子までを含む低級アルカン、例えば、ブタン及びプロパンがあり：そ して好ましくは、フッ素化又はフッ素化塩素化アルカンが在る。上記の混合物を 、使用してもよい。エアロゾルの製造においては、好適なバルブを備えた容器に 、細かく粉砕した化合物及び界面活性剤を含む、適当な推進剤を、充填する。し たがって、成分は、バルブの操作により放出されるまて昇圧下で維持される。

複合体を含む組成物を、治療的、予防的、又は診断的な用途のために投与するこ とができる。治療的な用途においては、組成物を、疾患の徴候及びその合併症を 治療し又は少なくとも部分的に休止させるのに十分な量で、先に記数したように 、疾瞥を既に患っている患者に、投与する。これを達成するのに適当な量を、” 治療的有効投与量”として定義する。この使用のために有効な量は、その疾患の 重症度及びその患者の総括的な状態に依存するであろう。先に記数したように、 これは、典型的に、約０．５ｍｇ／ｋｇと約２５ｍｇ／ｋｇとの間に、好ましく は約３と約１５ｍｇ／ｋｇとの間にあるであろう。

疾患を受けやすい又はその危険にある者に投与する。このような量は、”予防的 有効投与量゛として定義されている。この使用においては、正味の量は、再び、 患者の健康状態及び体重に依存する。この投与量は、一般的に、先に述へた範囲 内にある。

診断的用途においては、適当な複合体又はそれらのカクテルを含む組成物を、疾 患に関連する自己反応性Ｔ細胞の存在を測定するために自己免疫疾患をもつと疑 われる患者に投与する。あるいは、特定の治療の効果を、監視することができる 。これを達成するのに十分な量は、゛診断的有効投与量°として定義される。こ の使用においては、正味の量は、患者の健康状態等に依存するであろが、一般的 には、投与量たり０．０１から１０００ｍｇまでの、特に患者当たり約１０〜約 １００ｍｇの範囲にある。

また、キットを、治療的又は診断的用途のために提供することができる。したか って、本発明の対象組成物を、普通には、容器内で凍結乾燥された形態で、提供 することができる。標識又は毒素と結合され、又は結合されないことができる複 合体は、バッファー、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、等、安定剤、殺生 剤、不活性蛋白、例えば、血清アルブミン、等、をもち、そして１セツトの使用 の指示書をもつキット中に、含まれる。一般的には、これらの材料は、複合体の 量に基づく約５重量％未満て存在し、そして普通には、その蛋白濃度に再び基づ く少なくとも約０．００１重量％の全量で存在するであろう。しばしば、その活 性成分を希釈するための不活性増量剤又は賦形剤を含むことが必要であろうし、 そこでは、その賦形剤は、全組成物の約１から約９９重量％までの範囲内で存在 することかできる。複合体に結合することができる抗体を検定中で使用するとき 、これは、普通には、別々のバイアル中で存在するであろう。この抗体は、典型 的には、標識に結合し、そして本分野においてよく知られた技術に従って配合さ れる。

以下の例は、本発明を例示するものであり、これを限定するものではない。

実施例 例！ 本例は、ミニリン塩基性蛋白＾！ＢＰ（１−１４）Ａ’のＮ−末端ペプチドの、 不ズミ＋Ａ”分子の精製された個体のα及びβ鎖への結合について、示している 。

手順： 不ズミＩＡゝ及び］Ａ“の精製 ＩＡｋ及び［Ａ“を、米国特許第５．１３０．２９７号（これを、引用により本 明細書中に取り込む。）中に記載されている標準的な臭化シアン・カップリング 法により、（［Ａ　’及び［Ａ’に特異的な）モノクロナール抗体、　１０−２ ．１６を５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂビーズとカップロングさせることにより調製 されたアフィニティー支持体を使用して、それぞれ、培養ＣＨ２７細胞及びＳＪ Ｌ／Ｊマウス牌臓細胞から調製された膜のＮＰ−４０抽出物から、精製した。ア フィニティー精製ＩＡ　ｋ及びＩＡ“分子を、１２％１次元ＳＤＳポリアクリル アミド・ゲル電気泳動により、特徴付けた。

ＭＨＣ分子のα及びβサブユニットの単離・精製ＩＡ　ｋを、Ａｍ１ｃｏｎ濃縮 装置を使用してＩｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして１２％分離用（１６ｃｍ　Ｘ　 １８　ｃｍ）スラブ・ゲル・ユニット上に適用した。

電気泳動を、一定電圧（Ｉ００ボルト）において室温において１６時間、非還元 条件下で行った。１つのレーンを、ゲルの中心から切除し、そして銀染色により 顧色させた。ガイドとして染色されたゲル・レーンを使用して、α及びβ鎖のバ ンドを、切除し、そしてその蛋白を、０．１％ＳＯ５の存在中、Ａｍ１ｃｏｎ　 Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒ装置内で４時間、４００ｍＡにおいて電気泳動した 。溶出鎖を、濃縮し、０．１％ＯＧを含むＰＢＳに対して透析し、そして生来の そして還元されたＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で特徴付けした。

ペプチドの合成 配列、Ａｃ−ＡＳＱＡＲＰＳＱＲＨＧＳＫＹをもつ、ＲＩＢＰ（１−１４）Ａ’ のラット・ミニリン塩基性蛋白ペプチド同族体、配列、ＹＦＫＮ［ＶＴＰＲＴＰ ＰＰを現すＲＩＢＰ（８９−１０１）Ｙ”ペプチド、及び配列、ｌ５ＱＡＶＨＡ ＡＨＡＥ　ｆＮＥＡＧＲＹをもつ、卵白アルブミン・ペプチド、０ＶＡ（３２３ −３４０）Ｙ　３４’を、側鎖保護Ｆｍｏｃアミノ酸及びＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａ自動ペプチド合成機を使用して、標準的な固相法に より、合成した。脱保護された、粗ペプチド・アミドを、逆相ＨＰＬＣにより精 製し、そして精製ペプチドの同質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅ　ｉ　ｔｙ）及び同一性 （ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を、質量分光分析検定法により、確認した。

ペプチド結合検定 ペプチドの、α／βヘテロダイマー又は［Ａ”の単離鎖への結合を、薄層クロマ トグラフィー（ＴＬＣ）により、先に記載したような酢酸セルロース電気泳動（ ＣＡＥ）により、分析した。簡単に言えば、合成ＭＢＰ（１−１４）Ａ’及び０ ＶＡ（３２３−３４０）Ｙ　３４’ペプチドを、中性のｐＨにおいてＣｈｌｏｒ ａｍｉｎｅ−Ｔ　法を使用して［＋２５　ｉ］により放射標識した。２００μｇ ／ｍｌの濃度における無傷のＩＡｋ又は１００μｇ／ｍｌの濃度におけるそれぞ れの鎖を、４８時間、３７°Ｃにおいて５０倍のモルの過剰な放射標識ペプチド と共に、１００μｍの全容量において、インキュベートした。

過剰の未結合ペプチドを、０．１％ＯＧ洗剤を含むＰＢＳに対する４８時間３７ °Ｃにおける広範な透析により、除去した。１μｌの複合体を、５ｃｍのシリカ ・ゲルＴＬＣプレート上で３連て適用し、そして５０％メタノール及び５％酢酸 アンモニウムの溶媒系中で走らせた。このプレートを乾燥させ、そして放射能の 分布を、標識されたペプチドにより占有されたＩＡ’又は鎖のパーセントを計算 するために、Ｒ、０−０，２において、見積もった。

また、ペプチド結合を、ＣＡＥにより測定した。ここでは、１μｍの複合体を、 セルロース・ポリアセテート紙ストリップ（２，５ｃｍ　Ｎ１５．２　ｃｍ）の 中ノいに適用し、そして電気泳動を、高分解能Ｔｒｉｓ／Ｂａｒｂｉｔａｌ（３ ２，１ｗ／ｗ％、１３．７ｗ／ｗ％Ｂａｒｂｉｔａｌ及び５４．２ｗ／ｗ％ナト リウム・バルビツール）バッファーｐＨ８，１の存在中で１０分間３５〇一定ボ ルトにおいて行った。ストリップを、乾燥させ、そして標識されたペプチドによ り占有された［Ａｋ又は鎖のパーセントを計算するために、その起点（ｏｒｉｇ ｉｎ）を計数した。

鎖：ペプチド複合体の調製。

２つのタイプの複合体を、調製し、そして精製した。ペプチド結合及びＴ細胞結 合の検定のために、未標識のへテロダイマー又は個々の鎖と放射標識ペプチドと の複合体を、先に記載したように調製した。Ｔ細胞細胞外酸性化の速度の測定の ために、未標識クラスＩ］又は鎖及び未標識ペプチドを、同一条件下で使用し、 そしてその複合体を、］ｍＭリン酸ナトリウム、ペニシリン及びストレプトマイ シンを含む２炭酸塩不含、低緩衝化ＲＰＭＩ　１６４０媒質に対して透析した。

Ｔ細胞結合検定。

放射標識ペプチド及び非放射Ｍ！、　識１　ａダイマー又はモノマーの精製複合 体を、２．６　Ｘ　１０５休止Ｔ細胞と共にＣＯ，インキュベーター内で３７゛ Ｃにおいて踊ｇ／ｍｌ　ＢＳＡによりプレコートした１５ｍ１のポリプロピレン ・チューブの中でインキユベーした。抗体のブロッキング実験のために、細胞を 、標識複合体の添加の前に、５００μｇのアフィニティー精製ハムスター抗−マ ウスα／βＴＣＲモノクロナール抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉ ｅｇｏ、　ＣＡ）と共に、第一インキュベートした。ＴＮＰ　（Ｐｈａｒｍｉｎ ｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）に特異的な精製ハムスター［ｇＧイソ タイプ標準抗体を、陰性対照抗体として使用した。インキュベーション期間の終 わりに、１５ｍ１の冷凍ＰＢＳを、それぞれのチューブに添加した。細胞を、穏 やかに再Ｆ！！濁させ、２．０００　Ｘ　ｇにおいて遠心分離し、そしてその上 澄を、注意して除去した。洗浄手順を、３回繰り返し、そして細胞ベレットを、 ガンマ・カウンター内で計数した。

Ｔ細胞代謝酸性化速度の測定 酸性化速度測定のためのＴ細胞のマイクロフィジオメーターへの装填の詳細につ いては、０ｗ１ｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、前記中に記載されている。

簡単に言えば、細胞を、ＩＯ日日間抗原パルス（ｐｕｌｓｉｎｇ）から休止させ 、そしてそれらの塩基性代謝活性を低下させるため低血清（２，５％）培地中で 一夜培養する。細胞を収穫し、そして血清不含装填培地（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ 　バッファー、ｐＨ７，３を含む、低緩衝化ＲＰＬ！［１６４０）中にｌ　Ｘ　 １０７細胞／ｍｌにおいて再懸濁させる。細胞外酸性化測定を、マイクロフィジ オメーター内で行い、２．５分間当たり１分間の電位差計の測定値を集める。酸 性化速度のデータ（ボルト７秒）を、細胞刺激に先立って１００％に数学的に標 準化した。これは、別々のチャンバー内の細胞からのデータの比較することを可 能にする。

結果： アフィニティー精製ＩＡ’のα及びβ鎖を、非還元性ポリアクリルアミド・ゲル から電気溶出させ、そして図９中に示すようにＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル 電気泳動により特徴付けた。α／βヘテロダイマーのα及びβ鎖への解離は、精 製ＩＡ’を９５°Ｃにおいて５分間（パネルＡに示すように）インキュベートす ることによるか又はｐＨ３，０に４°Ｃにおいて１時間（パネルＢのように）晒 すことによるかのいずれかにより、達成されることができる。両方の条件が、こ のダイマーのモノマーへのかなりの解離をもたらす。高い温度におけるインキユ ベーシヨンは、ＭＨＣクラス］Ｉ鎖をより変性するよってあるので、低いｐＨ処 理が、モノマー濃縮のための方法として使用された。電気溶出法により精製され た個々の鎖は、交差汚染のいずれかからも自由である。場合により、異なるバッ チからの鎖調製物は、５−１５％ホモダイマーを含む。予測されるように、ホモ ダイマー・ノ＾シトは、易動性において、α／βヘテロダイマーの位置の近くに 移動する。生来のゲル内の約６０ｋＤにおける高分子量のバンドが鎖のいずれか の交差汚染の原因であないことを確かめるために、鎖調製物を、パネルＣ中に示 すように、２−４１Ｈによる還元の後に５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ゲル の銀染色は、検出可能な交差汚染性α又はβノくシトのいずれをも示さなかった 。鎖調製物中に存在するホモダイマーの相対量を、α及びβ鎖の両方についてそ の生来のゲル・レーンを走査するために定量化した。パネルＤ及びＥ中に示すよ うに、本研究において使用されるαとβポリペプチド調製物は、それぞれ、８゜ ６％と１２．９％のホモダイマーを含む。

ペプチドの、精製α及びβ鎖への結合は、＆ＩＢＰ（１−１４）Ａ’ペプチドの ［Ａ’への結合のためにＨａであることが報告されているところのｐＨ８，０に おいて行われた。図１０Ａ及び１０８中に示すような、ペプチド検定の両方にお いて、α及びβ鎖の両方の３０−３４％は、このペプチドにより占有されていた 。同一条件の下で単離されたα／βヘテロダイマーは、ＭＢＰ（１−１４）Ａ’ ペプチドによる２５％の占有率を示した。

ＭＢＰ（１−１４）Ａ’ペプチドの、［Ａ　ｋの個々の鎖への結合の特異性は、 そのそれぞれがペプチドの２−３％の結合のみを示すＩＡ　’のα及びβ鎖と共 に［＋２５１］−標識卵白アルブミン・ペプチド０ＶＡ（３２３−３４０）Ｙ　 ”０をインキュベートすることにより、示された。

１％ＯＧを含むＰＢＳ中の３７°Ｃにおける１本鎖：ペプチドの複合体の安定性 は、図Ｉｔ中に表されている。１時間、３７°Ｃにおけるβ鎖・ＭＢＰ（１−１ ４）Ａ　’複合体のインキュベーションは、４０％の解離を導Ｌ１だ。

これに反して、α鎖：＆ＩＢＰ（１−１４）Ａ　’複合体のほんの２０％の解離 及び［Ａ目ｔＢＰ（１−１４）Ａ　’複合体の５％の解離が、３７°Ｃにおいて ２４時間の期間にわたり観察された。αへＩＢＰ（１−１４）Ａ　’及びβ：Ｍ ＢＰ（＋−１４）Ａ　’について観察された解離は、明らかに２段階（ｂｉｐｈ ａｓｉｃ）である。開始相においては、β：＆ＩＢＰ（１−１４）Ａ　’複合体 は、より高い解離速度（ｋ。

＝６．２　ｘ　１０−＠５ｅｃ−’）をもっている。しかしながら、解離の第二 相のためには、α／β＾ＩＢＰ（１−１４）Ａ　’及びα・＾＋ＢＰ（１−１４ ）Ａ　’複合体の傾き（ｓｌｏｐｅ）は、それぞれ、５　ｘ　１０−’ｓｅｃ　 −’及び７　Ｘ　１０−’ｓｅｃ　−’のに、値とほとんど同しである。β：Ｍ ＢＰ（１−１４）Ａ　’複合体の第二相の傾きは、６．２　Ｘ　１０−’　５ｅ ｃ−’のに、値をもっていた。

影一 本例は、単離されたα及びβ鎖の、抗原性ペプチドとの１本鎖複合体かＴ細胞に 結合し、そしてこれを刺激することができることを、示している。

放射標識ペプチドと朱？！Ｊｉ　鎖との複合体を使用して、鎖・ペプチド複合体 とクローン化Ｔ細胞との直接結合を、測定し、そして細胞と会合する複合体分子 の数を、計算した。Ｔ細胞クローン４Ｒ３，９であってＩＡｋの文脈内で九ＩＢ Ｐ（＋−１４）を認識するものを、［＋２５１］＝へＩＢＰ（１−１４）Ａ　’ ペプチドを含む精製１本鎖複合体と共にインキュベートした。Ｔ細胞は、洗剤に 対し非常に感受性であるので、細胞結合及び刺激検定のために、洗剤不含の低緩 衝化ＲＰＭＩ　１６４０媒質又はＰＢＳバッファーに対して透析された複合体を 、使用した。図１２Ａ中に表された結果は、α鎮゛へＩＢＰ（１−１４）Ａ　’ 複合体の、４Ｒ３，９クローンＴ細胞への結合か、無傷のＩＡｋ：ＭＢＰ（１− １４）Ａ　’複合体のものに、匹敵することを示している。しかしながら、β鎖 ＾ＩＢＰ（＋−１４）Ａ　’複合体は、４Ｒ３，９Ｔ細胞へのより低い結合アフ ィニティーを示した。ｌＣクラスＩ＋ペプチド複合体とＴ細胞との会合は、３７ °Ｃにおいて６時間までに終了し、Ｔ細胞癌たりに会合した複合体分子の数か、 計算され、そしてＩＡ″　八ｔＢＰ（１−１４）Ａ　’複合体、α鎖訓ＢＰ（１ −１４）Ａ　’複合体及びβ鎖、八ＩＢＰ（１−１４）Ａ　’複合体について、 それぞれ、２．５５　Ｘ　１０　’　、２゜Ｉ　Ｘ　１０’　、１．０　Ｘ　１ ０’でることが見られた。Ｔ細胞癌たりに結合した複合体分子の数は、Ｔ細胞表 面上のＴＣＲｓの報告された数よりも高く、２．５−５．ＯＸ　１０’〜ｌ　ｘ 　１０’であり、これは、洗剤の非存在中の複合体の凝集レベルを原因とするこ とができた。Ｔ細胞に結合する鎖−ペプチド複合体の特異性は、＋Ａ’のα及び β鎖と［”’　！］：＆１ＢＰ（１−１４）Ａ　’ペプチドとの複合体を、ＩＡ ’とＭＢＰ（９０−１０３）複合体のために制限酵素処理されたＨＳ−Ｉ　Ｔ細 胞と共にインキュベートすることにより、確認された。

図１２Ｂ中に示すように、すべての３つの複合体の、ＩＡｋとλＩＢＰ（１−１ ４）ペプチドのために制限酵素処理された４Ｒ３，９Ｔ細胞への優先的結合を、 ＨＳ−Ｉ　Ｔ細胞と比較して観察した。陽性対照実験においては、ＩＡ“・軛Ｉ ＢＰ（８９−１０１）Ｙ　”″複合体のインキュベーションは、ＨＳ−１クロー ンＴ細胞への予想された強い結合を示した。４Ｒ３，９Ｔ細胞への鎖−ペプチド 複合体の結合も、α／β抗−ＴＣＲモノクロナール抗体により前処理された細胞 か複合体に結合できなかった（図１２Ｃ）ところの抗体ブロッキング実験により 確認された。同一条件下でイソタイプ適合抗体により前インキュベートされた細 胞は、結合の阻害を全く示さなかった。

単離された鎖、ペプチド複合体がインビトロにおけるＴ細胞応答の弓［き金を引 くかとうかを決定するために、我々は、リガント−仲介細胞引き金引き（ｔｒｉ ｇｇｅｒｉｎｇ）の細胞外酸性化速度を測定するマイクロフィンオメーターを使 用した。

Ｔ細胞代謝酸性化速度の測定・ 酸性化速度測定のためのマイクロフイジオメーターへのＴ細胞の装填の詳細につ いては、０ｗ１ｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、前記中に記載されている。

簡羊に言えは、細胞を、１０日間の抗原パルスから休止させ、そしてそれらの塩 基性代謝活性を低下させるため低血清（２，５％）培地中で一夜培養する。細胞 を収穫し、そして血清不合装填培地（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７ ，３を含む、低緩衝化ＲＰ九１１１６４０）中にＩ　Ｘ　１０’細胞／ｍｌにお いて再懸濁させる。細胞外酸性化測定を、マイクロフィジオメーター内で行い、 ２．５分間当たり１分間の電位差計の測定値を集める。酸性化速度のデータ（ボ ルト７秒）を、細胞刺激に先立って１００％に数学的に標準化した。これは、別 々のチャンバー内の細胞からのデータの比較することを可能にする。

複合体とＴＣＰとの相互作用の数分以内の特異的Ｔ細胞応答が、休止４Ｒ３，９ Ｔ細胞が１本鎖、ペプチド複合体に晒された時に、観察された。酸性化速度にお ける速い、持続性の増加であって、無傷ＩＡ’：ＭＢＰ（１−１４）Ａ　’複合 体とＴ細胞との相互作用の特徴的なものが、４Ｒ３，９Ｔ細胞が図１３Ａ中に示 すようにα鎖〜ＭＢＰ（＋−１４）Ａ　’複合体に晒された時に、観察された。

β鎖・ＭＢＰ（＋−１４）Ａ　’ペプチドの複合体も、４Ｒ３，９細胞における 増加された酸性化速度を誘導するか、α−鎖複合体と同程度ではなく、僅かによ り能力があった。無傷ＩＡ’　：ＭＢＰ（１−１４）Ａ　’複合体は、最も高い レベルのＴ細胞刺激を与えた。これは、約２時間後の複合体処理の後に、より明 らかになった。［Ａ”鎖：ペプチド複合体の、Ｔ細胞活性化の特異性は、図１３ Ａ及び１３Ｂ中に示すようにαとβの等モル混合物をＴ細胞を処理するために使 用するとき、増加した酸性化速度の欠如により、証明された。幾つかの実験にお いては、ペプチドをもたないα及びβ鎖は、培地単独の上では酸性化速度の増加 を全く与えなかった。同一セットの実験（図１３Ｂ）においては、幾つかの非特 異的＾ＩＨｃ複合体、ＩＡ″二＾＋ＢＰ（８９−１Ｏｆ）ＹＩＩ、］ＩＡα鎖： 九ＩＢＰ（８９−１０１）Ｙ　”　、及びＩＡ’β鎖・ＭＢＰ（８９−１０１） Ｙ　”１は、酸性化速度における存意な増加を誘導しなかった。

結論： 要約すると、ここに表した結果は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の単離鎖が抗原性ペプ チドに結合することかでき、そしてＭＨＣクラス１１分子の単離鎖と抗原性ペプ チドとの複合体がＴ細胞上の＾１１（Ｃクラス［１制限酵素処理されたＴＣＲｓ により認識されることを、証明した。Ｔ細胞クローン、４Ｒ３，９の場合には、 この結合は、無傷のへテロダイマーにより誘導されたものと類似の特異的Ｔ細胞 刺激を導く。この研究は、細胞表面上の無傷のα／βヘテロダイマーが抗原表象 のために常に必要ではないということを、示している。

例３ 本実験は、本発明の複合体がクローン化Ｔ細胞系において増殖性非応答性の状態 又はクローンのアネルギーを誘導することを証明している。これを行うために、 個々に単離されたα及びβ鎖、ＩＡ“のダイマー及び非ダイマーの形態を、ｋｌ ＢＰ９０−１０１　と複合体形成させ、そして）Ｉｓ−１クローン化Ｔ細胞の存 在中でインキュベートした。ＩＡ“・ＭＢＰ９０−１０１複合体は、ネズミＴ細 胞クローンＨ３−１により特異的に認識される。対照として使用された無関係な 複合体は、１つの特定のクローンにより特異的に認識されないこれらの２つの複 合体の後者であった。

クローン化Ｔ細胞系。ＨＳ−Ｉ　Ｔ細胞系クローンを、ＩＡ’発現抗原表象細胞 により提供される＆ＩＢＰ９０−１０１により制限酵素処理される。４Ｒ３，９ Ｔ細胞クローンは、ＩＡ’発現抗原表象細胞により提供される＾ＩＢＰ　ｒｌ− １４により制限酵素処理される。両方のクローンを、１０日間サイクル上で抗原 パルスに供した。

インヒドロにおけるＴ細胞非応答性の誘導。残りの抗原表象細胞を、Ｔ細胞クロ ーン（抗原パルスの１０日後）を、２ラウンドの１９％メトリズアミト（ｍｅｔ ｒｉｚａｍｉｄｅ）密度勾配遠心分離、その後のＲＰＡＩＩ　１６４０培地中の ２回の洗浄に供すことにより、除去した。Ｔ細胞クローン（Ｉ　Ｘ　１０　＠） を、適当な、適当でない対照複合体、並びに複合体の調製において使用された対 応ペプチドの１０−倍モル過剰の存在中で、３７°Ｃにおいて２４時間、それぞ れ培養した。追加の対照条件を、必要なときに導入した。Ｈｓ−１ａ胞を、４回 洗浄し、そして８　Ｘ　１０’　Ｔ細胞を、０．５，１０、又１；ｔ２０ｕＭ　 ＭＢＰ　９Ｏ−ｌｏｔペプチドの存在中、５Ｘ１０’新たに照射されたＳＪＬ／ Ｊ　ｎｍ１ＦＢ胞により、又ハ２０　Ｌｌ／ｍｌ　ＩＬ−またけにより、３連て 、培養した。３７°Ｃにおける７２時間のインキュベーションの最後の８時間の 間に、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを、添加し、そして増殖の程度を、取り込まれ た放射能により、測定した。

結果及び結論： 図１４は、Ｎ３−１細胞の、それぞれの関連複合体であっていずれかのダイマー 、α鎖、又はβ鎖［Ａ“成分から成るものへの、有意なアネルギ一応答について 説明している。この抗原性増殖応答性は、観察された制御応答の範囲にわたり、 少なくとも、２の因子により減少された。α鎖複合体及びβ鎖複合体とのアネル ギ一応答は、比較的類似しており、そしてそのダイマー複合体とは有意に異なっ ていなかった。［Ｎ１５は、複合体処理後のこれらの同一細胞の］Ｌ−２応答性 を、描写している。ア不ルギー細胞は、［Ｌ−２に感受性であることが報告され ているが、それらの増殖応答は、アネルギーを与えられていない細胞に比較して 存意に減少されていない。ＩＡ“複合体及びＩＡ“α鎖複合体のダイマー形態に 晒された）（Ｓ−１６ＢＩＩａは、減少された応答を示し、一方、β鎖のみから 作られた複合体は、対照のものと等価な［し−２応答を示す。

本例は、本発明の１本鎖複合体がインビボにおけるアネルギーを誘導する能力を 証明している。これらの実験は、ＳＪＬ／ＪマウスにおけるεＡＥの防止を証明 している。この実験は、一般的に、Ｓｈａｒｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｆ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８１１４６５−［４６９（１ ９９１）（：れを、引用により本明細書中に取り込む。）中に記載されているよ うに行った。簡単に言えば、【Ａｏのα及びβ鎖を、先に記載したような調製的 電気溶出法によるアフィニティー精製ＩＡ′から精製した。

ＥＡεは、Ｓｈａｒｍａ　ｅｔ　ａｌ中に記載されているように、１．２　Ｘ　 １０７ＭＢＰ（９１−１０３）反応性Ｔ細胞の養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ　ｔ ｒａｎｓｆｅｒ）により、導入される。本実験を、先に記載したように調製した ＡＩＢＰ　９１−１０３ペプチドと複合体を形成する］Ａ“のβ鎖を使用して行 った。０．３、及び７日目に、それぞれのマウスは、Ｓｈａｒｍａ　ｅｔ　ａｌ 中に記載されているように、０．５ｍｌ中の７．５μｇの複合体を受け取った。

結果を、図１６及び表１中に示す。

表１ ＭＢＰ　ｐ９１−１０３に結合した［−Ａｓ分子のβ鎖の注射による急性ＥＡＥ の防止 麻痺の数　開始日数　重症度の平均 β・！１ｌＢＰ９１−１０３　０／４ β九ＩＢＰＩ−１４２／４　１５　１．５α八ＩＢＰ９１−１０３　３／４　２ ４　１．２５β単独　２／４　１８　１．５ 生理食塩水ん　３／４　１２　１．５ 以下に表された結果は、ダイマーＭｌ（Ｃ分子を含んで成るＭＨＣ−ペプチド複 合体が洗剤の非存在中で凝集体として主に存在していることを示している。

１２３Ｉによりｍ識されたＩＡ′−Ｐ複合体を、上記の、米国特許第５゜１３０ 、２９７号中に記載されているように、調製した。複合体（１，５ｍｇ／ｍＩ） を、リン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）に対して広く透析し、洗剤を除去 し、そして６ｍｌ　ｂ、ｖ、　５ｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２００カラム（分画サイズ ５０００−６００．０００）上にロードした。図１７中に表された結果は、凝集 した複合体が空隙容量をもつカラムを通過し、そしてそれ故、６００．０００よ り大きな分子量をもつことを示している。

同しように透析されたＩＡ’複合体（１，５ｍｇ／ｍｌ）をも、遠心分離し、そ してそのペレットをカウントした。これを行うために、２００μｌの複合体（３ ００μｇ）を５ｍｌのＰＢＳ中で希釈し、そして６０分間、＋００．０００ｘｇ において固定角回転機内で遠心分離した。この結果を、以下の表２中に与える。

表２−高速回転による複合体凝集の検出実験＃　開始ｃｐｍ　べｈト中ｃｐｍ　 上澄中ｃｐｍ　凝集％１　５１４．５７６　３１７．７１７　２０５．７９７　 ６０．６８２　５１９．３４０　３２１，３０４　２０９．１０８　６０．５７ クロマトグラフイー及び遠心分離実験の結果は、両者とも、ＡＩＨＣ−ペプチド 複合体が凝集又はミセル形態において多く存在していることを示している。これ らの結果は、本発明の単一サブユニット複合体も、洗剤の非存在中では、凝集し ており又はミセル形態において存在していることを、強く示している。

本発明を、明瞭さ及び理解を目的として、上記の実施例において、幾分詳細に記 載したが、添付の請求の範囲の範囲内で、特定の変更及び修正を行うことができ ることは、明らかであろう。

ＦＩＧ　ＩＡ。

ＦＩＧ、２゜ ＦＩＧ、４゜ 一フ０　コく　αフ　ζ＜　ｅＭＪ　αフＣ呂゛甲　３弓　８遇５　６已　さ８ 　ηご”ａｒｅｚ　ｗ　Ｓ　”’；　Ｓ　：ミ、写　：呂　＝ミのフ　」フ　〉 Φ　＜＜　−−Ｌ）　＜ｔ、Ｄωフ　ｅ）　ａｌフ　−く　５０　−フ５フ　Ｏ ψく　；フ　Ｏフ　−ロ　＠＃ｕユフ　−くく　ユフ　〉Ｑ　くく　ψフＱ　沓 　ｏ）−ＣＤ　＜　１−　←　←Ｕ　）−ＣＤ　）−（ｔｏ　ＯＵ Ｑ　Ｕ）−Ｕ（Ｃ）　ヒ　← ８　旨　旨　白　？　８　已　ビ　已 ←　ＨＣＪ　（１−←　＜０１− ８　已　曹　旨　８　冨　≦　。　○ ヒ　＜＜＜　←　Ｌ）　ｕｕｕ （Ｄ　ｏ　・　ｕｏ（ｇ　已　宕　已 ８　冨　ミ　目　８ａｈ＜＜ Φ　Ｑ　）−０←　Φ　）−Ｃ）　＜ 旨　ａ　＝　１　？　詳　Ｈｐ　ＩＪ ＱＯΦＯΦ＜）　＋５　Ｑ　（Ｊ ｊ：：：：、、ｇ、定 ■　ミ　ｉ　目　１　目 Ｑｌ−（５１−（ヒ　已　已　８ く　０　）−δ　定　８　く　０　ト ０１−＜ ＜　（Ｊ　）−（く　（Ｑ　（Ｕ ８８８　冒　は　已　＜Ｂ　旨 已　已　已　目　８８　詳　罎　旨 ０ｌ−ＣＤ＜ト　ヒ　Ｈ（Ｊ　（） ＜５　ＣＪ　（Ｊ Ｕ　ｇ　（′　Ｕ　″　は　（。　０ ８　旨　≦　８　冒　（＋ｕｕ 盲　已　８　宕　ｂ　１９３　曹 ＜ＨＣ，）Ｑｌ− 一　■　−〇　■　〜　ト　−〇 ？””　（ｙＮ’ｌ’ −〜 Ｑ　ト　（Ｑ　（○　ト　Φ ロ　（、）ＱＵ（ ｏＭ　引　く　。　←　０ １−　（Ｃ）Ｃ）　Ｃり　ロ　く　Ｑ く　Ｏ←　Ｌ）、　！−１−Ｕ　ＣＪ ω　Ｕ　ｄ　）−（Ｊ　（り　Ｌ）　＜（（１−″　０　冒　ｂ　３　討 ロ　）−Ｑ ？　く　。　く　く　←　。　Ｑ く　ロ　←　く　Ｑ　Φ　Ｑ　く ０←Φ０ｏｔｐｏｕ （（）−ＣＤ　Ｏ）−←　０ （１−Ｃ，＋１−）−□Ｌ）　ヒ ０　ト　Φ　Ｑ　Ｃ）　１−　Φ　Ｏ ｓｈ＜＜＜　Ｑ　←　Ｏ ！＝＝１　舊　■３ く　ロ　く　Ｑ ヒ く　ロ　く　Ｑ ″″　旨　Ｌ　ト　。　Ｑ　Φ １−Ｕ　Ｃ：）＜ｖ　← Ｑく ＵＯ）−（○　く　Φ　Φ ００　０　（１：　台　冒　已 ト　く　０　０ ＣＪｃｐｌ−ｃｐＯＵ　ロ　ト ド　←　く　く　○　く　←　已 ０　０　Ｓ　ｌ−ＣＤ　Ｌ）　← ｔ−ｏ　Ｑ　＜Ｄ　０　０ ０　（し　８　才　３　８　＝ ＨＯく　く く　く　０　←　Ｏ已　旨　８　。

Ｕ　Ｑ　Ｕ　←　ビ　。　ｕ＜　。

（Ｌ）　＜Ｃ） Ｌ）　（（○　○　○　ヒ　Ｏト Ｃｒ−００Φトく ビ　Ｂ：ｏｕ＋＋＋ く ａ＜ａ＜ＬＤ　ＣＤ　←　く　ヒ ←　（＜）　ｔ）　ｔＤ　＜　ＣＤ　Ｏヒ←　Ｑｌ−１−ロ　ＣＪ　Ｌ：ｌ　） −（Ｊｏ　Ｏく　Ｏ Ｈ（）−１−リ　に　日　。　０ ０　０　０　Ｑ ｏ　ト　）−Ｑ　ト　Φ く Φ　ロ　ロ　ロ　く　）−０く ８　已　し　８　定　し　００ く　目　■　ｌ　１ く ８８８８　旨　８　定　ビ く　く　○　く　Φ　Ｑ　Φ　− ド　冨　Ｊ　屍　８　＝　３　は ヒ　←　ｕ（（Ｃ，）（Ｑ ｏ　０　ロ　ｏｏｕ ≦　１５　冒　巳　？　定　冨 ８　曾　８　冒　旨　０００ ヒ　ヒ　Ｌ）　Ｉ−ｕ　＜　Ｉ−。

・　・　・　目　目　訟 く　ロ　← Φ　く　ロ 旨　旨　８　冨　８３　は　鴇 〈　Φ　（ＣＩＯ（Ｊ Ｑ　ヒ　０　く　ロ　Ｑ　０　０ ＝　＝　ご　８　討　８　巳　じ ＯＱΦΦＵ　Ｕ　Ｃ） ？　ロ　ト　←　ト　≦　８　３ （）　ＣＪ　ＣＤ○Ｏ Ｕ　（Ｕ は　８　定　８　宜　已　５　急 Ｑ　（ｔＤ　（Φ −■　−〇　−■ −？　■　口　０）　羽　に　δ −１−〜　−廿ｎω　−の■　９＝臼口！りとぎ　さぎ’ｊ：　：Ｆ！　ｒ２’ ２　ぎぎ　３Ｃ・Ｎ〜　！２Ｂ！、　。。　εＢ　−二 Ｆ／（３８゜ ＦＩＧ、　９Ａ、　ＦＩＧ、　９Ｂ。

ＦＩＧ、　ＩＯＡ、　ＦＩＧ　１０１１ＦＩ６．　１２１１゜ ＦＩＧ、１３Ａ。

ＦＩＧ　１．５θ ＦＩＧ、１５Ａ ＦＩＧ、ｌ５１３゜ ＬＪ／ｍｌ　ＩＬ２ ＦＩＧ　１５Ｃ 日数 ＦＩＧ、／６ Ｆ／に、／７： フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／７４　 ８３１８−４ＨＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　８３１０−２Ｊ３３１５６４　Ｚ　 ９０１５−２Ｊ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　（Ｊｉ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ ，ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、 　ＣＨ，Ｃ５゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ 、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、Ｓ Ｄ、ＳＥ ＦＩ （７２）発明者　シャーマ、ツメシュ　ディー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０２２゜オスアルトス、ステユアート　 コート　躬（７２）発明者　マツコーネル、ハーデン　エム。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４３０５゜各タンフォード、エル　エスカ ーパド

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原性ペプチド及び抗原結合部位をもつ単離ＮＨＣサブユニット成分を含ん で成る実質的に純粋なＭＨＣ−ペプチド複合体であって、その抗原性ペプチドが その抗原結合部位と会合し、そしてそのＭＨＣ−ペプチド複合体が疾患関連Ｔ細 胞上のＴ細胞レセプタに選択的に結合するようなＭＨＣ−ペプチド複合体。
2. ２．抗原性ペプチド又はＮＨＣサブユニット成分に結合するエフェクター成分を さらに含んで成る、請求項１に記載の複合体。
3. ３．エフェクター成分が毒素である、請求項２に記載の複合体。
4. ４．エフェクター成分が標識である、請求項２に記載の複合体。
5. ５．ペプチドが抗原結合部位と非共有結合により会合している、請求項１に記載 の複合体。
6. ６．ベブチド上のエピトープが自己免疫疾患と関連したＴ細胞により認識される 、請求項１に記載の複合体。
7. ７．ＭＨＨＣサブユニット成分がクラスＩＩα鎖である、請求項１に記載の複合 体。
8. ８．ＭＨＣサブユニット成分がクラスＩＩβ鎖である、請求項１に記載の複合体 。
9. ９．医薬として許容される担体、並びに抗原性ペプチド及び抗原結合部位限もつ 単離ＭＨＣサブユニット成分を含んで成る単離されたＮＨＣ−ペプチド複合体で あってその抗原性ペプチドがその抗原結合部位と会合し、そしてそのＭＨＣ−ペ プチド複合体が疾患関連のＴ細胞上のＴ細胞レセプタに結合するような複合体を 、含んで成る医薬組成物。
10. １０．ＭＨＣ−ペプチド複合体がエフェクター成分をさらに含んで成る、請求項 ９に記載の医薬組成物。
11. １１．複合体がリボソーム又はミセル中に取り込まれている、請求項９に記載の 医薬組成物。
12. １２．複合体の濃度が約０．０２重量％と約１重量％との間にある、請求項９に 記載の医薬組成物。
13. １３．医薬として許容される担体がリン酸塩バッファー生理食塩水である、請求 項９に記載の医薬組成物。
14. １４．哺乳類において標的Ｔ細胞におけるアネルギーを誘導する方法であって、 標的Ｔ細胞に結合することができる複合体であってその複合体が抗原性ペプチド 及び抗原結合部位をもつ単離ＭＨＣサブユニット成分を含んで成り、その抗原性 ペプチドがその抗原結合部位と会合しているような複合体の治療的有効投与量を 、その哺乳類に投与することを含んで成る方法。
15. １５．ＭＨＣ成分がクラスＩＩα鎖である、請求項１４に記載の方法。
16. １６．ＭＨＣ成分がクラスＩＩβ鎖である、請求項１４に記載の方法。
17. １７．複合体がリボソーム又はミセル中に取り込まれている、請求項１４に記載 の方法。
18. １８．Ｔ細胞が自己免疫疾患と関連している、請求項１４に記載の方法。
19. １９．哺乳類において標的Ｔ細胞を取り去る方法であって、その標的Ｔ細胞に結 合することができる複合体であってその複合体が抗原性ペプチド、抗原結合部位 をもつ単離ＭＨＣサブユニット成分、及びエフェクター成分限含んで成り、その 抗原性ペプチドがその抗原結合部位と会合しているような複合体の治療的有効投 与量を、その哺乳類に投与することを含んで成る方法。
20. ２０．ＭＨＣ成分がクラスＩＩα鎖である、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．ＭＨＣ成分がクラスＩＩβ鎖である、請求項１９に記載の方法。
22. ２２．エフェクター成分が毒素である、請求項１９に記載の方法。
23. ２３．毒素が抗原性ペプチドと待合している、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．毒素がアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｉｎ）、マイコフェノレート（ ｍｙｃｏｐｈｅｎｏ１ａｔｅ）又は１３１である、請求項２２に記載の方法。
25. ２５．複合体がリボソーム又はミセル中に埋め込まれている、請求項１９に記載 の方法。
26. ２６．Ｔ細胞が自己免疫疾患と関連している、請求項１９に記載の方法。
27. ２７．哺乳類において自己免疫疾患を治療する方法であって、医薬として許容さ れる担体、並びに自己抗原性ペプチド及び抗原結合部位をもつ単離ＭＨＣサブユ ニット成分を含んで成る精製されたＭＨＣ−ペプチド複合体であってその自己抗 原性ペプチドがその抗原結合部位と会合している複合体を含んで成る医薬組成物 の治療的有効投与量を、その哺乳類に投与すること限含んで成る方法。
28. ２８．ＭＨＣ−ペプチド複合体が毒素をさらに含んで成る、請求項２７の方法。
29. ２９．医薬組成物が静脈内に投与される、請求項２７の方法。
30. ３０．有効投与量が、体重ｋｇ当たり約３ｍｇＭＨＣ−ペプチド複合体と体重ｋ ｇ当たり約１５ｍｇＭＨＣ−ペプチド複合体との間にある、請求項２９に記載の 方法。
31. ３１．自己免疫疾患がリウマチ様関節炎、多発性硬化症又は重症筋無力症である 、請求項２７の方法。
32. ３２．哺乳類において自己免疫疾患を診断する方法であって、医薬として許容さ れる担体、並びに標識付け部分、自己抗原性ペプチド及び抗原結合部位をもつ単 離ＭＨＣサブユニット成分を含んで成る精製されたＭＨＣ−ベブチド複合体であ ってその自己抗原性ペプチドがその抗原結合部位と会合している複合体を含んで 成る医薬組成物の診断的有効投与量を、その口前乳類に投与することを含んで成 る方法。
33. ３３．標識付け部分がラジオアイソトープである、請求項３２に記載の方法。
34. ３４．抗原性ベブチド、及び抗原結合部位をもつ単離ＭＨＣサブユニット成分を 含んで成る複合体の製造方法であって：糖蛋白を生産する細胞からＭＨＣ糖蛋白 を単離し：そのＭＨＣ糖蛋白からＭＨＣサブユニット成分を単離し：そのＭＨＣ サブユニット成分を、そのペプチドがその抗原結合部位に結合しているようなペ プチドと、接触させ：そして、その抗原結合部位に結合していない過剰のペプチ ドを除去する、ことを含んで成る方法。
35. ３５．過剰のペプチドを除去する段階が透析により行われる、請求項３４に記載 の方法。
36. ３６．リボソームを形成させるために脂質の存在中で複合体を透析する段階をさ らに含んで成る、請求項３４に記載の方法。
37. ３７．ペプチドが抗原結合部位に非共有結合により結合している、請求項３４に 記載の方法。
38. ３８．ＭＨＣサブユニット成分がクラスＩＩα鎖又はクラスＩＩβ鎖である、請 求項３４に記載の方法。
39. ３９．ペプチドがＭＢＰのアミノ酸１−１４を含んで成る、請求項３４に記載の 方法。
40. ４０．エフェクター成分を複合体に付着させる段階をさらに含んで成る、請求項 ３４に記載の方法。