JPH07501682A - 植物プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ９、　タンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項 １または２記載のプロモーターを保有する植物細胞。

１０、請求項８または９記載の植物細胞から再生されたトランスジェニック植物 。

１１、タンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項 １または２記載のプロモーターを細胞中に保有するトランスジェニック植物。

１２、請求項ＩＯまたは】ｌ記載のトランスジェニック植物から得られた種子。

１３、植物細胞において目的タンパク質を生産する方法であって＝（ｉ）請求項 ４−７のいずれか１つに記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、ただし 前記プロモーターの制御下にある遺伝子によりコードされるタンパク質が目的タ ンパク質である：および （ｉｉ）形質転換した植物細胞を、該タンパク質の発現を可能にする条件下で培 養すること； から成る方法。

１４、目的タンパク質を生産し得るトランスジェニック植物を作製する方法であ って： （ｉ）請求項４−７のいずれか１つに記載のベクターで植物細胞を形質転換する こと、ただし前記プロモーターの制御下にある遺伝子によりコードされるタンパ ク質が目的タンパク質である；および （ｉｉ）形質転換細胞から植物体を再生すること；から成る方法。

明細書 植物プロモーター 本発明は、植物プロモーターに関する。

植物細胞壁の主要な構造成分は、量の点からすると、セルロース、ヘミセルロー スおよびペクチンポリマーを含めた多糖類であるが、いくつかの特殊な細胞型（ 例えば、脈管／表皮細胞）では、細胞の機能的な役割に適合する他の成分がそれ らを補足している。

双子葉植物の細胞壁はさらに２種類の構造タンパク質、すなわちヒドロキシプロ リンに富む糖タンパク質（ＨＧＲＰ）と比較的最近ではグリシンに富むタンパク 質（ＧＲＰ）の仲間を含むことが見いだされた。エクステンシンと称するＨＧＲ Ｐは特徴的なＳ−Ｐ４反復構造を有し、プロリン残基がヒドロキシル化されてお り、その後グリコシル化される。

この度、双子葉植物からプロリンに富むタンパク質（ＰＲＰ）が数多く単離され た。これらのうちの多くは細胞壁と関係のあることが分かっているが、その機能 はまだはっきりしていない。個々の細胞型および個々の種において、存在するＰ ＰＰは異なっていると思われる。

ＰＰＰをコードするゲノムおよびｃＤＮＡクローンの単離から、これはいくつか の構造的に異なる配列を含むタンパク質群であることが見いだされた。ＰＰＰを コードする遺伝子の一部はメッセンジャーＲＮＡレベルで高度に調節された発現 パターンを示し、創傷、菌類の感染、オーキシンにより、または結節形成の間に 誘発されることが判明した。近年、２つの論文により、特定のＰＲＰ遺伝子の発 現は特定の発生現象と相関することが明らかになった。

双子葉植物の事例と対照的に、単子葉植物種からのＰＰＰに関するデータはほと んどない。トウモロコシからのエクステンシン様タンパク質の精製が報告された が、ヒドロキシプロリン残基は低レベルでしか存在しなかった。これに続いて、 トウモロコシ由来の高度に反復性のＰＲＰ　ｃＤＮＡ配列が発表され、ｍＲＮＡ 発現の研究から最高レベルは根の先端と子葉鞘に存在することが分かった。この タンパク質は、それが高い割合のトレオニン残基を含む点を除いて、双子葉植物 種由来のＰＲＰと有意なレベルの類似性を共有している。

本発明者らはこの度、２種類のプロリンに富むタンパク質（ＰＰＰ）の遺伝子の それぞれに対するプロモーター配列を同定した。

従って、本発明は、次のヌクレオチド配列：（ａ）　ＰＲＰ１４０遺伝子の上流 の−１３６９から−４９まで、または（ｂ）　ＰＰＰ３７８遺伝子の上流の−２ ３１６から−１２までを有するプロモーターを提供し、この配列は、修飾された 配列がプロモーターとして作用する能力を有する限り、１個またはそれ以上の塩 基の置換、挿入および／または欠失により、および／または両端あるいは一端で の伸長により修飾されていてもよい。

本発明はまたタンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された 前記プロモーターから成るＤＮＡ断片を提供する。

さらに、前記プロモーターの制御下にタンパク質をコードする異種遺伝子を含む ベクターが提供され、これにより該ベクターで形質転換された植物細胞は前記遺 伝子を発現することができる。適当なベクターはプロモーターが前記遺伝子の５ ゛末端に直接連結されたものである。前記ベクターはさらに植物細胞ゲノムへの 該遺伝子とプロモーターの伝達および安定した組込みを可能にする領域を含んで いてもよい。このベクターは通常プラスミドである。

植物細胞はこの種のベクターを使って形質転換することができる。従って、本発 明はさらにタンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された前 記プロモーターを保有する植物細胞を提供する。このような植物細胞からトラン スジェニック植物を再生しうる。得られたトランスジェニック植物は、その細胞 中に、タンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された前記プ ロモーターを保有する。トランスジェニック植物からは種子を採ることができる 。

本発明はさらに植物細胞内で目的タンパク質を生産する方法を提供し、この方法 は： （ｉ）　本発明によるベクターで植物細胞を形質転換すること、ただし前記プロ モーターの制御下にある遺伝子によりコードされるタンパク質が目的タンパク質 である：および（ｉｉ）　形質転換した植物細胞を、該タンパク質の発現を可能 にする条件下で培養すること； から成っている。

さらに、本発明は目的タンパク質を生産しうるトランスジェニック植物を作製す る方法を提供し、この方法は：（ｉ）　本発明によるベクターで植物細胞を形質 転換すること、ただし前記プロモーターの制御下にある遺伝子によりコードされ るタンパク質が目的タンパク質である；および（ｉｉ）　形質転換細胞から植物 体を再生すること；から成っている。

目的タンパク質は第一の方法により得られた形質転換植物細胞から、または第二 の方法により得られた植物体から単離することができる。

本発明のプロモーターは塩基−１３６９から塩基−４９までのコムギＰＲＰ１４ ０遺伝子の上流の配列、または塩基−２３１６から塩基−１２までのコムギＰＲ Ｐ３７８遺伝子の上流の配列から成り、塩基ＩはＰＲＰのＡＴＧ翻訳開始コドン のＡである。ＰＲＰ１４０プロモーターの配列は図６から、ＰＲＰ３７８プロモ ーターの配列は図５から、それぞれ推定することができる。

このプロモーターは、コムギＤＮＡのゲノムライブラリーを作製し、ＰＲＰ１４ ０またはＰＲＰ３７８遺伝子のライブラリーをスクリーニングし、コムギＰＲＰ １４０またはＰＲＰ３７８遺伝子の上流の配列を適当な制限酵素および／または エキソヌクレアーゼで消化することにより得られる。ＰＲＰ１４０遺伝子の上流 配列の塩基−４９にＮ５ｐＢＩＩ制限部位が、塩基−１３６９にＸｂａｌ制限部 位が存在する。ＰＲＰ３７８遺伝子の上流配列の塩基＋７２にＮｏｔｌ制限部位 が、塩基−２３１６に旧ｎｄｌ１１制限部位が存在する。

プロモーター配列から成るコムギＰＲＰ１４０またはＰＲＰ３７８遺伝子の上流 配列を含む数種類のプラスミドベクターが作製された。これらのベクターにはｐ ｌＰＫＨ−１２／２．３、ｐＸＮｏｔ／１．４５、ｐＢＩＸＮ／１．３およびｐ ＨＮ／２．４が含まれる。これらのベクターを保有する大腸菌ＭＣ１０２２は、 １９８９年１１月９日に英国アバディーンのナショナル　コレクション　オブ　 インダストリアル　アンド　マリーン　バクテリア　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　ＭａｒｉｎｅＢａｃ ｔｅｒｉａ）に受託番号ＮＣＩＭＢ　４０２２３、ＮＣＩＭＯ４０２２４、ＮＣ ＩＭＢ４０２２５およびＮＣＩＭＢ　４０２２６としてそれぞれ寄託された。

ｐＢＩＸＮ／１．３はｐｌＰＸＮ／１．３という名称で寄託された。

ＰＲＰ１４０プロモーターはｐＸＮｏｔ／１．４５をＸｂａ　ＩとＮ５ｐＢＩＩ で消化することによりこのプラスミドから切り出すことができる。ＰＲＰ３７８ プロモーターはｐＨＮ／２．４をＮｏｔｌ−ＢｓｔＸＩて線状化し、ヌクレアー ゼとインキュベートし、プラスミド集団を再連結し、ＰＲＰ３７８遺伝子の３′ 末端から塩基−１２までの欠失を有するプラスミドを選択し、このプラスミドを 旧ｎｄｌｌｌで消化することにより切り出すことができる。

プロモーター配列は１個またはそれ以上の塩基の置換、挿入および／または欠失 により、および／または両端あるいは一端での伸長により修飾されていてもよい 。しかしながら、修飾されたプロモーター配列はまだプロモーターとして機能し なければならない。コムギＰＲＰ１４０遺伝子の上流配列の塩基−７６９から塩 基−４９までの配列、およびそれより短い配列は、満足したレベルでタンパク質 を発現させるのに十分でないことがわかった。一方、コムギＰＲＰ１４０遺伝子 の上流配列の塩基−９６１から塩基−４９までの配列は満足したレベルでタンパ ク質を発現させる。一般的に、修飾配列とコムギＰＲＰ１４０遺伝子の上流の塩 基−１３６９から塩基−４９までの未修飾天然配列またはコムギＰＰＰ３７８遺 伝子の上流の塩基−２３１６から塩基−１２までの未修飾天然配列間には少なく とも６０％の相同度が必要である。相同度は少なくとも７５％、少なくとも８５ ％、あるいは少なくとも９５％でありうる。

ＰＲＰ１４０遺伝子の塩基−１３６９またはＰＲＰ３７８遺伝子の塩基−２３１ ６の上流へ（例えば他の制限部位まで）伸長する、より長いプロモーター配列も 提供される。上流への伸長は、一般にＰＲＰ１４０遺伝子の塩基−１３６９また はＰＰＰ３７８遺伝子の塩基−２３１６の上流の天然ヌクレオチド配列から成る 。この種のより長い配列は上記のようなコムギＤＮＡのゲノムライブラリーから 得ることができる。

塩基−９６１から塩基−４９までのコムギＰＲＰ１４０遺伝子の場合でも、上流 配列は１個またはそれ以上の塩基の置換、挿入および／または欠失により、およ び／または両端あるいは一端での伸長により修飾されてもよい。この場合も、こ のような修飾配列はプロモーターとして機能しなければならない。より長い修飾 配列および未修飾配列間には少なくとも６０％、例えば少なくとも７５％、少な くとも８５％　、あるいは少なくとも９５％の相同度が存在しうる。

修飾プロモーター配列は天然プロモーター配列に変化を導入することによって得 られる。これは天然配列のエンドヌクレアーゼによる制限、リンカ−の挿入、エ キソヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼの使用、特定部位の突然変異誘発 などの適当な技法を使って達成される。従って、より短いＤＮＡ配列は、例えば エキソヌクレアーゼＩｌｌやＢＡＬ　３１のようなエキソヌクレアーゼを使って 、天然プロモーター配列の５゛または３゛末端からヌクレオチドを除くことによ り得られる。

修飾配列がプロモーターとして機能しうるかどうかは簡単（こ確認できる。実施 例の如く細菌リポータ−遺伝子β−グルりロニダーゼのようなタンパク質コード 配列の上流にこの修飾配列を配置する。次にタバコリーフディスクを形質転換す る。その後、形質転換細胞により発現されたタンパク質を検定する。β−グルク ロニダーゼの場合は実施例１に記載した通りである。

プロモーターはタンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結する 。異種遺伝子は発現を希望するどのようなタンパク質をコードしてもよい。“異 種”とは、その遺伝子がそのプロモーターに自然界において機能しうる状態で連 結されていないことを意味する。従って、該遺伝子は、プロモーターがＰＲＰ１ ４０遺伝子の上流配列から誘導される場合にはＰＲＰ１４０をコードせず、また プロモーターがＰＲＰ３７８遺伝子の上流配列から誘導される場合にはＰＲＰ３ ７Ｂをコードしない。タンパク質はそのＮ−末端に異種遺伝子配列内にコードさ れる輸送ペプチド配列を含んでいてもよい。

プロモーターは一般に植物組織での遺伝子の発現を制御するために使用される。

発現がプロモーターによって制御されるタンパク質は除草剤耐性遺伝子によりコ ードされるタンパク質、もしくは害虫や病原体を生物学的に防除するタンパク質 でありうる。かくして、このタンパク質は葉を食べる昆虫に対して耐性を付与す るＢ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素のような殺虫性タンパク質でありうる 。

このプロモーターの他の用途は、ウィルス感染を防御するウィルスコートタンパ ク質の生産、医薬のような価値の高いタンパク質の生産、牧草の味や栄養価を変 えるタンパク質の生産などである。

プロモーター配列は異種遺伝子に直接またはリンカ−を介して連結する。リンカ −配列はイントロンを含んでいてもよい。イントロン配列の長さを除いて、リン カ−は４５個までの塩基、例えば３０個まで、あるいは１５個までの塩基で構成 することができる。リンカ−配列は輸送アミノ酸配列（例えば葉緑体やミトコン ドリアといった所定の細胞下領域にタンパク質を向かわせることができる輸送配 列）をコードする配列を含んでいてもよい。また、リンカ−配列は、発現レベル を高めるために、エンハンサーの特性を有する配列を含んでいてもよい。

プロモーターが異種遺伝子に機能しうる状態で連結されたＤＮＡ断片およびベク ターを作製することができる。これらの断片およびベクターは一本鎖であっても 、二本鎖であってもよい。直接このような断片を用いて、あるいはこの種のベク ターを用いて植物細胞を形質転換できる。ベクターにはプロモーターの制御下に 異種遺伝子が組み込まれる。このベクターはベクターで形質転換された植物細胞 において遺伝子を発現させることができる調節要素をさらに含む。このような調 節要素としては、プロモーターのほかに、翻訳開始および／または終止配列を挙 げることができる。

ベクターは一般にキメラ遺伝子および連結された調節制御要素の植物細胞ゲノム への伝達と安定した組込みを可能にする領域も含んでいる。

従って、ベクターは一般に転写調節配列および／または、その遺伝子のコード配 列の３”末端に存在しない場合は、停止フトンを備えている。かくして、ＤＮＡ 断片にも植物細胞での遺伝子の発現を可能にするターミネータ−配列および他の 配列が組み込まれる。

植物の特定部分でのまたはある条件下での発現レベルを上昇あるいは低下しうる エン／）ンサーまたは池の要素もＤＮＡ断片および／またはベクターに組み入れ ることができる。さらに、ベクターζま通常形質転換植物細胞に耐性を付与する 抗生物質耐性遺伝子をもっており、抗生物質を加えた適当な培地での増殖により 、形質転換された細胞、組織および植物を選別し得る。

形質転換細胞は適当な培地での増殖により選別する。かくして、例えば植物細胞 ゲノム中に、プロモーターの制御下に異種遺伝子を保有する植物細胞から成る植 物組織が得られる。従って、この遺伝子は植物細胞内で発現可能である。その後 、細胞内に、例えば植物細胞ゲノムに組み込まれた、異種遺伝子とプロモーター を含み、その結果として遺伝子を発現しうる植物体を再生することができる。再 生された植物体は繁殖させることができ、例えば種子を採ることができる。

植物細胞の好適な形質転換法は、異種遺伝子に機能しうる状態で連結されたプロ モーターを含むベクターを保有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）を使用することである 。従って、次の要素：（ａ）植物細胞のゲノムに組み込まれたとき遺伝子を発現 させることができる前記プロモーターと他の調節要素の制御下にある異種遺伝子 ： （ｂ）植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を定める少なくとも１つのＤＮＡ 配列：および （Ｃ）このＤＮＡを植物ゲノムに伝達することかできるＤＮＡ配列；を含むハイ プリントプラスミドベクターが使用される。

一般に、植物細胞ゲノムに組み込まれるＤＮＡはＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ ボーダー配列により境界を定められる。ただ１つのボーダー配列が存在するとき には、好ましくはそれは右端ボーダー配列である。このＤＮＡを植物細胞ゲノム に伝達することができるＤＮＡ配列は一般にＴＩ−プラスミドのビルレンス（ｖ ｉｒ）領域である。

かくして、異種遺伝子とその転写・翻訳調節要素（プロモーターを含む）はＴｉ −プラスミドのＴ−ＤＮＡボーダー配列間に挿入することができる。このプラス ミドは腫瘍化遺伝子が欠失された無力化Ｔｉ−プラスミドであってもよい。しか しながら、異種遺伝子とその転写・翻訳調節要素（プロモーターを含む）は、ｖ ｉｒ領域を含むＴｉ−プラスミドとトランスで二成分ベクター（ｂｉｎａｒｙｖ ｅｃｔｏｒ）のＴ−ＤＮＡボーダー間に挿入される。このような二成分ベクター は次の要素： （ａ）植物細胞のゲノムに組み込まれたとき遺伝子を発現させることができる前 記プロモーターと他の調節要素の制御下にある異種遺伝子；および （ｂ）植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を定める少なくとも１つのＤＮＡ 配列； を含む。

従って、ハイブリッドプラスミドベクターまたはｖｉｒ領域を有するＴｉ−プラ スミドとトランスで二成分ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシェン スを使って、植物細胞を形質転換することができる。茎やリーフディスクのよう な組織移植片にこの細菌を接種するか、あるいは再生用の植物プロトプラストと この細菌を同時培養する。また、植物プロトプラストは異種遺伝子をコードする ＤＮＡ断片（プロモーターと適当な他の転写・翻訳調節要素が存在する）の、ま たはこのような断片を含むベクターの、直接導入により形質転換してもよい。直 接導入はエレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、マイクロインジェ クションあるいは粒子衝撃を使って達成できる。

単子葉または双子葉植物からの植物細胞を本発明に従って形質転換することがで きる。単子葉植物種としてはオオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネなどがある 。双子葉植物種としてはタバコ、トマト、ヒマワリ、ペチュニア、ワタ、テンサ イ、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、セイヨウアブラナ、ポプラなどがあ る。

形質転換された植物細胞の組織培養物を増殖させると、分化した完全な形質転換 植物体が再生される。形質転換植物細胞は適当な培地で、好ましくは選択可能な 増殖培地で培養する。発生したカルスから植物体を再生することもできる。かく して、細胞中に、例えばそれらのゲノムに組み込まれた、異種遺伝子に機能しう る状態で連結されたプロモーターを保有するトランスジェニック植物が得られる 。その結果、この遺伝子は細胞内で発現可能である。

将来使用するために、再生された植物体から種子を採集することができる。

以下の実施例は本発明を例示するものである。添付図面において： 図１は、ファージ３ｃＸ２の挿入物ＤＮＡの制限地図を示す；図２は、ファージ Ｅ３．２の挿入物ＤＮＡの制限地図を示す；図３は、ＰＲＰ３７８遺伝子の配列 を示す：図４は、ＰＲＰ１４０遺伝子の配列を示す：図５は、ＰＰＰ３７８遺伝 子の上流の調節配列を示す；図６は、ＰＲＰ１４０遺伝子の上流の調節配列を示 す；図７は、ｐＢＩＩ（Ｎ／２．４の構築を示す；図８は、ｐＢＩＸＮ／１．３ 　（７）構築を示す；図９は、ｐＢＩＤ−２３４、−４００、−５４０、−７６ ９および−９６１Ｎの構築をホス１０は、ｐｌＰＫＨ−６、−１２および一５０ ／２．３の構築を示す；図１１は、ｐｌＰＨ−６／２．３の構築を示す；図１２ は、ｐｌＰ　Ｓ−６／７６２およびｐｌＰ　Ｐ−６／６１５の構築を示す；図１ ３は、ｐｌＰＤ−６／１８３９．１５１０．１２８９、＋０２３および８１６の 構築を示す； 図１４は、ＢＩＮ　１９に基づいた構築物の融合連結部の配列を示す；図１５は 、ｐｕｃ１９に基づいた構築物の融合連結部の配列を示す；図１６は、ＰＲＰＩ ４０プロモーター欠失型についてのＧｕｓ検定の結果を示す； 図１７は、ＰＲＰ３７８欠失型についてのＧｕｓ検定の結果を示す：図１８は、 ｃＤＮＡクローン（ＷＰＲＰＩ）のヌクレオチド配列を示す。

コムギＰＲＰプロモーターを単離するために採用した戦略は、最初にコムギＤＮ Ａのゲノムライブラリーを作製し、次にこのライブラリーをＰＲＰ遺伝子のため のｃＤＮＡプローブを使ってスクリーニングすることであった。

Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　ｃｖ、　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ の暗室て生育させた新芽から高分子量ＤＮＡを単離した（Ｌａｚａｒｕｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、５．８−２４．１９８５）。５ａｕ３Ａによる部分消化の条件を確立 した。

ショ糖密度勾配を用いたサイズ分画化により１８−２５　ｋｂのＤＮＡ断片を精 製した。ラムダシャロン３５　（Ｌｏｅｎｅｎ　ａｎｄ　Ｂｌａｔｔｎｅｒ、　 Ｇｅｎｅ勾配ての精製により調製した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使ってベクター ＤＮＡ　（１，５μｇ）とコムギＤＮＡ　（３，５μｇ）を高濃度（５００ｎｇ ／ｕ　Ｉ）テ連結し、その後市販の抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使ってｉ ｎ　ｖｉｔｒｏでパッケージングした。

約２．６　ｘ　１０６の組み換え体を宿主大腸菌に８０３にプレートし、プラー クからのＤＮＡ　リフトをニトロセルロースフィルターに移行させた。コムギＰ ＲＰ　ｃＤＮＡ　ＷＰＲＰＩ　（参考実施例）を”Ｐ−ｄＡＴＰでランダムプラ イマーラベルして、ライブラリーリフトを検索するために使用した。ハイブリダ イズする陽性プラークを数回のスクリーニングによって均一に精製し、その後こ れらの陽性ファージ由来のＤＮＡを更なる分析により精製した。

２、　ＰＰＰ遺伝子の特性決定 陽性ファージ３ｃＸ２　（図１）およびＥ３．２（図２）の挿入物ＤＮＡから制 限地図を作成し、ＰＰＰ遺伝子の位置と方向をハイブリダイゼーション実験によ り決定した。これらの領域を含むＤＮＡ断片を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの口１ｕ ｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのポリリンカー領域を含むｐＵｃＩ９誘導体であるプ ラスミドベクターｐＵＢｓｌにサブクローニングした（Ｒａｉｎｅｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１６．７９３１−７９４２゜１ ９８８）。エキソヌクレアーゼＩＩ！消化と二本鎖ジデオキシヌクレオチド配列 解析により、これらのクローンから重複配列を得た。

データを集め、５ｔａｄｅｎパツケージを使って分析した。決定された配列の範 囲を図１および２に示す。

ＰＲＰ３７８遺伝子とその単離に使用したｃＤＮＡプローブとのＤＮＡ配列を比 較すると、数個の塩基が相違することがわかり、これは単離した遺伝子コピーが クローン化ｍＲＮＡの対立遺伝子であることを示唆した。ＰＲＰ］４０遺伝子（ 図４）は明らかに新規なＰＲＰ型である。

３、　ＰＲＰの上流配列 ＰＲＰ３７８およびＰＲＰ１４０遺伝子の上流にある調節配列を、下記の構築物 中で使用したものを全て含めて、それぞれ図５および６に示す。その後のクロー ニング法において使用した制限酵素部位には下線が引いである。これらの配列は 、下流に配置されたタンパク質コード配列をそれらの制御下に正しく発現させる のに必要なプロモーターと他の調節要素を全て含むであろうと提案された。

この提案を試験しかつ植物形質転換の状況下でのＰＲＰ３７８およびＰＲＰ１４ ０プロモーターの有用性を評価するために、一連の構築物を作製した。それぞれ の場合に、ＰＲＰ３７８またはＰＲＰ１４０上流領域の一部を適当なベクター中 の細菌リポータ−遺伝子β−グルクロニダーゼとツバリンシンターゼターミネー タ−配列の前に置いた。

ＰＲＰ３７８プロモーターの場合、これはＺｅａ　ｍａｙｓプロトプラストでの 一時的発現に適する高コピー数のｐＵｃ１９に基ついたプラスミドであった。Ｐ ＲＰ１４０プロモーターの場合、これはＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍへの 形質転換に適する旧Ｎ１９に基づいたベクターであった。両方の場合に、ＰＰＰ プロモーターにより制御された発現は、形質転換植物またはプロトプラストから の抽出物における蛍光原基質を用いたβ−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）活性の酵 素検定により検出することができた。

（ａ）　ｐｌＰＰＫＧＴおよびｐＢＩＰＫＧＴｐｌＰＰＫＧＴはｐＲＡＪ２７５ 　（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５．３８７−４０５．１９８７）のＥｃｏＲ１／Ｓａｔ　ｌ 挿入物を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌのＫｌｅｎｏｗフラグメントて平滑末端 化し、ｐＵｃＰｏｌｙＴｅｒ　（ｐＬＩｃＩ９に５ｓｔｌ／ＥｃｏＲ１断片とし てクローン化したツバリンシンターゼターミネータ−断片）のＫｌｅｎｏｗ平滑 末端化Ａｓｐ７１８部位に連結したものである。対応する旧Ｎ１９に基づいたプ ラスミドはｐＢＩＰＫＧＴである。ｐｌＰＰＫＧＴおよびｐＢＩＰＫＧＴは互い から得るこＰＲＰ３７８遺伝子の２．４　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｎｏｔｌ断片 （図１）をプラスミドベクターｐＬＩＢｓｌにサブクローニングしてプラスミド ｐＨＮ７２．４を作製した。ｐｉ（Ｎ／２．４をＮｏｔｌで線状となし、この部 位を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使って修復した 。この挿入物を旧ｎｄ１１１消化により切り出し、Ｈｉｎｄｌｌｌ−３ｍａｌ消 化ｐＢ＋１０１．３　（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　Ｐｌａｎｔ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５．３８７−４０５゜１９８７）に挿入してｐＢＩ ＨＮ／２．４を作製した。融合連結部をヌクレオチド配列解析により調べ、その 配列と推定アミノ酸配列を図１４に示す。

ＰＲＰ１４０遺伝子の１．４５　ｋｂ　Ｘｂａｌ−Ｎｏｔｌ断片（図２）をプラ スミドベクターｐＵＢｓ　１にサブクローニングしてｐＸＮｏｔ／１．４５を作 製した。

ＸｂａＩとＮ５ｐＢＩＩで消化して１．３ｋｂ断片を切り出しく図８　）　、Ｘ ｂａｌ−３ｍａ　ｌ消化ｐＢＩＰＫＧＴに挿入してｐＢＩＸＮ／１．３を作製し た。融合連結部の配列を図１４に示す。

ミドｐＢＩＤ−２３４、−４００、−５４０、−７６９および−９６１Ｎの構築 （図９）プラスミドｐＸＮｏｔ／１．４５　（図８）をＸｂａｌ−Ｐｓｔｌて消 化して線状とした。エキソヌクレアーゼＩＩ＋と様々な時間インキュベートして Ｘｂａｌ末端から長さの異なる配列を欠失させた。ヌクレアーゼＳｌと大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して、プラスミド集団を閉 環状ＤＮＡとして再連結させた。ヌクレオチド配列解析を用いて、この集団の代 表的部分のＸｂａ　ｌ末端からの欠失の程度を調べた。

配列解析からの情報に基づいて、ＰＲＰ１４０の翻訳開始コドンの５゜側の２３ ４．４００．５４０．７６９および９６１ヌクレオチドまでの欠失型プラスミド をプロモーター活性の評価のために選択した（図６）。Ｈｉｎｄ！ＩＩ　とＮ５ ｐＢ　Ｉ　Ｉで消化して５つの制限断片を切り出し、１（ｉｎｄｌｌｌ−５ｍａ ｌ消化ｐＢＩＰＫＧＴに挿入してｐ［１１Ｄ−２３４、−４００、−５４０、− ７６９および一９６１Ｎを作製した。５つの全ての構築物において、融合連結部 の配列はｐＢＩＸＮ／１．３とそれと同一である（図１４）。

プラスミドｐＨＮ／２．４　（図７）をＮｏｔｌ−ＢｓｔＸｌテ消化して線状と した。エキソヌクレアーゼＩＩＩと様々な時間インキュベートしてＮｏｔｌ末端 から長さの異なる配列を欠失させた。ヌクレアーゼＳｔと大腸菌ＤＮＡポリメラ ーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントて処理して、プラスミド集団を閉環状ＤＮＡと して再連結させた。ヌクレオチド配列解析を用いて、この集団の代表的部分のＮ Ｏｔ！末端からの欠失の程度を調べた。

配列解析からの情報に基ついて、Ｈｉｎｄｌ１１部位から下流にＰＲＰ３７８の 翻訳開始コドンの５゛側の６．１２および５０ヌクレオチドまで約２．３ｋｂ伸 長する挿入物を有するプラスミドｐＨＤ−６、−１２、−５０／２．３をプロモ ーター活性の評価のために選択した（図５）。

３つのそれぞれのプラスミドを部分５ｓｔｌ消化で線状となし、突出部分をヤエ ナリ　（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで平滑末端化した。３つの挿入物を 旧ｎｄｌｌｌて消化して切り出し、旧ｎｄｌｌｌ−３ｍａｌ消化ｐｌＰＰＫＧＴ に挿入してｐｌＰＫ＋４−６、−１２および一５０／２．３を作製した。

融合連結部の配列を図１５に示す。

（ｉｉ）　ｐｌＰＨ−６／２．３の構築（図１１）このプラスミドはｐｌＰＫＨ −６／２．３に類似しているが、ｐＢ１２０１．１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　１ ９８７）に全長ＰＰＰ３７８プロモーターが挿入されており、“Ｋｏｚａｋ”共 通開始ＡＴＧの存在しない異なる連結部（図１５）を有する。

プラスミドｐｌＰＨ−６／２．３　（図１１）をＰｓｔｌ消化または部分５ｓｔ ｌ消化により線状となし、突出部分をヤエナリ　（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ）ヌクレ アーゼで平滑末端化した。ＧＵＳ遺伝子およびＮＯＳターミネータ−を有するカ セット中にＰＰＰ３７８プロモーターの７６２および６１５ヌクレオチドをそれ ぞれ有する挿入物をＥｃｏＲＩ消化で切り出し、ＥｃｏＲｌ／Ｓｍａ　ｌ消化ｐ ＵｃＩ９に挿入した。両方の構築物において、融合連結部の配列はｐｌＰＨＪ／ ２．３のそれと同一である（図１５）。

プラスミドｐＨＮ／２．４　（図７）を旧ｎｄｌｌｌ−Ａｐａｌで消化して線状 とした。エキソヌクレアーゼＩｌ＋　と様々な時間インキュベートしてＨｉｎｄ ｌｌｌ末端から長さの異なる配列を欠失させた。ヌクレアーゼＳｔと大腸菌ＤＮ ＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントて処理して、プラスミド集団を閉環 状ＤＮＡとして再連結させた。ヌクレオチド配列解析を用いて、この集団の代表 的部分の旧ｎｄｌｌｌ末端からの欠失の程度を調べた。

配列解析からの情報に基づいて、ＰＲＰ３７８の翻訳開始コドンの５゜側の１８ ３９ないし８１６ヌクレオチドまで伸長する挿入物を有するプラスミドｐＤ−１ ８３９、−１５１０、−１２８９、−１０２３および−８１６ＮをＫｐｎｌ−３ ｓｔｌｌて消化した。切り出した断片をＥｃｏＲｌ一部分５ｓｔｌｌ消化ｐｌＰ Ｈ−６／２．３　（ＧＵＳ遺伝子およびＮＯＳターミネータ−と共にＰＲＰ３７ ８プロモーターの近位部分を提供する）と連結し、その後ＥｃｏＲ１−Ｋｐｎ　 Ｉ消化ｐｕｃ　＋　９に連結した。この場合も、全ての構築物において、融合連 結部の配列はｐ　ＩＰＨ−６／２．３のそれと同一である（図１５）。

１９８４）　、構築物を大腸菌ＭＣ１０２２からアグロバクテリウム・ツメファ シェンスＬＢＡ　４４０４へ移した。ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎ ａ　ｔａｂａｃｕｍ）のサムスン（Ｓａｍｓｕｎ）変種のリーフディスクを記載 される通りに（Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３．４９ ６−４９８゜１９８４　）形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む 発芽培地で選択した。一般に、各構築物を含む植物体は５−１５本再生し、横側 々の形質転換体におけるＰＲＰプロモーターの活性は葉抽出物中のβ−グルクロ ニダーゼ活性を測定することにより調べた。組織抽出物を調製し、記載される通 りに（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　１９８７　）反応生成物４−メチルウンベリフェ ロンの蛍光を分析した。反応混合物は通常３７℃で４時間インキュベートし、２ 時間おきにアリコートを採取した。各抽出物のタンパク質濃度を測定して、それ らを直接比較した（Ｂｉｏ−Ｒａｄキットを使用）。

ＰＲＰ１４０プロモーター誘導構築物の発現に関する検定の結果はｎｍｏｌ　４ −メチルウンベリフェロン／ｎ＋ｉｎ／ｍｇタンパク質で表され、図１６に示し である。個々の形質転換植物間で通常観察される変動のために、１３６９から９ ６１ヌクレオチドまでの長さのＰＲＰ１４０プロモーターの切除が有意な活性低 下へ導くかどうかを確かめることは困難である。しかしながら、７６９および５ ４０ヌクレオチド型は実質的にほとんど活性をもたず、４００および２３４ヌク レオチド型は事実上不活性であることが明らかである。

ｐＵｃ１９に基ついた構築物は、Ｃｈｅｎらの方法に従って、Ｚｅａ　ｍａｙｓ の朽由来の細胞懸濁体（細胞系Ｂａ　Ｔａｎ　Ｂａ１）プロトプラストのＣａ＝ −ＰＥＧ媒介形質転換による一時的発現について検定した（Ｃｈｅｎ。

Ｄ、Ｆ、、　Ｔａ５ｓｉｅ、　Ａ、、　Ｄａｌｅ、　Ｐ、Ｊ、、　Ｇｏｌｄｓｂ ｒｏｕｇｈ、　Ａ、Ｐ、、　Ｌｉａｎｇ、　Ｗ、。

Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、Ｗ、、　Ｆｌａｖｅｌｌ、　Ｒ，Ｂ、　ａｎｄ　Ｘｉａ、　 Ｚ、Ａ、　（１９８８）、　Ｉｎ：　Ｐｕ１ｔｅ。

Ｋ１．、Ｄｏｎｓ、Ｊｉ、Ｍ、、Ｈｕｉｚｉｎｇ、ＩＬＪ、、Ｋｏｏｌ、Ａ、Ｊ 、、Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ。

Ｍ、ａｎｄ　Ｋｒｅｎｓ、Ｆ、Ａ、（編集）　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｐｌａ ｎｔ　ＰｒｏｔｏｐｌａｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ（植物プロトプラスト研究の進歩 ）、　Ｋｌｕｗｅｒ　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｄｏｒｄｒｅ ｃｈｔ）　ｏ一般に、各構築物に対して、５０μｇのＤＮＡとｌ　Ｘ　１０’プ ロトプラストを用いて３回の反復実験を行った。対照として、プロトプラストは 同量のニンン精子ＤＮＡおよびカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）　３ ５Ｓプロモーターの８５０ｂｐ型を−コピー保有するプラスミドＣＧ２０て形質 転換した。

形質転換プロトプラストの溶解液は形質転換植物と同し方法てβ−グルクロニダ ーセについて検定した（Ｊｅ［ｅｒｓｏｎ、　１９８７）。同一実験で試験した 構築物間の１　ｘ　１０’プロトプラスト当たりの発現活性を比較した。

ＰＰＰ３７８プロモーター誘導構築物に関する検定結果はｎｍｏｌ　４−メチル ウンベリフェロン／ｍｉｎ／ｌ　ｘ　１０’プロトプラストで表され、表１と図 １７に示しである。

表１．　Ｇｕｓ検定・ＰＲＰ３７８プロモーター３′欠失型ＣＧ２０　（ＣａＭ Ｖ　３５Ｓ）　３．５９±２．９６　（１００％）ニンン精子ＤＮＡ　０．０３ ０８　（０，８５８）ｐ　ＩＰＫＨ−６／２．３　９．６５±０．６３　（２６ ９）−１２１１，９２±４．２２　（３３２）−５０４，７３二０．６６　（１ ３２）ＰＰＰ３７８プロモーターの２．３ｋｂｐ型はトウモロコシプロトプラス トにおいてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの８５０　ｂｐ型よりも顕著（二強力で ある（表１）。さらに、それは３゛末端からの比較的短い欠失型に対して感受性 である。従って、ｐｌＰＫＨ−１２／２．３　（ＧＵＳ遺伝子の開始“ＡＴＧ″ に対してほぼ天然の状況下でプロモーターを配置した（図１５）構築物）は最高 レベルの発現を示すが、プロモーターをＡＴＧからより遠くにまたは近くに移動 させた（図１５）場合には活性が低下する。

図１７は、ＰＰＰ３７８プロモーターの５”末端からの欠失型の作用を示す。８ ００　ｂｐの欠失型は全長型の６０％以下に活性が低下し、活性は欠失の程度と 共に低下し続ける。この実験ては、ＰＲＰ３７８プロモーターの全長型は、Ｃａ ＭＶ　３５Ｓに対して表１に示したものと同レベルの活性をもたないけれとも、 その融合連結部が異なっており、しかもβ−グルクロニダーゼ遺伝子の開始ＡＴ Ｇが“ＫＯＺａｋ″共通配列をもっていない（図１５）。

参考実施例 コムギＰＰＰをコードするＷＰＲＰＩ　と称するｃＤＮＡが単離され、その配列 が決定された。ＷＰＲＰＩ　クローンが検出されたが、コムギｃＤＮＡライブラ リーは葉緑体のフルクトース−１，５−ビスホスファターゼに対して誘起された 抗体を使ってスクリーニングされた。この抗体がなぜＷＰＲＰＩ　クローンと交 差反応するのか分かつていない。最初に単離されたｃＤＮＡは全長（１，３ｋｂ ）てなかった。完全な配列は短いクローンを使ってｃＤＮＡライブラリーを再ス クリーニングすることにより得られたより長いｃＤＮＡから決定された。

コムギ由来のｃＤＮＡクローン（ＷＰＲＰＩ）の完全なヌクレオチド配列および その推定アミノ酸配列は図１８に示しである。この１５４８　ｂｐｃＤＮＡは１ １３７塩基対の完全なコード配列と１０１　ｂｐの５°非コード配列とポリアデ ニル化尾部で終わる３１０　ｂｐの３°非コ一ド配列を含んでいる。

実施例２ 実施例１．４の形質転換タバコの組織におけるＧｕｓ発現の局在化を調べた。検 定は実施例１．５に記載するように行ったが、葉以外の組織も検定した。結果を 以下の表２に示す。示した値はｐｍｏｌ／ｎ＋ｉｎ／μｇタンパク質である。か っこ内の数字は個々の形質転換植物内の組織発現レベルの順位を表す。全ての組 織において有意な発現レベルが見られる。葉柄と茎の発現レベルがＣａＭＶ　３ ５３によく匹敵する。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．次のヌクレオチド配列： （ａ）ＰＲＰ１４０遺伝子の上流の−１３６９から−４９まで、または（ｂ）Ｐ ＲＰ３７８遺伝子の上流の−２３１６から−１２までを有するプロモーターであ って、該配列は、修飾された配列がプロモーターとして作用する能力を有する限 り、１個またはそれ以上の塩基の置換、挿入および／または欠失により、および ／または一端あるいは両端での伸長により修飾されていてもよい、上記プロモー ター。
2. ２．請求項１に記載したように修飾されていてもよい、ＰＲＰ１４０遺伝子の上 流の−９６１から−４９までの配列を有する、請求項１記載のプロモーター。
3. ３．タンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項１ または２記載のプロモーターを含むＤＮＡ断片。
4. ４．請求項１または２記載のプロモーターの制御下にタンパク質をコードする異 種遺伝子を含むベクターであって、該ベクターで形質転換された植物細胞におい て該遺伝子が発現され得る、上記ベクター。
5. ５．前記プロモーターが前記遺伝子の５′末端に直接融合される、請求項４記載 のベクター。
6. ６．前記遺伝子とプロモーターを植物細胞ゲノムに伝達して安定した状態で組み 込ませる領域をさらに含む、請求項４または５記載のベクター。
7. ７．プラスミドである、請求項４−６のいずれか１つに記載のベクター。
8. ８．請求項４−７のいずれか１つに記載のベクターで形質転換された植物細胞。
9. ９．タンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項１ または２記載のプロモーターを保有する植物細胞。
10. １０．請求項８または９記載の植物細胞から再生されたトランスジェニック植物 。
11. １１．タンパク質をコードする異種遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項 １または２記載のプロモーターを細胞中に保有するトランスジェニック植物。
12. １２．請求項１０または１１記載のトランスジェニック植物から得られた種子。
13. １３．植物細胞において目的タンパク質を生産する方法であって：（ｉ）請求項 ４−７のいずれか１つに記載のベクターで植物細胞を形質転換すること、ただし 前記プロモーターの制御下にある遺伝子によりコードされるタンパク質が目的タ ンパク質である；および （ｉｉ）形質転換した植物細胞を、該タンパク質の発現を可能にする条件下で培 養すること； から成る方法。
14. １４．目的タンパク質を生産し得るトランスジェニック植物を作製する方法であ って： （ｉ）請求項４−７のいずれか１つに記載のベクターで植物細胞を形質転換する こと、ただし前記プロモーターの制御下にある遺伝子によりコードされるタンパ ク質が目的タンパク質である；および （ｉｉ）形質転換細胞から植物体を再生すること；から成る方法。