JPH07501683A - 植物プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ８、　タンパク質をコードする遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項１記 載のプロモーターを保有する植物細胞。

９、　請求項７または８記載の植物細胞から再生されたトランスジェニック植物 体。

１０、タンパク質をコードする遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項１記 載のプロモーターを細胞中に保有するトランスジェニック植物体。

１１、請求項９またはｌＯ記載のトランスジェニック植物体から得られた種子。

１２、請求項１１記載の種子から生育させた植物体。

１３、植物の根において目的タンパク質を生産することができるトランスジェニ ック植物体を作製する方法であって、（ｉ）請求項３−６のいずれか１つに記載 のベクターで植物細胞を形質転換すること、ただし前記プロモーターの制御下に ある遺伝子によりコードされるタンパク質が目的とするタンパク質である；およ び （ｉｉ）該形質転換細胞から植物体を再生することから成る方法。

明細書 植物プロモータ一 本発明は植物プロモーターに関する。

エクステンシンは植物細胞壁に含まれる、最もよく特性決定力くなされた構造タ ンパク質である（Ｃａｓｓａｂ　ａｎｄ　Ｖａｒｎｅｒ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、凹、　３２１−３５３．１９８８）。それは高度 に塩基性の、ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質の仲間であり、種々の植物 に存在する。エクステンシンは厚膜組織に最も豊富に存在することが報告され、 このタンノくり質には、細胞壁の機械的強化および組織化を含めて、多種多様な 機能的役割があるとされて（喝。

エクステンシンは個々の植物、器官および組織にお（１てその一次構造が異なっ ている。いくつかの事例では、同一の組織まｔこＣｔ細胞型に機能的に関係のあ る２つの異なるエクステンシンカく存在している。

器官特異的に発現される植物遺伝子を単離する計画の一部として、脂肪種子セイ ヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　Ｌ、）の根（こ存在するｍＲＮ Ａ種が、根に豊富であるが他の組織にはなし）配列を単離する目的で研究された 。根に非常に高レベルで存在し、交差／％イブリダイズする配列のファミリーが 単離され、特性決定力くなされ、そしてエクステンシンに相同なタンノくり質を コードすること力く分かった。これにより、本発明者らは、根においてタン／く り質を発現させる能力のあるプロモーターを同定することができた。

従って、本発明は、植物の根においてタンノくり質を発現させる能力を有し、か つ次の配列： （ａ）図１に示したヌクレオチド−１６１６からヌクレオチド−１までの配列ま たは該配列の一部、あるいは （ｂ）１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失によ り、および／または一端または両端での伸長により修飾された前記配列（ａ） を有するプロモーターを提供する。

本発明はまた、遺伝子（一般的には、タンパク質をコードする異種遺伝子）に機 能しうる状態で連結された前記プロモーターを含むＤＮＡ断片を提供する。さら に、上記のようなプロモーターの制御下にタンパク質をコードする遺伝子を含む ベクターが提供され、かくしてこのベクターで形質転換された植物細胞は該遺伝 子を発現することができる。適当なベクターはプロモーターが前記遺伝子の５゛ 末端に直接融合されたものである。ベクターはさらに遺伝子とプロモーターを植 物細胞ゲノムに伝達し、安定した状態で組み込ませる領域を含んでいてもよい。

このベクターは一般にプラスミドである。

植物細胞はかかるベクターを使って形質転換することができる。

従って、本発明はさらに、タンパク質をコードする遺伝子に機能しつる状態で連 結された前記プロモーターを保有する植物細胞を提供する。このような植物細胞 からはトランスジェニック植物を再生し得る。タンパク質をコードする遺伝子に 機能しうる状態で連結されたプロモーターを細胞中に保有するトランスジェニッ ク植物が得られる。トランスジェニック植物から種子を採取し、その後、この種 子から植物体を生育させることもできる。

本発明はさらに、植物の根において目的のタンパク質を生産し得るトランスジェ ニック植物の作製方法を提供し、この方法は（ｉ）本発明によるベクターで植物 細胞を形質転換すること、ただし前記プロモーターの制御下にある遺伝子により コードされるタンパク質が目的タンパク質である；および（ｉｉ）該形質転換細 胞から植物体を再生すること；から成っている。

添付図面において、 図１は、遺伝子ｅＸ　ｔＡのヌクレオチド配列、およびセイヨウアブラナのエク ステンシンポリペプチドの推定アミノ酸配列、並びにヌクレオチド−１６１６か らヌクレオチド−１までの本発明プロモーターの配列を示す。完全な配列は図２ に示す２．７ｋｂの旧ｎｃｌｌ）１ｉｎｃｌｌ断片の配列である。リーダー配列 の推定切断部位はコロン（：）で示しである。転写開始点は曲折アクセント（’ Ｉ”Ｓ）で示してあり、コンセンサス“ＴＡＴＡ”コントロールボックスに類似 した配列も示しである。その他の配列特徴は図面に示した通りである。

図２は、遺伝子ｅｘ　ＬＡをコードする脂肪種子セイヨウアブラナのゲノムクロ ーンλＢ３１　（１２，７ｋｂ）の制限地図、ｐＲ１ｓ４の制限地図、ｐＵｃＪ ａ中のλＢ３１からの旧ｎｄｌｌｌ−Ａｖａｌ断片、およびｅｘ　ＬＡを含む２ 、７ｋｂの旧ｎｃｌｌ−旧ｎｃｌｌ断片の配列解析地図である。ｒａおよび！ａ はそれぞれＥＭＢＬ３ラムダベクターの右アームおよび左アームを示す：　団３ Ｓ弼はコード配列を示す。Ｓａ／Ｈ２−ＡＩ／釦／ＸＩ断片はＥＭＢＬ３の一部 である。配列解析地図上の制限部位記号の説明：　Ｓａ。

５ａｉｌ；　Ｏ３，Ｈｉｎｄｌｌｌ：　Ｓｍ、　Ｓｍａｌ；　Ｏ２，Ｈｉｎｃｌ ｌ；　ＰＩ、　Ｐｓｌｌ；　Ａｌ。

Ａｖａｌ；　ＸＩ、　Ｘｍａｌ；　Ｎｓ、　Ｎ５ｉｌ；　Ｒ１，Ｒｓａｌ；　Ｈ ａ、　＋Ｉａｅｌｌｌ；　Ｓｓ、　５ｓｐｌ；Ｎｄ、Ｎｄｅｌ；　Ｐｖ、Ｐｖｕ ｌｌ。

図３は、ｐＵｃ１８中にλ８３１の旧ｎｄｌｌｌ−Ａｖａｌ断片を含むλＢ３１ がらのサブクローンｐＲλＳ４の詳細な制限地図を示す。　−■■はエクステン シンコード配列の転写の位置および方向を示す。挿入部にはＰｖｕｌ、　Ｘｈｏ ｌ、　Ｂｓｃｌ、Ｂａｍｔｌｌ　、ＢｇｌｌｌおよびＥｃｏＲＶのための部位が 存在しない。

図４は、サブクローンｐＲλＳ４の単純化した制限地図を示す；ｍ　はエクステ ンシンコード配列の位置を示し、口＝コは根での発現をもたらすプロモーターを 含む領域を示す。

図５は、実施例２で使用したハイブリッド遺伝子の地図である；　■■■　はツ バリンシンターゼ（ＮＯ８）ターミネータ−を示す。

図６は、ベクターＢＩＮ　＋９中の図５からのハイブリッド遺伝子の地図である 。

図７は、実施例３に記載したように、λＢ３１から切除したＨａｅ　ｌ　Ｉ　ｌ 断片上のセイヨウアブラナエクステンシンプロモーターを示す。

図８は、実施例３で作製した、セイヨウアブラナエクステンシンプロモーターと グルクロニダーゼ遺伝子コード配列から成る融合構築物を示す。

本発明の全長プロモーターは、図１のヌクレオチド−１６１６からヌクレオチド −１までの、脂肪種子セイヨウアブラナｅｘ　ｔＡ遺伝子の上流にある配列から 成り、塩基ＩはｅＸ　ｔＡ遺伝子のＣＡＴ転写開始コドンのアデニン（Ａ）塩基 である。このプロモーターはクローンλＢ３１から切除によって４．５ｋｂの旧 ｎｄｌｌｌ−Ａｖａｌ断片（図３）上に得られる。クローンλＢ３１は脂肪種子 セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ口ａｐｕｓ　Ｌ）から作製したゲノムライ ブラリーより得られた。

Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｖａｌ断片をｐＵｃ１８にサブクローニングして、得られた ｐＲλＳ４からプロモーターを０．９６ｋｂのＨａｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片として切 り出すことができる。ｐＲλＳ４およびバクテリオファージλ８３１を保有する Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＨ５αは、１９９０年３月８日に英国アバディーンのナショナルコ レクンヨン　オブ　インダストリアル　アンド　マリーンバクテリア（Ｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａ ｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉａ）に受託番号ＮＣＩＭＢ　４０２６５およびＮＣＩＭ Ｂ　４０２６６として寄託された。

ヌクレオチド−１６１６からヌクレオチド−１までの全長配列の一部と全長また は部分配列の修飾型は本発明の代わりのプロモーターである。全長または部分プ ロモーター配列は、１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入および／ま たは欠失により、および／または一端または両端での伸長により修飾することが できる。

しかしながら、部分または修飾プロモーター配列は、依然として植物の根におい てプロモーターとして作用し得るものでなければならない。全長配列または全長 配列の一部（すなわち、非修飾配列）が修飾される場合、一般に修飾配列と非修 飾天然配列の間には少なくとも６０％の相同度が必要である。相同度は少なくと も７５％、少なくとも８５％、あるいは少なくとも９５％でありうる。

全長プロモーター配列の一部は制限エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌ クレアーゼの使用により得られる。このプロモーターは、図１に示した配列をＨ ａｅ　Ｉ　ｌ　ｌで処理すると、０．９６ｋｂ断片として得られる。修飾配列は 非修飾プロモーター配列に変化を導入することにより得られる。これは、天然配 列のエンドヌクレアーゼによる制限、オリゴヌクレオチドリンカーアダプターの 挿入、エキソヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼの使用、部位特異的突然 変異誘発を含めた、適当な技法により達成できる。

全長プロモーター配列の一部または修飾配列がプロモーターとして機能し得るか どうかは実験によって簡単に確かめることができる。実施例３に記載するように 、プロモーターを欠く二成分ベクター（ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ）　ｐＢ１ １０１中のグルクロニダーゼコード配列にＳｍａ１部位で推定プロモーター配列 を融合させる。実施例３の手順に従って、作製されたトランスジェニック毛根に おいてグルクロニダーゼの発現を調べる。

プロモーターはタンパク質をコードする遺伝子（一般には異種遺伝子）に機能し つる状態で連結される。異種遺伝子は発現を希望するどのようなタンパク質をコ ードしてもよい。“異種”とは、その遺伝子がそのプロモーターに自然界におい て機能しうる状態で連結されていないことを意味し、すなわち異種遺伝子は脂肪 種子セイヨウアブラナのｅｘｔＡ遺伝子ではない。このタンパク質はさらに“異 種”遺伝子配列内にコードされるＮ−末端の輸送ペプチド配列を含んでいてもよ い。

このプロモーターは一般に植物の根においてタンパク質を発現させるために使用 される。発現がプロモーターによって制御されるタンパク質は、例えば害虫や病 原体（特に植物の根に感染しゃすい害虫や病原体）の生物学的防除を付与するタ ンパク質でありうる。

プロモーター配列は遺伝子に直接またはリンカ−を介して融合される。リンカ− 配列はイントロンを含んでいてもよい。イントロン配列の長さを除いて、リンカ −は４５個までの塩基、例えば３０個まで、あるいは１５個までの塩基で構成す ることができる。

プロモーターを遺伝子（一般には異種遺伝子）に機能しうる状態で連結させたＤ ＮＡ断片およびベクターを作製することができる。

これらの断片およびベクターは一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。かか る断片を使って直接ＤＮＡの取り込みにより、あるいはこの種のベクターを用い て、植物細胞を形質転換し得る。ベクターにはプロモーターの制御下に遺伝子が 組み込まれる。このベクターは該ベクターで形質転換された植物細胞において該 遺伝子を発現させることができる調節要素をさらに含んでいる。このような調節 要素としては、プロモーターのほかに、翻訳開始および／または終止配列を挙げ ることができる。一般には、ベクターは該遺伝子と関連調節制御要素を植物細胞 ゲノムに伝達しかつ安定した状態で組み込ませる領域も含んでいる。

従って、ベクターは転写調節配列および／または、該遺伝子のコード配列の３° 末端に存在しない場合は、停止コドンを備えている。かくして、ＤＮＡ断片にも ターミネータ−配列および植物細胞での該遺伝子の発現を可能にする他の配列が 組み込まれる。植物の特定部分での発現レベル、またはある種の条件下での発現 レベルを増加あるいは低下させ得るエンハンサ−または他の要素もＤＮＡ断片お よび／またはベクターに組み入れることができる。ベクターはまた形質転換植物 細胞に耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子を通常もっており、これにより適当な 抗生物質含有培地での生育により、形質転換された細胞、組織および植物体を選 択することができる。

形質転換細胞は適当な培地での生育により選択される。かくして、プロモーター の制御下に該遺伝子を、例えば植物細胞ゲノム内に、保有する植物細胞から成る 植物組織が得られる。従って、該遺伝子は植物細胞内で発現可能である。その後 、それらの細胞内に、例えば植物細胞ゲノムに組み込まれた、該遺伝子とプロモ ーターを含み、その結果として該遺伝子を発現し得る植物体を再生することがで きる。再生された植物体は繁殖させることができ、例えば種子を採ることができ る。かくして、タンパク質の根特異的発現が植物体中の該プロモーターにより促 進され得る。また、タンパク質（特に植物タンパク質）の生産のためには、形質 転換された根を培養下で生育させることもできる。

植物細胞の好適な形質転換法は、発現が望まれるタンパク質をコードする遺伝子 に機能しうる状態で連結されたプロモーターを含むベクターを保有するアグロバ クテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ）を使用することである。従って、次の要素： （ａ）植物細胞のゲノムに組み込まれたとき遺伝子を発現させることができる前 記プロモーターと他の調節要素の制御下にある遺伝子： （ｂ）植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を定める少なくとも１つのＤＮＡ 配列：および （Ｃ）このＤＮＡを植物ゲノムに伝達することができるＤＮＡ配列；を含むハイ ブリッドプラスミドベクターが使用される。

一般に、植物細胞ゲノムに組み込まれるＤＮＡはＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ ボーダー配列により境界を定められる。ただ１つのボーダー配列が存在するとき には、好ましくはそれは右端ボーダー配列である。このＤＮＡを植物細胞ゲノム に伝達することができるＤＮＡ配列は一般にＴｉ−プラスミドのビルレンス（ｖ ｉｒ）領域である。

かくして、遺伝子とその転写・翻訳調節要素（プロモーターを含む）はＴｉ−プ ラスミドのＴ−ＤＮＡボーダー間に挿入することができる。このプラスミドは腫 瘍化遺伝子が欠失された無力化Ｔｉ−プラスミドであってもよい。しかしながら 、遺伝子とその転写・翻訳調節要素（プロモーターを含む）は、ｖｉｒ領域を含 むＴｉ−プラスミドとトランスて二成分ベクター（ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ ）のＴ−ＤＮＡボーダー間に挿入される。このような二成分ベクターは次の要素 ：（ａ）植物細胞のゲノムに組み込まれたとき遺伝子を発現させることができる 前記プロモーターと他の調節要素の制御下にある遺伝子、および （ｂ）植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡの境界を定める少なくとも１つのＤＮＡ 配列： を含む。

従って、ハイブリッドプラスミドベクターまたはｖｉｒ領域を有するＴｉ−プラ スミドとトランスで二成分ベクターを含むアグロノくクテリウム・ツメファシェ ンスを使って、植物細胞を形質転換し得る。茎やリーフディスクのような組織片 にこのノくクチリアを接種するか、あるいは再生用の植物プロトプラストとこの ノくクチリアを同時培養する。植物プロトプラストは対象の遺伝子をコードする ＤＮＡ断片（プロモーターと適当な他の転写・翻訳調節要素が存在する）の、ま たはかかる断片を含むベクターの、直接導入により形質転換してもよい。直接導 ′入はエレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、マイクロインジェク ションまたは粒子衝突を使って達せられる。

単子葉または双子葉植物からの植物細胞は本発明に従って形質転換される。単子 葉植物種としてはオオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネなどがある。双子葉植 物種としてはタバコ、トマト、ヒマワリ、ペチュニア、ワタ、テンサイ、ジャガ イモ、レタス、メロン、ダイズ、セイヨウアブラナ、ポプラなどがある。形質転 換された植物細胞の組織培養物を増殖させると、分化した完全な形質転換植物体 が再生される。形質転換植物細胞は適当な培地で、好ましくは選択可能な増殖培 地で培養する。発生したカルスから植物体を再生することもできる。かくして、 細胞中に、例えばそれらのゲノムに組み込まれた、発現が望まれるタンパク質を コードする遺伝子に機能しうる状態で連結されたプロモーターを保有するトラン スジェニック植物が得られる。その結果、この遺伝子は細胞内で発現可能である 。将来使用するために、再生された植物から種子を採り、この種子から植物を生 育させることができる。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例１ １、　脂肪種子セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　Ｌ、）の根 からのポリ（Ａ）　＋ＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーから、交差 ハイブリダイズするｃＤＮＡクローンのファミリーを単離した。根、緑色の葉、 黄色くなった葉、および発芽しつつある種子から作製したｃＤＮＡによる根のｃ ＤＮＡライブラリーの示差的スクリーニングにより、根で豊富に発現されるクロ ーンを選択した。選択されたクローンに対応するｍＲＮＡ種は、ノザンプロット 分析およびＲＮａｓｅ保護検定により示されるように、他の器官の少なくとも４ ００倍のレベルで根において発現された。これらのｃＤＮＡクローンの１つをｐ ＲＲ。

５６６と名づけだ。

２、　脂肪種子セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　Ｌ、）のゲ ノムライブラリーを高ストリンジエンシー条件下でｐＲＲ、５６６にょリスクリ ーニングして、ｅＸ　ＩＡと称するエクステンシン遺伝子を得た。

この遺伝子は、単相体ゲノムあたり、プローブに対し強い相同性を有する約３つ の遺伝子と、弱い相同性を有する約２０の遺伝子から成る多重遺伝子ファミリー の一員である。単離された遺伝子は、ｃＤＮＡプローブと同一ではないが、根に おいて特異的に発現されることが分かり、約１３００ヌクレオチドのサイズのｍ ＲＮＡ種に転写された。Ｓ１マツピングによって単一の転写開始点を同定した。

ｅｘ　ｔＡ遺伝子の完全なヌクレオチド配列とそのフランキング領域を決定した 。これにより、この遺伝子のプロモーターを同定することができた。より詳細に はニ ゲノムＤＮＡ中のエクステンシン遺伝子の同定エクステンシンに相同なタンパク 質をコードするとして先に同定された、セイヨウアブラナの根からのｃＤＮＡ種 ｐＲＲ、５６６を、セイヨウアブラナゲノムＤＮＡの制限のサザンプロットにお いてプローブとして使用した。ｐＲＲ、５６６の挿入部は全ての制限消化物にお いて多数のゲノム断片にハイブリダイズしたが、それぞれの断片へのハイブリダ イゼーションの強さは同じでなかった。全ての消化物中の１−２の断片が他のバ ンドの少なくとも５倍の強度でハイブリダイズした。コピー数の復元は、強いバ ンドが単相体ゲノムあたり約２−３の遺伝子コピー数に相当することを示した。

このパターンから、このプローブに対し高度に相同性の遺伝子がゲノムあたり合 計３つ存在すると解釈できる。弱くハイブリダイズする断片は単相体ゲノムあた り１未満の概算コピー数で存在し、かくしてエクステンシンプローブに一部相同 であるだけの遺伝子を表すに違いない。このプローブにより検出された全配列は 大きな多重遺伝子ファミリーを構成しており、そのうちの３つの遺伝子がｐＲＲ 、５６６に密接に相同であることが判明し、サブファミリーを構成している。こ れらの結論の確認として、３°フランキング配列プローブ（２４０ｂｐ）をｐＲ Ｒ、５６６から作製し、上記のようにゲノムプロットにハイブリダイズさせたと き、このプローブの強くハイブリダイズするバンドへのハイブリダイゼーション は、プローブとして完全ｃＤＮＡ挿入部を用いた場合と同じであった。ただしｐ ＲＲ、５６６と弱くハイブリダイズするバンドへのハイブリダイゼーションはほ とんど除かれた。

ゲノムＤＮＡのランダムＳａｕ　３Ａ断片をλＥＭＢＬ３に挿入することにより 構築した脂肪種子セイヨウアブラナのゲノムライブラリーは、ｐＲＲ，５６６の 挿入部から作製したプローブを使って、低ストリンジエンシー条件下でスクリー ニングした。このｃＤＮＡクローンはセイヨウアブラナの根のｍＲＮＡから作製 したライブラリーより単離し、エクステンシンポリペプチドの一部をコードして いた。４０の陽性ファージプラークを同定し、十分にプラーク精製した。その後 、単離したクローンは、ただ１つのファージクローンがｃＤＮＡプローブに対し 連続して強いハイブリダイゼーションを与えたとき、高ストリンジエンシー条件 （０、Ｉ　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、　６５°Ｃ）下で再度スクリーニング した。このクローンλＢ３１をその後の実験のために選択した。

選択したファージからＤＮＡを単離し、プローブとしてｐＲＲ。

５６６を使って、制限およびサザンブロッティングにより特性を決定した。得ら れたλＢ３１の制限地図は図２に示してあり、このクローンは１２．７ｋｂの挿 入部を含むことが分かる。ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズするＤＮＡの領域 は、このベクターの左アームに隣接した１、Ｏｋｂの断片（Ｎｓｉｌ−Ｐｓｔｌ ）に局在化された。このクローンに存在する遺伝子をさらに特徴づけるために、 Ｄｄｅ　ＩとＲｓａｌによる制限を行い、続いて前のようにサザンブロツティン グとｃＤＮＡによる検索を行った。これら２種類の酵素は、それらがコード配列 中の反復配列に対応する多数の部位で相同ｃＤＮＡ配列を制限し、またこの配列 の３°非コード領域から特異な診断用断片を生成するという理由で選ばれた。こ のゲノムクローンは２８アミノ酸の反復配列をコードするｐＲＲ、５６６の領域 から生成された８４　ｂｐの制限断片を含んでいたが、ｐＲＲ、５６６に特異的 な診断用断片は存在せず、このことは存在する遺伝子がｃＤＮＡと同一でないこ とを示唆する。

別の１０のファージクローンからＤＮＡを精製し、同様にスクリーニングした。

しかしながら、クローンのどれもｐＲＲ，５６６と同じ診断用断片を含んでおら ず、本実験ではこれ以上考察しなかった。

λＢ３１に存在する遺伝子をさらに特徴づけるために、挿入ＤＮＡノササンプロ ットをセイヨウアブラナ根の第二のエクステンシンｃＤＮＡクローンｐＲＲ、５ ９２から作製したプローブとハイブリダイズさせた。このプローブはエクステン シン前駆体ポリペプチドの推定リーダー配列として同定された３９　ｂｐの配列 を含んでおり、ｐＲＲ、５６６ブローブで検出されたものと同じ１．Ｏｋｂの断 片にハイブリダイズした。ｐＲＲ、５６６由来の３°フランキング配列プローブ は、Ｈｉｎｃｌｌ−ＥｃｏＲ１断片をｐＵｃ１８にサブクローニングすることに より作製した。このプローブはコード配列を含まないが、そのＧ−Ｃに富むヌク レオチド組成のために非常に強くハイブリダイズする。

３°プローブはλ８３１のＤＮＡにハイブリダイズせず、このことはこのクロー ンが５°末端とエクステンシン遺伝子のコード配列を含むが、３°フランキング 配列を欠くか、あるいは３゛フランキング領域において異なっていることを示唆 する。

λＢ３１の１．Ｏｋｂ断片をラベルして、制限されたセイヨウアブラナゲノムＤ ＮＡのサザンプロットでプローブとして使用したとき、ｐＲＲ、５６６をプロー ブとして使用したときに得られたものと類似した結果（示してない）が得られた 。単相体ゲノムあたり１コピーて存在するゲノムＤＮＡの１．８５ｋｂの旧ｎｃ ｌ＋断片は、λＢ３１制限地図から推定された期待の旧ｎｃｌｌ断片と一致した 。

エクステンシン遺伝子ｅｘｔＡの配列 ゲノムクローンλＢ３１の約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を十分に検討した。

λＢ３１由来の５．３　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｖａｌ断片をｐＵｃ１８　（ Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　３３．１０３−１ １９．１９８５）にサブクローニングしてｐＲλＳ４　（図２および３）を作製 し、このプラスミドからの２．７ｋｂの旧ｎｃｌｌ−Ｈｉｎｃｌｌ断片の配列を 解析した（図２）。この領域の配列解析地図を図２に示し、完全に解析した配列 を図１に示す。この配列は２９９残基のポリペプチドを予測させるオーブン・リ ーディング・フレームを含んでいる。この配列の最初の２３残基は、他のエクス テンシン配列と比較したとき、ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅの規則（１９８５，Ｊ、　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、胆４．９９−１０５）によって定義されるように、リーダ ー配列をコードしている。コード配列の残りは２７６アミノ酸の非常にプロリン に富むポリペプチドをコードしている。

本発明のプロモーターは図１に示すようなｅｘｔＡ遺伝子の５°フランキング配 列である。この配列は開始コドンの５°から７４塩基に植物のコンセンサス“Ｔ ＡＴＡ″ボックスに密接に相同性の配列（ＣＴＡＴＡＴＡＡＡ）を含んでいる。

これを別にすれば、顕著な特徴は他に何も認められない。この５′フランキング 配列とニンジンのエクステンシン遺伝子ｐＤｃ５Ａｌ　（Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｖ ａｒｎｅｒ、　ＥＭＢＯＪ、　４．２１４５−２１５１、１９８５）のそれとを 比較しても、“ＴＡＴＡ”ボックスのほかに、高度に保存された配列の領域は存 在しない。

ｅｘ　ｔＡの発現 ｅｘ　ｔＡが発現される遺伝子に相当することを確かめるために、そしてその転 写開始点を決定するために、一連のＳｌマツピング実験を行った。Ｄｄｅ　１部 位（塩基７１）で５°末端をラベルした、５°方向にＮ５ｉ１部位（塩基−７４ ）またはＤｄｅ　１部位（塩基−２３７）まで伸長するｅｘ　ｔＡの断片を単離 し、セイヨウアブラナの根に由来するポリ（Ａ）＋ＲＮＡ　’にハイブリダイズ させた。ＳＬヌクレアーゼで処理した後、保護断片をポリアクリルアミドゲル電 気泳動で大きさにより分画化した。両方の場合に、６６−７５塩基の保護断片が 得られ、最も強いバンドは配列ＴＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＣ中の下線を付けた 塩基に対応し、この塩基を塩基＋１（図１ではＴ”Ｓで示しである）とした。こ の配列は植物の共通の転写開始点−ＣＡＴＣ−とよく一致し、”ＴＡＴＡ″ボッ クスから適当な距離（３４塩基）にある。対照中に存在しない他の保護断片は観 察されなかった。塩基−８６のＮｄｅ１部位でラベルした、塩基−４５３のＮｄ ｅ１部位まで伸長する別のプローブを作製し、上記のようにハイブリダイズさせ た。このプローブの保護断片は観察されなかったが、少量の完全なプローブが実 験および対照の両ハイブリダイゼーションにおいて観察された。これらの結果か ら、決定された転写開始点はｅｘ　ｔＡ中のただ１つの開始部位であることが判 明し、２つの転写開始点が観察されたニンジンのエクステンシン遺伝子と対照的 である。

上記の結論を確認するために、そしてｅｘｔＡ発現の器官特異性を調べるために 、異なるセイヨウアブラナの器官に由来するＲＮＡのノザンプロットにおいてこ の遺伝子の断片をプローブとして使用した。この遺伝子の完全なコード配列から 成り、塩基−７４まで伸長するプローブを、４つのセイヨウアブラナの器官、す なわち根、緑色の葉、黄色くなった葉、発芽しつつある種子に由来するＲＮＡと ハイブリダイズさせた。このプローブは根に含まれる約１３００および１４８０ 塩基の２つのｍＲＮＡ種とハイブリダイズし、発芽しつつある種子に含まれる約 １６００塩基のｍＲＮＡ種とは非常に弱くハイブリダイズした。このハイブリダ イゼーションパターンはｃＤＮＡ種ｐＲＲ。

５６６（および密接に相同性の種）によって示されたものと非常に似ており、同 一プロットのｃＤＮＡプローブへの再ハイブリダイゼーションにより、両方のプ ローブによって同じバンドが検出されることを確認した。ｐｌ？Ｒ，５６６の３ ゛フランキング配のサイズをｅｘｔＡの配列のサイズに加えるならば、３０塩基 のポリ（Ａ）尾部がｃＤＮＡ配列に付加されると仮定して、完成された遺伝子は 約１２５０塩基のｍＲＮＡ種をもたらすことが推定されるだろう。かくして、セ イヨウアブラナの根において観察された約１２６０塩基のｍＲＮＡ種はｅｘ　ｔ Ａの産物であると提案することができる。根に存在する大きいｍＲＮＡ種（約４ ．６ｋｂ）へのｅＸ　ｔＡプローブの極めて低レベルのハイブリダイゼーション も観察された。

実施例２：トランスジェニックタバコでのｅｘ　ｔＡの発現λＢ３１　クローン から単離した、もとのセイヨウアブラナｅｘ　ｔＡ遺伝子は、採用したクローニ ング戦略のために３゛ターミネータ−領域を欠いていた（図４）。従って、効率 のよい植物ターミネータ−配列を含む２６０　ｂｐのツバリンシンターゼ（ｎｏ ｓ）　ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１断片をクローンｐＮＯＰ−ＮＥＯから切り出し、 ＢａｍＨｌ−ＥｃｏＲＩ切断ｐＵｃ１８に連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａにク ローニングした。ｐＮＯＰ−ＮＥＯは、Ｂｅｖａｎ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２．８７１１−８７２１　 （１９８４）に発表されているように、ＮＯＳターミネータ−に連結された、カ ナマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ） 遺伝子に連結されたＮＯＳプロモーターを含むクローンである。

ｐＲλＳ４から４．７５　ｋｂの旧ｎｄ’１ｌｌ−３ａｌｌ断片として切り出さ れたｅｘｔＡ遺伝子はその後、ｔｌｉｎｄｌｌｌ−３ａｉｌで制限したＮＯＳタ ーミネータ−ｐＵｃ１８クローンに連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５αにクローニ ングした。

最終ｅｘｔＡ−ＮＯＳターミネータ−構築物を図５に示す。次いで、全ｅｘｔＡ −ＮＯＳターミネーター構築物を完全な５．０１　ｋｂの旧ｎｄｌｌｌＥｃｏＲ Ｉ断片として切り出し、旧ｎｄ　ｌ　ｌ　Ｉ−ＥｃｏＲｌで制限した二成分ベク ターｐＢＩＮ１９　（Ｂｅｖａｎ、　１９８４）に連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ １０２２にクローニングした。ｐＢＩＮ１９：ｅｘｔＡと称する最終ハイブリッ ド遺伝子構築物を図６に示すが、これはＴ−ＤＮＡボーダー間に配置された内因 性のカナマイシン耐性遺伝子をさらに含んでいる。

ｐｏ　ＩＮＩ　９　：　ｅｘ　ｔＡと名づけだこの構築物はＡ、　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４に三親接合（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ ）で移し、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ　（ＳＲＩ）のリーフディスクを 形質転換するために使用した。

タバコを試験用トランスジェニック系として使用する前に、タバコＤＮＡに対し てサザンブロッティング実験を行って、タバコＤＮＡへのエクステンシンコード 領域のハイブリダイゼーションが起こらないことを確かめた。低ストリンジエン シー条件でさえ、タバコＤＮＡへのエクステンシンコード領域のハイブリダイゼ ーションは見られなかった。詳細には： 細菌株および接合 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０２２株の中のベクタープラスミドｐＢＩＮ１９　（Ｂｅ ｖａｎ。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．８７１１−８７２１．１９８４）、 移動用Ｅ、ｃｏｌｉ１（ＢＩＯＩ／ｐＲＫ２０１３株（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ 、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７７、７３４７−７３５１゜１９８０）および宿主Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４ ４０４株（Ｈｏｅｋｅｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３．１７９− １８０．１９８３）を使用した。

細菌の接合のために、抗生物質を次の濃度で使用した：硫酸カナマイシン、５０ 　ｕ　ｇ／ｍｌ　（ｋａｎ）　；　リファンピシン、１００　ｕ　ｇ＃ｎ１（ｒ ｉｆ）；硫酸ストレプトマイシン、５００　μｇ／ｍｌ　（ｓｔｒｅｐ）。Ｅ、 ｃｏｌｉＭＣ１０２２／ＢＩＮ１９　（ｋａｎＲ，５ｔｒｅｐＳ、ｒｉｆ’　） 　、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／ｐＲＫ２０１３（ｋａｎＲ，５ｔｒｅｐｓ、ｒ ｉｆｓ）およびＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４（ｋａｎ５，５ ｔｒｅｐＲ，ｒｉｆ’　）の−晩培養物２００μｍずつを混合し、抗生物質によ る選別なしにＬＢプレートで２７℃、１５時間インキュベートすることにより、 組換えベクターＢＩＮ１９：ｅｘｔＡを三親接合で移した。その後、細胞混合物 を１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，で希釈し、カナマイシンを含む最少培地にまいて２７ ℃で４日間インキュベートした。Ａ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４コロニーは正しい抗生物質耐性マーカ ー（ｋａｎ’　、５ｔｒｅｐＰ、ｒｉｆＲ）について調べ、さらにコロニーハイ ブリダイゼーションとサザン分析により試験して、ｎｐｔおよびｅｘ　ｔＡ遺伝 子がＢＩＮ１９：ｅｘｔＡプラスミド中に転位していない完全な形で存在するこ とを確かめた。

タバコの形質転換および再生 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４／ｐ ＢＩＮ１９：ｅｘｔＡは、２０ｐｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に２７ ℃で培養し、この細菌をペレット化し、２　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋て３回洗い、ＭＳ 塩類（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ、社、英国ハーフオードシャー州すックマンズワース ）　、１０　ｍｇ／ｍｌのショ糖（ｐＨ５，８）中に約１０９細胞／ｍｌの密度 で再懸濁した。

十分に水をやったＮ、　ｔａｂａｃｕｍ　（ＳＲＩ）植物体から採集した開いた 葉を７ｏ％（ｖ／ｖ）エタノール（３０秒）で、次に５％（ｗ／ｖ）　Ｃａ（Ｏ ＣＩ）ｚ（１５分）で表面滅菌した。滅菌水で洗った後、それぞれの葉を主な葉 脈を避けながら四角（約８　ｘ　８　ｍｍ２）に切り、細菌懸濁液に入れ、断続 的にかき混ぜて切断した葉の縁を湿らせた。１０−１５分のインキュベーション （２２−２５°Ｃ）後、ＭＳ塩類（ビタミン類を含む）　、１０　ｍｇ／ｍｌの ショ糖、２μｇ／ｍｌのＮ６フルフリルアミノブテリン（カイネチン）　、０． ２　μｇ／ｍｌの１−ナフチル酢酸（ｐＨ５，８）および８　ｍｇ／ｍｌのバク トー寒天を含む新芽誘導培地の寒天プレートに（同軸面を上にして）葉片を置き 、２５°Ｃ，１８時間の光同期（１２０μｍｏ１．ｍ−２．ｓ−’ＰＡＲ）で培 養した。２日後、この葉片をＩ　Ｈ／ｍｌのカルベニシリン（ジナトリウム塩） を含む液体新芽誘導培地に移し、穏やかに一夜攪拌した（６０　ｒｐＭＩ振とう 器）。無菌吸収紙の上で葉片を表面乾燥し、５００μｇ／ｍｌのカルベニシリン 、２００μｇ／ｍｌのカナマイシン（硫酸塩）を含む新芽誘導培地の寒天プレー トに置き、上記の条件下で培養した。

葉片の切断縁から発生した小さな新芽（接種から４−６週間）を切り取り、半分 の濃度のＭＳ塩類、５　ｍｇ／ｍ＋のショ糖、２５０　μｇ／ｍｌのカルベニシ リン、２００μｇ／ｎ＋１のカナマイシン（ｐＨ５，８）を含む寒天プレートに 移した。生長しつづける幼芽は半分の濃度のＭＳ塩類、１００μｇ／ｍｌのカル ベニシリン、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび８　ｍｇ／＋ｎｌの寒天を 含む根誘導培地を入れた６０　ｍｌ無菌容器（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ社、英国ミドル セックス州フェルタム）に移した。根が伸びた幼芽は半分の濃度のＭＳ塩類、５ ０ｐｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび８　ｍｇ／ｍｌの寒天を含む２５０　ｍｌ 無菌がラスピンに移した。小さな苗が十分な根を伸ばしたとき、それらを培地か ら取り出し、ＬｅＶｉｎｇｔＯｎ　コンポスト：パーライトの１＝１混合物（Ｓ 　ｉ　１ｖａｐｅｒ　１ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、英国ハロゲート）を入れた鉢に植 え、毎日水をやりながら制御された環境のもとで生長させた。伝達された遺伝子 の完全性を評価するゲノム分析のためにＤＮＡを、そしてエクステンシン遺伝子 発現の分析のためにＲＮＡを抽出すべく、トランスジェニック植物体からの組織 を液体空気中に収穫した。鉢植えにした植物からは約５週間後に花が咲き、自家 受粉後に、裂開により各植物から種子を集めた。

ＤＮＡの抽出およびサザン分析 Ｎ、ｔａｂａｃｕｍの葉からＤＮＡを抽出し、精製した。ハイブリダイゼーショ ン用のＤＮＡプローブは、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　（Ａ ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２．６−１３．１９８３）によるランダムプライミング を使って、高比活性（＞８　ｘ　１０”Ｂｑ／μｇ）に１２ｐでラベルした。サ ザントランスファーとハイブリダイゼーションでは標準技法を使用し、ハイブリ ダイゼーション後の最終洗浄には高ストリンジエンシー（３０ｍＭ　ＮａＣｌ、 　３　ｍＭクエン酸Ｎａｓ、　６５８Ｃ，６０分）を採用した。フィルターは、 フラッシュをかけたＸ−線フィルム（Ｆｕｊｉｍｅｘ社、英国スイントン）と増 感スクリーン（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ社、英国ステイーブンエイジ）を使って、８０℃ で７２時間オートラジオグラフィーを行った。

ＲＮＡの抽出およびノザン分析 トランスジェニックＮ、　ｔａｂａｃｕｍ植物体の組織に由来する全ＲＮＡはＬ ｏｇｅｍａｎｎらの方法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｖ＋、　１６３．１６−２ ０．１９８７）により単離した。セイヨウアブラナのエクステンシンプローブに 特異的にハイブリダイズするＲＮＡのサイズを概算するために、ｌＯμｇの各試 料ＲＮＡをグリオキサレート化し、アガロースゲルで電気泳動を行い、その後ニ トロセルロースに移行させた。ノザンプロットを高ストリンジエンシー（１５ｍ Ｍ　ＮａＣ１，１，５ｍＭクエン酸Ｎａｐ、　０．１％　ドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）、　２５分、５０°Ｃ）のちとに洗い、フィルターを上記のように ２週間オートラジオグラフにかけた。

最初の形質転換実験から１５本のトランスジェニックタノくコ植物体を再生し、 生長させた。サザンおよびノザンブロ・ソテイングによる分析のために葉と根の 試料を集めた。再生されたトランスジェニック植物体のほとんとは、導入したノ ）イブリッドエクステンシン遺伝子の転位されていない完全なコピーを保有して いた。個々の形質転換体に含まれる導入遺伝子のコピー数の概算値はＩコピーか ら５コピーの範囲で変化した。転位されていない導入遺伝子の完全なコピーを保 有するトランスジエニ・ノクタノくコ植物体だけをエクステンシン発現のその後 の分析のために使用した。

セイヨウアブラナエクステンシンの特異的抗体の人手が困難であるために、プロ ーブとしてゲノムクローンλ８３１由来のエクステンシン１．ｏｋｂコード配列 を使って、タバコの葉と根組織から抽出した全ＲＮＡに対してノザンハイブリダ イゼーションを行った。

対照または形質転換タバコ植物からの葉ＲＮＡへの／％４ブリダイゼーションは 見られなかった。エクステンシンプローブのトランスジェニック根ＲＮＡへのハ イブリダイゼーションは試験した全ての形質転換体において観察されたが、個々 の形質転換体間のハイブリダイゼーシヨンのレベルは異なっていた（位置効果） 。

形質転換タバコの最初のバッチから種子を採り、その種子をコンポストにまき、 植物体を生育させた。

セイヨウアブラナでのｅｘ　ｔＡ遺伝子の発現を見るために、λ８３１由来のセ イヨウアブラナプロモーターを、ＢＩＮＩ９の二成分ベクター変異型中のグルク ロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子のコード配列に翻訳融合させた。この構築物を含む クローンを、腫瘍形成性Ｒｉプラスミ　ドのｐＲｉ　１８８５　（Ｃｏｎｓｔａ ｎｔｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｓｍｉｄ　５．　１７０−１８２゜１９８１ ）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（ＬＢＡ　９４０２）と接合させた。こ の株をセイヨウアブラナの苗に接種すると、トランスジェニック毛根が生え、毛 根ではＧＵＳ活性を容易に検定することができる。切除したトランスジェニック 毛根から完全な植物体を再生し得る。

詳細には、セイヨウアブラナのエクステンシンプロモーターをｐＲλＳ４から１ ．ｏｋｂのＨａｅｌｌｌ−Ｈａｅｌｌｌ断片として切り出した。この断片を、Ｇ ＵＳコード配列の開始点でＳｍａｌにより制限した、プロモーターを欠くグルク ロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を含む修飾ｐＢＩＮ１９二成分ベクターに平滑末端 連結した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　５．３８７−４０５．　１９８７）（図８）。この翻 訳融合体からのセイヨウアブラナプロモーターの発現は、どのセイヨウアブラナ ＡＴＧを翻訳開始コドンとして使用するかに応じて、７個あるいは１１個の余分 のアミノ酸をもつグルクロニダーゼ酵素をもたらすだろう。

ｐＢ１１０１中のｅｘｔＡ−ＧＵＳハイブリッド遺伝子（ｐ［１Ｉｌｏｌ　：ｅ ｘｔＡ−ＧＵＳ）はＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０２２にクローニングし、その後適 当なＡｇｒＯｂａＣ１ｅｒｉｕｍ株との三親接合によりＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ ｇｅｎｅｓに移した。ｐＢｌｌｏｌ　：ｅｘｔＡ−ＧＵＳを保有するＡｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓで形質転換されたセイヨウアブラナ“ 毛根”において、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ　５．３８７−４０５．１９８７）のＸ−Ｇｌｕ ｃ　（５−ブロモ−４−クロ叶３−インドリルーβ−Ｄ−グルクロニド）組織化 学的検定を使って、この構築物からの発現について調べた予備結果は、このプロ モーターがセイヨウアブラナの根組織において活性であることを明確に示した。

セイヨウアブラナの組織培養および形質転換プロトコール；Ａ、　ｒｈｉｚｏｇ ｅｎｅｓを用いた形質転換実験Ｂ、　ｎａｐｕｓ　ｃｖ、　Ｂｉｅｎｖｅｎｕｅ 　（ウインターセイヨウアブラナ）、Ｂｒｕｔｏｒ　ａｎｄ　Ｒａｐｉｄ　Ｃｙ ｃｌｉｎｇ、の無菌的に生育しツツある苗に、別個の独立したレプリコンとして 旧プラスミドｐＲｉ　１８５５（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８１）と図８のカナマイシン耐性融合構築物（ｐＢｌｌｏｌ　：ｅｘｔＡ−Ｇ ＵＳ）の両方を保有するＡ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ＬＢＡ９４０２株をその 子葉節に接種した。接種箇所から生えた毛根を切り取り、培地（ｌ　Ｘ　ＭＳ塩 類およびビタミン類、　４％シヨ糖、　２　ｇ／ｌＣａＣｌ２．Ｈ２Ｏ，０，１ ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、　２．５　ｎ＋ｇ／Ｉ　ＢＡＰ）、０．１ｍｇ／ｌのチアミ ン、２００　ｍｇ／ｌのセフォタキシム、５０　ｍｇ／ｌのカナマイシン、８　 ｇ／ｌのＢａＣｔＯＤｉｆｃｏ寒天、ｐＨ５，８中で生育させ、毛根を増殖させ た。

再生は次のように行うことができる二毛根の先端２−３ｃｍの０，５ｃｍ切片を 切除し、３　ｍｇ／ｌの濃度の２．４−Ｄで処理し、５０　ｍｇ／Ｉのカナマイ シンを含む発芽培地にプレートして図８の融合構築物のＴ−ＤＮＡカナマイシン 遺伝子を含む組織を選択する。これらの毛根から生えた新芽を切り取り、Ｐｅ１ ｌｅｔｉｅｒらの培地Ｆ　（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１９１．２４４−２５０．１９８３）で２−３週間生育させる。

次に、それらを板形成培地Ｇに移し、根が十分に発育したとき土壌に移植し、封 じ込め生育室で成熟体へ育てる。

トランスジエニックウィンターセイヨウアブラナ植物体は、日光に８時間あてな がら４℃で生育させて、花芽の形成を促進する。

花は開花前に除雄し、野生型セイヨウアブラナ花粉と異系交配させる。裂開後に 得られた種子を集め、土壌で育て、この子孫植物体を成熟させる。初めに、子孫 植物体は現れた毛根症候群の程度に関して肉眼で評価する。子孫の葉におけるカ ナマイシン耐性は、５０または１５０　ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むカルス誘 導培地（下記参照）にリーフディスクを移して検定する。Ｒｉとカナマイシン耐 性特性は共にサザンハイプリダイゼーション分析によりさらに確かめることがで きる。

実施例で使用した培地は以下の通りである：１、　苗の生育用培地 ＭＳ塩類　２．３５５　ｇ／ｌ シヨ糖　２０　ｇ／Ｉ Ｄ１ｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ寒天　１５　ｇ／Ｉ　ｐＨ５，８２、Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ培養用の液体培地−ＹＭＢマンニトール　１ ０　ｇ／ｌ 酵母エキス　０．４ｇ／Ｉ Ｋ）１２ＰＯ４０，５ｇ／ｌ Ｍｇ５Ｏ＋、２８ｚ０　０．２　ｇ／ｌＮａＣ１Ｏ，１ｇ／ｌ 力ｆマイシン５０ｍｇ／Ｉ　ｐｔ（７，０３、毛根培養用の培地（Ｏｏｍｓ’培 地：　Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｔｈｅｏｒ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　７１．３２５−３２９）ＭＳ塩類　４．７１　ｇ／ ｌ ＣａＣ１□、２Ｈ２０２ｇ／ｌ −ショ糖　４０　ｇ／Ｉ ＮＡＡ　Ｏ，１８ｍｇ／Ｉ ＢＡＰ　２．５　ｍｇ／ｌ チアミン）ＩＣＩ　０．１　ｍｇ／Ｉ Ｄ１ｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ寒天　８ｇ／ｌカナマイシン　２５または５０　ｍｇ／ ｌセフォタキシム　２００　ｍｇ／Ｉ　ｐｌ（５，８４、新芽誘導、増殖および 機影成用の培地り溶液、ＲＣＣ培地、ＦおよびＧ培地はＰｅ１ｌｅｔｉｅｒら（ １９８３）およびＧｕｅｒｃｈｅら（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０ ６．３８２−３８６．１９８７）に記載される通りである。さらに、これらの全 培地ではいつも２００　ｍｇ／ｌの濃度のセフォタキシムを維持する。

ＭＳ塩類　４．７ｇ／ｌ シヨ糖　３０　ｇ／Ｉ ＮＡＡ　２　ｍｇ／ｌ カイネチン　０．２ｍｇ／ｌ カナマイシン　１００　ｍｇ／ｌ 寒天　８　ｇ／ｌ ｉ暑ＨｇＢＨＨ（１ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法　第１８４条の８） 平成４年　９月１６日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．植物の根においてタンパク質を発現させることができるプロモーターであっ て、 （ａ）図１に示したヌクレオチド−１６１６からヌクレオチド−１までの配列ま たは該配列の一部、あるいは （ｂ）１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失によ り、および／または一端または両端での伸長により修飾された前記配列（ａ） を有するプロモーター。
2. ２．タンパク質をコードする遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項１記載 のプロモーターを含むＤＮＡ断片。
3. ３．請求項１記載のプロモーターの制御下にタンパク質をコードする遺伝子を含 むベクターであって、該ベクターで形質転換された植物細胞において該遺伝子が 発現され得るようなベクター。
4. ４．前記プロモーターが前記遺伝子の５′末端に直接融合される、請求項３記載 のベクター。
5. ５．前記遺伝子とプロモーターを植物細胞ゲノムに伝達して安定した状態で組み 込ませる領域をさらに含む、請求項３または４記載のベクター。
6. ６．プラスミドである、請求項３−５のいずれか１つに記載のベクター。
7. ７．請求項３−６のいずれか１つに記載のベクターで形質転換された植物細胞。
8. ８．タンパク質をコードする遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項１記載 のプロモーターを保有する植物細胞。
9. ９．請求項７または８記載の植物細胞から再生されたトランスジェニック植物体 。
10. １０．タンパク質をコードする遺伝子に機能しうる状態で連結された請求項１記 載のプロモーターを細胞中に保有するトランスジェニック植物体。
11. １１．請求項９または１０記載のトランスジェニック植物体から得られた種子。
12. １２．請求項１１記載の種子から生育させた植物体。
13. １３．植物の根において目的タンパク質を生産することができるトランスジェニ ック植物体を作製する方法であって、（ｉ）請求項３−６のいずれか１つに記載 のベクターで植物細胞を形質転換すること、ただし前記プロモーターの制御下に ある遺伝子によりコードされるタンパク質が目的とするタンパク質である；およ び （ｉｉ）該形質転換細胞から植物体を再生することから成る方法。