JPH07501699A - 定位の，および任意のｄｎａ増幅を使用することによる微生物の同定方法 - Google Patents

定位の，および任意のｄｎａ増幅を使用することによる微生物の同定方法

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JPH07501699A JP5510256A JP51025693A JPH07501699A JP H07501699 A JPH07501699 A JP H07501699A JP 5510256 A JP5510256 A JP 5510256A JP 51025693 A JP51025693 A JP 51025693A JP H07501699 A JPH07501699 A JP H07501699A
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ストラウス，ニール・アレクサンダー
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 定位の、および任意のＤＮＡ増幅を使用することによる微生物の同定方法 発明の分野 本発明はＤＮＡ増幅を使用する微生物の同定分野に関するものである。
より詳細には、本発明は生物に有意な特定のゲノム領域を増幅することにより作 出された生産物の特性決定に基づいた原核生物の種の同定に関する。さらに特定 のゲノム領域の増幅と共にゲノムの任意部分の増幅により、微生物の種、血清型 および株の同定が行われる。
発明の背景 種々の調査報告および文献が予想される試料中の細菌のような微生物の同定に関 して最近公表された。これらの資料では仮定に基づいて微生物を同定または分類 するための方法を開発することが強調されてきた。
すなわち、研究者は目的とする特定の微生物または病原体をスクリーニングする ために技術を利用する。さらに他の文献では、特異的プライマーまたは変種を合 体させたちのて、注意深く制御された操作の制約下で面倒なスクリーニングが必 要である。後に続く考察から明らかになるが、本発明はこれらの不都合を除去す る。
Ｗａｌｌａｃｅらに対するＰＣＴの国際公開第０８９／１０４１４号は新規遺伝 マーカーの創製法、および多重遺伝マーカー決定法を開示する。ゲノムＤＮＡ試 料を増幅し、増幅断片中の配列変化を検出する。増幅断片が次に検出される。こ の刊行物は一般的概念を教示し、それは複数の多形塵（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ 　１ｏｃｉ）を含むポリヌクレオチド標的配列が増幅され、その産物で座持異的 特性を有する標的配列の存在の有無が分析される。しかし、１ｌｌａ１１ａｃｅ らは微生物を検出するために高度に保存されたｒＤＮＡ配列間に介在するスペー サー領域の増幅については焦点をおいていない。文献ではこの研究については単 独でも、または全ゲノムからの任意の領域と一緒にでも扱っていない。
欧州特許第０３３２４３５号はひとつ以上の変異ヌクレオチド配列の検出法を目 的としている。核酸試料を、標的塩基配列の診断部位と実質的に相補的な診断用 プライマーと接触させる。伸長はプライマーの末端ヌクレオチドが標的塩基配列 の変異体または正常なヌクレオチドと相補的である場所でのみ起こる。伸長した 産物がある場合には検出される。この研究法では、増幅およびその後の分析に、 本発明で意図するような保存されているｒＤＮ＾ＤＮＡに介在するスペーサー領 域を標的にしていない。
Ｗｉｌｌｉａｍｓらの［任意のプライマーで増幅させたＤＮＡの多様性は遺伝子 マーカーとして有用である（ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ａｍｐｌｉ ｆｉｅｄ　ｂｙ　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｒｅ　ｕｓｅｆｕｌ 　ａｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒｓ）Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ第５ｅａｒｃｈ、　２２．６５３１−６５３５頁、およびＷｅｌ ｓｈらの「任意のプライマーでのＰＣＢを使用するフィンガープリンティング（ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲｗｉｔｈ 　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｐｒｉｍｅｒｓ）Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、第１８巻、Ｎｏ、　２４．７２１３−７２１８頁、の両方は細菌 を含む種々の源からのゲノムＤＮＡ試料の増幅産物の特徴的パターンを作成する ためのＤＮＡ増幅反応での任意のプライマーの使用を示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓら により使用された研究法は、小さいプライマーを比較的高いストリンジエンシー 条件で使用するものであった。これらの多形性は無作為に増幅させた多形ＤＮＡ （すなわちＲＡＰＤ）マーカー（標識形質）と呼ばれ、様々な種の遺伝子地図を 構築するために有用である。ｆｅｌｓｈらは増幅工程でより長いプライマーの使 用を記載し、これは初期のサイクルでは低いストリンジエンシー条件、次に後の サイクルではより高いストリンジエンシー条件を使用している。両方の場合にお いて、細菌の株が予め決定された参考パターンと任意にプライマー伸長されたゲ ノムのプリントとの比較により同定される。
Ｗｉｌｌｉａｍｓら、およびＷｅｌｓｈらにより記載された両方法は、比較的高 い回数の増幅サイクルで任意のプライマーを使用することを採用している。
このような条件下での実施ではかなりな量の第二増幅産物の形成、および非特異 的ＤＮＡ合成がよく起こる。このような増幅産物を電気泳動で分離し、次に得ら れるパターンを分析し、そしてパターン認識ソフトウェアにより処理する。
Ｗｉｌｌｉａｍｓら、およびＷｅｌｓｈらにより記載されたような単一の任意プ ライマーでの増幅は、与えられた種について種のレベルで共通な要素、および株 のレベルで識別された要素の両方を持つ任意の生産物パターンを生じることがで きる。しかし単一の任意プライマー、または一対の任意プライマーでは微生物の 広範な種にわたって正確に特性表示することはできない。したがって、種のレベ ルで共通のパターン要素、かつ株のレベルで識別できる要素に達するためには、 異なる微生物の種には異なる任意プライマーの種類が必要である。本発明は、Ｗ ｉｌｌｉａｍｓら、および’１ｅｌｓｈらにより記載された方法についての改良 を示し、それは一連の可能性のあるプライマーで未知微生物をスクリーニングす るかまたは仮定的な予備同定を行う必要はない。
仏国特許第２．６３６．０７５号は例えば食品中に存在する細菌、酵母、寄生体 および他の真核微生物の検出に関する。リポソームＲＮＡがある場合には製品か ら抽出され、逆転写酵素の存在下でＤＮＡに転写される。このＤＮＡ鎖はプライ マーの存在下で相補鎖に転写され、そして次に既知の検出しうる配列を特定する ひとつ以上のプライマーの存在下で増幅される。増幅された配列をアクリルアミ ドゲルの電気泳動により、または増幅領域の一部を包含するプローブを使用する ハイブリダイゼーションにより検出する。
Ｖｉｌｇａｌｙｓらは「数種のクリプトコツカス種の酵素的増幅リポソームＤＮ Ａの迅速な遺伝子同定およびマツピング（Ｒａｐｉｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　１ｄｅ ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ ｌｌｙ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡｆｒｏｍ　５ｅｖｒ ａｌＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ）ｊ　Ｊ、ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ、　１９９０年８月、４２３８−４２４６頁で、病原性真菌に関連 した種を同定するために必要な制限タイピングおよびマツピングを行うための簡 略化された方法を記載する。リポソームＤＮＡの既知の領域を増幅するためのポ リメラーゼ連鎖反応（以下のような）、続いて制限消化および電気泳動的分離を 使用する取り組みが討論されている。
仏国特許第２．６３６．０７５号明細書およびＶｉｌｇａｌｙｓらにより記載さ れた同定法は、多くの酵素的処理工程を採用し、この工程は中間産物の精製を必 要とする。多くの酵素的工程およびその中間産物単離の両方の必要性により、こ れらの方法は高価かつ労働過剰なものになる。
Ｍｕｌｌｉｓらは米国特許第４．６８３．１９５号明細書および米国特許第４． ６８３．２０２明細書でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法という）を記載し、こ れは核酸のいずれかの特定部分を増幅するために使用することができる。このよ うな分析法は、試験ゲノムから選択された標的ＤＮＡ部分の増幅を通じて多形性 を検出するために使用されて来た。そのような方法の欠点は、標的部分の異なる 鎖にハイブリダイズするふたつのオリゴヌクレオチドブライマーが設計できるよ うに、特異的部分の両端における十分な数の塩基が十分詳細に知られることを必 要とすることにある。必要なプライマーを設計するために標的ゲノムから必要な 配列情報得ることは、多大な労力を必要とする。
本発明の目的は、高度に保存されたｒＤＮｋＤＮＡ配列位置する断片の長さおよ び数の変化を検出することにより、属および種のレベルでの微生物の同定法を提 供することにある。これらの断片をリポソーム配列（１？Ｓ）断片と呼ぶ。本発 明のさらなる目的は好ましいＰｃｔｒ法を使用する微生物同定法を提供すること である。さらなる本発明の目的は、微生物同定法の基礎を提供する増幅に唯−一 対の核酸配列が必要となることである。
このために上記Ｒ５断片の多様性が、高度に保存されている配列（ｒＤＮＡ配列 として）を含有していると知られている領域間に介在する可変配列（スペーサー 領域として）の増幅により特性決定される。これらのＤＮＡ配列は可変配列を両 側に含むことができ、またはさもなければ可変配列に関連して位置することがで きる。さらに本発明の目的は、同定が血清型および株のレベルにまで及ぶことで ある。これは高度に保存されているｒＤＮＡ配列間に介在する可変配列の増幅と 一緒に、微生物ゲノムのさらなる任意の領域の増幅を利用する改良法を通じて行 う。本発明の特徴は、微生物および分子生物学的労作に共通する種々の、限定さ れるものではないが、電気泳動および染色法（エチジウムブロマイドによるよう な）、または分光光度法を含む。他の技術との適合性がある。
本発明の利点は増幅産物を作出するために、同一プライマーの対をすべての微生 物種に使用することである。これらのプライマーの配列は原核生物間で高度に保 存されているので、これらのプライマーを一般的ニ応用する。この単一のプライ マー対からの増幅により、与えられた種に特徴的な既知の遺伝子座中の保存配列 からの産物が作出される。任意の増幅の結果、さらなる産物が生成し、これらを ある種内の株を識別するために使用する。スクリーニングおよび予備的な同定の 必要性が除去されるので、時間および費用の実質的な節約が実現する。
本発明のもうひとつの利点は、本明細書中で記載する方法の使用により反応産物 の電気泳動的分離に関するパターンを提供し、このパターンは最少量の二次的で 非特異的増幅産物を含む。これらのパターンで、米国特許第４．８８５．６９７ 号明細書に記載されたような参照データベースパターン比較することに使用され るタイプのパターン認識ソフトウェアによる分析および処理により適する。
本発明のもうひとつの利点は、本明細書で記載する方法は唯一の酵素処理工程を 必要とするにすぎず、電気泳動的分離に先立って、引き続き試料精製を必要とし ないことである。このように、本方法は労力を要せず、かつ時間の十分な節約を もたらす。
本発明のこれらの、および他の目的、特徴および利点は以下の本発明の説明によ り一層容易に理解できるようになるであろう。
発明の要約 本明細書で開示されているものは微生物の種の同定法である。この方法は。
（ａ）微生物からのゲノムＤＮＡの単離、該ゲノムＤＮＡは高度に保存された配 列間に介在する可変配列を含み； （ｂ）該可変配列を増幅させ、これによってサイズと数が特定の分布を有する断 片を生産し；そして （ｃ）該断片をサイズで分離し、そして該断片の分布を分析し、これによって微 生物の種を決定する、 ことを含んで成る。
本明細書でさらに開示されているのは、微生物の種、血清型および株の同定法で あり、これは： （ａ）微生物からのゲノムＤＮＡの単離、該ゲノムＤＮＡは高度に保存された配 列間に介在する可変配列に加えてそのゲノムに沿った任意領域を含み： （ｂ）該可変配列を増幅させ、これによってサイズと数が特定の分布を有する断 片を生産し。
（ｃ）　（ｂ）と同時に該任意領域を増幅させ、これによってサイズと数が特定 の分布を有する任意ゲノム（ＡＧ）断片を生産し：そして（ｃ）該断片および該 ＡＧ断片をサイズで分離し、そして該断片および該へ〇断片の分布を分析し、こ れによって微生物の種、血清型および株を決定する、 ことを含んで成る。
これらの方法は、食品が担持する微生物のような内在する細菌の種、血清型およ び株を決定するために特に有用である。
好適な態様において、高度に保存された配列は高度に保存されたｒＤＮ八配列配 列る。したがって断片はＲ３断片である。
本明細書に記載された方法の好適な態様によれば、工程（ａ）の単離は細胞溶解 および除タンパクを含む。さらに工程（ｂ）の増幅は、好ましくは少なくとも一 対のオリゴヌクレオチドブライマーと、高度に保存されたｒＤＮ＾配列とのアニ ーリングを含むことができる。核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸が 、高度に保存されたｒＤＮＡ間に介在する可変配列を増幅するために適するプラ イマーに導入される。また、オリゴヌクレオチドブライマーは前記配列、および 複数の任意領域とアニールされ、任意領域の適当な増幅を確実にできる。
図面の簡単な説明 第１図は細菌のｒＲＮ＾遺伝子座の概略図である。この座には増幅が起こること を可能にする保存された配列領域、およびこれらのプライマー結合部位の間のス ペーサー領域を含む。
−サー領域の増幅産物について視覚化したパターンである。
のスペーサー領域の増幅産物について視覚化したパターンである。
遺伝子座中のスペーサー領域の増幅産物について視覚化したパターンである。
域の増幅産物について視覚化したパターンである。
第６図は目的の病原性種に関連する４種類の属から取った８つのさらなる種に関 するｒＲＮＡ遺伝子座中のスペーサー領域の増幅産物についての視覚化パターン である。これらの種は以下のものであるニジトロバクターｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇ ｅｎｅｓ）、エンテロバクタ−アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａ ｇ−サー領域および全微生物ゲノムからの任意領域の両方の増幅産物について視 覚化したパターンである。
スペーサー領域および全微生物ゲノムからの任意領域の両方の増幅産物について 視覚化したパターンである。
遺伝子座中のスペーサー領域および全微生物ゲノムからの任意領域の両方の増幅 産物について視覚化したパターンである。
Ａ遺伝子座中のスペーサー領域および全微生物ゲノムからの任意領域の両方の増 幅産物について視覚化したパターンである。
発明の詳細な説明 本明細書に記載された方法は、広範な微生物の同定に有用である。本方法の使用 を通じて明らかにできる代表的な、しかし限定的ではない微生物のタイプは属、 種および血清型を含み、リステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏ ｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｗｅｌ ｓｈｉｍｅｒｉ）、リステリアイノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　１ｎｎｏｃｕａ ）、リステリアイノアノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　１ｖａｎｏｖｉｉ）、サルモネ ラチフィムリム（ａ膳岬畦ｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）、サルモネラエンテリ チディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ ｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッ力ススクイリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃ５９恐匹畦■）、スタフィロコッカスワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ懸皿π人）、スタフィロコッカスサブロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ ｃｕｓ　５ａｐｒｏｐｈｙｔ封匹）、スタフィロコッカスエピデルミゾイス（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓ）、エシェリヒアコリー （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、エシエリヒアファ−グソ一二（Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エシエリヒアブラッテ（肪印町１ ｃｈｉａ　ｂｌａｔｔａｅ）、エシェリヒアコーマニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｈｅｒｍａｎｉｉ）、エシェリヒアブルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｖ ｕｌｎｅｒｉｓ）、シトロバクタ−フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆ ｒｅｕｎｄｉｉ）、シトロバクタ−ダイパーサス（四ｏｂａｃｔｅｒ　ｄｉｖｅ ｒｓｕｓ）、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅ ｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクタ−アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ ｒ　ａｇｇｌｏｍｅｒａスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ） 、プロテウスブルガリス（ＰｒｏｔｅｕｓＬｉｔｉｃａ）である。このような一 覧表はすでに視角化された産物のデータベースを作成することができ、これは本 発明の方法により電気泳動され、視角化された断片と比較する時、種（もし応用 できれば、さらに血清型および株、）の同定を可能にする。
当業者には容易に理解できることであるが、本方法は広範な環境情況での微生物 に応用できる。すなわち、本発明の好適な使用法は食品中の微生物の同定である 。加えて、ヒトおよび他の動物および植物内の微生物感染を対象とする調査にお いても本明細書中の方法が有利となるであろう。
本発明は原核生物の種の同定に関し、これはｒＲＮＡ遺伝子座の１６Ｓおよび２ ３Ｓ領域中に見いだされるスペーサー領域の増幅により生産される産物の特性決 定に基づく。このｒＲＮＡ遺伝子座は原核細胞に見いだされる遺伝子単位である 。この遺伝子座を作る核酸配列の重要部分は、すべての原核生物に共通である。
（第１図はこの座の一般的概略を表す。）この遺伝子座の１６Ｓ、２３Ｓおよび ５Ｓ領域の全体的関連性が、原核生物の異なる種を分類する道具として使用され て来た。１６ＳリポソームＲＮＡ領域をコードする遺伝子は、より少ない保存配 列の部分の間に介在する高度に保存された領域を含有することを示した。しかし １６Ｓ領域よりは良く特性決定されていないものの、２３ＳリポソームＲＮＡ領 域もまた同様な造作を有することが示された。
１６Ｓ、　２３Ｓおよび５Ｓ遺伝子配列はスペーサー単位（ｓｐａｃｅｒ　ｕｎ ｉｔｓ）で分けられている。これらのスペーサー単位（スペーサー領域とも言う ）は、原核生物に関する属および種のレベルで、配列および長さにかなりの程度 の変化を表す。与えられた種のの単一ゲノム中に、頻繁に多重ｒＲＮＡ遺伝子座 が存在することがある。これらの座中に見いだされるスペーサー領域も、長さお よび配列に有意な程度の変化を示す。１６３領域の保存された配列は、１６Ｓ配 列中の非保存配列のヌクレオチド組成を決定する目的で、増幅用の部位として使 用できることが示されて来た。同様に、１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡの３°お よび５′の保存領域はそれぞれ、これらふたつの保存領域間に含有されたスペー サー単位の増幅用のプライマー結合部位として使用できる、ということを期待す るのは理にかなっている。そのようなスペーサー領域の増幅は、与えられた原核 生物の種に特徴的なサイズおよび数を持つ断片を生成するであろうと期待される 。
ｒＲＮＡ遺伝子座の１６３領域は広範な細菌について配列決定された。この配列 データの編集はＤａｍｓらの［小さなリポソームサブユニットＲＮＡ配列の編集 （Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｍａｌｌ　ｒｉｂｏｓａｍａｌ　５ｕｂｕ ｎｉｔ　ＲＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）　Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ、第１６巻、補遺、第ｒ８７頁中に与えられている。
この配列データは、スペーサー領域に直ぐに隣接する１６Ｓ領域中の高度に保存 された配列を同定する目的で検討された。選択された配列はＧＡＡＧＴＣＧＴＡ ＡＣＡＡＧＧであり、Ｐｌと命名された。この配列はスペーサー配列からおよそ ３０−４０塩基離れた高度保存領域にある。
２３Ｓ領域に関して入手しうる配列データは実質的に少ない。Ｇｕｔｅｌｌらは ［構造的フォーマット中に存在する巨大サブユニットＲＮＡの編集（＾ＣＯｍｐ ｉｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　５ｕｂｕｎｉｔ　ＲＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅｓ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｉｎ　ａ　５ｔｒｕｃｔｕ■ ａｌ　ｆｏｒｍａｔ）　Ｊ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｊｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、第 １６巻、補遺、１１７５頁に、５種の細菌および４種の植物クロロプラスト配列 から成る２３Ｓの小さな収集を与える。選択された第２プライマーは、与えられ た細菌の配列中で最も保存されている配列を表し、これはスペーサー領域に直後 に見いだすことができた。選択された配列はＣ＾＾ＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＧＴで あり、これをＲ２と命名する。この配列が上記の５種の細菌例中に保存されてお り、そしてスペーサー領域からおよそ２０塩基離れて位置していた。この配列も 同領域で１３から１５塩基（８７％同一）植物クロロプラスト配列と適合すると いう事実は、この特定な配列が革新的に安定であり、かつ広範な種類の細菌につ いて保存されるであろうと期待できるさらなる理由を与える。
１６Ｓおよび２３Ｓ領域の両方についてのプライマーが、１７塩基に長さが制限 されているのは（そして使用するためには１５−１７塩基が好ましい）、より長 いプライマーは保存の程度がより悪い領域へ伸長するからである。
すべての細菌中に保存されていない領域を部分的に覆うプライマーは、増幅効率 がより変化するものと思われる。これはすべての細菌ゲノムＤＮＡ試料のために プライマーの単一の組、および増幅条件を特定することをより難しくする。リポ ソームスペーサーではない幾つかの配列は、円およびＲ２のプライマーの組によ って増幅可能である。このようなことが起こるのは稀であると思われるが、非ス ペーサー領域の増幅はたとえ高いストリンジエンシー条件下であっても除外する ことはできない。そのような増幅はこの方法の利用性を損なうものではないし、 微生物を種のレベル以下で区別するためのさらなるパターン情報を提供するよう になるだろう。プライマーＰ１およびＲ２を用い、高度なストリンジエンシー増 幅により生産された増幅断片はどれもＲ３断片と呼ぶ。この名前はこれらのプラ イマーに関する配列がリポソームスペーサー領域の両端を含む高度に保存された ｒＤＮＡ配列から取られたことを指示するために役立つ。
病原仕種の同定は種のレベルを越えて血清型および株にまで進める必要がよくあ る。この情報は例えば食品汚染の源を同定し、そして伝染性感染の経路を追跡す るのに価値がある。ｒＲＮ＾遺伝子座中のスペーサー領域の増幅から作られたパ ターンは種を同定するために十分な情報を含んでいるが、血清型および株のレベ ルにまで同定を進めるために十分な情報をいつも含んでいるとはかぎらない。リ ポソームＲＮＡ遺伝子は全原核ゲノムの約１％を構成しているにすぎない。種を 血清型および株のレベルで同定するためには、ｒＲＮ＾遺伝子の外側に位置する これらの領域のゲノム組成に関するさらなる情報を集める必要がある。
ゲノム材料からの任意の増幅断片を生産するための方法は、Ｗｉｌｌｉａｍｓら によって示された。その方法は小さいオリゴヌクレオチドの使用を記載し、すな わちＤＮＡ増幅反応中の任意組成は約ｌＯ塩基である。プライマーに相補的およ び逆相補的配列が、ＤＮＡ増幅が起こり得るために十分小さい、ゲノムに沿った 間隔で見いだすことができるように、短いプライマーが使用される。増幅工程で 生産された断片は無作為増幅多重ＤＮＡ　Ｒ＾ＰＤマーカーと呼ばれる。これら のＲＡＰＤマーカーは、増幅工程で使用するＤＮＡのゲノム構成における適度な 相違に対して感受性のサイズ分布を表す。
本発明においては、標的微生物のゲノムからの任意増幅断片の作出法と共に、ｒ ＲＮＡ遺伝子座中のスペーサー領域からの増幅断片の作出法も提供する。推定ｒ ＤＮＡスペーサー領域の増幅は、１５−１７塩基プライマーを使用して、最高約 ７２°Ｃ（および好ましくは最高約５５℃）の温度で、約１−２０（好ましくは ２−１０）分間の増幅反応中でアニーリングする。血清型および株のレベルでの 種の識別は、増幅に使用するプライマーのサイズを小さくし、一方それらの配列 の保存要素は維持する。プライマーのサイズを長さで１１塩基まで減少させ（そ して好ましくは１０−１２塩基を使用）、かつ温度を４３−４６℃にまでに下げ て、約１−１０分間（好ましくは約５−１０分）間アニーリングすることにより 、単一のプライマー対を使用してＲ３断片およびＲＡＰＤマーカーの両方をゲノ ムＤＮＡから作出することが可能である。ＲＡＰＤマーカーは任意のゲノム配列 の増幅により生産されるので、今後へ〇断片と呼ぶ。Ｒ３およびＡＧ断片の組み 合わせ増幅を今後ＲＳ／ＡＧ増幅と呼ぶ。増幅反応で生産されるＲ３断片は、種 のレベルで微生物を識別するのに十分独持なものである。さらに作出されるＡＧ 断片は微生物を血清型および株のレベルで識別するために十分なさらなる多様性 を提供する。
本発明の重要な特徴は、各ＲＳ／＾Ｇ増幅パターンが種を同定するために使用す るＲ３断片を含有することである。これは、与えられた種の独自の株は、その株 が共通の種に由来することを示す共通のパターン要素を含むことを意味する。参 照パターンデータベースに表されていない株に出会った場合でも、株の種が同定 できるのは、その種に関するＲ３断片を含んでいる参照パターンデータベースが 提供されているからである。
Ｒ３／ＡＧパターンを作出するために使用したプライマーの保存的性質を保護す るために、増幅反応に使用する１１−塩基プライマーは１５−塩基プライマー配 列の部分集合である。スペーサーに隣接する１６３部分のために選択された配列 は、ＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣであり、これを今後Ｐ３と命名する。スペーサー領 域に続＜２３Ｓ部分について選択された配列はＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣであり、 これを今後Ｐ４と命名する。
分子内ハイブリダイゼーションがｒＤＮ＾ＤＮＡ座中で有意な種度で起こること が知られている。得られる二次構造は、増幅プライマーがハイブリダイゼーショ ン部位に競合することを難しくすることよくがある。ｒＤＮＡ領域に含まれる断 片の増幅を増強するために、典型的には経験により増幅温度プロフィールを変更 する必要がある。主要な変更は実質的に長いアニーリング時間を使用することで ある。Ｒ３断片を作出には、ＰｌおよびＲ２について７分である。単一の反応で Ｒ３およびへ〇断片の両方を作出するためには、Ｒ３およびＲ４について８分で ある。両方の場合において、増幅反応を高いストリンジエンシー条件と共に、増 幅サイクルを減少させて実行する。高いストリンジエンシー増幅は、反応が最も 高いアニーリング温度で行われ、ここで産物が再生産的に形成される。ＰｌとＲ ２のプライマーの組に関する再生産的産物の形成を生じた最大温度は５５℃であ った。Ｒ３とＲ４のプライマーの組に関する再生産的産物の形成を生じた最大温 度は４３°Ｃであった。最大アニーリング温度の使用で最も安定なハイブリダイ ゼーション構造物のみが形成し、ならびにプライマー結合部位は再少量の二次構 造を有するであろうことが確実になる。
増幅反応に長いアニーリング時間を使用することにはふたつの理由がある。第一 に、ポリメラーゼはプライマーカいイブリダイズした部位を見つけるの十分な時 間が要り、この結果、各増幅サイクルの全体的効率が上昇する。第二に増幅の開 始部位は、その部位が最も大きい接近性を有するということよりはむしろ、アニ ーリング部位が最も安定なプライマー−二重鎖を形成するということにより支配 されるであろう。これは有意にパターンの再現性を向上させる、なぜなら増幅部 位は動力学的な接近性よりはむしろ、プライマーのハイブリダイゼーション部位 に基づくからである。相対的平衡は温度およびイオン強度における僅かな変化に 対して、特異的ＤＮＡ部位への接近性の相対的動力学よりもより感受性が低いの で、生成するパターンの完全さはイオン強度および温度の僅かな変化に対してよ り感受性が低い。増幅工程の効率の上昇は再現性があり、かつ容易に検出しうる パターンを、ＲＳ増幅については２５サイクル内、Ｒ３／ＡＧ増幅については２ ８サイクル内に生産することを可能にする。
任意のプライマー結合法は、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、およびＷｅｌｓｈらにより報 告され、双方は多数回の増幅サイクルを必要とし、それはそれぞれ４５回、およ び３２−４２回である。そのような多数回の増幅サイクルは、二次的増幅産物の 形成および非特異的ＤＮＡ合成を頻繁に生じる。そのような高い二次的増幅産物 および非特異的ＤＮＡを含む生産物プロフィールのバックグラウノンドは、パタ ーン認識ソフトウェアがそのようなプロフィールを既知のデータベースと比較す る能力を厳しく制限する。７−８分のアニーリング時間で、増幅サイクルの回数 を少なくすることで、非特異的ＤＮＡのバックグラウノンドが有意に減少した、 はるかに複雑さが少ない生産物プロフィールが作られる。Ｒ８またはＩ？Ｓ／Ａ Ｇ増幅からの産物を電気泳動で分離する時、作成されたパターンは、参照データ ベースとの比較に使用されるタイプのパターン認識ソフトウェアにより容易に分 析および処理できる。
ｍＭ　ＮａＣ１）に再懸濁する。細胞を２５０のりソスタフィン（Ｌｙｓｏｓｔ ａｐｈｉｎ）、３０μｇのＮ−アセチルムラミダーゼ、４００１Ｉｇのアクロモ ペプチダーゼ、および６００μｇのりゾチームから成る最終容量３０６μｌの溶 解バッファーの酵素消化に供する。消化を３７℃で３０−４５分間行う。溶解物 をクロロホルム／フェノールで抽出し、次にエタノール沈殿を行う。ＤＮＡをｔ ｒｉｓ／ＥＤＴ＾バッファーに溶解し、最終的な濃度を分光光度的に測定し決定 する。
ＤＮＡの増幅 増幅反応は一般的にＭｕｌｌｉｓらによる米国特許第４．６８３．１９５号明細 書、およびＭｕｌｌｉｓによる米国特許第４．９６５．１８８号明細書に記載さ れ、これらの特許は引用することにより本明細書の内容となる。米国特許第４． ６８３゜１９５号は基本的なＰＣＲ法の教示に関し、ならびに米国特許第４．９ ６５．１８８号は好熱性ポリメラーゼの教示に関する。核酸鋳型を増幅するため の特別な条件は、Ｍ、　Ａ、　Ｉｎｎ１ｓおよびり、　Ｈ，Ｇｅ１ｆａｎｄのｒ ＰＣＲ法、方法および応用ツカイド」、Ｍ、　Ａ、　Ｉｎｎ１ｓ、　Ｄ、　Ｈ， Ｇｅ１ｆａｎｄ、　Ｊ、　−Ｊ、　５ｎｉｎｓｋｙおよびＴ、　Ｊ、　ＩＦｈｉ ｔｅ４１集A 第３−１２頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されており、 これは引用することにより本明細書の内容となる。
具体的には、Ｍｕｌｌｉｓは核酸またはその混合物を含む任意の所望する特定の 核酸配列を増幅するための方法を目的としている。Ｍｕｌｌｉｓの方法は、核酸 の分かれた相補的鎖を過剰モルのふたつのオリゴヌクレオチドブライマーで処理 し、そしてプライマーを伸長させて所望の核酸配列を合成するために鋳型として 作用する相補的プライマー伸長産物を形成することから成る。Ｍｕｌｌｉｓのプ ライマーは、増幅される各特異的配列の種々の鎖に十分に相補的であるように設 計されている。反応の工程は段階的、あるいは同時に行うことができ、所望する 頻度で反復できる（本発明では増幅は少なくとも２回行われるべきである。）本 発明の内容によれば、ゲノムＤＮＡは細胞溶解物から単離され、除タンパクされ る。Ｒ３断片の増幅は（およびもし応用できるならば任意のゲノム領域）、少な くともひとつのオリゴヌクレオチドブライマーの対を、高度に保存されたｒＤＮ ＾ＤＮＡアニーリングさせる（ならびに、応用できるならば複数の任意領域と） ことから成る。この方法では、核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸が プライマーに取り込まれる。方法はＲ３断片を増幅するのに適する条件で行われ る（ならびにもし応用するならば、任意領域）。
好ましい核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼであり、特に耐熱性であるもの である。好ましいヌクレオシド三リン酸はデオキシリボヌクレオシド三リン酸で ある。
微生物のゲノムから作出された増幅産物のパターンを微生物の同定に利用するた めには、そのパターンは種のすべての員に共通な要素と共に、その種の中の独自 の株を識別する要素を含むべきである。この特性により、新しい株の種の同定を 明らかにすることが可能になり、これは参照パターンデータベースには含まれて いないので、その種のパターンの共通要素が参照データベースに含まれることを 提供する。もし同じ種の異なる株である場合には、それぞれが共通種要素無しで 完全に独自のパターンを作成するので、パターンそれ自体は未知の株の種を同定 することＤＮＡ試料を増幅前に２０ｎｇ／μｍの濃度に希釈する。１．２５μｌ の細菌ゲノムＤＮＡアリコートを２．５μｌのＩＯＸ反応バッファー、ｌｌｌ１ のｄＮＴＰ混合物（各５ｍＭ）、１．２５μｍの１５−塩基オリゴヌクレオチド プライマー各２種（ＰＬおよびＲ２を５０ｎｇ／μｍで）、および４２μｍの脱 イオン水と混合する。（プライマーは遺伝研究所（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ）から得、さらに精製することなく使用する。同じ機能を達成する他の 源からの他のプライマーも使用できる。）この混合物を９４°Ｃに５分間加熱し 、そして１．３単位の好熱性ＤＮＡポリメラーゼを混合物に加える。使用できる ポリメラーゼは弛ポリメラーゼを含み、これはＣｅｔｕｓ社により開発された精 製法に従いサーマスアクアチクス（Ｔｂｅｒｍｕｓ　Ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　Ｙ ＴＩから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ 　Ｃｅｔｕｓ社、Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴから入手できる。２５回の増幅サイク ルが自動熱循環機（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）で行われる。サイクルの構成は 以下のようである２９４°Ｃで１分間（変性工程）；室温から５５℃、２分間； ５５℃で７分間（アニーリング工程）；室温から７２℃、２分間そして７２℃で ２分間（合成工程）。最終サイクルは引き続きさらに７２℃で７分間行い、完了 するために部分的重合を起こさせる。サイクルプログラムの終わりに、ｂ＋ｌの ＥＤＴＡ（０，５Ｍ）を停止溶液として加え、精製物を４℃で保存する。
Ｒ５断片および任意のゲノム領域の増幅（ＲＳ／八〇へＤＮＡ試料を増幅前に２ ０ｎｇ／μｍの濃度に希釈する。２．５μｍの細菌ゲノムＤＮＡアリコートを５ μｍのＩＯＸ反応バッファー、２μｍのｄＮＴＰ混合物（各５ｍＭ）、２．５ａ ｌの１１＝塩基オリゴヌクレオチドプライマ一各２種（Ｒ３およびＲ４を５０ｎ ｇ／μｍで）、および３４μｌの脱イオン水と混合する。（プライマーは遺伝研 究所（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）から得、さらに精製することなく 使用する。この混合物を９４℃に５分間加熱し、そして２．０単位の好熱性ＤＮ Ａポリメラーゼを混合物に加える。使用できるポリメラーゼは石ポリメラーゼを 含み、これはＣｅｔｕｓ社により開発された精製法に従いサーマスアクアチクス （Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　ＹＴＩから単離された熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼで、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社、Ｎｏｒｗａｌｋ 、　ＣＴから入手できる。２８回の増幅サイクルが自動熱循環機で行われる。サ イクルの構成は以下のようである２９４°Ｃて０．５分間（変性工程）二室温か ら４３°Ｃ，２，７５分間、４３℃で８分間（アニーリング工程）；室温から７ ２℃、３，５分間そして７２℃で２分間（合成工程）。
最終サイクルは引き続きさらに７２°Ｃで７分間行い、完了するために部分的重 合を起こさせる。サイクルプログラムの終わりに、１μｍのＥＤＴＡ（０，５Ｍ ）を停止溶液として加え、精製物を４℃で保存する。
増幅産物の電気泳動 ５μｍの反応混合物アリコートを取り出し、２＋＋１の添加バッファー（ｌｏａ ｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ：１５％フィコールおよび０，２５％キシレンシアツー ル）と混合する。
この混合物を４％アクリルアミド／ビスゲル（２９／１）に添加し、電化泳動で 分離する。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ透過機で写真を取る。Ｒ ３断片および＾Ｇ断片を視覚化するための他の技術を選択できる。そのような技 術の択一的方法のひとつは、増幅中に蛍光−標識デオキシヌクレオチドを取り込 むことである。もうひとつの別法は分光法である。
寒旌彰 図２−６はｒｒＤＮＡスペーサー領域の増幅」の章に記載された方法を使用して 、特定した細菌由来のゲノムＤＮＡについて増幅を行うことにより作成した。図 ７−１０はｒｒＤＮＡスペーサー領域および任意のゲノム領域の増幅」の章に記 載された方法を使用して、特定した細菌由来のゲノムＤＮＡについて増幅を行う ことにより作成した。増幅産物はアクリルアミドゲルで分離し、ならびにエチジ ウムブロマイドで染色した。８種類の異なる属りの数の病原性微生物を表し、そ れらの同定および特性決定は特に重要らびにさらに４種類の属から採用された８ 種は目的とする病原仕種に関連するものである。これらの細菌に関する増幅反応 で生産された断片サイズのプロフィールの例、および電気泳動による解析は図２ ないし６に示す。
５種類の異なる属を表す細菌を、Ｒ５とへＧ断片（Ｒ３／ＡＧ）の組み合わせ増 幅ランブイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）から選択した。これ らの細菌に関する増幅反応で生産され、および電気泳動により解析された断片サ イズのプロフィールの例を図７ないし１０に示す。各株について、Ｒ８およびＲ Ｓ／ＡＧの両方の増幅に共通な断片サイズは図７−１０で矢印にて指示される。
細菌ＤＮＡの増幅を含有するレーンは各図で番号を付けられ、ならびにそのレー ンに対応する株の番号は図の凡例に与えられる。番号を付けていないレーンは、 増幅産物にサイズを指定するために使用される時間マーカーを含む。時間マーカ ーのサイズは次の通りである２２８，４１２．６９３．１３３１、および２３０ ６塩基対（ｂｐ）。増幅により生産された断片のサイズは、時間マーカーに相対 的なこれらの断片の位置から計算された。増幅産物のされた計算サイズの不確実 性は約２％である。
ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の４株のパターンを表す。すべての４株のエルモ ノサイトゲネス（Ｌ、　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は３５５および６２５ｂ ｐで同じ塩基対を表す。残るリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種の解像物は以下 のとおりである。レーン５および６、エルウエルシメリ（１，、ｖｅｌｓｈｉｍ ｅｒｉ）の３５５および６４０ｂｐの断片；レーン７および８、エルイノキュア （Ｌ、　１ｎｎｏｃｕａ）の３５５および６５５ｂｐの断片；レーン９および１ ０、エルイヴアノヴイ（！、、、　１ｖａｎｏｖｉｉ）の３８０および６０５ｂ ｐの断片。すべてのリステリア種に共通するサイズの断片は無かった。
実施例２ 図３はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属からの４種類の血清型についての Ｒ８断片の増幅に関するパターンを表す。サルモネラチフィムリム（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）の４株についてのパターンをレーン１−４ に表す。エスチフィムリム（Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）の４株すべてが、４ ８０．６５０および６７５ｂｐ断片の同じ組み合わせを表す。サルモネラ（Ｓａ ｌｍｏｎｅＬｌａ）の残りの血清型の解像物は以下のとおりである；レーン５お よび６、エスエンテリチディス（Ｓ、ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）の雨林とも４８ ０．６００および６５０ｂｐで共通の断片を表す；レーン７および８、ニスニュ ーポート（鼻、　ｎｅｗｐｏｒｔ）の雨林とも４８０．５７０および６１０ｂｐ で共通の断片を表し、ならびにニスニューポート＃７０７（Ｓ、　ｎｅｗｐｏｒ ｔ　＃７０７）もさらに５１０ｂｐに断片を表す、レーン９および１０、エスイ ンファンティス（Ｓ、　１ｎｆａｎｔｉｓ）の雨林とも４９５．５６０．６３０ および６５５ｂｐで共通の断片を表す。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の すべての血清型で共通の断片を４８０−４９５ｂｐの領域に含む。しかし試験し たすべての血清型は独自の生産物サイズプロフィールも含む。
実施例３ 図４はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属からの５種のＲ ５断片の増幅に関するパターンを表す。スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の８株についてのパターンをレーン１ −８に表す。レーン１−３の株すべてが４２５．４６５．５６５および７０５ｂ ｐ断片で共通のパターンを表す。レーン４−８に見られる残る５株はわずか２− ３の要素が共通である一連の異なるパターンを表し、例えば４８５．５７０およ び６２０ｂｐの断片を５株のうちの３種類で見いだすことができる。しかし５株 のうちの３種類以上には他の共通断片サイズはない。スタフィロコッカス（Ｓｔ ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の残りの種をレーン９−１６に表す。これらの種の 解像物は以下のようである：レーン９および１０、ニススクイ１バＳ、　５ｃｕ ｉｒｉ）の雨林とも３４５．４４５および５３５ｂｐで共通の断片を表し、なら びにエススクィリ＃８６ｇ（Ｓ、　５ｃｕｉｒｉ　＃８６８）もさらに５３ｏｂ ｐにバンドを表す；レーン１１および１２、エスウアーネリ（Ｓ、　ｗａｒｎｅ ｒｉ）は４５５．５０５．５２５および５４ｓｂｐで断片を持っ；レーン１３お よび１４、エスサブロフィチクス（Ｓ、　５ａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）は４７ ０．５５０、および６４０ｂｐで断片を持つ；レーン１５および１６、エスエピ デルミディス（Ｓ、　ｅｐｉｄｅｒｍｉ呻）の雨林とも３９０、および５９０ｂ ｐで共通の断片を表し、エスエビデルミディス＃７９６（ｌｊ、ｅｐｉｄｅｒｍ ｉｄｕｓ　＃７９６）はさらなる断片を５２０ｂｐで表し、ならびにエスエピデ ルミディス＃７８８（Ｓ、ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓ　＃７８８）は２つのさらな る断片を伺０および４９０ｂｌ）に示す。Ｒ３断片の増幅パターンにおいて、棟 内変異は、評価した他のスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ） 種よりもニスアウレウス（Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ）の方がはるかに大きい。これは Ｒ３断片の増幅により作成されたパターン中の情報が、種のレベル以下で識別で きる場合の例である。スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ ｃｕｓ　ａｕｒｅｕ号）以外のすべてのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ ｃｏｃｃｕｓ）種は、他の増幅産物よりもはるかに大量のレベルで存在する単一 の特徴的断片の生産により特徴つけられた。これらの特徴的な断片は以下のよう である：３４５ｂｐｐのエスサブロフィチクス（Ｓ、　５ａｐｒｏｐｈｙｔｉｃ ｕｓ）、および３９０ｂｐのエスエピデルミディス（Ｓ、　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ ｕｓ）。スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属で見いだされ るパターン中の遺伝子的変異も、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびリ ステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属で見いだされる変異よりも有意に大きかづた。
実施例４ 図５はエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属からの５種に関するＲ３断片 の増幅臼其）の４株すべてが、４８０および５３０ｂｐで同じ対を表す。４種類 のさらなるエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種の単−例をレーン５−８ に表す。これらのいずれもエシェリヒアコリ−（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉ）と共通の断片を持たないようであるが、レーン６のエノエリヒアファーグ ソニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）は４９５および５５０ｂ ｐ断片とは異なる同様な断片サイズを示す。
す６てのエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ）種に共通なサイズの断片は無 かった。
実施例５ 図６は目的とする病原種に関する４種類の属から取ったさらなる８つの種に関す るＲ５断片の増幅についてのパターンを示す。レーン１−４は２種のシトロバク タ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ）についてのパターンを表す。レーン１および２ に示されるシーフロインディ（Ｃ，ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の２株は、両方とも３１ ５．４９０および６１５ｂｐの断片と同一のパターンを与えた。レーン３および ４のシーダイバーサス（Ｃ，ｄｉｖｅｒｓｕｓ）株も４６０および６１５ｂｐの 断片と同一のバタパターンを表す。イーアエロゲネス（Ｅ、　ａｅｒｏｇｅｎｅ ｓ）の２株はレーン５および６に示され、４６５ｂｐで共通断片と同様のパター ンを示す。イーアエロゲネス＃６２（Ｅ、　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ＃６２）に関す る他のふたつの断片は２８０と５９０ｂｐである。イーアエロゲネス＄１１６７ （見、　ａｅｒｏｇｅｒ＋ｅｓ＃１６７）について、それぞれ１゜塩基長くシフ トしている同様な断片パターンが見られる。レーン７および８の２株ノイーアグ ロメランス（Ｅ、　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）は４５０．４７５および５８０ｂ Ｐの断片と同様なパターンを表す。レーン９および１０のイークロアカニ（Ｅ、 　ｃｌｏａｃａｅ）の雨林は３１０．４６５および５８０ｂｐで断片を表す。レ ーン１１−１４はプロテウス（ＰｒｏｔｅｕＳ）種についてのパターンを表す。
レーン１１および１２の２株のピー　ミラビリス（Ｐ、　ｍ１ｒａｂｉ１ｉｓ） は５０５．６６５および８５０ｂｐの断片で同一のパターンを表す。レーン１３ および１４において２株のピーブルガリス（Ｐ、　ｖｕｌｇａｒｉｓ）は断片５ ９０．８４０．９３０．１０７ｏおよび１２００ｂｐを表す。
レーン１５および１６はエルシニアエンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎ ｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）の２株のパターンを表す。両方の株が７４５および ８１５ｂｐで一対の断片を表す。
実施例６ 図７はリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属からの３種のＲ３およびへＧ断片の増 幅に関スるパターンを表す。レーン１−４はリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉ ｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の４株についてのパターンを表す 。４株すべてのエルモノサイトゲネス（！、、　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ） が３５５および６２５ｂｐの共通の対を表し、これは同じリステリアモノサイト ゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏ口ｏｃｙｔｏｇｅｎ明）について図２で観察さ れたＲ５断片と同一である。パターン中の残りの成分は任意ゲノムの増幅の結果 である。これらの成分は４種類のエルモノサイトゲネス（Ｌ、　ｍｏｎａｃｙｔ ｏｇｅｎｅｓ）株の３種類を区別できる。エルモノサイトゲネス（見ｍｏｎｏｃ ｙｔｏｇｅｎｅｓ）＃８９１および＃８９９は同じ増幅産物を生成する。残りの リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種の解像物は以下のとおりであるｌｓｈｉｍｅ ｒｉ）の２株間を区別するために使用できる。レーン７−８では、エルイノキュ ア（Ｌ、　１ｎｎｏｃｕａ）が３５５および６５５ｂｐに共通の断片対を表し、 これは同じエルイノキュア（Ｌ、　１ｎｎｏｃｕａ）株について図２で観察され たＲ３断片と同一である。パターン中の残りの成分は任意ゲノムの増幅の結果で およびＡＧ断片の増幅に関するパターンを表す。４株のサルモネラチフイムリム （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）のパターンをレーン１−４に 表す。４株のすべてが４８０．６５０および６７５ｂｐで同じ断片対を表し、こ れは同じエスチフイムリム（Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）株について図３で観 察されたＲ３断片と同一である。パターン中の残りの成分は任意ゲノムの増幅の 結果である。これら０．５６０．６３０および６５５ｂｐて共通の断片を表し、 これは同株の増幅について図３で観察されたＲ３断片と同じである。さらなる断 片は任意のゲノムいて同様なパターンを表す。レーン７−８では、ニスエンテリ テイディス（Ｓ、　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）の同株が４８０．６００および６ ５０ｂｐで共通の断片を表し、これは同じ株の増幅について図３で観察されたＲ ３断片と同じである。さらなる断片は任意のゲノム増幅の結果であるがこれらの 株間を識別するために使用できる。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属につ いて作成されたＲ３／ＡＧパターンのすべてが高度に関連していた。しかし、個 々のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型はＲ３／ＡＧ増幅での独自な生 産物プロフィールに基づいて識別できる。
実施例８ 図９はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属からの３種に関 するＲ３およびへ〇断片の増幅に関するパターンを表す。４株のスタフィロコッ カスアウレウス（ＳｔａｐｈｙＬｏｃｏｃｃｕｓ岬正凹）のパターンをレーン１ −４に表す。
レーン１の株＃８０７は４２５．４６５．５６５、および７０５ｂｐで断片を表 し、これは同株について図４で観察されたＲ３断片と同一である。パターン中の 残りの成分は任意ゲノムの増幅の結果である。レーン２および３では、スタフィ ロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）＃１０ ９８および＃１０９７の両方が５６５および６０５ｂｐで共通断片を表し、さら に＃１０９８は５０５ｂｐの断片を表し、ならびに＃１０９７はさらに５２５ｂ ｐの断片を表す。すべてのこれらの断片は同株について図４で観察さたＲ３断片 と同じである。パターン中の残りの成分は任意ゲノムの増幅の結果であり、スタ フィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の これらの２株間をより容易に区別するために使用できる。レーン４の株＃７９５ は４７０．５１５．５６５および６５０ｂｐで断片を表し、これらは同株につい て図４で観察されたＲ３断片と同じである。
パターン中の残りの成分は任意ゲノムの増幅の結果である。パターン中の残りの 成分は任意ゲノムの増幅の結果である。スタフィロコッカスする。さらなる断片 は任意のゲノム増幅の結果であるがこれらの株間を識別するために使用できる。
エスエピデルミデイス（Ｓ、　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓ）＃７８８および＃７９ ６の同株はレーン７および８に表されるが、これらは図４に観察されるＲ３断片 にサイズで対応する断片を表す。さらなる断片は任意のゲノム増幅の結果である がこれらの株間を識別するために使用できる。
へＧ断片の増幅に関するパターンを表す。レーン１−４は４株のエシェリヒアの 対を表し、これは同株の増幅について図５で観察されたＲ３断片と同一である。
パターン中の残りの成分は任意ゲノムの増幅の結果である。これらの成分はエシ ェリヒアフリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の４株を区別できる。レ ーン５および６に表される２株のソトロバクターフロインディー（Ｃｉｔｒｏｂ ａｃｔｏｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）両方は、３１５．４９０および６１５ｂｐの断 片を含有するパターンを表す。これらの断片は、図６に示されるシーフロインデ ィー（Ｃ，ｆｒｅｕｎｄｉｉ）のＲ８増幅に生産された断片にサイズが対応する 。さらなる断片は任意ゲノムの増幅の結果であり、これらの林間を区別するため に使用できる。
本発明の方法は本明細書中の発明の精神および観点から逸脱することなく、当業 者の経験に従い変更することができると理解される。
配列表 （１）一般情報； （ｉ）出願人：ヤンセンマークエー、シトラスネイル（ｉ）発明の名称：定位の 、および任意のＤＮＡ増幅の使用による微生物の同定法 （ｉ）配列数：４ （ｍ）連絡先 （＾）宛て先：イーアイデュポンデネモラスアンドカンパ（Ｂ）通り・バレーミ ルブラザ３６／２１２２（Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：１９８０−００３６ （マ）コンピューター読み取り先： （＾）媒体の種類、フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター、マンキントラシ ュ（Ｃ）実行システム：マツキントラシュ、６．０（Ｄ）ソフトウェア・マイク ロソフト、４．０（１）現在の出願データ： （Ａ）出願番号米国ノリアル番号０７／８０３．３０２（Ｂ）出願日：１９９１ 年１２月４日 （Ｃ）分類。
（−）弁理士／代理人に関する情報 （Ａ）氏名：ハンバイウィリアムエイチ（Ｃ）参照ｌ処理番号：ＭＤ−０１０１ （ａ）電気通信情報： （Ａ）電話：３０２−９９２−４９３０ＣＢ）テレファックス：３０２−８９２ −７９４９（２）配列番号：工に関する情報 （１）配列特性 （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 Ｑ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （η）配列の記載：配列番号Ｉ ＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡ　ＣＡＡＧＧ　１５（２）配列番号：２に関する情報 （ｉ）配列特性 （＾）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数・−末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｊ）分子の型ＤＮＡ　（ゲノム） （ｍ）配列の記載、配列番号２ ＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣＧＴ （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉ）分子の型：ＤＮＡ　Ｃゲノム） （ｉ）配列の記載：配列番号３ ＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡ　Ｃ１１ （２）配列番号；４に関する情報 （ｉ）配列特性 （＾）長さ一１１塩基 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 ０）分子の型：ＤＮＡ　（ゲノム） （ｍ）配列の記載；配列番号４ ＾＾ＧＧＣＡＴＣＣ八　Ｃ１１ Ｆ工Ｇ、１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９ 、　１Ａｊｌ＋＋１＋＆ｌ＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９２／１０２１７フロントページ の続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｑ　１／６８ Ｃ１２Ｒ１：３７） （Ｃ１２Ｑ　１／６８ Ｃ１２Ｒ１：４２） （Ｃ１２Ｑ　１／６８ Ｃ１２Ｒ１：４４） （Ｃ１２Ｑ　１／６８ Ｃ１２Ｒ１：４４５） （Ｃ１２Ｑ　１／６８ Ｃ１２Ｒ１：４５） Ｉ

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. １．（ａ）微生物からゲノムＤＮＡを単離し、該ゲノムＤＮＡは高度に保存され た配列の間に介在する可変配列を含み、（ｂ）該可変配列を増幅し、これによっ て大きさおよび数が特定の分布を有する断片を生産し、ならびに （ｃ）該断片を大きさで分離し、そして該断片の分布を分析し、これによって徴 生物の種を決定する、 ことを含んで成る、微生物の種の同定方法。
  2. ２．上記高度に保存された配列が高度に保存されたｒＤＮＡ配列であり、ならび に上記断片がＲＳ断片である、請求の範囲第１項記載の方法。
  3. ３．上記可変配列がスペーサー領域である、請求の範囲第２項記載の方法。
  4. ４．上記工程（ａ）の単離が細胞溶解および除タンパクを含む、請求の範囲第１ 項記載の方法。
  5. ５．上記工程（ｂ）が少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを上記高 度に保存されたｒＤＮＡ配列とアニーリングさせ、そして核酸ポリメラーゼおよ びヌクレオシド三リン酸を上記可変配列を増幅するために適する該プライマーに 導入することを含んで成る、請求の範囲第２項記載の方法。
  6. ６．上記増幅が少なくとも２回行われる、請求の範囲第５項記載の方法。
  7. ７．上記アニーリングが最高約７２℃の温度で、約１−２０分の時間起こる、請 求の範囲第５項記載の方法。
  8. ８．上記アニーリングが最高約５５℃の温度で、約１−２０分の時間起こる、請 求の範囲第５項記載の方法。
  9. ９．上記アニーリングが約２−１０分の時間起こる、請求の範囲第８項記載の方 法。
  10. １０．上記オリゴヌクレオチドプライマーが１５−１７塩基の長さである、請求 の範囲第５項記載の方法。
  11. １１．上記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼであり、ならびに上記ヌクレ オシド三リン酸がデオキシリポヌクレオシド三リン酸である、請求の範囲第５項 記載の方法。
  12. １２．上記ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性である、請求の範囲第１１項記載の方法 。
  13. １３．上記工程（ｃ）が上記ＲＳ断片を電気泳動で分離し、その後に該ＲＳ断片 を視覚化することを含んで成る、請求の範囲第２項記載の方法。
  14. １４．上記工程（ｃ）が電気泳動し、視覚化したＲＳ断片を微生物のデータベー スと比較することをさらに含んで成る、請求の範囲第１３項記載の方法。
  15. １５．上記データベースがリステリアモノサイトゲネス【（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　 ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアイノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｉ ｎｎｏｃｕａ）、リステリアイヴァノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｉｖａｎｏｖｉｉ ）、リステリアウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）、サル モネラチフィムリム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ））、サル モネラエンテリチディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｅｉｄｉｓ）、 サルモネラニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｎｅｗｐｏｒｔ）、サルモラ インファンティス（Ｓａｌｍｏｎｎｅｌｌａ　ｉｎｆａｎｔｉｓ）、スタフィロ コッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ）ｅｕｓ）、スタ フィロコッカススクイリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｃｕｉｒｉ）、ス タフィロコッカスサプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｕｓ　ｓａｐｒｏ ｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカスワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｕｓ　ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓ）エシェリヒアコリー（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｉｌ）、エシェリヒアブラッテ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　 ｂｌａｔｔａｅ）、エシェリヒアファーグソーニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆ ｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エシェリヒアハーマニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｈｅ ｒｍａｎｉｉ）、エシェリヒアブルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｖｕｌｎ ｅｒｉｓ、シトロバクターフロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎ ｄｉｉ）、シトロバクターダィバーサス（Ｃｉｔｒｉｂａｃｔｅｒ　ｄｉｖｅｒ ｓｕｓ）、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒ ｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクターアグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ 　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクタークロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａ ｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａ ｂｉｌｉｓ）、プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、 およびエルシニアエンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌ ｉｔｉｃａ）に特徴的な断片の分布を含む、請求の範囲第１４項記載の方法。
  16. １６．上記工程（ｃ）において、視覚化が上記ＲＳ断片をエチジウムブロマイド で染色するか、または該ＲＳ断片の位置を分光光度的手法により検出することに より行こなわれる、請求の範囲第１３項記載の方法。
  17. １７．上記工程（ｃ）において、視覚化が蛍光−標識デオキシヌクレオチドを増 幅（ｂ）の間に取り込むことにより行こなわれる、請求の範囲第１３項記載の方 法。
  18. １８．細菌の種を決定するのに有用な請求の範囲第１項記載の方法。
  19. １９．（ａ）微生物からゲノムＤＮＡを単離し、該ゲノムＤＮＡは高度に保存さ れた配列の間に介在する可変配列、さらにそれらのゲノムに沿った任意領域を含 み、 （ｂ）該可変領域を増幅し、これによって大きさおよび数が特定の分布を有する 断片を生産し、そして （ｃ）（ｂ）と同時に該任意領域を増幅しこれによって大きさおよび数が特別な 分布を有するＡＧ断片を生産し、そして（ｄ）該断片および該ＡＧ断片を大きさ で分離し、ならびに該断片および該ＡＧ断片の分布を分析し、これによって微生 物の種、血清型および株を決定することを含んで成る、徴生物の種、血清型およ び株の同定方法。
  20. ２０．上記高度に保存された配列が高度に保存されたｒＤＮＡ配列であり、なら びに上記断片がＲＳ断片である、請求の範囲第１９項記載の方法。
  21. ２１．上記可変配列がスペーサー領域である、請求の範囲第２０項記載の方法。
  22. ２２．上記工程（ａ）の単離が細胞溶解および除タンパクを含む、請求の範囲第 １９項記載の方法。
  23. ２３．上記工程（ｂ）および（ｃ）が少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプラ イマーを上記高度に保存されたｒＤＮＡ配列および複数の上記任意領域とアニー リングさせ、ならびに核酸ポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸を該可変配 列および任意領域を増幅するために適する該プライマーに導入することを含んで 成る、請求の範囲第２０項記載の方法。
  24. ２４．上記増幅が少なくとも２回行われる、請求の範囲第２３項記載の方法。
  25. ２５．上記アニーリングが最高約４３−４６℃の温度で、約１−１０分の時間起 こる、請求の範囲第２３項記載の方法。
  26. ２６．上記アニーリングが約５−１０分の時間起こる、請求の範囲第２５項記載 の方法。
  27. ２７．上記オリゴヌクレオチドプライマーが１０−１２塩基の長さである、請求 の範囲第２３項記載の方法。
  28. ２８．上記核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼであり、ならびに上記ヌクレ オシド三リン酸がデオキシリポヌクレオシド三リン酸である、請求の範囲第２３ 項記載の方法。
  29. ２９．上記ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性である、請求の範囲第２８項記載の方法 。
  30. ３０．上記工程（ｄ）が上記ＲＳ断片および上記ＡＧ断片を電気泳動で分離し、 その後に該ＲＳ断片および該ＡＧ断片を視覚化することを含んで成る、請求の範 囲第２０項記載の方法。
  31. ３１．上記工程（ｄ）がさらに電気泳動し、視覚化したＲＳ断片およびＡＧ断片 を微生物のデータベースと比較することを含んで成る、請求の範囲第３０項記載 の方法。
  32. ３２．上記データベースがリステリアモノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍ ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリアイノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｉｎ ｎｏｃｕａ）、リステリアイヴァノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｉｖａｎｏｖｉｉ） 、リステリアウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）、サルモ ネラチフィムリム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）、サルモラ エンテリチディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、サルモ ネラニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｎｅｗｐｏｒｔ）、サルモネライン ファティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｉｎｆａｎｔｉｓ）、スタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ）ｅｕｓ）、スタフィロコ ッカススクイリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｃｕｉｒｉ）、スタフィロ コッカスサプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐｒｏｐｈｙ ｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカスワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　 ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ ｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓ）、エシェリヒアコリー（Ｅｓｃｈｅｒｉ ｃｈｉａ　ｃｏｉｌ）、エシェリヒアブラッテ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｂｌ ａｔｔａｅ）、エシェリヒアファーグソーニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒ ｇｕｓｏｎｉｉ）、エシェリヒアハーマニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｈｅｒｍ ａｎｉｉ）、エシェリヒアブルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｖｕｌｎｅｒ ｉｓ）、シトロバクターフロインディ（Ｃｉｔｒｉｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄ ｉｉ）、シトロバクターダィバーサス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｄｉｖｅｒｓ ｕｓ）、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇ ｅｎｅｓ）、エンテロバクターアグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａ ｇｇｌｏｍｅｒａｕｓ）、エンテロバクタークロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ ｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉ ｌｉｓ）、プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、およ びエルシニァエンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔ ｉｃａ）の種、血清型および株に特徴的な断片の分布を含む、請求の範囲第３１ 項記載の方法。
  33. ３３．上記工程（ｄ）において、視覚化が上記ＲＳ断片および上記ＡＧ断片をエ チジウムブロマイドで染色するか、または該ＲＳ断片および該ＡＧ断片の位置を 分光光度的手法により検出することにより行こなわれる、請求の範囲第３０項記 載の方法。
  34. ３４．上記工程（ｄ）において、視覚化が蛍光−標識デオキシヌクレオチドを増 幅（ｂ）および（ｃ）の間に取り込むことにより行こなわれる、請求の範囲第３ ０項記載の方法。
  35. ３５．細菌の種、血清型および株を決定するのに有用な請求の範囲第１項記載の 方法。
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