JPH07501712A - 微量ｒｎａまはたｒｎａおよびｄｎａ検出用の一段ｒｎａおよび結合一段ｒｎａおよびｄｎａポリメラーゼ・チェイン・リアクション - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微量ＲＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡ検出用の一段ＲＮＡおよび結合一段ＲＮＡ およびＤＮＡポリメラーゼ・チェイン・リアクンヨン背景 ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）はＤＮＡの増幅のためによく 使用される技術である。この技術は、細菌またはＤＮＡウィルスに起因する疾病 に伴うような、特定のＤＮＡ配列の検出用の種々の検定に使用されている。さ　 ′らに、ＲＮＡからＤＮＡの逆転写と組み合わせて、ＰＣＲはＲＮＡの検出にも 使用できる。ＰＣＲの感度から、特に、微量ＲＮＡまたはＤＮＡの検出に適して いる。

ノンＡ１ノンＢ肝炎の主要因子として認識されている肝炎Ｃウィルス（ＨＣＶ） （Ｃｈｏｏ、　Ｑ、　−Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　；　Ａｌｔｅｒ、　！（、Ｊ、　 ｅｔ　ａｌ、）はヒト・フラビウイルスおよび動物ペスチウイルスに関連するプ ラス鎖ＲＮＡウィルスである（Ｃｈｏｏ、　Ｑ、　−Ｌ。

ｅｔ　ａｌ、　：　Ｈａｕｇｈｔａｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　）　。ＨＣＶ　 ＲＮＡゲノムは約１０，０００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり、個々の構造 および非構造蛋白質の３．１００アミノ酸前駆体をコードできる単一のオーブン ・リーディング・フレームを含む。

約３２４〜３４１ｎｔの５′非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、異なるＨＣＶ株の間 で高度に保存され、診断的ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲおよびＨＣＶ　ＲＮＡハイブ リダイゼーションの両方に有利である（）ｌｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、　；Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ。

（１９９１）　：Ｂｕｋｈ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、；Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９９２）　）。

循環抗ＨＣＶ抗体の検出まｆ：はＨｃＶ　ＲＮＡ（７）ＰＣＲ増！１ＭｆｆＨｃ Ｖ　ＲＮＡＰＣＲＪ）は現在、ＨＣＶ感染の診断に使用されている２つの主な技 術である。

逆転写ＰＣＲによるＨＣＶ　ＲＮＡの検出は抗ＨＣＶテストよりも、より直接的 であり、感度が良いので、急性および慢性ＨＣＶ感染両方の診断スタンダードと なってきた（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　；Ｂｕｋｈ 、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　；）Ｉｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍ。

ｅｔａｌ、）。ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲは感度が良く、特異的な技術であるが、 その労働密度、反応時間、汚染可能性および、技術および教科書の差異による試 験室間の本質的に異なる結果により、十分な臨床的適用が妨げられてきた。逆転 写（ＲＴ）のための別々の工程、それに続＜ＰＣＲ試薬の添加が労働密度および 汚染可能性の両方に関与している。したがって、ＲＴおよびＰＣＲ増幅の両方を 一段（１工程）で行える技術を持つことが有利である。

一段ＰＣＲ検定は、細菌リポソームＲＮＡのような豊富なＲＮＡについては成功 裏に実施されている。（ｆａｎｇ、　Ｒ，−Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、）　ｏしがし 、微量ＲＮＡにツいての一段ＲＮＡ　ＰＣＲ検定に対して、先行技術は、重大な 障害を記載している。

５ｅｌｌｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、はＲＴアーゼがＴａｑポリメラーゼを激しく阻害 することを報告している。ＨＣＶはしばしば、非常に低いコピー数で存在するた め、ＰＣＲ前に、いずれかのＨＣＶ　ＲＮＡがＤＮＡ形にコピーされることを保 証するために大量のＲＴアーゼが必要である。がくして、先行技術は、ＨＣＶＲ ＮＡのような微量ＲＮＡの検出用に、一段検定が非常に正確ではないと教示して いる。

肝炎Ｂウィルス（ｒＨＢＶＪ　）感染は、急性および慢性肝炎を起こす世界的な ヒトの健康問題であり、肝細胞癌の進行に伴う。ＨＢＶ感染の臨床的診断は循環 ＨＢＶ抗原、ＨＢＶウィルス・ペプチドに対する抗体の検出に基づいてきた。最 近、分子ハイブリダイゼーションにょるＨＢＶ　ＤＮＡの検出および定量が熱心 に検討されている。（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ　Ｊ、　Ｈｌｅｔａｌ、）、ＨＢＶ　 ＤＮＡ　ＰＣＲは、たとえ痕跡量のＨＢＶ　ＤＮＡでも、その検出に最も感度の 良好な技術であることが示されている。（Ｍｏｎｊａｒｄｉｏｎ　Ｊ、　ｅｔ　 ａｌ、およびＫａｎｅｋｏ　Ｓ、ｅｔ　ａｌ、　）、しかし、ＨＣＶ　ＲＮＡ　 ＰＣＲと同様、労働密度、汚染の危険性および分析に要する時間がその臨床的適 用を妨げている。

Ｍｏｏｎ、　１．　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、はＨＢＶおよびＨＣＶ感染の同時検出法 を開示している。

しかし、このＭｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ、の開示した方法は試料からのＤＮＡおよび ＲＮＡの抽出方法において相違する。また、Ｍｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ、は、抽出し たＤＮＡおよびＲＮＡを逆転写に付し、ついで、ＰＣＲ増幅および、ＨＣＶに特 異的なネスト状（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーの第２対を添加後に、第２のＰＣＲ に付すべきであることを特に教示している。

これらの欠点を克服するため、ＨＣＶ　ＲＮＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡの同時検出 ようの結合一段ＰＣＲを持つことが有利である。

発明の概要 本発明は、血清または組織中のＨＣＶ　ＲＮＡのような微量ＲＮＡ検出用の一段 ＲＮＡ　ＰＣＲ法および、血清または組織中のＨＣＶ　ＲＮＡのような微量ＲＮ ＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡの同時検出用の結合一段ＨｃＶ　ＲＮＡ　ＰｃＲおよび ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ法（ｒ結合−４ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲＪ）を提供する ものである。これらの技術は、両方とも感度良好で、特異的であり、従来の方法 を本質的に単純化し、検出に要する時間を減じ、汚染の危険性を減じる。これら の技術は、ＨＣＶゲノムの高度に保存された５°ＵＴＲからのプライマーを用い るＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲのような微量ＲＮＡの検出の従来の方法およびＨＢＶ 　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＲＮＡの検出に従前必要とされていた別々の工程に対す る改良である。これらの技術は、ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＨＣＶ　 ＲＮＡまたはＨＢＶ　ＤＮＡのみならず、いずれの源からのＲＮＡおよびＤＮＡ の検出にも好適である。

この−投法は高度に特異的な方法である。この−投法の特異性は、陽性および陰 性対照を含む、５０血清試料における従来のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲと１００％ 一致することにより確認された。

この−投法は、分析に要する時間を実質的に減じる。この−投法は、従来の２工 程ＲＴアーゼ、プラスＰＣＲ操作よりも、少なくとも３倍速い。

ＨＣＶ感染肝から抽出された系列希釈された肝ＲＮＡの検出感度は従来のＨＣＶ 　ＲＮＡ　ＰＣＲに匹敵する。さらに、この−投法は、ＨＣＶ検出用の従来のＰ ＣＲ法よりも感度が良好である。プラス鎖およびマイナス鎖の両方のＨＣＶ　Ｒ ＮＡを含有する血清試料において、該−投法は一貫して従来のＰＣＲよりも強い ＰＣＲ生成物シグナルを生じた。これらの結果は両方の鎖が、この−投法で逆転 写されたことを示した。

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は高度に特異的な方法である。結合一段ＨＢ Ｖ−ＨＣＶ　ＰＣＲ方法の特異性は、２８血清試料における従来のＨＢＶＤＮＡ 　ＰＣＲおよＵＨＣＶ　ＤＮＡ’　ＰＣＲと１００％一致す６．：：とにより確 認された。（以降の実施例１５の表参照）。加えて、結合ＨＢＶおよびＨＣＶ感 染患者の血清において、期待した４５６ｂｐＨＢＶ　ＤＮＡおよび２４１ＨｃＶ ｃＤＮＡバンドが同定された。また、正常ヒト血清では全くバンドが同定されな かった。最後に、サザーン・プロットで、該バンドのＨＢＶまたはＨＣＶ特異性 を確認した。

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は、また、試料の分析に要する時間を実質的 ニ減シ、ＨＢＶ　ＤＮＡ検出用＋７）結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法の感度 は、広く使用されているＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーション診断 技術より高い。これは、ＨＢＶ陽性血清における結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣ Ｒ法とＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーションの間の１００％一致に より証明された。しかし、ＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーション検 定陰性の１２名の患者において、３名の患者が、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣ Ｒ法においてＨＢＶ　ＤＮＡ陽性であった。

汚染の危険性の実質的な減少は、これらの方法を複数の臨床試料のテスト用に適 したものとする。試薬をたった１回しが添加しない故、反応に不純物が混入する 機会が少ない。

本発明は、工程の多くが自動化できる故に、従来利用されていた方法よりもより 均一な結果を与える。

図面の簡単な説明 図１は、一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲでのＲＴＮアーゼ縮効果を示す。２．５Ｕ 　Ｔａｑポリメラーゼおよび５．１０．２５．５０および１００Ｕ　ＲＴ７−ゼ の反応から、各々、２４１ｂｐＨＣＶ　ｃＤＮＡ生成物（ライン１および１゜か ら５および５°）を得た。ＭＷ（分子量）：１２３ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ） 　Ｄ　Ｎ　Ａマーカー。

図２は、系列希釈され、従来法（Ａ）および一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ法（Ｂ ）の両方でテストしたＨＣＶ陽性陽性血清１ハｌ抽出したＲＮＡを示す。ＭＷ： １２３ｂｐ　ラ’ｊ−ＤＮＡ？−カー。ライン１〜５は、各々、１ｏ−１，１０ −２，１０−３，１０−４および１０−５希釈した検体についてのＨｃｖ　Ｐｃ ＲのｃＤＮＡ（２４１ｂｐ）生成物を含有するアガロース・ゲルを示す。

図３は、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法、一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ法お よび従来のＨＢｖ　ＤＮＡ　ＰＣＲの結果を示す。ライン１および２ニ一段ＨＣ ｖ　ＲＮＡ　ＰＣＲ；ライン３および４：従来（１’）ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ 。

ライン５および６：結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ；５イン７：陰性対照。Ｍ Ｗ：　１２３ｂｐラダーＤＮＡマーカー。ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ生成物＝４５ ６ｂｐおよびＨＣＶ　ｃＤＮＡ　ＰＣＲ生成物＝２４１ｂｐ、パネルＡは電気泳 動ＰＣＲ生成物の臭化エチジウム染色アガロース・ゲルである。パネルＢはＨＢ ＶＤＮＡに特異的なプローブを用いたサザーン・プロット・ハイブリダイゼーシ ョンである。パネルＣはＨＣＶ　ｃＤＮＡに特異的なプローブを用いたサザーン ・プロット・ハイブリダイゼーションである。

発明の詳細な説明 本発明は、ＲＴＮアーゼよびＰＣＲ反応を結合させた一段操作を用いて試料中の 微量ＲＮＡを迅速に、正確に、感度良く検出する方法および手段を提供するもの である。微量ＲＮＡ検定に付される試料は、標準的な緩衝剤塩溶液中でＲＮＡを ＤＮＡに変換するＲＴＮアーゼよびＰＣＲを行う熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの 両方、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）　、所望により、微量ＲＮＡ の分解を防ぐためのＲＮアーゼ阻害剤、およびＰＣＲ反応用の適当なプライマー と一緒にされる。反応は逐次進行する。一段反応の性質から、第１の反応を停止 し、ＤＮＡを除去し、緩衝条件を変え、新らたな酵素を添加する必要性が除かれ る。これら除かれた各工程は時間を必要とし、試料汚染の機会を導く。

さらに、全ての成分を一旦試料に添加したら自動化できる。従来ＰＣＲに使用さ れているようなサーマル・サイクラ−（ｔｈｅｒｌＩｌａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）の ような制御された温度ブロックを採用して、試料を、まず、３７〜４２℃のよう なＲＴＮアーゼ適当な温度でインキュベートし、ついで、９４℃、３分間のよう な、ＲＴＮアーゼ変性させるに十分な温度および時間インキュベートすることが できる。これに続き・温度ブロックをＰＣＲにとって標準的な温度で循環させる 。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号参照。

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は上記のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲの利点と共 に、ＨＣＶ　ＲＮＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡ検出の両方が同時に行え、ＨＢＶおよ びＨＣＶのより効率的なスクーニングをもたらす利点も包含する。

試料の調製 一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ法において、検定すべき試料は、まず、グアニジウ ム・イソシアネート抽出（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、　；Ｃｈｏ ｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、　）のような標準的な技術のいずれ かによって、ＲＮＡを抽出することにより調製される。結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ 　ＰＣＲ法についての必要条件はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、それらの血清試 料中における相対量を反映する量で効率よく抽出することである。この抽出技術 はその源に関係なく、いずれのＲＮＡまたはＤＮＡ種に対しても実施できる。グ アニジウム・イソシアネートまたはブロティナーゼに法のような、ＤＮアーゼお よびＲＮアーゼを包含する蛋白質を分解または失活させる方法は、結合一段ＨＢ Ｖ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法での使用に適している。

血清試料中のＲＮＡおよびＤＮＡの両方の同時抽出のため、反復フェノール抽出 法が開発された。血清１５０μｌをプロティナーゼＫ　（１０ｍｇ／ｍ１）１０ 〜１５μｍで５０℃にて２時間消化する。フェノール／クロロホルム抽出を、ま ず、酸性雰囲気下（ｐＨ４，０）で行い、ＲＮＡを単離し、フェノール相のｐＨ をｐＨ８，０に調整後、繰り返してＤＮＡを単離する。この酸性度および塩基性 度は３．０〜５．０および７．１〜９．０の範囲で変動できる。別法として、フ ェノール／クロロホルム抽出を、塩基性ｐＨで行ってＤＮＡを抽出し、ついで、 ｐＨを酸性雰囲気に調整し、ＲＮＡを抽出することにより行うこともできる。

ｐＨの調整は、当業者に公知のごとく、例えば、トリス−ＥＤＴＡのような、Ｄ ＮＡおよびＲＮＡ抽出に適当な、適正なｐＨの緩衝液の添加により行われる。

両方の抽出物をプールし、酵母ｔＲＮＡ１０μｇを加え、該核酸をイソプロパツ ールで共沈させる。抽出した核酸のベレットを水で処理したジエチルポリカーボ ネート（ＤＥＰＣ）１０μｍに再懸濁させ、使用前、−７０℃で保存する。

Ａ、一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ 微量ＲＮＡの一段ＰＣＲ検出のための反応条件は従来のＰＣＲ反応で使用された 反応条件と同じである。個々のＲＮＡ検出について、最適な塩および酵素条件は 容易に決定できる。ＲＮＮアシン商標：　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏ、　、　Ｍａｄ ｉｓｏｎ、！■より入手）のようなりボヌクレアーゼ阻害剤はＲＴＮアーゼ応の 収率を増加させる。この反応のためのＲＮアーゼ阻害剤条件は従来のＲＴＮアー ゼよびＰＣＲ反応における条件と同じである。ＨＣＶ　ＲＮＡについて、最も好 適と判断された反応条件は実施例３に見られる。

Ｂ　結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法血清ＤＮＡおよびＲＮＡの抽出物（上記 試料の調製Ｂ参照）をウィルス鋳型として使用する。反応条件は、反応にＨＢＶ 　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＤＮＡ用の２対のオリゴヌクレオチド・プライマーを添 加する以外は一段ＨＣＶ　ＲＮＡＰＣＲの条件と同じである。

酵素 反応に使用する酵素は、相対的に純粋であるべきである。種々のＲＴＮアーゼい ずれか１つが使用できる。モロニーネズミ白血病つィルスＲＴアーゼ（ＭＭＬＶ ）、Ｍ−ＭＬＶ　ＲＮアーゼ　Ｈ−ＲＴＮアーゼＭ−ＭＬＶ　Ｈ−）およびニワ トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）ＲＴＮアーゼ成功裏にテストされた。ＲＴＮ アーゼＰＣＲのための）反応は多（の商業的販路（例えば、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ 　ＬｉｆｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 　ＭＤ　；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐｏｒ≠狽奄盾 氏B Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　：　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ ｓ、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）から購入できる。

Ｔａｑ　Ｉのような、従来のＰＣＲ反応で使用されていたと同様な、熱安定性Ｄ ＮＡポリメラーゼが該一段反応において増幅に使用される。かかる熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｅｍｅｒｙｖｉ ｌｌｅ、　ＣＡおよびＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、、　 Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、　ＣＡ）を包含する多くの源から入手できる。

ｄＮＴＰ ｄＮＴＰはＲＴＮアーゼよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの両方に使用される。

ｄＮＴＰの濃度は従来ＲＴアーセ反応とＰＣＲ反応とては異なるが、反応の逆転 写およびＰＣＲ部分両方で同じ濃度のｄＮＴＰを使用できることが判明した。

ｄＮＴＰは個々の源からのものを混合でき、または、４つのｄＮＴＰの予備混合 した溶液を使用できる（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）。

オリゴヌクレオチド・プライマー 従来のＰＣＲ用の標準的プライマーを該−投法で使用できる。それらはインキュ ベーション前の初めのミックスに添加される。ＨＣＶについては、先に報告され た１対のＨＣＶオリゴヌクレオチド・ブライ７−　（ｎｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９９１）、　Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９ ２）　）を使用した。それらは、ＨＣＶ　５°　ＵＴＲから誘導された：　５’ −ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＴＣＣＣ−３’、７−２６ｎｔ、センス、 ５°−ＡＡＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−３°、２２９−２４８ｎ　 ｔ、アンチセンス。

ＨＢＶについては、ＨＢＶブレーＳ／Ｓオーブン・リーディング・フレームから 誘導された１対のオリゴヌクレオチド・プライマーを使用した。５’　−ＧＴＣ ＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴ−３°、１１９−１３９ｎｔ、センス；５ ’−ＡＡＣＣＡＣＴＧＴＡＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣ−３’、５５５−５７５ｎｔ。

アンチセンス。

以下は微量ＲＮＡの一段検定の実施例である。しばしば患者試料中で低濃度で出 現するＨＣＶ　ＲＮＡをテストＲＮＡとして使用した。しかし、当業者は、適当 なプライマーの使用のような工程により検定されるいずれのＲＮＡの検定にも該 検定を採用できるであろう。

実施例ｌ ＲＮＡ抽出 グアニンニウム・イソシアネート−酸−フエノール法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ 、　Ｐ、、　ｅｔａｌ、）を用いて、血清０１ｍｌまたは肝臓組織からＲＮＡを 抽出した。先に報告されているように（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔ　ａｌ、 　（１９９２）　）　、正常ヒト血清およびα−１−抗トリプシン欠失患者から の肝臓組織を陰性対照として使用した。ＨＣＶ感染血清から抽出したＲＮＡを陽 性対照として使用した。５０名の患者（３３名は慢性ＨＣＶ感染、１７名は他の 病因の急性または慢性肝臓疾患）を、従来法および一段ＲＮＡ　ＰＣＲ法の両方 を用いてテストした。

実施例２ 従来のＰＣＲ 先の報告にしたがって（Ｉ（ｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔ　ａｔ、　（１９９１ ）　、Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔａｔ、（１９９２））　、従来のＨＣＶ　 ＲＮＡ　ＰＣＲを行った。要約すると、血清０．１ｍｌから抽出したＲＮＡを、 １０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、５０ｍＭ　ＫＣＩ、５ｍＭ　Ｍｇ ｃ１２．５００μＭ　ｄＮＴＰ、２０Ｕ　ＲＮアシン、１μＭ　アンチセンス・ プライマーおよび２５Ｕ　ＲＴＮアーゼ含有する２０μ】容量で逆転写した。Ｐ ＣＲは、ｌＱｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　、５０ｍＭ　ＫＣＩ、２ ｍＭＭｇＣＩ２．２００μＭ　ｄＮＴＰ。

領　５μＭの各プライマーおよび２．５Ｕ　Ｔａｑポリメラーゼを含有する５０ μｌ容量中で行った。従来法では、ＲＴを４２℃にて１時間行い、ＰＣＲは、− 末鎖ｃＤＮＡを変性し、９４℃にて５分間ＲＴアーゼを不活化し、ＰＣＲ増幅を ３０サイクル行った（９４℃、１分；５５℃、１分ニア２℃、２分）。

実施例３ 一段検定 一４ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＩは、１工程てＲＴおよびＰＣＲの両方を逐次行う。

反応は、ｌＱｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　、５０ｍＭ　ＫＣＩ、２ ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０５μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２０Ｕ 　ＲＮＮアシン２５Ｕ　ＲＴアーセおよび２．５Ｕ　Ｔａｑポリメラーゼを含有 する５０μｍ容量中で行った。ＲＴＮアーゼよるＴａｑポリメラーゼの阻害を評 価し、結果を最適化するため、両酵素の異なる濃度を用いて一段ＨＣＶ　ＲＮ、 へ　ＰＣＲを行った。従来のＲＴ　ＰＣＲは、ＲＴおよびＰＣＲに異なった濃度 のＭｇＣ＋２を使用するので、−投法で種々のＭｇＣＩＪ１度についてテストし た。

−投法では、インキュベーションをつぎのように、プログラムしたＯＲＴ反応（ ４２℃、１時間）；ＲＴＮアーゼ活化およぎＤＮＡ変性（９４℃、３分）：ＰＣ Ｒ増幅３０サイクル（９４℃、１分；５５℃、１分、７２℃、２分）〇−一段Ｃ Ｈに要する最少時間を決めるため、異なったインキュベーション期間でＲＴおよ びＰＣＲの両方をテストした。

実施例４ ＨＣＶ　ＲＮＡＰＣＲ結果の評価 各ＰＣＲ生成物１０μｍを１５％アガロース・ゲルで電気泳動し、臭化エチジウ ムで染色し、ＵＶ先光下写真を撮った。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの１２３ｂｐラ ダーＤＮＡマーカーで分子量を測定した。ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ生成物の特異 性をサザーン・プロット・ハイブリダイゼーション（Ｈｕ、　Ｋ、−リ、ｅｔａ １．（１９９１）、ｎｕ、　Ｋ、　−Ｑ、、　ｅｔ　ａｌ、　（１９９２）　） で証明した。

実施例５ 酵素タイプおよび源の変動 一段ＲＮＡ　ＰＣＲで３種のＲＴＮアーゼ比較したところ、Ｍ−ＭＬＶ　ＲＴＮ アーゼＧＩＢＣＯ／ＢＩ？Ｌ）およびＡＭＶ　ＲＴＮアーゼＢｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ）は匹敵する結果を生じた。Ｍ−ＭＬＶＨ−ＲＴＮアーゼＧＩＢＣＯ７ＢＲＬ ）はより弱いＰＣＲ生成物を生じた。匹敵する結果は、２つのＴａｑポリメラー ゼのいずれか（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　ＣｅｔｕｓまたはＢｅｃｋｍａｎ）の いずれかを使用して得られた。便宜上、以下の研究にはＭ−ＭＬＶ　ＲＴＮアー ゼＧ■ＢＣＯ／ＢＲＬ）　２５　ＵおよびＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　 Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　２．　５Ｕを使用した。

実施例６ ＭｇＣ１２濃度の変動 従来のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲではＲＴおよびＰＣＲ工程に異なる濃度のＭｇＣ ｌ２を使用しているので、１．１５．２．５および８ｍＭの濃度のＭｇＣ１□を 用いて一段ＲＮＡ　ＰＣＲを行った。一段ＨＣＶ　ＲＮＡＰＣＲでは、反応生成 物は、１．５．２．５および８ｍＭのＭｇＣ＋２で匹敵した。

ロスリバーウィルス（Ｓｅ４１ｎｅｒ、　Ｌ、　Ｎ、、　ｅｔ　ａｌ、）および 細菌リポソーム（ｆａｎｇ。

Ｒ，−Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、）の増幅にライての一段ＲＮＡ　ＰＣＲ法の以前の研 究で、ＭｇＣｌ２の最適濃度が議論された。比較的狭い範囲のＭｇＣ＋□濃度し か利用できないとするｆａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、の報告とは反対に、一段ＨＣＶ 　ＲＮＡ　ＰＣＲは１〜８ｍＭのＭｇＣｌ２ａ度範囲で反応生成物を生成した。

しかし、５または８ｍＭ濃度では、時々、アガロース・ゲル上で非特異性のシグ ナルを伴い、１ｍＭのＭｇＣｌ、を使用すると、ＰＣＲは一様に強度が小さくな った。したがって、２ｍＭのＭｇＣｌ２が好ましい濃度であった。

実施例７ ＲＴアーゼはＴａｑポリメラーゼ活性を阻害しうるので（Ｓｅｌｌｎｅｒ、　Ｌ 、　Ｎ、　、　；ＧｅｎｅＡｍｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲキット指図書、　Ｐｅｒｋｉ ｎ　ＥＬｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　（１９９０）　）　、この有害な相互作用を一段 ＲＮＡ　ＰＣＲで鋭意研究した。ＲＴアーゼまたはＴａｑポリメラーゼのいずれ かの濃度を変えてこれら２つの酵素の比を変えた。図１に示すごとく、２．５Ｕ のＴａｑポリメラーゼと、広範なＲＴポリメラーゼ濃度範囲（５Ｕ〜１００Ｕ） を用いる反応により、検出しうるＰＣＲ生成物が生成した。結果は２５ＵのＲＴ アーゼを用いるのが最適であった。２５ＵのＲＴアーゼ、２．５〜ＩＯＵのＴａ ｑポリメラーゼ濃度を用いてＰＣＲ生成物を製造した。最適結果は２．５ＵのＴ ａｑポリメラーゼを使用して達成された。すなわち、ＲＴアーゼのＴａｑポリメ ラーゼに対する比率は１０：１もの高さで利用でき、ＲＴアーゼによるＴａｑポ リメラーゼ阻害の有害な影響は認められなかった。

実施例８ ＲＴアーゼ反応条件 一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲにおけるＲＴをさらに研究するため、温度およびイ ンキュベーション期間を変化させた。４２℃、１時間のインキュベーションが最 適なように思えたが、１５分もの短い期間でも、より長時間のインキュベーショ ンで認められる生成物に匹敵するＰＣＲ生成物が得られた。従来のＰＣＲにおい ては、Ｔａｑポリメラーゼの不存在下、ＲＴ反応混合物を９５８Ｃにて５分間イ ンキュベートしてＲＴアーセを変性している。しかし、一段ＲＮＡ　ＰＣＲでは 、ＲＴアーゼの変性はＴａｑポリメラーゼの存在下で起こり、これはＴａｑポリ メラーゼの活性およびＰＣＲ増幅の特異性を減少させつる。一段ＲＮＡ　ＰＣＲ における２〜４分の変性は従来のＰＣＲの変性に匹敵する結果を生じた。

反応時間 正確なＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲに要する最少時間を決定するため、変性、アニー リングおよび延長時間を変化させた。Ｒ７反応を１５分に固定した場合、ＰｃＲ プロクラムヲ、９４℃、３０秒；５５℃、３０秒：および７２℃、４５秒、３０ サイクルに短縮できた。したがって、一段ＲＮＡ　ＰＣＲは、操作の単純化およ びプログラムされたインキュベーション時間の短縮の両方でＨＣＶ検出に必要な 時間を最少にできる。

実施例１０ 一致性および特異性 ＨＣＶ　ＲＮＡ検出１．ニー４ＲＮＡ　ＰＣＲを使用しｆニー場合、ＨＣＶ感染 患者の血清から抽出したＲＮＡ中で、期待した２４１ｂｐＨＣＶ　ｃＤＮＡを同 定した（陽性対照）。ＨＣＶ特異性はクローンしたＨＣＶ　ｃＤＮＡをプローブ として用いるサザーン・プロット検定により確認した。これに対し、正常ヒト血 清またはα−１−抗トリプシン欠失患者の肝臓から抽出したＲＮＡを用いた一段 ＲＮＡＰＣＲは陰性てあった。−散性および特異性をさらに評価するため、５ｏ 血清試料（あらかじめ陽性を確認したもの３７およびＨＣＶ　ＲＮＡ陰性１７） から抽出したＲＮＡを用い、従来のＰＣＲおよび一段ＲＮＡ　ＰＣＲを平行して 行った。一段ＲＮＡ　ＰＣＲと従来のＰＣＲの間で１００％の一致が認められ、 ｃＤＮＡの特異性はサザーン・プロッティングで確認した。

実施例１１ 感度 ＰＣＲは非常に感度のよい技術であるので、検定の特異性は一定関係である（Ｋ ｗｏｋ、　Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）　。一段ＲＮＡ　ＰＣＲの相対感度を評価す るため、ＨＣＶ感染肝臓から抽出したＲＮＡを系列希釈し、従来法および一段Ｒ ＮＡ　ＰＣＲ法の両方てテストした。図２に示すように、従来のＰＣＲおよび一 段ＲＮＡＰＣＲ両方とも、ＨＣＶ　ＲＮＡの匹敵する希釈を検出した。ＨＣＶ複 製中間体（マイナス鎖）を含有する血清検体から抽出したＲＮＡを用いると、一 段ＲＮＡＰＣＲは、アガロース・ケル上て従来のＰＣＲよりも強いジエチルを一 様に生じた。このことは、最初のＲＴが一段法で両方の方向に起こり、ＰＣＲ増 幅に利用できるｃＤＮＡの量が増加したことを示唆している。マイナス鎖ＨＣＶ 　ＲＮＡは慢性感染患者の約５０％の血清に存在するので、一段ＲＮＡ　ＰＣＲ はこのサブグループの検出に従来のＰＣＲよもより高感度でありうる。

ＮＳ３およびＮＳ４からのＨＣＶプライ７−　（）ｌｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ 　ａｌ、（１９９１））を使用した場合、反応生成物の強度は、一段および従来 のＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲいずれでも、ＨＣＶ　５’ＵＴＲプライマーを用いて 得られた強度よりも劣る。

この結果は、ＮＳ３／ＮＳ４および５“ＵＴＲプライマーを従来のＨＣＶ　ＲＮ Ａ　ＰＣＲて比較した報文（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、（１９９１） ；Ｂｕｈｋ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、）と一致する。種々のＨＣ〜′単離物にお いて、ゲノムのその領域が非常に保存されており（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍ、　 ｅｔ　ａｌ、）　、ＰＣＲ感度が最大であるのて（Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ ａｌ、　（１９９１）　；Ｂｕｈｋ、　Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、）　、ＨＣＶ　５° ＵＴＲからのプライマーが好ましい。

以下、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法についての実施例を示す。

実施例１２ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法 結合−ｆｉＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法は、一つ（Ｄ反応容Ｂで、ＨＣＶ　ＲＮＡ （７）ＲＴおよびＰＣＲと、ＨＢＶ　ＤＮＡのＰＣＲを逐次行う。核酸の抽出は 以下のとおり行う。血清１５０μｍを５０℃で２時間、プロティナーセＫ（１０ ｍｇ／ｍ＋）１０〜１５μｍで消化する。フェノール／クロロホルム抽出を、ま ず、酸性雰囲気下（ｐＨ４，０）で行い、ＲＮＡを単離し、フェノール相のｐＨ をｐＨ８，０に調整した後、抽出を繰り返し、ＤＮＡを単離する。酸性度および 塩基性度は３．０〜５０および７１〜９０の範囲で変動させることができる。別 法として、フェノール／クロロホルム抽出を塩基性ｐＨで行ってＤＮＡを抽出し 、ついて、ｐＨを酸性雰囲気に調整してＲＮＡを抽出できる。ｐＨの調整は、例 えば、トリス−ＥＤＴＡ等のような当業者に公知の、ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出に 適した適正ｐＨの緩衝液の添加により行うことができる。両方の抽出液をプール し、酵母ｔ　ＲＮＡ　１０Ｕｇを添加し、核酸をイソプロパツールで共沈させる 。抽出された核酸のペレットを、水で処理したジエチルポリカーボネート（ＤＥ ＰＣ）１０μｍに再懸濁させ、使用前、−７０℃に保存する。

ついで、核酸抽出液を変性し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を１０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ ｐＨ８，３）＋５０ｍＭ　ＫＣＩ　；２ｍＭ　ＭｇＣｌ２ａ、５μＭのＨＢＶま たはＨＣＶ特異性オリゴヌクレオチド・プライマー；２００ＵＭの各ｄＮＴＰ； ６．２５Ｕ　ＲＴアーゼ：２０Ｕ　ＲＮアシンおよび１．２５Ｕ　Ｔａｑポリメ ラーゼを含有する２５μｍ容量中で行う。

結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲについて、インキュベーションをつぎのとおち プログラムした。Ｒ７反応（４２℃、１時間）、ＲＴアーゼ不活化およびＤＮＡ 変性（９４℃、３分）；３０サイクルのＰＣＲ増幅（９４℃、１分：５５℃、１ 分ニア２℃、２分）。

実施例１３ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ結果の評価各ＰＣＲ生成物１０μｍを１．５％ アガロース・ゲルで電気泳動させ、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ先光下写真を 撮った。分子量は（ＪＢＣＯ／ＢＲＬからの１２３ｂｐラダーＤＮＡマーカーに より測定した。ＨＢＶ　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲ生成物の特異性を 、サザーン・プロット・ハイブリダイゼーション（Ｈｕ、　Ｋ、　−〇、　ｅｔ 　ａｌ、　（１９９３印刷中）；Ｈｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ、（１９９ ２））で証明した。ＨＣＶ５°ＵＴＲ７ラグメント含有ｐＧＨｃＶＩＡ　（ｌＴ ｕ、　Ｋ、　−Ｑ、　ｅｔ　ａｌ。

（１９９２））およびＨＢＶゲノムを含有するｐＮＥＲ（ｎｕ、　Ｌ　−Ｑ、　 ｅｔ　ａｌ。

（１９９０））の、２つのプラスミドをサザーン・プロット・ハイブリダイゼー ションのプローブ源として使用した。

実施例１４ ＨＣＶシグナルに対するＨＢＶシグナルの最適化ＨＢＶ　ＤＮＡのＨＣＶ　ｃＤ ＮＡに対する比を適当に調整しないと、ＨＢＶノグナルの強度がＨＣＶ　ｃＤＮ Ａのシグナル強度より非常に強くなり、４５６ｂｐ領域（ＨＢＶ　ＤＮＡバンド ）が不鮮明になり得、ＰＣＲ生成物の正確な分子サイズの測定が可能用なくなり 得る。２つの主要因がＨＢＶ　ＤＮＡおよび）ＩＣＶ　ｃＤＮＡシグナルの強度 の相違に関与している。第１に、ＨＢＶの力価が血清中のＨＣＶウィルスより大 きいことがＨＣＶ　ＲＮＡに比してＨＢＶＤＮＡ（７）鋳型ノ数ヲ増加すセル。

第２に、ＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲは、ＨＣＶで必要とされるようなＲＮＡの逆転 写を含まないので、より効率的である。

ＨＢＶ　ＤＮＡ：ＨＣＶ　ｃＤＮＡ比の最適化は以下のとおり行った。まず、Ｒ ＮＡをＨＢＶおよびＨＣＶ感染の患者の血清から０．１５ｍ１抽出した。ついで 、ｐＨの中和によりＤＮＡをフェノール相から抽出した。ＤＮＡを別の試験管に 集めた。ＲＮＡ抽出液を種々の量の抽出したＤＮＡと合した。ＲＮＡおよびＤＮ Ａを、１０μｇ　ｔＲＮＡと共に同じ試験管内で共沈させた。結合ＨＢＶ−ＨＣ Ｖ　ＰＣＲを上記のごとく行った。ＰＣＲ反応におけるＤＮＡ鋳型の量の減少は 、ＨＣＶ　ｃＤＮＡシグナルの強度に影響することなく、ＨＢＶ　ＤＮＡのシャ ープなバンドを生じた。ＨＢＶ　ＤＮＡおよびＨＣＶ　ＲＮＡ鋳型の種々の比の 比較は、ＤＮＡ　：ＲＮＡ抽出の比が１＋７．５〜１：１５（すなわち、プール した全ＨＣＶ　ＲＮＡ抽出液と、血清０．１５ｍ１からの抽出液の１／７５〜１ ／１５）で最適な結果が得られた。ＤＮＡ抽出液の希釈はＨＢＶ　ＤＮＡ検出の 感度を減じなかった。

実施例１５ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲの一致性および特異性結合ＨＢＶ−ＨＣＶ　Ｐ ＣＲ法は非常に特異的な操作である。期待される４５６ｂｐ　ＨＢＶ　ＤＮＡお よび２４１ＨｃＶ　ＣＤＮＡ／＜：／）’をＨＢＶおよびＨＣＶ感染の患者の血 清中で同定した。また、正常ヒト血清中ではなんのバンドも同定されなかった。

最後に、サザーン・プロットでＨＢＶまたはＨＣＶについてのバンドの特異性を 確認した。感度および特異性を評価するため、従来のＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲ， 一段ＨＣＶ　ＲＮＡ　ＰＣＲおよび結合ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲを２８血清試料 で平行して行った。結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法の特異性は、２８血消試 料における従来のＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲおよびＨＣＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲとの１ ００％一致により確認された。

従来法および一段）（ＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲの一散性慢性肝臓＊　結合ＨＢＶ／ ＨＣＶ　ＰＣＲ疾患群 ＨＢＶ　（＋）および　６　６　６ ＨＣＶ　（＋） ＨＢＶ　（＋）および　６　６　０ ＨＣＶ　（−） ＨＢＶ　（−）および　９　０　９ ）（ＣＶ　（＋） ＊：ＨＢＶ　ＤＮＡはＨＢＶ　ＤＮＡ　ＰＣＲで検出；ＨＣＶ　ＲＮＡは一段Ｒ ＮＡ　ＰＣＲ”ｒ検出。

実施例１６ ＨＢＶスロット・ハイブリダイゼーションと結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶＰＣＲの一 致性 ＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリダイゼーションはＨＢＶ感染の診断に広く使 用されている。したがって、３４血清試料を用いて、ＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ ハイブリダイゼーションと、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法の一致性を試験 した。結合一段ＨＢＶ＝ＨＣＶ　ＰＣＲ法とＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ハイブリ ダイゼーシヨンの間に１００％の一致性が認められた。

実施例１７ 結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲの感度ＨＢＶ　ＤＮＡ検出用の結合一段ＨＢＶ −ＨＣＶ　ＰＣＲ法の感度１ま広く使用されているＨＢＶ　ＤＮＡスロット・／ ＼イブリダイゼーション君会断技術よりも大きい。これは、ＨＢＶ陽性血清にお ける結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法とＨＢＶ　ＤＮＡスロット・ノＸイブリ ダイゼーンヨンとの間の１００％一致により示された。しかし、ＨＢＶ　ＤＮＡ スロツト・ノＸイブリダイゼーション検定陰性の１２名の患者中、３名の患者が 、結合一段ＨＢＶ−ＨＣＶ　ＰＣＲ法で陽性であった。

ｌ　１’　２２’　３３’　４４’　５５’ＭＶＩ／ＦＩＧ　／。

ＭＷ　１　２３４　５ Ｆ／Ｇ、２ｂ、Ｂ ＭＷ１２３４５ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　フー、ケーークィン アメリカ合衆国９００４８カリフォルニア州、ロサンゼルス、アパートメント・ ナンバー２２、サウス・スウイーツアー・アベニュー１１０番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．反応容器中に、活性逆転写酵素および活性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを一 緒に存在させ、１工程でＰＣＲ検定をおこなうことを特徴とする微量ＲＮＡの検 出方法。 ２．逆転写反応およびＤＮＡ増幅反応が逐次進行する請求項１記載の方法。 ３．ＤＮＡ増加反応開始前に、逆転写酵素を変性させる請求項２記載の方法。 ４．逆転写酵素：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの比が２：１〜１０：１である請 求項１記載の方法。 ５．反応容器が、さらに１〜８ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含有する請求項１記載 の方法。 ６．逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼをインキュベーション開始前に試料に 添加する試料中の微量ＲＮＡ検出用の一段ＰＣＲ法。 ７．活性逆転写酵素および活性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが同時に試料と存在 する試料中の微量ＲＮＡ検出用一段ＰＣＲ法。 ８．同じ反応液を逆転写およびＤＮＡ増加の両方に使用する微量ＲＮＡ検出用の 一段ＰＣＲ法。 ９．活性逆転写酵素および活性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが反応容器中で一緒 に存在する一段ＰＣＲ検定からなることを特徴とするＨＣＶ　ＲＮＡ検出方法。 １０．逆転写反応とＰＣＲ反応が逐次進行する請求項９記載の方法。 １１．ＤＮＡ増幅反応開始前に逆転写酵素を変性させる請求項１０記載の方法。 １２．逆転写酵素：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの比が２：１〜１０：１である 請求項１０記載の方法。 １３．反応容器がさらに１．５〜８ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含有する請求項１ ０記載の方法。 １４．逆転写反応とＰＣＲ反応を同一溶液中で行う請求項１０記載の方法。 １５．反応容器；該反応容器に２：１〜１０：１の比で添加すべき逆転写酵素お よび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを収納している別々の容器；ｄＡＴＰ、ｄＧＴ Ｐ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ；ＨＣＶ特異性のアンチセンスおよびセンス・プラ イマー；およびＰＣＲ用の標準的緩衝剤および塩からなることを特徴とする一段 ＰＣＲを使用するＨＣＶ　ＲＮＡ検出用キット。 １６．ａ）試料中の蛋白質を失活させ、ｂ）試料のｐＨを変えて酸性ｐＨとする ことにより試料中のＲＮＡ抽出を行い、ｃ）試料のｐＨを変えで塩基性ｐＨとし て試料中のＤＮＡ抽出を行う工程からなることを特徴とする水性および有機相か らなる試料中のＲＮＡおよびＤＮＡの同時抽出方法。 １７．該ＲＮＡがＲＮＡウイルスＲＮＡであり、該ＤＮＡがＤＮＡウイルスＤＮ Ａである請求項１６記載の方法。 １８．該ＲＮＡがＨＣＶ　ＲＮＡで、該ＤＮＡがＨＢＶ　ＤＮＡである請求項１ ６記載の方法。 １９．試料中の蛋白質失活を、グアニジニウム・イソチオシアネートを使用して 行う請求項１６記載の方法。 ２０．試料中の蛋白質失活を、プロティナーゼＫを使用して行う請求項１６記載 の方法。 ２１．該有機相がフェノールおよびクロロホルムからなる請求項１６記載の方法 。 ２２．ＲＮＡ抽出の間の試料のｐＨが３．０〜５．０の範囲であり、ＤＮＡ抽出 の間の試料のｐＨが７．１〜９．０である請求項１６記載の方法。 ２３．ＲＮＡ抽出の間の有機相のｐＨが４．０であり、ＤＮＡ抽出の間の有機相 のｐＨが８．０である請求項１６記載の方法。 ２４．ＲＮＡ抽出の間の試料のｐＨを、酸性ｐＨの緩衝液の添加により酸性とす る請求項１６記載の方法。 ２５．ＤＮＡ抽出の間の試料のｐＨを、塩基性ｐＨの緩衝液の添加により塩基性 とする請求項１６記載の方法。 ２６．ＲＮＡ抽出をＤＮＡ抽出前に行う請求項１６記載の方法。 ２７．ＤＮＡ抽出をＲＮＡ抽出前に行う請求項１６記載の方法。 ２８．ａ）試料中の蛋白質を失活させ、ｂ）試料のｐＨを酸性ｐＨとなるように 変えて試料中のＲＮＡ抽出を行い、ｃ）試料のｐＨを塩基性ｐＨとなるように変 えて試料中のＤＮＡ抽出を行い、ｄ）得られたＲＮＡおよびＤＮＡをプールし、 ｅ）得られたＲＮＡおよびＤＮＡ抽出物を含有する試料に、活性逆転写酵素と活 性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとを添加し、ｆ）まず、試料中で逆転写反応を行 わせてｃＤＮＡ生成物を生成させ、ついで、該活性逆転写酵素を不活化し、該活 性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを活性化し、ｇ）増幅されたｃＤＮＡ生成物を検 出し、また、増幅されて生じたＤＮＡ抽出物を検出する 工程からなることを特徴とする試料中のＲＮＡおよびＤＮＡの同時増幅および検 出方法。 ２９．逆転写酵素をＤＮＡ増幅反応の開始前に変性させる請求項２８記載の方法 。 ３０．逆転写酵素：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの比が２：１〜１０：１である 請求項２８記載の方法。 ３１．反応容器が、さらに１〜８ｍＭの濃度でＭｇＣｌ２を含有する請求項２８ 記載の方法。 ３２．逆転写およびＤＮＡ増幅に同じ反応液を使用する請求項３２記載の方法。 ３３．ＲＮＡがＲＮＡウイルスＲＮＡであり、ＤＮＡがＤＮＡウイルスＤＮＡで ある請求項２８記載の方法。 ３４．ＲＮＡがＨＣＶ　ＲＮＡであり、ＤＮＡがＨＢＶ　ＤＮＡである請求項２ ８記載の方法。 ３５．試料中の蛋白質の失活を、グァニジニウム・イソチオシアネートを用いて 行う請求項２８記載の方法。 ３６．試料中の蛋白質の失活を、プロティナーゼＫを用いて行う請求項２８記載 の方法。 ３７．有機相がフェノールおよびクロロホルム混合物である請求項２８記載の方 法。 ３８．ＲＮＡ抽出の間の試料ｐＨが３．０〜５．０であり、ＤＮＡ抽出の間の試 料ｐＨが７．１〜９．０である請求項２８記載の方法。 ３９．ＲＮＡ抽出の間の試料ｐＨが４．０であり、ＤＮＡ抽出の間の試料ｐＨが ８．０である請求項２８記載の方法。 ４０．ＲＮＡ抽出の間の試料ｐＨを、酸性ｐＨの緩衝液の添加により酸性とする 請求項２８記載の方法。 ４１．ＤＮＡ抽出の間の試料ｐＨを、塩基性ｐＨの緩衝液の添加により塩基性と する請求項２８記載の方法。 ４２．ＲＮＡ抽出を、ＤＮＡ抽出の前に行う請求項２８記載の方法。 ４３．ＤＮＡ抽出を、ＲＮＡ抽出の前に行う請求項２８記載の方法。 ４４．得られたＲＮＡおよびＤＮＡ抽出物をプールする工程に続いて、抽出物を 共沈させる請求項２８記載の方法。 ４５．得られたＲＮＡおよびＤＮＡ抽出物を共沈させる工程に続いて、抽出物を 、ＲＮアーゼ阻害剤を含有する溶媒中に懸濁させる請求項２８記載の方法。 ４６．蛋白質を失活させる手段を含有する容器、試料からＤＮＡおよびＲＮＡ種 を単離する手段、２：１〜１０：１の比で反応容器に添加すべき、逆転写酵素お よび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する別々の容器；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ；ＨＣＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー ＨＢＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー；ＰＣＲ用の標準的な緩衝 剤および塩；まず、蛋白質の失活を行い、ついで、酸性ｐＨでＲＮＡを抽出し、 それについで、塩基性ｐＨでＤＮＡを抽出し、その後、逆転写酵素および熱安定 性ポリメラーゼを添加し、逆転写およびＰＣＲを行うことを指示する指図書から なることを特徴とする一段ＰＣＲを用いるＲＮＡおよびＤＮＡの同時増幅用キッ ト。 ４７．蛋白質を失活させる手段を含有する容器、試料からＤＮＡおよびＲＮＡ種 を単離する手段、２：１〜１０：１の比で反応容器に添加すべき、逆転写酵素お よび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する別々の容器；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ；ＨＣＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー ＨＢＶ特異性のアンチセンスおよびセンスプライマー；ＰＣＲ用の標準的な緩衝 剤および塩；まず、蛋白質の失活を行い、ついで、酸性ｐＨでＲＮＡを抽出し、 それについで、塩基性ｐＨでＤＮＡを抽出し、その後、逆転写酵素および熱安定 性ポリメラーゼを添加し、逆転写およびＰＣＲを行うことを指示する指図書から なることを特徴とする一段ＰＣＲを用いるＨＣＶ　ＲＮＡおよびＨＢＶ　ＤＮＡ の同時増幅用キット。