JPH07501929A - オリゴマーフラグメントの合成非ランダム化 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

オリゴマーフラグメントの合成非ランダム化発明の分野 本発明は、薬物、生物学的活性診断法、および学術研究用試剤の開発に関する。 さらに詳細には、本発明は、標的分子に対して特異的に活性なフラグメントを決 定するための、オリゴマーフラグメントの合成非ランダム化（ｓｙｎｔｈｅｔｉ ｃ　ｕｎｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ）に関する。 相互参照すべき関連特許出願 本特許出願は、“オリゴマーフラグメントの合成非ランダム化”と題する１９９ １年８月２３日付は提出の米国特許出願第７４９．０００号（本特許出願の譲受 人に譲渡されている）の一部継続出願である。該特許出願の開示を本明細書の一 部としてここに引用する。 発明の背景 治療、診断、および研究用に有用なオリゴマーを設計することができる。従来に おいては、生物学的活性オリゴマー物質の開発は、所望の特性または有効性が達 成されるまで公知の配列をユニットごとに変えていく、という仕方に限定される ことが多かった。しかしながら、時間がかかりすぎるという欠点に加えて、こう したタイプの方法論を使用する場合のプロトコールは、最終生成物が出発物質の 構造をベースにしていること、そして出発物質の構造から大きくは脱し切れない 場合が多い、という点で制約がある。 最近、薬物や生物学的活性物質を“設計する”ことのできる新しい方法が開発さ れた。また活性ペプチドの同定を行うための種々の組み合わせ手法（ｃｏｉｂｉ ｎａｔＢｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１９９１．１８１．４０ ２；　Ｆｏｄｏｒらによる５ｃｔｅｎｃｅ坦９１．２５１．７６７ＨＧｅｙｓｅ ｎらによるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９８６．２３．７０ ９ＨＺｕｃｋｅｒｉａｎｎらによるけ取得の米国特許第５．０１０．１７５号； 等である。 特に核酸−蛋白質結合の分野に限定して述べると、組み合わせによる核酸選択法 （ｃｏｍｂｆｎａｔｏｒｉａｌ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　５ｅｌｅｃｔｉｏ ｎ　ｍｅｔｈｏｄ）では一般に、選択された配列が標的蛋白質に結合しつる能力 に基づいて、ランダムな核酸配列のプールから特定の核酸配列を選び出す。次い で、通常は選択された配列を増幅し、いくつかの強い結合配列が同定されるまで この選択プロセスが繰り返される。これらの方法は一般に、そのプロトコール中 において酵素作用工程を使用する。通常は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ ａｑＩを使用するポリメラーゼ連鎖反応増幅法が用いられる。最近、あるグルー プがＲＮＡ−結合蛋白質ｇｐ４３に対する標的配列を同定した（ＴｕｅｒｋとＧ ｏｌｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ坦９０２４９．５０５）　、　ＴｕｅｒｋとＧｏｌｄ の°指数濃縮によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｅｖｏｌｕ ｔｆｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄ　ｂｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍ ｅｎｔ；　５ＥＬＥＸ）　”法により、可変部分を有していて、且っｇｐ４３に 特異的に結合しうるＲＮＡ配列の４サイクルの増幅を使用して、特異的に結合し うるＲＮＡ配列が同定された。 他のグループは、プロテアーゼトロンビンを認識するＤＮＡ分子を設計した（Ｂ ｏｃｋら、　Ｎａｔｕｒｅ　１９９２．３５５．５６４）、この方法においては 、既知のプライマー区域（ｐｒｉｍｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ）に隣接するランダム区 域（ｒａｎｄｏｍ　ｒｅｇｉｏｎ）を含む集団が調製され、ついでＰＣＲの拡大 と選択が行わわる。この方法により、代謝補因子の小さな分子ミミック（Ｉｌｏ ｌｅｃｕｌｅ　ｍ１ｍ１ｃｓ）が、ＲＮＡ配列によって選択的に認識されている （Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎと５ｚｏｓｔａｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　１９９０．３４６． 　８１８）　ｏこれらの手法はオリゴヌクレオチドリガンドを設計するのに有用 であると考えられたが、増幅と配列の決定に際して酵素手段に依存するため、そ の用途が制約されている。標的分子に特異的に結合することができ、且つ標的分 子に対して特異的な活性を示す有用なオリゴマーを同定するためのより簡単な方 法が強くめられている。酵素手段に依存しない方法を使用すれば、プロトコール が簡単化されるだけでなく、そのプロトコールが有効である基質の範囲が広がる 。例えば、現在では１００種を越えるヌクレオチド類似体が使用可能である（Ｃ ｏｏｋ、、　Ｐ、　Ｄ、にょるｒＡｎｔｊ−Ｃａｎｃ５４４Ｊ　’）。全ての類 似体が酵素プロセスに適合するわけではないので、標的の配列特異的に結合でき る有用なオリゴマー配列を決定するための酵素に依存しない手段が強く要望され ている。このような方法により、天然のＲＮＡ結合蛋白賀だけでなく、いかなる 蛋白質、核酸、または他の標的分子にも特異的に結合できるオリゴマーを決定す ることができる。 特定の望ましい活性（標的分子の結合に限定されない）を有する有用なオリゴマ ー配列を決定するための方法も強（求められている。このような活性としては酵 素活性や触媒活性などがあるが、これらに限定されない。 図面の簡単な説明 図１は、ｒａｓ４７−塩基対ステム／ループＲＮＡのヌクレオチド配列と二次構 造を示した概略図である。 図２は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドとｒａｓ４７−塩基対ステム／ループＲＮＡ との結合親和性を示すゲルシフトアッセイのゲルイメージである。 図３は、４種のオリゴヌクレオチドのセットによるサイトメガロウィルス活性の 阻害を示した概略図である。化合物セットＣが、サイトメガロウィルスに対して 最も高い活性を有した。 図４は、１０μＭと１００μＭの濃度における４種のオリゴヌクレオチドのセッ トにより引き起こされるインフルエンザウィルス活性の阻害を示した概略図であ る。化合物セットＢとＤが、最も高い抗ウィルス活性を有した。 図５Ａは、ＨＩＶＴＡＲ要素のヌクレオチド配列と二次構造を示した概略図であ る。 図５Ｂは、４つの異なるオリゴヌクレオチド濃度における、ＨＩＶＴＡＲ要素に 対する４種のオリゴヌクレオチドセットの結合親和性を示したゲルイメージであ る。ＮＮＮＡ＊ＮＧＮＮＮＮ　（配列ＩＤ番号：２）のオリゴヌクレオチドセッ トが最も高い結合親和性を有した。 図６は、ＨＩＶ　ｇａｐ−ｐｏｌステムループのヌクレオチド配列と二次構造を 示した概略図である。 図７は、競合ｄＩｄＣが存在する場合と存在しない場合における蛋白質ＣＤ４に 対する配列ＮＮＮＮＴＮＮＮＮを有する１００ピコモルのホスポロチオエートオ リゴヌクレオチドセットの結合親和性を示したゲルイメージである。１ｏｏピコ モルが結合を示し、これは０．５μｇＣＤ４と１μｇＣＤ４において視認するこ とができた。 図８は、ビオチニル化された標的オリゴヌクレオチドに対して最も高い親和性を 有するオリゴヌクレオチドの選択を示したゲルイメージである。“勝利者（ｗｉ ｎｎｅｒ）”配列（上の矢印）は、３ラウンドの手順を施すことにより明らかと なった。レーンｌは１：１０に希釈されたインプット物質である。レーン２は１ ：１０に希釈された上澄み液である。レーン３は結合物質である。レーン４と５ は、それぞれラウンド２の上澄み液（１：１０希釈）および結合物質である。レ ーン６と７は、それぞれラウンド３の上澄み液（１：１０希釈）および結合物質 である。上の矢印は“勝利者“物質を示している。よりランダムなライブラリー 物質が、下の矢印によって示されている位置に移動する。 発明の要約 組み合わせ手法（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ）は、極めて 多数の化合物を生成させたり選別したりするための、そしてまた所望の結合特異 性もしくは薬理学的活性をもった個々の分子を同定するための可能性を提供する 。本発明は、標的分子に対して特異的に活性なオリゴマーを決定する実質的に非 酵素的な方法に関するものである。このようなオリゴマーは、酵素活性や触媒活 性等の望ましい活性だけでな（、結合親和性も示すことが好ましい。 本発明の方法は、主としてランダムに集成されたサブユニットのプールから、標 的分子に対して特異的な活性を有するすりゴマ−を決定するために有用である。 この方法は、より単純化されたオリゴマーセットを繰り返し合成することと、所 望の活性に関するアッセイにおいて最も高い活性を有するオリゴマーセットを決 定するための選択手順とを組み合わせることを含む。 本方法に工程を１つ追加するごとに、オリゴマー中の少なくとも１つの追加位置 が決定されるため、プールは単純化される。その結果、プール中の異なるオリゴ マー分子の可能な数は、オリゴマー中に残っているランダム位置の数と共に順次 減少する。 酵素を使用しな（でもよいため、制御された方法でオリゴマー化することのでき るいかなる分子にもこれらの方法を適用することができる。 本発明の１つの実施態様においては、標的分子に対して特異的な活性を有するオ リゴヌクレオチドを製造するための方法が提供される。これらの方法は、オリゴ ヌクレオチドのセット中の共通の位置を画定することによって、そして各セット が前記共有位置に異なる塩基ユニットを有するように、また共有位置にない塩基 ユニットがランダム化されるようにオリゴヌクレオチドセットを合成することに よって、複数のオリゴヌクレオチドセット（各オリゴヌクレオチドが少なくとも ４つの塩基ユニットを含む）を含んだ群を作製することを含む。次いで、標的分 子に対する活性について各セットをアッセイし、標的分子に対して最も高い活性 を有するセットが選択される。 本発明の他の実施態様においては、各々のオリゴヌクレオチド群をさらに副分画 （ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎ）　Ｌ／て、オリゴヌクレオチドのセットの副分画を 得ることができる。標的分子に対して各副分画をアッセイし、最も高い活性を有 する副分画が由来するセットを選択する。 これらの方法はさらに、複数のオリゴヌクレオチドセット（各セットが、あらか じめ画定された共通位置において、あらかじめ選定されたセット中のあらかじめ 画定１１　た共通位置に現れる塩基ユニットを有する）を含むさらなる群を作製 することを含む。前記のさらなるセットの群は、各々、追加の画定共通位置に異 なる塩基ユニットを有する。共通位置にないオリゴヌレクオチドの位置における 塩基ユニットはランダム化される。本発明の他の態様においては、この群をさら に副分画して、オリゴヌレクオチドのセットの副分画を得ることができる。 前記セットまたはセットの副分画を標的分子に対する活性に関してアッセイし、 最も高い活性を有するセット、または最も高い活性を有する副分画が由来するセ ットを選定する。前述の工程は繰り返し行うことができる。 標的分子に対して特異的活性を有するオリゴヌクレオチドカセットを決定する方 法も、本発明によって提供される。これらの方法は、オリゴヌクレオチドのセッ ト中の共有位置を画定することによって、そして各セットが前記共有位置に異な る塩基ユニットを有するように、また共有位置にない塩基ユニットがランダム化 されるようにオリゴヌクレオチドセットを合成することによりて、複数のオリゴ ヌクレオチドセット（各オリゴヌクレオチドが少なくとも４つの塩基ユニットを 含む）を含む群を作製することを含む。次いで、標的分子に対する活性に関して 各セットをアッセイし、標的分子に対して最も高い活性を有するセットが選択さ れる。その後、複数のオリゴヌクレオチドセット（各セットが、あらかじめ画定 された共通位置において、あらかじめ選定されたセット中のあらかじめ画定され た共通位置に現れる塩基ユニットを有する）を含むさらなる群が作製される。前 記のさらなるセットの群のそれぞれは、追加の画定共通位置において異なる塩基 ユニットを有する。画定された共通位置にないオリゴヌクレオチドの位置におけ る塩基ユニットはランダム化される。前記さらなるグループの各セットが、標的 分子に対する特異的活性に関してアッセイされ、最も高い活性を有するセットが 選択される。前述の工程を繰り返し、各位置が画定されたオリゴヌクレオチドカ セットを得る。 本発明の他の実施態様においては、標的分子に対して特異的活性を有するオリゴ ヌクレオチドを決定するための方法が提供される。このような方法は、複数のオ リゴヌクレオチドセット〔各オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのオリゴヌ クレオチドカセットと、少なくとも１つのフランキング区域（ｆｌａｎｋｉｎｇ 　ｒｅｇｉ。 ｎ）を含む〕を含む群を作製することを含む。共通位置がオリゴヌクレオチドセ ットのフランキング区域において画定され、各オリゴヌクレオチドセットが前記 共通位置に異なる塩基ユニットを有するように、また共通位置にない塩基ユニッ トがランダム化されるように、オリゴヌクレオチドのセットが合成される。次い で、各セットが標的分子に対する活性に関してアッセイされ、標的分子に対して 最も高い活性を有するセットが選択される。 これらの方法はさらに、複数のオリゴヌクレオチドセット（各セットが、あらか じめ画定された共通位置において、あらかじめ選定されたセット中のあらかじめ 画定された共通位置に現れる塩基ユニットを有する）を含むさらなる群を作製す ることを含む。前記のさらなるセットグループのそれぞれが、フランキング区域 における追加の画定共通位置に異なつた塩基ユニットを有する。フランキング区 域での共通位置にないオリゴヌクレオチドの位置における塩基ユニットがランダ ム化される。各オリゴヌクレオチドセットが、標的分子に対する特異的活性に関 してアッセイされ、最も高い活性を有するセットが選択される。前述の工程は繰 り返し行うことが好ましい。 本発明の他の実施態様においては、標的分子に対して特異的活性を有するポリペ プチドを作製する方法が提供される。これらの方法は、ポリペプチドセット中の 共有位置を画定することによって、そして各セットが前記共有位置に異なるアミ ノ酸ユニットを有するように、また共有位置にないアミノ酸ユニットがランダム 化されるようにポリペプチドセットを合成することによって、複数のポリペプチ ドセット（各ポリペプチドが少なくとも４つのアミノ酸ユニットを含む）を含む 群を作製することを含む。次いで、標的分子に対する活性に関して各セットをア ッセ・イし、最も高い活性を有するセットが選択される。 本発明のさらに他の態様においては、ポリペプチドのセットの副分画を得るため に、ポリペプチドの各群が副分画される。標的分子に対する特異的活性に関して 各副分画を検定し、最も高い活性を有する副分画が由来するセットが選択される 。 これらの方法はさらに、複数のポリペプチドセット（各セットが、あらかじめ画 定された共通位置において、あらかじめ選定されたセット中のあらかじめ画定さ れた共通位置に現れるアミノ酸ユニットを有する）を含むさらなる群を作製する ことを含む。前記のさらなるセットグループのそれぞれが、追加の画定共通位置 に異なったアミノ酸ユニットを有する。共通位置にないポリペプチドの位置にお けるアミノ酸ユニットがランダム化される。本発明の他の態様においては、この 群をさらに副分画して、ポリペプチドセットの副分画を得ることができる。 前記セットまたはセットの副分画のそれぞれが標的分子に対する活性に関してア ッセイされ、最も高い活性を有するセット、または最も高い活性を有する副分画 が由来するセットが選択される。前述の工程は繰り返して行うことができる。 標的分子に対して特異的活性を有するポリペプチドカセットを決定する方法も、 本発明によって提供される。これらの方法は、ポリペプチドセット中の共有位置 を画定することによって、そして各セットが前記共有位置に異なるアミノ酸ユニ ットを有するように、また共有位置にないアミノ酸ユニットがランダム化される ようにポリペプチドセットを合成することによって、複数のポリペプチドセット （各ポリペプチドが少なくとも４つのアミノ酸ユニットを含む）を含む群を作製 することを含む。次いで、標的分子に対する活性に関して各セットがアッセイさ れ、標的分子に対して最も高い活性を有するセットが選択される。その後、複数 のポリペブチトドセット（各セットが、あらかじめ画定された共通位置において 、あらかじめ選定されたセット中のあらかじめ画定された共通位置に現れるアミ ノ酸ユニットを有する）を含むさらなる群が作製される。前記のさらなるセット の群のそれぞれが、追加の画定共通位置に異なるアミノ酸ユニットを有する。画 定された共通位置にないポリペプチドの位置におけるアミノ酸ユニットがランダ ム化される。前記さらなる群の各セットが、標的分子に対する特異的活性に関し てアッセイされ、最も高い活性を有するセットが選択される。前述の工程を繰り 返し行い、各位置が画定されたポリペプチドカセットを得る。 本発明の他の実施態様においては、標的分子に対して特異的活性を有するポリペ プチドを決定する方法が提供される。これらの方法は、ポリペプチドセットのフ ランキング区域における共有位置を画定することによって、そして各セットが前 記共有位置に異なるアミノ酸ユニットを有するように、また共有位置にないアミ ノ酸ユニットがランダム化されるようにポリペプチドセットを合成することによ って、複数のポリペプチドセット（各ポリペプチドが、少な（とも１つのポリペ プチドカセットと少なくとも１つのフランキング区域を含む）を含む群を作製す ることを含む。次いで、標的分子に対する活性に関して各セットがアッセイされ 、標的分子に対して最も高い活性を有するセットが選択される。 これらの方法はさらに、複数のポリペプチドセット（各セットが、あらかじめ画 定された共通位置において、あらかじめ選定されたセット中のあらかじめ画定さ れた共通位置に現れるアミノ酸ユニットを有する）を含むさらなる群を作製する ことを含む。前記のさらなるセットの群のそれぞれが、フランキング区域におけ る追加の画定共通位置に異なったアミノ酸ユニットを有する。共通位置にないポ リペプチドの位置におけるアミノ酸ユニットがランダム化される。標的分子に対 する特異的活性に関して各ポリペプチドセットがアッセイされ、最も高い活性を 有するセットが選択される。前述の工程は繰り返して行うことができる。 発明の詳細な説明 本発明は、標的分子に対して活性のあるオリゴマーを決定するための非酵素的方 法に関する。本発明の１つの実施態様においては、標的分子に対して特異的な結 合親和性を有するオリゴヌクレオチドを決定する方法が提供される。本発明の他 の実施態様によれば、標的分子に対して酵素活性や触媒活性を有するオリゴヌク レオチドを決定する方法が提供される。本発明のさらに他の実施態様によれば、 標的分子に対して特異的な結合親和性を有するポリペプチドを決定する方法が提 供される。さらに、標的分子に対して酵素活性や触媒活性を有するポリペプチド を決定する方法も提供される。 本発明によれば、オリゴマーは、化学的に類似の共有結合によって一緒に繋がっ たユニットのストリングである。ホスホジエステル結合を介して一緒に繋がった 核酸、あるいはペプチド結合を介して一緒に繋がったアミノ酸は、天然に存在す るオリゴマーの例である。 本明細書において使用する“オリゴヌクレオチド”という用語は、天然に存在す る塩基と天然のホスホジエステル結合によつて連結されたフラノシル基から形成 されるポリヌクレオチドを意味している。この用語は、天然に存在するサブユニ ットまたはそれらの類縁体から形成される、天然存在の化学種または合成による 化学種を効果的に表している。さらに、本明細書において使用する“オリゴヌク レオチド”という用語は、天然に存在するオリゴヌクレオチドに類似した部分を 有しているが、しかし天然には存在しない部分を有している化合物をも表してい る。したがってオリゴヌクレオチドは、改変された糖部分または糖量結合を有し ていてもよい。これらのうちで代表的なものは、ホスホロチオエートおよび当業 界に公知のイオウ含有化学種である。いくつかの好ましい実施態様によれば、オ リゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の少なくとも一部が、オリゴヌクレオ チドの安定性や、ウィルス性ＲＮＡが局在化する細胞区域中にすりゴヌクレオチ ドが侵入する能力を高めるよう機能する構造で置き換えられている。このような 置き換えは、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル、メチルホスホネー ト結合、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキル構造、短鎖のへテロ原子もしく はヘテロ環式構造を含む。最も好ましいものは、ＣＨ２ＮＨＯＣＨｚ、ＣＦｉｚ 　Ｎ　（ＣＨｓ）　ＯＣＨ２，ＣＨＩ　ＯＮ　（ＣＨ３）　ＣＨ２，ＣＨｚ　Ｎ （ＣＨｓ）　Ｎ　（ＣＨｓ）　ＣＨ２，およＵＯ−Ｎ　（ＣＨｓ）−Ｃ）ｉｚ− ＣＨＩ構造であり、このときホスホジエステルは０−Ｐ−０−ＣＨ２である。さ らに、モルホリノ構造も好ましい（ＳｕＩＩｌｍｅｒｔｏｎ、　Ｊ、Ｅ、とＷｅ ｌｌｅｒ、　Ｄ、Ｄ、にょる１９９１年７月２３日付は取得の米国特許第５．０ ３４．５０６号）。他の好ましい実施態様におい°Ｃは、蛋白質−核酸（ＰＮＡ ）主鎖のように、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖をポリアミド主鎖 で置き換えることができ、このとき塩基は、ポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直 接または間接的に結び付いている（Ｐ、Ｅ、　Ｎ１ｅｌｓｅｎらによるｒｓｅｉ ｅｎｃｅ　１９９１２５４１４９７Ｊ　）。他の好ましい実施態様によれば、実 質的に非イオン性であって且つ非キラルであるような他の構造、あるいはキラル であって且つ鏡像異性体として特異的であるような構造で、ホスホジエステル結 合が置き換えられる。当業者は、本発明の実施に際して使用することのできる他 の結合を選定することができるであろう。 オリゴヌクレオチドは、少なくとも一部変性された塩基形を有する化学種を含ん でもよい。したがって、天然に普通に見受けられるもの以外のプリン類やピリミ ジン類も使用することができる。同様に、本発明の本質的な考え方から逸脱しな い限り、ヌクレオチドサブユニットのフラノシル部分に修飾を施すこともできる 。このような修飾の例としては、２’−０−アルキル置換、および２′−ハロゲ ン置換のヌクレオチドが挙げられる。本発明に対して有用な、糖部分の２′位置 修飾のいくつかの特定の例としては、ＯＨ，ＳＨ，Ｓ　ＣＨｓ、Ｆ、　ＯＣＮ。 ０　（ＣＨ２）、ＮＨｔ、またはＯ（ＣＨ２）、ＣＨ３（このときｎは１〜約１ ０）：Ｃ３〜Ｃ１１１の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、また はアラルキル；　ＣＩ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦｓ、ＯＣＦ！、Ｏ−アルキル、Ｓ−ア ルキル、またはＮ−’ｙルキル；　Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ −アルケニル；５ＯＣＨＩ、５ＣｈＣＨｓ：　０ＮＯｔ；　Ｎｏｔ；　Ｎｓ：　 ＮＨｚ：　ヘテロシクロアルキル；　へテロシクロアルカリール：　アミノアル キルアミノ；　ポリアルキルアミノ：置換シリル；　ＲＮＡ開裂基：共役基（ｃ ｏｎｊｕｇａｔｅ）　；　リポータ−基　：インターキレーター（ｉｎｔｅｒｃ ａｌａｔｏｒ）　；　オリゴヌクレオチドの薬物動力学特性を改良するための基 ；　オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改良するための基；および類似の特性を 有する他の置換基；などがある。シクロブチルのような糖模倣物（ｌｌｌｉｍｅ ｔｉｃ）を、ペントフラノシル基の代わりに使用することもできる。オリゴヌク レオチドはさらに、本発明の精神に矛盾しない他の修飾部分を含んでもよい。こ のようなオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチドとは構造的に異なっ た形で機能的に交換可能であるとして説明するのが最もよい。このようなオリゴ ヌクレオチドはいずれも、それらがオリゴヌクレオチド中のサブユニットとして 有効に機能する限り、本発明によって包含される。 本明細書においては、ポリペプチドとは、天然に存在するアミノ酸から特定の配 列で形成されている複数の連結アミノ酸ユニットを表している。前記アミノ酸ユ ニットは、一般にはペプチド結合を介して一緒に連結されている。天然に存在す るサブユニットは、普通に存在する２０種のアミノ酸だけでなく、あまり普通に は存在しに（い他のアミノ酸も含む。本明細書においては、ポリペプチドとはさ らに、ポリペプチドに類似しているが、天然には存在しない部分を有する化合物 をも表している。したがってポリペプチドは、修飾された結合を有していてもよ いし、あるいはＤ−アミノ酸等の修飾アミノ酸残基や本発明の精神と矛盾しない 他の修飾部分を含んでいてもよい。このような修飾ポリペプチドはさらに、当業 界ではポリペプチド類似体とも呼ばれている。 本発明の方法は、標的分子に対して特異的に活性のオリゴマーを決定するために 有用である。本明細書においては、“決定する“とは、オリゴマーの配列と標的 分子に対するオリゴマーの結合親和性とを同時的に同定することを意味している 。さらに、”決定する”とは、触媒活性や酵素活性等の活性を有するオリゴマー を同定することも意味している。場合によっては、本発明の方法を実施する前に 、オリゴマーの配列もオリゴマーの特異的活性もわ力じていないことがある。 また特定のオリゴマー配列はわかっているけれども、特定の標的分子に対する活 性が当業者にはわかっていない、という場合もある。さらに他の場合においては 、ある特定の標的分子に対する既知の配列の活性を最適化することができる。 本発明のオリゴマーは、標的分子に対する特異的活性に関してアッセイされる。 本発明のいくつかの実施態様において、“特異的活性”とは、標的分子に対する 前記オリゴマーの結合親和性を表している。本発明の他の実施態様においては、 特異的活性は結合親和性を包含し、そしてさらに触媒活性や酵素活性等の活性を も包含する。本明細書で使用している“結合親和性“とは、オリゴマーが、水素 結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、または他の作用を介して 標的分子と結合する能力を表している。例えば、あるオリゴヌクレオチドは、相 補的な（すなわち、ワトソンークリック塩基対引力によりハイブリダイズする能 力を有している）他のオリゴヌクレオチドに対して結合親和性を有している。 本発明の標的分子は、種々の生物学的に重要な分子のいずれを含んでもよい。 標的分子は、ＤＮＡやＲＮＡの重要区域のような核酸ストランドであってもよい 。 標的分子はさらに、蛋白質、炭水化物、または糖蛋白質のいずれでもよい。本発 明のいくつかの好ましい実施態様においては、前記標的分子は、免疫グロブリン 、レセプター、レセプターに結合するリガンド、抗原、または酵素等の蛋白質で あり、さらに具体的にはホスホリパーゼ、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、イン ターロイキン、プラスミノーゲン活性化因子、プロティンキナーゼ、細胞接着分 子、リポキシゲナーゼ、ヒドロラーゼ、またはトランスアンラーゼである。本発 明の池の好ましい実施態様においては、前記標的分子は、ヒトの免疫不全ウィル スの重要区域、カンジダ、ヘルペスウィルス、パピローマウィルス、サイトメガ ロウィルス、ライノウィルス、肝炎ウィルス、またはインフルエンザウィルスで ある。 本発明のさらに池の好ましい実施態様においては、前記標的分子は、ｒａｓ４７ −ｍａｒステムループＲＮＡ、ヒト免疫不全ウィルスのＴＡＲ要素、またはヒト 免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）もしくはＨＩＶ　ｔａｔ蛋白質のｇａｇ−ｐｏｔ ステムループである。さらに他の標的が細胞活性を誘導することがある。例えば 、ある標的がインターフェロンを誘導することがある。 本発明のいくつかの態様においては、蛋白質は遊離のアルデヒド基と結合するが 、核酸は遊離のアルデヒド基とは結合しない、という事実に基づいて標的蛋白質 を同定することができる。したがって、標的である可能性があるとして同定され ている蛋白質のサンプルを、遊離のアルデヒド基を有する固体支持体（例えばニ トロセルロースフィルター）に結合させることができる。例えば、９６−ウェル （９６−ｗｅｌｌ）ニトロセルロースフィルターマニホルドの個々のウェルにお いて、最大９６個までの蛋白質を結合させることができる。本発明のいくつかの 実施態様においては、一連の濃度の蛋白質について測定して、蛋白質標的の濃度 を低下させる効果を調べることができる。その後、検出可能となるよう標識され た同一のオリゴヌクレオチド群を、結合条件下において各蛋白質サンプルと共に インキュベートすることができる。標識されたオリゴヌクレオチド群の作製につ いて以下に説明する。支持体を洗浄し、結合の有無を調べ、このことにより、結 合の存在は、そのオリゴヌクレオチド群が与えられた蛋白質に対して特異的な活 性を有していることを示している。当業者には周知のことであるが、結合の有無 を検出する方法は使用する標識によって異なる。 本発明においては、ランダムオリゴマーのセットの群が作製される。オリゴマー は、当業者に公知の方法によって作製することができる。具体的には、オリゴヌ クレオチドとポリペプチドは、固相合成法または当業者に公知の他の手段により て作製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは標準的なホスホルアミ ダイト化学を使用して作製することができる。本発明のい（っかの実施態様にお いては、オリゴマーの群を、例えば放射性標識または蛍光標識によってさらに標 識することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの群は、〔γ−３！Ｐ）　Ａ ＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、オリゴヌクレオチドの５ ′位置において標識することができる。標識されたオリゴマーの群は、未標識の オリゴマーの群を使用したときには行うことのできない多くのアッセイにおいて 有用となる。 各セットのオリゴマーは、あらかじめ定めた長さであってもよい。このようなオ リゴマーは、約４〜５０ユニツトの長さであることが好まし、い。このようなオ リゴマーは、約４〜４０ユニツトの長さであることがさらに好ましい。さらに、 本発明のいくつかの実施態様に対しては、オリゴマーの約１０ユニツト未満がラ ンダム化されていることも好ましい。場合によっては、最初に６，７．または８ 個のランダムユニットを含むオリゴマーを供給することが望ましい。 本発明のいくつかの実施態様においては、前記オリゴマーの長さは手順全体を通 じて一定である必要はない。例えば、８−ｍａｒをアッセイして、標的分子に対 して最も高い結合親和性を有する配列を決定することができる。引き続き、この ８−ｍａｒを拡大して１５−ｍａｒとして試験し、これによって標的分子に対し て最も高い結合親和性を有する１５−ｍａｒの配列を決定することができる。 本発明の群は、手順全体を通して一定のままである複数のセットで構成されてい る。約３〜２０のセットが各群を構成することができる。本発明の１つの好まし い実施態様においては、４つのセットが各群を構成する。本発明の他の実施態様 においては、２０のセットが各群を構成する。あるいはまた、３つのセットが各 群を構成することもある。各群を構成するセットの数は、分子のいかなる化学種 に対しても存在する可能な個別の化学的類似ユニットの数によって異なる。例え ば、オリゴヌクレオチドの群は４つのセットで構成することができる。なぜなら 、核酸化字種を構成する類似ユニット（すなわち、グアニン、アデニン、シトシ ン、およびチミン；あるいはアデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル） が４つであるからである。あるいはまた、オリゴヌクレオチドグループは４つよ り多いセット（例えば、４つの普通に存在する塩基とさらなる修飾塩基）で構成 されてもよい。２０のセットがポリペプチドグループを構成してもよく、２０種 の普通に存在しているアミノ酸、すなわち、リシン、アルギニン、ヒスチジン、 アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システ ィン、セリン、トレオニン、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、インロイ シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファンを示し ている。普通に存在しないかあるいは修飾されたアミノ酸がアッセイ中に含まれ る場合は、２０より多いセットがポリペプチドの群を構成してもよい。塩基性ユ ニットのサブグループが、ある１つの群中のセットの数を決定することもある。 例えば、特定のポリペプチドを決定するための手順においては、セットは、酸性 アミノ酸ユニット、塩基性アミノ酸、ユニット、および中性アミノ酸ユニットを 示してもよい（すなわち３セツト）。いかなる１つの手順においても、群中のセ ットの数は全体を通して一定のままである必要はなく、変動してもよい。例えば 、ある１つのグループにおいては、３つのタイプのポリペプチドを示している３ つのセットがあってもよく、また次のグループにおいては、それぞれが普通に存 在するアミノ酸を示している２０セツトがあってもよい。 場合によっては、ヌクレオチドやアミノ酸類似体等の追加ユニットを使用するこ とが好ましく、このときオリゴマーのグループの複合性（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ）を増大させることが望ましい。グループの複合性は式ｐ　ｘ　ｐＮによって算 出することができる。このときＰは使用される異種ユニットの数であり、Ｎはラ ンダム化されるオリゴマー中の位置の数である。セット（Ｑ）の複合性は、式Ｐ ′″によって示される。表１は、使用される類似体の数が増大する結果としてグ ループの複合性が変化することを示している。当然のことながら、使用される異 種ユニットの数によって、作製されるセットの数が決定される。 表１ 群の構造＝　ＮＮＮ　Ｘ　ＮＮＮ 使用される異種類似体　各セット（Ｑ）の　全体としてのグループ複合性の数（ Ｐ）　複合性（Ｐ＠）　（Ｐ　−Ｐ’）４　４’　＝　４０９６　４　Ｘ　４０ ９６　＝　１６．３８４５　５’　−１５，６２５５Ｘ　１５．６２５　＝　７ ８．１２５６　６６社４６．６５６　６　Ｘ　４６．６５６　＝　２７９．９３ ６７　７’　−１１７，６４９７Ｘ　１１７．６４９　＝　８２３．５４３８　 ８’　−２６２，１４４８Ｘ　２６２．１４４−２．０９７．１５２９　９６・ ５３１．４４１　９　Ｘ　５３１．４４１　；　４．７８２．９６９１０　１０ ’　−１，０００，０００１０Ｘ　］、、０００，０００　＝　１０．０００． ０００群中の各セットが前記オリゴマーの共通位置に異種ユニットを有する。例 えば、オリゴヌクレオチドを決定する上で、４つのセットのうちの１つだけが共 通位置にアデニンを含有し、また１つだけが共通位置にグアニンを含有する等。 オリゴヌクレオチドの各セット中の残りの位置は、ランダムな塩基ユニットの組 み合わせによって構成されている。 本発明のさらに他の実施態様においては、共通位置が複数のオリゴマー位置で構 成されている。例えば９−ｍｅｒの場合、１つの共通位置が９−ｍｅｒの３番目 の位置であってもよく、あるいはその共通位！が９−ｍａｒの３番目位置と４番 目位置で構成されてもよい。 本発明のいくつかの態様においては、末端区域とは反対側のオリゴマーの中央区 域（例えば、オリゴヌクレオチドの３′区域もしくは５′区域、あるいはポリペ プチドのカルボキシ末端区域もしくはアミノ末端区域）を非ランダム化すること によって手順を開始するのが望ましい。なぜなら、いくつかの場合においては、 決定の同様の段階において、末端区域を画定するより中央位置を画定するほうが 、オリゴマーの特異的活性に対してより大きな影響を及ぼすことが見いだされて いるからである。例えば、実施例８において、３′位置を固定しようとする試み は、セットを識別する結果が得られなかったが、オリゴマーの中央位置を固定す ると検出可能な結果が得られた。 さらに、活性の検出可能性（シグナル対ノイズ）に対しては複合性に限度があり 、特に、高いパーセントの非ランダム化位置を有するオリゴマーの場合にそうで ある。あまり構造化されていない、空間配置的にダイナミックなオリゴマーの場 合、多くの標的分子に対して比較的弱い特異的活性をもつブレトラ（ｐｌｅｔｈ ｏｒａ）が生成すると考えられる。前述したように、これは使用するユニットの 数を増大させることによって改良することができる。オリゴマーのグループの特 異的活性を増大させるさらに他の方法は、オリゴマーに対し立体的に制約を加え るという方法である。例えば、オリゴヌクレオチドは、当該区域（ランダム化さ れた位置を含む）の３゛末端と５゛末端において相補的末端を供給することによ って、立体的に制約を加えることができる。相補的末端は、ハイブリダイズして 二次構造を形成する。 検出可能な特異的活性は、オリゴマー“カセット”の決定および／または使用に よっても高めることができる。オリゴマーカセットは、配列が決定されているオ リゴマーである。カセットは、既知の意味を有する配列で構成させることもでき るし、あるいは例えば本発明の方法によって決定することもできる。本明細書に おいて使用する“オリゴヌクレオチドカセット”は明らかになっているオリゴヌ クレオチド配列であり、または“ポリヌクレオチドカセット”は明らかになって いるポリペプチド配列である。本発明のいくつかの実施態様においては、オリゴ マーは、少な（とも１つのオリゴマーカセットと、少なくとも１つの非ランダム 化された位置のフランキング区域を含む。本発明の他の実施態様においては、オ リゴマーは１つより多いカセットで構成されていてもよく、このとき各カセット は、ランダム化された位置の少なくとも１つの区域によって隣接される。例えば 、既知の配列をもつオリゴヌクレオチドカセットは、３゛末端、５°末端、また は３末端°と５°末端の両方において隣接されていてもよい。 本発明のいくつかの実施態様においては、オリゴマーのグループをさらに副分画 してオリゴマーのセットの副分画を得、これによって一度にアッセイされる複合 性の程度の範囲を定めることが望ましい。このことは、全ての個々の配列の充分 な表示を行うために決定において使用しなければならない全体の物質量を減少さ せ、また最も活性の高い配列を多く含むオリゴマーセットから出発することによ って、アッセイのシグナル対ノイズ比を高める。あらゆる物理化学的または機能 的特性を適切な分離属性と組み合わせて使用して、グループを経験的に副分画し 、これによって異なった特性と減少した複合性をもつ多（の個別側分画を誘導す ることができる。特定の標的に対する最初の群中に特定のフィツト配列が存在す れば、それは限られた数の複合性の減少した副分画に濃縮されているだろう、と 理論づけられる。 当業者は、利用可能な適当な選択属性に関して選択の幅が広いことがわかるであ ろう。これに対処する手法は、当然のことながらオリゴマー群の要素の特性によ って異なる。群の要素の数が増大するにつれて、また構造的・化学的多様性が拡 大するにつれて、分離手法の選択の幅がより大きくなり、副分画の容量が増大す ることは当業者には容易にわかるであろう。例えば、サイズ、正電荷もしくは負 電荷、疎水性、および親和性等の相互作用のいずれか１つまたはこれらの組み合 わせによって、新規のオリゴマーを副分画に分割することができると考えられる 。本発明に包含されている分離手法に効果的に適用することのできる多くのクロ マトグラフィー法や機器分析法が当業者に知られている。 本発明のいくつかの実施態様においては、オリゴマーの各セットが所望の活性に 関してアッセイされる。本発明の池の実施態様においては、最も強い活性（強い シグナル対ノイズ比により示される）を有する副分画を同定するために、前述し たオリゴマ・−セットの副分画に対し同一のアッセイ実験が行われる。最も高い 活性を有するセット、または最も高い活性を有する副分画が由来するセットが選 択され、そして必要に応じてさらなる非ランダム化を行うことができる。 当業者に公知の方法によって特異的活性を検出することができる。適切なアッセ イは当業者には明らかであり、オリゴマーの濃度、標的分子の濃度、塩濃度、温 度、緩衝液の種類、緩衝液の濃度を、特定のシステムを最適化するよう変えるこ とができる。本発明のいくつかの好ましい実施態様においては、結合条件は生理 学的条件をシミュレートする。本発明の他の好ましい実施態様においては、結合 は、約８０〜１１０ｍＭの塩化ナトリウムｎＬ液、および約１０〜・１５ｍＭの 塩化マグネシウム緩衝液において生じる。さらに一般には、触媒活性または酵素 活性に関してオリゴマーをアッセイすることもできる。　ゲルシフトアッセイを 使用して、標的分子に対するオリゴマーの結合を可視化することができる。本発 明の方法によれば、本発明のオリゴマーに結合した放射性標識した標的分子を、 ポリアクリルアミドゲル等のゲル上で移動させることができる。結合した標的分 子は、結合していない標的分子より移動度が低（、したがってゲル上であまり遠 くには移動しない。放射性標識を使用すれば、標準的な方法、例えばＸ線撮影法 やホスホルイメージヤ−（モレキュラー・ダイナミックス）を使用することによ って、移動度の“シフト“の視覚化が可能となる。本発明の他の実施態様におい ては、標識されていない標的分子を放射性標識したオリゴマーに結合させたゲル シフトアッセイを行うことができる。 放射性標識したオリゴマーはさらに、あるオリゴマーに結合したビオチニル化標 的のストレプトアビジン捕捉にも有用である。例えば、放射性標識したランダム 化オリゴマーセットと共にインキュベーションを行う前に、標的をビオチニル化 することができる。次いで、各セットが同一条件下で標的と共にインキュベーシ ョンされ、標的分子がストレプトアビジン被覆されたビーズに捕捉される。した がって、標的に結合しているいかなるオリゴマーも捕捉される。ストレプトアビ ジン被覆されたビーズは市販されており、例えばプロメガ（Ｐｒｏｓｅｇａ）か ら市販のストレプトアビジン被覆マンガン粒子などがある。ビーズが洗浄され、 “勝利者゛配列をさらにａ縮するよう反応を再度平衡化させることができる。洗 浄後に残っている放射能の量によって、結合している各セットからのオリゴマー のパーセンｔ・がめられる。サンプル中の放射能の測定は、当業界に公知の多く の方法によって行うことができる。例えば、放射能の量は、シンチレーシコン計 数器を使用して各サンプルをカウントすることによって直接求めることができる 。サンプルをポリアクリルアミドゲル上で移動させ、このゲルをＸ線フィルムの 下に置き、得られたオートラジオグラムをデンシトメーターにより読み取ること もできる。 アッセイは、結合親和性の検出に限定されることなく、他の所望の活性（例えば 触媒活性や酵素活性）も検出することができる。本発明のいくつかの実施態様で は、細胞培養アッセイにより特異的活性の検出が可能である。例えば、細胞接着 の阻害は、細胞接着に関与する標的分子に対してオリゴマーが結合していること を示している。本発明のさらに他の実施態様においては、セットのさらなる群が 作製される。前記さらなる群のそれぞれは、選定された数のオリゴマーセットを 有する。さらなる群のセットは、あらかじめ画定された共通位置に、あらかじめ 選定されたセット中のあらかじめ画定された共通位置に現れるユニットを有する 。さらなるセンＩ・の各セットは、追加の画定共通位置に異なるユニットを有す る。共通位置にないオリゴマーの位置におけるユニットがランダム化される。 例えば、ある１つのグループにおいては、あらかじめ選定されたセットは、あら かしめ画定された共通位置においてアデニンを含む。さらなるグループは、前記 のあらかじめ画定された共通位置に前記アデニンを保持しており、他の画定共通 位置において、前記さらなる群中の各セットは異なるユニット（アデニン、グア ニン、チミン、またはシトシン）を含む。共通位置にないオリゴマーの位置にお けるユニットがランダト化される。 本発明のさらに他の実施態様においては、共通位置が前述のようなオリゴマーの 複数の位置を含む。例えば９−ｍａｒの場合、１つの共通位置は９−ｍｅｒの３ 番目位置であってもよく、あるいは共通位置が９−ｍａｒの３番目位置と４番目 位置で構成されていてもよい。 オリゴマーグループの複合性を増大させるのに有用な、および／またはオリゴマ ーの特異的活性を増大させるのに有用な前述した方法は、前記さらなるグループ にも等しく適用可能である。したがって、オリゴマーグループは複数のユニット を有してもよく、立体配置的に制約を受けてもよく、また特異的活性に関してア ッセイを行う前に副分画してもよい。さらに、さらなるグループのオリゴマーが １つ以上のカセットを含んでもよい。 所望の活性に関して再びセットがアッセイされる。前述の工程は繰り返し施すこ とができる。 以下の実施例は例示のためであり、本発明を制限するものではない。 非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドはヨウ素で酸化する標準ホスホアミダイト化学 を用いる自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３ ８０　Ｂ）により合成される。β−シアノエチルジイソブロピルホスホアミダイ ドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。 ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡから購入できるであろう。 ランダム塩基配列を持つ非修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドはヨウ素で酸化する改 良された標準ホスホアミダイト化学を用いる自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０　Ｂ）により合成された。標準合成法は テトラゾールのパルス放出後の待ち時間を９００秒に延長することで改良された 。β−シアノエチルジイソプロピル　ホスホアミダイトはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡから購入した。塩基はメ タノール性アンモニア中で一夜インキユベーションすることにより脱保護された 。塩基脱保護に続いて、オリゴヌクレオチドを真空下乾燥した。２′−ヒドロキ シルを保護しているｔ−ブチルジメチルシリルは、オリゴヌクレオチドをＩＭテ トラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液中で一夜インキュ ベーションすることにより除去された。ＲＮＡオリゴヌクレオチドはさらにＣｌ １ｌ　５ｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（ｌａｔｅｒｓ、　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ ｌｌｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃａｒｐ、、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）およびエタノ ール沈殿により精製された。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実質的にヌクレアーゼ耐性であるオ リゴヌクレオチド類似体の一種である。ホスホロチオエートＲＮＡオリゴヌクレ オチドおよびホスホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチドは、標準酸化ボトル を亜リン酸エステル結合の段階的チオ酸化のための３Ｈ−１，２−ベンゾジチオ ール−３−オン　１，１−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に置き換え て、各々実施例１および２に示した方法に従って合成された。チオ酸化サイクル 待ち工程は６８秒に延長し、続いてキャッピング工程を行った。 ２゛−０−アルキルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標準ホスホアミ ダイトを２′−０−メチルβ−シアノエチルジイソプロピルホスホアミダイト（ Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、　Ｎｅｅｄｈａｍ、　ＭＡ）に置換し、テトラゾールおよ び塩基のパルス放出後の待ちサイクルを３６０秒に増加させて、実施例３の方法 に従って合成された。 同様にこの方法をわずかに改変することにより、２′−〇−プロピル、２’−０ −フェニルおよび２°−０−ノニルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを製 造することができる。 実施例５ オリゴヌクレオチドは、所望の位置に２゛−アミノペントキシアデノシンを取り 込ませることにより製造された。オリゴヌクレオチドは０．２Ｍ　ＮａＨＣＯｓ 緩衝液に溶解され、ジメチルホルムアミドに溶解した５０倍量のピレン−１−酪 酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理された。得られた混合物は３ ７℃にて４−５時間インキュベートし、結合物は逆相ＨＰＬＣ，続いてＧ−２５ セフアデツクス　カラムで脱塩することにより精製された。 等量の７デノシン（Ａ）−、シチジンＣＣ’）−、グアノシン（Ｇ）−およびウ ラシル（Ｕ）−制御細孔ガラス（ＣＰＧ、　Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、　Ｎｅｅｄｈ ａｍ、　ＭＡ）を含む混合物でＤＮＡ合成機の４つのカラムを充填した。特定の ヌクレオチド塩基が望まれる場合の結合工程では、各々のカラムに決められたホ スホアミダイトが加えられた。各々の“ランダム”結合工程では、各々のカラム へ４つすべてのホスホアミダイトの等モルの混合物が加えられた。 実施例１から６に従って製造されたオリゴヌクレオチド群は、Ｍａｎｉａｔｉｓ 、　ｅｔ　ａｌ、′分子クローニング：実験室？　−１−ユアル′″　（Ｃｏｌ ｄ　Ｓｐｒｉｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）に記載されているごとく、〔γ− ”Ｐ）ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射性標識すること ができる。 表２に示されているように、実施例３および６に従って２４セツトのホスホロチ オエート　オリゴヌクレオチドが製造された。 表　２ １　ＡＮＮＮＮＮ　１３　ＮＮＮＣＮＮ３　ＣＮＮＮＮＮ　１４　ＮＮＮＣＮＮ ３　ＧＮＮＮＮＮ　１５　ＮＮＮＣＮＮ４　ＴＮＮＮＮＮ　１６　ＮＮＮＣＮＮ ３　ＮＡＮＮＮＮ　１７　ＮＮＮＮＣＮ７　ＮＣＮＮＮＮ　１８　ＮＮＮＮＣＮ ７　ＮＧＮＮＮＮ　１９　ＮＮＮＮＣＮ８　ＮＴＮＮＮＮ　２０　ＮＮＮＮＣＮ ７　ＮＮＡＮＮＮ　２１　ＮＮＮＮＮＡ１０　ＮＮＣＮＮＮ　２２　ＮＮＮＮＮ Ｃ１１ＮＮＧＮＮＮ　２３　ＮＮＮＮＮＧ１２　ＮＮＴＮＮＮ　２４　ＮＮＮＮ ＮＴＮＮＮＮＣＮ７ついて、非ランダム化のどの順序が最も高い初期比活性を与 えるかを決定するために標的分子に対する活性が試験された。 配列ＴＮＮＮＸＮＮＮＴＢ　（式中、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかであり 、ＸはＡ、Ｇ、ＣおよびＵの一つであり、およびＢはビオチンである）を持つオ リゴヌクレオチド群が実施例３および６に従って製造された。放射性標識化の部 位を提供するため、配列は両端でチミジンに隣接するように設計されている。配 列ＴＮＮＮＸＮＮＮＴを持つ対照物もまた実施例３および６に従って製造される 。 配列ＮＮＮＸＮＮＮＵを持つオリゴヌクレオチド群は、実施例１および６に従い 、ヌクレオシド類似体２’−０−ノニルアデノシン、Ｎ６−イミダシイルブロビ ルグアノシン、２′−〇−アミノペンチルシチジン、２°−〇−ペンチルーアデ ノシン、２゛−０−ペンチル−グアノシン、２’−０−ペンチル−シチジン、３ ′−末端２′−〇−メチルウリジンおよび６−アミノ−２−ヒドロキシメチル− １−ヘキサノールの一つまたはそれ以上を取り込ませて製造される。ヌクレオシ ド、２゛−〇−ノニルアデノシン、Ｎ６−イミダシイルブロビルグアノシン、２ ’−０−アミノペンチルシチジン、２′−〇−ペンチルーアデノシン、２’−０ −ペンチル−グアノシン、２’−０−ペンチル−シチジン、３′−末端２’−０ −メチルウリジンは、１９９１年１月１１日に出願されたＰＣＴ　ＵＳ９１１０ ０２４３に記載されている方法を改変して製造された。６−アミノ−２−ヒドロ キシメチル−１−ヘキサノールは市販品として入手可能である。当業者には既知 の方法によりヌクレオシドを修飾し、対応するホスホアミダイトを得る。 ｒａｓ　４７−ｍｅｒステム／ループＲＮＡは酵素的に合成され、常法により＄ ２ｐ末端標識され、ゲルで精製された。４つのセットを含む２′−〇−メチルオ リゴヌクレオチド類似体ライブラリーは、実施例４および６に従って製造された 。 各々のセットについてＲＮＡ標的に対する結合性が試験され、“セットＫｏ”が 以下の方法に従って決定された。 第１ラウンドではｒａｓＲＮＡ標的は約１０ｐＭの濃度で、４つのランダム、２ ゛−〇−メチルオリゴヌクレオチドのセットの各々と（５，１０，５０および１ ００μＭの濃度で）１００ｍＭ　ＮａＣ１および１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚから成る 緩衝液中でインキュベートされた。ハイブリダイゼーションは３７℃で４時間実 施され、続いて５０ｍＭ　ＮａＣｌを加えたトリス−ホウ酸緩衝液（ＴＢＥ）中 、２０％アクリルアミドゲル上２５Ｗで４時間行う電気泳動により、結合と非結 合物質を分離した。ゲルを乾燥し、放射活性バンドをホスホイメージヤ−（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で可視化した。ｒａｓ　ステム／ループ標 的のみはゲル上に観察される最も低いバンド（最も高い移動度）である。この標 的がオリゴヌクレオチド（非放射活性）に結合するとｒａｓ標的の移動度が減少 し、ゲル上のより高い位置のバンド（複合体）にシフトする。図２Ａにおいて、 オリゴヌクレオチドのセットＮＮＮＮＧＮＮＮＮまたはＮＮＮＮＵＮＮＮＮでは 結合はみられなかったが、ＮＮＮＮＡＮＮＮＮは１００μＭでわずかなシフトを 示し、ＮＮＮＮＣＮＮＮＮは５０μＭオリゴヌクレオチド濃度で５０％以上の標 的を結合形ヘシフトさせた。 次に、このプロトコールを第２ラウンドで繰り返した。ｒａｓＲＮＡ標的は約１ ０ｐＭの濃度で、上記の方法に従って合成された４つのランダムオリゴヌクレオ チドのセットの各々（１および１０μＭの濃度で）とインキュベートされて、図 ２Ｂのゲルイメージを与え、これはオリゴヌクレオチドのセットＮＮＮＮＣＮＡ ＮＮＳＮＮＮＮＣＮＧＮＮおよびＮＮＮＮＣＮＵＮＮは極微の結合しか示さない ことを示している。ＮＮＮＮＣＮＣＮＮは１μＭで標的の２５％以上、および１ ０μＭで標的の約５０％のシフトを示している。第３ラウンドではｒａｓＲＮＡ 標的は約０．１および１μＭの濃度のランダムオリゴヌクレオチドのセットとイ ンキュベートされて図２０のゲルイメージを与え、これはＮＮＣＮＣＮＣＮＮの みが標的の５０％を超えるシフトにより示される結合性を示した。 表３はｒａｓＲＮＡ標的に結合する“勝利者”配列を決定するために実施された ９つのラウンドの結果を示している。Ｋ、はμＭでの値である。 表　３ １　ＮＮＮＮＸＮＮＮＮ　６５，５３６　２２　１０　＞１００　＞１００２　 ＮＮＮＮＣＮＸＮＮ　１６．３８４　＞１０　４　＞１０　＞１０３　ＮＮＸＮ ＣＮＣＮＮ　４．０９６　＞１０　０．５　＞１０　＞１０４　ＮＮＣＸＣＮＣ ＮＮ　１，０２４　＞１０　０．１５　＞１０　＞１０５　ＮＮＣＣＣＸＣＮＮ 　２５６　０．０ｇ　＞１　０．４　＞１６　ＮＮＣＣＣＡＣＸＮ　６４　０． ０５　＞０．５　０．０８　＞０．５７　ＮＸＣＣＣＡＣＡＮ　１６　＞０．１ 　＞０．１　０．０３　＞０．１８　ＮＧＣＣＣＡＣＡＸ　４　０．０５　０． ０２　０．０５　０．０４２９　ＸＧＣＣＣＡＣＡＣｌ　Ｏ，０３０，０５０， ０２０，０１＊　ここでＮはＡ％Ｃ，ＧまたはＴのいずれかである：林　Ｑはセ ットの複雑さである。 表３に示したごと（、合成およびスクリーニングの各々のラウンドで最も低いＫ Ｏ（μＭ）を持つセットを区別することは困難ではなかった。 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応で期待されるごとく、オリゴヌ クレオチドの中心に近い位置が先端の５°または３゛末端の位置よりもＫｏに対 してより大きな影響を与えていた。例えばラウンド４における３°位を固定する 試みでは、セットを区別する結果が得られなかった。明瞭な勝利者を与える別の 位置がラウンド４で選択され、次にオリゴマーの中心から末端に向かって配列が 評価された。本方法により選択された最終オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの 一末鎖ループ領域と相補的である。 実施例１２ 単純ヘルペスウィルス−１の阻害検出のためのＥＬＩＳＡＨ５Ｖ−１外皮糖蛋白 質Ｂ　（ｇＢ）の検出のためのＥＬＩＳＡは、正常皮膚線維芽細胞（Ｎ　ＨＤ　 Ｆ　、　Ｃ１ｏｎｅｔｉｃｓ）を０゜０５ＰＦＵ／細胞の感染多重度でＨＳＶ− １（ＫＯ８）で感染させることにより実施された。ウィルス吸着後、細胞を洗浄 し、オリゴヌクレオチドを含む増殖培地で処理した。オリゴヌクレオチドは４つ の濃度で３重のウェルにおいて試験された。細胞は感染後４８時間で固定され、 ＥＬＩＳＡによりＨＳＶ−１ｇＢ抗原の存在を検定した。標準偏差は典型的には １０％以内であった。 １６．３４８の４つのセット中の６５，５３６の独特な８−ｍａｒの群が実施例 ３および６に従って製造され、各々実施例９に記載した方法に従って細胞培養物 中のヒト単純ヘルペスウィルスタイプ（ＨＳＶ−１）に対する活性がスクリーニ ングされた。表４に示されているごとく、合成およびスクリーニングの各々のラ ウンドにおいて、より有効性の増加した抗ウィルス活性が観察され、各々のラウ ンドで最も活性の高いセット（ボールド体）は困難なく識別された。 表　４ ＩＣａ。（μＭ）　Ｘ＝ ラウンド　配　列＊　Ｑ林　ＡＣＧＴ Ｉ　ＮＮＮＸＮＮＮＮ　１６．３４８　＞１００　＞１００　７０　＞１００２ 　ＮＮＮＧＮＮＸＸ　４，０９６　＞１００　＞１００　３０　＞１００３　Ｎ ＮＸＧＮＸＮＧ　１．０２４　＞１００　＞１００　１５　＞１００４　ＮＸＮ ＧＮＧＮＧ　２５６　３０　３０　５　２０５　ＸＧＮＧＮＧＮＧ　６４　２０ 　２０　１．５　２０６　ＧＧＮＧＸＧＮＧ　１６　１０　１０　１．５　１０ ７　ＧＧＸＧＧＧＮＧ　４　１．３　１．３　０．５　１．３８　ＧＧＧＧＧＧ ＸＧ　１　０．７　０．７　１．１　０．４＊　式中ＮはＡｌＣ，ＧまたはＴの いずれかである；林　Ｑは組の複雑さである。 固定されたグアノシンを含むオリゴヌクレオチドのセットは、最後のラウンドを 除いて、Ｈ３Ｖスクリーニングのすべてのラウンドで最も高い活性を持っており 、その結果、はとんどすべての固定化位置にグアノシンが選択された。 実施例１４ ＨＳＶ−１抗ウイルス活性のための８−ｍａｒオリゴヌクレオチドを含むＧ４コ アの最適化 Ｇ４コアを含む最適８−ｍａｒを決定するため、オリゴヌクレオチドカセットＧ ＧＧＧを用い、表５に示したようなオリゴヌクレオチド群が設計された。 表　５ 配　列＊　最も活性　Ｘ＝　ＩＣ，。（μＭ）ＮＮＧＧＧＧＮＸ　Ａ　２．５ ＮＮＧＧＧＧＸＡ　Ｔ　１．Ｉ ＸＮＧＧＧＧＴＡ　Ｇ　Ｏ，８ ＧＸＧＧＧＧＴＡ　Ｃ０，８ ＊　ＮはＡ、ＧＳＴまたはＣのいずれかである；表５に示したごとく、Ｇ４コア を囲む配列の最適化により、合成およびスクリーニングの４回のラウンドにおい て抗ウィルス活性は３倍増加し、Ｇ４コアが活性に最も重要な要素ではあるが、 有効性は隣接する配列により調整しうることをヒト免疫不全ウィルス阻害検出の ためのアッセイヒトＴ−リンパ芽球様ＣＥＭ細胞株は１０％ウシ胎児血清、グル タミンおよび抗生物質を加えたＲＰＭ１１６４０中で対数増殖期に維持された。 アッセイの日に細胞を洗浄し、トリバンブルー排除により計数した。これらの細 胞（ＯＥＭ−ＩＩＩＢ）は９６ウエルマイクロタイタープレートの各々のウェル に、ウェル当り５Ｘ１０”細胞で播種された。各々のウェルに細胞を加えた後、 化合物を指定された濃度および一連の半対数希釈で添加した。直ちに、感染性Ｈ ＩＶ−１１＋−が、感染後６日月に完全に細胞を殺す感染多重度で各々のウェル に加えられた。 ３７℃で６日インキュベートした後、各々のウェルにテトラゾリウム色素ＸＴＴ を加える前に、上澄液の一部を採取した。ＸＴＴは生きている細胞によりホルマ ザンブルー生成物に代謝され、それはＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｖ ｍａｘ　Ｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒにより分光学的に定量的に測定される。ＸＴ Ｔアッセイは試験化合物添加の結果としてのＨＩＶ誘発細胞致死の防護を測定し ている。上澄液の一部はＸＴＴアッセイで決定された活性の確認に利用された。 感染細胞から放出されたＨＩＶの量を測定するため、逆転写酵素アッセイおよび ｐ２４ＥＬＩｓＡが実施された。細胞致死が防がれることにより、ＸＴＴアッセ イでは光学密度が増加し、ウィルス逆転写酵素およびｐ２４コア蛋白質のレベル が減少した。 各々１６，３４８の４つのセット中の６５，５３６の独特な８−ｍｅｒの群が実 施例３および６に従って製造され、実施例１２に従って活性がスクリーニングさ れた。化合物のセットは表６に記載されている。表６は４つのオリゴヌクレオチ ドのセットに対するＩＣ，。（μＭ）を示している。 表　６ セット　配　列＊　ＩＣ，。（μＭ） Ａ　ＮＮＮＮ　Ａ　ＮＮＮ　不活性 Ｂ　ＮＮＮＮ　ＣＮＮＮ　不活性 ＣＮＮＮＮ　Ｇ　ＮＮＮ　５ Ｄ　ＮＮＮＮ　Ｔ　ＮＮＮ　不活性 ＊　ここでＮはＡｌＣ，ＧまたはＴのいずれかである。 セットＣは５μＭでＨＩＶ誘発細胞変性効果の５０％阻害を示したが、一方、他 の化合物のセットは２５μＭまでの濃度で不活性であった。 ヒト皮膚線維芽細胞のコンフルエント単層培養物を血清を含まない線維芽細胞増 殖培地中の指定された濃度のオリゴヌクレオチドのセットで処理した。３７℃で 一夜インキュベーシコン後、オリゴヌクレオチドを含む培養培地を除き、細胞を 洗い、ヒトサイトメガロウィルスを０．１ｐｆｕ／細胞の感染多重度で加えた。 ３７℃で２時間吸着させた後ウィルスを除き、指定された濃度のオリゴヌクレオ チドのセットを含む新鮮な線維芽細胞増殖培地を加えた。感染２日後、古い培養 培地を除き、指定された濃度のオリゴヌクレオチドのセットを含む新しい線維芽 細胞増殖培地に置き換えた。感染６日後に培地を除き、９５％エタノールを加え て細胞を固定した。ＨＣＭＶ抗原発現は、酵素結合イムノアッセイを用いて定量 された。アッセイ中の一次反応性抗体は遅発性ＨＣＭＶウィルス蛋白質に対して 特異的なモノクローナル抗体であった。検出はビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ を二次抗体として用い、続いてストレプトアビジン結合Ｂ−ガラクトシダーゼと の反応により達成された。クロロフェノールレッドＢ−Ｄ−ガラクトピラノシド を添加して発色させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５７５ナノメーター の吸光度を測定した。結果は非処理対照物に対するパーセントで表現されており 、以下のごと（計算された： １６．４３８の４つのセット中の６５，５３６の独特なホスホロチオエート８− ｍｅｒの群は実施例３および６に従って製造され、実施例１４に従ってヒトサイ トメガロウィルスに対する活性についてスクリーニングされた。化合物のセット Ａ　（ＮＮＮＮＡＮＮＮ）　、Ｂ　（ＮＮＮＮＧＮＮＮ）　、Ｃ（ＮＮＮＮＣＮ ＮＮ）およびＤ　（ＮＮＮＮＴＮＮＮ）（式中ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれ かである）が１０から２００μＭの濃度範囲でスクリーニングされた。図３に示 された結果は、化合物のセットＣがサイトメガロウィルスに対して最も強い活性 を持ち、１００μＭの量で約２０％の阻害および２００μＭの量で９０％阻害を 起こしていることを示している。組ＡＳＢおよびＤは極微の活性か抗ウィルス活 性がないことを示している。 ベロ細胞は、ラウンド体のセットを培地に１１０７Ｚおよび１００μＭの濃度で 直接培地に加えることにより一夜前処理した。−要処理後、細胞は０．０５のＭ ＯＩでインフルエンザＡ　／’　Ｐ　Ｒ／　８で感染させた。感染後、細胞をオ リゴヌクレオチド存在下４８時間インキュベートした。インキュベーション後線 輪をメタノールで固定し風乾させた。単層は次にマトリックス蛋白質についてＥ ＬＩＳＡで検定された。−次抗体はインフルエンザＡウィルスのマトリックス蛋 白質に特異的なモノクローナル抗体であった（Ｂ　Ｏ２０Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ ｓ　ｆｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ）　、二次抗体はアルカリ性ホスファターゼと結合 されたヤギ抗マウスＩｇＧ　（ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）であった。 基室はＡＴＴＯ−ＰＩ（Ｏ３試薬（ＪＢＬ）であった。Ｍｆｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃ ｙｔｏｆｌｕｏｕｒ　２３００を用いて蛍光が測定され、励起は４５Ｑｎｍで発 光は５８０μｍで読みとった。 １６．４３８の４つのセットの６５．５３６の独特なホスホロチオエート８−ｍ ｅｒの群は実施例３および６に従って製造され、実施例１６に記載したごとくイ ンフルエンザＡウィルスに対する活性についてスクリーニングされた。化合物の セットＡ　（ＮＮＮＮＡＮＮＮ）　、Ｂ　（ＮＮＮＮＧＮＮＮ）　、Ｃ（ＮＮＮ ＮＣＮＮＮ）およびＤ　（ＮＮＮＮＴＮＮＮ）（式中ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴの いずれかである）は１０μＭおよび１００μＭでスクリーニングされた。図４に 示したごと（、結果はセットＣおよびＤは最大の抗ウィルス活性を持っており、 セットＣはウィルス活性の約５０％阻害を示し、セットＤは約３５％阻害を示し た。ＡおよびＢはわずかな活性しか示さなかった。 データは一つの実験の三つのデータ値の相加平均および標準誤差である。 配列ＮＮＮＮＸＮＮＮ　（式中Ｎはアデニン、グアニン、シトシンまたはチミジ ンのいずれかであり、Ｘはアデニン、グアニン、シトシンまたはチミジンの一つ である）を持つ２０セツトを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチド群が実 施例３および６に従って製造される。セットは表７に示されている。 表　７ セット　修　飾 １−４　天然 ５−８　２’−０−メチル ９−１２　２°−〇−プロピル １３−１６　２°−〇−ペンチル １７−２０　２°−０−ノニル インターフェロンを誘導するために最も有効であるセットを決定するためにＥＬ ＩＳＡが実施された。最も有効なセット中のヌクレオチドが固定され、固定され た５番目の位置および４番目の位置にアデニン、グアニン、シトシンまたはチミ ジンの一つを持つセットが合成された。インターフェロンを誘導するのに最も有 効であるセットを決定するためにＥＬＩＳＡが実施される。すべての位置が決定 されるまで各工程を繰り返す。 ＨＩＶ　ＴＡＲ要素はすべてのＨＩＶ転写体の５°末端に観察される構造ＲＮＡ 　（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ　ＲＮＡ）である。ＨＩＶ　ＴＡＲ要素（図５Ａに図 示）に対する４つのオリゴヌクレオチドのセットの結合を分析するためゲルシフ トが使用された。 標的ＲＮＡは、転写活性化蛋白質ｔａｔに結合するのに必要とされる３つの塩基 バルジを持っている。各々ピレン類似体（Ａ＊で示されている）を含む表８に示 されるオリゴヌクレオチドが、実施例５および６に従って製造された。 表　８ セット　配　列　ＩＤ番号： Ｉ　ＮＮＮＡ＊　ＮＡＮＮＮＮ　３ ２　ＮＮＮＡ＊　ＮＣＮＮＮＮ　４ ３　ＮＮＮＡ＊　ＮＧＮＮＮＮ　２ ４　ＮＮＮＡ＊　ＮＵＮＮＮＮ　５ アツセイは１５μＭ濃度の放射活性標識標的および０．１．１．１０および１０ ０μＭの濃度の各々のセットを用いた。セットから標的への分子の結合のため、 より遅い移動度の複合体が生じる。図５Ｂに示されたごと（、セット３が最もＴ ＡＲと結合し、１００μＭのオリゴヌクレオチドのセットは標的の約５０％のシ フトを起こした。１００μＭのオリゴヌクレオチドのセット２は標的の約２５％ のシフトを起こした。セット１および４はほとんど標的のシフトを起こさなかっ た。６番目の位置がＧとして固定されるであろうし、池の位置は合成およびスク リーニングの第２ラウンドで非ランダム化されるであろう。 実施例２３ ＨＩＶ　ｇａｇ−ｐｏｌ　二本鎖に結合するランダムオリゴヌクレオチドのセッ ト 二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合は、デユーブレックスＲＮＡまたはＤＮＡの 主溝中に入って来る第三の鎖が結合される二本鎖複合体を形成することにより可 能である。オリゴマーと標的との間の相互作用の分子的性質は、本技術の実施に は既知である必要はない。従って、オリゴマーとＤＮＡまたはＲＮＡ間の新規相 互作用が結合の原因になるであろうことは可能である。図６にはｇａｇ−ｐ。 ｌ　ステムループとして知られているＨＩＶの二本鎖ＲＮＡ構造が図示されてい る（ＷｉｃｋｅｒｓおよびＥｃｋｅｒ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ）　ａ二本鎖相互作用の設計においての一つの制限は、標的として長 く伸びたホモプリンを持っている必要があることである。ｇａｇ−ｐａｌ　ステ ムループの３゛（右）側は、ステムの底辺（のシトシン対を除いてホモプリンで ある。ｇａｇ−ｐｏｌ　ステムループに結合する最良のオリゴヌクレオチドを決 定するため、フーグスティーン塩基対によりｇａｇ−ｐａｌ　ステムループのプ リンに富む鎖に結合するように、一群のＲＮＡオリゴヌクレオチドのセットが設 計され、実施例２および６に従って製造された。配列は２つのシトシンの位置に おいてランダム化され、表９に示した配列が提供された。ｇａｇ−ｐｏｌ　ステ ムループへの結合は、実施例８で前に記載したようなゲルシフト分析を以下のよ うに修正して測定した：放射性標識ｇａｇ−ｐａｌ　ＲＮＡは１００ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，２５ｍＭトリス酢酸ｐＨ５，２ｍＭＭｇＣｌ宜、１ｍＭスペルミジン中で オリゴヌクレオチドとインキュベートされた。ゲルは１５％アクリルアミドであ り、泳動緩衝液に５０ｍＭ　ＮａＣ１゜２ｍＭ　ＭｇＣ１１が加えられた。 表９の結果はラウンド１においてオリゴヌクレオチドセットＣＣＣＵＵＣＣＣＮ ＵＣ（配列ＩＤ番号：８）がＫＩ＋＝５０で標的に対して最も強い親和性を持っ ていたことを示している。第２ラウンドでは８番目のＣが固定され、９番目の位 置が決定された。第２ラウンドではオリゴヌクレオチドＣＣＣＵＵＣＣＣＣＵＣ （配列ＩＤ番号：１２）がＫＯ＝１で標的に対して最も強い親和性を持っていた 。このように二本鎖結合配列が最適化できる。 表　９ セット　配　列　Ｋｏ　（μＭ）　配列ＩＤ番号：Ａ、　ＣＣＣＵＵＣＣＡＮＵ Ｃ＞１００　６Ｂ、　ＣＣＣＵＵＣＣＧＮＵＣ＞１００　７ｃ、　ＣＣＣＵＵＣ ＣＣＮＵＣ５０８ Ｄ、　ＣＣＣＵＵＣＣＵＮＵＣ１００９ラウンド２ セット　配　列　Ｋ、（μＭ）　配列ＩＤ番号：Ａ、　ＣＣＣＵＵＣＣＣＡＵＣ １０１０Ｂｘ　ＣＣＣＵＵＣＣＣＧＵＣ１０１１ｃ、　ＣＣＣＵＵＣＣＣＣＵＣ １１２ Ｄｔ　ＣＣＣＵＵＣＣＣＵＵＣ１０１３配列ＮＮＧＧＧＧＮＸ　（式中、ＮはＡ 、Ｇ、ｌ’たｌ；１ｃ（７）いずれカテあり、ＸはＡ、Ｇ、ＴまたはＣの一つで ある）を持つ放射性標識オリゴヌクレオチド群が実施例３．６および７に記載し たごとく製造された。この群の、ウィルスにより産生される転写因子であるＨＩ Ｖ　ｔａｔ蛋白質に対する結合性が実施例２４に記載したごとくスクリーニング された。結合活性が観察された。 受容体および放射性標識リガンドはＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮから得られたキットと して供給された。アッセイは使用説明書に従って実施された。ランダム２′−〇 −メチル群は実施例４および６に従って製造され、配列ＧＣＧＮＮＮＡＮＮＮＮ ＮＮＣＧＣ（配列ＩＤ番号＋１４）：ＧＣＧＮＮＮＧＮＮＮＮＮＮＣＧＣ（配列 ＩＤ番号：１５）；ＧＣＧＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮＣＧＣ（配列ＩＤ番号：１６） ；ＧＣＧＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＣＧＣ（配列ＩＤ番号：１７）（式中、ＮはＡ、 Ｇ、ＣまたはＵのいずれかである）を持つ４つのセットが提供された。各々のセ ットはキット中に提供されるアッセイ緩衝液で１００μＭに希釈され、使用プロ トコールのごと（受容体およびリガンドとインキュベートされた。インキュベー ション後、リガンド結合受容体はガラスフィルターを通しての吸引濾過により非 結合物から分離された。結合リガンドは次にフィルターからシンチレーション液 に溶出し、シンチレーションカウンターで計数された。受容体およびリガンドは 、フィルターへの非特異的結合（ＮＳＢ）のレベルを確立するために過剰の非標 識リガンドと、および完全な結合レベルを確立するためにオリゴヌクレオチドの セットを入れないで（ゼロ）インキュベートされた。 表１０に示された結果は、セットＢがエンドセリン−１に対して最も活性であっ たことを示している。 表　１０ ＣＰＭ　ＮＥＴ　ＣＰＭ　％■ ＮＳＢ　２８４　−　− ゼロ　１４２１　１１４０　１００ Ａ　１２２３　９３９　８２ Ｂ　１２００　９１６　８０ Ｃ１３４７１０６３９３ Ｄ　１３３０　１０４６　９２ 実施例２６ ０イコトリエンＢ４へのランダム２′−０−メチルオリゴヌクレオチドの結合受 容体および放射性標識リガンドはＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮから得られたキットとし て供給された。アッセイは使用説明書に従って実施された。ランダム２゛−Ｏ− メチル群は実施例４および６に従って製造され、配列ＧＣＧＮＮＮＡＮＮＮＮＮ ＮＣＧＣ（配列［）番号：１４）；ＧＣＧＮＮＮＧＮＮＮＮＮＮＣＧＣ（配列Ｉ Ｄ番号：１５）；ＧＣＧＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮＣＧＣ（配列ＩＤ番号：１６）； ＧＣＧＮＮＮＵＮＮＮＮＮＮＣＧＣ（配列ＩＤ番号：１７）（式中、ＮはＡ、Ｇ 、ＣまたはＵのいずれかである）を持つ４つのセットが提供された。各々のセッ トはキット中に提供されるアッセイ緩衝液で１００μＭに希釈され、次に使用プ ロトコールに従って受容体およびリガンドとインキュベートされた。インキュベ ーション後、リガンド結合受容体はガラスフィルターを通した吸引濾過により非 結合物から分離された。結合リガンドは次にフィルターからシンチレーション液 中へ溶出され、シンチレーションカウンターで計数された。 受容体およびリガンドは、フィルターへの非特異的結合のレベルを確立するため に過剰の非標識リガンドと、（ＮＳＢ）および完全結合のレベルを確立するため にオリゴヌクレオチドのセットを加えないで（ゼロ）インキュベートされた。表 １１に示された結果は、セットＤがロイコトリエンＢ４に対して最も活性であっ たことを示している。 表　１１ ＣＰＭ　ＮＥＴ　ＣＰＭ　％■ ＮＳＢ　３８３　−　− ゼロ　１０６３　６８０　１００ Ａ　９８９　６０６　８９ Ｃ９００５１７７６ Ｄ　８９４　５１１　７５ 実施例２７ ウィルス受容体ＣＤ４に対するホスホロチオエートおよび２゛−０−メチルオリ ゴヌクレオチドの結合 オリゴヌクレオチドの２つの群が製造された。ホスホロチオエートオリゴヌクレ オチド群は実施例３および６に従って製造された。２゛−０−メチルオリゴヌク レオチド群は実施例４および６に従って製造された。両方の群とも配列ＮＮＮＮ ＴＮＮＮＮ　（式中、ＮはＡＳＣ，ＧまたはＴのいずれかである）を持っている 。 ランダムオリゴヌクレオチドの各々の群の１００ピコモルの５゛末端を〔γ−” Ｐｌ　ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより高い比活性で標識した 。 各々（７）標識群は１００ｍＭ　ＫＣＩ、１．５ｍＭ　ＭｇＣＩｔ　、０．２ｍ ＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ　ＤＴＴおよび２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ から成る緩衝液（ｐＨ＝７．９）中、室温で蛋白質ＣＤ４と反応させた。指示さ れているごとく非特異的拮抗剤としてポリｄＩ・ｄＣが添加された。１時間後、 蛋白質結合オリゴヌクレオチドが１ｘＴＢＥ緩衝液中６％非変性（ｎａｔｉｖｅ ）アクリルアミドゲル上で電気泳動することにより非結合体から分離された。ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチドアッセイの結果は図７に示されており、オ リゴヌクレオチドの蛋白質への結合を示している（矢印）。２゛−０−メチルの セットでは結合は検出されなかった。ｔａｔ　蛋白質に対するホスホロチオエー トブールの結合も観察されていた。 実施例２８ ポリペプチドのランダム群の製造およびその結合アッセイ本発明の実施にはポリ ペプチドを使用してもよい。モノマーアミノ酸は適当な前駆体化学物質および当 業者が入手可能な機器（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入可能な 機器のような）を用いて容易にベブチドヘオリゴ化される。 合成の最初のラウンドは以下のごと（である：表　１２ 位置　１２３４５６７８９ セットＩ　ＸＸＸＸＢＸＸＸＸ セット２　ＸＸＸＸＡＸＸＸＸ セット３　ＸＸＸＸＷＸＸＸＸ セ−ｚ）４　ＸＸＸＸＬＸＸＸＸ ここで、Ａは酸性アミノ酸として定義され、Ｂは塩基性アミノ酸として定義され 、Ｗは中性アミノ酸として定義され、Ｌは親油性アミノ酸として定義され、Ｘは 上記定義群からの任意のアミノ酸として定義される。 上記のセットの各々は、Ｄｕｓｔｆｎ、　Ｍ、Ｌ、およびＳｐｒｉｎｇｅｒ、　 Ｔ、＾、、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。 １！ｌｕ８．１０７．３２１に記載されているようなＩＣＡＭ−１媒介の細胞結 合が測定される細胞培養アッセイを用いて、細胞接着の阻害について試験された 。最も低いポリペプチド濃度で最も大きな細胞接着の阻害を示すセットが選択さ れる。 ５位の選択されたアミノ酸を保持しながらプロトコールが繰り返され、最適の結 合配列に達するまで各々の残った位置を続けて試験する。 配列３’ｄＢＡＢ　ＡＧＡ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　ＧＣＧ　５’　（配列ＩＤ番号： １８）（式中、Ｂはビオチンである）を持つ０．２μＭの標的オリゴヌクレオチ ドは室温で３０分間、実施例４．６および７に従つて製造され、配列ＮＮＮ　Ｎ ＣＮ　ＣＮＮ　（式中、Ｎはアデニン、シトシン、チミジンまたはグアニンの（ ゛）ずれかである）を持つ１０μＭの放射性標識２゛−０−メチルオリゴヌクレ オチド群および標的に対し相補的な（ｄＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＣ；配列ＩＤ番 号：１９）０．１μＭの放射性標識オリゴヌクレオチドとインキュベートした。 標的オリゴヌクレオチドおよび結合された放射性標識オリゴヌクレオチドは、ス トレプトアビジン被覆マグナシエアービーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上に捕捉し、ビ ーズを洗浄し、上澄液を除去した。捕捉された放射性標識オリゴヌクレオチドを ビーズから除き、ポリアクリルアミドゲル上で展開した。図８は試料ゲルを示し ており、“勝利者”が過剰のランダム配列オリゴヌクレオチドから分離できるこ とを示している。この方法を繰り返した。レーン１は捕捉に先立って元の溶液を １＝１０に希釈して実施された。レーン２は１：１０に希釈された上澄液である 。レーン３は最初のラウンドからの結合物質である。“勝利者”配列のバンドは 明らかであり、最初の矢印へ移動している。レーン４および５は、各々２回目の ラウンドからの上澄液（１：１０希釈）および結合物質である。２回目のラウン ドでは”勝利者”バンドはより純度が高くなっている。レーン６および７は、各 々第３のラウンドからの上澄液（１：１０希釈）および結合物質である。上澄液 は放射性標識オリゴヌクレオチドを含んでいない。第３のラウンドで非特異的オ リゴヌクレオチドをほとんどあるいは全く含まない“勝利者”バンドが得られた 。 配列ＮＮＮＮＮＮＮＮ　（式中、Ｎはアデニン、グアニン、チミジンまたはシト シンのいずれかである）を持つオリゴヌクレオチドの群が実施例３および６に従 って製造された。この群は［γ−３２Ｐ）ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキ ナーゼを用いて標識された。 ９６−ウエルニドロセルロースフイルターマニホールドの個々のウェルで、下記 の蛋白質をリン酸緩衝化塩溶液に溶解してインキュベートする：プラスミノーゲ ン活性化因子Ａ２、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子βおよびｇｐｉ２ｏ。対照ウ ェルには、リン酸緩衝化塩溶液のみを加える。フィルターを洗浄する。オリゴヌ クレオチドの標識群の一部を各々のウェルに加え、室温で１０分間インキュベー トする。フィルターを洗浄し、オリゴヌクレオチドの蛋白質に対する結合が起こ っているかどうかを決定するために各々のウェルのバックグラウンドを超える値 を計数する。 実施例３１ ニトロセルロース結合蛋白質に対して結合親和性を持つホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドの決定 ８つの位置の長さのオリゴヌクレオチドの４つのセットを含むオリゴヌクレＡ。 チド恋似体群が実施例３および６に従って製造され、各々のセ・ットのニトロセ ルロース結合蛋白質に対する結合が試験され、実施例２７に従って同定された。 各々の蛋白質に対してウェル当りの計数値により示される最も強い親和性を持つ セ・ソトが各々の蛋白質に対しての“勝利者セット”である。第１ラウンドの結 果力（表１３に示されている。 表　１３ 位置　１２３４５６７８　蛋白質勝利者セットＩ　ＮＮＮＮＡＮＮＮ　プラスミ ノーゲン活性化因子Ａ。 腫瘍壊死因子α セット２ＮＮＮＮＧＮＮＮ　勝利者なしセット３　Ｎ　Ｎ　Ｎ　Ｎ　ＣＮ　Ｎ　 Ｎ　ｇｐ１２０セット４ＮＮＮＮＴＮＮＮ　腫瘍壊死因子βフィルターを洗浄し ウェルを計数する。第２のラウンドにおいて５番目の位置をＡに固定し、プラス ミノーゲン活性化因子Ａ２および腫瘍壊死因子αを含むウェル中で試験するため 、セット（ＮＮＮＡＡＮＮＮ）、（ＮＮＮＧＡＮＮＮ）、（ＮＮＮＣＡＮＮＮ） および（ＮＮＮＴＡＮＮＮ）が製造された。同様にｇｐｉ２０および腫瘍壊死因 子βウェルの試験のため、各々５番目の位置がＣＩ＝固定されたおよび５番目の 位置がＴに固定されたセ・ソトが製造された。８回目のラウンドで４つの標的蛋 白質すべてに対する゛勝利者“配列が決定される。 実施例３２ ぢ互ｐグぜ方Ｉ邸腑對上耕とＬμ潰Δ区弘」鏡μ唯を持つオリゴヌクレオチドの 決定 ８つの位置の長さのオリゴヌクレオチドの４つのセ・ソトを含む第１ノゴヌクレ オチド類似体群が実施例３および６に従って製造され、ここで各々のセット１１ その５番目の位置にアデニン、グアニン、チミジンおよびシトシンの異なった一 つを持ち、残りの位置はランダム化され、群：ＮＮＮＮＡＮＮＮ、ＮＮＮＮＧＮ ＮＮ。 ＮＮＮＮＴＮＮＮ、およびＮＮＮＮＣＮＮＮが提供される。各々のセットはアニ オン交換カラムで荷電により副分画される。各々の副分画はゲルシフトアッセイ により標的蛋白質に対する親和性について試験される。５番目の位置にアデニン を持つセットからの副分画が最も高い結合親和性を持っている。次のラウンドに おいては、５番目の位置にアデニンを含むように５番目の位置が固定され、各々 のセットは４番目の位置に異なったヌクレオチドを持っており、群ＮＮＮＡＡＮ ＮＮ、ＮＮＮＴＡＮＮＮＳＮＮＮＧＡＮＮＮ、およびＮＮＮＣＡＮＮＮが提供さ れる。これらのセットは再びアニオン交換カラムを用いて荷電により副力画され 、この副分画の標的蛋白質に対する親和性がゲルシフトアッセイにより試験され る。各々の位置が決定されるまでこの工程が繰り返される。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ；４７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＧＵＧＧＵＧＧＵＧ　ＧＧＣＧＣＣＧＵＣＧ　ＧＵＧＵＧＧＧＣＡＡ　ＧＡＧ ｔｌＧＣＧＣＩＩＧ　ＡＣＣＡＵＣＣ’　４７配列番号：２ 配列の長さ：１０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数−一本鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：４ 他の情報：アデニンのピレン類似体 配列 ＮＮＮＡＮＧＮＮＮＮ　１０ 配列番号：３ 配列の長さ＝１０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉ　ｃ）配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置−４ 他の情報：アデニンのピレン類似体 配列 ＮＮＮＡＮＡＮＮＮＮ　１０ 配列番号＝４ 配列の長さ：１０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉ　ｃ）配列の特徴； 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位ｆｆｉ：４ 他の情報：アデニンのピレン類似体 配列 ＮＮＮＡＮＣＮＮＮＮ　１０ 配列番号：５ 配列の長さ・１０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列の特徴： 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置＝４ 他の情報：アデニンのピレン類似体 配列 ＮＮＮＡＮＵＮＮＮＮ　１Ｇ 配列番号＝６ 配列の長さ＝１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数−一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＣＣＵＵＣＣＡＮＵ　Ｃ１１ 配列番号＝７ 配列の長さ：１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｔｃ）配列 ＣＣＣＵＵＣＣＧＮＵ　Ｃ１１ 配列番号＝８ 配列の長さ：１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列の種［：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＣＣＵＵＣＣＣＮＵ　Ｃ１１ 配列番号：９ 配列の長さ＋１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＣＣｔｌＵＣＣＩＩＮＵ　Ｃ１１ 配列番号：１０ 配列の長さ＋１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＣＣＵＵＣＣＣＡＵ　Ｃ、１１ 配列番号：１１ 配列の長さ＋１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＣＣＵＵＣＣＯＧ［Ｉ　Ｃ、、１１ 配列番号：１２ 配列の長さ＋１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｚｅｎｏｍｉ　ｃ）配列 ＣＣＣ１１ＵＣＣＣＣＵ　Ｃ１１ 配列番号：１３ 配列の長さ＋１１塩基対 配列の型２核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列の種類二ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｒｎｆ　ｃ）配列 ＣＣＣＵＵＣＣＣＵＵ　Ｃ１１ 配列番号：１４ 配列の長さ＋１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＣＧＮＮＮＡＮＮＮ　ＮＮＣＧＣ１５配列番号：１５ 配列の長さ＋１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＣＧＮＮＮＧＮＮＮ　ＮＮＣＧＣ１５配列番号：１６ 配列の長さ＋１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＣＧＮＮＮＣＮＮＮ　ＮＮＣＧＣ１５配列番号：１７ 配列の長さ＋１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー；直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＣＧＮＮＮＵＮＮＮ　ＮＮＣＧＣ１５配列番号＝１８ 配列の長さ＋１３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー−直線状 配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＡＡＧＡＣＧＴＣＴＴ　ＧＣＧ　１３ 配列番号：１９ 配列の長さ＋１２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉ　ｃ）配列 ＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＣ１２ 配列番号：２０ 配列の長さ：２９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直線状 配列の種ＩＩ：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＧＣＣＡＧ＾υＣＵＧ　ＡＧＣＣＵＧＧＧＡＧ　ＣＵＣＵＣＵＧＧＣ２９配列番 号：２１ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＲＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）配列 ＣＵＧＧＣＣＵＵＣＣＵＡＣＡＡＧＧＧＡＡ　ＧＧＣＣＡＧ　２６Ｃ・Ｇ −Ｃ −Ｕ −Ｇ −Ｕ ロロくＱ 浄書（内容に変更ない 配列１番号　２゜ 手続補正書 平成　６年　６月／７＠

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. １．標的分子に対して特異的活性を有するオリゴヌクレオチドを決定する方法で あって、 （ａ） （ｉ）セットのオリゴヌクレオチド中の共通位置を画定する；および（ｉｉ）そ れぞれのセットが該共通位置において異なる塩基ユニットを有し、該共通位置に ない塩基ユニットがランダム化されているように、該オリゴヌクレオチドのセッ トを合成する； ことにより、複数のオリゴヌクレオチドのセットを含む群であって、それぞれの オリゴヌクレオチドが少なくとも４塩基のユニットを含む群を作製する；（ｂ） それぞれのセットについて、標的分子に対する活性をアッセイする；および （ｃ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む方法。
2. ２．さらに、 （ｄ）複数のオリゴヌクレオチドのセットを含むさらなる群であって、それぞれ のセットがあらかじめ画定された共通位置において、あらかじめ選択されたセッ ト中のあらかじめ画定された共通位置に現れる塩基ユニットを有する群を作製す る；該さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された共通位置において異 なる塩基ユニットを有し、オリゴヌクレオチドの画定された共通位置ではない位 置の塩基ユニットがランダム化されており；（ｅ）それぞれのセットについて、 標的分子に対する特異的活性をアッセイする；および （ｆ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む、請求項１記載 の方法。
3. ３．請求項２記載の工程が繰り返し行われることを特徴とする方法。
4. ４．前記群が約３から約２０個のセットを含む、請求項１記載の方法。
5. ５．前記群が４個のセットを含む、請求項１記載の方法。
6. ６．前記オリゴヌクレオチドが長さ４から約２０のヌクレオチドユニットである 、請求項１記載の方法。
7. ７．前記オリゴヌクレオチドのセットの群が検出可能なように標識されている、 請求項１記載の方法。
8. ８．前記オリゴヌクレオチドのセットの群が放射性標識されている、請求項７記 載の方法。
9. ９．前記アッセイが、ゲルシフト・アッセイ、ビオチニル化標的のストレプトア ビジン捕捉、フィルター結合アッセイまたはアフィニティ・クロマトグラフィー である、請求項１記載の方法。
10. １０．前記オリゴヌクレオチドのセットの群が立体的に束縛されている、請求項 １記載の方法。
11. １１．前記標的分子が核酸である、請求項１記載の方法。
12. １２．前記標的分子が炭水化物である、請求項１記載の方法。
13. １３．前記標的分子が蛋白質である、請求項１記載の方法。
14. １４．前記標的分子が糖蛋白質である、請求項１記載の方法。
15. １５．前記標的分子が免疫グロブリン、レセプター、レセプター結合リガンド、 抗原、酵素または転写因子である、請求項１記載の方法。
16. １６．前記標的分子がホスホリパーゼ、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、インタ ーロイキン、ロイコトリエン、プラスミノーゲン活性化因子、プロテインキナー ゼ、細胞接着分子、リポキシゲナーゼ・ヒドロラーゼ、トランスアシラーゼまた は転写因子である、請求項１記載の方法。
17. １７．前記標的分子がカンジダ、パピローマウイルス、エプスタインバーウイル ス、ライノウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイ ルス、インフルエンザウイルスまたはサイトメガロウイルスの領域である、請求 項１記載の方法。
18. １８．前記標的分子がＲＮＡ分子またはそのフラグメントである、請求項１記載 の方法。
19. １９．前記標的分子がヒト免疫不全ウイルスの領域である、請求項１記載の方法 。
20. ２０．前記標的分子がヒト免疫不全ウイルスのＴＡＲ要素である、請求項１記載 の方法。
21. ２１．前記標的分子がヒト免疫不全ウイルスのｇａｇ−ｐｏｌステムループであ る、請求項１記載の方法。
22. ２２．前記標的分子がｒａｓの４７塩基対ステムループである、請求項１記載の 方法。
23. ２３．前記標的分子がヘルペスウイルスの領域である、請求項１記載の方法。
24. ２４．前記標的分子がサイトメガロウイルスの領域である、請求項１記載の方法 。
25. ２５．前記標的分子がインフルエンザウイルスの領域である、請求項１記載の方 法。
26. ２６．前記標的分子がエンドセリン−１である、請求項１記載の方法。
27. ２７．前記標的分子がロイコトリエンＢ−４である、請求項１記載の方法。
28. ２８．前記標的分子がｇｐ１２０である、請求項１記載の方法。
29. ２９．前記標的分子がＨＩＶｔａｔ蛋白質である、請求項１記載の方法。
30. ３０．前記標的分子がインターフェロンの産生を誘導する、請求項１記載の方法 。
31. ３１．標的分子を同定する方法であって、（ａ）選択された分子の群を固体支持 体に結合させる；（ｂ）固体支持体を、検出可能なように標識された、すべての 位置がランダム化されたオリゴヌクレオチドとともに、結合条件下でインキュベ ートする；（ｃ）１つまたはそれ以上の標的分子に対するオリゴヌクレオチドの 活性を示すオリゴヌクレオチドの結合の存在または不在を検出する；の各工程を 含む方法。
32. ３２．さらに、 （ｄ） （ｉ）セットのオリゴヌクレオチド中の共通位置を画定する；および（ｉｉ）そ れぞれのセットが該共通位置において異なる塩基ユニットを有し、該共通位置に ない塩基ユニットがランダム化されているように、該オリゴヌクレオチドのセッ トを合成する； ことにより、複数のオリゴヌクレオチドのセットを含む群であって、それぞれの オリゴヌクレオチドが少なくとも４塩基のユニットを含む群を作製する；（ｅ） それぞれのセットについて、標的分子に対する活性をアッセイする；および （ｆ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む請求項３１記載 の方法。
33. ３３．さらに、 （ｇ）複数のオリゴヌクレオチドのセットを含むさらなる群であって、それぞれ のセットがあらかじめ画定された共通位置において、あらかじめ選択されたセッ ト中のあらかじめされた共通位置に現れる塩基ユニットを有する群を作製する； 該さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された共通位置において異なる 塩基ユニットを有し、オリゴヌクレオチドの画定された共通位置ではない位置の 塩基ユニットがランダム化されており；（ｈ）それぞれのセットについて、標的 分子に対する特異的活性をアッセイする；および （ｉ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む、請求項３２記 載の方法。
34. ３４．請求項３３記載の工程が繰り返し行われることを特徴とする方法。
35. ３５．標的分子に対して特異的活性を有するオリゴヌクレオチドを決定する方法 であって、 （ａ） （ｉ）セットのオリゴヌクレオチド中の共通位置を画定する；および（ｉｉ）そ れぞれのセットが該共通位置において異なる塩基ユニットを有し、該共通位置に ない塩基ユニットがランダム化されているように、該オリゴヌクレオチドのセッ トを合成する； ことにより、複数のオリゴヌクレオチドのセットを含む群であって、それぞれの オリゴヌクレオチドが少なくとも４塩基のユニットを含む群を作製する；（ｂ） オリゴヌクレオチドの群を副分画して、オリゴヌクレオチドのセットの副分画を 得る； （ｃ）それぞれの副分画について、標的分子に対する活性をアッセイする；およ び （ｄ）最も高い活性を有する副分画が由来するセットを選択する；の各工程を含 む方法。
36. ３６．さらに、 （ｅ）複数のオリゴヌクレオチドのセットを含むさらなる群であって、それぞれ のセットがあらかじめ画定された共通位置において、あらかじめ選択されたセッ ト中のあらかじめされた共通位置に現れる塩基ユニットを有する群を作製する； 該さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された共通位置において異なる 塩基ユニットを有し、オリゴヌクレオチドの画定された共通位置ではない位置の 塩基ユニットがランダム化されており；（ｆ）オリゴヌクレオチドの群を副分画 して、オリゴヌクレオチドのセットの副分画を得る； （ｇ）それぞれの副分画について、標的分子に対する特異的活性をアッセイする ；および （ｈ）最も高い活性を有する副分画が由来するセットを選択する；の各工程を含 む、請求項３５記載の方法。
37. ３７．請求項３６記載の工程が繰り返し行われることを特徴とする方法。
38. ３８．標的分子に対して特異的活性を有するオリゴヌクレオチドカセットを決定 する方法であって、 （ａ） （ｉ）セットのオリゴヌクレオチド中の共通位置を画定する；および（ｉｉ）そ れぞれのセットが該共通位置において異なる塩基ユニットを有し、該共通位置に ない塩基ユニットがランダム化されているように、該オリゴヌクレオチドのセッ トを合成する； ことにより、複数のオリゴヌクレオチドのセットを含む群であって、それぞれの オリゴヌクレオチドが少なくとも４塩基のユニットを含む群を作製する；（ｂ） それぞれのセットについて、標的分子に対する活性をアッセイする；（ｃ）最も 高い活性を有するセットを選択する；（ｄ）複数のオリゴヌクレオチドのセット を含むさらなる群であって、それぞれのセットがあらかじめ画定された共通位置 において、あらかじめ選択されたセット中のあらかじめされた共通位置に現れる 塩基ユニットを有する群を作製する；該さらなる群のそれぞれのセットが，追加 の画定された共通位置において異なる塩基ユニットを有し、オリゴヌクレオチド の画定された共通位置ではない位置の塩基ユニットがランダム化されており；（ ｅ）それぞれのセットについて、標的分子に対する特異的活性をアッセイする； および （ｆ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含み、該工程（ｄ） 、（ｅ）および（ｆ）が繰り返し行われて、それぞれの位置が画定された該カセ ットを得る；の各工程を含む方法。
39. ３９．標的分子に対して特異的活性を有するオリゴヌクレオチドを決定する方法 であって、 （ａ） （ｉ）セットのオリゴヌクレオチドのブランキング区域中の共通位置を画定する ；および （ｉｉ）それぞれのセットが該共通位置において異なる塩基ユニットを有し、該 共通位置にない塩基ユニットがランダム化されているように、該オリゴヌクレオ チドのセットを合成する； ことにより、複数のオリゴヌクレオチドのセットを含む群であって、それぞれの オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのあらかじめ画定されたオリゴヌクレオチ ドカセットおよび少なくとも１つのブランキング区域を含む群を作製する；（ｂ ）それぞれのセットについて、標的分子に対する活性をアッセイする；および （ｃ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む方法。
40. ４０．さらに、 （ｄ）複数のオリゴヌクレオチドのセットを含むさらなる群であって、それぞれ のセットがあらかじめ画定された共通位置において、あらかじめ選択されたセッ ト中のあらかじめされた共通位置に現れる塩基ユニットを有する群を作製する； 該さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された共通位置において異なる 塩基ユニットを有し、オリゴヌクレオチドの画定された共通位置ではない位置の 塩基ユニットがランダム化されており；（ｅ）それぞれのセットについて、標的 分子に対する特異的活性をアッセイする；および （ｆ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む、請求項３９記 載の方法。
41. ４１．請求項４０記載の工程が繰り返し行われることを特徴とする方法。
42. ４２．前記カセットが請求項３８記載方法に従って作製される、請求項３９記載 の方法。
43. ４３．標的分子に対して特異的活性を有するポリペプチドを決定する方法であっ て、 （ａ） （ｉ）セットのポリペプチド中の共通位置を画定する；および（ｉｉ）それぞれ のセットが該共通位置において異なるアミノ酸ユニットを有し、該共通位置にな いアミノ酸ユニットがランダム化されているように、該ポリペプチドのセットを 合成する； ことにより、複数のポリペプチドのセットを含む群であって、それぞれのポリペ プチドが少なくとも４アミノ酸ユニットを含む群を作製する；（ｂ）それぞれの セットについて、標的分子に対する活性をアッセイする；および （ｃ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む方法。
44. ４４．さらに、 （ｄ）複数のポリペプチドのセットを含むさらなる群であって、それぞれのセッ トがあらかじめ画定された共通位置において、あらかじめ選択されたセット中の あらかじめされた共通位置に現れるアミノ酸ユニットを有する群を作製する；該 さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された共通位置において異なるア ミノ酸ユニットを有し、ポリペプチドの画定された共通位置ではない位置のアミ ノ酸ユニットがランダム化されており；（ｅ）それぞれのセットについて、標的 分子に対する特異的活性をアッセイする；および （ｆ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む、請求項４３記 載の方法。
45. ４５．請求項４４記載の工程が繰り返し行われることを特徴とする方法。
46. ４６．前記群が約３から約２０個のセットを含む、請求項４３記載の方法。
47. ４７．前記ポリペプチドが長さ約１２から約２０のアミノ酸ユニットである、請 求項４３記載の方法。
48. ４８．前記標的分子が核酸である、請求項４３記載の方法。
49. ４９．前記標的分子が炭水化物である、請求項４３記載の方法。
50. ５０．前記標的分子が蛋白質である、請求項４３記載の方法。
51. ５１．前記標的分子が糖蛋白質である、請求項４３記載の方法。
52. ５２．記標的分子が免疫グロブリン、レセプター、レセプター結合リガンド、抗 原、酵素または転写因子である、請求項４３記載の方法。
53. ５３．前記標的分子がホスホリパーゼ、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、インタ ーロイキン、ロイコトリエン、プラスミノーゲン活性化因子、プロテインキナー ゼ、細胞接着分子、リポキシゲナーゼ、ヒドロラーゼまたはトランスアシラーゼ である、請求項４３記載の方法。
54. ５４．前記標的分子がカンジダ、パピローマウイルス、エプスタインバーウイル ス、ライノウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイ ルス、インフルエンザウイルスまたはサイトメガロウイルスの領域である、請求 項４３記載の方法。
55. ５５．標的分子に対して特異的活性を有するポリペプチドを決定する方法であっ て、 （ａ） （ｉ）セットのポリペプチド中の共通位置を画定する；および（ｉｉ）それぞれ のセットが該共通位置において異なるアミノ酸ユニットを有し、該共通位置にな いアミノ酸ユニットがランダム化されているように、該ポリペプチドのセットを 合成する； ことにより、複数のポリペプチドのセットを含む群であって、それぞれのポリペ プチドが少なくとも４アミノ酸ユニットを含む群を作製する；（ｂ）ポリペプチ ドの群を副分画して、ポリペプチドのセットの副分画を得る； （ｃ）それぞれの副分画について、標的分子に対する活性をアッセイする；およ び （ｄ）最も高い活性を有する副分画が由来するセットを選択する；の各工程を含 む方法。
56. ５６．さらに、 （ｅ）複数のポリペプチドのセットを含むさらなる群であって、それぞれのセッ トがあらかじめ画定された共通位置において、あらかじめ選択されたセット中の あらかじめされた共通位置に現れるアミノ酸ユニットを有する群を作製する；該 さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された共通位置において異なるア ミノ酸ユニットを有し、ポリペプチドの画定された共通位置ではない位置のアミ ノ酸ユニットがランダム化されており；（ｆ）ポリペプチドの群を副分画して、 ポリペプチドのセットの副分画を得る； （ｇ）それぞれの副分画について、標的分子に対する活性をアッセイする；およ び （ｈ）最も高い活性を有する副分画が由来するセットを選択する；の各工程を含 む、請求項５５記載の方法。
57. ５７．請求項５６記載の工程が繰り返し行われることを特徴とする方法。
58. ５８．標的分子に対して特異的活性を有するポリペプチドカセットを決定する方 法であって、 （ａ） （ｉ）セットのポリペプチド中の共通位置を画定する；および（ｉｉ）それぞれ のセットが該共通位置において異なるアミノ酸ユニットを有し、該共通位置にな いアミノ酸ユニットがランダム化されているように、該ポリペプチドのセットを 合成する； ことにより、複数のポリペプチドのセットを含む群であって、それぞれのポリペ プチドが少なくとも４アミノ酸ユニットを含む群を作製する；（ｂ）それぞれの セットについて、標的分子に対する活性をアッセイする；（ｃ）最も高い活性を 有するセットを選択する；（ｄ）複数のポリペプチドのセットを含むさらなる群 であって、それぞれのセットがあらかじめ画定された共通位置において、あらか じめ選択されたセット中のあらかじめされた共通位置に現れるアミノ酸ユニット を有する群を作製する；該さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された 共通位置において異なるアミノ酸ユニットを有し、ポリペプチドの画定された共 通位置ではない位置のアミノ酸ユニットがランダム化されており；（ｅ）該さら なる群のそれぞれのセットについて、標的分子に対する活性をアッセイする；お よび （ｆ）最も高い活性を有する副分画が由来するセットを選択する；の各工程を含 み、該工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返し行って、それぞれの画定され た位置を有する該カセットを得る；の各工程を含む方法。
59. ５９．標的分子に対して特異的活性を有するポリペプチドを決定する方法であっ て、 （ａ） （ｉ）セットのポリペプチドのブランキング区域中の共通位置を画定する；およ び （ｉｉ）それぞれのセットが該共通位置において異なるアミノ酸ユニットを有し 、該共通位置にないアミノ酸ユニットがランダム化されているように、該ポリペ プチドのセットを合成する； ことにより、複数のポリペプチドのセットを含む群であって、それぞれのポリペ プチドが少なくとも１つのあらかじめ画定されたポリペプチドカセットおよび少 なくとも１つのブランキング区域を含む群を作製する；（ｂ）それぞれのセット について、標的分子に対する活性をアッセイする；および （ｃ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む方法。
60. ６０．さらに、 （ｄ）複数のポリペプチドのセットを含むさらなる群であって、それぞれのセッ トがあらかじめ画定された共通位置において、あらかじめ選択されたセット中の あらかじめされた共通位置に現れるアミノ酸ユニットを有する群を作製する；該 さらなる群のそれぞれのセットが，追加の画定された共通位置において異なるア ミノ酸ユニットを有し、ポリペプチドの画定された共通位置ではない位置のアミ ノ酸ユニットがランダム化されており；（ｅ）それぞれのセットについて、標的 分子に対する特異的活性をアッセイする；および （ｆ）最も高い活性を有するセットを選択する；の各工程を含む、請求項５９記 載の方法。
61. ６１．請求項６０記載の工程が繰り返し行われることを特徴とする方法。
62. ６２．前記カセットが請求項５８記載の方法に従って作製される、請求項５９記 載の方法。