JPH07501942A - 抗ガン免疫療法用ベクター構成体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １３、ヒト、マカク、イヌ、ラット及びマウスから成るグループの中から選択さ れる、請求の範囲第１２項に記載の標的細胞。

１４、　請求の範囲第１１項の組換え型ウィルスの感染を受けた標的細胞。

＋５．　ヒト、マカク、イヌ、ラット及びマウスから成るグループの中から選択 される、請求の範囲第１４項に記載の標的細胞。

１６、　請求の範囲第１Ｏ項の組換え型ウィルスの感染を受けた標的細胞。

＋７．治療的活性物質として使用するための、変性された細胞成分の免疫原性の 非腫瘍形成性形態を含む組成物。

１８、治療的活性物質として使用するための、請求の範囲第１項乃至第８項に記 載の組成物。

＋９．治療的活性物質として使用するための、請求の範囲第９項乃至第１１項に 記載の組成物。

２０、選択された腫瘍細胞を処理するための薬剤を製造するための、変性された 細胞成分の免疫原性非腫瘍形成性形態を含む組成物の利用。

２１、選択された腫瘍細胞を処理するための薬剤を製造するための、請求の範囲 第１項乃至第８項に記載の組成物の利用。

２２、選択された腫瘍細胞を処理するための薬剤を製造するための、請求の範囲 第９項乃至第１１項に記載の組成物の利用。

浄書（内容に変更なし） 明細書 抗ガン免疫療法用ベクター構成体 技術分野 本発明は、一般に抗ガン免疫療法に関する。より特定的には本発明は腫瘍細胞に 対する免疫応答を生成することにより選択された腫瘍細胞を殺す方法に関する。

発明の背景 ガンは、アメリカにおける全死亡率の５分の１を占め、第２の主要死因である。

ガンは標準的に、細胞個体群の無制御の分割によって特徴づけられる。この無制 御の分割は、標準的には腫瘍の形成を導き、この腫瘍はその後その他の部位に転 移しつる。

原発性充実腫瘍は一般に外科的切除により適切に処理することができる。しかし ながら細形腫瘍をもって訪れる患者の大部分は原発腫瘍部位以外にも微小転移巣 を有している。外科手術のみによる治療の場合、これらの患者の約７０％は、ガ ンを再発させることになる。

外科手術以外に、数多くのガンが現在細胞障害性化学療法薬（例えばビンクリス チン、ビンブラスチン、シスプラチンなど）及び／又は放射線療法が関与する組 合せ療法でも治療されている。しかしながらこのアプローチのもつ１つの問題点 は、放射線療法及び化学療法作用物質が正常な組織に対する毒性をもち、往々に して生命を脅す副作用を生み出すということにある。さらに、これらのアプロー チは庄々にしてきわめて高い緩解不全率（ガンのタイプに応じて最高９０％）を もつ。

化学療法及び放射線療法に加えて、数多くの人々が、ガン細胞を除去するため患 者自身の免疫系を強化又は増大させることを試みてきた。いくつかの免疫療法で は、免疫系が腫瘍細胞を破壊するのを刺激するため細菌又はウィルス性成分が利 用されてきた。このような成分の例としては、免疫調節剤（例えばＢＣＧ　、内 毒素及び混合細菌ワクチン）、インターフェロン（α、β及びγ）、インターフ ェロン誘発物質（例えばＢｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ及びさまざまなウィ ルス）及び胸腺因子（例えばチモシン分画５及びチモシンアルファりがある（一 般的に［ガンのバイオ療法の原理Ｊ　Ｏｌｄｈａｍ（ｅｄ）、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒ ｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８７参照）。このような作用物質は一般にアジュバン トとして及び動物の腫瘍モデルにおける非特異的刺激物質として育用ガンの治療 はリンフ才力インも同様に利用されてきた。簡単に言うと、リンフ才力インはさ まざまな細胞によって分泌され、一般に免疫応答の生成において特定の細胞に対 し効果をもたらす。リンフ才力インの例としては、インターロイキン（ＩＬ）　 −１，−２，−３及び−４ならびにＧ　−ＣｓＦ、　ＧＭ　−ＣＳＦ及びＭ　− ＣＳＦといったコロニー刺激因子が含まれる。最近になって、１つのグループが 、腫瘍細胞に対し細胞障害性をもつ細胞を大量に拡張させ産生させるため末梢血 細胞を刺激するのにＩし−２を利用した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｎ、Ｅｒｇｌ。

Ｊ、Ｍｅｄ　３１３：１４８５−１４９２．１９８５）。

その池のグループは、抗体を媒体とした抗ガン療法の使用を提案している。簡単 に言うと、正常細胞に比ベガン細胞に独特のものであるか又はより優勢である成 る種の細胞表面抗原を認識する抗体を開発することが可能である。これらの抗体 っまり［マジックカプセルＪは単独で使用することもできるし或いは又腫瘍細胞 を特異的にターゲティングし殺すため毒素と接合させることもできる（Ｄｉｌｌ ｍａｎ。

「抗体療法Ｊガンバイオ療法の原理、Ｏｌｄｈａｍ（ｃｄ、　）Ｒａｖｅｎ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｉ、ｔｄ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８７）。例えば、Ｂａ１ｌ　ｅｔ　ａｔ（Ｂ１ｏｏｄ ６２：１２０３−１２１０．１９８３）は、急性骨髄性白血病を患う幾人かの患 者を白血病に特異的ないくつかのモノクローナル抗体のうちの単数又は複数のも ので治療をし、治療中循環する白血病細胞の著しい減少という結果を得た。同様 にして、例えば黒色腫、結腸直腸ガン、前立腺ガン、乳ガン及び肺ガンを含むさ まざまな腫瘍を治療するため療法的に毒素と接合された抗体を使用した者もいた （Ｄｉｌｌｍａｎ　、前出、を参照）。しかしながら１つの問題点は、はとんど のモノクローナル抗体がマウス由来のものであり、従ってマウス抗体に対する過 敏性が特に反復した療法の後のその効力を制限しているという点にある。共通の 副作用としては、発熱、発汗及び悪寒、皮疹、関節炎及び神経麻痺が含まれる。

従って、腫瘍の誘発又は進行に対する天然の宿主防御を増大させることのできる 作用物質は、先行技術の方法の細胞障害性副作用無（、緩解速度を増大させ患者 の生存率を高めることができる。

本発明はこのような作用物質を提供し、さらにその他の関連する利点を提供する 。

発明の要約 本発明は、通常選択された腫瘍細胞と結びつけられる変性された細胞成分を用い て選択された腫瘍細胞を破壊するための方法を提供する。１つの態様においては 、混血動物に対して、通常選択された腫瘍細胞と結びつけられた変性された細胞 成分の少なくとも１つの免疫原性非腫瘍形成性形態の発現を誘導するベクター構 成体に対して投与する段階を含む、選択された腫瘍細胞を破壊するための方法が 提供されている。本発明のもう１つの態様の範囲内では、（ａ）温血動物から細 胞をとり出す段階、（ｂ）通常選択された腫瘍細胞が含まれる。もう１つの実施 態様においては、例えばΔｒａｓ″１１゜と結びつけられた変性された細胞成分 の少なくとも１つの免疫原性非腫瘍形成性形態の発現を誘導するベクター構成体 を取り出した細胞に対して投与する段階、及び（Ｃ）細胞を温血動物の体内に戻 し、選択された腫瘍細胞か破壊されるようにする段階を含む、温血動物において 選択された腫瘍細胞を破壊するための方法が提供されている。当業者にとっては 明白であるように、細胞が取り出される動物は、それを戻す動物と同じである必 要はない。ただし好ましくはこれらの動物は組織適合性を有しているべきである 。さらに、本発明内に逆転写した後の結果として得られたプロウィルスのタンパ ク質産生のことを意味している。本発明のさまざまな実施態様の範囲内では、ベ クター構成体は組換え型レトロウィルスによって支持されていてもよいし、或い は、アデノ随伴ウィルス、カナリア痘ウィルス、アデノウィルス及びポックスウ ィルスから成るグループの中から選ばれたものといったその他の組換え型ウィル スによって支持されていてもよい。代替的には、変性された細胞成分の免疫原性 形態はインビトロで製造され得、適切なアジュバント好ましくは細胞免疫の誘発 を導くアジュバントと共に患者に投与することができる。

本発明のもう１つの態様においては、変性された細胞成分の少なくとも１つの免 疫原性非腫瘍形成性形態の発現を誘導するベクター構成体か提供されている。さ まざまな実施態様において、細胞成分は、点突然変異、欠失又は染色体転座のい ずれによってでも変性されつる。その他の実施態様においては、変性された細胞 成分には、ｒａｓ”　、ｐ５３°、　Ｒｈ”　、ビルムス腫瘍遺伝子によりコー ドされた変性タンパク質、ユビキチン”　、ＤＣＣ、ＡＰＣ、ＭＣＣ、ｎｅｕ　 、変性レセプタ又はｂｃｒ／ａｂｌといった染色体転座の結果得られるポリペプ チドである。

Δｒａｓ”　’及びΔｒａｓ”’を含む非腫瘍形成性変性細胞成分が提供されて いる。本発明のその他の態様においては、変性された細胞成分はムチン０である 。同様に提供されているのは、例えばｒａｓ”及びｐ５３゛の両方の発現を誘導 するベクター構成体又はｒａｓ”　、ムチン°及びＤＣＣの発現を誘導するベク ター構成体などを含む、いくつかの変性された細胞成分を誘導するベクター構成 体である。

本発明のもう１つの態様においては、上述のベクター構成体を支持するため、組 換え型レトロウィルスならびにポリオウィルス、鼻炎ウィルス、ポックスウィル ス、アデノウィルス、パルボウイルス、ヘルペスウィルス及びシンドビスウイル スといったその他のウィルスが提供されている。これらの組換え型ウィルスの感 染を受けた標的細胞も同様に提供されており、これには、例えばヒト、マカク、 イヌ、ラット及びマウスの細胞から成るグループから標的細胞が選択される実施 態様も含まれている。

同様に提供されているのは、薬学的に受容できる担体又は希釈剤と組合わされた 形の上述の組換え型ウィルスを含む薬学組成物である。

本発明のこれらの及びその他の態様は、以下の詳細な説明を参照することによっ て明らかになるだろう。

図面の簡単な説明 図１は、プラスミド５Ｐ−Ｖａｔ”（ｔｏｏ）の構成を示す概略図である。

図２は、プラスミドＳＰ−Δ−ＶａｌＩ２の構成を示す概略図である。

図３は、プラスミドＮ　２−ｒａｓ−Ｖａｌ′２の構成を示す概略図である。

図４は、プラスミドＮ２−Δ−ｒａｓ−Ｖａｌ”の構成を示す概略図図５は、Ｋ Ｔ−３レトロウイルスバツクボーンへとクローニングされたムチンｃＤＮＡの概 略図である。

図６は、さまざまな細胞タイプからのムチンの発現を示すウェスクンプロ、、、 に′−′ｒ匁ス 図７は、いくつかのＢＣＩＯＭＢクローンについてのＣＴＬ応答を示すグラフで ある。

図８は、い（っかの異なるＢＣＩＯＭＢクローンについてのムチン発現のＦＡＣ ３分析である。

図９は、２つの８１６Ｆ１０クローンの腫瘍形成性を示す棒グラフである。

図１０は、８１６ＦＩＯ−ムチンクローンの注射を受けたマウス体内の防御を示 す棒グラフである。

発明の詳細な説明 本発明について記述する前に、本発明を理解する上でまず以下で使用するいくつ かの用語の定義について記述することが有益であるかもしれない。

「変性された細胞成分」というのは、細胞を腫瘍形成性のものにすることに結び つけられるか又は一般に腫瘍形成性の細胞を結びつけられるものの細胞を腫瘍形 成性のものにするのに必要とされることはなく又はそのために必須のものではな いタンパク質及びその他の細胞成分のことである。本発明の１つの態様において は、細胞成分の変性の前に、この細胞成分は、正常な細胞の成長及び調節にとっ て必須でありうる。例として挙げられるのは、細胞内タンパク質分解、転写調節 、細胞周期制御及び細胞間相互作用を調節するタンパク質である。変性後、細胞 成分はもはやその調節機能を果たさず、従って細胞は無制御の成長を受ける可能 性がある。このような変性された細胞成分の代表的例としては、ｒａｓ”　、ｐ ５３”　、　Ｒｂ”　、ビルムス潰瘍遺伝子によりコードされた変性タンパク質 、ユビキチン３、ＤＣＣ、＾ＰＣ及びＭＣＣ遺伝子によりコードされたタンパク 質ならびにｎｅｕ　、変性又は突然変異形態の甲状腺ホルモンレセプター、血小 板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプタ、インシュリンレセプター、上皮成長因子 （ＥＧＦ）レセプター及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ）レセプターといったレセ プター又はレセプター様の構造が挙げられる。本発明のその他の態様においては 、細胞成分は、通常この細胞成分を発現しない細胞タイプの中での発現によって 変性された状態となりつる。

例えば、ムチンは、正常な胸部又は膵臓の上皮以外の細胞タイプの中での発現の 時点で異常型グリコジル化を受け、従って「変性された」状態となる。これらの ならびにその池の細胞成分については以下でさらに詳しく説明し、又引用した参 考文献中で論述されている。

以下で引用した参考文献は全て本書にその全体が参考として内含されるものであ る。

［非腫瘍形成性Ｊというのは、ヌードマウスにおいて細胞形質転換をひき起こし たり腫瘍形成を誘発することのない変性された細胞成分のことである。腫瘍形成 性細胞成分を非腫瘍形成性細胞成分と区別する代表的な検定については、以下で 、又例４においてさらに詳しく記述されている。

本発明において使用されている［免疫原性」というのは、適切な条件下で免疫応 答をひき起こすことのできる変性された細胞成分のことである。この応答は細胞 により媒介されなくてはならず、同様に体液性応答も含んでいる。免疫原性を決 定するのに利用できる代表的検定については、以下と例５でさらに詳しく記述さ れている。

「ベクター構成体」というのは、問題の配列又は遺伝子（単数又は質を導入する ための方法が提供されている。これらの方法を利用し複数）を発現することので きる集合体のことをいう。ベクター構成体は、プロモーター要素を含んでいなく てはならず、好ましくは、ポリアデニル化を誘導するシグナルを含んでいる。さ らに、ベクター構成体は、転写された時点で問題の配列又は遺伝子（単数又は複 数）に作動的に連鎖され翻訳開始配列として作用する１つの配列を含んでいなく てはならない。好ましくはベクター構成体は同様にＮｅｏ、　５ＶｘＮｅａ、　 Ｔに、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール又はＤＨＰＲといっ た選択可能な標準、ならびに単数又は複数の制限部位及び翻訳終結配列も含むこ とができる。さらに、ベクター構成体がレトロウィルス内に置かれる場合、この ベクター構成体は、（すでに存在していない場合）レトロウィルスに適した長い 末端重複（ＬＴＲ，）及びパッケージングシグナルを含まなくてはならない。

上述のように、本発明は、選択された腫瘍細胞を破壊するために適した方法及び 組成物を提供する。本発明の１つの態様においては、通常選択された腫瘍細胞に 結びつけられる変性された細胞成分の少なくとも１つの免疫原性の非腫瘍形成性 形態の発現を誘導するベクター構成体を温血動物に対して投与する段階を含む方 法が提供されている。本発明のもう！っの態様においては、（ａ）温血動物から 細胞をとり出す段階、（ｂ）通常選択された腫瘍細胞と結びつけられる変性され た細胞成分の少なくとも１つの免疫原性の非腫瘍形成性形態の発現を誘導するベ クター構成体を、取り出した細胞に対し投与する段階、及び（Ｃ）温血動物に対 して細胞を戻し、選択された腫瘍細胞が破壊されるようにする段階を含む、温血 動物において選択された腫瘍細胞を破壊するための方法が提供されている。本発 明の第３の態様においては、免疫応答が生成され選択された腫瘍細胞か破壊され るような形で温血動物の体内に適切なアジュバントと共に変性された細胞成分に 対応する他の場所で製造されたタンパクのことである。細胞成分内で発生する変 性の代表例としては、点突て、変性された細胞成分と結びつけられている腫瘍細 胞を破壊する免疫応答を生成することができる。

簡単に言うと、外来性病原体を認識し防御する能力は、免疫系の機能にとって中 枢のものである、この免疫系は、免疫認識を通して「自己Ｊを［非自己Ｊ　（外 来性）と区別することができる。このことは、防御メカニズムが宿主組織に対し てよりもむしろ侵入する実体に対し確実に向けられるようにするために最も重要 である。免疫系の基本的特徴は、きわめて多形な細胞表面認識構造（レセプター ）及び侵入する病原体の破壊のためのエフェクターメカニズム（抗体及び細胞溶 解性細胞）の存在である。

細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）　ハ通常、ＣＤ３．　ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ −２，ＬＦＡ−１又はその類似体といった補助分子を伴うＭＨＣ分子と合わせて 、処理された病原体特異的ペプチドを表示することにより誘発される（例、Ａｌ ｔｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３８：５１２．１９８９）。細 胞媒介応答の刺激又は認識を強化するタンパク質をコードするその他の遺伝子も 同様に、この情況で使用することが可能である。ＭＨＣ（主要組織適合性）クラ ス■の分子と結びつけた状態での抗原ペプチドの体裁は、ＣＤ８”ＣＴＬの産生 を導く。ＭＨＣクラス■の分子と結びつけた体裁のペプチドは、抗体、ヘルパー 細胞及びＢ−細胞メモリーの産生を導き、ＣＤ４”ＣＴＬを誘発しつる。以下で 詳述する方法は、潜在的なりラス■−制限を受けた防御及び治療的ＣＴＬ応答な らびに体液性応答を誘発する有効な手段を提供する。

上述のとおり、変性された細胞成分というのは、細胞を腫瘍形成性にすることに 結びつけられているか又は、腫瘍形成性細胞全般に結びつけられているものの細 胞を腫瘍形成性にするために必要とされるものでも必須のものでもないタンパク 質及びその他の細胞成分公髪」人大茂ひ果１１！、坏転厘が含まれる。これらの 変性は、宿主免疫系が「自己Ｊとして認識できない変性された細胞成分を生成し 、かくして変性細胞成分を含む新生細胞又は新生物発生前細胞を除去するために 役立つ。

本発明の１実施態様においては、非腫瘍形成性の変性ｒａｓ（ｒａｓ”　）遺伝 子の発現を誘導するベクター構成体が提供されている。簡単に言うと、ｒａｓ” 遺伝子は、新生細胞と因果関係をもち実際、膵臓ガン、結腸ガン及び肺腺ガンと いった全く異なるさまざまなガンにおける腫瘍形成の誘発及び維持に必要となり うろことがら、魅力ある標的である。さらにｒａｓ’遺伝子は、新生物発生前腫 瘍の中にも見い出され、従って、悪性腫瘍の検出に先立って免疫介入療法を適用 することができる。

正常なｒａｓ遺伝子は、非腫瘍形成性であり、全ての哺乳動物に混存する。これ らの遺伝子は進化中の保存度がきわめて高く、細胞周期及び正常な成長特性の維 持において重要な役割を果たしていると思われる。正常なｒａｓタンパク質は、 ＧＴＰと結合しＧＴＰアーゼ活性をもつＧ−タンパク質てあり、外部環境から細 胞内部へシグナルを伝送し、かくして細胞がその環境に対し応答することができ るように作業に関与している。一方、ｒａｓ”遺伝子は、環境から細胞の挙動を 分離しかくして新生細胞の無制御の増殖を導くことにより、新生細胞の正常な成 長調節を変える。ｒａｓ遺伝子の突然変異は、早期に処理すれば腫瘍形成を防ぐ ことのできる発ガン現象の早期事象であると信じられている（Ｋｕｍａｒ　ｅｔ 　ａｌ、、ｒ新形成の開始に先立つｒａｓガン遺伝子の活性化Ｊ　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２４８：１１０１−１１０４．１９９０）。

ｒａｓ”遺伝子は、例えば膵臓、結腸及び肺の腺ガンを含む広範なガンの中て発 生する（下表１を参照） 表１ 腫瘍タイプ　ｒａｓ突然変異の発生率 膵臓線ガン　９０％ 結腸腺’！！　５０％ 結腸腺ガン　５ｏ９６ 精上皮’１　４０％ 肺腺ガン　３０％ を髄形成異常症候群　３０％ 急性を髄性白血病　３０％ 角質輔細胞腫　３０％ 甲状腺ガン　２５％ 黒色腫　２０％ 膀胱ガン　６％ さまざまなガンの中に見られるｒａｓ’遺伝子の中で起こる突然変異のスペクト ルはかなり制限されている。これらの突然変異は、正常なオン／オフスイッチを 構成性オン位置に変換することによりｒａｓタンパク質のＧＴＰアーゼ活性を変 性する。ｒａｓ”における腫瘍形成性突然変異はまず第１に（インビボで）　１ ２．１３及び６１という３つのコドンのみにおいて発生し、コドン１２における 突然変異がヒト及び動物の両方の腫瘍において最も優勢である。下表２は、さま ざまなヒトの腫瘍についてのコドン１２及び１３における突然変異の発生率を記 している（位置１２及び１３についての正常なコドンはそれぞれＧＧＴ及びＧＧ Ｃであり、その両方共アミノ酸グリシンをコードする）。

表２ 結腸直腸腺腫　３９％　３％〈１％　９％　２３％　２％　２３％又はガン腫 肺ガン１７％　４％　４％　４０％　３０％　＜１％　４５％表３はヒトのｒａ ｓを活性化する既知のインビボ突然変異（コドン１２、１３及び６１）ならびに インビボ形質転換活性をもつ潜在的突然変異をまとめている。簡単に言うと、イ ンビトロ形質転換活性をもつ潜在的突然変異は、発現時点でもう１つのアミノ酸 を産生ずるための正常なコドンの１核酸の系統的置換によって生成されつる（例 えばこの要領でその他のアミノ酸が位置１２で正常なグリシンに置換された）。

このような突然変異は、現在のところヒト又は動物において発生するものとわか っていないが、場合によってインビボで発生することが発見されたならば抗ガン 免疫療法の基礎として役立つ可能性がある。・ 表３ てコードされる新奇のタンパク質は、腫瘍形成性細胞の標識として使用でき、こ れらの新奇のコーディング領域に対して向けられた免疫応答は、変性配列（ｒａ ｓ”　）を含む腫瘍形成性細胞を破壊するのに利用できる。

本発明のもう１つの実施態様においては、変性されたｐ５３（ｐ５３°）遺伝子 の発現を誘導するベクター構成体が提供されている。簡単に言うと、ｐ５３は、 形質転換された細胞の抽出物内で当初発見され、従って最初ガン遺伝子として分 類された核リンタンパク質である（Ｌｉｎｚｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｅ、　Ｃ ｅ１ｌ　１７：４３−５２．１９７９；Ｌａｎｅ　ａｎｄ　ｃｒａＷｒｏｒｄ。

Ｎａｔｕｒｅ　２７８：２６１−２６３．１９７９）　、その後、当初のｐ５３ 　ｃＤＮＡクローンが１）５３の突然変異形態であることが発見された（Ｈｉｎ ｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

６３ニア３９−７４６．１９８９）。現在、ｐ５３は細胞周期を夏に調節する腫 瘍抑制遺伝子でありこの遺伝子の突然変異が腫瘍の形成を導くと思われている。

研究対象となった結腸ガンのうち、７５％〜８０％が両方の１）５３対立遺伝子 の喪失、っまり欠失を通して１つ、点突然変異を通して１つの対立遺伝子喪失を 示している。類似の突然変異が、肺ガン及び脳腫瘍及び乳房腫瘍でも見られる。

ｐ５３の突然変異の大部分（例えばｐ５３°１．　ｐ　ｓ　３−　ｔ、など）は 、アミノ酸残基１３０〜２９０の間でクラスター化されている。（Ｌｅｖｔｎｅ 　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３５］：４５３−４５６．１９９１参照のこと；同様に特異的突 然変異についてさらに詳しく記述している以下の参考文献も参照のこと：　Ｂａ ｋｅｒｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：２１７−２２１．１９８９； Ｎｉｇｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ３４２ニア０５−７０８．１９８９ （ｐ５３の突然変異は、遺伝子の保存度の高い４つの領域と一致する４つの「ホ ットスポット」においてクラスター化し、これらの突然変異はヒトの脳、乳房、 肺及び結腸の腫瘍の中に観察される）　；　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３４８：６８１−６８２．１９９０；Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：４９１−４９４．　＋９８９；　Ｉｇｇｏ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｌａｎｃｅｔ　３３５：６７５−６７９゜１９９０；Ｊａｍｅｓ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：２８５８−２ ８６２．１９８９；Ｍａｃｈａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ　１１：１３８ ４−１３８５．１９８８；Ｋｅｉｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ７４：２ ３１８−２３２４．１９８９；ＭＡｌｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２５０：１２３３−１２３８．１９９０；Ｂａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５０ニア７１７−７７２２．１９９１；Ｃｈｉｂａ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｏｎｅｏ−ｇｅｎｅ　（ガン遺伝子）５；１６０３−１６１０．１９９ ０（早期非小細胞肺ガンの病因が、コドン１３２−２８３の間での９５３遺伝子 中の体細胞突然変異に結びつけられている）　；　Ｐｒｏｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５：＋５７３−１５７９．１９９０　（アミノ酸１２ ６〜２２４をコードするＩ）５３遺伝子内の突然変異が、発発乳ガンにおいて同 定された）　：　Ｃｈｅｎｇ及びＨａｓｓ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ 、　１０：５５０２−５５０９．１９９０　；　Ｂａｒｔｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５　：　８９３−８９９．１９９０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８７：７５５ ５−７５５９．　！９９０；Ｍｅｎｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８７：５４３５−５４３９．　１９９０：Ｍｕｌｌｉ −ｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ８７：５８６３−５８６７、１９９０：及びＲｏｍａｎｏ　ａｔ　ａｌ 、、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　４：１４８３−１４８８．１９９０　（ヒト骨肉腫由来 細胞系統）１０Ｓ−ＳＬ内でのコドン１５６におけるｐ５３突然変異の同定）〉 。

ｐ５３遺伝子のいくつかの変性は、成る種の特異的毒素によるものでありうる。

例えばＢｒｅｓｓａｃ　ｅｔ　ａｌ、、（Ｎａｔｕｒｅ　３５０：４２９−４３ １．１９９１）は、肝細胞性ガン腫を患う患者におけるコドン２４９での特異的 Ｇ−Ｔ突然変異について記述している。想定されているこの突然変異の１つの原 因作用物質は、アフリカにおける食物汚染物質として知られている肝臓の発ガン 物質であるアフラトキシンＢ、である。

特に影響を受けている遺伝子の４つの領域は残基１３２−１４５．１７１−１７ ９．２３９−２４９　、及び２７２−２８６において起こっている。

特に問題となっている３つの「ホットスポットｊは、残基１７５．２４８及び２ ７３において起こっている（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３５１ ：４５３−４５６゜１９９１）。これらの変性ならびに前述のその他の変性は新 奇のコーディング配列（単数又は複数）を含むタンパク質（単数又は複数）の産 生を結果としてもたらす。これらの配列によりコードされる新奇のタンパク質は 、腫瘍形成細胞の標識として使用することができ、これらの新奇のコーディング 領域に対して向けられた免疫応答を利用して、変性した配列（ｐ５３”　）を含 む腫瘍形成細胞を破壊することが可能である。

本発明のもう１つの実施態様においては、変性Ｒｈ　（Ｒｈ＠）遺伝子の発現を 誘導するベクター構成体が提供されている。簡単に言うと、網膜芽細胞腫という のは、染色体バンド１３ｑ１４内にあるＲｂという呼称の遺伝子座の喪失に結び つけられる小児期の眼ガンである。この領域からの遺伝子がクローニングされて おり、これは約＋　１０ｋｄの核リンタンパク質を産生ずる（Ｆｒｉｅｎｄ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：６４３．１９８６；１、ｅｅ　ｅｔ　ａｔ 、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：１３９４．１９８７；及びＰｕｎｇ　ｅｔ　ａ ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ２３６：１６５７．　＋９８７）。

Ｒｂは、細胞増殖の負の調節遺伝子であると信じられており、転写制御及び細胞 周期調節において１つの役割をもつ。Ｒｈは核の中に見い出される少なくとも７ つのタンパク質に結合し、特に、Ｅ２Ｐ（Ｂａｇｃｈｉｅｔ　ａ［、、ｃｅｌｌ 　６２：６５９−６６９．１９９０）及びＤＲＴＦ（Ｓｈｉｕｊｉ及びＬａ　Ｔ ｈａｎｇｕｅ。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、Ｉｌ：１６８６−１６９５．１９９１）という 両方の呼称を与えられた細胞転写因子と関与していると思われる。Ｒｈは、細胞 増殖に関与するさまざまな核タンパク質を隔絶することによって細胞の成長を制 限するものと信じられている。

Ｒｈ遺伝子内での欠失が検出され、これは、Ｒｈ遺伝子が腫瘍形成性の原因であ りうるということを証明している。これらの欠失には例えば、前立腺ガン及び膀 胱ガン細胞系統におけるエクソン２１での欠失（Ｂｏｏｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：７１２−７１５．１９９０；　）ｌｏｒｏｗ ｉｔｚｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：９３７．１９８９）、肺の小 細胞ガンにおけるエクソン１６の欠失（Ｓｈｅｗ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ、Ｇ ｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆ、　１：１７．１９９０）、及びエクソン２１と ２７の間の欠失（Ｓｈｅｗ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ。

ＵＳＡ　８７：６、１９９０）が含まれる。これらのエクソンの欠失は、欠失し たエクソンの接合部において新奇のコーディング配列を含むタンパク質の産生と いう結果をもたらす。この新奇のタンパク質コーディング配列は、腫瘍形成性細 胞の標識として用いることができ、この新奇のコーディング領域に対して誘導さ れた免疫応答は、Ｒｈエクソン欠失を含む腫瘍形成細胞を削除することができる 。

本発明のもう１つの実施態様においては、ビルムス腫瘍をひき起こす変性遺伝子 の発現を誘導するベクター構成体が提供されている。

簡単に言うと、ビルムス腫瘍は標準的には！６オ以下の小児に見られる。１００ ００人の１人の子供にこの腫瘍が発生し、小児ガンの約５９６を構成している。

腫瘍は通常、繊維質偽莢膜によってとり囲まれている大きな腹部塊の形で現われ る。腫瘍の約７％は１方の腎臓内で多病巣性であり、５，４％は両方の腎臓に関 与している。ビルムス腫瘍遺伝子は、染色体１１１１１３に局在化され、腫瘍抑 制遺伝子の特徴であるｃＤＮ＾クローン（ｗｔｌ）が分離された（Ｃｅｌｌ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６０：５０９゜１９９０；　Ｇｅ５ｓｌｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４３ニア４４．１９９０；Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｔ、、　 Ｃｅ１１６０：４９５．１９９０：及びＨａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　 ６１：１２５７．　＋９９０）。ｗｔｌ遺伝子は４つの亜鉛フィンガ及びグルタ ミン及びプロリンが豊富なアミノ末端を含むタンパク質をコードする。このよう な構造は、転写及び調節機能と結びつけられるものと考えられている。

ビルムス腫瘍遺伝子の突然変異には、リジン、トレオニン及びセリンを第３及び 第４の亜鉛フィンガーの間に挿入することが含まれる。このような挿入を含むｗ ｔｌ　タンパク質はＥＧＲ−１部位に結合しない。第２の代替的突然変異は亜鉛 フィンガーのドメインに対する直ぐＮＨ，末端の領域内での約１７個のアミノ酸 の挿入という結果をもたらす（Ｍａｄｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　 ２５３：１５５０−１５５３．１９９１；Ｃａ１ｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　６０：５０９．１９９０：Ｇｅ５ｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒ ｅ３４３ニア４４．１９９０：Ｒｏｓｅ　ｅｔａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６０：４９５ 　、１９９０：Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　６１；１２５７．１９０ ０：及びＢｕｃｋｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、１１： １７０７．１９９１）。

上述のような変性は、新奇コーディング配列（単数又は複数）を含むタンパク質 （単数又は複数）の産生という結果をもたらす。これらの配列（単数又は複数） によってコードされた新奇のタンパク質（単数又は複数）は、腫瘍形成細胞の標 識として使用でき、これらの新奇コーディング領域（単数又は複数）に対して誘 導された免疫応答を、ビルムス腫瘍をひき起す変性された配列又は遺伝子（単数 又は複数）を含む腫瘍形成細胞を破壊するのに利用することが可能である。

本発明のもう１つの実施態様においては、変性ＤＣＣ（結腸直腸ガンにおいて欠 失されたもの）遺伝子の発現を誘導するベクター構成体が提供されている。簡単 に言うと、結腸直腸腫瘍における対立遺伝子喪失のきわめて一般的な領域は染色 体１８ｑであり、これは７０％以上のガン腫そしてほぼ５０％の晩期腺腫におい て喪失される。この領域からの推定上の腫瘍抑制遺伝子（ＤＣＣ）が同定されて おり（Ｐｅａｒｏｎｅｔ　ａｌ、、　１９９０）　、これは、神経細胞接着分子 （ＮＣＡＭ）及びコンタクチン（ＥｄｉｌｍａｎがＢｉｏｃｈｅｍ　２７：３５ ３３−３５４３．１９８８にて再検討したもの）といった細胞表面接着分子に対 する著しい相同性をもつタンパク質をコードする。このタンパク質は、恐らくは 正常な細胞−細胞及び／又は細胞−細胞外基質の相互作用における変性を通して 、結腸直腸腫瘍の発達において１つの役割を果たすと信じられている。

ＤＣＣ遺伝子は正常な結腸粘膜の中で発現されるが、その発現は大部分の結腸直 腸ガンにおいて減少しているか又は皆無である（Ｓｏｌｏｍｏｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　３４３：４１２−４１４．１９９０）。この発現の喪失は、いく つかのケースにおいては、ＤＣＣ遺伝子の体細胞突然変異と結びつけられた。約 ７５０のアミノ酸タンパク質をコードする隣接した一連のＤＮＡをクローニング した（Ｐｅａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｒ結腸直腸ガンにおける変性されている染 色体１８４遺伝子の同定Ｊ　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：４９−５６．１９９０） 。

本発明のもう１つの実施態様においては、ＭＣＣ又はＡＰＣの発現を誘導するベ クター構成体が提供されている。ＭＣＣ（結腸直腸ガンで突然変異した）及びＡ ＰＣは両方共、家族性腺腫様ポリープ症（ＦＡＰ）において突然変異を受ける腫 瘍抑制遺伝子として同定された（Ｋｉｎｚｌｅｒｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２５１．１３６６−１３７０．１９９１）　、　ＦＡＰは、ガンに導く最も 一般的な常染色体性優性病であると信じられており、これは米国において５００ ０人に１Å以上が罹患している（Ｎｉｓｈｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎ ｃｅ２５３：６６５−６６９．１９９１）　、罹患患者は通常、結腸及び直腸の 腺腫様ポリープを１００乃至１０００発生させ、これはガン腫へと進行する可能 性がある。ガードナー症候群（ｒＧｓ、　Ｊ　、ＦＡＰの一派生型）は、結腸及 び直腸の多くの腺腫と合わせて類皮脂、骨腫及びその他の新生物を呈する。この 増殖は、染色体５ｑ上に発見される家族性腺腫様ポリープ症遺伝子（及び特にＭ ＣＣ及びＡＰＣ）の喪失又は不活性化によって誘発されると信じられている。

例えば、Ｎ１５ｈｊｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、（前出）においては、ＡＰＣ遺伝子の 以下のような生殖細胞系突然変異がＦＡＰ及びＧＳ患者において発見された＝（ １）コドン２８０、突然変異を停止するためのセリン（特に下顎骨腫患者におけ る）、（２）コドン３０２、類皮腫を有する患者１名を含む２人の別々の患者に おいて突然変異を停止するためのアルギニン、（３）コドン４１４、下顎骨腫患 者におけるアルギニンからシスティンへの突然変異及び（５）コドン７１３、も う１人の下顎骨腫患者における突然変異を停止するためのセリン（Ｎｉｓｈｉｎ ｏ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　２５３：６６５−６６９．１９９１）　、さらに、ＭＣＣコド ン番号１２．１４５．２６７゜４９０、５０６及び６９８内で６つの点突然変異 が同定され、ＡＰＣ内で付加的な４つの体細胞突然変異が同定された（コドン番 号２８９．３３２．４３８及び＋３３８）。

上述のような変性は、新奇なコーディング配列（単数又は複数）を含むタンパク 質（単数又は複数）の産生という結果をもたらす。

これらの配列（単複）によってコードされた新奇のタンパク質（単複）は、＠傷 形成細胞の標識として使用でき、これらの新奇コーディング領域（単複）に対し て誘導された免疫応答を、ＤＣＣ，ＡＰＣ又はＭＣＣをひき起こす変性された配 列又は遺伝子（単複）を含む腫瘍形成細胞を破壊するために利用することが可能 である。

大発明のもう１つの実施態様においては、変性されたユビキチンの発現を誘導す るベクター構成体が提供されている。簡単に言うと、ユビキチンは、細胞周期制 御及びＤＮＡ複製に関与する細胞タンパク質である。ユビキチンのその他の機能 としては、細胞内タンパク質分解、熱シヨツク応答、転写調節、細胞周期制御、 及び細胞−細胞相互作用が含まれる。ユビキチンは、さまざまな代謝性帰結に対 しタンパク質をターゲティングする標識分子であると信じられており、このタン パク質をコードするｃＤＮＡ配列が同定されている（Ｌｕｎｄｅｔｅｔａｌ、、 ｒヒトユビキチンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の分析によって、ユ ビキチンが前駆物質として合成されることが明らかにされるＪ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２６３：４９２６−４９３１．１９８５）。

ヒト結腸ガン細胞系統の中で、最近突然変異ユビキチン（ユビキチン０）が同定 された（Ｍａｆｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ−Ｓｕｒｇ　１２６：４６２− ４６６、１９９１）。

この腫瘍細胞は、ハイブリッドユビキチンーリポソームタンパク質５２７ａから 成る新奇融合タンパク質を含んでいる。このタンパク質の融合接合は、免疫原性 であり従ってこの融合タンパク質を支持する腫瘍細胞を除去するのに使用されう る新奇の非自己タンパク質配列という結果をもたらす。

本発明のもう１つの実施態様においては、変性されたｂｅｒ／ａｂｌの発現を誘 導するベクター構成体が提供されている。簡単に言うと、慢性骨髄性白血病患者 のほぼ全てからの＠瘍細胞において、染色体９と２２の融合であるフィラデルフ ィア染色体は、融合１）２１０ｂｅｒ　／ａｂｌタンパク質の合成を誘導する。

このハイブリッド遺伝子は、慢性骨髄性白血病を導く無調節タンパク質−キナー ゼ活性をもつ２１０ｋＤリンタンパク質をコードする（Ｄａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ 、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：８２４−８２９゜１９９０；　Ｓｈｔｉｖｅｌｍ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５５０−５５４，１９８５；Ｂｅ ｎ−Ｎｅｒｉａｈｅｔ　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３＋２１２−２１４ ．１９８６；及びＳｈｔｔｖｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌ１４７　＋　２ ７７−２８４．１９８６）。これら２つの染色体の融合接合は、免疫原性であり 従うてこの融合タンパク質を支持する腫瘍細胞を除去するのに使用されつる新奇 の非自己タンパク質配列という結果をもたらす。

本発明のもう１つの実施態様においては、［オンＪ又は［オンＪモードて機能的 にロック又は粘着させられる変性レセプターの発現を誘導する。簡単に言うと、 外部環境を監視し、細胞に信号を送って適切に応答させることによって、数多く の細胞レセプターが細胞成長に関与する。監視又は信号送りのいずれのメカニズ ムが故障した場合、細胞はもはや外部環境に応答せず、無制御の成長を示す可能 性がある。例えばｎｅｕ及び甲状腺ホルモンレセプターの突然変異形態又は変性 形態、ＰＤＧＦレセプター、インシュリンレセプター、インターロイキンレセプ タ（例えばＩＬ−１，−２，−３などのレセプター）又はＧ　−Ｃ３Ｆ、　ＧＭ −Ｃ３Ｆ　、又はＭ　−ＣＳＦレセプターといったＣＳＦレセプターを含む、数 多くの異なるレセプター又はレセプター様構造が、変性細胞成分として機能する ことができる。

例えば、ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子レセプタｒＨＥＲＪ又は上皮成長因子ｒＥＧ ＦＪ　レセプタとも呼ばれる）は、乳ガンをもつ女性の２８％以上に見られる変 性レセプターである。このタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンが分離され た（Ｓｌａｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４ニア０７−７１２ ゜１９８９；Ｓｌａｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　７　： 　３７１−３８０．１９８９；５ｈｉｈ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　２９０：２６１．１９８１）。このクローンは、細胞外、膜内外 及び細胞内ドメインをもち（Ｓｃｈｅｃｈｔｅ・ｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２： ５１３．１９８４　；　Ｃｏｕｓｓｅｎｓｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３ ０：１１３２．１９８５）従ってｎｅｕレセプターをコードすると信じられてい るタンパク質をコードする。

化学誘発された神経膠芽細胞腫の細胞から分離されたラットのｎｅｕ遺伝子の研 究は、それがバリンからグルタミン酸への位置６６４での単一の突然変異を含む ことを示している（Ｂａｒｇｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＢＭＢＯＪ。

７：２（１４３，１９８８）。その他の研究においては、Ｎ−エチル−Ｎ−ニト ロソ尿素で処置された幼児ラットは、神経系の悪性腫瘍を発生させた。

発生した４７の三叉神経鞘腫及び１２の神経鞘腫は全て、ｎｅｕ遺伝子の位置６ ６４でＴ−Ａ）ランスバージコンを有していた。（Ｎｉｋｉｔｉｎ　ｅｔａｌ、 　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８：９９ ３９−９９４３．１９９１）。

その他の変性レセプタも同様に、選択された腫瘍細胞を破壊するためにベクター 構成体によって発現されうる。例えば、染色体３ｐ２１−ｐ２５での欠失は、小 細胞肺ガンと結びつけられた（Ｌｅｄｕｃ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎ＋。

Ｊ、　ｔ（ｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　４４：２８２−２８７．１９８９）。そうで なければＤＮＡ結合する甲状腺ホルモンレセプタ（ＴＨＲ）をコードするＥＲＢ ＡＰ遺伝子の中で欠失が起こると信じられている。

上述のようなレセプタ内の変性は、新奇コーディング配列（単複）を含むタンパ ク質（単複）（又はレセプター）の産生という結果をもたらす。これらの配列（ 単複）によってコードされた新奇のタンパク質（単複）は、腫瘍形成細胞の標識 として使用でき、これらの新奇コーディング領域（単複）に対し誘導される免疫 応答は、変性された配列（単１）又は遺伝子（単複）を含む腫瘍形成細胞を破壊 するのに利用できる。

上述のとおり、本発明のその他の態様においては、正常な乳房又は膵臓の上皮以 外の細胞タイプにおいて発現された場合に、異常にグリコジル化されたムチン（ ムチン０）の発現を誘導するベクター構成体が提供されている。簡単に言うと、 ムチンは、約５０％の炭水化物を含む高分子量の糖タンパク質である。多形上皮 ムチンＣＰＥＭ＞は、ガン患者の血清中に発見される腫瘍関連ムチン（Ｇｌｒｌ ｉｎｇ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｉｎｔ、　、１．　Ｃａｎｃｅｒ　４３：ｌ０７６−１０７６、１９８９）であ る。全長ｃＤＮＡ配列が同定された（Ｇｅｎｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５（２５）　：１５２８６−１５２９３．１９ ９０：Ｌａ■ ｅｔ　ａｔ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５（２５）　：ｌ５２ ９４−１５２９９．１９９０　；及びＬｉｇｔｅｎｂｅｒｇｅｔ　ａｌ、　、　 、１．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：５５７３−５５７８．１９９０）。

乳房腫及び膵臓腫は両方共、２０アミノ酸の縦列反復を含む同一のコア配列を伴 うムチンを発現する（Ｊｅｒｏｍｅ　ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５ １：２９０８−２９１６．１９９１）。乳房腫に発達したＣＴＬ細胞系統は、膵 臓腫標的と交叉反応し、さらに、特定の２０アミノ酸縦列反復を特異的に認識す るように思われる（Ｊｅｒｏｍｅｅｔ　ａｌ、、前出）。単数又は複数の２０ア ミノ酸縦列反復をコードする配列又は完全なムチンｃＤＮＡでさえ、異常にグリ コジル化されたムチンを発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を発達させるために 本発明のベクター構成体によって発現されうる。本発明の特に好ましい実施態様 については、以下の例６から！０でさらに詳しく記述されている。

上述の変性細胞成分をコードする配列は、さまざまな供給源から得ることができ る。例えば、変性細胞産物をコードする配列を含むプラスミドは、米国標準培養 収蔵所（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｒｕｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）といった供託所 から、又はＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　（Ｃｏｌｕｍ ｂｉａ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）といった商業的供給源から得ることができる。上述の配列の いくつかを含むプラスミドの代表例としては、ＡＴＣＣＮｏ、　４１０００（ｒ ａｓの１２番目のコドンにＧ−Ｔ突然変異を含む）及びＡＴＣＣＮｏ、　４１０ ４９（１２番目のコドンにＧ−Ａ突然変異を含む）が含まれる。

代替的には、正常な細胞成分をコードするプラスミドは、ＡＴＣＧなどの供託所 から得て（例えば正常なｒａｓタンパク質をコードする配列を含むＡＴＣＣＮｏ 、　４１００１．　ａｂ　ＩをコードするＡＴＣＣＮｏ、　５７１０３及びｂｃ 、ｒ遺伝子座をコードするＡＴＣＣＮｏ、　５９１２０又は５９１２１を参照） 、変性細胞成分を形成するべくこれを突然変異させることもできる。特定の部位 を突然変異誘発するための方法は、当該技術分野において既知の方法を用いて容 易に達成させつる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、前出、１５．３％以下参 照）。特に、ｒａｓといった正常な細胞成分の点突然変異は、例えばコドン１２ ．１３又は６１といった特定のコドンの部位特異的突然変異誘発によって容易に 達成できる。

同様の要領で、正常な細胞成分をコードする配列を細胞から得て、変性細胞成分 をコードする配列を得るため部位特異的突然変異誘発によりこれを突然変異させ ることが可能である。このような配列は、配列のいずれかの側でプライマーを調 製しＲＣＲにより配列を増幅させることによって容易に得ることができる（米国 特許第４．６８３．２０２号、　４６８３．１９５号及び４８００．１５９号参 照Ｘ　ｒＰＣＲテクノロジー；その原理とＤＮＡ増幅への応用Ｊ　Ｅｒ１ｉｃｈ （ｅｄ、）Ｓｒｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９８９も参照のこと）。簡単に言 うと、熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ、特異的ＤＮＡプライマー、＾ＴＰ、　ＣＴ Ｐ、　ＧＴＰ及びＴＴＰの存在下での加熱によって、２本鎖ＤＮＡが変性される 。合成が完了したとき、２本鎖ＤＮＡが産生される。このサイクルを何回も反復 して、望ましいＤＮＡの階乗増幅を結果として得ることが可能である。

変性細胞成分をコードする配列を、例えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓＩｎｃのＤＮＡシンセサイザー（例えばＡＢＩＤＮＡシンセサイザー３９２型 （Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、Ｃａ１ｆｏｒｎｉａ））で合成することもできる。

このような配列は、長−重鎖ＤＮＡ分子を形成するために連結されうる。簡単に 言うと、短かい重複したアンチセンスリンカ−を−次配列と混合させ、その後− 次配列を連結させて長い一本鎖ＤＮＡ分子を形成することができる。

変性された細胞成分をコードする配列がひとたび得られたならば、配列が非腫瘍 形成性タンパク質を確実にコードするようにすることが必要である。特定の細胞 成分の腫瘍形成性を評価するさまざまな検定が知られており、これらは容易に達 成することができる。代表的な検定としては、（以下の例４で詳述されている） ラット線維芽細胞検定）、ヌードマウス又はラットにおける腫瘍の形成、軟寒天 内のコロニー形成及び、遺伝子導入マウスといった遺伝子導入動物の調製が含ま れる。

ヌードマウス又はラットにおける腫瘍の形成は、特定の細胞成分の腫瘍形成性を 決定するための特に重要で感受性の高い方法である。

ヌードマウスは、機能的細胞免疫系が欠如しており（すなわちＣＴＬを存してい ない）、従って細胞の腫瘍形成潜在能をテストすべき有用なインビボモデルを提 供する。正常な非腫瘍形成細胞は、ヌードマウスに感染させられた場合無制御の 成長特性を示さない。しかしながら、形質転換された細胞は急速に増殖し、ヌー ドマウス体内で腫瘍を生成する。簡単に言うと、１つの実施態様においては、ベ クター構成体は同系のマウス細胞に投与され、その後ヌードマウスに注射される 。マウスは注射後２週間乃至８週間目視され、腫瘍の成長が確認される。腫瘍が 存在するか否かを見極めるためにマウスを安楽死させて剖検に付すこともできる （Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、４８：１５３１−１５３３．１９７２；Ｆｕｒｅｓｔ 　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ生物学的薬物の産生のため考慮されている細胞系統の腫瘍 形成性試験ＪＡｂｎｏｒｍａｌＣｅｌｌｓ、Ｎｅｗ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ 　Ｆ、１（ｏｐｐｓ　ａｎｄ　Ｐｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ（ｅｄｓ）、Ｔｉ５ｓｕ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、　１９８５：及びＬｅｖｅｎｂｏｏ ｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｓｔｄ。

１３：１３５−１４１．１９８５）。

腫瘍形成性は又、軟寒天内のコロニー形成を視覚化することによっても評価でき る（Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｖｉｒ、２３：２ ９１−２９４゜１９６４）。簡単に言うと、正常な非腫瘍形成細胞の１つの特性 は［接触阻害Ｊである（すなわち、細胞は、隣接する細胞に触れた時点で増殖を 停止する）。細胞を半固体寒天支持体内で平板固定すると、正常な細胞は急速に 接触阻害された状態となり増殖を停止するが、一方腫瘍形成細胞は増殖し続は軟 寒天中でコロニーを形成する。

遺伝子導入マウスといった遺伝子導入動物を利用して、変性細胞成分の腫瘍形成 性を評価することも可能である（Ｓｔｅｗａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　３８；６２７−６３７．１９８４；Ｑｕａｉｆｅ　ｅｔ　ａｌ、、ｃ ｅｌｌ　４８；１０２３−１０３４，１９８７；及びＫｏｉｋｅ　ｅｔ　ａｌ、 　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６；５６ １５−５６１９．１９８９）B 遺伝子導入動物において、問題の遺伝子は動物の全ての組織内で発現されつる。

この導入遺伝子の無調節発現は、新しく導入された遺伝子の腫瘍形成潜在能につ いてのモデルとして役立つ。

変性された細胞成分が細胞を腫瘍形成性のものにすることに結びつけられる場合 、この変性細胞成分を非腫瘍形成性にすることが必要である。例えば、１つの実 施態様においては、変性細胞成分をコードする問題の配列又は遺伝子は、遺伝子 産物を非腫瘍形成性にするため端を切り取られる。変性細胞成分をコードする遺 伝子は、さまざまなサイズに切取られ得るが、変性細胞成分をできるかぎり多く 保持するのが好ましい。さらに、どんな切形作業でも、変性細胞成分の免疫原性 配列の少なくともいくつかを無傷の状態におくことが必要である。代替的には、 免疫原性領域の下流で、変性細胞成分をコードする遺伝子内に多数の翻訳終止コ ドンを導入することができる。終止コドンの挿入はタンパク質発現を早開に終結 させることになりかくしてタンパク質の形質転換部分の発現が妨げられる。

１つの実施態様においては、ｒａｓ”タンパク質を非腫瘍形成性にするため、ｒ ａｓ’遺伝子を切形にする。簡単に言うと、ｒａｓ　”のカルボキシ末端アミノ 酸は、機能的に、タンパク質が細胞膜に付着することがてきるようにする。

これらの配列の切形により、変性細胞成分は非腫瘍形成性になる。

好ましくは、ｒａｓ’遺伝子は、例えば、アミノ酸番号１１０をコードする配列 のまわりでプリン環形成において切形される。ｒａｓ”遺伝子配列は、変性ア、 ミノ酸（単複）を含む約２０個というわずかなアミノ酸がベクター構成体によっ てコードされるように切形されつるが、好ましくは、できるかぎり多くのアミノ 酸が発現されるべきである（非腫瘍形成性を維持しながら）。

もう１つの実施態様においては、細胞成分を非腫瘍形成性にするためｐ５３°タ ンパク質が切形によって修正される。前述のように、ｐ５３タンパク質の全ての 突然変異が腫瘍形成性であるわけではなく、従って全ての突然変異を切形しなく てはならないわけでもない。それでも、好ましい実施態様においては、９５３° は、アミノ酸１００〜３００をコードし従って４つの主要な「ホットスポット」 を全て含む配列まで切形される。

発ガン性であるその他の変性細胞成分も同様に、それらを非腫瘍形成性のものに するべく切形されつる。例えば、非腫瘍形成性にするため、ｎｅｕ及びｂｃｒ／ ａｂｌの両方を切形することが可能である。

非腫瘍形成性は、上述のように、又図４に記されているように、切形の変性細胞 成分を検定することによって確認できる。

しかしながら、変性細胞成分が非腫瘍形成細胞全般に結びつけられているだけで あり細胞を腫瘍形成性にするために必要とされる又は必須であるのでない場合、 細胞成分を非腫瘍形成性にすることは分も同様に免疫原性でなくてはならない。

特定の配列の免疫原性は往々にして予想が困籠であるが、Ｔ細胞エピトープは往 々にして免疫原性の両親媒性アルファーヘリックス成分を存している。しかし定 、ＩＬ−２産生検定及び増殖検定といったＴヘルパー細胞についてテストする検 定がある。免疫原性を決定するための特に好ましい方法は、以下の例５で詳述す るＣＴＬ検定である。

上述のように、本発明のもう１つの態様においては、一般的抗ガン治療薬を形成 するため複数の異なる変性細胞成分を同時発現させることができる。一般に、当 業者であれば、さまざまな組合せを行なうことが可能であるということは明らか であろう。好ましい実施態様においては、この治療薬は、特定のタイプのガンに ターゲティングされうる。例えばほとんど全ての結腸ガンがｒａｓ、　ｐ５３． 　ＤＣＣＡＰＣ又はＭＣＣ遺伝子における突然変異を有している。可能性ある全 ての突然変異を処置するため、結腸ガンをもつ患者に対して、一定数のこれらの 変性細胞成分を同時発現するベクター構成体を投与することかできる。この方法 論は、その他のガンを治療するためにも利用することかできる。かくして、ムチ ン０、ｒａｓ”　、　ｎｅｕ及びｐ５３３を同時発現するベクター構成体を、乳 ガンの治療に利用することかできる。

さらに、本発明の変性細胞成分は、リンホカイン及び／又は免疫モジュレータと 同時発現されうる。リンホカインの代表例としては、Ｒ瘍壊死因子、ＩＬ−１， ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６゜ＩＬ−７，ＩＬ−８，Ｉ Ｌ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＧＭ−Ｃ３Ｆ、　Ｃ５Ｐ−１及びＧ−Ｃ３Ｐ が含まれる。免疫モジュレータの代表的例としては、ＣＤ３゜ＩＣＡＭ−１、Ｉ ＣＡＭ−２，ＬＦＡ　−１，ＬＰＡ　−３，β−２−マイクログロブリン、ｃｈ ａｐｅｒｏｎｅｓ、アノレフ了インターフェロン及びガンマインターフェロン及 び主要組織適合遺伝子複合体（ＭｔｌＣ）がある。

特定の変性細胞成分がひとたび選択されると、それはその発現を誘導するベクタ ー構成体の中に入れられる。本発明のベクター構成体は、外科手術の代替品とし て使用することもできるし、又は外科的又はアジュバントとしての方法と組合せ て使用することもでき、残留腫瘍細胞に対する特異的細胞障害性が惹起されるこ とから、化学療法又は放射線療法に比べて外科手術後により高い効果を発揮する 可能性がある。レトロウィルスベクター構成体の構成は、以下の図２でより詳細 に記述されている。さらに、付加的なベクター構成体の構成ならびに直接注射に よるレトロウィルス構成体の投与については、［組換え型レトロウィルスＪとい う題の出願（Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ。

０７１５８６、６０３．１９９０年９月２１日提出）の中でさらに詳しく記述さ れている。この出願はその全体か参考としてここに内含されるものである。

例えばポリオウィルス（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９： ３８５−３８８．１９８９及び５ａｂｉｎ、Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄａ ｒｄｊｚａｔｉｏｎ　Ｉ：１１５−１１８．１９７３）；鼻炎ウィルス（＾ｒｎ ｏＬｄ、　Ｊ、　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ４０１−４０５．１９９ ０）　；カナリア痘ウィルス又はワクシニアウィルスといったポックスウィルス （Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈｅｔ　ａｌ、　、　ＰＮＡＳ８６：３１７−３２１． １９８９；ＦＬｅｘｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａ ｄ、　rｃｉ。

５６９：８６−１０３．　＋９８９：Ｆｌｅｘｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｖａｅｃ ｉｎｅ　８：１７−２１．１９９０；［Ｊ、Ｓ、特許第４６０３１１２号及び４ ．７６９．３３０号：　ＷＯ３９１０１９７３号）　；　ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉ ｇａｎｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１０８−１＋４；１９７９）； インフルエンザウィルス（Ｌｕｙ−ｔｊｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　５９； １１０７−１１１３．１９８９；ＭｃＭｉｃｈｅａｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　 ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３０９：１ ３−１７．　＋９８３；及びＹａｐ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　２７３：２３８−２３９．１９７８）　；アデノウィルス（Ｂｅ ｒｋｅｒ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６−６２７．１９８８、及び Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１−４３ ４゜１９９１）；アデノ随伴ウィルスなどのパルボウイルス（Ｓａｍｕｌｓｋｉ 　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６３：３８２２−３８２８．１９８ ９及びＭｅｎｄｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６６：１５４−１６５．１９８８）；ヘルパス（にｉｔ、 　Ａｄｕ、　Ｂｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｂｉｏｌ。

２１５：２１９−２３６．１９８９）；ＳＶ４０；Ｈ／Ｖ　：麻疹（ＥＰＯ４４ ０，２１９）　；及びシンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３４：１１８８−１１９１．１９８９）を含むその他のウィルス も同様に、ベクター構成体を投与するのに利用することができる。さらに、ウィ ルス担体は、相同の、非病原性の（欠損）、複製応答能あるウィルス（例、Ｏｖ ｅｒｂａｕｇｈ　ｅｔ　ａｔ　５ｃｉｅｎｃｅ２３９：９０６−９１０．１９８ ８）であってよく、それでもなおＣＴＬを含む細胞免疫応答を誘発する。

ベクター構成体又は、変性細胞成分をコードする核酸を直接患者に投与するには 、例えば、リボフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４ニア４１３−７４１７．１９８ ９）　、直接ＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３５２ ：８１５−８１８．１９９１）；マイクロ発射体ボンバードメント（Ｗｉｌｌｉ ａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡｓ　８８：２７２６−２７３０．１９９１）；　 リポソーム（Ｗａｎｇｅｔ　ａｌ、　、　ＰＮＡＳ　８４．７８５１−７８５５ ．１９８７）　；ＣａＰＯ４（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、　、　ＰＮＡＳ ８P　ニ ア５２９−７５３３．１９８４）　；　又はＤＮＡリガンド（Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ 、、Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ２６４：１６９８５−１６９８７．１９８９ ）といった、さまざまな物理的方法を利用した方法によるトランスフェクション を含むさまざまな方法を利用することがてきる。

さらに、変性細胞成分（単ｖｉ）をその細胞表面上で発現する細菌の投与により 、ＣＴＬ応答を生成することもてきる。代表的な例としては、ＢＣＧ（Ｓｔｏｖ ｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３５１：４５０−４５８．１９９１）及びサルモネラ（ Ｎｅｗ−ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４ニア０−７２．１９ ８９）が含まれる。

細胞媒介の及び体液性応答を、変性細胞成分自体の非経口投与によって、腫瘍に 対し誘発することも可能である。簡単に言うと、変性細胞成分（ｒａｓ’　、ｐ ５３°、など）又は関連するエピトープを支持するペプチドは、昆虫由来バキュ ロウィルス系（Ｄｏｅｒｆ　Ｉｅｖ、　ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３１：５１−６８．１９８６）、哺乳類由来系統（例え ばＣＨＯ細胞）（Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　６３：３４８ ９−３４９８．１９８９）、酵母由来系統（ＭｃＡｌｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ ａｔｕｒｅ　３０７：１７８−１８０）及び原核生物系統（Ｂｕｒ−ｒｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２７９＋４３−４７．１９７９）といった組換え 体系統におけるＤＮＡの発現及び化学的合成（Ｂｅｒｇｏｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ａ ｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｔｈｅｓｉｚｅｒ　 Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１６．１９８６．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅ−ｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を含 む、数多くの既知の方法で産生できる（Ｅｌ　ｌｉｓ　ａｎｄ　Ｇｅｒｅｔｙ、 　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　３１　：５４−５８．１９９０）。

これらのタンパク質又はペプチドは、クラス■及びクラス■の応答を含む細胞媒 介型応答を誘発するべく、従来の手段により精製し数多くの方法により送り出す ことが可能である。これらの方法には、ＩｓｃＯＭｓ（Ｍｏｒｅｉｎ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２５：２８１−２８４，１９９０；Ｔａｋａｈ ａｓｈｉｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：８７３−８７５ｍ、１９９０ ）　、リポソーム（Ｇｅｒｇｏｒｉａｄｉｓｅｔ　ａｌ、、　Ｖａｃｃｉｎｅ　 ５：１４５−１５１．１９８７）　、脂質接合（Ｄｅｒｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　３４２：５６１−５６４．１９８９）、自己由来細胞上のペプチ ドノコ−ディング（Ｓｊａｅｒｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２９：４４ ９−４７１．１９８７）　、ピノソーム（Ｍｏｏｒｅａｔ　ａｌ、、Ｃｅ１１５ ４ニア７７−７８５．１９８８）、ミョウバン、完全又は不完全フロインドアジ ュバント（Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ８８：９４４８−９４５２．１９９１）　、又は有効な非経口投与を可能 にするその他のさまざまな有用なアジュバント（例、Ａ１１ｉｓｏｎ　ａｎｄ　 Ｂｙａｒｓ、Ｖａｃｅｉｎｅｓ　８７：５６−５９　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８７）といったさまざまなタイ プのアジュバントの使用が含まれている。

代替的には、変性細胞成分に相応するタンパク質又はペプチドは、腸莢膜（Ｃｈ ａｎｎｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ　１９５：４ ４５−４５２．１９６６）又は胃腸放出のためのポリ（ＤＬ−ラクチドーコーグ リコレート）球（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ　ｅｔ　ａｔ、、エイズワクチン開発におけ る　に関する国際会議議事録中、ＤＡＩＤＳ、　ＮＩＡＩＤ、米国保健社会福祉 省、１９９１）などのその他の適切な担体の中での免疫応答を惹起するべく経口 投与用に包膜させることも可能である。

さらに、これらのタンパク質又はペプチドは、それらをより免疫原性にして（例 えばＴヘルパーエピトープに相応するアミノ酸配列を付加することにより）、特 定の構造又はそのあらゆる組合せに対して疎水性残基を付加することによって細 胞の摂取を促進するように操作することも可能である（Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、 、ＰＮＡｓ　８８：９４４８−９４５２゜１９９１　；Ｍｉ　１ｉｃｈ　ｅｔ　 ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５： 　１６１０−１６１４D１９８８： Ｗｉｌｌｉｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４０：３２３−３２４，１９８９；Ｇｒｉｆ ｆｉｔｈｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５；４５０−４５６．１９９１ ）。

本発明の一態様においては、（ａ）温血動物から細胞を取り出す段階、（ｂ）通 常選択された腫瘍細胞と結びつけられた変性細胞成分の少なくとも１つの免疫原 性の非腫瘍形成性形態の発現を誘導するベクター構成体を、取り出した細胞に投 与する段階、及び（ｃ）選択された腫瘍細胞が破壊されるように温血動物に細胞 を戻す段階を含む、温血動物の体内の選択された腫瘍細胞を破壊するための方法 か提供されている。本発明の範囲内では、取り出された細胞は必ずしも同じ動物 に戻される必要は無（、もう１匹の動物内の選択された腫瘍細胞を破壊するのに 利用することもできるということを理解しておくべきである。このような場合、 組織適合性が一致した動物であることが一般に好まれる（ただしつねにそうであ るわけではない。例えば、ヤマモトｅｔ　ａｌ、、ｒ実験的ＦＩＶワクチンの効 力Ｊ　ＰＩＶ研究研究者第１隙 月）。さらに、例えばヒト、マカク、イヌ、ラット及びマウスの細ことができる ということも理解しておくべきである。

皮ふ（皮ふ線維芽細胞）及び血液（末梢血白血球）などを含むさまざまな場所か ら細胞を除去することが可能である。望ましい場合、ベクター構成体の投与のた め、血液からＴ細胞サブセット又は幹細胞といった細胞の特定の分画を取り出す ことも同様に可能である（例：　ＰＣＴＷｏ　９１／＋６１１６、「免疫選択装 置及び方法」という題の出願）。このとき、ベクター構成体を、上述の技術のい ずれかを利用して取り出された細胞に投与し、その後細胞を温血動物に戻すこと がてきる。

本発明のもう１つの態様においては、腫瘍形成性細胞成分及びプロドラッグ活性 化体の発現を誘導するベクター構成体が提供されている。例えば１つの実施態様 においては、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（　ＨＳＶＴＫ）といった プロドラッグ活性化体及び変性細胞成分のための遺伝子が、ベクター構成体に内 含される。このときこのベクター構成体は、ＨＳＶＴＫを発現する細胞を殺すａ ｃｙｃｌｏｖｉｒといった外因性物質の存在下で、細胞に投与される。当業者で あれば容易に評価できるように、このベクター構成体は、たとえ送り出された遺 伝子がベクターを取り込んだ細胞内での腫瘍形成事象に寄与する場合でさえ、こ れらの細胞が例えばａｃｙｃｌｏｖｉｒによって役立つ状態にされつるようにす るためにも利用することができる。

ベクター構成体を投与するに先立ち、まず最初に、どの変性細胞成分（単複）が 腫瘍細胞に結びつけられるかを決定することが望ましい。これは、数多くの方法 で決定されうる。例えば、特異的腫瘍標識又は変性細胞成分を検出するためにＥ ＬＩＳＡベースの検定を利用することができる。

代替的には、遺伝的レベルで変性細胞成分の存在を決定することが可能である。

例えば、ＤＮＡ又はｃＤＮＡを腫瘍から直接得て変性細胞成分に特異的な標識づ けされたプローブを用いてハイブリッド形成条件下に付することも可能である。

腫瘍細胞の数が少ない場合には、ＰＣＲ（上述のとおり）を利用して選択された 核酸領域を増幅することがてき、次にこれを同様に、標識づけされたプローブを 用いたハイブリダイゼーションに付すことができる。ハイブリダイゼーションプ ローブは、それが変性細胞成分をコードする配列に特異的に結合できるような条 件下で選択され利用されなくてはならない（Ｏｒｋｉｎ　ｅｔａｌ．、、Ｌｃｌ ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１ニア７５−７７９．　１９８３）　、さらに、当業者 であれば、例えばＲＮアーゼＡミス対合分割方法の使用などを含むその他の検出 方法を未変性又は増幅された核酸に対し容易に応用できるということも認識して おくべきである（Ｌｏｂｅｚ−Ｇａｌｉｎｄｅｚ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ。

Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ８５：３５２２−３５−２６．　１９８８）。

本発明の好ましい実施態様においては、アデノ随伴ウィルス、カナリア痘ウィル ス、アデノウィルス及びポックスウィルスから成るグループの中から選ばれた組 換え型ウィルス又は組換え型レトロウィルスといった上述の組換型ウィルスの１ つ、又は付着したリガンドを伴う又は伴わない組換え型ＤＮＡベクターを、薬学 的に受容できる担体又は希釈剤と組合わせて含む薬学組成物が提供される。この 組成物は、溶液としてか又は投与に先立って溶液中に懸濁させられる固体形態（ 例えば凍結乾燥された）として調製可能である。さらに、組成物は、注射、経口 又は直腸投与のいずれかのための適当な担体又は希釈剤を用いて調製できる。本 発明のいくつかの実施態様においては、組成物は、それを選択された腫瘍内に直 接注射できるような形で調製することができる。

薬学的に受容できる担体又は希釈剤は、利用される用量及び濃度では受容体にと って毒性をもたないものである。注射できる溶液のための担体又は希釈剤の代表 例としては、水、好ましくは生理的ｐＨで緩衝された等優良塩水（例えばリン酸 緩衝液又はトリス緩衝液）、マンニトール、デキストラーゼ、グリセロール、及 びエタノールならびにヒト血清アルブミンといったポリペプチド又はタンパク質 がある。特に好ましい組成物には、ｌｏｎｇ／ｍｌのマンニトール、１　ｍｇ／ ｍｌのＩＳＡ　、２０ｍＭのトリス１）Ｈ＝７．２及び１５０ｍＭのＮａＣ１内 のベクター又は組換え型ウィルスが含まれる。この場合、組換え型ベクターは約 ｌμｇの材料を表わしていることから、これは高分子量材料の１％未満そして合 計材料（水を含む）のｔ　／１０００００未満であってよい。

この組成物は少なくとも６力月間−７０°Ｃで安定している。組成物は、静脈内 （ｉ、　ｖ、　）でも皮下（Ｓ、　Ｃ）でも注射できるが、一般には筋肉（ｉ、 ｍ、）注射するのが好ましい。通常用いられる個々の用量は、１０’〜１０”　 ｃ、　ｒ、　ｕ、　（ＨＴＩ０８０細胞上で滴定されたネオマイシン耐性のコロ ニー形成単位）である。これらは当初３〜４用量について１〜２週間の間隔で投 与される。その後の追加免疫注射は、６〜１２力月後に１〜２用量その後は一年 に一回といったように与えることができる。

セルロース、ラクトース、マンニトール、ポリ（ＤＬ−ラクチトーコーグリコレ ート）球及び／又はでんぷんといった炭水化物などの担体又は希釈剤と共に、経 口製剤形態を利用することもできる。組成物は例えば錠剤、ゲル、カプセル、丸 剤、溶液又は懸濁液の形をとることができ、さらには持続放出性の製剤形態にす ることもできる。直腸投与のためには、ポリアルカレングリコース又はトリグリ セリドといった従来の担体を用いて座薬の調製を達成することができる。

以下の例は、例示を目的として提供されているものであり、制限的意味の無いも のである。

ｒａｓ””の分離 全Ｔ２４　ｒａｓ””コーディング領域を含む７００塩基対のＨｉｎｄｎ［フラ グメントをプラスミドＨＲＡＳＩ（ＡＴＣＣＮｏ、　４１０００）から得、ｐＳ Ｐ７３（Ｐｒｏ−ｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＨｉｎｄ ｎＩ部位へ連結する。このプラスミドを５Ｐ−Ｖａｌ１２（１００ＸＩＩＩ　１ 参照）と呼ぶ、ｒａｓ””を含むプラスミドを、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＩＪａｒｙｌａｎｄ）といったその 他の供給源から得ることも可能である。

ｐＳＰ７３内のｒａｓ　’″１！の適切な配向を決定するため、クローンをＰｒ ｕ　ＩＩ消化に付し、１００ｂｆｌ消化物を含むクローンを選択する。このクロ ーンを５Ｐ−Ｖａｌ”（＋００）と呼ぶ。

Ｅ、ｃｏｌｉ（ＤＨ５ａｌｐｈａ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ ａｂｓ　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を５Ｐ−Ｖａｌ”ベク ター構成体を用いて形質転換し、一定量のプラスミドＩ）ＮＡを生成するべく増 殖させる。次に、基本的にＢｉｒｎｂｏｉｍｅｔ　ａ［（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒ ｅｓ、７：１５１３．１９７９；　ｒ分子クローニング、実験室マニュアルＩ　 Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、（ｅｄｓ、）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　ｐ１２５以下、１９８９も参照のこと）に記述されてい るとおりに、プラスミドを分離し精製する。

例２ Δｒａｓ”　’　”を含むベクター構成体の調製Ａ、Δｒａｓ”’の調製 制限エンドヌクレアーゼ分割により、Ｎｃｏｌ−３ｍａｒフラグメントを除去す る（図２参照）。３つの読取り枠金ての中に汎発性停止コドンを含むＸｂａ　Ｉ リンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ　Ｍａｓ ｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）をｒａｓコーディング配列に３′で挿入する。このプロ セスは、Ｘｂａ　１部位における制限エンドヌクレアーゼ分割とそれに続く連結 によって除去することのできるポリＸｂａ　Ｉ領域を形成する。この突然変異体 はＳＰ−Δ−Ｖａｔ”と呼ばれ非活性切形ｒａｓ（ｒａｓ”　）タンパク質　を 発現する。

Ｂ、レトロウィルスバックボーン内へのΔｒａｓ”２の挿入Ｎ　２−ｒａｓ−ｎ ｅｏ及びＮ　２−　ｒａｓ”−ｎｅｏレトロウィルスベクターを基本的にＵ、　 Ｓ、　Ｓ、　Ｎ　０７１５８６．６０３に記述されているとおりに構成する。節 用に言うと、この工学処理されたＮ２マウス組換え型レトロウィルスは、感染及 びトランスフェクションを受けた細胞系統の分離を容易にするためＳＶ４０早期 プロモータ及びネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子を含む。Ｎ２Ｍ ｏＭＬＶｇａｇＡＴＧインシュータコドンは同様に、レトロウィルス力価を増大 させかつ形質導入された遺伝子の発現レベルを高めるためインビトロ部位特異的 突然変異誘発によりＡＴＴに変性される。

次にｓｐ−Δ−Ｖａｌ”（１００）からの３５０ｂｐのＸｈｏｌ−Ｃ１ａｌフラ グメントを次にレトロウィルスベクターに連結させる。この構成体はＮ２−Δ− ｒａｓ’−Ｖａｌ”と呼称された（図４参照）。

全長５Ｐ−Ｖａｎ’（ｌｏｇ）ｃＤＮＡは、形質転換のための正の対照として使 用されるべく、同様にレトロウィルスベクターに連結される。この構成体をＮ　 ２−ｒａｓ−Ｖａｌ”と呼ぶ（図３参照）。

例３ 哺乳動物細胞のトランスフェクション ｌ０９６のウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ、　Ｃａ１ａｂａｓａｓ、　Ｃａ１ｉｆ ｏｒｎｉａ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５ａｎｔ ａＡｎａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）の中で、マウスの線維芽細胞系統ＢＣＩＯＭ Ｅ　（ＭＨＣＩ梨Ｈ−２ｄを伴うＢＣ）及びＬ３３（同様にＨ−２ｄ）（南カリ フォルニア大学Ｃｕｎｔｈｅｒ　Ｄｅｎｎｅｒｔより入手）及びヒト線維芽細胞 系統ＨＴ１０８０（ＨＴ）（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ１２１）を成長させる。Ｂｃ 又はＨＴ細胞を上述のベクター構成体を用いて形質導入又はトランスフェクショ ンする。ＢＣ−ｒａｓ”細胞は、マウスの免疫化のために用いる。

イヌの細胞系統ＣＦ２から作られたＣＡ細胞（両栄養性パッケージング系統）内 てＣａＰＯ５方法により組換え型レトロウィルスをトランス７エク’ｉ　ａ　ン する（Ｕ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｎ、　０７１５８６．６０３参照）。細胞をＧ４１８ 選択し、クローニングし、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ内で膨張さ せる。最高力価のクローンからのウィルス上清を０．４５μｍのフィルターを用 いてろ過し一７０°Ｃで保管する。

代替的には、感染（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｓｏｍａｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｍａ ｌ、Ｇｅｎｅｔ　１２：１７５−１８３１９８６）によりパッケージング細胞系 統（ＰＣＬｓ）内にレトロウィルスベクターを導入したときに、より高い力価を 得ることができる。

簡単に言うと、両栄養性ＭＬＶベクターは、ＰＣＬを感染させるものとして知ら れているものの、ａｍｐｈｏ　ｅｎｖの発現のためこのような細胞系統の感染を 阻止される可能性がある（［ウィルス干渉」）。この問題を克服するためには、 その他のウィルス外膜を含むベクター（両性レセプタ以外の細胞レセプターに結 合する異種栄養性ｅｎｖ又はＶＳＧＧタンパク質といったもの）を生成させるこ とが可能である。

簡単に言うと、２−３細胞といった高レベルのＭｏＭＬＶｇａｇ／ｐｏｔを発現 する細胞系統上に、ｘｅｎｓ　ｅｎｖ　（上記ｐＣＭＶ　Ｘｅｎ５）又はＶＳＶ Ｇタンパク質発現ベクター、ＭＬＰＧのいずれかを発現するＤＮＡｌ０μｇと、 問題のベクターＤＮＡｌ０μｇを同時トランスフェクションする。このとき、そ れぞれ異種栄養性ｅｎｖ又はＶＳＶＧタンパク質を含む結果として得られたベク ターを同時トランスフェクションした細胞内で過渡的に産生させることができ、 ２日後に、細胞無しの上清を潜在的ＰＣＬに対し付加することができる。Ｇ４１ ８内での選択により、ベクター感染を受けた細胞を同定することができる。

マウスの線維芽細胞系統ＢＣＩＯＭ及びＬ３３をＣａＰＯａ技術を用いてレトロ ウィルスベクターＤＮＡでトランスフェクションし、８日間８ｏＯＩＩ　ｇ　／ 　ｍｅのＧ４１８を用いてクローンを選択することができる。その後、細胞を溶 解させ、ウェスタンプロットを用いてｒａｓ”タンパク質の発現について検定す ることができる（一般にＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、。

１８、６０以下参照）。

例４ 形質転換（Ｉｌ瘍形成性）検定 ラット２細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ　１７６４）を、１０％のウシ胎児血清で 補足されたダルベッコーフォークトの修正イーグル培地の中で成長させる。トラ ンスフェクションより一日前に、ラット２の細胞を５ｃｍの四あたり１０１個の 細胞という割合で平板固定する。前述の通り細胞を０．１−１．０μｇの構成体 ＤＮＡを用いてトランスフェクションする（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｄ ｅｒＥｂ、　１９７３：Ｃｏｒｓａｒｏ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ、　１９８１ ）。翌日、細胞をトリプシン処理し３枚の５ｃｍ四に播種し、その後３日毎に５ ％のウシ胎児血清と２　Ｘ　１０−＠Ｍのデキサメタシン（これは形質転換され たラット２細胞の形態と形質転換されていないものの形態の間の対比を強める） を含む培地を用いて３日毎に栄養補給する。形質転換されたフォーカスが約１週 間後に見える。約３週間後、プレートを染色しフォーカスを計数する（Ｍｉｌｌ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　３６：５１゜１９８４）。

ｒａｓ’組換え型レトロウィルスでのトランスフェクションを受けた細胞は、形 質転換されたフォーカスを形成したが、一方Δｒａｓ”組換え型レトロウィルス でのトランスフェクションを受けた細胞はこれを形成しなかった。

例５ 細胞障害性検定 生後６週間から８週間の雌のＢＡＬＤ／Ｃ７ウス（ｌ（ａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇ ｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）に対し て、５Ｘ１０”個の照射された（１００００ラド、６０℃）ベクターでトランス フェクションを受けた細胞（例、ＢＣ−ｒａｓ”）を−同腹腔内（ｉ、ｐ、）に 注射する。７日後に動物を安楽死させ、牌細胞（３ｘ　１０”　／ｍ）を、フラ スコ（Ｔ　−２５、Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ） 内で、照射された同系の形質導入細胞（６Ｘ　１０’　／　ｍｊ’）を用いてイ ンビトロで培養する。培地は、ＲＰＭ１１６４０、熱活性化されたウシ胎児血清 （５％、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）　、ピルビン酸ナトリウム（ ｌ　ｍＭ）　、ゲンタマイシン（５０℃ｇ／１ｌＪ）及び２−メルカプトエタノ ール（１０−’Ｍ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で構成されている。エフェクター細胞を４〜７日後に収穫し 、標準的な４〜６時間の検定で９６ウエルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｒ ｎｊｎｇ　Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）内でさまざまなエフェクタ一対 標的細胞比を用いてテストする。この検定では、最終的体積２００μｍで、Ｎａ ２”Ｃｒｙｓで標識づけされた（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈ ｅｉｇｈｔｓ。

１１１ｉｎｏｉｓ）（１０ｕＣｉ、　３７℃で１時間）標的細胞（ＩＸＩＯ’細 胞／ウェル）が利用される。インキュベーションの後、１００μｌの培地を除去 し、ベックマンのガンマ分光計において分析する。自発的放出（ＳＲ）は標的に 培地を加えたものからのＣＰＭとして、又最大放出（ＭＲ）は標的にＩＭのＨＣ ｌを加えたものからのＣＰＭとして決定される。標的細胞の百分率は、次のよう に計算される：〔（エフェクター細胞＋標的ＣＰＭ）−（ＳＲ）　／　（ＭＲ） 　−（ＳＲ）　）　Ｘ１００゜標的の自発的放出値は標準的にＭＲの１０％〜２ ０％である。

二車 マウスのプロベクターＤＮＡの調製 １、ＫＴ−３へのムチン遺伝子のクローニングムチンの変性形態に基づいた免疫 療法を開発するためには、多形上皮ムチン（ｒＰＥＭ　Ｊ　）のｃＤＮＡのため の遺伝子をパッケージングし、さまざまな細胞内に送り出し発現させることが可 能であることを示すため、以下の実験を行なうことができる。簡単に言うと、ム チンｃＤＮＡは、ＳＫ”ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇ ｏ、　（ａ）内で、ＩｍｐｅｒｉａｌＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎ ｄ（ＩＣＲＦ）のＪａｙｃｅ　Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕがら 得られる。全コーディング配列を含むもののポリアデニル化部位が欠如している ムチンｃＤＮＡフラグメントを、匣（ヌクレオチド３８）及びＢａｍＨＩ　（ヌ クレオチド＋７６６）での消化により分離する（ＥＣ３，１，２１゜４、　Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄ ｉａｎａ）　ａこの番号付けは、実際のｃＤＮＡクローンが約３２の縦列反復を 含んでいるのに対し単一の仮定的縦列反復しかもたない公表された配列に対応し ている。４．０キロベース（ｋｂ）のＸｍｎ　ｌ−ＢａｍＨＩムチンｃＤＮＡフ ラグメントは、フレノウ（ＥＣ２，７，７，７，、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ ｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｅｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）を用いて平滑 末端化され、ネオマイシン耐性遺伝子を含む複製欠損ＭｏＭｕ１．ＶＫＴ　−３ レトロウイルスバツクボーンへとクローニングされる（図５参照）。このレトロ ウィルスバックボーンをＸｈｏｌ及びＣ１ａｌで消化し、フレノウを用いて平滑 末端化し、末端を子牛腸内ホスファターゼ（ＣＩＰ　ＥＣ３，１３，Ｉ　Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉ ａｎａ）を用いて脱リン酸化する。

連結されたベクターを細菌細胞内に形質転換し、ｃＤＮＡの配向を、制限酵素を 用い又５′及び３′接合部を配列決定することによって決定する。センス配向て ＰＥＭを有するものをアンチセンス配向てＰＥＭを有するものという２つのクロ ーンを選択する。

Ｚ　パッケージング細胞系統ＣＡの形質導入ＣＦ−２のイヌ細胞系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ６５７４）に基づく複製欠損ベクターのパッケージングのための細胞系統 （ＣＡ）は、基本的に特許出願Ｗ０９２１０５２６６内に記述されているとおり に調製することができる。

簡単に言うと、ＣＡパッケージング細胞系統は、非ＬＴＲプロモーターを有する ２つの異なるプラスミドによってコードされるＭｏＭｕＬＶ両栄養性外膜及びｇ ａｇｐｏ　ｌタンパク質を発現する。さらに、ヒト細胞系統２９３を発現するＭ ｏＭｕＬＶｇａｇ　−ｐａｌ（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ１５７３から誘導された もの）は、特許出願ＷＯ９２１０５２６６で記述されているとおりに確立するこ ともできる。これは、この場合上記出願の中で記述されているＶＳＶＧタンパク 質である外膜発現ベクターを、ムチンｃＤＮＡを含む複製欠損レトロウィルスベ クターと同時トランスフェクションすることによって、異なる外膜特異性が発現 されつる可変性の部分的パッケージング細胞系統である。

上述のように調製される組換え型レトロウィルスベクター（ｒＰＥＭベクター」 と呼ばれる）はこのとき、Ｌ３３．　ＢＣｌｏＭＢ及びＣＡといった細胞系統を 形質導入するために利用することができる。

例７ マウス腫瘍系統の形質導入 ポリブレン（４ｍｇ／ｍ１．１．５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカ−メチ レン、ポリメト臭化物、Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒ ｉ）の存在下て、１−１０の感染多重度（ｒＭ、ｏ、Ｉ　Ｊ　）で、ムチンｃＤ ＮＡを含むＰＥＭベクターを用いて、Ｌ３３．　ＢＣＩＯＭＥ及びＣＡ細胞系統 を形質導入する。感染から２４時間後にＧ４［８選択を開始する。ＰＥＭを発現 するはずの細胞タイプを溶解させ、ＡＧＭ及び正常ムチンの両方によって発現さ れるエピトープを認識するＨＭＦＧ−１（ヒト乳脂肪球モノクローナル抗体）を 用いたウェスタンプロット法によって分析する。ＨＭＦＧ−１，ｌ（ＭＦＧ−２ 及びＳＭ３抗体は、ＩＣＲＦのＪｏｙｃｅ　Ｔａｙｌｏｕ−Ｐａｐａｄｉｍｔｒ ｉｏｕ博士から入手した。ヒト乳ガン細胞系統ＭＣＦ〜７（ＡＴＣＣＨＴＢ−２ ２）に比べてより低い分子量の形態が優位である状態で、３つの細胞系統全てに おけるムチン発現が実証されている。（図６参照）。電気泳動パターンは、さま ざまな分子量の形態のスミアという結果をもたらしたが、これはグリコジル化の 不均一性のせいであると推定される。これらのデータは、ムチンタンパク質がこ れらの細胞タイプにおいて過小グリコツル化されているのが優勢であり、従って ＳＭ３抗体によって認識されるＡＧＭエピトープを発現する可能性が最も高いと いうことを示唆している。

例８ ＢＣＩＯＭＢ検定 ムチンの変性された形態の発現を誘導するレトロウィルスベクターがＣＴＬ応答 を生成できるか否かを見極めるため、ＢＣＩＯＭＢ細胞又は、八ＧＭを発現する ２つの他のＢＣＩＯＭＢクローンのうちの１つのいずれかを用いて、Ｂａ１ｂ／ Ｃマウスに注射する。これらのマウスに対しては、１、ＯＸＩＯ’の照射済み（ １００００ラド）のベクター形質導入を受けた細胞を腹腔内（ｉ、　ｐ、　）に −回注射した。７日〜１４日後に動物を安楽死させ、収穫した牌細胞（３０００ ０００細胞／−）を照射されたムチンベクター形質導入を受けた細胞（６０００ ０細胞／−でそれぞれＢＣＩＯＭＢ、ＢＣＩＯＭＥ　ＡＧＭ＃６又はＢＣＩＯ旺 ＡＧＭ渭ｌＯのいずれか）を用いて培養する。

培地は、５％の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ、１（ｙｃｌｏｎｅ　Ｌ ｏｇａｎ。

Ｕｔａｈ）、１−のピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｌＨ＝７ ．４．５０μｇ／ＩＩＩＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ ｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）及び１．０×１０−’の２−メルカプトエタノールで 補足されたＲＰＭ１１６４０　（Ｉｒｖｉｎｅにおいで９６ウエルのマイクロタ イタープレート内でさまざまなエフェクタ一対標的細胞比を用いてテストする。

この検定では、２００μｌの最終的体積で、放射性クロムで標識性された（ＣＲ ”標的細胞（１００００細胞／ウエル）が利用された。インキュベーションの後 、さまざまなウェルから１００μｌの上溝を除去し、ベックマンのガンマ計数器 （Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｃａ１ｉｆ）が分析する。標的細胞溶解の百分率は、〔（ エフェクター細胞上標的ＣＰＭ）−（ＳＲ）／（ＭＲ）−ＳＲ）　Ｘ１００とし て計算される。ＡＧＭ発現クローン（ＢＣ１０ＭＢ＃６）のうちわずか１つだけ がＣＴＬ応答を生成した（図７参照）。

２つのＡＧＭクローンについて何故ＣＴＬ応答が異なるのかを理解するためには 、これらのそれぞれのクローンの表面上でＡＧＭの発現レベルを測定することが 必要である。マウスのｌ（ＭＦＧ−２又はＳＭ３モノクローナル抗体を用いてＡ ＧＭ＃６及びＡＧＭ＃１０の単一細胞懸濁液をインキュベートし、洗浄し、ＰＴ ＴＣ−接合させたウサギ抗マウス抗体を用いてインキュベートし、次に蛍光活性 化セルソーター（ＰＡＣ３）内で分析する。ＡＧＭ＃１０のＦＡＣ３分析は、細 胞表面上のＡＧＭの発現を確認した。

ＣＴＬ応答を生成したクローンＡＧＭ＃６は、ＡＧＭの表面発現が全く無いこと を実証した（図８参照）。しかしながら、以前のウェスタンプロット分析データ は、クローンＡＧＭ＃６がまさにＡＧＭを細胞内で発現することを確認していた 。従って、ＣＴＬ応答の誘発は、自己ＭＨＣ分子の情況下でマウスのＴ細胞がＡ ＧＭを認識でき、表面上で発現された大量のＡＧＭがＭｌ（Ｃによるペプチドの 提示を遮断できるという可能性を示唆している。

例９ 腫瘍形成性に対するＰＥＭの効果 以下の実験は、ムチンが腫瘍の形成を阻害できるか否かをテストするために行な うことができるものである。簡単に言うと、ポリブレン（４ｍｇ／　ｍｌ　）の 存在下で１−１０のＭ、　０．　Ｉ、てムチンｃＤＮＡを含む複製欠損ウィルス 粒子を用いてＢＩ６Ｐ１０細胞系統を形質導入した。２４時間後にＧ４１８選択 を開始する。次に、親８１６ＰＩＯ又はムチンを発現する２つのＢ１６Ｆ１０ク ローンのうちの１つのいずれかの細胞４０００００個を静脈内でマウスに注射す る。クローンのうちの１方は、親８１６Ｐ１０又はもう１方のムチン発現クロー ンのいずれかよりもわずかに低い腫瘍形成性を存することが示された。これは、 いずれかの形態のムチンの表面発現により生み出される免疫原性の増大によるも のと想定されている（図９）。

例ＩＯ ＰＥＭベクターの注射によるＰＰＭ発現腫瘍に対するマウスの予防接種 ムチンの変性された形態の発現を誘導するレトロウィルスベクターかワクチンと して機能できるか否かをテストするため、マウスに対し、レトロウィルスベクタ ーをコードするムチンを注射し、次にムチンを発現する８１６ＰＩＯ又は旧６Ｆ ＩＯ細胞で攻撃誘発した。簡単に言うと、各用量間に１週間置いて２用量の摂生 法で、２一体積中１．８Ｘ　１０＠のウィルス粒子を、予め処置されたＣ５７１ Ｂｌ／６のマウスに腹腔内注射する。２回目のベクター用量から２週間後に、ム チンを発現するＢＩ６ＦＩＯ又はＢＩ６ＦＩＯのいずれかを用いて静脈内４００ ０００個の細胞でマウスを攻撃誘発する。図１０のデータが実証しているように 、ムチンベクターでの免疫化は、ムチン発現腫瘍のその後の成長に対する防御を 行なった。

以上のことから、ここでは例示を目的として、本発明の特定の実施態様について 記述されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくさまざまな修正 を加えることができるということもわかるだろう。従って、本発明は、添付のク レームによってのみ制限されるものである。

浄書（内容に変死なし） 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変！なし） 浄書（内容に変更なし） 浄啓（内容に変更なし） ムチン　ｃＤＮＡ　ＳＶ４０　Ｎｅ。

ＦｆｆＧＵＲＥ５ Ｆ”１ＧＵＥＥ　７ ＢＣＩＯＡＩＥ ７　ＦＩＴＣ２００ ＣＩＯＭＥ 浄詐（内容に変可なし） ＦｆｆＧＵＲＥ　１０ 手続補正書 平成６年す月７日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．変性された細胞成分の少なくとも１つの免疫原性の非腫瘍形成性形態の発現 を誘導するベクター構成体。
2. ２．前記細胞成分が点突然変異によって変性されている、請求の範囲第１項に記 載のベクター構成体。
3. ３．前記細胞成分が染色体転座によって変性されている、請求の範囲第１項に記 載のベクター構成体。
4. ４．前記細胞成分が欠失により変性されている、請求の範囲第１項に記載のベク ター構成体。
5. ５．前記変性された細胞成分がｒａｓ＊，ｐ５３＊，Ｒｂ＊、ビルムス腫瘍遺伝 子によりコードされた変性タンパク質、ユビキチン＊、ＤＤＣ，ＡＰＣ，ＭＣＣ ，ｎｅｕ、変性レセプター及びｂｃｒ／ａｂｌｒａｓ＊から成るグループの中か ら選択されている、請求の範囲第１項に記載のベクター構成体。
6. ６．変性された細胞成分の前記非腫瘍形成性形態がΔｒａｓ＊１２，Δｒａｓ＊ １３、及びΔｒａｓ＊６１から成るグループの中から選択されている、請求の範 囲第１項に記載のベクター構成体。
7. ７．前記構成体がｒａｓ＊及びｐ５３＊の両方の発現を誘導する、請求の範囲第 １項に記載のベクター構成体。
8. ８．前記構成体が、ｒａｓ＊、ムチン＊及びＤＣＣの発現を誘導する、請求の範 囲第１項に記載のベクター構成体。
9. ９．請求の範囲第１項乃至第８項のいずれか１項に記載のベクター構成体を支持 する組換え型レトロウイルス。
10. １０．ムチン＊の発現を誘導するベクター構成体を支持する組換え型ウイルス。
11. １１．前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイ ルス及びボックスウイルスから成るグループの中から選ばれている、請求の範囲 第１項乃至第８項のいずれかに記載のベクター構成体を支持する組換え型ウイル ス。
12. １２．請求の範囲第１０項に記載の組換え型レトロウイルスの感染を受けた標的 細胞。
13. １３．ヒト、マカク、イヌ、ラット及びマウスから成るグループの中から選択さ れる、請求の範囲第１２項に記載の標的細胞。
14. １４．請求の範囲第１１項の組換え型ウイルスの感染を受けた標的細胞。
15. １５．ヒト、マカク、イヌ、ラット及びマウスから成るグループの中から選択さ れる、請求の範囲第１４項に記載の標的細胞。
16. １６．請求の範囲第１０項の組換え型ウイルスの感染を受けた標的細胞。
17. １７．治療的活性物質として使用するための、変性された細胞成分の免疫原性の 非腫瘍形成性形態を含む組成物。
18. １８．治療的活性物質として使用するための、請求の範囲第１項乃至第８項に記 載の組成物。
19. １９．治療的活性物質として使用するための、請求の範囲第９項乃至第１１項に 記載の組成物。
20. ２０．選択された腫瘍細胞を処理するための薬剤を製造するための、変性された 細胞成分の免疫原性非腫瘍形成性形態を含む組成物の利用。
21. ２１．選択された腫瘍細胞を処理するための薬剤を製造するための、請求の範囲 第１項乃至第８項に記載の組成物の利用。
22. ２２．選択された腫瘍細胞を処理するための薬剤を製造するための、請求の範囲 第９項乃至第１１項に記載の組成物の利用。