JPH07502015A

JPH07502015A - タンパク質配列決定法

Info

Publication number: JPH07502015A
Application number: JP5501560A
Authority: JP
Inventors: ファーンズワース、ヴィンセント
Original assignee: ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド
Priority date: 1991-06-21
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2011-10-16
Also published as: EP0549752A1; EP0549752B1; EP0884324A3; DE69228669D1; JP2543010B2; DE69228669T2; US5270213A; WO1993000355A1; EP0884324A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質配列決定法発明の分野本発明はタンパク質分析用のフェニルチオ−カルバミルアミノ酸の産生方法に関する。

発明の背景エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解は、十分に確立されたタンパク質の連続分解法である。タンパク質のアミノ末端アミノ酸を取出し、それを分析に適した形態に転化させるには、３種類の反応が必要とされる。

その第一の反応（カップリング反応）は、タンパク質の末端アミノ基にフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を付加させることによってアミノ末端を修飾する。この反応は１通常は塩基触媒反応である。

次いで、得られたフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）タンパク質を、第二の反応（切断反応）において無水酸で処理する。該第二の反応（切断反応）は、ＰＴＣ基由来の硫黄がタンパク質鎖中の第一のカルボニル炭素と反応することを可能にする。この環化反応は、タンパク質の第一のアミノ酸をアニリノチオシリノン（ＡＴＺ）誘導体として分離すること結果として生じ、しかもタンパク質中の次のアミノ酸をＰＩＴＣカップリング反応の次のラウンド（ｒｏｕｎｄｌに暴露させる状態にする。第三の反応（転化反応）では、前記ＡＴＺアミノ酸が水性酸中でフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸に転化される。　ＰＴＨは、ＡＴＺよりも安定であり、しかも容易に分析できる。このエドマン分解法は、化学又は試料の制限によってさらなる分析が不可能になるまで継続し得る。

一般的に、エドマン（Ｐ、　Ｅｄｍａｎ）がこのタンパク質の自動連続分析法をｌ１％′ｆｙ３１こ報告（参考文献１）して以来ずっと、フェニルチオ上ダン１ −イン（ＰＴＨ）アミノ酸がエドマン反応の最終生成物であると考えられている。該１’Ｔ）Ｉは、前記アミノ酸の比較的安定な形態であり、しかもエドマン酸切断工程の生成物から水性酸による処理によって容易に産生する（ｇｅｎｅｒｈｔｅ）　、この転化反応は、前記切断工程の後に存在するＡＴＺアミノ酸、ＰＴ［アミノ酸及びＰＴ）ｌアミノ酸の混合物から単一のＰＴ１１アミノ酸誘導体を得るための簡単な方法を提供・６る。

前記切断反応の理論“を酸物１ｊ：ＡＴＺであるが、実際にけ、酸性切断後環境にお４−ＪるＡＴＺの部分転化によって瀘意量のＰｉＧ誘導体及びＰＴＨ誘導体が存在することが認められ５べきである。別の種／７の要因、例えば配列決定化学薬品中の還元剤の存在もよ／：′：、前記アミン“酸誘導体類の最終的割合に影−７を及ぼす。この転化の程度（４、また、無水酸切断条件下でｉ’ＴＩを生成する最も大＠　ｔｔ　ｒＲ向を示ｒのはアスパラギン酸ＡＴＺ誘導体でＪ）す、特定のアミノ酸にも幾分左右される。

低いピコモル範囲内のＰＴＨアミノ酸を高性能・液体クリマドグラフィー（Ｈ円、Ｃ）や紫外線（ＵＶ）吸収法を使用ｔ７で分析すること１ゲ可能である。この性能の水準はほとんどの用途に受け入れられる７＞≦、重要な多数の天然産ベプ千ド及びタンパク質は極めて低い〔ナブビコモル（ｓｕｂｐｉｃｏｍｏｌａｒ）　］量でしか得られないし、しかもＵＶ検出感度の限界のために現在の配列決定法を用いて分析１″ることはできない。

タンパク質微量調製法にお１する新たな開発が、微少量のｔＩＩＪ＝ａさ第１゜たタンパク質を配列決定用に調製することを可能にしている９例えば、ゲル電気泳動の後にシークエンザ−（ｓｅｑｕｃｎｃｅｒ　：配列決定装置）適合性膜に移すことによ一ンてクンバク質を単離する最近開発された方法（参考文献２）は、サブピコモル量の試料を精製された形態で調製することを可能にしている。しかしながら、慣用の染色法によって目視できる膜上のタンパク質バンドは、首尾良く配列決定するための濃度が低すぎる場合が多い８本出願人には、これらの低い濃度において分析を妨げる主な要因はエドマンの化学又は計測に固有の制限ではなく　ＰＴ）Ｉアミノ酸同定の方法であると思われる。

従って、配列決定化学及びπ１測はそのままにして（ｉｎｔａｃｔ）、　Ｉ＆終主生成物検出感度を高める方法においで該最終生成物を改変する方法を探求することが望ましい。

Ｉｎ１ｎａｎとＡｐｐｅｌｌａは、水性酸転化工程をどりやめて、切断後混合物中に存在するＡＴＺアミノ酸をメチルアミンと反応させることによってエドマン反応の最終生成物を視覚化する方法を報告した（参考文献３）。これらの生成物、すなわちノエニルヂオカルバミルアミノ酸メチルアミド（ＰＴＭＡアミノ酸）は、紫外領域において吸収するので、感度の著しい増強はＰＴＨ分析については実現されない、しかしながら、彼らの報告は、切断後に存在するＡＴＺアミノ酸を第−汲アミンと反応し得ろ方法を記載しているという理由から重要であるａ　ＴＳＩＪｇｉｊａら（参考文献４）及び１ｏｒｎら（参考文献５）はこのアブ口・−チを採用し、それをよりよい検出感度を提供する方法に応用している。彼らは、＾ＴＺアミ、ノ酸が放射性及び蛍光性の第一級アミン（ＴｓｕｌｚＬｔａ）又は蛍光性アルコール（Ｈｏｒｎ）と反応性であることを明らかにしている。これらの化合物は、紫外線吸収によって可能な濃度よりもさらに低い濃度で容易に検出される。

■が用ｉｔａの方法とＨｏｒｎの方法の両方は、ピコモル濃度以下で首尾よい配列決定分析の可能性を提供するが、それらの方法はまた幾つかの欠点も招く６例えば、酸切断後のエドマン分解の理論値線生成物はＡＴＺアミノ酸であるが、同様に存在するＰＴＣアミノ酸及びＰＴＨアミノ酸の若干量が常に存在する。該ＰＴＣアミノ酸及びＰＴＨアミノ酸はＡＴＺアミノ酸と異なり、前記の第一級アミン又はアルコールと反応しないので所望の検出可能な化半種を生成せず、このような次第で該方法の有効感度を低下させる。上記アミノ酸類のうちの幾つかの場合には、生成物のほとんど全部は、エドマン分解（前記参照）の切断工程中のこれらのアミノ酸類の酸転化によるＰＴＣ及び／又はＰＴＨであり得る。さらにまた、分解化学反応を害するであろう痕跡量の酸素又は過酸化物を捕そくすることを促進するためにエドマンの化学において還元剤を入れるのが慣例である。これらの酸化性汚染物質の悪影響は、分析されるタンパク質の量が少なくなるのに比例して大きくなる。このことは、配列決定される試料の量がますます少なくなるのにしたがってエドマン分解の反復効率において急激な減少として容易に認められる。あいに（、還元剤の存在は。

分解化学を保護しながら、感度増強反応に利用できるＡＴＺをほとんど放出させないでＰＴＨの方に切断後生成物の割合を大きく変化させる（図１参照）。この効果はまた、配列決定される試料の鳳が少なくなればなるほど増幅されるように思われる。

また、切断後混合物中にＡＴＺアミノ酸の２個以上の形態が存在する有無をいわせない形跡が存在する（図２８参照）。これらの推定される変異性体のうちの一つは、第一級アミン類又はアルコール類と反応性ではない、典型的な切断後混合物は、有意な量でこの非反応性体を含有し得る。該混合物をニートのトリフルオロ酢酸でさらに処理すると、反応性体に対する比率が変化するが、該混合物中のＰＴＣ及びＰＴＨの割合も増大する（図２ｂ参照）。これらの効果の全ては、共同して働いて感度増強反応に利用し得るＡＴＺの量を大幅に減少させる。

切断後エドマン生成物に対して直接的に作用する増強された化学を使用することによって得られた公表された配列データにおいては、これらの効果の全ては、特に全く存在しないと思われるアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン及びグルタミンの高められた生成物の濃度に関して、疑いもなく明らかである（参考文献４）、この効果は図３に示される。本発明は、ＰＴＨアミノ酸、ＰＴＣアミノ酸及びＡＴＺアミノ酸からなる切断後混合物を均質な反応性ＡＴＺアミノ酸に転化させることによってこれらの逆効果を克服しようするとするものであり、しかもまた感度の増強された化学の効率を低下させることなくエドマン分解の効率を保つためにエドマン配列決定化学薬品中の還元剤の使用を可能にさせるものである。

発明の概要本発明の目的は前記の諸欠点を克服することにある。

本発明の別の目的は、ピコモル量又はサブピコモル量でタンパク質を配列及び配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）することにある。

本発明の別の目的は、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸又はアニリノチオシリノン（ＡＴＺ）アミノ酸から一段階でフェニルチオカルバミイル（ＰＴＣ）アミノ酸を産生させることにある。該ＰＴＨアミノ酸又はＡＴＺアミノ酸は、タンパク質のエドマン分解の生成物であり得る。

本発明のさらに別の目的は、フェニルチオカルバミイル（ＰＴＣ）アミノ酸から反応性のアニリノチオシリノン（ＡＴＺ）アミノ酸を産生させることにある。

本発明のさらまた別の目的は、還元性条件下に水性塩基中でフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸をＰＴＣアミノ酸に転化させ、次いでルイス酸を用いてＡＴＺアミノ駿に転化させる２工程法でフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸から反応性のアニリノチオシリノン（ＡＴＺ）アミノ酸を産生させることにある。

本発明は、酸切断工程の後に新規な単一工程によってニドマン分解の最終生成物として均質なフェニルチオカルバミイル（ＰＴＣ）アミノ酸を産生させることに関する。この新規な転化反応は、先のエドマン分解法における水性酸転化工程に取って代わるものであり、該反応においてはＡＴＺアミノ酸が分析される最終生成物である。得られるＰＴＣアミノ酸は、紫外線吸収法によって直接に分析し得る。切断後混合物中のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸とアニリノチオシリノン（ＡＴＺ）アミノ酸の両方は、前記と同じ新規化学を使用して単一反応でフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸に転化し得る。エドマン切断工程後に存在するアミノ酸誘導体類（例えば、ＡＴＺアミノ酸、ＰＴＣアミノ酸及びＰＴＨアミノ酸）の混合物は、還元剤の存在下で塩基触媒比重転位反応及び開環反応によってＰＴＣアミノ酸に転化し得る。該混合物中に存在するＰＴＣアミノ酸は、この化学によって影響されないので、均質なＰＴＣアミノ酸生成物が得られる。該ＰＴＣアミノ酸は適切な条件下で安定であり、ピコモル濃度で慣用のＨＰＬＣ法／ｌｌＶ法によって簡単に分析される（図４及び図１１参照）。

この塩基触媒転化反応は、伝統的な酸触媒エドマン転化反応よりも優れた幾つかの利点を提供する。第一には、ＰＴＣアミノ酸アミド、アスパラギン及びグルタミンはこれらの温和なアルカリ条件下でそれらの反応性の酸に脱アミドしないので、均質な生成物が高収率で得られる。第二には、ＰＴＣアミノ酸は、同様の条件下ではＰＴＩ（アミノ酸よりも安定である。比較的均質なＰＴＣアミノ酸を製造できる適当な転化化学が存在していなかったので、ＰＴＨアミノ酸は歴史的に分析最終生成物として使用されてきている。

また、　ＰＴＣアミノ駿を直接に分析してサブピコモル量の感度を得る代わりに、該ＰＴＣアミノ駿をサブピコモル濃度で検出可能な誘導体に転化し得る。　ＡＴＺアミノ酸、ＰＴＣアミノ酸及びＰＴＨアミノ酸からなる切断後混合物は、２工程法でＡＴＺアミノ酸の均質な調製物に転化される。該２工程法においては、ＰＴＨアミノ酸が先ず前記のように（塩基と還元剤の存在下で）　ＰＴＣアミノ酸に転化され、次いで該ＰＴＣアミノ酸がルイス酸で処理されることによってＡＴＺアミノ酸に転化される０次いで、このＡＴＺアミノ酸を、標識化剤、例えば放射性又は蛍光性のアルコール又はアミンと反応させて、より検出可能な化合物を製造し得る。適当な蛍光性アミンとしては、フルオレセイン、エオシン及びローダミンのアミン、例えば４°−（アミノメチル）フルオレセイン又は５−（アミノアセトアミド）フルオレセインが挙げられる。蛍光性アルコールの例としては、フルオレニルメチルアルコール、１−ピレンノナノール、ｌ−ピレンメタノール又は１−ピレンブタノールが挙げられる。放射性標識については、例えばＴｓｕｇｉｔａの論文、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、、１０３：３９９−４０１　（１９ｇ＆）（放射性標識化ヨードヒスタミン）が参照される。他の標識は、参考文献４及び５に記載されている。好ましい標識はフェニルチオカルバミルアミノフルオレセイン（ＰＴＣＡＦ）である。蛍光性標識又は放射性標識が好ましいが、検定技術で公知でありしかもアミノ酸と相溶性の任意の検出可能な標識が使用し得る。

本発明を最初にＰＴＣ−アミノ酸を産生させるのに使用する場合には、該ＰＴＣ −アミノ酸をＡＴＺアミノ酸に転化させ、次いで前記のように操作することによって、さらに別の分析化学に切り替え得る。

従って、ＰＴＣアミノ酸は、出発点であってそれから、エドマン分解反応が完結した後に、例えばルイス酸で処理することによって高収率でアミノ反応性訂Ｚアミノ駿を産生ずる出発点を提供する。このことにより、この化学を用いてＡＴＺアミノ酸を還元剤の存在下であっても再生し得るので、エドマン切断工程の間に又は後にＡＴＺアミノ酸が自然にＰＴＣアミノ酸やＰＴＨアミノ酸に転化するという問題が巧みに回避される（図５ａ参照）。このようにして産生されたＡＴＺアミノ酸は、多数の感度増強性化合物例えば前記の文献にすでに報告された化合物と反応し得る（図５ｂ参照）。ＰＴＣアミノ酸はまた検出感度を高め得る化合物と直接に反応し得る。

実用的検討として、本方法はまた標品として使用し得る種々のアミノ酸誘導体の定量的産生を促進する０例えば、現在、アミノ酸分析を定量するのに使用されるＰＴＣアミノ酸標品を産生させるためには、全てのアミノ酸をエドマンカップリング反応工程に供しけなければならない、このことは、アルカリ性条件下でフェニルインチオシアネートを使用することを意味する。ＰＩＴＣがあまり揮発性ではないという理由及び種々の副反応が生じるという理由から、次後の分析において説明をしなければならない望ましくない副生物（例えば、ジフェニルチオ尿素、ジフェニル尿素等）が常に存在する。本発明の方法を使用すると、商業的に入手し得るＰＴ）ｌアミノ酸を正確に秤量し、次いで本発明の化学に供してＰＴＣアミノ酸を生成させ得る。妨害性の不揮発性反応剤又は競争副反応が存在しないので、得られる標品は調製及び定量するのがより容易である（図６参照）。

ＡＴＺアミノ酸の感度増強化製品用種晶の現在使用されている産生方法の場合には、その状況がさらに複雑である（参考文献４）、一連のペプチドであって各々そのＮ−末端において異なるアミノ酸を有する一連のペプチドについて実際のエドマン分解を行うことによって先ずＡＴＺアミノ酸を産生させ、次いで得られた生成物を所望の検出化合物と反応させ、次いで得られた生成物をＨＰＬＣで精製し、最後に上記化合物を秤量することが必要となっている。この方法は標準混合物中の諸アミノ酸の各々について行わなければならない。本発明の方法は、上記標準に対してはるかに簡単なルートを提供する。

ＰＴＣアミノ酸を、入手し得るＰＴＩ（アミノ酸から産生させた後に、該ＰＴＣアミノ酸を揮発性ルイス酸を用いた処理に供する。該ルイス酸は、減圧で除去し、次いで得られたＡＴＺアミノ酸を所望の検出化合物と反応させ、定量する（図７参照）。

本発明によれば、フェニルチオヒダントインアミノ酸又はアニリノチオシリノンアミノ酸を稀薄塩基と還元剤とを用いて処理することによって均質なフェニルチオカルバミルアミノ酸が得られる。

反応性アニリノチオシリノンアミノ酸はフェニルチオヒダントインアミノ酸から、該フェニルチオヒダントインアミノ酸を水性塩基中でフェニルチオカルバミルアミノ酸に転化させ、次いで該フェニルチオカルバミルアミノ酸をルイス酸を用いてアニリノチオシリノンアミノ酸に転化させることにより産生される。アニリノチオシリノンアミノ酸を１種々の化合物と反応させて高検出性のアミノ酸、例えば４−アミノフルオレセインにし得る。

本発明の化学の別の利点は、以下の記載、請求の範囲及び図面から明らかであろう。

図面の簡単な説明図１はエドマン分解の切断生成物に対する還元剤の影響を示すものである。

図１ａは、アミノ末端アミノ酸としてアラニンを用いたペプチドについて行った手動のエドマン分解の最初のサイクルの切断後生成物のｔｌＶ／Ｉ（ＰＬＣクロマトグラムである。切断及び抽出は還元剤の不存在下で行った。図１ｂは、還元剤としてジチオトレイトール（ＤＴＴ）　ｆ！：存在させた場合の切断後生成物のＵＶ／ＨＰＬＣクロマトグラムである。１と表示したピークはＰＴＣアラニンであり、ピーク２はＰＴＩ（アラニンであり、ビーク３はＡＴＺアラニンである。星印（＊）で表示したピークはエドマン分解反応副生物である。還元剤を存在させると、切断後生成物の割合は、ＡＴＺ誘導体からＰＴＨ誘導体の方に明らかに移動する。

図２は２個以上のアラニン互変異性体の証拠を示すものである。

図２ａは、アミノ末端にアラニン有するペプチドについて行った手動のエドマン分解の最初のサイクルの切断後生成物のＵＶ／ＨＰＬＣクロマトグラムである。

図２ｂは、ニートのトリフルオロ酢酸を用いて処理した後の上記と同じ切断後混合物である。ビーク１はアラニンのＰＴＣ誘導体であり、ビーク２はＰＴＨ誘導体であり、ビーク３は推定非反応性ＡＴＺ互変異性体であり、ビーク４は反応性訂２アラニン誘導体である。星印（＊）で表示したピークは分解化学における副生物である０図２ｃは、図２８の切断後生成物をアミノフルオレセインと反応させた結果を示す蛍光クロマトグラムである０図２ｄは、図２ｂの切断後生成物をアミノフルオレセインと反応させた結果を示す蛍光クロマトグラ牟である。５と表示したピークは、実施例３に述べた化学を行うことによって生成されたアラニンのＰＴＣＡＦ誘導体である。切断後生成物のストレートのトリフルオロ酢酸処理は、ＰＴＣＡＦ応答の大きな増加によって明らかにされるように、ＡＴＺアラニンの推定非反応性互変異性体が反応性ＡＴＺ互変異性体に変化していると思われる。

図３は、本発明の化学の実用性を示す２つのシークエンサー実験の比較である。

、図４は、エドマン分解サイクルの後のＰＴＨアミノ酸又はＡＴＺアミノ酸のいずれかよりのＰＴＣアミノ酸の産生を示すものである。

図５は、ＰＴＣアミノ酸からの反応性ＡＴＺアミノ酸の産主における本発明の化学の有効性を示すものである。

図６は、商業的に入手し得るＰＴＨアミノ酸からＰＴＣアミノ酸を産生させた結果を示すものである。

図７は、本発明の化学（実施例１．２及び３に述べたもの）を使用して、商業的に入手し得るＰＴ）ｌアミノ酸から産生させたＰＴＣＡＦアミノ酸の幾つかの蛍光クロマトグラムを示すものである。

図８は、本発明の化学を使用してＰＴＨアミノ酸から反応性ＡＴＺアミノ酸を産生させた結果を示すものである。

図９は、本発明の化学を使用してＡＴＺアミノ酸からＰＴＣアミノ酸を産生させ得ることを示すものである。

図１０は、β−ラクトグロブリンＡの試料２０ピコモルからの２つのシークエンサーサイクルを示すものである。

図１１は、シークエンサー実験の最初の３サイクル（図１１ａ、ｂ、ｃ）を示すものである。該実験において、切断後生成物は、２５％トリフルオロ酢酸の代わりに５％水酸化アンモニウムを用い、　０．００３％ＤＴＴを移動溶媒（酢酸エチル）に加えて自動的にＰＴＣアミノ酸に転化される。シークエンサーにはβ− ラクトグロブリンＡの１００ピコモルが装填され、該試料の４０％が分析される。このことは、エドマンの分解化学を使用して自動化装置から高収率でＰＴＣアミノ酸を製造し得ることを示す。

図１２は、シークエンサー実験からの幾つかのサイクルを示すものであり、該実験においては、切断後生成物は自動的にＰ丁Ｃアミノ酸に転化され、次いで実施例３に述べた蛍光標識化学に供せられる。

発明の詳細な説明典型的な計測においては、切断工程後のエドマン反応の生成物であってＡＴＺアミノ酸、ＰＴＣアミノ酸及びＰＴＨアミノ酸を包含し得る生成物は、塩基と還元剤とを用いて処理することによってＰＴＣアミノ酸に転化される。

フェニルチオヒダントイン環は塩基によって開環される。恐らくは、該塩基は７よりも高いｐＨをもつ水溶液の形態であり、該水溶液は適当な塩基を水に溶解することによって得ることができろ。該塩基は、強塩基例えば水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムであり得るし、あるいは弱塩基例えば水酸化アンモニウムであり得る。本発明に使用できる別の弱塩基としては、第一級アミン、第二級アミン及び第三級アミン例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、アニリン、ジフェニルアミン、ピリジン及びキノリンが挙げられる。

フェニルチオヒダントイン環はまた、極性溶媒例えばジメチルホルムアミド、アセトニトリル又は低級（Ｃ１−Ｃ４）アルコール中で塩基を用いることによっても開環できる。しかしながら、この反応は完全ではあり得なく、若干量のフェニルカルバミルアミノ酸がフェニルチオカルバミルアミノ酸と共に生成し得る。

塩基の濃度は０．１％〜１０％の範囲内であり得るが、この濃度は塩基の溶解度及びイオン化定数に応じて変化させ得る。しかし、塩基ては、３％よりもはるかに高い濃度は、アミノ酸誘導体の分解を生じるが、より高い濃度の第三級アミンは許容される。また、塩基の物理的特性が重要であり得る０例えば、高められた温度における塩基の溶解度は劇的に変化する。水酸化アンモニウムの水溶液中に存在する水素結合は、第三級アミンの水溶液に比べてはるかに高い転化温度の使用を可能にする。このことは、反応時間及び塩基の揮発性が重要な要素である配列決定装置の転化フラスコ中で反応が行われる場合には重要である。

還元剤は、慣用の還元剤例えばジチオトレイトール又はβ−メルカプトエタノールであり得るし、また慣用のスルフヒドリル含有化合物であり得る。還元剤、例えばＤＴＴ又はＢＭＥの濃度は、０．００１％〜０．１％の範囲内又はそれよりも高いものであり得るが、実用上の理由から０．０１％が優れた選択である。還元剤は前記塩基と共に混合してもよいし、あるいは別々に添加してもよい０例えば、タンパク質シークエンサーに関しては、エドマン切断生成物を反応カートリッジかも転化フラスコに移すのに使用される溶媒中に存在させたＤＴＴ又は別の還元剤であってもよい、この溶媒中の還元剤の濃度が適切に選択される場合には、移動溶媒を蒸発させた後の転化フラスコに塩基が添加されるとすでに所定量の還元剤が存在するであろう、このことが好都合であるばかりではなく、多くの還元剤は水性塩基中でよりも中性溶媒中でより安定である。

反応は、高められた温度例えば５０℃で１５分間行うのが好ましい。

反応は室温で生じるが、その場合にはさらに長い温置時間（例えば、１〜２時間）が適当である。さらに高い温度を使用してもよいが、その場合には該温度が反応剤又は生成物を分解させるほどには高くないということを条件とする。

好ましい態様においては、前記の稀薄塩基は、２．５容量％トリエチルアミン（ＴＥＡ）水溶液又は１容量％水酸化アンモニウム水溶液であり得る。還元剤は０．Ｏ１重量％の濃度で存在させるのが好ましく、該還元剤はジチオトレイトール（ＤＴＴ）であってもよいし、あるいは揮発性の還元剤が好ましい場合には０．０１％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）であってもよい１反応は不活性雰囲気中で高められた温度（５０℃）で１５分間にわたって行われる。

ＰＴＣ酸のＡＴＺ酸への転化に有用なルイス酸については、任意のルイス酸すなわち電子対を受容でき、反応混合物と相溶性である任意の薬剤がこの転化反応に使用できる。使用できるルイス酸の例としては、トリメチル硼素、三弗化硼素、三塩化硼素、塩化アルミニウム、弗化水素酸、燐酸、塩化第二錫及び塩化第二鉄が挙げられる（Ｔａｒｒの論文すなわち参考文献６参照）。

好ましい態様の幾つかを幾つかの実施例によりさらに説明する。

実施例１フェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体は、フェニルチオヒダントインアミノ酸から下記のようにして調製される。

１、秤定量のＰＴ）ｌアミノ酸を３００μｍガラス製反応管に入れる。

２、トリエチルアミンの１０％（ｖ／ｖ）水溶液を調製する。

３、不活性気体を吹き込んである水から、ジチオトレイトールの０．０１％（ｗ／ｖ）水溶液を調製する。

４、　次いで、工程３で得たＤＴｒ（ジチオトレイトール）溶液３０μｍを前記反応管に加える。

５、工程２で得たＴＥＡ　（）リエチルアミン）溶液ｌＯμｍを前記反応管に加える。

６、不活性気体を前記反応管に加え、該反応管に蓋をし、反応生成物を混合し、該反応管を約５０℃で１５分間保持する。

７、前記反応管の加熱を止め、内容物を減圧乾燥する。

８、　アセトニトリル４０μｌを加え、該反応管を旋回させ、次いで内容物を減圧乾燥する。この工程は痕跡量の塩基を除去するのに必要であり、さらに化学を行うべき場合には必須である。

得られたＰＴＣアミノ酸は、不活性雰囲気中で乾燥及び冷却状態が保たれる場合には、この形態で長期間貯蔵し得る。

図５ａは、実施例１に述べた化学を使用して商業的に入手し得るＰＴＨアミノ酸から産生させた２種類のＰＴＣアミノ酸（アラニンとバリン）からなる混合物の実施例２に述べた化学を用いて処理する前（図５ａ）及び処理後（図５ｂ）のＵＶ／ＨＰＬＣクロマトグラムを示すものである。　ＡＴＺアミノ酸誘導体は高収率で生成する。上記クロマトグラフィーシステムはＰＴＨ／ＰＴＣの検出により理忍的と考えられること及びこの装置におけるＡＴ２アミノ酸誘導体の応答は比較的低いことが認められる。

図５０は、実施例３に述べた化学を使用して、図５ｂ中のＡＴＺアミノ酸とアミンフルオレセインとの反応により得られる生成物（ＰＴＣＡＦアラニンとＰＴＣＡＦバリン）の蛍光クロマトグラムを示すものである。

図６は、前記に述べた諸工程を使用して、商業的に入手し得るＰＴＨアミノ酸から調製した２種類のＰＴＣアミノ酸の混合物を示すものである。図６８は、秤量し、ＨＰＬＣ装填溶媒に溶解され、注入された２種類のＰＴＨアミノ酸（アラニンとバリン）の混合物のＵＶ／ＨＰＬＣクロマトグラムである。図６ｂは、ＰＴＣアミノ酸を産生させるために実施例１に述べた化学を行った後の上記と同じ混合物のクロマトグラムである。妨害性のエドマン化学の副生物が存在しないこと認められる。

図８ａは、開業的供給源から得られるＰＴＨアラニンのＵＶ／ＨＰＬＣクロマトグラムである。図８ｂは、実施例１に述べた化学を使用して、図８８のＰＴＨアミノ酸から産生させたＰＴＣアラニンである。図８０は、実施例２に述べた化学を使用して、図８ｂのＰＴＣアラニンから産生させたＡＴＺアラニンである。先の生成物が存在していないことによって明らかにされるように化学の各工程において高収率であることが認められる。若干量のＰＴＣアラニンがＡＴＺアラニンのクロマトグラム中に存在するが、これはＨＰＬＣ装填溶媒（９０％水／１０％アセトニトリル）中に存在する水によるＡＴＺのＰＴへの転化に由来するものであると思われる。

実施例２＾ＴＺアミノ酸の反応性互変異性体は、ＰＴ）ｌアミノ酸から実施例１の諸工程を実施してＰＴＣアミノ酸を産生させて、次いで下記のように操作することによって都合よく調製し得る。

１、　８Ｆ３（三弗化硼素）５μｍを溶媒３ｍｌに加えることにより、ジクロロメタン（ＤＣＭ）又はジクロロエタン（ＤＣＥ）に溶解した三弗化硼素エーテレート（ＢＦ３）の０．０１３Ｍ溶液を調製する。溶媒が完全に乾燥していない場合には、望ましくない沈殿物が生成するであろう。

ＢＦ３を添加する前に溶媒にアセトンを１滴加えると透明溶液を与えるであろう。

２、工程１で得たＢＦ３溶液３０μｍを、ＰＴＣアミノ酸を入れた反応管に加える。

３、不活性気体を前記反応管に加え、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）ラインドキャップで蓋をし、混合し、約５０℃で１５分間装（。

４、加熱を止め、減圧乾燥する。

得られたＡＴＺアミノ酸は、不活性雰囲気中で乾燥及び冷却状態が保たれる場合には、この形態で短期間貯蔵し得る。しかしながら、ＡＴＺアミノ酸はむしろ不安定であるので、できるだけ早く次の増強された化学を行うことが好ましい。図８は、ＰＴＨアミノ酸から反応性ＡＴＺアミノ酸を製造する例を示すものである。

実施例３均質な活性ＡＴＺアミノ酸が入手できると、ＵＶ吸収を使用してＰＴＨアミノ酸よりも、低い濃度でより容易に検出される生成物を製造するための多数の可能な化学的な経路がある０例えば、高電光性のフェニルチオカルバミルアミノフルオレセイン（ＰＴＣＡＦ）アミノ酸、例えばＴｓｕｇｉｔａら（参考文献４）によって報告されたもの（該参考文献は全部が参照される）は、ＰＴＨアミノ酸、ＰＴＣアミノ酸又はＡＴ７．アミノ酸から前記諸実施例の工程を実施し、次いで下記のように操作することによって調製し得る。

１、　０．０１％ピリジンを含有するアセトニトリルに溶解した３０μｇ１０＋１の濃度の４−アミノフルオレセイン（４ＡＦ）の溶液を調製する。ピリジンは使用する前に蒸留すべきである。

２、工程１で得た４ＡＦ溶液３０ｕ１を、反応性ＡＴＺアミノ酸を入れた反応管に加える。ＡＴＺの量はこれらの条件については最高で１００ピコモルであり得る。

３、不活性気体を前記反応管に加え、混合し、約５０℃で１５分間装（。

４、加熱を止め、減圧乾燥する。

５、　アセトニトリル３０μｌを加え、減圧乾燥する。この第二の工程により、生成物の次後の分析を妨害し得る痕跡量のピリジンを除去する。

図３８は、慣用の直接宙光Ｆ識化方法を使用するシークエンサー実験から得られた幾つかのシークエンサーサイクルを示すものである。切断後生成物を、実施例３に述べた化学を使用して酸切断工程の後に直接に標識した。前記ＡＴＺアミノ酸の自動転化を防止するのを促進するために、シークエンサー化学薬品中に還元剤は使用しなかった。還元剤が無い場合でもサイクル５ではＰＴＣＡＦグルタミンの収率が極端に低いことが認められる。図３ｂは、シークエンサー化学薬品中に還元剤としてＤＴＴを使用した場合のシークエンサー実験から得られた幾つかのシークエンサーサイクルを示すものである。

実施例１及び２で述べた化学を実施して、実施例３で述べたように蛍光標識する前に訂２アミノ駿を再生させた。この方法を使用するサイクル５ではＰＴＣＡＦグルタミンの収率が著しく増大することが認められる。両方の場合において、シークエンサーには２５ピコモルのβ−ラクトグロブリンＡを装填した。この試料装填濃度では、このＡＴＺ−再生化学が切断後生成物について行われない場合には、シークエンサー化学薬品中に還元剤が存在すると有意義なＡＴＺ−に基づく分析が不可能になることが認められるべきである。

ＰＴＣＡＦアミノ酸は不活性雰囲気で乾燥及び冷却状態が保たれる場合には長期間貯蔵し得る。またこれらの誘導体も室温で溶液中で数日間安定である。本発明の化学を用いて調製した幾つかのＰＴＣＡＦアミノ酸を図７に示す。

これらの特定のアミノ酸は、それらのＡＴＺ体が非常に不安定であるが又はエドマン化学の間にＰＴＣ又はＰＴＨに容易に転化するがいずれかであるという理由から、直接標識法によって検出するのは非常に難しい、このことにより、エドマン分解の間に生成したＰＴＩ（から反応性訂２を回収するのに本発明の化学が有用であることが説明される。

図１０ａはＰＴＣＡＦ−バリン及びＰＴＣＡＦ−インロイシンを含有するＰＴＣＡＦアミノ酸標品である。該標品は、商業的に入手し得るＰＴＨアミノ酸を用いて開始して、実施例１．２及び３で述べた本発明の化学を使用して調製した。図１０ｂとｌＯｃはシークエンサー実験のサイクル２及びサイクル３から得られたＰＴＣＡＦ−イソロイシンとＰＴＣＡＦ−バリンである。　ＰＴＨアミノ酸は標準エドマン化学及び転化反応の後にシークエンサ１自動分取装置（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｆｒａｃｔｏｉｎ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）に採取し、次いで実施例１．２及び３に述べた化学に供される。

図１２に示すように、幾つかのサイクルは、シークエンサー実験から得られ、該シークエンサー実験においては、切断後生成物が自動的にＰＴＣアミノ酸に転化され、次いで実施例３に述べた蛍光標識化学に供される。シークエンサーには２５ピコモルのβ−ラクトグロブリンＡが装填された。ピークは分析された試料１０％で約１〜２ピコモルを示す。サイクル５におけるグルタミン回収率は、別のアミノ酸の回収率と総計で少なくとも同等であることが認められる。このことは、前記の直接標識法とは著しく異なっている。

実施例４アミノ酸のＡＴＺ体はエドマン切断工程の後に存在する。ＡＴＺアミノ酸は、通常は水性酸中でＰＴＨ体に転化される。しかしながら、該ＰＴ）１体は下記のようにしてＡＴＺアミノ酸から高収率で調製し得る。

１、トリエチルアミン（ＴＥＡ）の１０％（ｖ／ｖ）水溶液を調製する。

これは溶解度限界に近いので、ＴＥＡが完全に溶解することを確実にする。

２、　ジチオレイトール（ＤＴＴ）の０．０１％（Ｗ／Ｖ）水溶液を調製する。

ＤＴＴを加える前に水に不活性気体を吹き込む。

３、工程２で得たＤＴＴ溶液３０μｍを、ＡＴＺアミノ酸を入れた反応管に加える。

４、　工程１で得たＴＥＡ溶液１０μｌを前記反応管に加える。

５、　不活性気体を前記反応管に加え、蓋をし、混合し、約５０℃で１５分間装（。

６、加熱を止め、内容物を減圧乾燥する。

７、　アセトニトリル４０μｍを加え、該反応管を旋回させ（ｖｏｒｔｅｘ）、次いで減圧乾燥する。この工程は痕跡量の塩基を除去するのに必要であり、さらに化学を行うべき場合には必須である。

図４ａは、ト末端アラニンを有するペプチドについて手動エドマン分解のサイクル１から得られた切断後生成物のＵＶ／ＨＰＬＣクロマトグラムである。ＤＴＴを配列決定化学薬品中に還元剤として使用して切断後生成物の割合をＰＴＨアラニン誘導体方向に移動させた。ビーク１はＰＴＣアラニンであり、ビーク２はＰＴＨアラニンであり、ビーク３はＡτ２アラニンであり、星印（＊）で表示したピークはエドマン分解反応副生成物である０図４ｂは、ＰＴＨア長ニノニン生させるために実施例１で述べた化学を用いて図４８の生成物（生れてＰＴＨアラニン）を処理した結果゛を示すものである。図４ｏ１よ、図゛４・におけるような切断後生成物であって、還元剤が存在しない場合の切断後生成物のｕｖ／ｉ＋ｐｔ、ｃクロマ［グラムである。これは、生成物の割合をＡＴＺアラニン誘導体方向に移動させる。ピークは図４８に示したように表示した。図４ｄは、ＰＴＣアラニンを産生させるために実施例４で述べた化学を用いて図４ｃの生成物（主としてＡＴＺアラニン）を処理した結果を示すものである。

図９８は、実施例１及び２に述べた本発明の化学を使用して商業的に入手し得るＰＴＨアミノ酸から調製した２種類のＡＴＺアミノ酸の混合物のＵＶ／ＨＰＬＣ：クロマトグラムである０図９ｂは、実施例４に述べた化学を実施した後の９８の混合物のＵＶ／ＨＰＬＣクロマｉグラ゛ムである。

これは、同じ化学を使用してＰＴＨ又はＡＴＺのい□ずれかからＰＴＣを産生じ得ることを例証する。

還元剤（ＤＴＴ）はおそらく、塩基の存在下でＡＴＺアミノ酸環をＰＴＣアミノ酸に開環させるのには必要ではないということが認められるべきである。しかしながら、これらは、エドマン切断反応工程後の実際の条件下で存在する幾つかのｐｒＫアミノ酸が存栓するであろうし、ＤＴＴはこのＰＴＨアミノ酸を均質生成物で得られるＰＴＣアミノ酸に転化させることを可能にするであろう０図４は、この転化化学を使用してエドマン分解から産生されたＰＴＣアミノ酸を示すものである０図９は、前記の実施例１及び２に述べた化学を用いて創製された合成ＡＴＺアミノ酸から産生されたＰＴＣアミノ酸類の混合物を示すものである。

前記の化学は、エドマン分解の生成物の検出限界を高める目的でタンパク質配列決定装置を部分的に又は完全に自動化し得る。例えば、自動分取装置を備えたタンパク質シークエンサー（例えば、Ｐｏｒｔｏｎ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓモデルＰＩ２０２０又は同等の装置）は、化学又は装置を改変することなく通常のように運転し得る。ＰＴ）ｌアミノ酸は装置の分取管に通常のように採取される。

これらの分取管の内容物は減圧乾燥され、アセトニトリル中に再溶解され、再度乾燥される。

次いで、実施例１〜３に述べた化学が行われ、得られた蛍光性ＰＴＣＡＦアミノ酸は、慣用の方法例えば蛍光検出器を備えたＨＰＬＣで分析される。この方法においては、出発物質として使用したアミノ酸誘導体はＰＴＨアミノ酸であり、検出を高めるために使用した化学は慣用のエドマン分解の完結後に行った。この方法の例は図１Ｏに認められる。

さらに自動化された方法を使用して、シークエンサー中で転化試薬を修飾し、還元剤例えばＤＴＴを移動溶媒に加えることによりＰＴＣＡＦアミノ酸を創製し得る。この例においては、２５％トリフルオロ酢酸が５％水酸化アンモニウムで置換えられ、ＤＴＴが０．０１％の濃度まで酢酸エチル（上記移動溶媒）に加えられる。また、５％水酸化アンモニウムは０．Ｏ１％ＤＴＩ’を含有でき、しかも酢酸エチルがそのまま（ｎｅａｔ）残り得るが、ＤＴＴはアルカリ性溶液中で長期間安定ではないであろうし、しかも毎日又は２日毎に新たに調製するべきである。配列決定サイクルの終りに、分取装置はＰＴＨアミノ酸の代わりにＰＴＣアミノ酸を含有するであろう、この方法は、慣用のＵｖ吸収法を使用して直接に分析し得るＰＴＣアミノ酸の完全に自動化された１成を可能にする。このオプションの実用性を図１１に例証する。蛍光性ＰＴＣＡＦアミノ酸は、　ＰＴＣアミノ酸から前記の実施例２及び３に述べた化学を行うことにより調製し得る０図１２はこの方法の結果を示すものである。また、ＰＴＣアミノ酸は前記の増強された化学以外の増強された化学にも供し得る。

ＰＴＣＡＦアミノ酸創製用の完全自動化方法は、転化フラスコに４積類の試薬を供給するために備えられているシークエンサー（例えば、Ｐｏｒｔｏｎ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓモデルＰＩ２０９４又は同等の装置）で実施し得る。この方法においては、エドマン切断生成物を高蛍光性の均質生成物に転化させるための化学が、装置の転化フラスコ中で完全に行われる。簡単な計測においては、転化に必要な３種類の試薬は、５％水酸化アンモニウム、ジクロロメタン（ＤＣＥ）中の０．０１３Ｍ　ＢＦ３及びピリジン０．０１％を有するアセトニトリル中の４ＡＦ３０μｇ／ｍｌである。

また、移動溶媒は０．０３％ＤＴＴを含有する６分取装置に採取されるか又はＨＰＬＣ中に自動的に注入される生成物はＰＴＣＡＦアミノ駿であろう。

本発明の方法を使用して多数の別のＡＴＺアミノ酸修飾反応が可能であることを認めることが重要である０例えば、アミノ又はヒドロキシル弗素化化合物は、ガスクロマトグラフィー／電子捕獲（ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｃａｐｔｕｒｅ）を用いる検出が望まれる場合には蛍光性化合物の代わりに使用し得る。電気化学的に活性な化合物はまた最終生成物の高められた検出用に調製し得る。別の方法は、関連した有機化学に熟知している者には自明であろう。

参考文献１、Ｅｄｍａｎ、　Ｐ、とＡ、　Ｂｅｇｇの論文、Ａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ″。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻、第８０頁（１９６７年）２、Ｍａｔｓｕｄｉａｒａ、Ｐの論文、　”５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｉｃｏ＋＋＋ｏｌｅ　Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｂｌｏｔｔｅｄ　ｏｎｔｏ　Ｐｏ１ｙｖｔｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６２巻、第１００３５−１００３１１頁（１９１１７年）３、Ｉｎｍａｎ、　Ｊ、に、とＥ、＾ｐｐｅｌｌａの論文、”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ＾ｎ１ｌｉｎｏｔｈｉｏｚｏｌｉｎｏｎｅｓ　ａｆｔｅｒ　Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｔ。

Ｎ−Ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｙｌ−Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ｍｅｔｈｙｌａ＋＊１ｄｅｓ”　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏＬｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、発行、第４７巻、第３７４−３１１５頁（１９７７年）４、Ｔｓｕｇｉｔａらの論文、”５ｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｄ＋＊ａｎ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ。

４−Ａｍ１ｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１０６巻、第６０−６５頁（１９８９年）Ｓ、Ｈｏｒｎらの論文、”Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｙｌ　Ａｍ１ｎ。

Ａｃ１ｄ　Ｅｓｔｅｒｓ　ｆｏｒ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｅｄａ＋ａｎＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　”　、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣｈｅｍＬｓｔｒｙ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、発行、第５１−５９頁（１９８９年）６、Ｔａｒｒ、Ｇの論文、”Ｍａｎｕａｌ　Ｅｄｍａｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ″Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＭｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒＬｚａｔｉｏｎ、　Ｔｈｅ　Ｈｕｏ＋ａｎａ　ＰｒｅｓｓＩｎｃ、発行、第１５５−１９４頁（１９８６年）参考文献全てはその全部が参照される。

６　７　８　９　１０　１１　１２＋３１４１５１６１７１８４９２０２１２２２３０　２　４　６　Ｂ　＋ＣＭ２１４＋６１８時間（分）時間（分）国際膿杏Ｓ台

Claims

【特許請求の範囲】

１．フェニルチオヒダントインアミノ酸からフェニルチオカルバミルアミノ酸を産生する方法であって、該フェニルチオヒダントインアミノ酸を還元剤の存在下で塩基で処理することからなるフェニルチオヒダントインアミノ酸からフェニルチオカルバミルアミノ酸を産生する方法。
２．アニリノチオゾリノンアミノ酸からフェニルチオカルバミルアミノ酸を産生する方法であって、該アニリノチオゾリノンアミノ酸を塩基で処理することからなるアニリノチオゾリノンアミノ酸からフェニルチオカルバミルアミノ酸を産生する方法。
３．前記アニリノチオゾリノンアミノ酸を還元剤の存在下で塩基で処理する請求の範囲第２項記載の方法。
４．フェニルチオヒダントインアミノ酸とアニリノチオゾリノンアミノ酸の混合物から均質なフェニルチオカルバミルアミノ酸を産生する方法であって、前記フェニルチオヒダントインアミノ酸とアニリノチオゾリノンアミノ酸の混合物を還元剤の存在下で水性塩基で処理することからなるフェニルチオヒダントインアミノ酸とアニリノチオゾリノンアミノ酸の混合物から均質なフェニルチオカルバミルアミノ酸を産生する方法。
５．フェニルチオカルバミルアミノ酸からアニリノチオゾリノンアミノ酸を産生する方法であって、該フェニルチオカルバミルアミノ酸をルイス酸で処理してアニリノチオゾリノンアミノ酸を生成することからなるフェニルチオカルバミルアミノ酸からアニリノチオゾリノンアミノ酸を産生する方法。
６．前記フェニルチオカルバミルアミノ酸がフェニルチオヒダントインアミノ酸と塩基とを還元性条件下で接触することによって得られるものである請求の範囲第５項記載の方法。
７．前記塩基がトリエチルアミン及び水酸化アンモニウムからなる群から選ばれるものである請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記還元剤がジチオトレイトール及びβ−メルカプトエタノールからなる群から選ばれるものである請求の範囲第１項記載の方法。
９．タンパク質のＮ−末端アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体を生成するタンパク質配列決定方法において、前記フェニルチオヒダントイン誘導体を還元剤の存在下で塩基で処理して前記Ｎ−末端アミノ酸のフェニルチオカルバミル誘導体を生成することを特徴とするタンパク質配列決定方法。
１０．前記フェニルチオカルバミル誘導体をフルオレセインで処理して蛍光性フェニルチオカルバミルアミノ酸誘導体を生成する請求の範囲第９項記載の方法。
１１．フェニルチオカルバミルアミノ酸からアニリノチオゾリノンアミノ酸を製造する方法であって、該フェニルチオカルバミルアミノ酸をルイス酸で処理することからなるフェニルチオカルバミルアミノ酸からアニリノチオゾリノンアミノ酸を製造する方法。
１２．前記ルイス酸が三弗化硼素である請求の範囲第１０項記載の方法。
１３．Ｎ−末端アミノ酸のＡＴＺ誘導体も生成され、且つ前記処理により該ＡＴＺ誘導体もまた前記Ｎ−末端アミノ酸のＰＴＣ誘導体に転換される請求の範囲第９項記載の方法。
１４．前記ＰＴＣ誘導体が続いてＡＴＺ誘導体に転換され、且つ次いで該ＡＴＺ誘導体が検出可能な標識で標識される請求の範囲第９項記載の方法。
１５．前記ＡＴＺ誘導体が蛍光性又は放射性のアミン又はアルコールとの反応により標識される請求の範囲第１４項記載の方法。