JPH07502019A - 内毒素または超抗原に誘導された毒性を治療するインターロイキン−１０類似体またはアンタゴニストの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内毒素または超抗原に誘導された毒性を治療するインターロイキン−１０類似体 またはアンタゴニストの使用発明の分野 本発明は、敗血症性または毒素性ショック様症状、例えば、内毒素または超抗原 に誘導された毒性および自己免疫状態の治療を含む、有効量のインターロイキン −１０（Ｉ　Ｌ−１０）またはその類似体若しくはアンタゴニストを投与するこ とによって免疫応答を調節する方法に関する。

聾 苛酷な感染は、大きな生理学的および代謝の変化を引起こすことがある。症状は 様々であるが、発熱、低血圧症、代謝性アシド−シス、組織壊死、広範囲にわた る器官機能不全および、正しく治療されない場、合、最終的には致死を挙げるこ とができる。例えば、それぞれ本明細書中に参考として包含されているバーコラ （Ｂｅｒｋｏｗ）（監修）Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ、ｏ−ウェー、ニ ューシャーシー州；ウエザラル（Ｗｅａｔｈｅｒａｌ　ｌ）ら（監修）Ｏｘｆｏ ｒｄ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、オフスフオード・ユニバー ジティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓ　ｉ　ｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）、 ：−ユ　Ｅ−り；ブラウンヮルド（Ｂｒａｕｎｗａ’ｌｄ）ら（監修）Ｈａｒｒ ｉｓｏｎ’　ｓ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ 、　マグロ−・ヒル、ニューヨーク；またはワインガーデンフィラデルフィアを 参照されたい。敗血症性ショックおよび毒素性ショック症状は種々の感染応答に 特有であり、しばしば、若干のまたは全てのこれらの症状を示す。

敗血症性ショックは内毒素に誘導された応答の典型である。敗血症性ショックは 、内毒素、□典型的には、グラム陰性細菌の細胞壁からのリボ多糖（ＬＰＳ）成 分か免疫系に出現することによって引起こされる。毒素性ショックは超抗原に誘 導された応答の典型であり、グラム陽性細菌の細胞膜からのタンパク質成分、例 えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）の放出によって引起こされる。

応答は両方とも微生物感染によって最初に引起こされるが、免疫系は微生物産物 に対して異なったように応答してそれらのそれぞれの応答を引起こす。

内毒素、例えば、ＬＰＳによって引起こされたショック応答において、宿主由来 タンパク質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はグラム陰性敗血症の多数の有害な作 用を引起こすことが最近実証された。ＴＮＦに対する抗血清による受動免疫は、 グラム陰性菌血症★たは内毒素血症の多数の致命的作用を防止することができる 。

３０：６６２〜６６４を参照されたい。ＴＮＦの高血清濃度は、髄膜炎菌性髄膜 炎、マラリアおよびリーシュマニア症を含むいくっがの他の感染症においても観 察された。ＴＮＦの循環濃度が高い多数の患者の器官機能不全は更に高い死亡率 Ｅｎｇ　］、Ｊ、Ｍｅｄ、、３１９　：　３９７〜４００　；スキュデリー（Ｓ ｃｕｄｅｒｉ）ら（１９８８）Ｌａｎｃｅｔ　１３６４〜１３６５；およびカー ノ（Ｋｅｒｎ）ら（１９８９）Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、、８７；１３９〜を参照され たい。

動物かまたはヒト被験者に対するＴＮＦの投与により、２〜６時間後に検出可能 なインターロイキン−６（ＩＬ−６）血清濃度を生じたことが報告された。マ、 １４２巻、１５４２頁（１９８９）；およびプロツヵート（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒ 　ｔ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ９Ｍｅｄ、、１６９巻、２２５７頁（１９８９）。Ｂ細胞 刺激因子２、インターフェロン−β２または肝細胞刺激因子としても知られてい るＩＬ−６は、Ｂ細胞成熟を引起こすＴ細胞由来の糖タンバク質として同定され た。例えば、キンモト（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ）、Ｂｌｏｏｄ　７４：１〜１０を 参照されたい。更に最匠、Ｉ　Ｌ−６は、肝細胞中の鋭敏タンパク質の誘導並び に造血系前駆細胞およびＴ細胞に対する作用を含む多面的生物活性を有すること が実証された。例えば、ガイガー（Ｇｅｉｇｅｒ）ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｔｎｍｕ ｎｏｌ、、１８巻、７１７頁（１９８８）；マリンジョビク（Ｍａｒｉｎｊｏｖ ｉｃ）ら、Ｊ、Ｉｔｎｍｕｈｏｌ、、１．４２巻、８０８頁（１，９８９）、モ ロン（Ｍｏｒｒｏｎｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６３巻、１．２５５４頁（］、９８８）；およびバールムラター、Ｉｍｍｕｎ ｏ　１．．１４５巻、４１８５〜４１９１頁（１，９９０）には、敗血症性ショ ックのマウスモデルにおいてｊＩ、−６に吋する抗体アンタゴニストが生存を延 長することが示された。

ブドウ球菌エンテロトキシンＢ＜５ＥＢ）は超抗原であり、毒素性ショック反応 を引起こすことがある。、：れらの反応はＴ細胞の実質的なサブセットの活性化 の結果として生ｌ、苛酷なＴ１１１ｆｄ媒介全身性免疫反応を導く。この応答は 、１Ｌ−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストが治療的処置に有用であ る点に関して、■細胞媒介応答に特有である。機械的（こは、超抗原１まＴ細胞 受容体のＶβ要素と直接的に相互作用し１ｉつ比較的低いクラスＩＩＭＨＣ特異 性てＴ細胞を活性化すると考えられる。バーマン（ＨｅｒｍｆＸｎ）ら（１９９ １）　、Ａｎ。

Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、９ニア４５〜７７２を参照されたい。

現在、敗血症、画面症等のような敗血症症状は抗微生物性化合物によって治療さ れるのか典型的である。敗血症は、細菌感染がカテーテル挿入または外科的処置 によってしばしば引起こされる病院環境において一般的である。しかしながら、 このような症状がショックを伴う場合、感染に応答して誘導されたサイトヵイン によって部分的に引起こされるショック症候群を好転させる療法には有効な付加 的手段が存在しない。例えば、ヤング（Ｙ　ｏ　ｕ　ｎ　ｇ）　（１９８５）　 ｒ　Ｊ、マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）ら（監修）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ −Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ（第２版 ）ジョン・ウィリー・アンド・ヤング（Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ ）。

ニューヨーク、４６８〜４７０頁を参照されたい。特に、抗生物質による治療は 微生物の致死をもたらし、そしてショック応答を引起こす細菌生産物の放出をも たらす。

細菌性敗血症および関連の敗血症性ショックは、ある種の手術、腹部外傷および 癌若しくは移植療法による免疫抑制または他の医学的症状の結果として生じた感 染によって引起こされた致命的な症状であることが多い。米国において、毎年７ ００．０００人を越える患者が、敗血症性ショックを引起こす細菌感染に罹患し ている。これらの内約１６０．０００人は敗血症性ショック症状を示し、そして 約５０．０００人はこのような結果として死に至っている。毒素性ショックに苦 しむ憎者は毎年少数であるが、典型的に、その応答の重大さはより一層生命を脅 かすものである。

感染に対するこれらの苛酷な免疫学的応答の重大な結果のために、微生物によっ て引起こされたショックを予防的にまたは治療的に処置する有効な技術が急を用 １７て必要とされている。本発明は、これらのおよび他の苛酷な免疫反応を処置 （る組成物および方法を提供する。

発明の概要 本発明は、有効量の・インターロイキン−１ｏまたはその類似体若しくはアンタ ゴニストを投与することにより、種々の微生物によって引起こされたショック症 状を処置する方法を提供する。本発明は、更に、これらのインターロイキン−１ ０に関連の化合物を含む薬剤組成物を包含する。好ましくは、本発明のインター ロイキン−１０は、以下のアミノ酸配列ｌ鼠）Ｌｉｓ　５１２ｒ　’ｙｚｒ　） 、ｌａ　Ｌｅｕ　ｔａｕ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｐｕ　 Ｔｈｒ　ＧｌｙＶａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＧＬｎ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　０ｙｓＴｈｒ　Ｐ、 ｘｓ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｃｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＭｅしＬｅ ｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌａｖ　ＡｒｇＡｓｐ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｓｅｒ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｂｅ　Ｇｉｎ　ｒｃ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇ ｉｎＬｅｕ　ｆｉｓｐ　Ａｓｎ　Ｌａ＋Ｊ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｓ＝　Ｌｅｕ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌ／ ！ｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　八ｌａ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　１％ｍ　Ｉ ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　ＴｙｒＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｉ’ｅｃ　Ｐ ｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　１ ｉｅＬｙｓ　Ａｌａ　）ｕｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｕ　ｆｉｓｎ　Ｉｚｕ　Ｉ、ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｉ ｚｕ　ｋｑ　ｆｉｘｑ　Ｃｙｓ　１（ｉｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　 Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｘｎ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｇ ｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ｌ’ｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　ｆｉｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ 　ＧｉｎＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｉ’ｅｔ 、Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　１−ｓｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　工１ｅＡｓｎ　Ｔｙｒ 　工ｉｅ　Ｇｌｕ　Ｎａ　Ｔ′／ｒ　Ｉａｊ　Ｔｈｒ　ｒｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　 ｈｒｑ　Ａｓｎおよび ）ｋｔ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｉ＝ｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ 　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｚｕ　ＬｅｕＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＴｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　ＣＹｓ　Ａ ＬＰ　Ａｓｎ　ＰｈｅＦ’ｒｏ　Ｇｉｎ　ｈｃ　Ｌｅｕ　ｌ”Ｌｑ　陣Ｌｅｕ　 均Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｂｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｐｈｅ　 Ｐｈ：　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｉ’ｓ；ｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓ ｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌ／！ｕ　Ｇｌ ｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｉ ｎ　ＡｌａＬａＩＪ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＩＭＲＩｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ 　ＸＡｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｔ−ｈｅ　Ｐｒｏ　ＧｉｎＡｌａ　Ｇｌｕ 　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　）ｕｓ 　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｆｉｘｑ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ 　）ｕｓＡＸｑ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ｃ’、’ｓ　Ｇｌｕ　Ａ！ｎ　Ｌｙ ｓ　Ｓｅｒ　ＬｙＳ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ｌ１ｅＬｙＳ　ＡＳｎ 　Ａｌａ　ｔｈｅ　Ａｓｎ　Ｌ）’Ｓ　Ｌｅｕ　ＱＬｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌ ｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　ＬｙＳ　ＡｌａＦｂ＝　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ｆｉｓ ｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　ｆｉｓｎ智ｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ 　１ｍセ離１１ｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｑ。

（但し、標準的な三文字略語を用いてＬアミノ酸を示し、Ｎ末端から開始してい る） によって定義された読取り枠の成熟ポリペプチドから成る群より選択される。こ れらの２種類の型のＩＬ−１０を、時にはそれぞわ、ヒトＩＬ−１０（またはヒ トサイトカイン合成阻害因子）およびウィルスＩＬ−１０（またはＢＣＲＦＩ） と称する。ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１２ ３０〜１２３４．ヴイエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ。

（Ｆｉｏｒｅｔｉｎｏ）ら（１９８９）Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７０：２０８１ 〜２０９５；およびシ、：Ｌ−（Ｈ８Ｌ＋）ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２ ５０：８３０〜８３２を参照されたい。天然のタンパク質配列の突然変異体、例 えば、欠失および挿入変異型を含む対立遺伝子変異型および突然変異タンパク質 は、本明細書中で用いられる代替組成物である。

更に好ましくは、本発明の方法で用いられる成熟ＩＬ−１０は、Ｓｅｒ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ 　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　ＰｈｅＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＸＡｕ　Ｐｒｏ　 Ａｓｎ　＋セｃ　Ｌｃｕ　ｆｉｘｑ　Ａｓｐ　Ｌｃｕ　ｌｒｑ　Ａｓｐ　ｋｌａ 　ＰｈｅＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　 ｒａｔ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　ｔａｕ　Ａｓｐ　ＡｓｎＬｅ＋、ｒ　Ｌｅｕ 　ＬＡｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ｔａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｓｐ　Ｅ’ｈ ｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｉ’ｅｔ　Ｘ１ｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｌ ｕ　ＧｌｕＶａｌ　ト’ｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　、ＡＬａ　Ｇｌｕ　）ｊｎ　Ｇ ｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＨｌｓＶａｌ　Ａｓ ｎ　５ｅｒ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ｔａｕ　ＬｙＳ　Ｔｈｒ　Ｌｓ ｕ　Ｎ１Ｌａｕ　ｋ’ｑ　ＬａｕＡｒｑ　Ａｒｑ　ＣｙＳ　ｌｕ５　Ａｒｑ　ｐ ｈｅ　Ｌ＋！！ｕ　ｐｒｏ　ＣｙＳ　Ｇｌｕ　ＡＳｎ　ＬｙＳ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ 　ＡｌａＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　 Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｓｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙｌｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌ ｙｓ　Ａｉａ　１４ｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　ｌ ｉｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ｌｌ５Ｇｌｕ　Ｎａ　Ｔｙｒ　Ｉ論ｔ　Ｔｈｒ　７％ｍ 　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　ｋｑ　Ａｓｎおよび Ｔｈｒ　Ａ５Ｐ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　ｆｉｓｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ 　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＡｒｇＰｓｐ　Ｉｕａ　Ｐｈｅ　 Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ｔ、ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ 　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＧｌｕＶａｌ　Ａｓｐ　ｆｉｓｎ　Ｌｅｕ　ＬＡｕ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ、　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｊｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙ ５Ｇｌｙ　ｉ’ｙｒ　ｔａｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｕ　Ｆｋ＝しＩｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　ＴｙｒＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｖａｌ　）”ａｔ　Ｐｒｏ　ＧＬｎ　Ａｌａ　Ｇ”ｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａ ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡｌａＬｙｓ　Ａｓｐ　）ｕｓ　Ｖａｌ　ＡＳｎ　Ｓｅ ｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｆｉＭ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｉｊｕ　Ａｒ ｑＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ 　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＬｙＳＳ＝ｒ　ＬｙＳ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｉｉｅ　ＬｙＳ　ＡＳｎ　ＡＬａ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　 ＬｙＳ　Ｌｅｕ　ＧｉｎＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　１’ｙｒ　Ｌｙｓ　 Ａｌａ　ト’ｅｔ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｐｈａ　ｌ１ｅ ｆｉｓｎ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　■ｅ−Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　 Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ。

から成る群より選択される。

本発明は、部分的に、望ましくない炎症性反応（例えば、敗血症性シ四ツク）を 媒介するいくつかのサイトカインの合成と、毒素性ショック様症候群をもたらす 場合である超抗原によるＴ細胞の活性化の双方をＩＬ−１０が阻害するという発 見に基づいている。逆に、ＩＬ−１０アンタゴニストはこれらの同一免疫応答を 増大させるものであり、そしてこのような増大は他の臨床的環境、例えば、ある 種の腫瘍および自己免疫モデルにおいて実際に望ましい。

図面の簡単な説明 図１゜ＴＲＰＣＩＩプラスミドの図。洟施例３を参照されたい］図２゜Ｉ　Ｌ− ４、ｈｌ−１０およびｖｌＬ−１０は、ＩＬ−２で活性化された末梢血液単核細 胞（ＰＢＭＣ）による（Ａ）ＩＦＮｙおよび（Ｂ）ＴＮＦα合成を阻害する。Ｎ Ｄは測定されなかった。エラーパーは一つの実験での二重反復試験試料の範囲を 示す。異なるドナーからのＰＭＢＣは、ＩＬ−２によって刺激された場合、ＩＦ ＮｙおよびＴＮＦａを生産する能力が異なった。Ｉ　Ｌ−４およびＩＬ−１０の 阻害作用は、それぞれ（ｃ）抗ＩＬ−４および（ｄ）抗ＩＬ−１０中和抗体によ って逆行する。ＰＢＭＣを、実験の項に記載したように、組換体Ｉ　Ｌ−２（ｒ 　Ｉ　Ｌ−２）　２００Ｕ／ｍ　ｌおよび種々の量のｒｌＬ−４かまたはＣＯ８ 細胞で生産されたヒトＩＬ−１０（ＣＯ８−ｈｌＬ−１０）と−緒に中和性抗す イトカイン１０μｇ／ｍｌまたはイソタイプ対照免疫グロブリンの存在下で培養 した。抗体およびサイトカインを、Ｉ）ＢＭＣを加える前に３０分間インキュベ ートした。

図３゜（Ａ）ＩＬ−４は、ＰＢＭＣ中のＩ　Ｌ−２によって誘導されたリンパ球 活性化キル（ＬＡＫ）活性を阻害するが、ヒトＩＬ−１０（ｈｌＬ−１０）また はウィルスＩＬ−１０（ｖｌＬ−１０）はこれを阻害しない。図２の場合と同様 の実験によるＰＢＭＣを上澄みと一緒に採集し、そして５１Ｃｒ標識Ｃ０ＬＯ（ 結腸癌、図３Ａ１）およびダウディ（バーキットリンパ腫、図３Ａ２）細胞に対 するその細胞毒性を検査した。（Ｂ）ＬＡＫ活性は、ＩＬ−２およびＩＬ−１０ と一緒に培養されたＰＢＭＣ中のＣＤ５６＋細胞によって発現される。ＰＢＭＣ を、ＦＩＴＣに結合した抗ＣＤ−５６抗体で染色し、そしてファクスター・プラ ス（ＦａｃＳｔａｒ　Ｐｌｕｓ）（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄ ｉｃｋｉｎｓｏｎ）、サン・ホセ、ＣＡ）で選別した。ＣＤ５６＋およびＣＤ５ ６−（純度９９．７％）部分の細胞毒活性を検査した。Ｉ　Ｌ−２のみを有する ＰＢＭＣの培養物由来の細胞と同様の結果が得られた。

図４゜（Ａ）精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導ＩＦＮｙ合成はＩＬ−４によって 直接的に阻害されるが、ｈｌ’Ｌ−１０によってもｖｌＬ−１０によっても阻害 されない。ＦＡＣ３で精製したＮＫ細胞（純度＞９９．５％）を細胞１０６個／ ｍｌで、２００単位／ｍｌのｒｌＬ−２と、５００単位／ｍｌのｒｌｌ、４かま たはイセル（Ｙｓｓｅｌ’　ｓ）培地中のＣ０８−ｈＩＬ−１０、Ｃ０８−ｖｌ Ｌ−１０か若しくはＣＯ３−模擬上澄み（１０％）と−緒に４〜５日間培養した 後、二重反復試験培養物からの上澄みを集め且つエリザによるＩＦＮｙの測定用 に混合した。（Ｂ）精製ＮＫ細胞およびＰＢＭＣによるＩＬ−２誘導増殖はＩ　 Ｌ−４によって阻害されるが、ｈｌＬ−１ｏ／ｖｌＬ−１０によって阻害されな い（図４Ｂ１：選別されたＮＫ、図４Ｂ２：ＰＢＬ）。

図５゜（Ａ）Ｔ細胞ではない付着細胞の添加は、精製ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘 導ＩＦＮｙ合成のＩＬ−１，０に媒介された阻害を回復した。（Ｂ）精製された 単球の添加は、精製ＮＫ細胞によるＩ　１．、−２誘導ＩＦＮｙ合成のＩＬ−１ ０に媒介された阻害を回復した。単球単独では、検出可能な量より少ないＩＦＮ ｙを生じた。エラーパーは一つの実験の二重反復試験試料の範囲を示す。ＩＬ− ２不存在下のＩＦＮγ生産は検出限界未満であった（図２）。異なるドナーから のＮＫ細胞は、ＩＦＮｙを生産する能力が異なった。（Ｃ）ＮＫ細胞、ＣＤ１４ ＋細胞および両方の細胞種並存によるＩＬ−２誘導ＴＮＦａ合成に対するＩＬ− １０の効果。ＮＫ細胞（細胞１０６個／ｍ１）および／またはＣＤ１．４＋細胞 （細胞３ｘ１０５個／ｍｌ）を、４００Ｕ／ｍｌのｒｌＬ−２および１０％Ｃ０ ３−ｈｌＬ−１０上澄みの存在下または不存在下で５日間培養した。

図６゜ＬＰＳによって活性化されたヒト単球によるＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮ ＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産の速度論。遠心水簸によって単離されたヒト・単球 をテフロンバッグ中において（細胞４ｘ１０６個／ｍ１）ＬＰＳ　（ｔμｇ／ｍ ｌ）の不存在下または存在下で培養し、そして（Ａ）ＩＬ−１０、（Ｂ）ＩＬ− ６、（Ｃ）ＴＮＦａまたは（Ｄ）ＧＭ−Ｃ３Ｆの生産を、サイトカイン特異的エ リザによって指示された時間に採集された培養物上澄み中で決定した。

図７゜ＬＰＳの増大する濃度に応答したヒト単球によるＩＬ−１０の生産。ヒト 単球（細胞４ｘ１０６個／ｍｌ）をテフロンバッグ中において増大する濃度のＬ ＰＳと一緒に２４時間培養し、モして［Ｌ−１０の生産をエリザによって決定し た。

図８゜ＩＦＮｙ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮｙによって活性化された単球 によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０ ６個／ｍＩ）を、ＩＦＮ７　（１００Ｕ／ｍｌ）、ｌ、１ｏ、１００１：りｌ； ！１０００ｎｇ／ｍｌのＬＰｓ並び１．：ＬＰｓ（１，１０，１００また＋！１ １０００ｎ／ｍｌ）およびＩＦＮｙ　（１００Ｕ／ｍｌ）の組合わせと一緒に、 ＩＬ−１０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下（ロ）かまたは存在下（ロ）で２４時 間培養し、そして（Ａ）ＩＬ−１ａ、（Ｂ）ＩＬ−１β、（Ｃ）ＩＬ−６、（Ｄ ）ＴＮＦａまたは（Ｅ）ＧＭ−ＣＳＦの生産をサイトカイン特異的エリザによっ て上澄み中において決定した。

図９゜ＬＰＳによって活性化した単球にょるＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆの生産 に対するヒトＩＬ−１０またはウィルスＩＬ−１０の効果。ヒト単球（細胞４Ｘ １０６個／ｍｌ）をＬＰＳ　（ｌμｇ／ｍ＋）によって活性化し且つヒトＩＬ− １０（１００Ｕ／ｍｌ）またはウィルスＩＬ−１０と一緒に中和性抗ＩＬ−１０ ｍΔｂ　１９Ｆ１　（１０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下で２４時間培養 し、そして（Ａ）ＴＮＦａまたは（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦの生産をサイｌ−カイン特 異的エリザによって決定した。

図１０゜ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるサイトカイン特異的ｍＲＮΔ レベルの発現に対する外因性ＩＬ−１０、内因的に生じたＩＬ−１０および■Ｌ −４の効果。ヒト単球（細胞４Ｘ１０６個／ｍ＋）を培地中において４℃および ３７℃で培養しまたはＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、！Ｌ−１０（１００Ｕ／ｍ ｌ）および中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　１９Ｆ１　（１０μｇ／ｍｌ）の不存在 下または存在下においてＬＰＳ　（１Ｆｇ／ｍｌ）によって活性化し、そしてｍ ＲＮＡを２４時間後に単離した。β−アクチン、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ −６、Ｉ　Ｌ−８、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆの発現を、サイト カイン特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析に続いて内部プローブを用いる反応 生成物のサザンブロツティングにより、逆転写されたｍＲＮＡで決定した。ＣＤ ４Ｔ細胞クローンから得られたｃＤＮＡは、ＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆの発現 に関する対照として包含された。

図１１゜ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるサイトカイン特異的ｍＲＮへ レベルの発現に対するＩＬ−１−０の効果。ｍＲＮＡをヒト単球（細胞４Ｘ１０ ６個／ｍ１）から単離し、ＩＬ−１，０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下または存 在下においてＬＰＳ　（１Ｆｇ／ｍｌ）によって７時間活性化し、そしてＩＬ− ６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＧＦβおよびβ−アクチンの発現をノザン分析に よって決定した。

図１２ｏＬＰＳによって活性化したヒト単球によるＩＬ−１０およびＴＧＦβ特 異的ｍＲ，ＮＡレベルの発現に対する外因性ＩＬ−１０、内因的に生じたＩＬ− １０およびＩＬ−４の効果。ヒト単球（細胞４ｘ１０６個／ｍ＋）を培地中にお いて４℃および３７℃で培養しまたはＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１０ （１００Ｕ／ｍｌ）および中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　１９Ｆ１　（１０μｇ／ ｍｌ）の不存在下または存在下においてＬＰＳ　（１Ｆｇ／ｍｌ）によって活性 化した。ｍＲＮＡを２４時間後に単離した。（Ａ）ＩＬ−１０、（Ｂ）ＴＧＦβ およびβ−アクチンの発現をノザン分析によって決定し、そして（Ｂ）Ｉ’Ｌ− １０の発現を、サイトカイン特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析に続いて内部 プローブを用いる反応生成物のサザンブロッティングにより、逆転写されたｍＲ ＮＡで決定した。

図１３゜ＬＰＳによって活性化したヒト単球によるクラスＩＩＭＨＣ発現に対す る内因的に生じたＩＬ−１０の効果。ヒト単球を（Ａ）Ｏｎｇ／ｍＩのＬＰＳ、 （Ｂ）０．１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、（Ｃ）Ｌｏｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは（Ｄ） １０００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳと一緒に中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　１９Ｆ１（１ ０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において４０時間培養した。ＨＬＡ−Ｄ Ｒ／ＤＰ　（Ｑ５／１３）の発現を間接免疫蛍光法によって決定した。

図１４゜マクロアーン細胞系のＡＰＣ機能に対するＩＬ−１０の効果。上段（図 １４Ａ）：マクロファージ細胞系ｌＧ１８．ＬＡまたはＰＵ５．Ｉ　Ｃ細胞１０ ６個／’ｍ　ｌ　）をＩ’ＦＮｙ　（２ｎｇ／ｍ＋）で活性化させた。次に、こ れらのＡｐｃを洗浄し且−）ＨＤＫ、Ｉ　Ｔｈｌ細胞（細胞５ｘ１０４個／ウェ ル）および抗原（ＴＮＰ−ＫＬＨ，１０μｇ’／ｍｌ）と−緒に、精製ＩＬ−１ ０（２００単下段（図１４Ｂ）：マクロファージｌＧ１８．ＬＡを上記のように 活性化させたたＤｏｌｌ、、ＩＯＴ細胞ハイブリドーマ（細胞５ｘ１０４個／ウ ェル）と−緒に、精製ＩＬ−１０（下段）（２００単位／ｍｌ）の存在下（Ｆ２ ）または不存在下（■）でインキー−ベートした（細胞１０５個／ウェル）。上 澄みを２０時間後に集め、そし５てＩＬ−２の検査をした。全パネルにおいて、 三重反１ｕ試験培養物の平均値およびＳＤを示す。

図１５゜ＩＬ−１０は、精製された腹膜マクロファージにおいて形態学的変化を 引起こす。腹膜マクロファージ（Ｍａｃ−１””明、Ｂ２２０’）をＦＡＣ８で 精製した後、１ＦＮ７　（２ｎｇ／ｍし　（上段、図１５Ａ）ｔたはＩＬ−１０ （２００単位／ｍｌ）を加えたＩＦＮ７　（２ｎｇ／ｍり（下段、図１５Ｂ）の 存在下で７２時間インキュベー１・した。上澄みを除去し、細胞を自然乾燥させ 、固定し、そしてライト・ギムザて染色し、乾燥させた後、写真をとった。

図１６ウ　Ｉ　Ｌ−１０は、マクロファー′）細胞系によるＬＰＳに誘導された ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ７Ｇタンパク質の生産を阻害する。マクロファ ージ細胞系ｌＧ１８．ＬＡ（図１６ＡＸＢおよびＣ）およびＰＵ５．　１　（図 １６Ｄ。

ＥおよびＦ）を、示されたように、ＬＰＳ　（ｉｏμｇ／ｍｌ）；またはＩＦＮ ７（２ｎｇ／ｍｌ）を加えたＬＰＳ　（１０／１ｇ／ｍｌ）と−緒に、１１−− １０またはＩＬ−４（若干の場合）を双方とも２００単位／″ＩＴＩ　Ｉ　’Ｃ の存在下または不存在下でインキ−ベートしｔこ（細胞１０６個／　ｒｎ　ｌ　 ）。上澄みを集め、そしてそれらのＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦ−α濃度を 検査した。

図１７（Ａ、Ｂｌ、Ｂ２およびＣ部分）。＋Ｌ−１０は、マクロファージ細胞系 におけるＬＰＳに誘導されたＴＮＦ−αＲＮＡの発現を阻害する。マクロファー ジ細胞系ｌＧ１８．ＬＡを図１６の場合と同様に刺激した。上澄ろを６時間後に 除去し、そしてＲＮＡ調製用に細胞を採集する際にイソチオシアン酸グアニジウ ム溶液を加えた。適宜に刺激された細胞系ｌＧ１８．ＬＡの試料の全ＲＮＡの１ ０μｇをゲルに充填し、プロットした後、ＴＮＦαおよびアクチンをプローブし ｔこ。

図１８゜腹膜マクロファージの刺激。ＩＬ−１０は、腹膜マクロファージによＩ Ｌ−１０（２００単位／ｍｌ）、抗ＩＬ−１０（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＩＦ Ｎ７　（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下においてＬｒ’Ｓ　（１０μｇ ／ｍ１）と−緒に、細胞７ｘｌＯ”個／ｍｌでインキュベートシた。上澄みを採 集し、そして特異的免疫検定（エリザ）を用いる取、知の標準に相対するそのＩ Ｌ−６濃度を検査した。

図１．９．　Ｉ　Ｌ−１，０は、マクロファージからの可溶性同時刺激剤をダウ ンレギュレートし、ないしまたは可溶性阻害剤を誘導しない。（Ａ）上澄みは、 ＩＦＮγで２４時間刺激後にＴｈｌ細胞（ＩＩＩ）Ｋ−１、細胞２　ｘ　１０　 ”ｉｌｌ／ｍ　１）および抗原（ＫＬＨ１５００μｇ／ｍりで２４時間更に刺激 後のマクロファージ細胞系ｌＧ１８．ＬＡから得た。上澄みを濃縮しそしてＩＦ ＮγおよびＩＬ−２を枯渇させた後にＣ３ｌＦ検定において用いた。これらの上 澄み単独には、それ自体で検出可能な濃度のＩＦＮγが含まれていなかった。Ｉ ＦＮγで活性化したｌＧ１８、ＬＡマクロファージＡＰＣＣ細胞１０５個／ウェ ル）を細胞ＨＤＫ−１（細胞５ｘｌＯ４個／ウニノリおよび抗原（ＴＮＰ−ＫＬ Ｈ１１０μｇ／ｍｌ）のみと−緒に（△）または上記上澄み（Ｒ終濃度２５％） を加えた（口）か若しくは除いた（ム）種々の用量のＩＬ−１，０の存在下でイ ンキュベートした。Ｃ３ｌＦ検定からの上澄みを４８時間後に集め、そしてその ＩＦＮγ濃度を検定した。

一つの実験での三重反復試験培養物の平均値およびＳＤを示す。（Ｂ）勾配用量 の精製した牌臓マクロファージをＩＬ−１０の不存在下（■）若しくは存在下（ ロ）　（２００単位／ｍ　Ｉ　）において；または勾配用ｍの精製マクロファー ジとＢ細胞（細胞２．５ｘ１０３個／ウェル）との混合物をＩＩ、−１０の不存 在下（・）若しくは存在下（０）（２００単位／ｍｌ）において；またはＢ細胞 のみをＩＬ−１０の不存在下（イ））若しくは存在下（０）（２００単位／ｍｌ ）において、ＴＮ　Ｐ−ＫＬＨ（１０ｔｔ　ｇ／ｍ　Ｉ　）を用いるＨＤＫ、− Ｉ　Ｔｈｌクローン（細胞１０４個／ウェル）のためのＡＰＣとして用いた。４ ８時間後に上澄みを集め、そしてそのＩＦＮγを検定した。三重反復試験培養物 の平均値およびＳＤを示す。

図２０゜ＩＬ−１０は、Ｂａ１ｂ／ＣマウスにおいてＳＥＢに誘導された毒性を 防止する。図２０Ａ　：　５ＥＢ２０μｇ／ｄ−Ｇａ　ｌ　３０ｍｇ；図２０Ｂ ＋ＩＬ−１０／５Ｅ８２０μｇ／ｄ−Ｇａ１３０ｍｇ；図２０Ｃ：ＳＥＢ１０１ ｚｇ／ｄ−ＧａＩ３０ｍｇ；図２０Ｄ：　ＩＬ−１０／５ＥＢ１０μｇ／ｄ−Ｇ ａ１３０ｍｇ；図２０Ｅニガラクトサミン３０ｍｇ；図２０Ｆ：ＩＬ−１０１， Ｏｔｔｇ。

図２１゜＋１−１０はマウスを致命的な内毒素血症から防護する。Ｂａ１ｂ／Ｃ マウス２０匹の群に、ＬＰ８３５０μｇを、またはＬＰ８３５０μｇと種々のｍ ｍの精製組換体ネズＩＬ−１０とを同時に腹腔内（ｉ、Ｉ）、　）注射した。引 続き６日間にわたって致死を監視した。

図２２゜抗ＩＬ−１０抗体は、致命的な内毒素血症からマウスを防護するＩＬ− １０の能力を中和する。ＬＰＳを投与する１時間前に、１３ａｌｂ／ｃマウス２ ０匹の群に、抗ＩＬ−１０抗体２Ａ５を１−ｍｇ（図２２Ａ）またはイソタイプ 対照抗体ＧＬｌ＋３を１ｍｇ　（図２２Ｂ）腹腔内に与えた。次に、図２１の説 明に記載したように、マウスにＬＰ３３５０μｇを単独でかまたは種々の用量の ＩＬ−１０と同時に腹腔内注射した。

図２３゜ＩＬ−１０は、ＬＰＳ注射の３０分後に投与された場合、致命的な内毒 素血症からマウスを防護する。Ｂａ１ｂ／ｃマウス２０匹の群に、ＬＰ８３５０ μｇを時間０において腹腔内に、モして組換体ｔＬ−ｔｏの１．０μｇをＬＰＳ 注射後の時間０１０．５時間、１時間、２時間または５時間に腹腔内に与えた。

ＩＬ−１０不存在下でＬＰＳを３５０μｇ腹腔内に与えられた対照マウスはこの 実験において全て死亡した。

図２４゜抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた全生存腹膜洗浄細胞に よる表面１ｇＭおよびＩｇＤ発現の免疫蛍光性分析。Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、誕 生から８週間まて抗ＩＬ−１０抗体５ＸＣ−１を注射した（図２４Ｄ）。実験の 項に記載したように、イソタイプ対照抗体Ｊ’５／Ｄ（図２４Ｂ）、リン酸緩衝 溶液（ＰＢＳ）（図２４０）または何もしない（図２４Ａ）。結果は、各実験群 から計数された５、０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。

図２５゜処置の８週間後に検査された抗ＩＬ−１０処置および対照マウスの血清 ＩｇＭ濃度。結果は、各群における５個体の血清の幾何平均±ＳＥＭを示し、２ 種類の異なる実験からのデータがある。３種類の追加の実験により、同一結果が 得られた。

図２６゜Ｇ１，３−デキストラン（図２６Ｂ）またはホスホリルコリン（図２６ Ａ）に対する抗ＩＬ−１０処置および対照マウスのインビボでの抗体応答。Ｂａ １ｂ／ｃマウスに、誕生から９週間まで抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ，１、イソタイ プ対照抗体Ｊ５／Ｄ、ＰＢＳを注射するかまたは未処置のままにした。８週目に 、実験の項に記載したように、マウスにＧ１，３−デキストランまたは加熱殺菌 した肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を試 験投与した。結果は、５個体血清中で検出された特異的抗体濃度の幾何平均上Ｓ ＥＭを示す。

図２７゜ｓｘｃ、を抗ＩＬ−１０処置および対照マウスから得られた生存牌臓リ ンパ系細胞の表面Ｂ２２０およびＣＤ３発現の免疫蛍光性分析。更に詳細に関し て、図２４の説明〜図２４のＡ−Ｄ部分にそれぞれ対応する図２７のＡ−Ｄ部分 を参照されたい。

図２８゜抗ＩＬ−１０処置または対照マウスのＴＮＰ−ＫＬＨに対するインビボ 応答。マウスに、誕生から１０週退会で抗ＩＬ−１０抗体（・）またはイソタイ プ対照（○）を注射した。８週目に、被験動物にＴＮＰ−ＫＬＨを１０μｇ腹腔 内に試験投与した。ＴＮＰ特異的１ｇＭ　（図２８Ａ）およびＩｇＧ（図２８Ｂ ）の血清濃度をそれぞれ免疫感作して７日および１４日後に決定した。結果は３ 種類の別個の実験を示し、名田は個々のマウスを示す。

図２９゜抗ＩＬ−１ｏ抗体は腹膜洗浄Ｂ細胞に対して直接的に細胞毒性ではない 。非感作の８退会Ｂａ　Ｉ　ｂ／ａマウスに、抗ＩＬ−１０抗体１ｍｇ　（ＳＸ Ｃ。

１−図２９、Ａ、ＢおよびＣ部分）またはイソタイプ対照１ｍｇ（Ｊ５／Ｄ−図 ２９、Ｄ、ＥおよびＦ部分）を腹腔内に注射した。腹膜洗浄細胞を別個の被験動 物から１日、２日または３日後に集め、そして表面１ｇＤおよびＩｇＭの同時発 現を分析した。結果は、各実験群から計数された５、０００個の生存細胞の蛍光 強度を示す。

図３０゜抗ＩＬ−１０処置または対照マウスにおける血清ＩＦＮγ濃度。ＢａＩ ｂ／ｃマウスに、誕生から８週間まで抗ＩＬ−１０抗体（・）またはイソタイプ 対照（○）を注射した。８週目に集められた血清のＩＦＮγを免疫検定によって 分析した。結果は、５種類の別個の実験を示し、谷内は個々のマウスを示す。

図３１゜抗ＩＦＮγ抗体の同時投与は、マウスの腹膜Ｂ細胞を枯渇させる抗ＩＬ −１０処置の能力を低下させる。Ｂａ１ｂ／ｅマウスを、誕生から８週間まで抗 ＩＬ−１０抗体（図３ＩＣ）；抗ＩＦＮγ抗体を加えた抗ＩＬ−１０（図３１Ｂ ）で処置するかりまたは処置しなかった（図３１Ａ）。次に、腹膜洗浄細胞の８ ２２０およびＩｇＭの同時発現を分析した。結果は、各実験群から計数された５ 、０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。

図３２゜抗ＩＬ−１０処置マウスにおける８週目の血清ＴＮＦα濃度。マウスを 、実験の項に記載したように、誕生から８週間まで抗１−１０抗体ＳＸＣ。

１（・）またはイソタイプに適合した対照抗体（○）で処置した。８週目に集め られた血清のＴＦＮα含量をエリザによって検定した。結果は、５種類の別個の 実験を示し、谷内は個々のマウスを示す。

図３３゜抗ＩＬ−１０処置マウスにおける血清ＩＬ−６濃度。誕生から８週間ま で抗ＩＬ−１０抗体ＳＣＸ、１　（・）またはイソタイプに適合した対照抗体（ ０）で処置したマウスから集められた血清のＩ　Ｌ−６含量をエリザによって検 定した。結果は、５種類の別個の実験を示し、谷内は個々のマウスを示す。

図３４゜抗ＩＬ−１０処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックの結果として の致死に対する増大した感受性を示す（図３４ＡにおいてＬＰ３５００μｇ１図 ３４ＢにおいてＬＰ８４００μｇ１図３４ＣにおいてＬＰＳ１００μｇ１図３４ ＤにおいてＬＰＳ５０μｇ１図３４ＥにおいてＬＰ３５０μｇおよび図３４Ｆに おいてＬＰＳＬμｇ）。マウスを誕生から８週令までＳＸＣ，１ラットＩｇＭ抗 ＩＬ−４０抗体（・）、２Ａ５ラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０抗体（ム）または適 当なイソタイプ対照抗体（○）（△）で処置した。８週目に、マウス（マウス５ 匹／′群）に種々の用量のＬＰＳを腹腔内注射した。引続き４日間にわたって致 死を監視した。

図３５゜抗ＩＬ−１０処置マウスにおける免疫グロブリンイソタイプの血清濃度 。マウスを誕生から８週間までｓｘｃ、を若しくは２Ａ５抗ＩＬ−１０ラット抗 体、適当なイソタイプ対照抗体またはＰＢＳで処置した。８週目に集められた血 清の全ネズミＩｇＧ１（図３５Ａ）、ＩｇＧ２ａ（図３５Ｃ）　、Ｉ　ｇＧ２ｂ （図３５Ｅ）、１ｇＧ３（図３５Ｂ）、ＩｇＥ（図３５Ｄ）またはＩｇＡ（図３ ５Ｆ）の含量を、イソタイプ特異的免疫グロブリンエリザを用いて検定した。結 果は、各免疫グロブリンイソタイプ分析に関する４種類の別個の実験を示す。各 実験中のデータを、５個体の血清中で検出された免疫グロブリン濃度の幾何平均 信士Ｓ、Ｅ、　Ｍ、として示す。

図３６゜抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙｌ　Ｂ細胞枯渇は一時的である。

マウスを誕生から８週令まて抗ＩＬ−１０抗体ＳＸＣ，１で処置した後、処置を 中止した。腹膜洗浄細胞をこのようなマウスの種々の群（マウス３匹／群）から ８週目（図３６ＡおよびＤ）、１．２週目（図３６ＢおよびＥ）および１６６週 目図３６ＣおよびＦ）に集めた。結果は、各実験群から５０００個の生存細胞が 計数される全生存腹膜洗浄細胞による表面１ｇＭおよび表面８２２０発現の免疫 蛍光性分析を示す。

図３７゜ＳＸＣ，１抗ＩＬ−１０処置マウス（図３７Ｄ）または対照マウス（図 ３７Ｃではイソタイプ対照抗体Ｊ５／Ｄ、図３７Ｂではリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ ）で処置し、または図３７Ａでは何もしなかった）から得られた生存腹膜洗浄リ ンパ系細胞による表面Ｌｙ１および表面１ｇＭ発現の免疫蛍光性分析。結果は、 各実験群から計数された５０００個の生存細胞の蛍光強度を示す。

図３８゜ＳＸＣ，１抗ＩＬ−１０処置または対照マウス（図３７と同様）から得 られた全生存腹膜洗浄細胞による表面Ｍａｃ−１および表面ＩｇＭ発現の免疫蛍 光性分析。結果は、各実験群から計数された５０００個の生存細胞の蛍光強度を 示す。

図３９゜抗ＩＬ−４０処置または対照マウスのＴＮＰ−フィコールに対するイン ビボでの抗体応答。マウスに誕生から９週令まで抗Ｉ　Ｌ−１０抗体ＳＸＣ，１ （０）またはイソタイプ対照抗体（・）を注射した。８週目に、被験動物にＴＮ Ｐ−フィコール１０μｇを腹腔内に試験投与した。ＴＮＰ特異的１ｇＭまたは１ ｇＧの血清濃度を、エリザによってそれぞれ５日後または１０日後に決定した。

各データの円は個々のマウスを示す。

図４０゜抗ＩＬ−１０抗体処置はＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の開始を遅 らせる。雌のＮＺＢ／Ｗ　Ｆｌマウス２０匹の群に、５ＸＣ−１ラッ目ｇＭ抗マ ウスＩＬ−１０抗体（・）かまたはＪ５／Ｄと称するイソタイプ対照抗体（○） を誕生から全実験の間中１週間に３回注射した。引続き４２週間にわたって被験 動物の生存を監視した。

図４１゜抗ＩＬ−１０抗体で処置されたＮＺＢ／Ｗ雌マウスにおけるタンパク尿 （＞　３　＋）の発生。雌のＮＺＢ／Ｗ　Ｆｌマウス２０匹の群に、５ｘｃ−を 抗ＩＬ−１０抗体（・）かまたはイソタイプ対胛抗体（○）を誕生から全実験の 間中１週間に３回注射した。腎臓病の発症は、アルプスティクスディツプスティ ックを用いて１２週間から４２週間までタンパク尿を測定することによって決定 された。データは、尿中のタンパク質が３００ｍｇ／ｄｉを越えるマウスの割合 を示す。

図４２゜抗ＩＬ−１０処置ＮＺＢ／Ｗマウスからの腎臓の組織学的検査。図４２ Ａは、対＠Ｎ　Ｚ　Ｂ／ＷＦ　１腎臓（ＰＡＳ染色）を示す。細管中に免疫複合 体およびタンパク質円柱の均一な沈着を伴う苛酷な糸球体腎炎が存在し、細管に 対するタンパク質の漏出を示す。図４２Ｂは、抗ＩＬ−１０処置したＮＺＢ／Ｗ ＦＩ腎臓（ＰＡＳ染色）を示す。

図４３゜抗ＩＬ−１０処ＩＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己抗体産生。ＮＺＢ／Ｗ 雌マウスに、５ｘｃ−ｉ抗ＩＬ−１０抗体（・）またはイソタイプ対照（○）を 誕生から全実験の間中３日毎に注射した。５か月目または６か月目に集められた 血清のＩｇＧ抗体結合性二本鎖ＤＮＡ含量をエリザを用いて評価した。谷内は個 々のマウスを示す。

図４４゜抗ＩＬ−４０処置ＮＺＢ／ＷＦＩマウスにおける血清ＴＮＦα濃度。

ＮＺＢ／Ｗ雌マウスに、５ｘｃ−ｉ抗ＩＬ−１０抗体（・）またはイソタイプ対 照（０）を誕生から全実験の間中３日毎に注射した。５か月目、７か月目または ８か月目に集められた血清のＴＮＦα含量をサイトカイン特異的エリザを用いて 評価した。谷内は個々のマウスを示す。

図４５゜抗ＴＮＦα抗体は、ＮＺＢ／Ｗ　Ｆｌマウスの抗ＩＬ−１０に誘導され た防御を逆行させる。ＮＺＢ／Ｗ雌マウス３６匹および１８匹の群に、２Ａ５抗 ＩＬ−＝１０抗体（−）（ム）またはＧＬ１１３と称するイソタイプ対照抗体（ ロ）をそれぞれ誕生から全実験の間中１週間に２回注射した。抗ＩＬ−１０抗体 を注射した被験動物の半数は更に、ＸＴ２２抗ＴＮＦα抗体を誕生後３００週目 開始して１週間に２回与えられた（ム）。被験動物の生存を３４週間にわたって 監視した。

発明の詳細な説明 本発明は、免疫機能を調節する、特に、微生物によって引起こされたショックま たは制御Ｂ細胞の分化若しくは発生の有害な作用を防止するおよび／または低減 するためのＩＬ−１０またはその類似体若しくはアンタゴニストの使用法に関す る。本発明は、更に、これらの方法を実施するためのｒｔ、−ｉｏまたはその類 似体若しくはアンタゴニストを含む薬剤組成物を含む。本発明において用いるた めのＩＬ−１０は、好ましくは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド州にそれぞれ受託番号６８１９１．６８ １９２および６８１９３として寄託されているｐＨ５ＣＳｐＨ１５ｃおよびｐＢ ＣＲＦＩ　（ＳＲａ）のｃＤＮＡインサートによって定義される読取り枠によっ てコードされた成熟ポリペプチドの群より選択される。

ＩＬ−１０は、単球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を加えた単球によるＴ ＮＦαおよびＩＦＮγ合成を阻害するが、ＮＫ細胞単独では阻害されない。■Ｌ −４は、Ｉ　Ｌ−２で活性化されたＮＫ細胞からのサイトカイン分泌を直接的に 阻害する。これは、ＩＬ−４およびＩＬ、−１０がＮＫ細胞に対して独特な経路 によって作用することを示唆し、例えば、ＩＬ−１０作用は単球の関与を必要と する。ＩＬ−１０はＩ　Ｌ−２で活性化されたＮＫ細胞からのサイトカイン分泌 を直接的に阻害するが、ＬＡＫ活性を阻害しないし、ＩＬ−２に誘導されたサイ トカイン合成およびリンパ球に活性化されたキラー（ＬＡＫ）活性が異なる機序 によって調節されていることが示唆される。

ＩＬ−４０は、単球および／または活性マクロファージまたはＮＫ細胞によるｎ ：（炎症性サイトカインの産生を阻害するその能力の機序によって明らかに抗炎 症活性を有することが実証されている。このサイトカイン生産の明害は転写段階 で生じる。

ＩＬ−１０は、更に、動物において超抗原に誘導された応答、例えば、Ｔ細胞に 媒介された応答を調節することが本明細書中において実証された。ブドウ球菌性 エンテロトキシンＢ　（ＳＥＢ）は苛酷な毒素性ショック応答を引起こすことが あり、マウスでの実験はインビボでの効力を実証する。超抗原と同時のまたは超 抗原に対する暴露後でも、目７−ＩＯの投与は高ＳＥＢ暴露による致死を防出す るのに有効である。

グラム陰性細菌のリボ多糖（１，ｆ）Ｓ）は動物において敗血症性ショック応答 を引起こす１．この内毒素に誘導されｔ：ショック応答は、前記のように、刺激 されたマクロファージ／単球からのＴＮＦα、ＩＬ−１および／またはＩ　Ｌ　 、−６の放出の結果として生じる。しかしながら、ＩＬ−１０の投与は１、ＬＬ −１ｑ、ＩＬ−１β、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ−８およびＧＭ　Ｃ３Ｆの誘導された発 現を抑制する。データは、ＩＬ−１，０がＬＰＳ出現後に投与されたとしても内 毒素に誘導されたショックからマウスを防護することができると決定されること を示す。逆に、抗ＩＬ−１０抗体はその防御作用を阻１１−することかできる。

実験は、更に、抗ＩＬ−１０で処置されたマウスか実質的に高濃度の循環性腫瘍 壊死因子アルファ（ＴＮＦα）および循環性ＩＬ−６並びに内毒素に誘導された ショック（例えば、ＬＰＳに誘導された）に対する深い感受性も示すことを示し ている。

抗ＩＬ−１０抗体は他の免疫学的症状の処置においても有用である。データは、 若いマウスに対する長期間の抗ＩＬ−１０抗体の投与がＢ細胞のｉ−ｙ−１ザブ クラスを枯渇させることかあるということを示す。これは、１１、−１０をＬｙ −１Ｂ細胞発生の調節剤として包含し、モしてＬ　ｙ　−ＩＢ細胞を枯渇させる 手段を提供する。この観察報告は自己免疫症状の処置の見通しをもたらす。

自己免疫応答の発生には複雑なＴ細胞相互作用が必要である。マウスのＮＺＢ／ ′Ｗ種は線通（全身性エリテマトーデス、５ＬＥ）傾向があり且つ自己免疫症状 の処置用の治療薬を検査するモデルを提供Ｖる。更に、これらのマウスは、他の Ｂ細胞種と比較して異常な割合のｔ、ｙ−ｉ　Ｂ細胞を示す。インビボでのマウ スの実験を、ＮＺＢ／Ｗ種を用いて記載オる。

これらのマウスの抗ＩＬ−１０処置は、全体の生存によってまたはタンパク尿症 、腎炎茗しくは自己抗体力価の発生によって監視される自己免疫応答の開始を実 質的に遅らせた。この結果は、抗ＩＬ−１０処置が他の哺乳動物、例えば、ヒト を処置するのに当然有用であることを示している。

広範囲の単細胞および多細胞発現システム（すなわち、宿主−発現ベクター組合 わせ）を用いて、本発明の方法で用いるためのポリペプチドを生産することがで きる。宿主細胞種としては、制限されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物等が ある。特異的発現システムの選択および／または修飾を行なうための指針を提供 する多数の論評が入手可能である。例えば、いくつかの大腸菌発現システムを論 評し−Ｃいるデ・ボーア（ｄｅ　Ｂｏｅｒ）およびシェパード（Ｓｈｅｐａｒｄ ）［大腸菌において異種遺伝子発現を最適にする方法（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆ ｏｒ　Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｊ、２．０５〜２４７頁、クルー ジ（Ｋｒｏｏｎ）（監修）Ｇｅｎｅｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ　Ｅｘｐｒｅ ｓｓ　ｉｏｎ　（ジョン舎つィリーφアンド・ヤンズ、ニューヨーク、１９８３ ）；哺乳動物細胞をトランスフェクトし且つ形質転換する方法を論評しているク チャラバティ　（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）ら、Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉ ｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、１６巻。

４号、３４９〜３７９頁（１９８４）およびバネルン（Ｂａｎｅ　ｒ　ｊ　ｉ） ら、Ｇ、ｅ−ｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５巻、１９〜３］頁（１９ ８３）；大腸菌０．酵母および哺乳動物細胞における遺伝子発現の抜粋記事を論 評しているレツー）７　（Ｒｅｚｎ　１ｋｏｆ　ｆ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ ）監修、Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（バターワー ス（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）、ボストン、１９８６）：並びに哺乳動物発現 システムを論評しているスイリー（Ｔｈｉｌｌｙ）、ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌ 　Ｉ　、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（バターワース、ボストン、１９８６）を参照 されたい。これらはそれぞれ参考として本明細書中に包含される。同様に、特異 的ｃＤＮＡおよび発現制御配列を結合しおよび／または操作して本発明によって 用いるのに適当な発現ベクターを考案しおよび／または修飾する技術・■びに条 件を記載している多数の論評か入手可能であり、例えば、それぞれ参考として本 明細書中に包含される、マニアティス（Ｍａｎｉａｊｉｓ）ら（１９８２）、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、 コールド・スプリング・ハーバ−・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏ ｒ　Ｐｒｅｓｓ）、：ｌ−ルド・スプリング、ノ、−バー、ニューヨーク；サム プルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版、１〜３巻）、コールド・スプリン グ・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク；およ びオースベル（Δｕｓｕｂｅｌ）ら（１９８７年および定期補遺）、Ｃｕｒｒｅ ｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ且ｍ、ウィリー・アンド ・ヤンズ、ニューヨークがある。

大腸菌発現システムは、リッグス（Ｒｉｇｇｓ）により、本明細書中に参考とし て包含されている米国特許第４．４３１．７３９号明細書に開示されている。

大腸菌における高発現に特に有用な原核性プロモーターは、デ・ボーアにより、 本明細書中に参考として包含されている米国特許第４，５５１，４３３号明細書 に開示されたｔａｃプロモーターである。分泌発現ベクターは、更に、大腸菌宿 主に利用可能である。特に有用なのは、ブレイブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）らによって ＥＭＢＯＪ、、３巻、２４３７〜２４４２頁（１９８４）に開示されたｐｌＮ− Ｉ　Ｉ　１−ｏｍｐＡベクターであり、そこにおいて転写されるｃＤＮＡは、ｏ ｍｐＡタンパク質のシグナルペプチドをコードしている大腸菌ＯｍｐＡ遺伝子の 一部分に融合され、順に、成熟タンパク質を細菌の周辺腔中に分泌させる。米国 特許第４．３３６，３３６号明細書および同第４．３３８，３９７号明細書は、 更に、原核生物のための分泌発現ベクターを開示している。したがって、これら の参考文献は参考として本明細書中に包含される。

多数の細菌株が原核性発現ベクターに適当な宿主であり、大腸菌、例えば、Ｗ３ １１０　（ＡＴＣＣ番号２７３２５）、ＪＡ２２１、Ｃ６００、ＥＤ７６７．０ １月、ＬＥ３９２、ＨＢＩＯＩ、Ｘｊ７７６　（ＡＴＣＣ番号３−１２４４）、 Ｘ２２８２、ＲＲＩ　（ＡＴＣＣ番号３１３４３）　ＭＲＣｌ、枯草菌（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｕｓ）株；並びに他の腸内細菌科、例えば、ネズミチ フス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または霊菌（Ｓｅｒ ｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ）がある。真核性タンパク質の発現に有用な細菌株、例えば、大腸 菌に１．２　Ｘ１７７６を誘導する一般的な方法は、カーチス三世（Ｃｕｒｔｉ ｓ　ＩＩＩ）によって米国特許第４，１９０．４９５号明細書に開示されている 。

原核性および真核性微生物の他に、多細胞生物由来の細胞を含む発現システムを 用いて本発明のタンパク質を生産してもよい。特に興味深いのは、その翻訳後プ ロセラシブ機構が生物学的に活性の哺乳動物タンパク質を生産するのに一層適当 であるので、哺乳動物発現システムである。数種類のＤＮＡ腫瘍ウィルスは哺乳 動物宿主のためのベクターとして用いられてきた。特に重要なのは、細菌の複製 制御配列に結合したＳＶ４０複製、転写および／または翻訳制御配列を含む多数 のベクターであり、例えば、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルブ（Ｂｅｒ ｇ）によって開発され、Ｍｏ１１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２巻、１６１〜１７ ０頁（１９８２）およびＭｏ１１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、３巻、２８０〜２８ ９頁（１９８３）で開示され、そしてタケベ（Ｔａｋｅｂｅ）ら、Ｍｏ１１．Ｃ ｅ１１．Ｂｉｏｌ、、８巻、４６６〜４７２頁（１９８８）によって改良された ｐｃＤベクターがある。したがって、これらの参考文献は本明細書中に参考とし て包含される。他のＳＶ４０基剤哺乳動物発現ベクターとしては、カオフマン（ Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）によってＭｏ　Ｉ　ｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２巻、１３０４〜１３１９頁（１９８２）に、およびク ラーク（Ｃｌ　ａ　ｒ　ｋ）ら、米国特許第４，６７５，２８５号明細書に開示 されたもののがあり、双方の文献とも本明細書中に参考として包含される。通常 、サル細胞は上記ベクターに対して好ましい宿主である。ＳＶ４０　ｏｒｉ配列 および完全なＡ遺伝子を含むこのようなベクターはサル細胞中で自律複製するこ とができる（非自律複製プラスミドよりも高コピー数および／または安定コピー 数を与える）。更に、ＳＶ４０　ｏｒｉ配列を含み完全なＡ遺伝子を含まないベ クターは、グルラマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）によってＣｅｌ＋、２３巻、１７５〜 １８．２頁（１９８１）に記載され且つＡＴＣＣ（受託番号ＣＲＬ１６５１）か ら入手可能なＣＯ５７サル細胞中で高コピー数（安定ではない）に自律複製する ことができる。上記ＳＶ４０基剤ベクターは、更に、宿主細胞ＤＮＡ中への組込 みによって他の哺乳動物細胞、例えば、マウスＬ細胞を形質転換しうる。

多細胞生物は、更に、本発明のポリペプチドの生産用宿主として役立つことがで き、例えば、昆虫幼生、マエダ（Ｍａｅｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻。

５９２〜５９４頁（１９８５）およびＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、、３５ １〜３７２頁（１９８９）、並びに形質転換した動物、ジエニッシュ（Ｊａｅｎ ｉｓｃｈ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１４６８〜１４７４頁（１９８８）で ある。これらの参考文献、類似の他のものも参考として本明細書中に包含される 。

■、インターロイキン−１０および類似体の検定ＩＬ−１０と集合的に称するＩ Ｌ−１０関連タンパク質およびペプチドは、検定および単位の基準を形成するこ とができるいくつかの生物活性を示す。特に、ＩＬ−１，０は、ＩＦＮγ、リン ホトキシン、Ｉ　Ｌ−２、Ｉ　Ｌ−３およびＧＭ−Ｃ９Ｆから成る群において、 同系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）および抗原に対する暴露によって１種類またはそ れ以上のこれらのサイトカインを合成するように誘導されたＴヘルパー細胞集団 の少なくとも１種類のサイトカインの合成を阻害する性質を有する。この活性に おいて、ＡＰＣは、それらが複製することはできないが、それらの抗原プロセッ シング機構は機能する状態であるように処理される。

これは、便宜上、ＡＰＣに、例えば、約１５００〜３０００Ｒ（ガンマまたはＸ 線）をＴ細胞と混合する前に照射することによって達成される。マウスＩＬ−１ ０の検定に関して、表２も参照されたい。

表２ 増殖検定に改良されたＩ　Ｌ−１０（Ｃ８Ｉ　Ｆ）検定抗原提示細胞（Ａ　Ｐ　 Ｃ） （１）ＢＡＬＢ／ｃ牌臓（細胞約１０８個／牌臓）をｃＲＰＭＩｃ７）試験管中 に取る。

（２）単細胞懸濁液をストレーナおよび１０ｍ１シリンジのバレルを用いて（フ ード中での滅菌技術を用いて）製造し、１２００ｒｐｍで回転させる。

（３）ペレットを冷ＮＨＣ１（Ｈ２０中０．８３％）５ｍｌ中に再懸濁させる。

１２００ｒｐｍで再度回転さぜる。

（４）ペレットをｃＲＰＭｌ　（検定用ＩＬ−２不含）５ｍｌ中に再懸濁させ且 つ回転させて洗浄する。

（５）ｃＲＰＭＩの５ｍｌ中に再懸濁させ且つ計数する。

（６）３０００ラドを照射する（一般的に２０分間）。

（７）細胞濃度を８ｘｌＯ”／ｍｌに調整する。（検定において５０ｍ１／ウエ ルを加えて最終４ｘｌＯ５／ウエルにする）。

（抗ＩＬ−１０抗体を加えるのが望ましい場合、Ｉ　Ｌ−１０を微量滴定プレー ト中の最終容量１００ｍ１かまたは最終容量５０ｍ１中で滴定する）。

Ｔｈ、１細胞 （１）検定の３日前に、ＨＤＫＩ細胞のアンプルをＩＬ−２含有ｃＲＰＭｌの２ ｘ２５ｍｌ中に解凍する。

（２）細胞を翌日検査し、必要ならば２分の１または３分の１に分割する。

（３）検定当日に、プレートする直前に細胞を１２０Ｏｒｐｍで回転させ且つｃ ＲＰＭ［の５ｍｌ中に再懸濁させ、そして計数する（トリパンブルーで２分の１ に希釈する）。

（４）濃度を２ｘ１０５／ｍｌに再調整し且つ５０ｍ１／ウエルを加える（最終 細胞１０４個／ウェル）。プレートアウトする前にＫＬＨを加えて濃度を４００ ｍｇ／ｍｌにする。（これは最終濃度１００ｍｇ／ｍｌを与える）。

対照 ＫＬＨ不含Ｔｈｌ細胞５０ｍ１０ Ｔｈｌ細胞十ＫＬＨ５０ｍ１０ 牌臓ＡＰＣ５０ｍ１０ ＩＬ−１０を加減する（おそらく最高濃度が好ましい）。

最終容量を最大２００ｍ１までにする。

検定の順序 （１）ＡＰＣを調製する。

（２）ＩＬ−１０をプレートアウトする。

（３）Ｔｈｌ細胞を調製し且つプレートアウトする。

（４）ＡＰＣをプレートアウトする。

４８時間後に、ＩＦＮｇエリザ用に上澄み１００ｍ１を除去し一次に、３Ｈ−チ ミジン（１ｍＣｉ／ウェル）を加え、そして翌朝採集する。

或いは、サイトカイン阻害は、−次または、好ましくは、二次混合リンパ球反応 （ＭＬＲ）において検定することができ、その場合、同系ＡＰＣを用いる必要は ない。ＭＬＲは当該技術分野において周知であり、例えば、本明細書中に参考と して包含される、ブラドリー（Ｂｒａｄｌｅｙ）、ミシエル（Ｍｉｓｈｅｌｌ） ら監修の５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕ ｎｏ　Ｉ　ｏｇｙ　（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、サン・フランシスコ、１ ９８０）の１６２−１６６頁：およびバチスト（Ｂａｔｔｉｓｔｏ）ら、Ｍｅｔ ｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５０巻、８３〜９１頁（１９ｓ　７）を参照さ れたい。簡単には、同種リンパ系細胞の２集団を混合し、その一方の集団は、例 えば、照射によって増殖を防止するように混合前に処理された。好ましくは、細 胞集団は、補足培地、例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０中 において細胞約２ｘ１０６個／ｍｌの濃度で調製される。対照および試験培養物 双方に対して検定用に各集団０．５ｍｌを混合する。二次ＭＬＲ用に、−次ＭＬ Ｒにおいて７日後に残っている細胞を、新たに調製さ桜照射された刺激剤細胞に よって再刺激する。ＩＬ−１０を有すると疑われる試料は試験培養物に対して混 合時に加えることができ、そして対照および試験培養物双方のサイトカイン生産 は、混合して１〜３日後に検定することができる。

ＩＬ−１０検定用にＴ細胞集団および／またはＡＰＣ集団を得るには、例えば、 本明細書中に参考として包含されている、ディサバト（ＤｉＳａｂａｔｏ）ら監 修、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻（１９８４）に充分に記載さ れている当該技術分野において周知の技術を用いる。好ましいＩＬ−１０検定用 のＡＰＣは末梢血液単球または組織マクロファージである。これらは、例えば、 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻、８８〜１．０２頁（１９８４）；メイジ（ Ｍａｇｅ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻、１１８〜１３２頁 （１９８４）；リトヴイン（Ｌｉｔｖｉｎ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ 、、１０８巻、２９８〜３０２頁（１９８４）；ステイーブンリン（Ｓｔｅｖｅ ｎｓｏｎ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻、２４２〜２４９頁 （１９８９）；およびロメイン（Ｒｏｍａ　ｉ　ｎ）ら、Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、３０８巻、１４８〜１５３頁（１９８４）に記載の標 準的な技法を用いて得られる。好ましくは、ヘルパーＴ細胞をＩＬ−１０検定に おいて用い、それは末梢血液、稗臓またはリンパ節からリンパ球を最初に分離し た後、商業的に入手可能な抗ＣＤ４抗体、例えば、米国特許第４．　３８１．　 ２９５号明細書に記載され且つオルトφファーマソイティカル・コーポレーショ ン（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）から入手可能な ０ＫＴ４を用いて、例えば、パニングまたは流動細胞計測法によってヘルパー細 胞を選択することにより得られる。マウス抗ＣＤ４は、ベクトン・ディクソン（ Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ）またはファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ）から入手可能である。必要な技術は、それぞれ参考として本明細書中に包含さ れる、ボイム、５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、２１巻（補遺９７）、７７頁（１９６８）；Ｍｅｔｈ、ｉｎＥ ｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻（上記に引用）およびプラム（／３ｒａｍ）ら、Ｍｅ ｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１２１巻、７３７〜７４８頁（１９８６）に十 分に開示されている。概して、ＰＢＬは、新鮮な血液からフィコール・ハイバク （Ｆｉ　ｃｏ　ｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離によって得られる。

種々の抗原を検定において用いることができ、例えば、スカシガイのヘモシアニ ン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）、トリのγ−グロブリンまたは類似のものを用いることができ る。

更に好ましくは、抗原の代わりに、ヘルパーＴ細胞を検定において抗ＣＤ３単ク ローン性抗体、例えば、米国特許第４．．３６１．５４９号明細書に開示された ０ＫＴ３で刺激する。

対照および試験試料中のサイトカイン濃度は、標準的な生物検定および／または 免疫化学検定によって測定される。特異的サイトカインに関する免疫化学検定の 構成は、精製サイトカインが入手可能である場合、当該技術分野において周知で ある。例えば、それぞれ本明細書中に参考として包含され、論題に対する典型的 な広範囲の参考文献のである、力ンプベル（Ｃａｍｐｂｅ　ｌ　１）、Ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｃｉｙ　Ｔｅｃｈｎ１団（エルセピア、アムステル ダム、１９８４）’；テユッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、米国特許第４，４８６． ５３０号明細書を参照されたい。ヒト１Ｌ−２、ヒトＩＬ−３およびヒトＧＭ　 ＣＳＦ川のエリザキットは、ジェンザイム・コーホレーン１ン（Ｇｅｎｚｙｍｅ 　Ｃａｒｐ、）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能であり：そしてＩＦＮ γ用のエリザキットはエンドンーン・インコーホレーテッド（Ｅｎｄｏｇｅｎ、 Ｉｎｃ、）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能である。ヒドリンホトキシ ンに特異的な多クローン性抗体は’−５エンザイム・コーポレーシヨンから入手 可能であり、それを、ヒドリンホトキシンのためのラジオイ８２）で用いること ができる。

上記に記載したサイトカインの生物検定を用いてＩＬ−１０活性を決定すること ができる。ヒドリンホトキシンの生物検定は、それぞれ本明細書中に参考としく Ｍａ　ｔ　ｔ　ｂ　ｅｗｓ）ら、クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｓ）ら監修のトン、 Ｄ、Ｃ，１，１，９８７）の２２１〜２２５頁に開示されている。ヒトＩＬ−２ およびＧＭ−Ｃ３Ｆは、ＡＴＣＣからそれぞれ受託番号ＴｌＢ２１４およびＣＣ Ｌ２４６として入手可能な因子依存細胞系ＣＴＬＬＩおよびＫＧ、−１を用いて 検定することができる。ヒトＩ　Ｌ−３は、例えば、メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌ ｆ）、Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　ＣｏｌｏｎｙＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ 　Ｆａｃｔｏｒｓ（エルセピア、アムステルダム、１９８４）に記載されたよう に、軟質寒天培地において広範囲の造血細胞コロニーの形成を刺激するその能力 によって検定することができる。ＩＦＮγは抗ウイルス検定、例えば、ミージャ ー（Ｍｅａｇｅｒ）、クレメンスら監修（上記に引用）の１２９〜１４７頁を用 いて定量することができる。マウス同等物は、適当な細胞系を用いて同様に検定 することかできる。

サイトカイン生産は、更に、ｍＲＮＡ分析によって決定することができる。サイ トカインｍＲＮＡは、ホワイト（Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ；　Ｃｈ ｅｍ、。

２５７巻、８５６９〜８５７２頁（１９Ｂ２）およびジレスピー（Ｇｉｌｌｅｓ ｐｉｅ）ら、米国特許第４．４８３，９２０号明細書に記載の細胞質ドットハイ ブリダイゼーションによって測定することができる。したがって、これらの参考 文献は本明細書中に参考として包含される。他の方法としては、精製ＲＮＡを用 いるドツトブロッティング、例えば、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）ら監１９８５）の 第６章がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いることもでき、本明 細書中に参考として包含されているイニス（Ｉ　ｎｎ　ｊ　ｓ）ら（監修）イン コーホレーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）、ニューヨーク を参照されたい。

いくつかの場合において、ＩＬ−１０活性の検査をするための試料を前処理して 、検定の妨げとなるかもしれない予め決定されたサイトカインを除去する。例え ば、ＩＬ−２は、若干の細胞においてＩＦＮγの生産を増大させる。したがって 、検定で用いられるヘルパーＴ細胞に応じて、ＩＬ−２を試験される試料から除 去すべきことがある。このような除去は、便宜上、試料を標準的な抗すイトカイ ン親和性カラムに通過させることによって達成される。

便宜上、ＩＬ−１０活性の単位は、米国特許第４．！５５９．３１０号明細書に 記載され且つＡ、　Ｔ　ＣＣから受託番号ＣＲＬ８３０６として入手可能なＭＣ ／９細胞のＩ　Ｌ−４に誘導された増殖を増大させるＩ　Ｌ−１，Ｏの能力に関 して定義される。１単位／ｍｌは、以下の検定においてＩ　Ｌ−４の水準を上記 ＭＣ／９増殖の最大刺激の５０％にするＩＩ、−１０の濃度として定義される。

ＩＬ−４およびＩＬ、−１０の二重反復試験または三重反復試験用希釈液を標準 的な微量滴定プレートにおいて培地５０ｕｌ／ウエルに調製する。培地はＲＰＭ １１６４０．１０％ウシ胎児血Ｌ５０ｕＭ２メルカプトエタノール、２ｍＭグル タミン、ペニシリン（１００Ｕ／’Ｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ ／Ｌ）から成る。培地で希釈した１６００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４，２５μｌ／ウエ ル（最終４００　Ｕ／ｍｌ）を加え、そして−晩中、例えば、２０〜２４時間イ ンキュベートする。

”Ｈ−チミジン（例えば、培地中５０ｍＣ１／ｍｌ）を０．５〜１．０ｍＣ１／ ウェルて加え、そして細胞を再度−晩生インキユベートした後、細胞を採集し且 つ取込まれた放射能を測定する。

サイトカインＩ　Ｌ−４およびｒＬ−１０の製法の一般的な説明に関しては、そ れぞれ本明細書中に参考として包含されている米国特許第５，０１７，６９１号 明細書およびＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７／４５３．９５１号明細書を参照されたい。

１１、　アゴニストおよびアンタゴニストＩＬ−１，０アゴニストは、ＩＬ−１ ０とその受容体との相互作用を模擬する分子であってよい。このようなものは、 ＩＬ−１０の類似体若しくはフラグメントまたはＩＩ、−１０受容体のりガント 結合性部位エピトープに対する抗体、或いはＩＬ−１，０の受容体相互作用性部 分に対して結合する特定の抗体に対する抗イデイオタイプ抗体であってよい。

アンタゴニストは、受容体結合に関して競合するタンパク質の形をとることがで き、例えば、それは受容体を活性化する能力を欠き、同時にＩＬ−１０結合また はＩＬ−１０結合性分子、例えば、抗体を阻止する。

抗体は、天然に存在する形でもそれらの組換体ても、ＩＬ、−１０サイトカイン 、フラグメントおよび類似体に対して生じることかある。更に、抗体はＩＬ−１ ０に対してその活性型かまたは不活性型でも生じることができ、その相違は、活 性サイトカインに対する抗体か、活性コンホメーションでしか存在しないエピト ープを認識すると考えられることである。抗イデイオタイプ抗体もこれらの方法 で考えられ、潜在的なＩＬ−１，０アゴニストでありうる。

望ましい抗原、例えば、サイトカインの予め決定されたフラグメントに対する結 合性フラグメントおよび一本鎖変型を含む抗体は、フラグメントと免疫原性り： ノバク質との結合体（ｃｍｎｊｕｇａｔｅｓ）で動物を免疫感作することによっ て生じることができる。単クローン性抗体は望ましい抗体を分泌する細胞から製 造される。これらの抗体は、正常若しくは不活性類似体に対する結合性に関して スクリーンすることができるしまたはアゴニスト若しくはアンタゴニスト活性に 関してスクリーンすることができる。通常、これらの単クローン性抗体は、少な くとも約１ｍＭ、更に一般的には、少なくとも約３００μＭ、典型的には少なく とも約１０μＭ、更に典型的には、少なくとも約３０μＭ１好ましくは、少なく とも約１０μＭ１そして更に好ましくは、少なくとも約３μＭまたはそれ以上の ＫＤと結合する。前記はＩＬ−１０に関するが、同様の抗体が他の類似体、その 受容体およびアンタゴニストに対して生じる。

本発明の、抗原結合性フラグメントを含む抗体は、有意に、診断または治療的に 有効でありうる。それらは、ＩＬ−１０受容体に対して結合し且つ該受容体に対 するリガンド結合を阻害しまたは生物学的応答を引き出すＩ　Ｌ−１０の能力を 阻害する強力なアンタゴニストでありうる。

ＩＬ−１０またはフラグメントは、他の物質、特に、免疫原として用いられる融 合したまたは共有結合したポリペプチドのようなポリペプチドに対して結合しう る。サイトカインおよびそのフラグメントは、種々の免疫原、例えば、スカシガ イのヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド等に対して融合また は共有結合しつる。多クローン性抗血清を製造する方法の説明に関しては、それ ぞれ本明細書中に参考として包含されている、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ホー バー・メディカル・ディビジョン（Ｈｏｅｂｅｒ　ＭｅｄｉｃａｌＤｉｖｌｓｉ ｏｎ）、ハーバ−（Ｈａｒｐｅｒ）およびロウ（Ｒｏｗ）　、１９６９年；ラン ドスタイナー（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ）（１９６２）Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ 　ｏｆ　Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ。

ドーパ−・パブリケーションズ（Ｄｏｖｅｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、　 二ューヨーク、およびウィリアムス（Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ａｍｓ）ら（１９６７ ）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、１巻、アカデミツク会プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、 ニューヨークを参照されたい。典型的な方法は、抗原による動物の超免疫感作を 行なう。次に、被験動物の血液を反復免疫感作直後に集め、そしてガンマグロブ リンを単離する。

いくつかの場合、種々の哺乳動物宿主、例えば、マウス、舊歯類動物、霊長類、 ヒト等から単クローン性抗体を製造するのが望ましい。このような単クローン性 抗体を製造する技術の説明は、例えば、スタイツ（Ｓｔｉｔｅｓ）ら（監修）Ｂ ａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、ラン グ・メディカル伊バブリケーションズ（Ｌａｎｇｅ　ＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ）、ロス・アルトス、ＣＡおよびそこにおいて引用された参考文 献、バーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌ　ａ　ｎ　ｅ）　（１９８８） ２版）、アカデミツク拳ブレス、ニューヨーク；コリガン（Ｃｏ　ｌ　ｉ　ｇａ ｎ）ら（監修、　１．９９１年および定期補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ｙ、　ウィリー・アンド・サンズーニューヨー ク；そして特に、単クローン性抗体を生成する一つの方法を論及しているコーラ −（Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５ ）Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７において見出すことができる。これら の参考文献はそれぞれ本明細書中において参考として包含される。簡単に要約す ると、この方法は、動物に免疫原を注射することを含む。次に、被験動物を層殺 し、そしてその牌臓から細胞を取りだした後、それを骨髄腫細胞と融合させる。

その結果は、骨髄腫親細胞とは異なる、インビトロの選択的条件下において再現 することができるハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」である。次に、 ハイブリドーマ集団をスクリーンして個々のクローンを単離し、そのそれぞれが 単−抗体種を免疫原に対して分泌する。この方法において、得られた個々の抗体 種は、免疫原性物質上で認識された特定部位に応答１−で生じた免疫動物からの 不死化およびクローン化された単−Ｂ細胞の生産物である。

他の適当な技術は、抗原性ポリペプチドに対するリンパ球のインビトロでの暴露 或いはファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を伴う 。それぞれ本明細書中に参考として包含されている、ヒユーズ（Ｈｕｓｅ）ら（ １９８９）ｒファージラムダにおける免疫グロブリンレパートリ−の大型組合わ せライブリーの生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＬａｒｇｅＣｏｍｂｉ ｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌ　 ｉｎ　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｉｎ　ＰｈａｇｅＬａｍｂｄａ）Ｊ、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４６：１２７５〜１２８１；およびワード（Ｗａｒｄ）ら（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４〜５４６を参照されたい。本発明のポリペプチド および抗体は修飾を伴ってまたは伴うことなく用いることができ、キメラ抗体ま たはヒト様抗体がある。更に、組換え免疫グロブリンを製造することができ、カ ビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）、米国特許第４，８１６．５６７号明細書を参照され たい。これらの特許は本明細書中に参考として包・　含される。

サイトカインまたはその受容体に対して生じた抗体は、更に、アゴニストまたは アンタゴニストの性質を示すことができる抗イデイオタイプ抗体を生じるのに有 用である。これらは本明細書中で論及したような種々の免疫学的応答を調節する のに有用である。

ＩＩｌ、精製および薬剤組成物 本発明のポリペプチドが、例えば、形質転換した酵母または哺乳動物細胞の分泌 生成物のような可溶性型で発現する場合、それらは、硫酸アンモニウム沈殿、イ オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグ ラフィーおよび／または類似のものを含む当該技術分野の標準法にしたがって精 製することができ、例えば、本明細書中に参考として包含さね、このような精製 の指針を提供する「酵素精製および関連技術（ＥｎｚｙｍｅＰｕｒｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）ＪＭｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２：２３３〜５７７　（１９７７）およびスコ ープス（Ｓｃｏｒｐｅｓ）、Ｒ，、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（スプリンガー・フエアラー ク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８２）を参照され たい。同様に、本発明のポリペプチドが、例えば、凝集体、封入体または類似の もののような不溶性型で発現する場合、それらは、遠心分離によって破裂した宿 主細胞から封入体を分離し、封入体をカオトロピズム剤および還元剤で可溶化さ せ、可溶化した混合物を希釈し、そしてポリペプチドが生物学的に活性のコンホ メーションをとるようにカオトロピズム剤および還元剤の濃度を低下させること を含む、当該技術分野における標準法によって精製することができる。後者の手 順は、本明細書中にそれぞれ参考として包含されている以下の参考文献、すなわ ち、ウィンクラ−（Ｗｉ　ｎｋ　Ｉ　ｅ　ｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２５：４０４１〜４０４５　（１９８６）；ウィンクラ−１Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ ｏｇｙ、３：９９２−９９８　（１９８５）；ロス（Ｋｏｔｈｓ）ら、米国特許 第４．５６９．７９０号明細書；並びに欧州特許出願第８６３０６９１７．５号 明細書および同第８６３０６３５３．３号明細書に開示されている。

本明細書中で用いられる「有効量」とは、例えば、悪寒、血管収縮、精神的錯乱 、潅流低下、超高熱等のような認識された症状によって決定されるショック症状 を改善しまたは防止するのに十分な量を意味する。特定の患者に対する有効量は 、治療される敗血症の状態および種類、患者の全身の健康状態、投与方法、副作 用の苛酷さ等のような因子に応して変更することができる。概して、ＩＬ−１０ 試薬は、有効量の試薬および薬剤担体を含む薬剤組成物として投与される。例え ば、本明細書中に参考として包含される、カブラン（Ｋａｐｌａｎ）およびパ・ アンド・カンパニー　（Ｍｏｓｂｙ　ａｎｄ　Ｃｏ、）　、セント・ルイス、Ｍ Ｏ。

およびギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）ら（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄＧｉｌ ｍａｎｓ：Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ（Ｐｅ ｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。ある種の用途において、■Ｌ−１ ０治療薬は、抗生物質組成物を含む別の薬学的活性成分と組合わせることができ る。

薬剤担体は、患者に対して本発明の組成物を供給するのに適当な何等かの適合し た無毒性物質でありうる。このような薬剤の非経口投与に有用な多数の組成物シ ングロカンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、イー ストン、ＰＡ　１９８０）。或いは、本発明の組成物を植込み可能なまたは注射 可能な薬剤供給システムによって患者の体内に導入することができる。例えば、 本明細書中に参考として包含される、アーカート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、Ｐｒ ｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８１）；米国特許第３．７７３．９１９号明細書 、同第３，２７０，９６０号明細書等を参照されたい。

非経口によって投与される場合、ＩＬ−１０を薬剤担体と一緒に注射可能な状態 の（溶液、懸濁液、エマルジョン）単位剤形中に配合する。このような担体の例 は、正常食塩水、リンガ−液、デキスロース溶液およびハンクス液である。非水 性担体、例えば、固定油およびオレイン酸エチルを用いてもよい。好ましい担体 は５％デキストロース／食塩水である。担体は、少量の添加剤、例えば、等張性 および化学的安定性を増大させる物質、例えば、緩衝剤および保存剤を含むこと ができる。ＩＬ−１０試薬は、凝集体および他のタンパク質を実質的に含まない 精製された状態において約５〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で配合されるのが好 ましい。好ましくは、１−１０は、約５０〜８００ｍｇ／日の範囲の量を供給す るように（すなわち、約１〜１６ｍｇ／ｋｇ／日）、連続注入によって投与され る。毎日の注入速度は副作用および血液細胞計数の監視に基づいて変更すること ができる。

有効態のＩＬ−１０アゴニストまたはアンタゴニストを決定する場合も同様に考 えられるが、ある種のアンタゴニストは更に高い範囲などの一層広範囲の用量範 囲が必要であると考えられる。

ＩＶ、生物学的観察および機序 以下に提唱した機序によって制限されないが、以下の論及により、ＩＬ−１０類 似体、゛アゴニストおよびアンタゴニストの使用法および用途が洞察される。免 疫システム機能、発生および分化に対する有用な背景を提供する。例えば、本明 細書中に参考として包含される、ポール（Ｐａｕｌ）（監修）（１９８９）Ｆｕ ｎｄａｍｅｎｔａｌ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版）ラヴエン・プレス（Ｒａ ｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）、二ｘ−ヨーク。特に、炎症に関する第２６章、遅延型過 敏症に関する第２８ｆ！および自己免疫に関する第３１章は、本明細書中に記載 した使用法に関連する。

ヒトＰＢＭＣおよび精製ＮＫ細胞においてＩＬ−２によって引起こされたサイト カイン合成およびＬＡＫ活性に対するＩＬ−４およびＩＬ−１０の作用は、例え ば、実験Ａにおいて研究された。ＩＬ−４およびＩＬ−１０双方がＰＢＭＣにお いてＩＬ〜２に誘導されたＩＦＮｙおよびＴＮＦα合成を阻害し、ＩＬ−４だけ が精製ＮＫ細胞によるＩ　Ｌ−２に誘導されたＩＦＮγ合成を阻害する。したが って、ＩＬ−４およびＩＬ−１ｏは、異なる機序によってＮＫ細細胞サイトイイ ン合成阻害している。

ＴＮＦα生産を研究する実験結果により同様の結論が示唆された。しかしながら 、この場合、単球もこのサイトカインを生産する。１１．−１ｏはＮＫ細胞によ るＩＬ−２誘導ＴＮＦａ合成に対して直接作用しなかったが、単球にょるＴＮＦ α生産を■正することができた。ＮＫ細胞およびＣＤＬ４＋細胞双方を含む培養 物のＩ　Ｌ−２による刺激は、生産を大きく増大させ、そしてＩＬ−１０はこの 増大を完全に阻止した。Ｉ　Ｌ−２は、ＴＮＦａを更に生産するようにＣＤ１４ ＋細胞を活性化しなかったので、相乗作用の増大はおそら＜ＮＫ細胞ＴＮＦα合 成の増加を示している。したがって、目、−１０は単球による双方のＴＮＦα生 産を阻害し、更に、それらの同時刺激がＮＫ細胞ＴＮＦα合成に対して作用する と考えられる。

ＩＬ−４およびｈｌＬ−１０／ｖｌＬ−１０双方は、ＩＬ−２に刺激されたＰＢ 、ＭＣによるＩＦＮｙおよびＴＮＦα合成を抑制するが、ＩＬ−４だけはＩＬ− ２に誘導されたＬＡＫ活性を阻害する。これらの観察は、ＰＢＭＣにおけるＩＬ −２に誘導されたサイトカイン生産および細胞毒性が異なる経路によって調節さ れていることを示す。これらの観察報告は、ＩＬ−２およびＬＡＫ細胞の臨床的 使用において重要である。ＩＬ−２療法に関係した問題としては、心臓血管作用 および毛細管漏出症候群があった。これらの副作用の原因は不明であるが、癌患 者においては、ＩＬ−２によって生じたＴＮＦａなどのサイトカインの放出が関 与していることがある。ＩＬ−１０が、ＩＩ、−２に誘導されたサイトカイン合 成を阻害するがＬＡＫ活性を阻害しないということは、このサイトカインが、こ のような患者を治療するのにＩＬ−２と組合わせて有用でありうるということを 示唆する。更に、ＴＮＦａが、感染したＴ細胞においてヒト免疫欠乏ウィルスの 発現を引起こすことができるということを示唆するデータを考慮すると、ＴＮＦ ａの合成を阻害するｒｌ、、−１０の能力はこれに関連してかなり興味深いもの である。

これらの研究は、更に、ヒトＩＬ−１０が１．活性化後の単球によって比較的多 量に生産されることを実証する。速度論研究により、低濃度のＩＬ−１０は単球 を活性化して７時間後に検出され、そして最大のＩＬ−１０生産は活性化の２４ 〜４８時間後に生じうろことが分かった。これは、活性化後４〜８時間に高濃度 で分泌されたＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦａの生 産と比較して相対的に遅いものであった。更に、ヒトＩＬ−１０は、ＩＦＮｙ、 ＬＰＳまたはＩＦＮｙおよびＬＰＳの組合わせによる活性化後の単球によるサイ トカイン生産に対して強力な阻害作用を有することが分かった。これらの阻害作 用は、ＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０活性双方を阻害するｍＡｂ　１９Ｆ１に よってそれらを完全に中和することができるので、Ｉ　Ｌ−１０に特異的である 。

濃度１００Ｕ／ｍｌで加えられたＩＬ−１０は、ＩＬ−１ａ、ＴＮＦａ、ＧＭ− Ｃ８ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆ合成を、ＩＦＮｙ　（１００Ｕ／ｍｌ）およびＬＰＳ　 （１βｇ／ｍｌ）の組合わせによる単球の最適の活性化後に９０％より大まで減 少させた。ＩＬ−１β、Ｌ　Ｌ　−６およびＩＬ−８生産に対する阻害作用は、 特に、単球がＩＦＮｙおよびＬＰＳの組合わせによって活性化された場合、あま り明白ではなかった。単球によるサイトカイン生産をＩＬ−１０が阻害する機序 、例えば、ＩＬ−１０のこれらの副作用が他の因子によって直接的に媒介される のが間接的に媒介されるのかということは不明である。ＩＬ−１は繊維芽細胞、 胸腺細胞および単球においてＩＬ−６生産を引起こすことができるので、例えば 、＋　Ｌ−６生産の不完全な阻害は、減少したＩＬ−１生産の結果であるという 可能性がある。

ヒト細胞に対して生物活性を有することが分かっているウィルス−ＩＬ−１０を 、あまり広範囲にてはな（検査した。しかしながら、ｖ−ＩＬ−１０は、Ｉ−Ｐ Ｓで活性化された単球によるＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産を、ヒトＩＬ−１ ０が阻害したのと同程度まで阻害した。ＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産に対す るｖ−ＩＬ−１０のこれらの阻害作用はｍＡｂ　１９Ｆ１によって中和され、Ｖ −ＩＩ、−１０作用の特異性を例証した。

ＩＬ−１α、ｒｔ、−ｔβ、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ８Ｆお よびＧ−Ｃ３Ｆ分泌の阻害は転写段階で生した。ＩＬ−１０は、ノーサン分析お よびＰＣＲ分析によって確認されるように、ＬＰＳによって引起こされたサイト カイン特異的ｍＲＮＡ合成を強く阻害した。ＰＣＲ分析は、個々の試料の反応生 成物を半定量的方法で比較可能な条件下において実施した。これは、試料と定量 的に比較しうる結果との間に等量の反応生成物を生したβ−アクチンに特異的な プライマーによるｃＤＮＡの増幅が、ＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現を同一試料におい てノーサン分析およびＰＣＲ分析双方によって確認した場合に得られたという事 実によって確認された。更に、サイトカインｍＲＮＡ発現濃度はこれらの培養物 の上澄み中のタンパク質量と相関した。ＩＬ−１０は、活性化された単球におい てＴＧＦβ　ｍＲＮＡ発現に影響を与えることができなかった。しかしながら、 ＴＧＦβが非活性単球において構成要素として発現され且つＬＰＳによる単球の 活性化がＴＧＦβ　ｍＲＮＡ濃度に影響を与えなかったということは留意される べきである。アソイアン（Ａｓｓｏｉａｎ）ら（１９８７）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：６０２０〜６０２４は、単球 がＴＧＦβ　ｍＲＮＡを構成要素として発現し且つＴＧＦβ分泌か単球活性化を 必要とするということを実証した。しかしながら、ＩＬ−１０かＴＧＦβの潜伏 型から活性型への変換に対する作用を有するかどうかは不明である。

ＩＬ−１０の生産はＩＬ−４によって転写段階で阻害されることが分かった。

ＩＬ−１０生産に対するＩＬ−４の阻害作用は顕著であったが、Ｉ　Ｌ−４はＩ Ｌ−１０の生産を完全に阻止することはできなかった。Ｉ　Ｌ−４は、ＩＬ−１ 、ＩＬ−６およびＴＮＦａの生産を完全に阻害するのに十分であった高ＩＬ−４ 濃度（４００Ｕ／ｍｌ）を用いた場合でさえも、ＩＬ−１０の生産を最大７０％ までしか阻害しなかった。ＩＬ−４が、ヒト単球によるＩＬ−１α、ＩＬ−１β 、ＩＬ−６、Ｉ　Ｌ−８およびＴＮＦａの生産を阻害することができることは既 に実証されている。これらの知見は、ＩＬ−４が、更に、ＬＰＳで活性化された ヒト単球によるＩ　Ｌ−８、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆの生産を阻害するこ とを実証することにより確証され且つ拡大された。この阻害は転写段階で生じた 。更に、データは、Ｉ　Ｌ−４およびＩＬ−１０がヒト単球によるサイトカイン 発現に対して同様の作用を有するということを例証し、免疫系におけるサイトカ インの多面的作用および重複性が強調される。

興味深いことに、ＩＬ−１０は、２４時間活性化された単球においてＩＬ−１０ ＭＲＮＡ合成を強く阻害したので、それは自己調節サイトカインである。更に、 中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下におけるＬＰＲによる単球の活性化は、ＩＬ −１０ｍＲＮＡの発現を２４時間で増大させ、内因的に生じたＩＬ−１０もＩＬ −１，０ｍＲＮＡ合成を阻害することが示された。ＩＬ−１０が、ヒト単球によ るそれ自体の生産をダウンレギュレートすることができるということにより、こ れは負のフィードバック機序によって調節される最初のサイトカインとなる。内 因的に生じたＩＬ−１０の自己調節作用は、更に、ＬＰＳで活性化された単球に よるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ およびＧ−ＣＳ　Ｆの生産に関して、抗ｔｔ、−ｔｏ抗体の存在下でＬＰＳを用 いて観察された。しかしながら、これらのサイトカインの生産に対する内因性Ｉ Ｌ−１０の阻害作用は、培養開始時に加えられた内因性ＩＬ−１０の場合よりも 顕著ではなかった。これは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、Ｉ　Ｌ−８、 ＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆが活性化の４〜８時間後に高濃度で既に生じている が、最大の内因性ＩＬ−１０生産は活性化後２４〜４８時間ではるかに遅く生じ るという事実に関係している。この見解は、内因的に生じたＩＬ−１０の最も強 い阻害作用が、単球の活性化後に遅れて生じることが分かったＧＭ−Ｃ３Ｆ分泌 において見られたという観察報告によって支持される。ＩＬ−１０ｍＲＮＡ合成 はＩＬ−１０タンパク質分泌に反映され且つそれに先行する、およびＩＬ−１０ は細胞表面上のその受容体と単に相互作用することができるだけであると仮定す ると、これらの結果により、内因的に生じたＩＬ−１０の阻害作用は比較的遅く 起こり、したがって、免疫応答の後期において特に重要でありうるということが 示唆される。

最初に、ＩＬ〜１０をマウスにおいて、Ｔｈｌ細胞によるサイトカイン生産（主 としてＩＦＮγ）を阻害したＴｈ２細胞によって生じたサイトカイン合成阻害因 子（ＣＳ　Ｉ　Ｆ）として記載した。Ｔｈｌ細胞によるサイトカイン生産に対す るｍ−ＩＬ−１０のこの阻害作用はマクロファージの存在を必要とし、例えば、 それぞれ本明細書中に参考として包含される、フィオレンチノＥ　ｔ’　ｌ　Ｍ ｅｄ、１５４：１５１７〜１５２４；ランバートよびｖ−４’Ｌ−１０は、単球 をＡＰＣとして用いる場合、抗原特異的Ｔ細胞増殖を強く阻害する。更に、抗原 特異的増殖性Ｔ細胞応答の減少は、主として、これらの細胞でのクラスＩＩＭＨ Ｃ抗原発現に対するＩＬ−１０の強力なダウンレギュレートリー作用によって引 起こされた単球の減少した抗原提示能力に依る。

これらのデータは、１−１０が単球によって遅れて生産され且つこれらの細胞に よるＩＬ−１０分泌に対する自己調節作用を有するという本知見と共に、ＩＬ− １０が抗原特異的Ｔ細胞応答の進行に対して強力なダウンレギュレートリー作用 を有することを示す。したがって、ＩＬ−１０は、抗原に駆動された増殖性Ｔ細 胞応答を抑制するのに主要な役割を果たすことができる。単球によって生産され たＩＬ−１０が、Ｔ細胞活性化に対する強力な自己調節フィードバック活性を有 することもできるという見解は、ＬＰＳ刺激が中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在 下で実施された場合にクラスＩ［ＭＨＣ発現を低下させなかったし、そして強く さえ増大させたので、ＬＰＳによる活性化後の単球によって生産されたＩＬ−１ ０が、これらの細胞でのクラスＩＩＭＨＣ抗原のダウンレギュレーションに対し て応答性であるという観察によって支持される。

前炎症性すイトカインであるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およ びＴＮＦａは、急性および慢性の炎症性過程、並びに慢性関節リウマチを含む多 数の自己免疫疾患に関与する。これらのサイトカインは、免疫システムの細胞の 活性化および機能を調節するが、内皮細胞、ケラチノサイトおよび肝細胞のそれ らも調節する。ＩＬ−１ｏがこれらのサイトカインの分泌に対して強いダウンレ ギュレートリー作用を有するという知見は、ＩＬ−１０が炎症の強力な阻害剤で あることを示唆する。これらの細胞でのクラスＩＩＭＨＣ抗原のダウンレギュレ ーションによって単球のＡＰＣ能力を低下させることによる抗原特異的Ｔ細胞増 殖の阻害および単球による前炎症性すイトカイン分泌に対する阻害作用を含む、 これまでに記載されたその性質に基づいて、ＩＬ−１０は免疫および炎症性応答 のサプレッサーとして主要な役割を果たすと考えられる。この役割は、更に別の インビトロの研究において並びに内毒素およびエンテロトキシン双方の超抗原応 答のインビボ模型において確証される。

本研究は、ＩＬ−１０が、マクロファージ細胞系および腹膜マクロファージによ るＬＰＳに誘導されたサイトカイン生産に対して阻害作用することを実証する。

例えば、ＩＬ−１０はＴ細胞応答の調節において重要な役割を有するのみならず 、感染または損傷の際に引出された炎症性応答に対しても重要な役割を有する。

マクロファージ細胞系に対するＩＬ−１０の作用は、ネズミおよびヒト双方のマ クロファージおよび単球によるサイトカイン生産を阻害することが予め分かつて いる同様の量のＩＬ−４によって引出される作用よりも顕著である。これらの結 果は、Ｌ　Ｐ　Ｓに誘導されたＴＮＦαタンパク質生産のＩＬ−４による有意の 阻害を示すが、これらの細胞系においてＩＬ−６合成の阻害はあまり顕著ではな い。

しかしながら、ＩＬ−４によるＴＮＦａの阻害は、ヒト単球に関して従来報告さ れたほど大きくはない。この相違は、種の相違、単球よりもむしろ分化したマク ロファージ細胞系を用いることにより、またはこれらの研究が、ヒト単球システ ムの一つにおいて用いられた１１００ｎ／ｍｌ用量に対立するものとしてＬＰ３ １０μｇ／ｍ＋を用いたことから説明することができる。Ｉ　Ｌ−４とは対照的 に、ＩＬ−１０は、＋４．−６、ＴＮＦａおよびＩＬ−４タンパク質生産をこの 高濃度のＬＰＳで有意に阻害した。マクロファージ細胞系のＬＰＳおよびＩＦＮ γによる刺激は、はるかに高濃度のＴＮＦａおよびＩＬ−６を誘導し、ある場合 において、これはＩ　Ｌ−４作用に対して不応性であって、ＩＬ−４およびＩＦ Ｎγがマクロファージ活性化のある種の態様に対して反対のおよび相殺作用を有 することができることを示唆した。更に、これは、一層低量のＬＰＳを用いて実 施されたヒト単球での研究とは対照的である。更に、ＬＰＳを加えたＩＦＮγに 誘導されたＩＬ−６およびＴＮＦαタンパク質の生産のＩＬ−１０に媒介された 阻害は、Ｉ　Ｌ−４を用いて見られる阻害よりも有意であった。ＩＬ−６および ＴＮＦａをコードしているＲＮＡの、ＬＰＳまたはＬＰＳを加えたＩＦＮγに誘 導された発現の阻害は、更に、逆転写ＲＮＡに関する半定量的ＰＣＲ増幅増幅用 いて観察された。若干の場合、Ｉｔ−４は１−１０と同程度に発現を阻害し、Ｉ Ｌ−１０が、翻訳されたタンパク質の分泌または安定性に対する作用を有するこ とが示唆された。しかしながら、ＩＬ−１，０はその作用を達成し、マクロファ ージによるサイトカイン生産に対するその最終の阻害作用は、ＩＬ−４によって 見られる作用よりも強力であると考えられる。モノカイン生産に対するＩＬ−１ ０の作用は、この強力な阻害剤がおそらく広範囲の臨床的発現において抗炎症薬 としての可能性を有することができるということを示唆する。

腹膜マクロファージは、刺激性Ｔ細胞からのＩＬ−１０によって阻害されたこと が更に分かったので、ＩＬ−１０がこの精製細胞集団によってサイトカイン分泌 を阻害したかどうかを検査した。ＬＰＳによって刺激されたＢＡＬＢ／ｃまたは ＣＢＡ／Ｊマウスから得られたＦＡＣ８精製腹膜マクロファージは、ＩＬ−１０ の存在下において僅かだけ減少した有意の量のＩＬ−６タンパク質を生産した。

予備的ＰＣＲデータは、精製されたマクロファージがＩＬ−１０を生産したこと を示唆したので、ある種のＬＰＳ刺激には、ＬＬ−１０に対して向けられた抗体 が含まれていた。双方の系統のマウスにおけるＬＰＳ刺激に対してこの抗体を加 えることにより、Ｉ　Ｌ−６タンパク質の生産ははるかに高濃度まで増大した（ ２０時間以内に３０〜３５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　／細胞７ｘ１０５個７’ｍ１）ｏ これは、タイトオートクリン制御下にあるマクロファージによるサイトカイン生 産と一致し、すなわち２集団以上のマクロファージが腹膜マクロファージＭａｃ −１”鮮明中に含まれ、その一つがＩＬ−１０のその生産によって他にまさる制 御を有することと一致する。更に、ヒト単球システムにおいて平行して得られた データは、ＩＬ−１０が、水簸によって精製されたヒト単球によるＩＬ−１０そ れ自体の生産を含むＬＰＳに誘導されたサイトカイン生産を阻害することを示す 。Ｉ　Ｌ−４およびＩＬ−１０などのＴヘルパー細胞由来のサイトカインの作用 をＩＦＮγなどのＴｈｌ　Ｔヘルパー細胞サイトカインと対比した従来の報告に より、これらのサイトカインが互いに相殺作用を有することがあるという確証が 得られる。！ＦＮγは、同一マクロファージによるＩＬ−１０の生産を表面上阻 害することにより、ＬＰＳに応答して生じたＩＬ−６濃度を、抗ＩＬ−１０によ って達成されたのとほぼ同程度の高濃度まで増大させた。これらのデータは、Ｉ Ｌ−６およびＴＮＦａなどのサイトカイン生産が、ＩＬ−１０によって調節され 、引続き、活性Ｔ細胞およびＮＫ細胞によって生産されたＩＦＮγの制御下にあ ることを示唆する。ＩＦＮγのこの作用は、腹膜マクロファージとＩＦＮγとの ２４時間のインキュベーションが、Ｔｈｌ細胞を刺激するそれらの能力を改良し たことを示す従来の観察報告を説明することができる。

ＩＬ−１０が、刺激性細胞からのマクロファージのサイトカイン合成をどのよう に阻害するかといつ機序はまだ解明されていない。マクロファージがＩＬ−１０ の存在下で刺激された場合に観察されるサイトカイン合成における有意の減少を 考慮すると、ＩＬ−１０は、マクロファージおよび抗原に応答した最適サイトカ イン分泌に必要とされる同時刺激活性をダウンレギュレートすることができる。

刺激されたＩＧｌ、８．ＬＡマクロファージ細胞から得られた上澄みを用いて、 Ｔｈ１細胞のマクロファージおよび抗原依存刺激に対するＩＬ−１０の阻害作用 を克服することは不可能であった。これは、ＩＬ−１０が、可溶性同時刺激剤の ダウンレギュレーションによってサイトカイン合成に対するその作用を媒介しな い場合の機序と一致する。疑わしいが、ＩＬ−４０はこの種の因子の生産よりも むしろその作用を妨害すること、またはこのような同時刺激剤が極めて不安定で あり若しくは吸収さね、したがって、これらの上澄み調製試料中に存在しないこ とが考えられる。或いは、１−ｉｎは膜に結合した同時刺激剤の発現を阻害する ことができ、更に、これは、可溶性同時刺激剤で置き換えることができないＡＰ Ｃ／’補助細胞を細胞の刺激に必要とすることを示唆する従来の報告を説明する であろう。サイトカイン合成の目、−１０阻害機序に対する別の説明は、Ｉ　Ｌ −１０が、マクロファージによる１種類または複数の阻害因子の生産を誘導した 後、Ｔ細胞に対して作用してライトカイ：／分泌を阻害するということがありう る。Ｔ細胞の刺激に関する抗原特異的システムにおけるマクロファージおよびＢ 細胞ＡＰＣのＩｒ１合は、それぞれの個々のＡ　Ｐ　Ｃによる刺激に匹敵するＴ 細胞の追加の刺激をもたらす。ＩＬ−１０の存在は、細胞によるサイトカイン合 成を、Ｂ細胞ＡＰＣがそれ自体で達成する程度まで阻害する。これは、マクロフ ァージが、Ｔ細胞に直接的に作用する阻害剤またはＢ細胞ＡＰＣの生産を引起こ さないことを示唆する。疑わしいが、このような阻害剤がマクロファー、ルー′ ｒ細胞相互作用に特異的でありうるかまたはＢ細胞ＡＰＣがこのような活性作用 を何とか克服し若しくは回避することが考えられる。ヒトシステムにおいて得ら れたデータにより、Ｉ　Ｌ−１，０は、単球によって生産された可溶性阻害因子 または同時刺激因子による１′ヘルパー細胞増殖のその阻害を達成しないことが 示唆される。しかしながら、それらの作用は、ヒト単球での■１、−１０による ＭＨＣ−クラスＩｆ抗原のダウンレギュレーションによって説明することができ 、これはマウスンステムにおいてはまだ観察されていない。

エフェクター機能の調節に加えて、ＩＬ−１０は、更に、種々のパターンのサイ トカインを生産するＣＤ４　Ｔヘルパー細胞の種々のサブセットの活性化により 、抗体生産に対する免疫応答または遅延型過敏症（ＤＴＨ）の開始においである 役割を果たｔことがある。Ｂ細胞およびマクロファージ双方がＩ　Ｌ−１０を生 産し且つＡＰＣとしても機能し、同時に、種々のサイトカインモジュレーターに 対して感受性である（ＩＦＮγは多数のＢ細胞機能を阻害し、ＩＬ−１０はマク ロファージを阻害するがＢ細胞ＡＰＣ機能を阻害しない）ということは、この理 論に対する支持を与える。更に、これらの研究は、ＩＬ−１０がマクロファージ によるサイトカイン合成に対しで何意の阻害作用を有し、更には、腹膜マクロフ ァージの顕著な形態学的変化を引起こすことを示唆する。総合すると、これらの 観察報告は、Ｔ細胞応答の調節においてのみならず、感染または損傷によって引 出された急性炎症応答の重要なモジュレータ−と１７でも、ＩＬ−１０の重要な 役割を示唆する。

実験りにおいて、インビボでの超抗原に媒介された毒性を阻害するＩＬ−１０の 能力を検査した。ＩＬ−１０は、部分的にはＴ細胞を活性化するマクロファージ の能力を阻害することによって、■細胞によるサイトカイン生産を阻害すること ができる。超抗原は、ＴＣＲのＶβ鎖およびＡＰＣ上に存在するクラスＩＩＭＨ Ｃ分子間に「橋」を形成することによってＴ細胞を活性化する分子として定義さ れた。これらの結果は、Ｉ　Ｌ−１，０が、マクロファージによって与えられた 超抗原によって活性化されたＴ細胞によるサイトカイン生産を阻害しうろことを 示唆した。この作用はインビトロで観察された。超抗原は、例えば、ウィルスに よってコードされた内因性でありうるしまたは外因性、例えば、微生物エンテロ トキシンてありうる。後者の群の最も研究された超抗原としてはブドウ球菌性エ ンｊロトキシンがある。現在、これらの毒素によって示された毒性は、インビボ てＴ細胞を活性化するそれらの能力に依ることが知られている。これらの観察報 告は、■細胞活性化を阻害する物質が、超抗原によって示された毒性を妨げるこ とを示唆する。これは、シクロスポリンが、ＳＥＢに媒介された毒性を妨げると いう観察報告と一致する。この模型により、ＴＮＦαは毒性の主要な媒介物質で ある。ここで示された結果は、ＩＬ−１０が、おそらくはＴ細胞によるＴＮＦ生 産を阻害するその能力によってＳＥＢの毒性を防止することができることを示す 。

これらの観察報告は、インビボでのＩＬ−４０の作用機序に興味深く関係してい る。１１．−１０はマクロファージ機能、例えば、サイトカイン生産、Ｔ細胞を 活性化する能力を阻害Ｖることが分かっているし、ぞしてＢ細胞においてＩａ抗 原発現を引起こす。しかしながら、ＳＥＢの毒性はＡＰＣによるＩａ抗原の発現 に依存するので、これらのインビボでの実験の成果は不明確であった。ＩＬ〜１ ０がＳＥＢに誘導された毒性を防止するということは、インビボでの主ＡＰＣは マクロファージであってＢ細胞ではないということを示唆する。

これらの結果は、ＩＬ−１０の治療的使用に関して重要な意味を持つ。ブドウ球 菌性エンテロトキシンによって引起こされる食中毒の他に、近年、多数の疾患が 超抗原によって引起こされることか報告されており、例えば、毒素性ショック症 候群、川崎病、ブドウ球菌性毒素によって引起こされた疾患および自己免疫疾患 様慢性関節リウマチである。

ＩＬ−１０は、致命的な内毒素血症からマウスを防護するのに極めて有効であり 、その知見は、Ｉｔ−１，０か細菌性敗血症の治療に有用でありうることを示唆 する。多数の他の試薬、例えば、ＴＮＦαまたは内毒素に対する抗体およびＩＬ −ＩＲａは、細菌性敗血症の治療のための臨床試験において一般的であるが、こ れらの大部分は、最適の防御のためには、動物モデル実験において敗血症誘導前 に与えられることが要求された。これに対する一つの例外であるＩＬ−ＩＲａは 、動物モデル実験において敗血症誘導時に投与された場合に有効であるが、内因 性ＩＬ−１受容体全部を阻止するのに十分に多量に投与する必要がある。更に、 薬理学的用量のＩＬ−１０は、おそらくは受容体飽和量よりも少量で、致命的な 内毒素血症からの防護に寄与すべきであるマクロファージ／単球機能に対する一 連の作用を生じる。

前述の論及は、免疫系の種々の態様の調節および分化におけるＩＬ−１，０投与 の効果に関するが、抗ＩＬ−１０抗体を用いてＩＬ−１０サイトカインの作用を 遮断することによって更に別の見通しが達成される。

ここで示されたデータは、マウスの誕生から成体までの抗ＩＬ−１０抗体による 連続処置が、これらの同一被験動物の牌臓に位置した通常のＢ細胞の数、表現型 または免疫担当を変更することなく全ｔ、ｙ−Ｉ　Ｂ細胞の数および機能を激し く低減させることを示す。いくつかの観察報告は、抗ＩＬ−１０処置マウスにお けるＬｙ−ＩＢＢ細胞提案された枯渇を支持する。すなわち、（ａ）抗ＩＬ−Ｉ Ｏ処置マウスは、正常マウスにおいてはＬｙ−ＩＢＢ細胞富む部位であるそれら の腹膜腔中にＢ細胞をほとんどまたは全く含まない（ＤＮＡＸ実験動物施設の８ 週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜洗浄細胞は、表現型分析により、５％未満の通 常のＢ細胞を含む）；　（ｂ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、ｔ、ｙ−ｔ　Ｂ細胞 を循環性１ｇＭの主要源として識別する従来の再構成実験と一致する、正常血清 ＩｇＭ濃度の０〜１０％を含み；そして（ｃ）抗ＩＬ−１０処置マウスは、特異 的Ｂ細胞がＬ　Ｙ−Ｉ　Ｂ細胞サブセットにあるための抗原であるホスホリルコ リンおよびα１，３−デキストランの注射に応答してほとんどまたは全く抗体を 生じない。抗ＩＬ−１０処置マウスにおいて通常のＢ細胞区分が変更されていな いことを示唆するデータは同様に強制的であり、変化していない牌臓Ｂ細胞数は 正常細胞表面の遺伝標識表現型を示し、そして胸腺依存抗原およびＢ細胞マイト ジェンに対して正常に応答することを示唆する。抗ＩＬ−１０処置マウスにおけ るＬ−ｙ−ｔＢＢ細胞選択的枯渇は、これらの被験動物の腹膜腔において抗Ｉ　 Ｌ−１０処置の数週間後に再現されるＬｙ−ｉ　Ｂ細胞が中断したように、一時 的であることが分かった。

抗ＩＬ−１，０処置マウスにおけるｔ、ｙ−ｉ　Ｂ細胞の選択的枯渇に対する説 明として、いくつかの可能な機序が考えられた。示されたデータは、中和性抗Ｉ Ｌ−１０および抗ＩＦＮγ抗体の同時投与が、これらの実験において腹膜Ｂ細胞 の枯渇を実質的に防止したので、少なくとも部分的には、これが抗ＩＬ−１０処 置後のＩＦＮγ上昇の結果であることを示す。ＩＦＮγが直接的にかまたは間接 的＋ にＬｙ−ＩＢ細胞発生を阻害するという関係は、Ｌｙ−ｔ　Ｂリンパ腫ＢＣＩ、 １のＩＬ−５に誘導されたインビトロ増殖をＩＦＮγが僅かに抑制させるという 従来の観察報告を暗示させる。これらの実験を続けて、正常ＢＡＬＢ／ｃマウス からの牌臓細胞以外の、腹膜細胞のＬＰＳに誘導された増殖のＩＦＮγに媒介さ れた抑制が観察された。抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＩＦＮγの上昇がＬｙ −Ｉ　Ｂ細胞枯渇を完全に説明するかどうか、およびこれがＬｙ−ＩＢＢ細胞Ｉ ＦＮγの直接作用または若干のＩＦＮγに媒介された間接作用に反映されるかど うかは十分に理解されていない。おそらく、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける他 の変化が、ｔ、ｙ−ｉ　Ｂ細胞の枯渇に対して更に寄与している。おそらく、抗 ＩＬ−１０処置が内因性モノカイン濃度の上昇をもたらしている。抗ＩＬ−１０ 処置マウスは、ＬＰＳに誘導されたショックによる致死に対して５０倍を越えて 感受性であり、その結果はモノカインによって媒介されることが知られており、 そして個々の抗ＩＬ−１０処置マウス３２匹の内の５匹は実質的な濃度の血清Ｉ Ｌ−６を含み、モノカインは正常な動物の循環において見出されないのが一般的 であり、これらの実験による１０匹の対照マウスのいずれの血清中でも検出され なかった。しかしながら、ＬＰＳのインビボ投与によって血清モノヵイン濃度が 大きく上昇したＩＬ−６形質転換マウスまたは動物は正常血清１ｇＭ濃度を有す ると考えらね、Ｌｙ−１，８細胞数が変化していないことが示唆される。通常の Ｂ細胞以外のＬｙ−ＩＢＢ細胞構成的および誘導性ＩＬ−４０を生じるという初 期の知見は、ＩＬ−１０がオートクリン成長因子として作用するという示唆をも たらす。現在のところ、これは、抗ＩＬ−１０および抗ＩＦＮγ抗体で処置した マウスから回収された腹膜Ｌｙ−Ｉ　Ｂ細胞の実質的な数を考慮すると、疑わし いと考えられる。

連続の抗ＩＬ−１０処置によってつくられたＬｙ−ＩＢ細胞枯渇マウスは、Ｌｙ −１，８細胞を欠失し且っ胸腺非依存抗原のサブセットに対して非応答性である ＣＢＡ／ＣａＨマウス由来の自然突然変異系統である免疫欠乏ｘｆｄマウスに対 してかなりの類似点を有する。これらの類似点にもかかわらず、本発明者の予備 研究は、ｘｊｄマウスがＩＬ、−１０を正常に生産し、そして機能的ＩＬ−１０ 受容体を有し、したがって、ｘｉｄマウスおよび抗ＩＬ−１０処置マウスが機械 的に区別されることを示した。更に、抗ＩＬ−１０処置マウスをｘｉｄマウスと 区別した一つの性質は、前者によって示されるが後者の動物では示されない抗Ｉ ｇＭ刺激に対する牌臓細胞のインビトロの応答性である。

ＩＬ−１０の生理学的役割は、マウスに誕生から成体まで、ＩＬ−１０を特異的 に中和する単クローン性抗体を注射することによって研究された。このような処 置は、これらの被験動物の免疫状態に多数の独特な変化をもたらす。被験動物は 、循環性ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、そして多くの場合、ＩＬ−６の増加を特徴とす る。これらの作用は、従来報告されたＩＬ−１０のインビトロの性質である、細 胞培養実験におけるＩＦＮγおよびモノカイン生産の強力な抑制と一致する。

内因性ＩＦＮγの増加は、抗ＩＬ−１０処置によって得られた他の結果のいくつ かの原因であると考えられる。例えば、それは、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞枯渇をもたら し、続いて、これは、循環性ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体の減少、並びにホスホリル コリンおよびα１，３デキストランに対する特異的抗体応答の要因となる。上昇 したＩＦＮ−γ濃度は、ＩＦＮ−γによってこのイソタイプが明確に調節される 循環性ＩｇＧ２ａの増加の原因でもあると考えられる。腹膜Ｔ細胞、顆粒球およ び循環性ＩｇＧ２ｂの増加の残りの変化は機械的に理解されないが、これらは、 二次サイトカイン摂動の結果でありうる。概して健康であるが、抗ＩＬ−１０処 置マウスは、内毒素に誘導されたショックの結果としての致死に対して極めて感 受性であることが分かった。この致命的な炎症反応は、ＴＮＦα、ＩＬ−１、Ｉ Ｌ−６かまたは内毒素に特異的な抗体の受身伝達によって防止することができる モノカインに媒介された結果である。したがって、内因性モノヵインのアップレ ギュレーンヨンを示し、そして杭内毒素抗体を生じると考えられるＢ細胞集団（ すなわち、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞を欠いている抗ＩＬ−１０処置マウスが、この炎症 性反応に対して一層感受性であるということは驚くべきことではない。これらの データは、抗炎症薬としてのＩＬ−１０の臨床的役割を示唆する。この概念と一 致して、実験は、薬理学的用量のＩＬ−１０が、内毒素に誘導されたショックに よる致死からマウスを防護することを示す。

抗ＩＬ−１０処置マウスの概説された表現型は、ＩＬ−１０の既知のインビトロ の性質と明らかに一致するが、それにもかかわらず、それは、遺伝子を標的とす ることによってＩＬ−１０欠乏にされたマウスについての予備報告のそれとは対 照的である。これらの突然変異体は、検出不能な濃度の循環性ＩＦＮ−γ、ＴＮ Ｆ−αおよびＩＬ−６、腹膜腔中の正常な数のｔ、ｙｉ　Ｂ細胞、並びに−次近 似において正常の血清１ｇ濃度を有する。この相違の解釈は明らかではないが、 同様の相違する状態は、Ｉ　Ｌ−２ノツクアウトマウスと、誕生から成体まで抗 ＩＬ−２受容体抗体で処置されたマウスの少なくとも若干の報告との間に存在す る。

一つの解釈は、サイトカイン系中に存在する十分に認識された重複性に関係する 。

発育するマウス胚は、密接に関係した機能を有するサイトカインをコードしてい る遺伝子の発現を増幅することによって臨界的サイトカイン遺伝子の損失を補う ことが可能である。例えば、ＩＬ−４はＩＬ−１０と多数の性質を分担している ので、このサイトカインは、ＩＬ−１０の全損失を補うのに優れた候補であり、 したがって、その発現はｉ　Ｌ−ｉ　ｏノックアウトマウスにおいてアップレギ ュレートされるようになりつる。これに対して、マウスの誕生からの抗体治療に よる内因性ＩＬ−１０の中和は、サイトカインの「漏出」脱離を最もよく表わし 、そして残留する痕跡の内因性ＩＬ−１０は、深刻な免疫不全および補償サイト カイン経路の調節活性化を避けるのに十分でありうる。抗体で処置された動物は 、投与された異種抗体および／または結果として得られた免疫複合体に対する人 為的免疫応答を増大させるという別の解釈を全く排除することはできない。それ にもかかわらず、この解釈は、イソタイプ対照抗体および、インビボで免疫複合 体を更に生じると考えられる他のサイトカインに対する抗体が、抗ＩＬ−１０処 置マウスに起因する免疫調節を生じないので疑わしいと考えられる。

抗ＩＬ−１０処置マウスにおいて観察された免疫調節のパターンは、既知のヒト 免疫不全症のいずれとも全く相関しないので、ヴイスコット・オールドリッチ患 者およびＩｇＡ欠乏症候群患者双方にある種の類似点か存在する。これらのヒト 免疫欠乏は、それぞれ循環性１ｇＭまたはＩｇＡの欠失、杭軸菌性抗体応答を生 しる低下した能力、および循環性１ｇＧ１の頻繁な増加、おそらくはネズミＩｇ Ｇ２ａと相関する主な補体結合性ヒト抗体イソタイプを特徴とする。このような 患者が減少した１１−１０生産または応答性を示すかどうか、そうである場合に 、続いてこれがそれらの免疫欠乏の一因となるかどうかは確証を待っている。

ＩｇＡ欠乏症候群におけるＩＬ−１０の可能な役割は、無経験（ｎａｉｖｅ）ヒ トＢ細胞を、架橋した抗ＣＤ４０抗体およびＴＧＦβによる活性化後にＩｇＡ分 泌細胞に分化させるのに必要とされる重要な補助因子としてＩＬ−１０が明らか に関係している最近の研究を考慮すると、特に興味をそそる。抗ＩＬ−１０処置 マウスが、２種類の細菌性抗原に対する特異的抗体応答を生じることができない ことは、ＩＬ−１０が、上記に記載したように、杭軸菌性免疫において有効なア ンユバントであるという主張を更に支持する。

ＩＬ−１０の生理学的役割および臨床的可能性についての情報の提供に加えて、 抗ＩＬ−１，０処置マウスは、免疫系に対するｔ、ｙ−ｔ　Ｂ細胞の寄与を評価 する新たな機会を提供する。前記のように、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬ Ｙ−Ｉ　Ｂ細胞枯渇によって生じた二次的結果は、この少数のＢ細胞並集団に予 め起因する多数の性質を確証する。しかしながら、これらのデータにより、更に 、免疫系に対するｔ、ｙ−ｔ　Ｂ細胞の寄与を考える新しい見通しが得られる。

特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはｒｇＥの応答の発生 に関して、これらのイソタイプの血清濃度はＬｙ−ＩＢＢ細胞枯渇した抗ＩＬ− １０処置マウスにおいて減少しないので、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞必要とされないと結 論することは適当である。同様に、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞若干の胸腺非依存性ＩＩ型 抗原、例えば、ホスホリルコリンおよびα１，３デキストランに対する応答性に 本質的であるので、明らかに、それらは他の、例えば、ＴＮＰ−フィコールおよ び抗１ｇＭに必要とされない。実際に、多糖抗原に対するＢ細胞応答性に独自に 関係したイソタイプである循環性１　ｇＧ３の不変のまたは僅かに上昇した濃度 は、Ｌｙ−１，８細胞欠乏マウスが、大部分の胸腺非依存性ＩＩ型抗原に対して おそらく応答することができるということを示唆する。抗ＩＬ−１０処置マウス のこの態様は、Ｌｙ−Ｌ　Ｂ細胞を欠失しているが、胸腺非依存性ＩＩ型抗原全 部に対して応答しない自然発生免疫欠乏マウス系統であるｘｉｄマウスとそれら とを容易に区別する。

免疫系に対するＬ’ｙ−ＩＢＢ細胞寄与についての情報の提供に加えて、抗ＩＬ −１０処置マウスは、本発明者がインビボでのＴＮＦα上昇の結果を評価するこ とを可能にする。本発明者のデータは、ＩＬ−１０のインビボでの拮抗作用が血 清ＴＮＦα濃度の実質的な上昇をもたらすことを明らかに例証する。ＴＮＦα上 昇の好ましくない結果は上記（例えば、敗血症性ショック、大脳マラリア等）で 詳細に考察されたが、ＴＮＦα上昇の多数の好ましい結果も考慮すべきである。

これらには、直接的抗腫瘍作用、顆粒球−単球造血系の拡大、若干の自己免疫疾 患および感染症に対する放射線防御および防御の動物モデルにおける実証がある 。

したがって、これらの考察は、ＩＬ−１０アンタゴニストをこれらの種類の疾患 の処置において治療的に介入するための候補として暗示する。実際に、本発明者 は、抗ＩＬ−１０抗体が、狼瘉傾向のあるＮＺＢ／Ｗマウスにおいて自己免疫の 発生を実質的に遅らせることができるということを実証する程度までこの提案を 確証した。

要約すると、本発明は、多数の疾患状態の主要な媒介物質であるモノカインの生 産を調節するためのＩＬ−１０またはＩＬ−１０アンタゴニストの使用に関する 。ＩＬ−１０およびそのアゴニストは、ＴＮＦαなどのモノカインの顕著な抑制 を引起こし、この方法において、望ましくない炎症性反応、例えば、細菌性敗血 症、毒素性ショック、慢性関節リウマチおよびプソナシス（ｐｓｏｎａｓｉｓ） に対する防御を提供する。同様に、ＩＩ、−１０アンタゴニストは、ＴＮＦαな どのモノカインの濃度を増大させ、引続き、抗腫瘍薬として、並びにある種の自 己免疫疾患および感染症に対する放射線防御および防御の提供において作用する こ以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。ベクターおよび宿主の選択並 びに試薬の濃度、温度および他の’ｉｉＪ変パラメーターの値は、本発明の適用 を例示するためのものであり、それを制限するものと考えるべきてはない。

実例１ 細菌宿主におけるヒ）、　ｌ　１．−１０の発現合成ヒｌ−１ｉ、　−１，０遺 伝子を多数の化学的に合成された二本鎖ＤＮＡフラグメントから組立てて、ＴＡ Ｃ−ＲＢＳ−ｈｌｌ、−１０と称する発現ベクターを生成した。クローニングお よび発現は、標準的な細菌の系、例えば、ビエラ（Ｖｉｅｒａ）およびメリック （Ｍｅ　ｓ　ｓ　ｉ　ｎｇ）によってＧｅｎｅ−，１９巻。

２５９〜２６８頁（１９８２）に記載された大腸菌に、１２株Ｊ　Ｍ　ｌ　０１ 、ＪＭ１０３または類似のものにおいて実施した。制限エン１−゛ヌクレアーゼ 消化およびリパーゼ反応は、典型的に、欅を的なプロトコル、例えは、本明細書 中に参考とラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）、ンク・ハーバ−・ラホラトリー、二ｊ−ヨーク）、およびオースベル ら（１９８々を用いて実施した。

アルカリ法を小規模なプラスミド調製試料に用いた。大規模な調製試料に対して は、等量のイソプロパツールを用いて核酸を透明な溶菌液から沈殿させるアルカ リ法の変法を用いた。冷２．５Ｍ酢酸アンモニウムによる沈殿を用いてＲ，ＮＡ を除去した後に、塩化セシウム平衡密度遠心分離および臭化エチジウムによる検 出を行なった。

フィルターハイブリダイゼーションに関して、ワットフン５４０円形フィルター を用いてコロニーを取り上げた後、それを、０．５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５ＭＮａ ＣＩ　；　ＩＭトリスＨＣＩ　ｐＨ８，０，１，５Ｍ　ＮａＣ１（それぞれ２分 間）による連続処理によって溶解させ且つ固定し、そして８０℃で（３０分間） 加熱した。ハイブリダイモーションは、６ｘＳＳ、ＰＥ、２０％ホルムアミド、 １１％ドデシル硫酸すｉ−リウム（ＳＤＳ）、大腸菌ｔＲＮＡ１００μｇ／ｍｌ およびクマシーブリリアントブルーＧ−２５０（バイオ−ラド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒ ａ　ｄ）　）１００μｇ／ｍｌ中において３２　Ｐ標識（キナーゼ処理）合成り ＮＡを用いて４２℃で６時間であった。（２０ｘＳＳＰＥは、ＮａＣｌを１７４ ｇ。

ＮａＨ２ＰＯ４９Ｈ２０を２７．６ｇおよびＥＤＴＡ７．４ｇをＨ２０８００ｍ ｌ中に溶解することによって製造された。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整した。

容量を１リツトルに調整し５、そしてオー　トクレープによって滅菌した）。フ ィルターを１−　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した（室温、 １５分間）。オートラジオグラフィー（フジ（Ｆｕ　ｊ　１）ＲＸフィルム）後 、陽性コロニーは、フィルター上において再増殖コロニーを青色に染色されたコ ロニーと一緒に整列させることによって位置が示された。ＤＮＡは、ジデオキシ 法、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 、７４巻、５４６３頁（１９７７）によって配列決定された。ジデオキシ反応用 の鋳型は、Ｍ１３ｍｐヘクターで再クローン化された適当な領域の一本鎖ＤＮＡ 、例えば、メリックら、勤王ユｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９巻、３０９頁 （１９８１）かまたはミニアルカリ法によって製造し且つ０．２Ｍ　ＮａＯＨで 変性しく室温、５分間）、そして２容量のエタノールを加えることによって０． ２Ｍ　ＮａＯＨ。

１．４３Ｍ酢酸アンモニウムから沈殿させた二本鎖ＤＮＡであった。ＤＮＡは、 ホスホルアミダイト化学によりアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ合成機を用いて合成された。合成、脱保護、開 裂および精製（７Ｍ尿素ＰＡＧＥ１溶離、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフ ィー）は、３８０Ａ合成機マニュアルに記載されたように実施した。

クローン化される合成りＮＡの相補鎖（それぞれ４００μｇ）を混合し、そして 反応容ｆｆ１５０ｍ１中においてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。こ のＤＮＡをベクターＤＮＡ１ｍｇと連結し、適当な制限酵素で消化し、そして連 結反応は容ｆｆ１５０ｕｌ中において室温で４〜１２時間行なった。リン酸化、 制限酵素消化、ポリメラーゼ反応および連結反応の条件は記載されている（マニ アティスら、上記に引用）。コロニーは、アンピシリン、イソプロリル−１−千 オーβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０，４ｍＭ）および５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシト（Ｘ−ｇａ　１）（４０ μｇ／ｍＩ）を補足したし寒天上に平板培養することによって（望ましい場合） ＩａｃＺ＋の評点をした。

ＴＡＣ−ＲＢＳベクターは、ｔ　ａ　ｃ　Ｐ含有プラスミドｐＤＲ５４０（ファ ーマンア（Ｐｈａ　ｒｍｃ　ｉ　ａ））の単−Ｂａｍ８１部位を、ＤＮＡポリメ ラーゼを用いる充填によって構築された。次に、これを、共通リポソーム結合性 部位（ＲＢＳＳＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣ）をコードしている二本鎖フラ グメントを形成する非リン酸化合成オリゴヌクレオチド（ファーマシア）に対し て連結した。

連結反応後、混合物をリン酸化し、そして５ｓｔｌリンカ−ＡＴＧＡＧＣＴＣＡ Ｔと再連結した。次に、この複合体を５ｓｔｌおよびＥｃｏＲＩて開裂させ、そ して１７３ｂｐのフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ） によって単離腰そし７てＥｃｏＲＩ−３ｓｔｌ制限ｐＬＩｃｉ９（ファーマシア ）（下記に記載の）でクローン化した。最終構築物（ＴＡＣ−ＲＢＳと称する） のＲＢＳ−ＡＴＧ−ポリリンカー領域の配列は、本明細書中に参考として包含さ れる米国特許第５，０１７，６９１号明細書に開示されている。

合成Ｉ　Ｌ−１０遺伝子を８工程においてｐＵｃ１９プラスミドで組立てた。各 工程て、欠失および／またはインサートを含まないインサートは、工程１で挿入 されたＡＴＧ開始コドンを含む枠においてｐＵｃｌ９の１ａｃＺ（ａ）遺伝子を 維持することによってクローニング後に検出することができた。欠失および／ま たは挿入変化を含むクロー〉は、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含むＬ−アンピシ リンプレート上の青色コロニーの評点によって濾去することかできた。或いは、 各工程で、小規模のプラスミドＤＮＡ調製試料に普遍的配列決定プライマーを用 いてインサートの配列を容易に確証することができる。

工程１において、ＴＡＣ−ＲＢＳベクターを５ｓｔｌで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポ リメラーゼ（その３′エキソヌクレアーゼ活性は５ｓｔｌカツトの３′突出鎖を 消化してプラント末端フラグメントを生成する）で処理し、そしてＴ４　ＤＮＡ ポリメラーゼの失活後にＥｃｏＲＩて処理して１７３塩基対（ｂ　ｐ）フラグメ ントを生成する。このフラグメントはＴＡＣ−ＲＢＳ領域を含み且つＡＴＧ開始 コドンのところにプラント末端および反対側の末端にＥｃｏＲＩカットを有する 。

最後に、１７３ｂｐのＴＡＣ−ＲＢＳフラグメントを単離した。

工程２において、工程１の単離されたＴＡＣ−ＲＢＳフラグメントを、ＥＣＯＲ ［／Ｋｐｎｌて消化したプラスミドｐＵｃｉ９と、下記に示したように、上流末 端にプラント末端および下流末端にＫｐｎｌカットに対応するスタッガー末端を 有する合成フラグメントＩＪ／Ｂと一緒に混合した。このＫｐｎｌ末端はＢｓｔ ＥＩ　１部位に対しておよびその下流に隣接している。フラグメントを連結して 工程２のｐＵｃｌ９を生成する。

工程３において、合成フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂ（下記に示した）を 、ＢｓｔＥＩＩ／Ｓｍａｌて消化した工程２のｐＵｃｌ９と混合しく増幅および 精製後）且つ連結して工程３のｐＵｃｌ９を生成した。フラグメント３　Ａ／Ｂ の下流末端が、Ｓｍａ　Ｉプラント末端を生成する余分の塩基を含むことに留意 されたい。これらの余分の塩基は工程４において開裂した。更に、フラグメント ２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂは、混合によってアニールする相補的９残基一本鎖末端 を有し、２Ａ／Ｂの上流ＢｓｔＥＩＩカットと、ｐＵｃｌ９に対して連結する３ Ａ／Ｂの下流プラント末端を残している。

工程４において、Ａｆ　ｌ　Ｉ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉて消化した工程３のｐＵｃｌ９ 　（増幅および精製後）を再精製し、合成フラグメント４Ａ／Ｂ（下記に示した ）と混合し、そして連結して工程４のｐＵｃｌ、９を生成する。

工程５において、Ｘｂａ　Ｉ／’Ｓａ　ｌ　Ｉて消化した工程４のｐＵｃｌ９　 （増幅および精製後）を合成フラグメント５Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且 つ連結して工程５のｐＵｃｌ９を生成する。フラグメント５Ａ／Ｂの５ａｉｌス タツガー末端が工程６においてＨｐａｌによる消化によって除去されることに留 意された工程６において、Ｈｐａ　Ｉ／Ｐｓ　Ｌ　Ｉで消化した工程５のｐＵｃ １９　（増幅および精製後）を合成フラグメント６八／Ｂ（下記に示した）と混 合し且つ連結して工程６のｐＵｃ１９を生成する。

工程７において、Ｃ１ａｌ／５ｐｈｌで消化した工程６のｐＵｃ１９　（増幅お よび精製後）を合成フラグメント７Ａ／Ｂ（下記に示した）と混合し且つ連結し て工程７のｐＵｃ１９を生成する。

工程８において、Ｍｌｕｌ／Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで消化した工程７のｐＵｃ１９ （増幅および精製後）を合成フラグメント８Ａ／Ｂおよび９Ａ／Ｂと混合し且つ 連結して最終構築物を生成する。最終構築物を標準的な技法によって、例えば、 八ＴＣＣから受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌に一１２株ＪＭＩＯＩ に挿入した。培養後、タンパク質をＪＭＩＯＩ細胞から抽出し、そしてその抽出 物の希釈液の生物活性を検査した。フラグメントと称する配列を表１に示す。

衣よ 小文字は、塩基が天然の配列の同一部位のそれとは異なることを示す。

表１（続き） フラグメント７Δ／Ｂ 実施例２ ＣＯ３７サル細胞におけるｖｌＬ−１０の発現ｖｌＬ−１０の読取り枠をコード している遺伝子を、タヶベ（Ｔａｋｅｂｅ）ら（１９８Ｂ）Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、８：４６６〜４７２に記載された、増幅フラグメントをＥ　ｃ　ｏ　 ＲＩ　？ｌ′１化ｐｃＤ（，５Ｒａ）ベクター中に後で押入することが可能なプ ライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。挿入されたフラグ メントのコーディング鎖を以下に示す（読取り枠を大文字で与える）。

適当な配向のインサートを有するクローンを、ｖＩＬ−１０の発現および／また は制限消化の電気泳動パターンによって識別した。ｖｌＬ−１０遺伝子を有する 一つのこのようなベクターはｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲａ）と称され且つＡＴＣＣに 受託番号６８１９３として寄託された。ｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲａ）を大腸菌Ｍ（ ，１０６１において増幅させ、標準的な技法によって単離し、そしてＣ０Ｓ７サ ル細胞を以下のようにトランスフェクトするのに用いた。すなわち、トランスフ ェクションの前日に、ＣＯ３７サル細胞約１．５ｘｌＯ６個を、１００ｍｍプレ ートそれぞれの５％ウシ胎児血／Ｗ（Ｆｅ２）および２ｍＭグルタミンを含むダ ルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）中に播種した。トランスフェクションを実 施するために、ＣＯ３７細胞をトリプシンとのインキュベージコンによる皿がら 取出し、血清不含ＤＭＥ中で２回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ中において細胞 １０７個／ｍｌに懸濁させた。アリコート０．７５ｍ１をＤＮＡ２０μｇと混合 し、そして滅菌０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベツトに移した。１０分 後、細胞にバイオラド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓ ｅｒ）装置において２００ボルト、９６０ｍＦでパルスした。更に１．０分後、 細胞をキュベツトから取出し、そして５％ＦＣ３，２ｍＭグルタミン、ペニシリ ン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含むＤＭＥ２０ｍｌを加えた。

混合物を１００ｍｍ組織培養皿４個に分別した。３７℃、５％ＣＯ２で１２〜２ ４時間後、培地を同様の１％ＦＣ３のみを含む培地と取り換え、そしてインキュ ベージコンを３７℃、５％Ｃ０２で更に７２時間続けた後、培地を集め、そして ＩＦＮγ合成を阻害するその能力を検定した。

新たに単離した末梢血液白血球（ＰＢＬ）のアリコート１０ｍ１　（細胞約２ｘ １０６個／ｍｌ）を、（ｉ）５％ＦＣ３および２ｍＭグルタミンを補足した９０ ％ＤＭＥと、（ｉ　１）ｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲａ）で予めトランスフェクトされ たＣ０８７細胞からの１０％上澄みとから成る培地中においてフィトヘマグルチ ニン（ＰＨＡ）　（１００ｎｇ／ｍｌ）と−緒に３７℃でインキュベートした。

２４時間後、細胞および上澄みを採集して、ＩＦＮγ　ｍＲＮＡかまたはＩＦＮ γタンパク質の存在をそれぞれ検定した。対照は、１０％上澄みが、無関係のｃ ＤＮＡインサートを有するプラスミドで予めトランスフェクトされたＣ０８７培 養物からであることを除き、同様に処理された。ｖｌＬ”ｌＯ処置試料は、対照 に相対して約５０％のＩＮγ合成阻害を示した。

実施例３ 大腸菌におけるｖｌＬ−１０の発現 下記のｖＩＬ−１０をコードしている遺伝子は大腸菌において発現することがで きる。

ｐ［３ｃＲＦ１　（ＳＲｆＩ）のｃＤＮ八イフィンサート１３プラスミドで再ク ローン化し、そこにおいて、それは特定部位の突然変異誘発によって２回変更さ れた。

すなわち、最初に、成熟ｖｌＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の５′末 端にＣｌａｌ部位を形成し、そして第二に、成熟ｖｌＬ−１０ポリペプチドのコ ーディング領域の３′末喘にＢａｍ８１部位を形成した。次に、突然変異配列を 、以下に記載したＴＲＩ’Ｃ１１発現ベクター中に容易に挿入した。

ＴＲＩ’Ｃ１１ベクターを、合成した」（通ＲＩ３ＳフラグメントをＣ１ａｌリ ンカ−（ΔＴＧＣＡＴ）に対して連結することによっておよびその結果得られた フラグメントをＣ１ａｌ制限ｐＭＴ１１ｈｃ　（Ｃｌａｌ部位を含むように予め 修飾された）でクローニングすることによって構築した。ｐＭＴｌｌｈｃは、ｐ ＶＸプラスミドＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌポリリンカー領域を有するｐＢＲ３ ２２のＴＥＴ　誘導体である小型の（２，３キロベース）高コピーへＭＰＲであ る。ｐＶＸは、マニアティスら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ 　：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング−ハーバ− ６プレス、コールド・スプリング・ハーバ−に記載されている。これを、Ｅｃｏ ＲＩおよびＢａｍＨＩでｐＭＴｌｌｈｃを制限することによってＣｌａｌ部位を 含むように修飾し、得られた５′付着端をフィルインし、モしてＣ１ａｌリンカ −（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）と連結し、それによってＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ１部 位を復元し且つＳｍａ　１部位をＣｌａｌ部位で置き換えた。ＴＲＰＣＩＩ構築 による一つの形質転換体は、Ｃｌａｌ部位に隣接してタンデムにＲＢＳ配列を有 した。

Ｃｌａｌ部位の一つおよびＲＢＳ配列の第二コピーの一部分を、このプラスミド をＰｓｔｌで消化し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理し、ＥｃｏＲＩで制限し、 そして４種類全部のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下において７４　ＤＮ Ａポリメラーゼで処理することによって除去した。得られた３０〜４０ｂｐの７ ラグメントをＰＡＧＥによって回収し且つＳｍａｌ制限ｐＵｃ１２中にクローン 化した。次に、ｐＫｃ１０１由来の２４８ｂｌ）の大腸菌ｔｒｐｐ含有ＥｃｏＲ Ｉフラグメントにコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１：１５５〜１６４．アカデミツク・プレス（Ａ ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、：、−ヨークに記載された）をＥｃｏＲ１部位 でクローン化してＴＲＰＣＩＩ構築を完成した。これを図１に図示する。ＴＲＰ ＣＩＩは、最初にそれをＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩで消化し、それを精製した後 、それを標準的な連結反応溶液中において、成熟ＢＣＲＦＩをコードするヌクレ オチド配列を有するＭ１３のＣ１ａｌ−ＢａｍＨＩフラグメントと混合すること によってｖｌＬ−１０のためのベクターとして用いられた。ＴＲＰＣＩＩ−ＢＣ ＲＦＩと称するインサート含有ＴＲＰＣＩＩを、例えば、ＡＴＣＣから受託番号 ３３８７６として入手可能な大腸菌に１２株ＪＭＩＯＩにおいて増殖させた。

実験Ａ この項で示したデータは、本明細書中にその全部が参考として包含されているン ユーら（１９９２）Ｉｎｔ’　Ｉ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　４：５６３〜５６９、に おいてその優先０後に公開された。

概要 ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）とインターロイキン−２（ＩＬ−２）との培 養は、サイトカインの合成およびリンホカインに活性化されたキラー（ＬＡＫ） 活性の発生を刺激する。インターロイキン−４およびインターロイキン−１Ｏ（ Ｉ　Ｌ−１０：サイトカイン合成阻害因子、Ｃ３ｌＦ）双方は、ＩＬ−２に誘導 されたヒトＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成を阻害する。しかしな がら、Ｉ　Ｌ−４とは異なり、Ｉ　Ｉ−−−１０は、ＰＢＭＣおよび活発なナチ ュラルキラー（Ｎ　Ｋ）細胞のＩＬ−２に誘導された増殖も、ＩＬ−２に誘導さ れたＬ　Ａ　Ｋ活性も阻害しない。更に、Ｉ　Ｌ−４は、精製された活発なＮＫ 細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成を阻害するが、対照的に、ＩＬ− １０の阻害作用はＣＤ１４＋細胞（単球／マクロファージ）によって媒介される 。ＩＬ−１０は単球またはＮＫ細胞を加えた単球によるＴＮＦα合成を阻害する が、ＮＫ細胞単独による場合は阻害しない。これらの結果は、ＩＬ−４およびＩ Ｌ−１０が異なる経路によってＮＫ細胞に作用することおよびＩ　Ｌ−２に誘導 されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性は異なる機序によって調節されること を示す。

インターロイキン−】０（サイトカイン合成阻害因子、Ｃ３ｌＦ）は、マウスお よびヒトＴリンパ球および単球／マクロファージによるＩＦＮγなどのサイトカ インの合成を阻害する。Ｔ細胞サイトカイン合成に対する阻害作用は間接的であ り、単球／マクロファージによってそれらの抗原提示細胞としての能力において 媒介される。マウスおよびヒト双方のＩＬ−１０（ｍｌＬ−１０；ｈｌＬ−４０ ）は、マウスおよびヒト細胞に対してＩＬ−１，０活性を示すエプスタイン・バ ールウィルス読取り枠ＢＣＲＦＩ　（ウィルスＩＬ−１０；ｖｌＬ−１１０）に 対して相同である。ｖｌＬ−１０が、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２に誘導された ＩＦＮγ合成を阻害することは初期に観察された。ＮＫ細胞はＩ　Ｌ−２に刺激 されたＰＢＭＣ中の主要なＩＦＮＩ源であることが報告されているので、Ｉ　Ｌ −２に誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性に対するｈｌＬ−１０およ びｖｌＬ−１０の作用は、これらのサイトカインとＬＡＫ活性の既知の阻害剤で あるＩＬ−４とを比較することと一緒に研究された。データは、Ｉ　Ｌ−４、ｈ ｌＬ−１０およびｖｌＬ−１０が、ＩＬ−２に刺激されたＰＢＭＣによるＩ　Ｆ Ｎ７およびＴＮＦαの合成を阻害するが、Ｉ　Ｌ−４だけが精製ＮＫ細胞による ＩＦＮγ合成を阻害するということを示す。更に、Ｉ　Ｌ−４とは異なり、ＩＬ −１０はＩ　Ｌ−２に誘導されたＬＡＫ活性を阻害しない。これらの結果は、Ｉ Ｌ−４およびＩＬ−１０が異なる機序によってＮＫ細胞に作用し且つＩＬ−２に 誘導されたサイトカイン合成およびＬＡＫ活性が異なる経路によって調節される という模型を支持する。

実施例Ａ１ ヒト組換体Ｉ　Ｌ−２（ｒ　Ｉ　Ｌ−２）は、Ｓ、ズラウスキー（Ｚｕ　ｒ　ａ ｗｓ　ｋ　ｉ）による標準的な方法（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｘ）を用いて好ましく製造す るかまたは購入した（シータス（Ｃｅｔｕｓ）、ｚメリービル、ＣＡ）。ヒトｒ ｌＬ−４はシエリング・プラウ・リサーチ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）からであった。ヒトｒｌＬ−１βはバイオソース・インター ナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）　（カマリロ 、ＣＡ）から購入した。組換体ｂｌＬ−１０およびｖｌＬ−１０をＣ０８７）ラ ンスフエクション上澄みとして用い、不適当なｃＤＮＡを含むかまたはｃＤＮＡ 不含のトランスフェクションからの上澄みを対照として用いた。本明細書中に参 考として包含され且つ上記のビエラら（１９９１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｆα（エンドジエン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）、ボストン、ＭＡ）をエリザによって測 定した。ｌ　Ｌ−２不存在下のサイトカイン生産は、ＩＦＮγおよびＴＮＦαエ リサ検定の感度限界未満であり、それぞれ０．３ｎｇ／ｍｌおよび１２ｐｇ／ｍ ｌダウディ　（バーキットリンパ腫）細胞はシエリング・プラウ（リヨン、フラ ンス）によって提供された。ルイス・ラニア博士（Ｄｒ、ＬｅｗｉｓＬａｎｉｅ ｒ）によって提供されたＣ０ＬＯ（結腸癌）細胞を、５％ウシ胎児血清を加えた ＲＰＭ１１６４０中において培養した。

抗体 白血球細胞表面抗原に対する単クローン性抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ 　１．４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６）をベクトン・デイキンソン（サン・ ホセ、ＣＡ）から購入した。マグネチックビーズ枯渇実験用の抗体（ＣＤ３、Ｃ Ｄ４、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤＬ９）は、適当な細胞系を注射した５ＣＩＤマウ スの腹水から製造した。抗Ｉ　Ｌ−４および抗ＩＬ−１０中和抗体は、例えば、 本明細書中に参考として包含される、フレティアン（Ｃｈ　ｒｅ　ｔ　ｉ　ｅｎ ）ら（Ｊ９８９）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１１７：６７〜８１； およびイセル（Ｙｓｓｅｌ）　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、７２： ２１９〜２２７に記載されている。

ＰＢＭＣの調製および培養 ヒトＰＢＭＣを、健康なドナーからのバフィーコートからフィコール・ハイバク での遠心分離によって単離し、そして１％ヒトＡｂ＋血清を有するイセル（Ｙｓ ｓｅｌ’　ｓ）培地中において他のサイトカインを含むかまたは含まない１０６ ／ｍｌ　ｕｂ　ｒ　ＩＬ−２（２００単位／ｍｌ）で培養した。培養は２４（ま たは９６）ウェルプレート中において５日間実施し、そして上澄みを採集した。

異なるドナーからのＰＢＭＣは、Ｉ　Ｌ−２によって刺激された場合、ＩＦＮ− γおよびＴＮＦ−αを生産するそれらの能力が異なった。

細胞精製 ＰＢＭＣを洗浄し且つ組織培に皿中において３７℃で４０分間インキュベートし た。付着細胞をラバーポリスマンで掻取ることによって集めた。非付着細胞を除 去し、ペレットにし、そしてナイロンウールカラムに入れ且つ３７℃で４０分間 インキュベートした。カラムから溶離後、細胞をペレットにし、１０％ＦＣ３／ ＰＢＳを含む３０％パーコール（Ｐｅ　ｒｃｏ　ｌ　ｌ）中に再懸濁させ、そし て４０％パーコール上に重層した。室温で３０分間遠心分離後、界面の大型顆粒 リンパ球を回収し且つ２回洗浄した。これらの細胞を抗ＣＤ５６抗体（ベクトン ・ディキノソン、サン・ホセ、ＣＡ）と−緒に４℃で３０分間インキュベートし 、洗浄した後、ＦＡＣ３選別の前に、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（ジャクソン・イム ノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ニーボンゾー ル、ＰＡ）で染色した。ＣＤ５６＋細胞は、選別を行なった細胞の約３５〜５０ ％であった。選別された細胞は、再分析により、９９．５％より大のＣＤ５６＋ であった。精製ＮＫ細胞９Ｘ１０４個を、最終容量１００ｍ１中において付着細 胞またはＴ細胞３ｘ１０４個と混合し、そして他のサイトカインを含むかまたは 含まないＩＬ−２と一緒に培養した。

同一　ドナーからの精製ＮＫ細胞および単球を以下のように得た。すなわち、Ｐ ＢＭＣをヒツジ赤血球と一緒に一晩生インキュベートし；ロゼツト形成「Ｅ＋」 （ＣＤ２＋）および非ロゼツト形成ｒＥ　−Ｊ細胞をフィコール・ハイバク勾配 での遠心分離によって分離した。Ｅ十細胞に、ＰＢＭＣに関して記載したのと同 様の精製操作（前記を参照されたい）を施して精製ＮＫ細胞を得た。引続き、Ｅ −細胞を抗ＣＤ１４　ｍＡｂ　（ＬｅｕＭ３）およびＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス ＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートし、そしてＣＤ１４＋細胞をファクスタープ ラス（ＦＡＣ３ｔａｒ　ｐｌｕｓ）で選別した。これらの細胞純度は９８％より 大であった。精製ＮＫ細胞１０　個を１００ｍ１中において純粋な単球１０４個 と一緒にインキュベートし且つ単独でかまたはＩＬ−２および前記に記載の他の 添加物と一緒に培養した。

或いは、ＮＫ細胞および単球をマグネチックビーズ選択によって豊富にした後、 以下のように選別した。すなわち、ＰＢＭＣを最初に単りローン性抗ＣＤ３、抗 ＣＤ４、抗ＣＤ５および抗ＣＤ１９抗体と一緒にインキュベートしてＴ細胞およ びＢ細胞を染色した。ＰＢＳて２回洗浄後、ヤギ抗マウス１ｇＧ被覆マグネチッ クビーズ（グイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−４５０、ダイナル嘩インコ ーボレーテッド（Ｄｙｎａｌ　Ｉｎｃ、）、グレート・ネック、ＮＹ）を加えて 、抗体被覆Ｔ細胞およびＢ細胞をマグネチック選択によって除去した。得られた 豊富なＮＫ細胞および単球を抗ＣＤ５６−ＰＥおよび抗ＣＤ１４−ＦＩＴＣで染 色し、そしてＣＤ５６＋およびＣＤ１４＋細胞を細胞ソーターで単離した。２種 類の選別された細胞集団の純度は９８．５％より大であった。

細胞毒性検定 ＰＢＭＣを、１％ヒトＡＢ＋血清を含むイセル培地中においてＩＬ−２を２００ Ｕ／ｍｌと一緒に細胞１０６個／ｍｌで３日間インキ−ベートした。培養は、リ ンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ）２４ウエルプレート（フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏ ｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マクリーン、ＶＡ）の１−ｍ１ウエル中で実 施した。培養期間後に細胞を採集し、２回洗浄し、そして５１０ｒ放出検定にお いてエフェクター細胞として用いた。本明細書中に参考として包含されィ）１０ ００個を、Ｕ字型の９６ウエルプレート中の０．２５％ＢＳＡ含有イスコヴ（Ｉ ｓｃｏｖ’　ｓ）培地（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉ　ｇｍａＣｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、セント・ルイス、ＭＯ）中において種々の数のエフェク ター細胞と混合した。プレートを５０ｘｇて５分間遠心分離した後に、給温した ５％Ｃｏ２雰囲気中において３７℃で４時間インキュベーションした。試料を採 集し且つガンマカウンター（ＬＡＢ、ブロンマ、スウェーデン）で計数した。

組換体ｈｌＬ−１０、ｖｌＬ−１，０およびｈ　Ｉ　Ｌ−４を、末梢血液単核細 胞（ＰＢＭＣ）中においてＩ　Ｌ−２によって引起こされたＩＦＮγおよびＴＮ Ｆαの合成並びにＬＡＫ活性に対するそれらの作用に関して検査した。ＰＢＭＣ をｒＩＬ−２の２００Ｕ／ｍｌ中においてｒ　ＩＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）と− 緒にかまたはｈｌＬ−１，０、ｖｌＬ−１０含有若しくはサイトカイン不含（模 擬）のＣＯ３７上澄みと一緒に５日間培養した後、サイトカイン合成を測定した 。ｈｌＬ−１０、ｖｌＬ−１０またはＩ　Ｌ−４を含む培養物中においてＩＬ− ２に誘導されたＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成は実質的に阻害された（図２Ａ、 ２Ｂ）。

ＩＬ−４によって得られた結果は、Ｉ　Ｌ−４が、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮ γ　ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を阻害するという観察報告を確証する。■ Ｌ−４およびＩＬ−１０双方によるサイトカイン合成の阻害は用量依存性であり 、抗ｈＩＬ−４および抗ｈｌＬ−１０単りローン性抗体をそれぞれ阻止すること によって逆行するが、イソタイプ対照免疫グロブリンでは逆行しない（図２０１ ２Ｄ）。

ＬＡＫ活性を、更に、ＬＡＫ細胞によって効率よく死滅するが活発なＮＫ細胞に よっては死滅しないバーキットリンパ腫細胞系ダウディおよび結腸癌系Ｃ０ＬＯ に対して評価した。ダウディおよびＣ０ＬＯ細胞に対するＩＬ−２に誘導された ＬＡＫ活性は、［Ｌ−４を含む培養物においてのみ阻害され、ｈｌ−１０および ｖｌＬ−１０培養物中においては変化しないかまたは僅かに増大さえした（図３ Ａ）。ＴＬ−２に誘導されたＬＡＫ活性は、主としてＣＤ５６　（Ｌｅｕ１９） ＋ＮＫ細胞によって媒介される。Ｃ０ＬＯ細胞に対するＬＡＫ活性がＩＬ−１０ によって阻害されなかったということは、活性ＮＫ細胞によって媒介された細胞 毒性がこのサイトカインによって影響されないことを示した。しかしながら、活 性ＣＤ３＋　ｇｄ＋　Ｔ細胞はダウディ細胞を死滅させることができるので、ダ ウディに対するＩＬ−２に誘導されたｇｄ＋　Ｔ細胞の細胞毒性をＩＬ−１０が 刺激し、同時に、この標的細胞に対するＩ　Ｌ−２に誘導されたＮＫ活性を阻止 することは可能であった。

ＩＬ−２およびｈｌＬ−１０で培養されたＰＢＭＣ中において誘導された抗ダウ ディＬＡＫ細胞の表現型を決定するために、ＣＤ５６＋およびＣＤ５６−集団を ＦＡＣ３によって選別し且つそのダウディ細胞に対する細胞毒性を検査した。

図３Ｂは、Ｉ　Ｌ−２単独の場合と同様に、有意のＬＡＫ活性がＣＤ５６＋集団 においてのみ観察されたことを示す。したがって、ＩＬ−４およびＩ　Ｌ−１０ 双方がＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγおよびＴＮＦαの合成を阻害し、ＩＬ−４ だけが、ＰＢＭＣ中に存在する活性ＮＫ細胞によるＩ　Ｌ−２に誘導された細胞 毒性を阻害する。

実施例Ａ２ ＩＬ−１０は、ＩＬ−２に刺激された精製ＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成またはそ して最終容量２００μＩ／ｍｌ中においてサイトカイン存在下または不存在下で ４日間インキュベートした。次に、１０μｍ中の３Ｈ−チミジン１ｍＣ１を各ウ ェルに加えた。６時間後に培養物を採集し、そして取込まれた放射能をシンチレ ーション計数によって評価した。

ＰＢＭＣにおけるＩ　Ｌ−２に誘導されたＩＦＮγ合成の大部分は、Ｔ細胞より もむしろＮＫ細胞由来であるらしい。したがって、Ｉ　Ｌ−２に誘導されたＩＦ Ｎγ合成に対するｈｌＬ−１０、ｖｌＬ−１０およびＩ　Ｌ−４の作用は、ＦＡ Ｃ８て精製されたＮＫ細胞（純度＞９９．５％）によって検査された。ＩＬ−４ は、これらの細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ分泌を阻害したが；対照 的に、ｈｌＬ−１０もｖｌＬ−１０も、精製された活発なＮＫ細胞によるＩＦＮ ７合成を抑制しなかった（図４Ａ）。更に、ＩＬ−４は、ＰＢＭＣまたは精製Ｎ Ｋ細胞によるＩＬ−２に誘導された増殖を有意に阻害したが、ＩＬ−１０は、Ｉ Ｌ−２に媒介された増殖に対して作用しなかった（図４Ｂ）。

ＩＬ−４とは対照的に、ＩＬ−１０はＮＫ細胞に直接的に作用しないが、同時刺 激シグナルを与える単球の能力を阻害する。この結論は、！Ｌ−２に誘導された ＩＦＮγ生産に対するＩＬ−１，０の作用によって最も明確に支持される。前記 のように、補助細胞調製試料はＩＦＮγを生産しなかった。ＩＬ−２に刺激され たＮＫ細胞は、補助細胞を用いることなく有意の濃度のＩＦＮγを生産したが（ 図４Ａ、５Ａおよび５Ｂ）、プラスチック付着細胞および精製ＣＤ１４＋細胞双 方を精製ＮＫ細胞に加えることにより、ＩＦＮγ合成は大きく増大した。ＮＫ細 胞に対するＩＬ−１０の直接作用の不存在（図４Ａおよび４Ｂ）は、ＩＬ−１０ が、単球に対して作用することによってＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を阻 害していることを示唆する。同様に、ＩＬ−１０によるＴ細胞サイトカイン合成 阻害は、単球／マクロファージ補助細胞によって媒介される。

実施例Ａ３ ＩＦＮγ合成が、ＰＭＢＣの培養物中においてＩｔ、−１０によって阻害された が純粋なＮＫ細胞では阻害されなかったということは、ＩＬ−１０のこの作用が 補助細胞によって媒介されたことを示唆した。これらの補助細胞の性質を研究す るために、パーコール勾配遠心分離によって得られた低密度細胞画分から、また はＴ細胞、Ｂ細胞および単球を枯渇したＰＢＭＣからＣＤ５６＋細胞を選別する ことによってＮＫ細胞を精製し、そしてプラスチック付着細胞とまたはパーコー ル勾配からの高密度細胞集団（Ｔ細胞９８％）と混合した。付着細胞をＮＫ細胞 に加えることにより、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産は激し く増大し；付着細胞のこの刺激作用はＩＬ−１０によって阻止された（図５Ａ） 。

付着細胞集団自体は、ＩＬ−２に応答して検出可能な濃度のＩＦＮγを生産しな かった。対照的に、Ｔ細胞含有画分は、ＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩ ＦＮγ生産に対して作用しなかったし、ＩＬ−１０によるＩＦＮγ生産の阻害を 媒介しなかった（図５Ａ）。

プラスチック付着細胞は単球に富むが、他の細胞集団を含むことができる。単球 が、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ生産を増大させたし、ＩＬ−１０によるその 阻害も媒介したことを確証するために、ＮＫ細胞およびＣＤ１４＋単球を選別に よって精製し且つＴＬ−２およびＩＬ−１０存在下で培養した。図５Ｂは、ＮＫ 細胞に対して精製された単球を加えることにより、ＩＬ−２に誘導されたＩＦＮ γ生産が増大したことおよびＩＬ−１０がこの増大を阻害したことを示す。

ＴＮＦα合成に関して、定性的に同様の結果が観察された。図５０は、予想され るように、ＮＫ細胞がＩ　Ｌ−２に応答して検出可能なＴＮＦαを生産したこと を示す。ＣＤ１４＋細胞は、ＩＬ−２とは無関係にＴＮＦαを生産する。ＩＬ− １０は、ＩＬ−２の存在下（図５Ｃ）および不存在下双方において単球によるＴ ＮＦα生産を阻害する。対照的に、ＮＫ細胞によるＴＮＦα合成はＩＬ−１０に よって阻害されなかった。ＮＫおよびＣＤ１４＋細胞の同時の刺激により、どち らかの細胞だけで観察されるよりも実質的に高いＴＮＦα生産濃度が得られ、こ の増加はＩＬ−１０によって阻止された。

単球およびそれらの生産物は、ＮＫ細胞を休止させることにより、ＩＬ−２に誘 導されたＩＦＮγ生産を実質的に増加させることが分かった（図５Ｂ）。いくつ かのモノカイン、例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦαは、種々の条件下においてヒ トおよびマウスＮＫ細胞によるＩＦＮγ合成の同時刺激剤として包含された。、 ＬＰＳまたはＩＦＮγに刺激された単球／マクロファージによるＩＬ−１、ＩＬ −６およびＴＮＦαなどのモノカインの合成をＩＬ−１０が阻害するということ は、ここで報告されたＩＬ−１０の作用が、補助細胞による同時刺激分子の生産 をＩＬ−１０が阻害することに基づいていたことを示唆する。付着細胞の上澄み （主として単球を含む）は、ＩＬ−２に刺激された精製ＮＫ細胞によるＩＦＮγ 生産を増大させることが観察されたが、ＩＬ−１０存在下で培養された付着細胞 の上澄みは、ＩＬ−１，０を枯渇した場合でさえもこの能力を欠いている。この 上澄みの活性が補助細胞の完全な同時刺激作用の要因であるかどうかは不明であ る。

ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βはＮＫ細胞によるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮｒ生 産を同時刺激するが、Ｉ　Ｌ−６またはＴＮＦαは刺激しないということが観察 されたが；しかしながら、ＩＬ−１を最大１０００Ｕ／ｍｌまで加えることは、 未分別のＰＢＭＣによるＩＬ−２に誘導されたＩＦＮγ合成に対するＩＬ−１０ の阻害作用を逆行させない。したがって、１種類若しくはそれ以上の追加の活性 がこの系において機能し、またはＩＬ−１ｏが、ＮＫ細胞によるサイトカイン合 成を阻害する第二の因子の合成をもたらすという可能性が存在する。

実験Ｂ ＩＬ−１０はヒト単球によるサイトカイン合成を阻害する：単球によって生産さ れたＩＬ−１０の自己調節の役割。

この項において示したテークは、本明細書中に参考として完全に包含されている 、デ・ワール−７レフイト（ｄｅ　Ｗａａｌ　Ｍａｌｅｆｙｔ）ら（１９９０） Ｊ、Ｅｘｐｔ　１．Ｍｅｄ、１７４　：１２０９〜１２２０に、その優先０後に 公開された。

概要 この項は、ＬＰＳによって活性化されたヒト単球が、従来、サイトカイン合成阻 害因子（Ｃ３ＩＦ）と称されるインターロイキン（ＩＬ−１０）を用量依存形式 において高濃度で生産することができるということを実証する。ＩＬ−１０は、 単球の活性化の７時間後に検出可能であり、ＩＬ−１０生産の最大濃度は２４〜 ４８時間後に観察された。これらの速度論は、ヒト単球によるＩＬ−１０の生産 が、活性化の４〜８時間後にいずれも高濃度で分泌されたＩ　Ｌ−１α、ＩＬ− １β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦαおよびＧ−Ｃ３Ｆの生産と比較して相対的 に遅いことを示した。ＬＰＳで活性化した単球によるＩＬ−１０の生産は、ＩＬ −１α、［Ｌ−１β、Ｉ　Ｌ−６、Ｉ　Ｌ−８、ＴＮＦα、ＧＭ　Ｃ３Ｆおよび Ｇ−Ｃ３Ｆの場合と同様に、Ｉ　Ｌ−４によって阻害された。更に、培養の開始 時に、■ＦＮγ、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγの組合わせによって活性化 された単球に対して加えられたＩＬ−１０は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉ　Ｌ −６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ８Ｆの生産を転写段階で 強く阻害した。ウィルスＩＬ−１０はヒト細胞に対する同様の生物活性を有する が、更に、ＬＰＳ活性化後の単球によるＴＮＦαおよびＧＭ−Ｃ３Ｆの生産を阻 害した。中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下におけるＬ　Ｐ　Ｓによる単球の活 性化は、ＬＰＳ処理のみの場合と比較して多量のサイトカイン生産を引起こし、 内因的に生じたＩＬ−１，０はＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉ　Ｌ−６、Ｉ　Ｌ− ８、ＴＮＦα、ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆの生産を阻害することが示唆され た。更に、ＩＬ−１０は、ＬＰＳに活性化された単球においてＩＬ−１０ｍＲＮ Ａ合成を強く阻害したので、その作用は自己調節的であった。更に、内因的に生 じたＩＬ−１０は、ＬＰＳによる単球の活性化後のクラスＩＩＭＨＣ発現の減少 の原因であることが分かった。総合すると、これらの結果により、ＩＬ−１０は 、クラス１１　ＭＨＣ発現をダウンレギュレートし且つ単球による前炎症性すイ ト力インの生産を阻害するその能力ゆえに、免疫学的応答および炎症性応答に対 して重要な調節作用を有するということが示される。

最近、ネズミーイレターロイキン１０　（ＩＬ−１０）が同定され、その遺伝子 はそのサイトカイン合成阻害因子（Ｃ３ＩＦ）活性に基づいてクローン化された 。

ネズミの系において、ＩＬ−１０はＣＤ４＋　Ｔｈ２サブセツトによって生産さ れており、しかも、Ｔｈｌクローンによるサイトカイン生産、特に、ＩＦＮγを 阻害する。ＩＬ−１０によるサイトカイン生産の阻害は、Ｂ細胞ではなくマクロ ファージを抗原提示細胞・（Ａ　Ｐ　Ｃ）として用いた場合にのみ観察された。

そのＣ３ｌＦ活性に加えて、ＩＬ−１０は多面的であり且つ胸腺細胞、細胞毒性 Ｔ細胞、マスト細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む種々の細胞種に対して 作用することが分かった。

更に、ヒトＩＬ−１０はＣ３ｌＦ活性を示す。ＰＨＡまたは抗ＣＤ３　ｍＡｂに よって活性化したＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＧＭ−Ｃ８Ｆの生産はＩＬ−１ ０によって強く阻害され、そしてこの阻害は転写段階で生じた。ヒトおよびネズ ミ双方のＩＬ−１０は、エプスタイン・バールウィルスゲノムの従来特性決定さ れていない読取り枠ＢＣＲＦ−１に対して広範囲の配列相同関係を有する。この 読取り枠の発現は、マウスおよびヒトＴ細胞でのＣ３ｌＦ活性を含む大部分の性 質をヒトおよびネズミＩＬ−１０と共有するウィルスＩＬ−１０（ｖ−ＩＬ　− １Ｏ）と称する活性タンパク質を生成させた。

ヒ目Ｌ−１０およびｖ−ＩＬ−１０は、クラスＩＩＭＨＣ分子のダウンレギュレ ーションによってヒト単球の抗原提示能力を減少させることにより、抗原特異的 増殖性Ｔ細胞応答を阻害することができる。ここで示された結果は、ヒト単球が 、ＬＰＳによる活性化後に高濃度のＩＬ−１０を生産することができること、お よびこの生産が他のモノカインの場合と比較して相対的に遅いということを示す 。更に、ＩＬ−１０は、ＬＰＳ、ＩＦＮγまたはＬＰＳおよびＩＦＮγによって 活性化された単球による前炎症性すイトカイン、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１ β、１Ｌ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦａ並びに造血系成長因子であるＧＭ−、Ｃ Ｓ　ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆの生産を強く阻害することをここで報告する。内因的に 生じたＩＩ、−１０は、単球によるＩＬ−１α、！Ｌ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ− ８、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ８Ｆの生産に対して自己調節的作用を 有するのみならず、それ自体の生産および単球てのクラス目　ＭＨＣ発現を自己 調節的にダウンレギュレートする。これらの結果は、ＩＬ−１０が免疫学的応答 および炎症性応答に対して重要な調節作用を有することを示す。

実施例ＢＩ ＩＬ−１０はヒト単球によって生産される。

ヒト単球の単離および培養 ヒト末梢血液単球を正常ドナーの血液５００ｍ１から単離した。単核細胞を血液 成分分離器での密度遠心分離によって単離した後、遠心水筆によってリンパ球お よび単球に分別した。単球調製試料は、非特異的エステラーゼ染色によって判定 したところ〉９５％純度であり、生存しうる細胞を９８％を越えて含んでいた。

単球は、１％のプールされた熱失活ヒトＡＢ＋血清を補足したヒト血清アルブミ ン（ＨＳ　Ａ）含有イセル培地中て培養された。この培地は、リムルス（Ｌｉｍ ｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解検定によって確認したところ、内毒素を含んでい なかった（内毒素＜０．２ａｇ／ｍｌ）。単球は、これらの細胞の付着を防止す るテフロンバッグ（ヤンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ＭＮＬ、セント・ニクラース、ベ ルギー）中において細胞濃度４ｘ１０６個／ｍ＋で培養された。指定した時間培 養後に単球を集め、そして間接免疫蛍光法によってその細胞表面発現を分析する かまたはノーザン分析およびＰＣＲ分析によってそのリンホカイン遺伝子発現を 分析した。更に、単球培養上澄みを、これらの細胞の活性化後のＩＬ−１α、Ｉ Ｌ−１β、ＩＬ−６、Ｉ　Ｌ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦａ、ＧＭ−ＣＳ　Ｆおよ びＧ−Ｃ３Ｆの生産を決定するために集めた。培養後の細胞の生存率は、トリパ ンブルー排除によって決定したところ９５％を越えていた。

試薬 組換体ヒトＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０を大腸菌においてグルタチオン−ｓ −トランスフェラーゼ融合タンパク質として発現させ、精製し、そしてトロンビ ンで消化してＮ末端融合部分を除去し、活性ヒトおよびウィルスＩＬ−１０を得 た。精製ヒトｒ−ＩＬ−４およびｒ−ＩＦＮγは、シェリング寺プラウ・リサー チ（ブルームフィールド、ＮＪ）によって提供された。ＬＰＳ　（大腸菌０１２ ７：Ｂ８）は、ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（デトロイト、Ｍりから得られた。中和性抗ＬＬ− １０ｍＡｂ　１９Ｆｌは、ｖ−［Ｌ−１０に対して生じたものであり、ヒトおよ びウィルスＩＬ−１０双方を効率よく中和した。

単球によるＩＬ−１αおよびＴＮＦａの生産は、エンドジエン（ボストン、ＭＡ ）から入手したリンホカイン特異的エリザによって測定された。これらのエリザ の下方検出限界は、それぞれ５０ｐｇ／ｍｌおよび１０ｐｇ／ｍｌであった。

ＩＬ−１βの生産は、ンストロン（Ｃｉｓｔｒｏｎ）（パイン・プルツク、ＮＪ ）から入手したリンホカイン特異的エリザによって決定された。このエリザの感 度は２０ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ〜６濃度は、ジェンザイム（ボストン、ＭＡ ）から購入したリンホカイン特異的エリザによって決定された。この検定の感度 は０、　３１．３　ｎ　ｇ／ｍ　ｌであった。ＩＬ−８およびＧ−Ｃ８Ｆ特異的 エリザをＲ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネアポリス、ＭＮ）から入手 し、Ｉ　Ｌ−８およびＧ−ＣＳＦの生産を定量するのに用いた。これらのエリザ の感度は、それぞれ４．７ａｇ／ｍｌおよび７．２ａｇ／ｍｌであった。ＧＭ− Ｃ８Ｆ生産は、リンホカイン特異的エリザによって決定された。このエリザの感 度は５０　ｐ　ｇ／ｍｌであった。ＩＬ−１０生産は、抗ＩＬ−１０ｍＡｂ（Ｊ ＥＳ　９Ｄ７）を被覆抗体として、および別の抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　（ＪＥＳ３ −１２Ｇ８）をトレーサー抗体として用いる特異的エリザによって決定された。

このエリザの感度は５０ｐｇ／ｍｌであった。

ＩＬ−１０は、活性ヒトＴ細胞クローン、活性末梢血液ＴおよびＢ細胞、ＥＢ■ 形質転換Ｂ細胞系および単球によって生産される。遠心水筆によって単離された 、高度に精製されたヒト単球は、ＬＰｓによる活性化後にＩＬ−ＬＯを生産した 。更に、これらのヒト単球は、高濃度のＩ　Ｌ−６、ＴＮＦａおよびＧＭ−ＣＳ Ｆを生産しうろことが分かった（図６）。ＬＰＳで活性化された単球によるサイ トカイン生産の速度論は、ＬＰＳで活性化された単球にょるＩＬ−１０生産が比 較的遅いことを示した。それは７．５時間で採集された上澄み中において最初に 検出されたが、最大生産は活性化の２０〜４８時間後に観察された。対照的に、 ＴＮＦａおよびＩＬ−６は、活性化によって速やかに生産され、そしてそれぞれ 活性化後３．５時間および７．５時間で最大生産濃度に達した（図６）。しかし ながら、ＧＭ−Ｃ８Ｆ生産は、更に、ＬＰＳによる活性化の７．５時間後に最初 に検出されたが、この場合、最大生産濃度は２０時間で達せられた。用量応答実 験により、１．　Ｏｎ　ｇ／ｍ　ＩのＬＰＳによる単球の活性化は既に有意の濃 度のＩＬ−１０生産を引起こすことが示されたが、最大ＩＬ−１０合成はＬＰＳ 濃度１μｇ／ｍｌで観察された（図７）。

実施例Ｂ２ ＩＬ−１０はヒト単球によるサイトカイン生産を阻害する。

ＩＬ−１０は、活性ＰＢＭＣによるＩＦＮγおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産を阻害する ことが分かった。単球によるサイトカインの生産に対するＩＬ−１０の作用を決 定するために、高度に精製された単球を、ＩＬ−１０の不存在下または存在下で ＬＰＳにより２４時間活性化した。更に、単球を、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍＩ） または、ｖ−ＩＬ−１０に対して生じたものであるがヒトＩＬ−１０およびｖ　 −１−４０双方を効率よく中和する中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　１９Ｆ１の存在 下においてＬＰＳを用いて２４時間活性化した。サイトカイン生産は、活性化し て２４時間後に採集されたこれらの培養物の上澄みにおいて、サイトカイン特異 的エリザによって決定された。表８１に示したように、培地のみにおいて３７℃ でインキュベートされた単球は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ− ８、Ｉ’Ｌ−１０、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ８Ｆを生産しなかった 。

これらの条件下では、有意の濃度のＩ　Ｌ−８のみが合成された。ＬＰＳ　（１ ａｇ／ｍｌ）による単球の活性化は、高濃度のＩＬ−１ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ− ６、ＩＬ−８、ＩＬ−１ｏ、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＧ−Ｃ８Ｆを生産し た。

興味深いことに、ＩＬ−１ｏは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８ 、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆの生産を様々な程度まで阻害した（ 表Ｂｌ）。Ｉ　Ｌ−１０の最も強い阻害作用は、８０〜１００％まで阻止された ＩＬ−１α、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆの生産に対して観察され た。

ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の生産阻害はあまり顕著ではなかったし、ＩＬ−８の 合成は１−１０によって僅かしか影響されなかった。

実施例Ｂ３ ［、−１０は、更に、ＩＦＮγによって活性化された単球のサイトカイン生産を 阻害する。

ＩＬ−１０は、更に、ＩＦＮγまたはＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わせによって 活性化された単球によるサイトカイン生産を阻害する。図８は、最適濃度１゜Ｏ Ｕ／ｍｌでのＩＦＮγが、概して、最適濃度１μｇ／ｍｌでのＬＰＳの場合より もあまり強力でないサイトカイン分泌誘導物質であったことを示す。更に、単球 によるサイトカイン生産に対するＩＦＮγおよびＬＰＳの組合わせの作用は、概 して付加的であったことが実証される。ＩＬ−１０の最も強い阻害作用は、ＩＬ −１α、ＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産に対して観察された。ＴＮＦａおよび ＧＭ−Ｃ３Ｆ分泌は、最適ＬＰＳおよびＩＦＮγ濃度によって単球を活性化した 後でさえも、９０％を越えて抑制された。ＩＬ−１βおよびＩＬ−６分泌に対す るかなりの阻害作用が最適刺激条件で観察されたが、それらの阻害は、単球が準 最適濃度のＬＰＳによって、最適濃度のＩＦＮγ不存在下または存在下で刺激さ れた場合に一層顕著であった。

実施例Ｂ４ ウィルスｒＬ−ｔｏは単球によるサイトカイン生産を阻害する。

ウィルスＩＬ−１ｏおよびヒトＩＬ−１０は、ヒト細胞に対して同様に作用する 。図９は、ＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０双方が、単球にょるＴＮＦａおよび ＧＭ−Ｃ３Ｆ生産を同様に阻害したことを示す。濃度１００Ｕ／ｍ！で加えられ たＩＬ−１０およびｖ−■Ｌ−１０は、ＬＰＳ　（ｔμｇ／ｍｌ）による活性化 後の単球によるＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産に対して有意の阻害作用を有す る。ＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ８Ｆ分泌に対するＩＬ−１０およびｖ−ＩＬ−１０ のこれらの阻害作用は、インキュベーションをｍＡｂ　１９Ｆ１の存在下で実施 した場合に逆行しく図９）、ｖ−１１，−１０の阻害作用の特異性が実証された 。

実際に、ＩＬ−１０またはｖ−ＩＬ−１０および中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存 在下でのＬＰＳによる単球の活性化は、ＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ８Ｆの増大した 生産さえも引起こし、内因的に生じたＩＬ−１０はこれらのサイトカインの生産 を抑制することが示された。

単球によるサイトカイン生産に対する内因的に生じたＩ　Ｌ　−１，０の阻害作 用は、中和性抗ＩＬ−１，０ｍＡｂの存在下においてＬＰＳて活性化された単球 によって生産されたサイトカイン濃度を定量することによって更に評価された。

表８１において、単球の、抗ＩＬ−１０を加えたＬＰＳ処理は、ＬＰＳ単独によ る活性化と比較して一層高濃度のサイトカイン生産を引起こしたことが示され、 内因的に生じたＩＬ−１０は、ＴＮＦａおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産に対するその阻 害作用に加えて、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１β、ＩＩ、−６、ＩＬ−８およびＧ−Ｃ ３Ｆの生産を阻止することが示された。最も有意の阻害作用は、Ｉ　Ｌ−１α、 ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦａの生産に対して見出されたが、ＩＬ−１β、Ｉ　Ｌ −６、ＩＬ−８およびＧ−Ｃ３Ｆの発現に対する阻害作用はかなりではあるがあ まり顕著ではなかった。総合すると、これらの結果は、内因性ＩＬ−１０および 内因的に生じたＩＬ−１，０双方が、ＬＰＳて活性化した単球にょるＩＬ−１α 、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦａ、ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＧ−Ｃ８Ｆ の生産を阻害することを示す。

実施例Ｂ５ １Ｌ−４は、活性化した単球によるＩＬ−４０生産を阻害する。

ＩＬ−４は、ＬＰＳて活性化した単球によるＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ ａの生産を阻害する。ＩＬ−４がＩＬ−１０生産も阻害したかどうかを決定する ために、単球をＬＰＳて２４時間活性化し、そしてＩＬ−１０分泌を測定した。

表８１は、！Ｌ−４が、ＬＰＳて活性化した単球によるＩＬ−１０生産を強く阻 害したことを示す。更に、ＩＬ−４は、ＩＬＩβ、Ｉ　Ｌ−６およびＴＮＦα分 泌に対するその阻害作用に加えて、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆの生産を効率 よく阻止する。しかしながら、ＩＬ−１０に関して観察されたように、Ｉ　Ｌ− ８の生産はＩＬ−４によって僅かしか影響されなかった。集合的に、これらのデ ータは、Ｉ　Ｌ−４およびＩＬ−１０が、活性化された単球によるサイトカイン 生産に対して同等の阻害作用を有することを示す。

実施例Ｂ６ 下記のプローブをノーザン分析に関して用いた。すなわち、ｐＣＤ−ｈＴＧＦβ の６００ｂｐのＳｍａ　Ｉフラグメント（ｎｔ１２９９〜１８９９）、ヨコタ（ Ｙｏｋｏｔａ）ら（１９８７Ｌムヱ匹且立立に土ユ見１１３巻、ゲデル（Ｇｏｅ ｄｄｅｌ）およびウェブ（Ｗｅｂｂ）（監修）、アカデミツク・プレス、ニュー ヨークを参照されたい；ｐＡＬ（ｂ−アクチ：／）（７）１２００ｂｐのＰｓｔ 　１７ラグメ：ｚト、ヒエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）ら（１９９１）Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳΔ　８８：１１７２〜１１７６を参照されたい； ｐｃＤ−ｈｒＬ−６の５６７ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｘｂａ　Ｉフラグメント（ｎｔ １〜５６７Ｌヨコタら（１９８７）を参照されたい；５Ｐ６４−３−１０ｃ　（ ＩＬ−８）の２６８ｂｐのＨ４ｎｄ　１１１７ラグメント（ｎｔ２９〜２９７） 、シュミド（Ｓｃｈｍｉｄ）ら（１９８７）Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９：２５０〜　を参照されたい：ｐＣＤ−５Ｒａ−ｈＩＬ −１０の７６０ｂｐのＢｇｌ　ｌｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩフラグメント（ｎ　ｔ　 １５９〜９１９）　、ビニリア（Ｖｉｅｒｅａ）ら（１９９１）を参照されたい 。下記のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ生成物のサザン分析に用いた。すなわち、 Ｉ　Ｌ−１ａ　：　５’　−ＣＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＡＴＡＡＧＴＣＡＴＣ−３ ’　（ｎ　ｔ　５００〜５２１）　、？−チ（Ｍａｒｃｈ）ら（１９８５）Ｎａ ｔｕｒｅ　３１５：６４１〜　を参照されたい： ＩＬ−１β：　５’　−ＣＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧ −３’　（ｎ　ｔ　４４４〜４６９）　、？　−チら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ を参照されたい；Ｉ　Ｌ　−６：　５’　−ＧＡＧＧＴＡＴＡＣＣＴＡＧＡＧＴ ＡＣＣＴＣ−３’　（ｎ　ｔ　５１０〜５３１）　、ヒラメ（Ｈｊｒａｎｏ）ら （１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３〜　を参照されたい： Ｉ　Ｌ　−８：　５’　−ＴＡＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣＴｒ−３’ 　（ｎ　ｔ　２００〜２２１）　、シュミドら（１９８７）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、を参照されたい；Ｉ　Ｌ−１０：　５’　−ＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＣ ＴｒＴＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣ `ＴＧＡ −ＧＴＧＡＧＴＴｒＧＡＣＡＴＣ−３’　（ｎ　ｔ　４２９〜４９８）　、ビニ リアら（１９９１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ；ＴＮ 　Ｆ　ａ　：　５’　−ＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡＣ−３’　 （ｎ　ｔ　５００〜５２１）　、ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）ら（１９８４）Ｎａ ｔｕｒｅ　３１２ニア２４〜　を参照されたい； ＧＭ−ＣＳ　Ｆ　：　５’　−ＣＣＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴ−３’　 （ｎ　ｔ　１５０〜１６８）　、’）　−（Ｌｅｅ）ら（１９８５）　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８２　：　４３６０〜４３ ６４を参照されたい；アクチン：　５’　−ＣＴＧＡＡＣＣＣｒ＾＾ＧＧＣＣＡ ＡＣＣＧＴＧ−３’　（ｎ　ｔ　２５０〜２７２）　、アロンソ（Ａｌｏｎｓｏ ）ら（１９８６）Ｊ、Ｍｏｌ、Ｅｖｏｌ、２３：１１〜　を参照されたい；およ び Ｇ−ＣＳ　Ｆ　：　５’　−ＧＣＣＣＴＧＧ−ＡＡＧＧＧＡＴＣＴＣＣＣＣＣ− ３’　（ｎ　ｔ　４００〜４２１）　、ナガタ（Ｎａｇａｔ、ａ）ら（１９８６ ）Ｎａｔｕｒｅ　３１９：４１５〜　を参照されたい。更に、ヌクレオチド配列 は、ジエンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）　、ｃｌｏ　インテリジエネティクス・イ ンコーホレーテッド（Ｉｎｔｅｌｌ　ｉｇｅｎｅｔ　ｉｃｓ、Ｉｎｃ、）、メン ロニ・パーク、ＣＡ並びにＢＣＣＧデータベースおよびライスコンシン・バイオ テクノロジー・センター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉ ｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｅｒ）、マディソン、ライスコンシン から入手可能である。合成ヌクレオチド生合成は、本明細書中に参考として包含 さス、オフスフオードに記載されている。

ｍＲＮＡ単離およびノーザン分析 全ＲＮＡを、チオシアン酸グアニジニウム−ＣｓＣ１法によって単球２０ｘ１０ ６個から単離した。ノーザン分析に関して、全ＲＮＡｌ０μｇ／試料を、６゜６ ％ホルムアルデヒド含有１％アガロースゲル上の寸法によって分離し、ナイトラ ン（Ｎｙｔｒａｎ）ナイロン膜（ジュライヒャーφアンド・シューエル（Ｓｃｈ ｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ１１）、キーン、ＮＨ）に移し且つプローブと ハイブリッド形成させ、高比活性（＞１０”ｃｐｍ／ｍｇ）に標識された。フィ ルターをハイブリッド形成し、緊縮条件下Ｃ洗浄し、そして展開させた。

ＰＣＲ分析 全ＲＮＡの１マイクログラムを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８をプライマーとして およびＡＭＶ逆転写酵素（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒｍ ａｎｎｈｅ　ｉｍ））を反応２０μｍ中で用いて逆転写させた。逆転写物２マイ クロリットル（全ＲＮＡ　１００　ｎ　Ｈに等しい）を各増幅反応に直接的に用 いた。

ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、反応５０μｌ中において、各プラ イ７−２５　す、／　モル、ｄＧＴＰＳｄＡＴＰ、ｄｃＴＰおよびｄＴＴＰ　（ ７ｙ−ｖシア、ウプサラ、スウェーデン）をそれぞれ１２５μＭ、５０ｍＭ　Ｋ ＣＩ、ＩＡポリメラーゼ（＝、−・イングランド・バイオラブズ（ＮｅｗＥｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー、ＭＡ）１単位。用いたプライマーは以 下の通りであった。すなわち、 Ｉ　Ｌ　−１ａセン７、フライ７−　５’　−ＣＡＴＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＣ ＡＧＡＧＧＡＡＧ−３’　（ｎ　ｔ　３０２〜３２５）； Ｉ　Ｌ−１ａ　７　：／　チＪｒｚ　ンスフライ７−　５’　−ＴＧＣＣＡＡＧ ＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＧＴＣＴｒＧＣＴｒ−３’（ｎｔ７７０〜７４３）； Ｉ　Ｌ−１ｆ３セン７．１ライフ　−５’　−ＣＣＡＧＣｒＡＣＧＡＡＴＣＴＣ ＧＧＡＣＣＡＣＣ−３’　（ｎ　ｔ　２３０〜２５３）； Ｉ　Ｌ−１／３７ンチセンスプライ７−５’　−ＴｒＡＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡ ＡＴｒＧＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＧＴ−３’（ｎｔ８９６〜８６３）； Ｉ　Ｌ　−６センスフライ？　−５’　−ＡＴＧＡＡＣＴＣＣｒＴＣＴＣＣＡＣ ＡＡＧＣ−３’　（ｎ　ｔ　１〜２１　）　；Ｉ　Ｌ　−６７ンチセンスフライ ７−　５’　−ＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧ ＡＣＴＧ−３’（ｎｔ８１０〜７７７）； ＩＬ−８センスプライマー　５’−ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴ Ｇ−３’　（ｎ　ｔ　１〜２１）　；Ｉ　Ｌ　−８７ン’ｆ　セン７、　フ−ｙ 　イｖ　−５’　−ＴｒＡＴＧＡＡＴｒＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴｒＣＡＡＡＡＡ −ＣＴＴＣＴＣ−R’ （ｎｔ３０２〜２６９）； Ｉ　Ｌ−１０センスフライ７−　５’　−ＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡ ＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡ＝３’　（ｎ　ｔ　３２３〜３４９）； ＩＬ−１０アンチセンスプライマー　５’　−ＴＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧ ＴＣＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡ−３’（ｎｔ６７４〜６４８）； ＴＮＦａセンスプライマー５′−＾ＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＧ ＡＣ−３’　（ｎ　ｔ　３１０〜３３３）； ＴＮＦａアンチセンスプライ７−　５’　−ＴＧＡＧＴＣＧＧＴＣＡＣＣＣＴＴ ＣＴＣＣＡＧ−３’　（ｎ　ｔ　７８２〜７６０）； ＧＭ−Ｃ３Ｆセンスブーｙ　イア　−５’　−ＧＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＧ ＣＣＣ−ＧＣＴＣＧＣＣ−３’　（ｎ　ｔ　７６〜１００）； ＧＭ−Ｃ８Ｆ７ンチ（ｒンスプライ７−５’　−ＣＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣ ＴＣＣＡＧＧＣＧＧＧＴ−３’（ｎｔ２７６〜２５０）； Ｇ−Ｃ３Ｆセンスプライマー　５’　−ＧＡＧＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧ ＣＴＧＴＧＣＣ−３’　（ｎ　ｔ　２３３〜２５８）； Ｇ−Ｃ３Ｆアンチセンスプライ７−　５’　−ＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡ ＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣ−３’　（ｎ　ｔ５３３〜５０８）； β−アクチンセンスプライ７−５’　−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣ ＣＡ−３’　（ｎ　ｔ　１〜２０）　；β−アクチンアンチセンスプライ７−　 ５’　−ＧＴＣＣＴＴＡＡ−ＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴｒＴＣ−３’（ｎｔ５ ４８〜５３０）。

反応をパーキン・エルマー／シーすスＤＮＡ熱サークラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）中において２０ サイクル（９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で６ ０秒間伸長）インキュベートした。反応物をＣＨＣｌ３で抽出し、４０μｍ／試 料をＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲルに加えた。生成物を臭化エチジウム染 色によって可視化した。次に、ゲルを０．５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣ１ 中で変性させ、１０Ｍ酢酸アンモニウム中で中和し、そしてナイトランナイロン 膜に移した。膜は、６ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ、１０ｘデンハート溶液（０゜２％ フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ＢＳＡ、ペンタクスフラ クションＶ）および大腸菌ｔＲＮＡ（ベーリンガー、マンハイム、ＦＲＧ）２０ ０μｇ／ｍｌ中において５５℃で４時間予備ハイブリッド形成された。増幅にお いて用いたプライマーに対して内部の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプロー ブ（２００ｎ　ｇ）の５′末端に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（二ニーφイ ングランド・バイオラブズ）およびγ−５２Ｐ−ＡＴＰ　（アマ−ジャム（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）、アーリントン・ハイツ、ＩＬ）で標識した。プローブをニック （Ｎｉｃｋ）カラム（ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）に通すことによ り、取込まれなかったヌクレオチドから分離し、そしてハイブリダイセージジン 配合物に加えた。５５℃で１２時間のハイブリダイセージジン後、フィルターを ０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ：　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸Ｎａ 　ｐＨ＝７．０）および１％ＳＤＳ中において室温で洗浄し、そしてコダック（ Ｋｏ’ｄａｋ）ＸＡＲ−５フイルムに１〜２時間暴露した。

ＩＬ−１０が単球によるサイトカインの生産を阻害した濃度を決定するために、 比較ＰＣＲ分析を、ｔＬ−ｉｏ、ＩＬ−４または中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの不 存在下または存在下においてＬＰＳで２４時間活性化された単球から単離したＲ ＮＡで実施した。この実験のサイトカイン測定値を表８１に示す。これらの試料 から単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、サイトカイン特異的プライマ ーを用いて増幅させた。比較的少数のサイクルを増幅に用いて、増幅したＤＮＡ １ｌがサイクル数に比例し且つ元の試料中の特異的ｍＲＮＡ量と相関することを 確証した。図１０は、これらの条件下において等量のβ−アクチン特異的ｃＤＮ Ａが増幅したことを示す。培地のみにおいて４℃で２４時間インキュベートした 単球は、極めて低濃度のＩＬ−８ｍＲＮＡを発現した。これらの細胞の３７℃で のインキュベーションはＩＬ−８ｍＲＮＡの発現を増大させたが、ＩＬ−１α、 ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＧＭ−Ｃ８ＦまたはＧ−Ｃ３Ｆ 　ｍＲＮＡの発現を引起こさなかった。ＬＰＳ活性化はＩＬ−１α、ＩＬ−１β 、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＧ−Ｃ８Ｆ　ｍＲＮＡの強い発現を引起こしたが 、ＴＮＦαおよびＧＭ−Ｃ８Ｆ　ｍＲＮＡは過変に誘導された。更に、図１０は 、ＩＬ−１α、Ｉ　Ｌ−６、ＴＮＦα、ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＧ−Ｃ３Ｆ発現が、 ＩＬ−１０およびＩＬ−４によってｍＲＮＡ段階で強く阻害され、ＩＬ−１βお よびＩＬ−８発現はＩＬ−１０によって僅かしか影響されなかったことを示す。

抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下でのＬＰＳによる単球の活性化は、ＩＬ−１α、ｌ ｌ−４８，１１、−６、ＩＬ−８およびＧ−Ｃ３Ｆ　ｍＲＮＡの発現を適度に増 加させ且っ］’ＮＦαおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ　ｍＲＮＡ合成を強く増大させた。ナ イトカイン特異的ｍ　Ｒ，Ｎ　Ａの発現濃度およびそれらの内因性および外因性 ＩＩ、−１０またはＩ　Ｌ−４によるモシュｌノージョンは、表旧に示される対 応するタンパク質の分泌と十分に相関しており、ＩＬ−１０およびＩ　Ｌ−４が 、ＬＰＳで活性化された中球によるサイトカイン発現を転写段階で阻害したこと を示す。

実施例８７ ヒト中球が、ＬＰＳによる活性化後に比較的遅（Ｉｔ、−１０を生産した。：と を実証して、口５−１０か内因性Ｉ１．．−１０　ｍＲＮＡ合成に影響を与えう るがどうかを決定した。ヒト単球を、Ｉレー１０の存在下または不存在下におい てＬＰＳて７時間活性化Ｌ１そしてｒｎＲＮＡ発現をノーサンプロッティングに よって分析した。図１１は、ＩＬ−１，０ｍＲＮＡかｉ、　ｐ　ｓによる活性化 の７時間後に検出されたこきおよびＴ　［、、−、、−１０はＩＬ−１０ｍＲＮ Ａ発現に対してこの時点では阻害作用しないかまたは最小の阻害作用のみり有し たことを示す。対照的に、Ｉ　Ｌ−６およびＩＬ−８ｍＲＮＡの発現はＩＬ−１ ０によって強く阻害さゎず―。

しか（２ながら、単球をＬ　Ｐ　Ｓによっで２４時間活性化させた別の実験系に おいて、１１、−１０は、図１２のノーサン分析によって示されたように、ＩＬ −１０ｍＲＮＡの発現を強く減少させた。更に一５図１２は、中和性抗ｖ−ｉＬ −１，０ｍＡｌ−＋の存在下でのＬＰＳによる単球の活性化が、ＩＬ−４０ｍＲ ＮＡ発現のアップ１ノギユレーシヨンを２４時間で生じたことを示す。これらの 結果は、この後者の実験において用いたＲＮＡを、図１０で示したＰＩ分析にも 用いたので、ＩＬ−１０特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析によっ゛ζ確証さ れた。図１２Ｂにおいて、ノーサン分析によりＩＬ　１０　ｍＲＮＡ発現で観察 された定量的相違は、比較ＰＣＲ分析によって観察されたものと相関したことが 分かる。更に、より感受性のＰＣＲ分析により、培地のみにおいて３７℃で単球 を培養して２４時間後に誘導された低濃度Ｉ　Ｌ−１，ＯｍＲＮＡの検出が可能 になった。これらの結果は、Ｉ　Ｌ　−１，ＯがＩＬ−１０ｍＲＮＡ合成に対し ておよび、ｍＲＮＡ合成文が１１、−１０タンパク質生産に正確に反映する場合 はおそらくヒト単球にょるＩＬ−１０生産に対しても自己調節作用を有すること を示す。しかしながら、ＩＬ−１０生産のダウンレギュレーションは、活性化過 程においてがなり遅れて生じた。ＴＧＦβ　ｍＲＮＡは、新たに単離された活性 化されていない単球において構成的に発現されたものであり、７〜２４時間のＬ ＰＳ活性化によって増大しなかった（図１１および図１２）。更に、図１１およ び図１２は、ＴＧＦβｍ　ＲＮ　Ａの濃度が、ＩＬ−４、ＩＬ−１０または中和 性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在Ｙで活性化を実施１．た場＆に影響を受けなかった ことを示す。

実施例Ｂ８ ＩＬ−１０は、単球によるタラスＩＩＭＨＣ発現に対して自己調節作用を有す細 胞（１０５個）を、Ｖ字型底微ｆｆｉ為定プレー１−　（フロー・ラボラトリー ズ、マクリーン、ＶＡ）中において精製ｍＡｂ　＋’、１ｍｇ／ｍ１）１０μｍ と一緒に４℃で３０５）間インキュベートした。０．０２ｍＭアジ化ナトリウム および１％ＢＳＡ（シグマ、セント・ルイス、ＭＯ）含有ＰＢＳで２回洗浄した 後、細胞を、ヤギ抗マウス抗体（ＴＡＧＯインコーボレーテッド、バーリンゲー ム、ＣＡ）のＦＩＴＣ標識Ｆ　（ａｂ’　）　２フラグメントの１／４ｏ希釈液 と一緒に４℃で３０分間インキュベートした。更に３回洗浄後、標識された細胞 試料をファクスヵン（ＦＡＣ３ｃａｎ）（ベクトン・ディキンソン、サニーベー ル、ＣＡ）でのフローミクロフルオメトリーによって分析した。抗ＭＨＣクラス ＩＩ　ｍＡｂ　ＰｄＶ５．２　（ＨＬＡ、−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ）　、Ｑ５／１３ ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰおよびＬ２４３　（ＨＬＡ−ＤＲ）は前に記載されており、 コーニング（Ｋｏｎｉｎｇ）ら（１９８４）Ｈｕｍ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、−９：　 ２２１〜　；クオランタＩｍｍｕｎｏ１．１２５：２９３〜　を参照されたい。

ＩＬ−１０は、ヒト単球の細胞表面上でのクラスＩＩＭＨＣ分子の発現をダウン レギュレートする。ＩＬ−１０は、構成的１−４またはＩＦＮγに誘導されたＭ ＨＣクラスＩＩ発現をダウ〉レギュレートすることが分かった。単球はＬＰＳに よる活性化後に高濃度のＩＬ−１０を生産するので、内因性ＩＬ−１，０が、Ｌ 　ｐ　ｓて活性化された単球によるクラスＩＩＭＨＣ発現を阻害しうるがどうか を研究した。単球を、中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下または不存在下におい て種々の濃度のＬＰＳて活性化させた。図１３は、ＬＰＳにょる単球の活性化が 、これらの細胞での構成的ｔ（ＬＡ−ＤＲ／ＤＰ発現を用量依存形式で減少させ たことを示す。しかしながら、中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　１９Ｆ１の存在下に おいて、ＨＬＡ−ＤＲ／’ＤＰ発現の強い誘導が観察された。同一の結果がいく つかのＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ特異的ｍＡｂによって観察された 。

これらの結果により、内因的に生したＩＬ−１０は、自己調節的に、ＬＰＳ活性 活性化上ト単球でのクラスＩＩＭＨＣ発現のダウンレギュレーションの原因とな ることが示される。

実験Ｃ ＪＬ−１０は、活性化されたマクロファージによるサイトカイン生産を阻害する 。

この項で示したデータは、本明細書中に参考として完全に包含される、フィオレ ンチノら（１９９１）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４７：３８１５〜３８２２ において、その優先８後に公開された。

概要 ＋Ｌ−１，０は、Ｂ細胞抗原提示細胞（Ａ　Ｐ　Ｃ）以外のマクロファージの、 Ｔｈ１　丁細胞クローンによるサイトカイン合成を刺激する能力を阻害する。マ クロファージ細胞系および正常な腹膜マクロファージ双方に対するＩＬ−１０の 直接作用を研究した。１、ＰＳ（またはＬ　Ｐ　ＳおよびＴＦＮγ）で誘導され た［Ｌ−１、Ｉ　Ｌ−６およびＴＮＦαタンパク質の生産は、２種類のマクロフ ァージ細胞系においてＴＬ−１０によって有意に阻害された。更に、ＩＬ−１， ０は、同様の濃度で加えられた場合のＩ　Ｌ−４よりも強力なモノカイン合成阻 害剤であると考えられる。更に、ＬＰＳまたはＬＰＳおよびＩＦＮγて誘導され たＩＬ−１α、ＩＬ−６またはＴＮＦα　ｍＲＮＡの発現は、半定量的ＰＣＲま たはノーサンプロット分析によって示されたように、ＩＬ−１０によって阻害さ れた。ＬＰＳで誘導されたＩＬ−６分泌のＩＬ−１０による阻害は、ＦＡＣ３精 製腹膜マクロファージにおいて、マクロファージ細胞系の場合よりもあまり顕著 ではなかった。しかしながら、腹膜マクロファージによるＩＬ−６生産は、抗Ｉ Ｌ−１０抗体の添加によって増加し、ＬＰＳ活性活性化上ノ力イン合成の内因的 減少を引起こす内因性ＩＬ−１０がこれらの培養物中に存在することを意味した 。更に、ＬＰＳに刺激された腹膜マクロファージは、エリザによって検出可能な ＩＬ−１０を直接的に生産することが分かった。ＩＦＮγは、ＬＰＳに刺激され た腹膜マクロファージによるＩＬ−６生産を増加させることが見出され、そして これはこの同一細胞集団によるＩ　Ｌ　−１，０生産のその抑制の結果であると 考えられる。モノカイン合成に対するその作用に加えて、ＩＬ−１０は、更に、 ＩＦＮγに刺激された腹膜マクロファージにおける有意の形態変化を引起こす。

マクロファージに対する、特に、モノカイン生産段階でのＩＬ−１０の強力な作 用は、Ｔ細胞応答の調節においてのみならず急性炎症性応答においても、このサ イトカインに関する重要な役割を示している。

ＩＬ−１，０は、Ｔｈｌ　Ｔヘルパー細胞によるマクロファージＡＰＣ依存すイ ト力イン合成を阻害し、種々の他の細胞に対して多面的作用を示し、そして他の 細胞によって生産されるＴｈ２　Ｔヘルパー細胞クローンによって生産されたサ イトカインとして最初に記載された。Ｔｈｌ細胞はＩＬ−２およびＩＦＮγを分 泌し且つマクロファージ活性化および遅延型過敏症（ＤＴＨ）を優先的に引起こ し、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４およびＩＬ−５を生産し且つＢ細胞応答を助ける。い ったん活性化すると、それぞれの種類のＴｈ細胞は、他方の増殖および／または 機能を調節することができる。このような交差調節は種々のサイトカインによっ て媒介され、そしである種の抗体およびＤＴＨ応答が相互に排他的でありうると いう観察報告に対する説明を与える。ＩＬ−１０は、Ｂ細胞以外のマクロファー ジに作用して、ＴｈＬクローンによるサイトカイン合成を阻害し、しかもＩＬ− １０はマクロファージに対して直接作用を及ぼす。

マクロファージ生産物、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαは、感染ま たは組織損傷の際に引出された多数の炎症性応答および免疫学的応答に関係して いた。ＴＮＦαおよびＩＬ−１は、様々な細胞種において多数の代謝変化を更に 引起こす内因性発熱物質である。更に、ＩＬ−１およびＩＬ−６は、肝急性期タ ンパク質の合成の主要な誘導物質である。以下の実施例は、１Ｌ−１０が、ＬＰ Ｓで活性化されたマクロファージによるＩＬ−１、ＴＮＦαおよび１Ｌ−６など のサイトカイ：／の生産を阻害することを示す。したがって、ＩＬ−１０は、Ｔ 細胞活性化におけるその役割に加えて、マクロファージ機能を調節することによ って炎症性応答においても重要な役割果たしているう実施例Ｃ１ ■１、−１０は、種々９Ｚクロフアージ系のＡＰＣ機能を阻害する。

サイトカイン 精製した組換体ｍｌｌ、−１αは、Ｐ、　ｏメディコ（Ｌｏｍｅｄ　ｉ　ｃｏ） 、、ホフマン・ラ−ロ−７シュ（Ｈｏ　ｆ　ｆｍａｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅ）　、 ナラトリー、ＮＪから惜しみなく贈与された。組換体ｍ１Ｌ−２およびｍ１ＦＮ γは、シエリング・リサーチ、ブルームフィールド、ＮＪから入手した。Ｍ、ピ アス（Ｐｅａｒｃｅ）、ＤＮＡＸにより快く提供された組換体精製マウス！Ｌ− ６をＣｏ５７細胞において発現させ且つイムノアフィニティー精製した。マウス ＴＮＦαはジエンウイム・コーポレーション（ボストン、ＭＡ）から入手した。

前記に記載のＦ１１５ｃＤＮＡクローンおよび模擬トランスフェクトした細胞か らの対照上澄みを用いてＣＯ５７細胞をトランスフェクトすることによって得ら れた組換体マウスＩＬ−１０（Ｃ５ＩＦ）を、特に断らない限り最終濃度２％で 用いた。或いは、ウォーレン・ダンク（Ｗａｒｒｅｎ　Ｄａｎｇ）により快く提 供された組換体マウスＩＬ−１０を大腸菌において発現させ、そして５ＸＣ２抗 ＩＬ−１０抗体を用いてアフィニティー精製した。

抗体 ＩＦＮｙ（ＸＭＧｌ、２）に対する中和性単クローン性抗体（ｍＡｂ）およびＩ Ｌ−１０（ＳＸＣＬ）を用いた。チェルヴインスキ−（Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ） ９３８〜２９４５を参照されたい。５ＸＣ−１に関するイソタイプ適合対照であ るＪ５は、ロバート・コツマン（Ｒｏｂｅ　ｒ　ｔ　Ｃｏ　ｆ　ｆｍａｎ）（Ｄ ＮＡＸ）により快く提供された。Ｉ　Ｌ−６に対する単クローン性抗体（２０Ｆ 　３および３２Ｃ１１，＞（スターンズ（Ｓｔａｒｎｅｓ）ら（Ｌ９９０’）Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４５　：　４１８５〜４１９１を参照されたい）およびＴＮＦαに対する単ク ローン性抗体（ＭＰ６．ＸＴ３．１１およびＸＴ２２．１１）は、ジョーン・エ イブラムズ（Ｊｏｈｎ　Ａｂｒａｍｓ）（ＤＮＡＸ）によって精製され且つ豊富 に提供された。ＦＡＣＦＪｔ別用に用いた抗体としてはラット抗マウスＢ２２０ （ＲＡ３−６Ｂ２）　（：ｌフマンら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２８９：６８ １〜６８３を参照されたい）およびラット抗マウスＭａｚ−Ｌ　（Ｍｌ、／７０ ）（スブリンガ−（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら（１９７８）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、８＋５３９〜・５４２を参照された（りがあった。Ｆ　ｃ　−ｇＲに対す るラット抗マウス単りローン性抗体は２．４Ｇ２であった。アンケレス（ｔＪｎ ｋ、ｅｌｅｓｓ）（１９７検定用培地（ｃＲＰＭＩ）は、１０％熱失活ウシつ児 血清（Ｆｅ２）（Ｊ、Ｒ。

サイエンティフック・インコーホレーテッド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ、 ））含有ＲＰＭ１１６４０　（Ｊ、Ｒ，サイエンティフック・インコーホレーテ ッド、ウッドランド、ＣＡ）　、０．０５ｍＭ　２−ＭＥ　（シグマ・ケミカル ・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）およびＬＯｍＭヘペス緩衝液（ギブコ・ ラボラトリーズ（Ｇｉｂｃｏ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、グランド・アイラ ンド、ＮＹ）から成った。Ｔ細胞増殖用に、組換体ｍ１Ｌ−２（３３０Ｕ／ｍｌ ）をｃＲＰＭＯ■に対して加えた。

抗原 パシフィック・バイオ・マリン・ラボラトリーズ・インコーホ１ノーテツド（Ｐ ａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏ−Ｍａｒｉｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｊｅｓ、Ｉｎｃ。

）（ペニス、ＣＡ）またはカルビオケム・ラブダ（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＬａｂ ｓ）（う・ホヤ、ＣＡ）から入手したスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）を最 終濃度１００〜５００μｇ／ｍｌで用い月つシグマからのオボアルブミンを最終 濃度１ｍｇ／ｍｌで用いた。

（Ｋａｐｐｌｅｒ）ら（１９８１）Ｊ、Ｅｘｐｔ’　ｌ　Ｍｅｄ、１５３：１１ ９８〜　を参照されたい）をサイトカイン合成（Ｃ３ＩＦ）阻害検定に用いた。

Ｃ，ジエンウェイ（Ｊａｎｅｗａｙ）（ｚ−ル大学、ニューヘブン、ＣＴ）から 入手したＴｈ２りＯ−：／ＤＩＯ，Ｇ４．１　（ＤＩＯ）　、ＡＫＲ／Ｊ抗ｒン アルブミン（ケイ（Ｋａｙｅ）ら（１９８３）Ｊ、Ｅｘｐｔ’　Ｉ　Ｍｅｄ、１ ５３：８３６〜８５６を参照されたい）をＩＬ−１検定に用いた。スダ（Ｓ　ｕ 　ｄ　ａ）ら（１９８９）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１２０：１７ ：３−１７８を参照されたい。全クローンを、抗原（Ａ　ｇ）および照射された ＡＰＣを用いる周期的刺激によって維持した後、ＩＬ−２含有培地において増殖 させた。チェルヴインスキーら（１９８７）Ｊ、Ｅｘｐｔ’　ｌ　Ｍｅｄ、を参 照されたい。クローン化ＩＧ、１８．ＬＡマクロファージ細胞系（Ｈ−２ｄ）は 胸腺支質細胞培養物由来であって、２０％Ｌ細胞上澄み中で維持された。ＰＵ５ ．ｔマクロファージ１１９　：　９５０〜９５４を参照されタイ）を、１０％Ｆ Ｃ３含有ｃＲＰＭＩ中で維持した。ＡＰＣとして用いるのに、細胞系１Ｇ、１８ ．ＬＡおよびＰＵ５．　１をＩＦＮ７　（０，５〜２ｎｇ／ｍｌ）と−緒に２０ 〜２４時間活性化させた。ＴＮＦαおよびＴＮＦβに対して応答性であるＷＥＨ Ｉ、１６４．１３細胞系（エスペビク（Ｅｓｐｅｖｉｋ）ら（１９８６）Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ。

％１ｅｔｈｏｄｓ　６５：５５〜６３を参照されたい）をｃ　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　／ 　５％ＦＣ３中で維持した。

サイトカインの免疫定量検定 サイトカイン濃度（Ｉ　Ｌ−６、ＩＦＮ７およびＣ３Ｉ　Ｆ／Ｉ　Ｌ−１０）を 、二層サンドウィッチェリサ形式で測定した。

生物検定 比色定量ＭＴＴ増殖検定を、ＴＮＦα（ＷＥＨｒ　１６４．１３細胞）、ＩＬ− ２（ＨＴ−２細胞）および■Ｌ−１（Ｄ１ｏ細胞）（全検定に細胞１０４個／ウ ェノりの生物検定に用いた。活性は、既知の標準に相対する単位／ｍｌかまたは ｐｇ若しくはｎｇ／ｍｌとして表わされる。それぞれの場合において、単位／ｍ １は、その生物検定の最大応答の５０％を生じる具体的なサイトカインの量を表 わす。

Ｔｈｌサイト力イレイン合成導および測定Ｔｈｌ、ＨＤＫ、１細胞＊たはＤｏ− １１，１０Ｔ細胞ハイプリドーマ細胞１〜５Ｘ１０　個を、９６ウ工ル平底微量 滴定トレー中の全容量２００μＩ／ウエル中において抗原存在下または不存在下 で種々の数の生存ＡＰＣと混合した。

サイトカイン濃度を２０時間または４８時間の上澄み中において測定した。

マクロファージ細胞系の刺激 マクロファージ細胞系ＩＧ、１．８．　ＬＡおよびＰＵ５，１を静かに掻取るこ とによって採集し、洗浄し、そして９．５ｃｍ組織培養皿（ベクトン・ディキン ソン、Ｎ　Ｊ）　中（７）　ｃ　ＲＰＭ　Ｉ　１５％Ｆ　ＣＳ中４；：細胞１０ 　”Ｍｌｍ　ｌ　テ、５％ＣＯ７９５％空気中において３７℃てＲＮＡ発現用に ６時間または上澄み中のサイトカイン検出用に２４時間再懸濁させた。ＬＰＳに よる刺激は、ＩＬ−１０（２００単位／ｍｌ）またはＩＬ−４（２００単位／ｍ ｌ）の存在下または不存在下において１０μｇ　／　ｍ　Ｉ　ｓまたは若干の場 合、ＬＰＳおよびＩＦＮｙを１００単位／ｍｌであった。上澄みを集め、遠心分 離しく８００ｘｇ）、そして−８０℃で貯蔵した後、ＩＬ−１、ＩＬ−６および ＴＮＦαの濃度を検定するのに用いた。

更に、マクロファージ細胞系をＩＦＮｙで上記のように２４時間刺激し、若干の 場合は更に、Ｔｈｌクローン、ＨＤＫ、１およびその特異的抗原ＫＬＨの存在下 において２４時間刺激した。この場合、上澄みを、１０．ＯＯＯＭＷカットオフ の膜を有するアミコン（ＡＭＩＣＯＮ）フィルターを用いて更に濃縮し、そして イムノアフィニティーカラムを用いてＩＬ−２およびＩＦＮｙを除去した。次に 、これらの上澄みおよび濃縮工程からのフロースルーの、抗原特異的およびＡＰ Ｃ依存性Ｔｈｌサイトカイン合成を同時刺激する能力を検査した。更に、ＡＰＣ として用いるために、マクロファージ細胞系ｌＧ１８．ＬＡおよびＰＵ５．１を 最初にＩＦＮｙ　（０，５〜２ｎｇ／ｍｌ）で２０〜２４時間活性化した。

１−１０は、正常な腹膜若しくは牌臓マクロファージまたはマクロファージ細胞 系ｌＧ１８．ＬＡをＡＰＣとして用いた場合、Ｔｈｌ細胞によるＩＦＮγ生産を 刺激するＡＰＣの能力を阻害する。ＩＬ−ｉｔ）は、ｌＧ１８．ＬＡとは由来が 異なるＰｔＪ５，１マクロフアージ系に対しても有効であるが（図１４）、Ｔｈ 】細胞に関してＡＦ’ＣとしてＰｔＪ５，１細胞系を用いて達成された刺激は、 ＩＧｌＢ、ＬＡマクロファージ細胞系で観察されたほど大きくはなかった。図１ ４Ｂは、１Ｇ１．８．ＬＡ細胞系が、Ｔｈｌクローンおよびオボアルブミン特異 的Ｔ細胞ハイブリドーマＤｏ１１．１０双方によるＩＬ−２生産の抗原特異的誘 導を媒介することもできるということを示す。双方の刺激はＩＬ−１０によって 有意に阻害された。

実施例Ｃ２ ＩＬ−１０はＩＦＮγに刺激された腹膜マクロファージにおける形態学的変化を 誘導する。

腹膜マクロファージの精製および刺激 腹膜細胞は、冷ｃＲＰＭＩ／１０％ＦＣ３７ｍｌを注射し且つ抜取ることによ１ ０単クロ一ン性抗体またはＩＦＮγの存在下または不存在下においてＬ　Ｐ　Ｓ 　１のＴＮＦαおよびＩＬ−６を、エンザイムリンクドイムノアツセイを用いて 検定した。

ＦＡＣ８精製腹膜マクロファーンを、ＩＬ−１０の存在下または不存在下におい てＩＦＮγと一緒に種々の時間インキコベートした。次に、上澄みを除去し、細 胞を自然乾燥させ、固定し、そしてライト・ギムザて染色し、た。図１５に示し たように、ＩＬ−１０は細胞の成熟および脱付着性を引起こし、それはマクロフ ァージＡＰＣ機能の阻害に関して重要でありうる。

実施例Ｃ３ ｌＬ−１０は、活性化されたマクロファージ細胞系による生物学的に活性のまた は分泌されたサイトカインの生産をダウンレギュレートする。

初期の知見は、ＩＬ−１０か、ノＮＰＣとして機能し且つＴｈｌサイトカイン合 成を活性化するマクロファージの能力に対して直接的に作用することを示唆して いる。これらのマクロファージ細胞系によるモノカイン生産に対するＩＬ−１０ の直接作用を検査した。ＩＬ−１０の存在下または不存在下においてＩＦＮγ、 ＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳで刺激されたマクロファージ細胞系から集め られた上澄みの、１種類または複数のサイトカインの濃度を検査した。可能な場 合、Ｔ　Ｌ　−４を対照として用いたが、それはこの因子が活性マクロファージ によるサイトカイン生産を阻害することが分かっていたからである。ＩＦＮγ単 独によるマクロファージ細胞系の刺激は、上澄み中のモノカイン、ＩＬ−１，Ｉ Ｌ−６またはＴＮＦαの検出可能な濃度をもたらさなかった。対照的に、ＬＰＳ またはＬＰＳおよびＩＦＮγは、有意の濃度のこれらのサイトカインをもたらし た（図１６）。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）不存在下で実施した、ＩＬ−１を 検出するのに用いられるＤＩＯ，Ｇ４．１検定では、マクロファージによって発 現される他のサイトカインは検出されない。マクロファージ細胞系ＩＧ、１８． 　ＬＡおよびＰＵ５．１は、ＬＰＳによる誘導後にＩＬ〜１生物活性を生じるそ れらの能力が双方とも有意に阻害された（図１６）。更に、ＩＬ−１０は、ＷＥ ＨＩ。

１６４．１３．生物検定において実証されたように（これらのマクロファージ上 澄み中の活性は全て、特異的阻止抗体を用いるＴＮＦαに起因することが分かっ た）、双方のマクロファージ細胞系の上澄み中においてＬＰＳまたはＩＦＮγお よびＬＰＳに誘導されたＴＮＦαの生産に対して極めて有意の阻害作用を有する 。

同様に、ＩＬ−１０は、ＩＬ−６に関するエンザイムリンクドイムノアッセイに おいて測定されたように誘導されるＬＰＳを加えたＩＦＮγおよび／またはＬＰ Ｓによって刺激されたマクロファージ細胞系によるＩＬ−６タンパク質の生産を 阻害する。全実験において、検査されたｉｆ、−１０は、ＬＰＳまたはＩＦＮγ およびＬＰＳに誘導されたモノカイン生産に対して（タンパク質濃度で）ＩＬ− ４よりもはるかに有意の阻害作用を有した。

実施例Ｃ４ ＲＮＡ発現およびＲＮＡの分析 中細１ｉ’ｄＲＮＡを、イ・、！チオシアン酸グアニジニウム法を用いてマクロ ファージ細胞系から抽出した。ＲＮＡｆｉ度を２６０ｎｍでの吸収によって測定 しｔこ。ＲＮＡプロ・ノド分析は、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら（１９９０）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ　２４８：１２３０〜１２３４に記載されたように、または逆転写され ｔこＲＮＡのＰＣ試寧１（２０分の１の希釈度のｃＤＮＡ）をサーマラーゼ（サ ーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｒｎｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリ メラーゼ）（ＩＢＩ）２．５単位およびシータス／′パーキン・エルマーサーモ サイクラ−を用０て以下、すなわち、９４℃で３０秒間の融解：５５℃で３０秒 間のアユ−１ノング；および７２℃で１分間の伸長の条件下において、以下に示 したようなＨＰＲＴ（／−ウスキーピング酵素）　、ＴＮＦαおよびＩＬ−６に 特異的なプライマーを用（１て増中晶させた。すなわち、Ｈｒ’ＲＴセンス：　 ５’　−ＧＴＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣＡＧＴ　ＣＡＡ　ＣＧＧ　ＧＧＧ　ＡＣ−３’ （ｎｔ４２２〜４４４）：ＨＰＲＴアンチセンス：　５′−ＣＣＡ　ＧＣＡ　Ａ ＧＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＴＴＴＡＡＣＣＡ−３’　（ｎｔ５９８〜５７５）；Ｈ ＰＲＴプローブ：　５’　−ＧＣＴ　ＴＴＣＣＣＴ　ＧＧＴＴＡＡＧＣＡＧＴＡ ＣＡＧＣＣＣＣ−３’　（ｎｔ５４３〜５７０）；ＴＮＦαセンス：　５’　− ＧＣＧＡＧＣＴＣ，Ｇ　ＡＡＣＴＧＧ　ＣＡＧ＾＾Ｇ−３’　（ｎｔ４４９９〜 ４５１９）；ＴＮＦａアンチセンス−＋５’−ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＡＣＣＣＡＴ　 ＣＧＧ　ＣＴＧ　ＧＣＡ−３’　（ｎ　ｔ　５８６５−５８４５）　；　ＴＮＦ ａプローブ：　５’　−ＣＡＧ　ＴＴＣＴＡＴ　ＧＧＣＣＣＡ　ＧＡＣＣＣＴ　 Ｃ−３’　（ｎ　ｔ　５８０１〜５８２１、）；ＩＬ−６セン７、　＋　５’　 −ＣＣＡ　ＧＴＴ　ＧＣＣＴＴＣＴＴＧ　ＧＧＡ　ＣＴＧ−３’　（ｎ　ｔ　１ ５２０−１３４０）；ＩＬ−６アンチセンス：　５’　−ＧＧＴ　ＡＧＣＴＡＴ 　ＧＧＴ　ＩへＣＴ　（１，ｃ＾−３’（ｎｔ６０９３〜６０７５）；ＩＬ−６ プローブ：　５’　−ＧＴＧ　ＡＣ＾＾ＣＣＡＣＧ　ＧＣＣＴＴＣＣＣＴ　ＡＣ Ｔ−３’（ｎｔ１５４７〜１５７０）。

プライマーはいずれも、遺伝子中の介在配列を伸長させｔこ。感受性および特異 性は、増幅した生成物のド・ソトブロ・丹を、増幅した生成物１こ対して内在す る放耐性標識（−ｐ、γ−ＡＴＰ）オリゴヌクレオチドでプローブ１−ることに よって更に増大した。放射能プロ・ントを、アンビス・イメージ・スキャナー（ Ａｍｂｉｓ　Ｉｍａｇｅ　５ｃａｎｎｅｒ）を用（１て定量し、そしてＸ線フィ ルムに暴露することによって可視化した。それぞれの場合にお０て、Ｐ３Ｂ８Ｄ １　ＲＮＡの標準曲線は、検定の再現性を確実にするように包含され、そして最 終ドツトプロットにおける導入ＲＮＡのｐｇに相対する任意の単位をそれから得 た。更に、ハウスキーピング酵素ＨＰ　ＲＴの内部標準を用いて、正確に同量の ＲＮＡを用いることおよび全試料を逆転写し且つＰＣＨによって同じ効率で増幅 させることを確実にした。

ＲＮＡは、マクロファージ細胞系１．Ｇ１８．ＬＡおよびＩ’ｌＪ５．　１から 、ＩＬ−１０またはＩ　Ｌ、−４の存在下または不存在下でのＬＰＳまたはＬＰ Ｓおよび■ＦＮγによる刺激後に抽出された。全ＲＮＡ１０μｇのＲＮＡプロッ ト分析は、ＩＬ−１０か、双方の細胞系において、後者の場合ある程度少ないが 、ＬＰＳまたはＩＦＮγおよびＬＰＳによって誘導されたＴＮＦα　ＲＮＡの発 現をダウンレギュレートしたことを示した（図１７）。これは、双方の細胞系か らの逆転写ＲＮＡを分析するのに半定量的ＰＣＨ法を用いることを確立した。表 ０１に記載の各サイトカインの標準曲線を含むことにより、各ドツトに示された 全標準ＲＮＡのｐｇに相対する任意の単位を得て、それによって数字によるデー タを示すことが可能であった。表０１は、１１．−１０およびＩＬ−４が、マク ロファージ細胞系ｌＧ１８．ＬＡにおけるＬＰＳで並びにＩＦＮγおよびＬＰＳ て誘導したＴＮＦαの発現を阻害することを示す。これは、標準曲線の直線部分 から得られた値によって最もよく図示され、そして表０１の説明文は、数的デー タを誘導するのに用いられた方法を説明する。同様の方法を用いる、ＬＰＳ並び にＩＦＮγおよびＬＰＳに応答したマクロファージ細胞系ＰＵ５．ｉによるＲＮ Ａ発現の分析は、更に、Ｉ　Ｌ−６およびＴＮＦαの発現もＩＬ−１０によって 阻害されたことを示した（表Ｃ２）。

戦　１−○　ρ 実施例Ｃ３ Ｔｈｌ細胞に対するＡＰＣ機能に関してＩＬ−１０によって阻害されることが既 に分かっている腹膜マクロファージ（Ｍａｃ−１およびＢ２２０基準で選別され た）（Ｍａｃ−１＋（魚η明）；Ｂ２２０　）を、ＬＰＳに応答したＴＮＦａお よびＩ　Ｌ−６の生産に関して更に検査した。ＴＮＦａは、ＬＰＳに刺激された ＦＡＣ３選別マクロファージの上澄み（細胞密度、細胞７ｘ１０５個／ｍｌ）中 において検出することができなかった。対照的に、有意の濃度のＩＬ−６が、上 記のようにＬＰＳに刺激されたマウスＢＡＬＢ／ｃまたはＣＢＡ／Ｊからの腹膜 マクロファージから得られた上澄み中において検出可能であった（図１８）。細 胞を１−１０の存在下においてＬＰＳによって刺激した場合、ＩＬ−６濃度は減 少したが、意外にも、その阻害の程度は、マクロファージ細胞系（図１６）で観 察されたよりもあまり顕著ではなかった（図１８）。しかしながら、ＬＰＳによ って誘導されたＩＬ−６生産濃度は、ＬＰＳ刺激においてＩＬ−１０に対して向 けられた単クローン性抗体を包含することによって増加させることができた（図 １８）。マクロファージがＬＰＳに応答してＨ，−１，０を生産したことは、Ｉ Ｌ−１０に特異的なエリザで確証された（上記のようにＬＰＳに刺激されたＣＢ Ａ７勺またはＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ腹膜マクロファージは、ＩＬ−１０をそれ ぞれ２単位／ｍｌまたは４．５単位／′ｍ１生産した）。

図１８は、更に、精製されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ腹膜マクロファージが、Ｌ ＰＳ単独で刺激された場合に対立するものとしてＩＦＮγの存在下でＬＰＳに刺 激された場合に高濃度のＩＬ−６を生産することを示す。これは、ＢＡＬＢ／ｃ マウスからの腹膜マクロファージによるＩＬ−１０生産についての更に別の実験 の結果によって説明することができる。この場合、ＬＰＳに刺激されたマクロフ ァージはＩＬ−１０を１２単位７’ｍｌ生産し、そしてこれは、細胞をＩＦＮγ の存在下でＬＰＳによって刺激した場合、３単位７”ｍ１未満まで減少した。

実施例Ｃ６ マクロフアージＡＰＣ機能のＩＬ−１０阻害に関する可溶性同時刺激剤の機序試 験 ＩＬ−１０は、生存抗原提示細胞（ＡＰＣ）（マクロファージ）の存在下におい てＴｈｌサイトカイン合成を阻害するだけである。ＩＬ−１０作用の一つの可能 な機序は、Ｔｈｌ細胞からの最適サイトカイン放出に必要とされる可溶性補助因 子の生産の抑制である。上澄みは、Ｔｈｌ細胞および特異的抗原の存在下または 不存在下においてＩＦＮγに刺激されたマクロファージから得られた。このよう な上澄み（図］９Ａ）またはそれらの濃縮の際に生じたフロースルーは、Ｔｈ１ 細胞に対するマクロファージＡＰＣ機能のＩＬ−１０に媒介された阻害を逆行さ せることができなかった。これらのデータは、ＩＬ−１０が、Ｔｈｌサイトカイ ン合成に必要な可溶性同時刺激剤をダウンレギュレートするという証拠を与えな い。同様の実験は、ＩＬ−１０が、Ｔ細胞に対して直接的に作用する可溶性阻害 因子をマクロファージに生じさせるという証拠を与えないが、このような阻害剤 は不安定でありまたは膜に結合していることがある。これを検査するために、細 胞混合実験を以下のように実施した。牌臓Ｂ細胞およびマクロファージをＦＡＣ ８選別した（Ｂ２２０およびＭａｃ−１基準で）。勾配用量のマクロファージを 、Ｂ細胞の存在下または不存在下、更にはＩＬ−１０の存在下または不存在下に おいてＨＤＫ、１細胞の抗原特異的刺激のためのＡＰＣとして用いた。Ｔｈｌす ・イトカイン合成のＢ細胞以外のマクロファージ刺激は、Ｉ　Ｌ−１０によって 阻害された（図１９Ｂ）。勾配用量のマクロファージと一定数のＢ細胞との混合 により、Ｔｈｌサイトカイン合成の追加の刺激が得られたく図１９Ｂ）。しかし ながら、ＡＰＣのこの混合物に対するＩＬ−１０の添加は、Ｔｈｌサイトカイン 合成濃度をＢ細胞ＡＰＣ単独で達成された濃度まで低下させただけであって、そ の観察報告は、Ｔｈｌ細胞に対して直接的に作用する近距離若しくは不安定な阻 害剤、またはＢ細胞ＡＰＣの存在に反論するものである。

実験Ｄ ＩＬ−１０は、超抗原に誘導された致命的なショックからマウスを防護する。

概要 マウスモデルにおいてブドウ球菌性エンテロトキシンＢ　（ＳＥＢ）によって誘 導された致命的なショックに対する保護におけるＩＬ−１０の役割を研究した。

ＩＬｉ、Ｏによるマウスの予備処置は、ＳＥＢおよびＤ−ガラクトサミンを注射 した後のマウスの致死を防止した（後者は、ＳＥＢに対するマウスの自然の抵抗 性を克服するのに必要であった）。この効果は、ＩＬ−１０が、好ましくは、Ｔ 細胞を活性化するマクロファージの能力を阻害するその能力によって、インビボ での細胞活性化を阻害することができるということを示す。

超抗原は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβに特異的な方法で、ＴｃｒＶβ鎖とクラ スＩＩＭＨＣ分子のＢ鎖とを結合することによってＴ細胞を活性化するＴ細胞マ イトジェンである。超抗原には、ネズミ乳がんウィルスによって生産された内因 性分子と、黄色ブドウ球菌によって生産されたもののようなエンテロトキシンを 含む外因性超抗原とがある。超抗原の毒性作用は抗原提示細胞（Ａ　Ｐ　Ｃ）の 存在に依る。近年、これらの毒素の毒性作用は、それらのＴ細胞マイトジェン活 性ゆえに、インビボで実証されてきた結論であると認識されている。

ＩＬ−１０は、種々の細胞系において多面的な活性を示すサイトカインである。

これらには、ネズミＴ細胞およびマスト細胞に対する成長補助因子、Ｂ細胞中の Ｉａ誘導およびＴ細胞活性化を阻害するその能力がある。後者の作用は、ＡＰＣ として作用するマクロファージの能力を阻害することにより、間接的であること が実証されている。この作用は、ＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＩＬ６のようなサイ トカインを生産するそれらの能力を含むマクロファージ機能に対するＩＬ−１０ の一般的な阻害作用の一部分であると考えられる。

本実験では、Ｔ細胞に媒介された致命的なショックのインビボモデルとして、マ ウスにおいてブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に誘導されたショック を用いた。このモデルにおいて、マウスは、Ｄ−ガラクトサミンによる予備処置 によってＳＥＢの毒性作用に対して感受性にされた。この処置は、おそらくは肝 臓クリアランス機序に影響を与えることによって、エンテロトキシンに対してマ ウスが有している自然の抵抗性を低下させる。引続き少用量のＳＥＢを投与する と２日以内に致死する。このモデルにおいて、毒性は、ＴＮＦα生産を生じたＴ 細胞が重要な役割を果たしていることが分力じている大型のＴ細胞活性化による ことが分かる。ＩＬ−１０によるマウスの処置は、おそらくはマクロファージ依 存Ｔ細胞活性化を阻害するその能力により、ＳＥＢに媒介された毒性を阻害する 。

実施例ＤＩ ＩＬ−１０は、インビボでのＳＥＢ媒介毒性を防止する。

ヱ２各 ４〜５週令の雄のＢＡＬＢ／ｃ　Ｈ−２ｄマウスを、シモンソン・ラボラトリー ズ（Ｓｉｍｏｎｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ギルロイ、カリフォルニ アから購入した。

試薬 用いた材料は以下であった。ネズミインターロイキン１０（ｍＩＬ−１０）は、 ＤＮＡＸリサーチ・インスティテユート（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ）（パロ・アルド、ＣＡ）のサティシュ・メノン（Ｓａｔｉｓｈ　Ｍｅｎｏｎ） による標準的な操作によって製造した。Ｄ（＋）−ガラクトサミン（Ｇ−０５０ ０）は、シグマ、セント−ルイス、ＭＯから購入した。最初の実験で用いたブド ウ球菌性エンテロトキシンＢ　（ＳＥＢ）もシグマから購入した。次の実験で用 いたＳＥＢは、トキシン・テクノロジー（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） 、？ディソン、ＷＩＳから、Ｐ、ヒユーゴー（Ｈｕｇｏ）（Ｎａｔｉｎａｌ　Ｊ ｅｗｉｓｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒＩｍｍｕｎｏ　Ｉ　ｏｇｙ、デンバー、Ｃｏ 、）によって快く提供された。材料は全て平衡塩溶液中で希釈した。

処置 ４〜５週令の雄マウスに、種々の濃度のｍ１Ｌ−１０を注射した（腹腔内）。

３〜４時間後、同マウスにＤ−ガラクトサミンを注射した（腹腔内）。２回目の 注射の１時間後、マウスにＳＥＢを数種類の濃度で注射した。注射後２４時間、 ３６時間および４８時間にマウスを観察した。

最初の実験により、ＩＬ−１０はインビボでのマウスモデルにおいてＳＥＢの毒 性を変化させることが確証された。予備実験は、このモデルにおいて高死亡率を 観察するのに必要とされるＳＥＨの最小用量を決定することに向けて計画された 。この用量は、ＳＥＢの由来（供給者）およびロフトに応じて変化した。この用 量をある与えられたロットのＳＥＢに関していったん決定したら、ＩＬ−１０（ １０μｇ／マウス）による予備処置を検査した。図２０は、ＩＬ−１，０による 予備処置の結果として、５ＥＢＩＯμｇ／マウスを注射された全マウスが生き残 ったことを実証する。ＩＬ−１０による予備処置は、５Ｅ８２０μｇ／マウスを 注射された被験動物の最終の致死を防止しなかったが、それらの生存を延長させ た。

実験Ｅ インターロイキンＩＯは、致命的な内毒素血症からマウスを防護する。

概要 ＩＬ−１０は、インビトロでのＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦαの生産を減少 させ、そしてマウスにおけるＩＬ−１０の中和は、同すイトカインの増加をもた らす。本実験は、ＩＬ−１０のこのモノカイン抑制性が、ＬＰＳに誘導されたシ ョックであるモノカインに媒介された炎症性反応からマウスを防護する能力を与 えるかとうかを検査する。組換体ネズミ５Ｌ−１０の０．　５〜１μｇを１回注 射することにより、再現性をもってＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを内毒素の致 命的な腹腔内注射から防護した。この結果は、ＩＬ−１０を内毒素の注射と同時 に投与しても、または３０分後に投与しても得られた。ＩＬ−１０の防護作用は 、中和性抗ＩＬ−１０抗体の先行注射によって逆行し且つ内毒素に誘導されたＴ ＮＦα放出の実質的な減少と相関した。これらのデータは、ＩＬ−１０を細菌性 敗血症の治療のための候補として、更に一般的には有効な抗炎症薬として暗示す る。

いくつかの細菌感染は、低血圧症、発熱、組織壊死、広範囲にわたる器官機能不 全および最終的な致死を含む大きな生理学的変化を引起こすことがある。グラム 陰性細菌の場合、この毒性は、細菌の細胞壁のリポ多糖（ＬＰＳ）成分である内 毒素による。実際に、適当な用量のＬＰＳをウサギ、マウスおよび他の動物に注 射すると、敗血症性ショック症候群に典型的な変化か生じ、したがって、この炎 症性反応の簡単な動物モデルが得られる。単クローン性抗体かまたはＩＬ−ＩＲ ａと称する生理学的ＩＬ−１アンタゴニストを用いてこれらのモノカインを中和 することによって動物を細菌および内毒素に誘導されたショックから防護するこ とができるので、内毒素に誘導された毒性は、内毒素に刺激されたマクロファー ジ／単球からのＴＮＦα、ＩＬ−１および／またはＩ　Ｌ−６の放出によると考 えられる。

インターロイキン１０（ＩＬ−１０）は、ヘルパーＴ細胞およびＮＫ細胞による ＩＦＮγ生産の抑制；胸腺細胞、マスト細胞およびＢ細胞の成長同時刺激；並び にモノカイン生産の抑制を含む多数のインビトロの性質を有する。後者の性質に 関して、ＩＬ−１０は、ヒト単球およびマウス腹膜マクロファージにょるＴＮＦ α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＧＭ−Ｃ３Ｆの誘導さ れた生産を大きく抑制する。対照的に、ＩＬ−１０は、単球にょるＴＧＦβの構 成的発現に対して作用しないし、事実上、ＩＬ−Ｊ、Ｒａの単球生産をアブレギ ュレートする。これらのインビトロのデータは、特異釣車クローン性抗体を用い るＩＬ−１０の中和が、マウスにおける循環性ＴＮＦαおよびＩＬ−６の濃度を 増大させることを示すインビボの実験によって支持される。ＩＬ−ＩＲａを増加 させる能力と組み合わされたＴＮＦα、１１．−１およびＩＬ−６の生産を抑制 するＩＬ−１ｏの能力が、内毒素に誘導されたショックに対してマウスを防護し うるこのサイトカインを与えるかどうかを検査した。

実施例Ｅ１ ８週令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、シモンセン・ラボラトリーズ（Ｓｉｍｏｎｓ ｅｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ギルロイ、ＣＡ）から入手した。

試薬 大腸菌血清型ＯＪ】１・Ｂ４　からのリボ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）は、シグマ・ケミ カル・カンパニーから購入した。組換体ネズミＩＬ−１０を大腸菌において発現 させ、そしてアフィニティー精製およびイオン交換クロマトグラフィーによって 高比活性に精製した。この材料は最小の内毒素を含み且つ４℃で少くとも４か月 間安定した状態のままであった。ネズミＩ　Ｌ−１０の非活性は、サイトカイン 合成阻害検定（フィオレンチノら（１９８９）Ｊ、Ｅｘｐｔ’　１．Ｍｅｄ、１ ７０：２０８１〜２０９５を参照されたい）およびＭＣ／９マスト細胞同時刺激 検定（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）−スナイプス（Ｓｎｉｐｅｓ）ら（１９ ９１）Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７３：５０７−５１０を参照されたい）双方で評 価された。中和抗体実験には、２Ａ５、ラットＩｇＧ１抗マウスＩＬ−１０単ク ローン性抗体またはＧＬ１１３と称するイソタイプ対照抗体を用いた。

ＴＮＦα検定 ＴＮＦαの血清濃度は、サイトカイン特異的エリザを用いて評価された。

ＢＡＬＢ／ｃマウス２０匹の群に、致死用量のＬＰＳ単独かまたは同量のＬＰＳ を種々の量の組換体ネズミｌｌ、−１０と一緒に腹腔内に注射した。この種類の いくつかの実験において、ＩＬ−１０の０．５μｇか、１．０μｇかまたは１０ μｇを被験動物に対してＬＩ’Ｓと同時に投与した場合、マウスはＬＰＳに誘導 されたショックの結果として生じる致死から完全に防護された（図２１）。これ らの実験のいくつかにおいて、ＬＰＳ投与時にＩＬ−１０を０．１μｇまたは０ ゜０５μｇ与えられたマウスでは、更に、部分的な防護が観察された（図２１） 。

実施例Ｅ２ 抗ＩＬ−１０抗体による防護の中和 致命的な内毒素血症からのＩＬ−１０に媒介された防護は、中和性抗ＩＬ−ＬＯ 抗体の先行投与によって阻止することができたがイソタイプ対照抗体によって阻 止されず（図２２）、この作用の特異性が確証された。

実施例Ｅ３ ＩＬ−１０の遅れた投与は、防護を有効に存続させる。

速度論研究は、致命的な内毒素血症からのＩＬ−１０に媒介された防護が、ＩＬ −１０をＬＰＳ注射の３０分後に投与した場合でさえも達成されたことを示した 。しかしながら、ｌＬｉ０投与が更に遅れると、防護は実質的に減少し、そして ＩＬ−１０をＬＰＳ注射の５時間後に投与した場合、防護は観察されなかった（ 図２３）。

実施例Ｅ４ ＩＬ−ＩＯのＴＮＦαに対する作用 致命的な内毒素血症は、望ましくないモノウィン媒介炎症性反応である。ＩＬ− １０は、インビトロでの活性マクロファージおよび単球によるモノカイン生産を 抑制することが示されており、上記ＴＬ−１０に媒介された防護は、内毒素に誘 導された応答でのモノカイン生産の抑制を反映したことが示唆される。実際に、 ＬＰＳ±ＩＬ−１ｏ注射後１時間、２時間および３時間に集められた血清は、Ｉ Ｌ−１０によって防護された被験動物における循環性ＴＮＦα濃度の大きな減少 を示した。抗ＴＮＦ抗体はマウスを致命的な内毒素血症から同様に防護するので 、ＴＬ−１０に誘導されたＴＮＦαの抑制は少くとも防護に寄与し、このサイト カインが致命的な内毒素血症に備えると考えられる。マクロファージ／単球機能 に対するＩＬ−１０の他の作用も、致命的な内毒素血症を防護するその能力に寄 与することができる。インビトロの実験は、ＩＬ−１０が、ＩＬ−１およびＩＬ −６を抑制するのみならずＩＬ−１，Ｒａをアップレギュレートすることを示し ′Ｃおり、この結論は、中和性抗すイトカイン抗体を用いる報告によって示唆さ れたように、致命的な内毒素血症を防止し、またはＩＬ−］Ｒａの投与を指示す るものである。

実験Ｆ 概要 Ｌ　Ｙ−１Ｂ細胞は、継続的自己補充の顕著な性質を有し、そして最近記載され たサイトカインインターロイキン１０　（Ｉ　Ｌ−１０）の大きく増加した構成 的および誘導性の生産の基準で通常のＢ細胞と更に区別することができる。ＩＬ −１０がｔ、ｙ−１，８細胞に対するオートリリンかまたはバラタリン成長因子 として作用するかどうかは、マウスを誕生から８週令まで継続的に、マウスＩＬ −１０を特異的に中和する単りローン性うットＩｇＭ抗体で処置することによっ て検査された。この方法で処置されたマウスは、腹膜内在１−ｙ−ｔｓＢ細胞欠 失１１、大きく減少した血清免疫グロブリンＭ濃度を含み、そして特異的Ｂ細胞 がＬｙ−ＩＢ細胞サブセット中に存在するための抗原であるα１．３−デキスト ランまたはホスホリルコリンの腹腔内注射に対する有意のインビボ抗体応答を生 じることができなかった。対照的に、抗ＩＬ−１０で処置されたマウスの通常の 膵臓Ｂ細胞は、全数、表現型並びにＢ細胞マイトジェンおよび胸腺依存抗原トリ ニドフェニル−スカシガイのヘモシアニン（ＴＮＰ、−ＫＬＨ）に対するインビ ボ応答に関して正常であった。Ｌ　Ｙ−Ｉ　Ｂ細胞枯渇の機序は、中和性抗ＩＦ Ｎγ抗体の同時投与がこれらのマウスにおいて腹膜内在ＬＹ−ＩＢ細胞の数を実 質的に回復させたことから、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける内因性インターフ ェロン−γ（ＩＦＮγ）濃度の増大に関係していると考えられた。これらの結果 は、ＩＬ−１，０をＬ／−ＩＢ細胞発生の調節剤として暗示させ、そしてＬ）’ −ＩＢ細胞を特異的に枯渇させる方法を規定することによって免疫系におけるこ れらの細胞の役割を更に評価することを可能にする。

１−　ｙ　−１，８細胞は、成体マウスの全Ｂ細胞の〜２％を含み且つ通常のＢ 細胞とそれらを区別するいくつかの興味ある性質を示す。すなわち、（ａ）大部 分の一次および二次リンパ系組織中でかろうじて検出可能であるが、腸に関係し たリンパ系組織中のそれらの子孫と同様に、それらは腹膜腔および胸膜腔におい て極めて豊富であり：　（ｂ）それらは初期の個体発生において発生し且つ優勢 であった後、動物の生存に関して自己補充性であり；　（Ｃ）それらは、自己決 定因子と極めて交差反応性である限られたレパートリ−の低親和性抗体を生じ、 体細胞突然変異によって成熟するとは考えられないし；そして（ｄ）それらは血 清中に見出される大部分のＩｇＭ抗体を生じ、そしてホスホリルコリンおよびα １．３−デキストランなどのいくつかの細菌決定因子によって引出される完全な 抗体応答を生しない。免疫系機能におけるそれらの正確な役割は不明であるか、 Ｌｙ−ｔＢＢ細胞よって生した抗体の特異性に基づいて進められた様々なモデル は、杭軸菌性免疫における。老化赤血球などの宿主細胞破片のクリアランスにお ける：および発生の際の抗体レパートリ−の調節における役割を含む。Ｌｙ−Ｉ ＢＢ細胞、ＩＬ−１０、いくつかのモノカインの生産をダウンレギュレートする 免疫抑制サイトカインおよびＴ細胞誘導サイトカインの有力な生産者であるとい う本発明者の最近の知見により、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞一層広範な免疫調節の役割の 可能性が高くなっている。多数のこれらの顕著な特徴をヒトにおいて評価するこ とはむずかしいが、関連１−た性質を有するＬｙ−１含有ヒトＢリンパ球の集団 は識別された。

実施例Ｆ１ 継続的ＩＬ−４０中和は、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞マウスを枯渇させる。

妊娠中期のＢ　ＡＬ　Ｂ　／　ｃマウスおよびＣＨ３／ＨｅＪマウスをシモンセ ン・ラボラトリ−（ギルロイ、ＣＡ）から人手した。

抗ＩＬ−４０処置 令のそろったＢＡＬＢ／’Ｃマウス５−１０匹に、ＳＸＣ，１と称する中和性ラ ットＩｇＭ抗マウス１１−１０抗体（第１週に０．２ｍｇ／注射、第２週に０゜ ５ｍｇ／注射、第３〜第８週に１．０ｍｇ／注射）、等量のＪ　５／Ｄと称する イソタイプ対照または等Ｊｅｔ（１００または２００μｌ）のリン酸緩衝溶液（ Ｐ　Ｂ　Ｓ）を誕生から８週令まで週に３回腹腔内注射した。全部の実験におい て未処置の令のそろったＢＡＬＢ／ｃマウスを比較のために含んだ。抗体ＳＸＣ ，１およびＪ５／′Ｄは、血清不含ハイブリドーマ上澄みから（すられほつ２回 連続した３５％硫酸アンモニウム沈殿工程によって精製された。若干の実験にお いて、マウスは、同量の２Ａ５と称する別個のラットＩｇＧ１抗マウスＩＬ−１ ０個体またはそのイソタイプ対照ＧＬ１１３を与えられた。これらの後者の抗体 は、第１週に０゜５ｍｇ／注射、第２週に１ｍｇ／注射、第３〜第８週に２ｍｇ ／注射で腹腔内に投与された。

免疫蛍光法 洗浄した細胞を、以下の試薬の組合わせで染色した。すなわち、フルオレセイン 処理した抗マウスＩｇＭ抗体（ＤＳ−１；ファーミンジエン（Ｐｈａｒｍｉｎｇ ｅｎ）　、サン響ディエゴ、ＣＡ）；ビオチニル化うット抗マウスＩｇＤ抗体（ １１−２６ｃ、Ｊ、カーニー（Ｋｅａｒｎｅｙ）によって製造された）；フルオ レセイン処理した抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２ＣＩＬベーリンガー・マンハ イム・コーポレーション、インディアナポリス、ＩＮ）、カルタグ・ラブダ（Ｃ ａｌｔａｇ　Ｌａｂｓ、）、サウス・サンフランシスコ、ＣＡ）。細胞はファク スカン（ＦＡＣ８ｃａｎ）を用いて分析し、死滅した細胞は先の観点および横の ばらつきの基準で排除された。結果は、各実験群から計数された生存細胞５，０ ００個の蛍光強度を示す。

抗体エリザ 処置の８時間後に集められた血清試料を、マウスＩｇＭの存在に関して、ラット 抗マウスＩ　ｇＭ　（Ｒ８−１０３、ファーミンジエン）をＰＶＣ微量滴定プレ ート」二に５μｇ７’ｍｌで塗布したサンドウィッチエリザを用い°Ｃ検定し、 血清試料の希釈液または標準としての数種類の精製骨髄腫マウス１ｇＭタンパク 質の混合物を加えた後、免疫複合体を、ビオチニル化う・リド抗マウスＩｇＭ（ Ｒ１９−１５、ファーミンジエ〉）と、アビジンを結合した西洋ワサビ大根のペ ルオキシダーゼ（カルビオケム・コーポレーション（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍＣｏ 　ｒ　ｐ、　）　、う・ホヤ、ＣＡ）と、基質（２，２’−アジノビス［３−ユ チルベンズチアジンン硫酸：シグマｅケミカル・コーポレーション）１ｍｇ／ｍ ｌとを用いて検出した。

ホスホリルコリンおよびα１，３−デキストランに対する特異的抗体応答は、抗 ＩＬ−１０または対照マウスの腹腔内に、食塩水０．　５　ｍ　ｌ　、スロドキ ー博士（Ｄｒ、５ｌｏｄｋｉ）（米国農務省農業研究事業団）によって提供され たロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ　ｔｏｃＭｅｓｅｎ ｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のα１，３−デキストラン５０μｇまたは、ホスホリル コリンの源としての加熱殺菌された肺炎連鎖球菌２ｘ１０８個を試験投与した後 に決定された。血清を全マウスから７日後に集め、モしてエリザを用いてα１， ３−デキストランまたはホスホリルコリンに対する特異的抗体の分析をした。Ｔ ＮＰ−ＫＬＨに対する特異的抗体応答は、マウスの腹腔内にＴＮＩ’−ＫＬＨを １０μｇ試験投与した後に決定され、ＩｇＭ分析用の血清を７日後に集め、Ｉｇ Ｇ分析用には１０日および１４日後に集めた。ＴＮＰ特異的抗体はエリザを用い て定量した。いずれの場合にも、抗ＩＬ−１０処置は抗原の試験投与と血清採集 との間継続された。

ＩＦＮγエリザ 抗ＩＬ−１，０処置または対照マウスから集められた血清試料のネズミＴＦＮγ をサイトカイン特異的エリザを用いて検定した。

雄および雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、勾配用量のＳＸＣ，１と称する中和性ラッ ト１ｇＭ抗マウスＩＬ−１０ｍＡｂを誕生から８週令まで週に３回注射した後、 Ｌｙ−ＩＢＢ細胞数および機能の分析をした。処置されない或いはＰＢＳかまた は関係のないラッ目ｇＭイソタイプ対照（１５／Ｄと称する）を同様に注射され た令のそろったＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの対照群を比較用に含んだ。抗体 は、成果を有意に変更することなく腹腔内にかまたは皮下に投与された。用いた 抗体注射計画は、抗体ＳＸＣ，１およびＪ５／Ｄ両方の場合においてラット１ｇ Ｍ特異的エリザによって測定したところ、５０ｍｇ／ｒｎｌの８週日に平均血清 ラットＩｇＭ濃度を生じた。処置の８週間後、抗ＩＬ−１０処置マウスは以下の 判定基準、すなわち、全体重；肝臓、膵臓、胸腺、リンパ節、腸および肺の全体 的組織学的検査、ヘマトクリット；牌臓、胸腺、リンパ節および腹膜中の全白血 球数−並びに牌臓、リンパ節および胸腺中のＢ細胞、Ｔ細胞および非Ｂ／非Ｔ細 胞の比率に関して３種類の対照群マウスと区別がつかなかった。対照的に、記載 された４種類の実験群それぞれを含むマウス５〜１０匹から集められてプールさ れた腹膜洗液中で得られた細胞の免疫蛍光性表現型決定により、抗ＩＬ−１０（ ＳＸＣ。

１）処置マウスにおいてＩｇＭ　およびＩｇＤ＋細胞の著しい枯渇が示されたが 、対照動物のいずれにおいてもそれは示されなかった（図２４）。同一のデータ が、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを用いる２種類と別個のラットＩｇＧ１抗ＩＬ−１０ 中和抗体を用いる数種類を含む２４種類の独立した実験において得られた。抗Ｉ Ｌ−１０処置した被験動物は、更に、免疫蛍光法によって評価されるＢ２２０含 有腹膜細胞を枯渇し且つＬＰ８５０μｇ／ｍｌと同時培養して３日後に［３Ｈ］ −チミジンを取込むこれらの細胞の能力によって評価されるＬＰＳ応答性腹膜細 胞を枯渇した。これらの知見は、抗ＩＬ−１０処置Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウ スがそれらの腹発明者の動物施設の８週合のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔が通常 のＢ細胞を僅かしか含まない（〈５％）ということは重要である。したがって、 図２４で示された結果は、主としてｔ、ｙ−ＩＢＢ細胞枯渇を示す。腹膜Ｂ細胞 のこの著しい枯渇にもかかわらず、抗ＩＬ−１０処置マウスの腹膜腔の全細胞性 は、対照群のそれと有意に異なることはなかった。更に別の免疫蛍光分析は、示 差造血系細胞計数と一緒に、Ｂ細胞の損失が、抗ＩＬ−１０処置動物における腹 膜ＣＤ４＋Ｔ細胞および顆粒球の増大によって補われることを示した。二つの他 の観察報告により、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬｙ−ＩＢＢ細胞枯渇は免 疫系の至る所で起こり且つ腹膜腔に限定されなかったことか示された。第一に、 抗ＩＬ−１０処置マウスは、マウス１ｇＭ特異的エリザによって監視したところ 、３種類の対照と比較された血清ｒｇＭ濃度の著しい９０〜１００％の減少を示 した（図２５）。第二に、抗［Ｌ−１０処置マウスは、それに対する機能的に応 答性のＢ細胞がＬＹ−Ｉ　Ｂ細胞サブセット中に完全に存在する２種類の胸腺依 存抗原であるα１．３０−デキストランまたはホスホリルコリンに対するインビ ボ抗体応答を生じるそれらの能力が全く不十分であった（図２６）。

実施例Ｆ２ 抗ＩＬ−１０処置マウスは、表現型的におよび機能的に正常な通常のＢ細胞を含 髭 ＬＹ−ＩＢＢ細胞抗ＩＬ−１，０処置の著しい作用に関して、これらの動物にお ける通常のＢ細胞の状態を慎重に評価することは重要であった。上述のように、 抗ＩＬ−１０処置または対照の動物の膵臓中の白血球は、２４種類の独立した実 験において有意の差がなかった。図２７は、Ｂ２２０＋　Ｂ細胞、ＣＤ３＋　Ｔ 細胞および非Ｂ／Ｔ細胞（Ｂ２２０　ＣＤ３−）の比率がマウスの４種類の実験 群のいずれにおいても差がなかったことを示す。同等のデータは、Ｉｇ　Ｂ細胞 またはＣＤ４＋Ｔ細胞を比較した場合に得られた。これらのデータは、抗ＩＬ− １０処置マウスの牌臓Ｂ細胞の全表現型数がそれぞれの対照群のそれと同じであ ることを示す。抗ＩＬ−１０処置マウスの通常のＢ細胞の免疫担当は２種類の方 法で検査された。第一に、抗ＩＬ−１０処置マウスは、胸腺依存ＴＮＰ−ＫＬＨ の注射に応答して正常のＩｇＭおよび■ｇＧ抗体を生じた（図２８）。ＴＮＰ− ＫＬＨに対する二次応答も、抗ＩＬ−１０処置マウスにおいては正常である。

第二に、抗ＩＬ−１０処置マウスからの牌臓Ｂ細胞は、ＬＰＳまたは抗１ｇＭ抗 体５０μｇ／ｍｌに対する正常なインビトロ増殖応答を生じた（表Ｆｌ）。抗■ Ｌ−１０処置マウスに関する膵臓細胞のバックグラウンド増殖応答は、しばしＣ ｆ１対照のそれより３〜５倍高い（表Ｆｌ）。集合的に、これらのデータは、抗 ＩＬ−１０処置マウスにおける通常のＢ細胞が、対照マウスでのそれらと定量的 にも機能的にも区別できないことを示唆する。

人旦上 ＬＰＳ、抗１ｇＭおよび抗ＣＤ３刺激に対する、抗ＩＬ−１０処置および対照マ ウスからの膵臓細胞のインビトロ増殖応答未処置　２２４　２２，５７０　３， ３４６　９０，０９３Ｐ　Ｂ　Ｓ　３２０　４２．２９８　３．８２１　１１５ ．６９２Ｊ５／Ｄ　５４７　４６，７４８　２，８９７　１３５．１’７２８Ｘ Ｃ，１２，７７９６１，６０９？、２１８　９６．３８９被験動物は、図１に記 載のように、誕生から８週令まで処置された。各群のマウス３匹から得られた２ ｘ１０６個／ｍｌのプールした膵臓細胞を培地のみにおいて、またはＬＰＳ　（ ５０ｍｇ／ｍｌ）　、ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（５０ｍｇ／ｍｌ）若しくはハム スター抗マウスＣＤ３抗体（５ｍｇ／ｍｌ）を補足した培地において３日間培養 した。抗ＣＤ３刺激に関して、膵臓細胞を加える前に抗体を微量滴定プレート上 に塗布した。増殖は、［３Ｈ］チミジン（ＮＥＴ　０２７；ニュー・イングラン ド・ヌクレアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、ＭＡ ）ｉｍｃ／ウェルによる１６時間のノ々ルスの後、　［３Ｈ］チミジンの取込み によって評価された。

実施例Ｆ３ 各群のマウス３匹から得られたプールした牌臓細胞２Ｘ１０６個／ｍｌを、培地 のみまたは、ＬＰＳ（５０μｇ／′ｍｌ）、ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（０６１１ −０２０１；カッペル・ラボラトリーズ（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）、コクランビル、ＰＡ）（５０μｇ／ｍｌ）若しくはハムスター抗マウスＣ Ｄ３抗体（Ｄ、Ｊ、ブルーストーン、シカゴ大学、シカゴ、ＩＬから）（５μｇ ／ｍｌ）を補足した培地にお０て３日間培養しｔこ。抗ＣＤ３刺激に関して、膵 臓細胞を加える前に抗体を微量滴定プレート上に塗布した。

増殖は、［３）（］チミジン（ＮＥＴ　０２７；ニュー・イングランド・ヌクレ アー、ボストン、ＭＡ）１ｍＣｉ７’ウェルによる１６時間のパルスの後、［３ Ｈ］チミジンの取込みによって評価された。

いくつかの可能な機序が、抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＬＹ−ＩＢＢ細胞枯 渇に対する説明として考えられた。この作用は、抗Ｈ，−１０処置抗体を成体マ ウスに注射しても、１日、２日または３日後の全腹膜洗浄細胞または全腹膜Ｂ細 胞の回σには影響がなかったので（図２９）、同抗体によるＬｙ−ＩＢ＠胞の選 択的細胞毒性に関与し２ているとは考えられなかった。別の説明として、本発明 名は、Ｌｙ−＝ＩＢ細胞枯渇が、若干の他の内因性サイトカイン摂動の二次的結 果に反映された可能性を考えた。実際に、抗ＩＬ−１０処置マウスは、概して、 血清ＩＦＮγ濃度を増加させたことが分かっており（図３０）、その観察Ｎ５ｌ ｉＳインビ）・口てのＴｈｊおよびＮＫ細胞による１Ｆ”Ｎγ生産を抑制する従 来報告されたＩＬ−１０の能力と一致する。この抗１Ｌ−１０に誘導されたＩＦ Ｎγの増加が、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞枯渇に直接的かまたは間接的に関与し２ていた 可能性を検査するために、マウスに、抗ＩＬ−１０および抗ＩＦＮγ−中和抗体 、または抗ＩＬ−１，０および適当なイソタイプ対照抗体の組合わせを誕生から 成体まで注射した。結果は、抗ＩＦＮγ抗体は腹謄Ｌｙ−ＩＢ細胞のマウスを枯 渇させる抗１Ｌ−１０処置の能力を実質的に減少させたがそのイソタイプ対照で は減少させなかったことを示した。抗ＩＦＮγ抗体単独、または抗ＩＬ−１−０ および抗ＩＦＮγ抗体の組合わせの継続投与が、適正な抗ＩＬ−１０またはその イソタイプ抗体で処置されたマウスからの全腹膜洗浄細胞の回収率を変更しなか ったことに留意することは重要である。これらのデータは、Ｌｙ−ＩＢ細胞枯渇 が、少くとも部分的には抗ＩＬ−１，０処置マウスにおけるＩＦＮγ増加の結果 であるとい・）概念を支持する。

実験Ｇ 抗ＩＬ−１０処置マウスの変更された免疫学的状態概要 中和性抗ＩＩ、−１０抗体による誕生から成体までの継続した処置は、ｌ−ｙ　 ］　Ｂ細胞の特異的枯渇をもたらすが、通常のＢ細胞は、数、表現型および機能 に関して正常のままであるということを上記で示した。実験Ｆを参照されたい。

これらの被験動物の特性決定を延長すると、このデータは、抗１１、−１０処置 マウスをいく一つかの他の判定基準によって未処置またはイソタイプ対照処置マ ウスと区別することができることを示している。抗ＩＩ、−１０処置マウスは実 質的に高濃度の循環性ＴＮＦαおよび多くの場合循環性ＩＬ−６を含み、そして ＬＰＳに誘導されたショックすなわちモノカインに媒介された炎症性反応による 致死に対しで大いに感受性であった。抗ＩＬ−１０処置マウスにおける血清免疫 グロブリン濃度の分析は、血清１ｇＡ濃度の減少が、血清■ｇＩ〜１の従来報告 された減少と、ＩｇＧ２ａおよびＩ　ｇＧ２ｂの著しい増加とを伴うことを示し た。抗ＩＩ、−１０処画マウスのＩ、ｙ　ＩＢ細胞枯渇の更に別の研究は、抗日 ５−１０処置を中断して８週間後にｔ、ｙ−刊Ｂｍ胞が正常の数に戻ることにょ っＣ実証されたように、この作用が一時的であて・たことを示した。抗ＴＩ、− １０処置の際に起こったＬｙＩＢ細胞枯渇は、腹膜Ｔ細胞および顆粒球の増加に よって補われることが分がった。

最後に、抗ＩＬ−１０処置マウスはホスホリル訓ノンおよびα１，３−デキスト ランに対し２で抗体を生産することができなかったので、それらはＴＮＰ−フィ コールの腹腔内注射後に正常の抗体応答を生じた。この結果は３、胸腺非依存Ｈ 型多糖抗原の系列中の豆類の存在を示唆する。これらのデータを、免疫系におけ る１　１、−１０およびＬｙＩＢ細胞の役割に関するそれらの意味との関係にお いて論及する、１ 免疫系は、種々の造血系および非造血系細胞によって生産されるサイトカインと 称する一群の可溶性情タンパク質によって調節される。この５年間にわたるこれ らの免疫調節物質の広範囲のインビトロ特性決定は、サイトカイン系内の広範囲 の機能的多面性および重複性の概念をもたらす。現在、免疫学者は、この概念が インビボでのサイトカインの生理学的役割を正確に反映しているがどぅがを評価 する課題に直面している。最近発見されたサイトカインＩ　Ｌ−１０の生理学的 役割が、研究の主題となっている。インビトロの性質の広範囲のリストは、若干 のモノカ１ンおよびサイトカインの生産をダウンレギュレートし且つ全部ではな いが若干の抗原提；ソ細胞による抗原提示を阻害することができる強力な免疫抑 制剤としてＩＬ−４０を特性決定した。刺激性についての同様に項目の多いリス トは、胸腺細胞、末梢Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞の成長同時刺激剤：細胞 毒性Ｔ細胞の発生および機能のアノブリファイア；並びにＢ細胞の生存可能性お よび分化の誘導物質と同一のサイトカインを表わしている。インビボでのＩＬ− １０の生理学的役割を評価するために、マウスに中和性抗ＩＬ−１０単クローン 性抗体を誕生から成体まで週に２〜３回注射した。初期の分析は、この処置か、 Ｌｙ−ｔまたはＢ−Ｉ　Ｂ細胞と称する８９２３球の少数のサブセットの著しい 枯渇をもたらし、それによってＩＬ−１０はＬｙ−１／Ｂ−Ｉ　Ｂ細胞発生の調 節剤として暗示されることを示した。

Ｌｙ−１，８細胞は、ヒトおよびマウスの胎児および新生児のリンパ系組織にお いて極めて支配的であるが、成体免疫系においては少数しか見出されない８９２ ３球の亜集団である。成体の一次および二次リンパ系組織においてはかろうじて 検出可能なＬ）’−ＩＢ細胞は、成体マウスの腹膜および胸膜腔においては極め て豊富であるが、成人の循環中においては低数で見出される。ネズミの系におけ るそれらの広範な特性決定は、体細胞突然変異を容易に受けないし、しかも自己 抗原および細菌の細胞壁成分と極めて交差反応性である限られたレパートリ−の 低親和性抗体を含む多数の興味ある性質を示した。更に、ネズミ再構成実験は、 通常のＢ細胞とは対照的に、Ｌｙ−ＩＢＢ細胞宿主の全寿命の間自己補充するこ とができること、並びにそれらは大部分の血清１ｇＭ並びにホスホリルコリンお よびαＬ、３−デキストランなとのいくつかの細菌決定因子に対する完全な抗体 応答を生じることを示した。Ｌｙ−ＩＢＢ細胞従来の特性決定は、ＩＬ−１０の 大きく増加した且つ誘導しうる生産の基準でそれらを通常のＢ細胞と更に区別す ることができることを示しており、これらの細胞に関するより広範な免疫調節の 役割の可能性を高めた。これらの興味ある性質にもかかわらず、免疫系における Ｌｙ−ＩＢＢ細胞正確な役割は不明のままである。

中和性抗ＩＬ−１０抗体で誕生から成体まで継続的に処置されてきたマウスは、 それらの腹膜Ｂ細胞の欠失によって並びにそれらが血清１ｇＭ濃度と、α１，３ −デキストランおよびホスホリルコリンに対するインビボ抗体応答とを激しく減 少させたことによって実証されたように、Ｌｙ−Ｉ　Ｂ細胞を枯渇した状態にな る。ｔ、ｙ−１，８細胞の枯渇は、内因性ＩＦＮγの増加の二次的な結果である ことが分かっており、抗ＴＦＮγ抗体の同時投与によって防止することができた 。

これらのマウスの引続きの免疫状態においてＬｙ−ＩＢＢ細胞よび内因性ＩＬ− １０両方を特異的に枯渇した結果をここで報告する。

実施例Ｇ１ 内因性サイトカイン濃度に対するマウスの抗ＩＬ−１０処置の効果ヱ立玉 妊娠中期のＢＡＬＢ／ｃマウスをシモンセンのラボラトリ−（ギルロイ、ＣＡ） から入手した。

抗ＩＬ−１，０処置 令のそろったＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス５〜１０匹に、以下のプロトコルに したがって、２種類の抗ＩＬ−１０抗体のどちらかを誕生から８週令まで腹腔内 注射した。

若干の実験において、マウスに、ＳＸＣ，１ラツ目ｇＭ抗マウスＩＬ−１０抗体 （モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）ら（１９９０）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｌ４５：２ ９３８〜２９４５を参照されたい）（第１週にＱ、２ｍｇ／注射、第２週に０゜ ５ｍｇ／注射、第３〜８週に１．０ｍｇ／注射）、等量のＪ５／Ｄと称するイソ タイプ対照または等容量（１００または２００μｌ）のリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ 　Ｓ）を１週間に３回注射した。他の実験においては、マウスに、２Ａ５、う・ ソトＩｇＧ１抗マウスＩＬ−１０抗体（第１週に０．２ｍｇ／注射、第２週に０ ．　５ｍｇ／注射、第３〜８ａに１ｍｇ／注射）、等量のＧＬ１１３と称するイ ソタイプ対照または等容量の（１００または２００μｌ）のリン酸緩衝溶液（Ｐ 　Ｂ　Ｓ）を１週間に２回注射した。未処置の令のそろったＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ 　ｃマウスを、全部の実験において比較用に含んだ。抗体は全て、血清不含ハイ ブリドーマ上澄みから得られ、硫酸アンモニウム沈殿によって精製された。この 処置計画の後、プールされた膵臓、胸腺、リンパ節または腹膜洗浄細胞を４種類 の群のマウスそれぞれから集められ且つ流動血球計算法および機能検定によって 分析された。

サイトカインエリザ 抗ＩＬ−１０処置または対照マウスから集められた血清試料のネズミＴＮＦαま たはネズＥ　Ｉ　Ｌ−６を、サイトカイン特異的エリザを用いて検定した。

マウスの誕生から成体までの継続した抗１１、−１０処置は、双方ともそれらの 血清中の検出可能なＩＦＮγを欠失している未処置またはインタイブ対照処置マ ウスとは対照的に、８週目に集められた血清中の実質的な量の■ＦＮγの存在を もたらす。抗日７−１０処置から得られた内因性サイトカイン摂動を更に探求す るために、処置の８週間後に集められた血清のＴＮＦαおよびＩＬ−６の存在を 、サイトカイン特異的エリザを用いて評価した。抗ＩＬ−１０処置マウスからの 血清は、極めて高いＴＮＦα濃度を含み（図３２）、しばしば高いＩＬ−６濃度 を含んだ（図３３）。抗ＩＬ−１０処置マウスにおけるＴＮＦαおよびＩＬ−６ の増加は、インビトロでのモノカイン生産を抑制する報告されたＩＬ−１０の能 力と一致している。

実施例Ｇ２ ヱ罎■虜工呈」訃樫げ回友■ニュｙｑｐ脳国内毒素に誘導されたショック マウスに、１μｇ〜５００μｇの範囲の用量の内毒素（大腸菌血清型０１１１： Ｂ４、シグマ・ケミカル・カンパニーからのリボ多糖）を腹腔内注射した。その 後１〜６日間にわたって生存を監視した。

内因性モノカイン濃度に対する抗ＩＬ−１０の作用を、ＬＰＳに誘導されたショ ックすなわちモノカインに媒介された炎症性反応に対するこれらの被験動物の感 受性を評価することによって更に分析した。初期に示されたデータは、ＴＮＦα 、ＩＬ−１またはＩＬ−６に対する中和性単クローン性抗体およびＩＬ−ＩＲａ と称する生理学的ＩＬ−１アンタゴニストが、ＬＰＳに誘導されたショックから マウスを効果的に防護することを示した。このような実験は、ＳＸＣ，１（ラッ トＩｇＭ）かまたは２Ａ５（ラットＩｇＧ１）抗ＩＬ−１０抗体を誕生から８週 目まで注射されたマウスが、ＬＰＳに誘導されたショックによる致死に対して著 しく感受性であったことを示す（図３４）。ＤＮＡＸ動物施設の８週令のＢＡＬ Ｂ／ｃマウスに関するＵ　Ｐ　Ｓ　Ｌ　Ｄ　ｉ　ｏ　ｏは、大部分の抗ＩＬ−１ ０処置マウスを死滅させた内毒素１μｇと同程度に少量の〉３８０μｇ／マウス （腹腔内）であることが分かった。この増大した感受性の正確な機序はまだ決定 されていないが、これらのデータは、抗ＩＬ−１０処置マウスのおける炎症性モ ノカインの一般化されたアップレギュレーションと一致している。

抗体エリザ 処置の８週間後に集められた血清試料の、全イソタイプのマウス免疫グロブリン の存在を、イソタイプ特異的サンドウィッチエリザを用いて検定した。この目的 に用いられたプレート結合性抗体は以下の通りであった。すなわち、ラット抗マ ウスＩｇＧ１　（３０９６、Ｒ，コツマン（Ｃｏｆ　ｆｍａｎ）　、ＤＮＡＸに よって豊富に提供された）：ラット抗マウスＩｇＧ２ａ　（Ｒ８−１０３；ファ ーミンジエン、サン・ディエゴ、ＣＡ）；ラット抗マウスＩｇＧ２ｂ　（Ｒ９− ９１、ファーミンジェン）：ラット抗マウスＩｇＧ３　（Ｒ２−３８、ファーミ ンジエン）；ラット抗マウスＩｇＡ　（Ｒ５−１４０、）７−ミンジエン）；ラ ット抗マウス■ｇＥ　（ＥＭ９５、Ｒ，コツマンによって豊富に提供された）。

プレート被覆抗体を１〜５μｇ／ｍｌで用いた。これらのエリザで用いたサンド ウィッチ抗体は、ビオチニル化ラット抗マウスＩ　ｇＧｌ　（３０９８Ｂ、Ｒ， コツマンによって豊富に提供された）；ビオチニル化ラット抗マウスＩ　ｇＧ２ ａ　（Ｒ１９−１５；ファーミンジエン）：ビオチニノ、ｌ／化うット抗マウス Ｉ　ｇＧ２ｂ　（Ｒ１２−３、ファーミンジエン）：ビオチニル化ラット抗マウ スＩｇＧ３　（Ｒ４０−８２、ファーミンジェン）；ビオチニル化ラット抗マウ スＩ　ｇＡ　（２７４０Ｂ、Ｒ，コツマンによって豊富に提供された）；ビオチ ニル化ラット抗マウスＩ　ｇＥ　（Ｒ３５−１１８、ファーミンジエン）であっ た。これらのサンドウィッチ抗体を、ストレプトアビジンを結合した西洋ワサビ 大根のペルオキシダーゼ（カルビオケム、う・ホヤ、ＣＡ）および基質［２，２ −アジノビス（３−エチルベンズチアソリン硫酸）、シグマコと一緒に１〜３μ ｇ／ｍｌで用いた。エリザは、精製マウス骨髄腫免疫グロブリンを標準として用 いて定量した。

マウスの誕生から成体までの継続した抗ＩＬ−１０処置は、イソタイプ対照処置 マウスにおいて観察された正常血清１ｇＭ濃度と比較して顕著な血清１ｇＭ濃度 の枯渇をもたらす。処置の８週間後に集められた血清中の他の免疫グロブリンイ ソタイプの測定値を図３５に示す。３種類の対照群マウス（すなわち、未処置、 ＰＢＳ処置またはイソタイプ対照抗体で処置された）における各免疫グロブリン イソタイプの濃度は、正常マウスにおける血清１μ濃度の以前に実証された範囲 とほとんど変わらなかった。しかしながら、抗ＩＬ−１０処置マウスにおける血 清１μ濃度においては多数の変化が観察された。これらのマウスは、従来報告さ れた血清１ｇＭの減少並びにＩｇＧ２αおよびＩ　ｇＧ２βの著しい増加を伴う 血清１ｇＡ濃度の顕著な減少を示した（図３５）。残りのイソタイプ（［ｇＧｌ 、１ｇＧ３、ＩｇＥ）は変化しないかまたは若干の実験において２〜４倍に増加 した。

実施例Ｇ３ 抗ＩＬ−１，０処置マウスにおけるＬｙ−ＩＢ細胞の枯渇は一時的である。

免疫蛍光法 洗浄した細胞を、以下の試薬の組合わせて染色した。すなわち、フルオレセイン 処理抗マウスＩｇＭ抗体（Ｄ　Ｓ−１、ファーミンジエン、サン・ディエゴ、Ｃ Ａ）；ビオチニル化うット抗マウスＩｇＤ抗体（１１−２６ｃ、Ｊ、　カーニー 、Ｕ、バーミンガム、Ａｌａ、によって製造された）；フルオレセイン処理抗マ ウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１、ベーリンガー・マンハイム、インディアナ ポリス、ＩＮ）、ビオチニル化抗マウスＢ２２０抗体（ＲＡ３−６Ｂ２；カルタ グ、Ｓ、Ｆ、　）　、およびビオチニル化ラット抗マウス顆粒球／好酸球抗体（ ８Ｃ５；Ｒ，コツマン、ＤＮＡＸによって製造された）。ビオチニル化試薬は、 フィコエリトリン結合ストレプトアビジン（ベクトン・ディキンソン、マウンテ ン・ヴユー、ＣＡ）と−緒に用いられた。細胞はファクスカンを用いて分析さね 、そして死滅細胞は先の観点および横のばらつきの基準で排除された。結果は、 各実験群から計数された生存細胞５．０００個の蛍光強度を示す。

抗ＩＬ−１０処置マウスは、抗ＩＬ−１０処置を中断した後に評価され、これら の被験動物におけるＬｙ−ＩＢ細胞の枯渇が不可逆的であるかどうかを決定した 。いくつかの群のマウスに、抗ＩＬ−１０抗体を誕生から８週間まで注射した後 、処置を中断した。次に、各群を、腹膜ｔ、ｙｉ　Ｂ細胞の存在に関して、処置 の終了直後かまたはその後８週間の間の種々の時点て分析した。重要なことに、 種々の時点で集められた全腹膜洗浄細胞の収量には有意の差が見られなかった。

この性質を有するいくつかの実験において、抗ＩＬ−１０処置後に最初の３週間 、マウスは腹１１１１ＬｙｌＢ細胞を欠いたままであった。その時間間隔の後、 ＬｙｌＢ細胞は腹膜腔中に再度現れ始め、ＬｙＬＢ細胞の正常な全数は、抗ＩＬ −１０処置の終了後８週間目に観察された（図３６）。腹膜Ｂ細胞区分の再構成 は、抗ＩＬ−１０処置を中断後約４週間口に８２２０鮮明１　ｇＭ不鮮明Ｂ細胞 が最初に現れ、その後数週間後に８２２０””　Ｉ　ｇＭ鮮明Ｂ細胞が現れるこ とを特徴とした（図３６）。

実施例Ｇ４ 抗ＩＬ−１０処置マウスにおける腹膜Ｔ細胞および顆粒球の増大した数示差造血 系細胞計数 膵臓および腹膜洗液からの細胞懸濁液を用いて、細胞形態学分析用のサイトスピ ン（ｃｙｔｏｓｐｉｎｓ）を製造した。試料をライト・ギムザ（シグマ、セント ・ルイス）で染色し且つそのリンパ球、マクロファージ、顆粒球、好酸球および マスト細胞を検鏡によって分析した。

誕生から８週令まで継続的に処置されたマウスは腹膜Ｂ細胞を枯渇した状態にな ったが、このようなマウスから得ることができる腹膜洗液細胞の全数は、対照マ ウスのそれとほとんど変わらなかった。抗ＩＬ−１０処置マウスから集められた 腹膜洗液細胞で実施された示差造血系細胞計数は、これが腹膜顆粒球／好酸球お よび見掛は上の非Ｂ細胞リンパ球の増大を反映していることを示した（表Ｇｌ） 。抗ＩＬ−１０処置マウスからの腹膜洗液細胞の表面遺伝標識表現型決定により 、Ｌｙｌ鮮明１ｇ陰性細胞（図３７）　、ＣＤ３陽性陽性陰性細胞、Ｍａｃｌ鮮 明１ｇ陰性細胞（図３８）および８Ｃ５鮮明１ｇ陰性細胞の増加が示された。こ れらの分析は、Ｌｙｌ陽性、ＣＤ３陽性の１９２６球の増加を示し、そしてＭａ ｃｌおよび８Ｃ５表面遺伝標識を発現する顆粒球の増加を確証する（表Ｇｌ）。

表■：抗ＩＬ−１０処置または対照マウスにおける造血系亜集団の比率リンパ球 　マクロファージ　好中球　好酸球　マスト細胞未処置　？４　２２　１．８　 １．７　０．５ＰＢＳ処置　６６　２９　１．４　３４．３　０．３イソタイプ 　６４　３１　１．２　４．５　０．３対照処置 抗ＩＬ−１０４４２２１８，０１６，００処置 未処１１　９４　２．７　２．３　０．５　０ＰＢＳ処置　９２　３．６　３． ６　１．４　０イソタイプ　９Ｇ　１．２　１．８　０．６　０対照処置 抗ＩＬ−１０９２２，４５，００，９０処置 （ｔいずれの群も、はぼ同じ腹膜および牌臓細胞数／マウスを有した。数値は計 数された全細胞数の百分率を表わす） 実施例Ｇ５ 抗Ｉ　Ｌ−１０処置マウスは胸腺非依存性抗原ＴＮＰＮツーコールに対して応答 すに 特異的抗体応答 ＴＮＰ−フィコールに対する特異的抗体応答は、ＴＮＰ−フィコール（ジェーに 試験投与し且つ５日または１０日後に血清を集めた後に決定された。抗ＩＬ−１ ０または対照抗体の注射は、抗原の試験投与と血清採集との間継続された。ＴＮ Ｐ特異的抗体はエリザを用いて定量された。

抗Ｉ　Ｌ−１０処置マウスは、２１！Ｉｆ類の胸腺非依存ＩＩ型抗原であるホス ホリルコリンおよびα１．３デキストランに対するインビボ抗体応答を引出すそ れらの能力を欠失している。図３９は、抗ＩＬ−１０処置マウスが、第三の胸腺 非依存ＩＩ型抗原であるＴＮＰ−フィコールに対して正常なインビボ抗体応答を 生じることを示す。この応答性は、抗ＩＬ−１０処置マウスからの稗臓Ｂ細胞が 、胸腺非依存■型抗原の推定上の多クローン性類似体である抗１ｇＭ抗体による 刺激後に正常の増殖応答を生じるという本発明者の従来の観察報告と一致する。

実験Ｈ 抗ＩＬ−１０抗体の継続した投与は、ＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の開始 上塁五ｉゑ。

概要 ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する抗ＩＬ−１０抗体の継続した投与は、［狼−傾向の あるＪＮＺＢ／Ｗマウスにおいて自己免疫の発生をもたらすことが知られている ３種類の免疫媒介物質である自己抗体、プレクス（ｐｌ　ｅｘ）ＴＮＦαおよび ＩＦＮγの内因性濃度を変更する。ＮＺＢ／ＷマウスにおけるＩＬ−１０中和の 結果を探求するために、被験動物に抗ＩＬ−１０抗体またはイソタイプ対照抗体 を誕生から８〜１０か月まで週に２〜３回注射した。抗ＩＬ−１０処置は、全体 の生存率によってかまたは、タンパク尿、腎炎若しくは自己抗体の発生によって 監視されるＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の開始を実質的に遅らせた。９が ガロの生存率は、被処置マウスにおいては対照に相対して１０％〜８０％増加し た。自己免疫に対するこの防護は、中和性抗ＴＮＦα抗体を、長期間抗ＩＬ−１ ０処置されたマウス中に３０週０に導入した場合に、防護されたＮＺＢ／Ｗマウ スが速やかに自己免疫を生じたことから、内因性ＴＮＦαの抗ＩＬ−１０に誘導 されたアップレギュレーションに依ると考えられた。これらのデータは、ＩＬ− １０７ンタゴニストがヒト全身性エリテマトーデスの治療において有益であるこ とを示す。

（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１ハイブリッドマウスは、ヒトの全身性エリテマトーデス によく似た苛酷な自己免疫疾患を発症する。ＮＺＢ／Ｗマウスは、致命的な免疫 複合体に媒介された糸球体腎炎を、雌では約６〜９かガロに、そして雄では１２ 〜１８かガロに自発的に発症する。ＮＺＢ／Ｗマウスにおける自己免疫の根本的 な原因を定義するための従来の試みは、ＭＨＣ遺伝子に可能な役割に対して集中 していた。実際に、様々な細胞種におけるＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現をアップ レギュレートするサイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、ＮＺ Ｂ／Ｗマウスにおいて自己免疫の発生を促進する。いくつかの最近の研究は、Ｍ ＨＣ複合体中に位置するＴＮＦα遺伝子が、ＮＺＢ／Ｗマウスの線通腎炎の発病 に関与していることがあるということを示唆した。これらの研究は、ＮＺＢ／Ｗ マウスが例外的に低濃度のＴＮＦαを生産すること並びにこれはＴＮＦα遺伝子 Ｊの制限断片長条型およびＴＮＦα遺Ｃ云子の５′調節領域の単純なジヌクレオ チドタンデム反復の多望性と相関することを示す。これらの観察報告の原因とな る役割は、組換体ＴＮＦαによる置換療法がＮＺＢ／Ｗマウスの腎炎の発症を有 意に遅らせるという事実によって暗示される。

ＩＬ−１０は、インビトロ検定においてマウスおよびヒトの種々の免疫刺激およ び免疫抑制性双方を媒介する活性Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージのサブセ ットによって生産されるサイトカインである。ＩＬ−１０の生理学的役割を評価 する最近の研究において、ＢＡＬＢ／ｃマウスを中和性抗ＩＬ−１０抗体で誕生 から８退会まで継続して処置した。ＩＬ−１０の既知のインビトロの性質と一致 して、抗ＩＬ−１０処置マウスは、高濃度の内因性ＩＦＮγおよびＴＮＦαを特 徴とする。高濃度のＩＦＮγは、引続き、大部分のネズミ自己抗体が由来する集 団であるＬｙｌまたはＣＤ５またはＢ−Ｉ　Ｂ細胞と称するＢリンパ球の数的に 少数のサブセットの枯渇をもたらす。正常マウスでのこれらの研究は、ＩＬ−１ ０の中和が、ＮＺＢ／Ｗマウスにおいて若干の望ましい結果、すなわち、内因性 ＴＮＦαの増加および自己抗体生産の減少並びに若干の望ましくない結果、すな わち、内因性ＩＦＮγの増加を生じることがあるということを示唆した。ＮＺＢ ／Ｗ雌マウスにおける自己免疫の発生に対する継続した抗ＩＬ−１０処置の全作 用をここで実験する。Ｉ　Ｌ−１０の中和がこれらのマウスでの自己免疫の開始 を有意に遅らせるというデータは、内因性ＴＮＦαのアップレギュレーションに 依る。

マウス ＮＺＢ／Ｗ　ＦｌマウスをＤＮＡＸリサーチ・インスティトゥートの動物集団中 において、ジャクソンーラボラトリー（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （バー・ハーバ−１ＭＥ）から購入したＮＺＨの雌およびシモンセン・ラボラト リーズ（ギルロイ、ＣＡ）から購入したＮＺＷの雄を用いて繁殖させた。自己免 疫のより速い開始ゆえに、雌のＦ１マウスのみを用いた。

抗ＩＬ−１０処置 Ｂ／ＷＦＩ雌マウス１７〜２３匹の群を、ＳＸＣ，１またはＪＥＳ　２Ａ５と称 するＩＬ−１０に対するラットＩｇＭｍＡｂまたはＩｇＧ　ｍＡｂで処置した。

令のそろったＢ／ＷＦＩ雌マウス２１〜２３匹／群を、Ｊ５／Ｄ（ＩｇＭ）また はＧＬ１１３（ＩｇＧ）と称するイソタイプ適合対照ｍＡｂで処置した。

抗ＩＬ−１０ｍＡｂおよびイソタイプ対照ｍＡｂは、ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウ スから腹水として採集し、２連続硫酸アンモニウム沈殿によって精製し、リン酸 緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に対して透析し、そしてタンパク質電気泳動および光学 濃度の測定によって定量した。処置は３部分から成り、すなわち、（ａ）誕生か ら第１週まてｍＡｂｏ、２ｍｇ／７ウスを、ＩｇＭで４回／週またはＩｇＧで２ 回／週腹腔内（ｉ、ｐ、　）注射し、（ｂ）第２週に、ｍＡｂｏ、５ｍｇ／マウ スをＩｇＭで３回／週またはＩｇＧで２回／週腹腔内注射し、そして（ｃ）第３ 週から成体まで、ｍＡｂ１ｍｇ／マウスをＩｇＭで３回／週またはＩｇＧで２回 ／週腹腔内注射した。予備実験により、この計画はマウス血清中のラットＩｇＭ 濃度を約５０μｇ／ｍｌに維持することができることが示された。

腎臓疾患の評価 タンパク尿は、アルプスティクス（Ａｌｂｕｓｔｉｘ）ディツプスティック（マ イルス・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、エルクハート、ＩＮ）を用いて比色定量的に測定し、そ して以下のコードにしたがって等級を付けた。すなわち、痕跡＝ｌＯｍｇ／ｄ　 Ｉ　；　ｌ＋＝３０ｍｇ／ｄ　Ｉ　；　２＋＝１００ｍｇ／ｄｌ　；　３＋＝３ ００ｍｇ、／ｄ　Ｉ　；　４＋＝１，０００ｍｇ／ｄ　１つ糸球体腎炎の組織学 的苛酷さは、組織病理学的変化の強さおよび範囲に基づくＯ〜２＋のスケールで 等級を付け、０＝糸球体病変のない腎臓；１＋＝軽い病変、例えば、増大したメ サンギウム基質、メサンギウム／糸球体細胞性、半月形成、または炎症性滲出液 および被膜癒着の存在；顕著な胃内柱なし；２＋＝苛酷な病変、例えば、広範囲 の胃内柱形成によって７０％を越える糸球体が閉塞した糸球体構造であった。

自己抗体エリザ 二本鎖または一本鎖ＤＮＡに特異的な血清抗体（ｄｓ−または５ｓ−ＤＮＡ）を エリザによって定量した。簡単にいえば、ｄｓ−またはｓ　５−ＤＮＡ５ｍｇ／ ｍｌを４℃で一晩中のインキュベーションにおいて用いてエリザプレート（フロ ー・ラボラトリーズ、マクリーン、ＶＡ）を切断した。次に、抗原で被覆された 時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ−０，０５％トウィーン２０ で洗浄し、そして西洋ワサビ大根のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１ｇｇ／ｍＩを 結合した抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ（ザイムド・ラボラトリーズ・インコーホ レーテッド（Ｚｙｍｅｄ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｌｎｃ、）Ｓ、サン・フ ランシスコ、ＣＡ）と−緒に１時間インキュベートした。Ｖｍａｘマイクロプレ ートリーダー（モレキコラー・ディバイシズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ ｓ）、メンローパーク、ＣＡ）を用いて、２．２′　−アジノービス（３−エチ ルベンチアジンン−６−スルホン酸）、ＡＢＴＳ　（シグマ。ケミカルズ、セン ト・ルイス、ＭＯ）Ｉｍｇ／ｍｌを加えて３０分後に吸光度を測定した。

抗ＤＮＡ力価は、シエリング・プラウ・コーポレーションのシェルビー・ラムラ ンド博士（Ｄｒ、Ｓｈ、ｅ　ｌｂｙ　Ｕｍｌ　ａｎｄ）によって提供された４月 令のＭＲＬ／Ｍｐ　Ｊ−１ｐ　ｒマウスからプールされた血清の対照標準を用い る単位として表わされた。この標準血清の１．＋１００希釈液を、便宜上、１０ ０単位であると仮定した。

１ｇおよびＴ＝ＮＦαの血清濃度 １ｇエリザに関して、ヤギ抗マウスＩｇＧ（キルケガード・アンド・ぺり−・ラ ボラトリーズ−インコーホレーテッド（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆Ｐｅｒｒｙ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、ゲイサーズバーグ、ＭＤ）で被覆され たプレートを、１：１０００または１：５０００希釈の被験血清と一緒に、続い てＨＲＰ結合ヤギ抗１ｇＧまたは抗１ｇＭ（ザイムド・ラボラトリーズ・インコ ーホレーテッド）と−緒にインキュベートし、そして発色させた。ＩｇＧおよび ＩｇＭ濃度は、骨髄腫タンパク質の混合物である既知の濃度の本発明者の原液と 一緒にインキュベートすることによって作成された標準曲線から決定された。

ＴＮＦａエリザに関して、ラット抗マウスＴＮＦａ　ｍＡｂ　（ＭＰ６−ＸＴ３ ゜１１）で被覆されたプレートを、１：１０希釈の被験血清と一緒に、続いてＨ ＲＰ結合ラッう抗マウスＴＮＦａ　ｍＡｂ　（ＭＰ６−ＸＴ２２）と−緒にイン キュベートし、そして発色させた。

本出願人は、ｐＨ５Ｃ，ｐＨ１５ｃおよびｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲａ）を有する大 腸菌ＭＣ１０６１の別個の培養物を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）、ロックビル、ＭＤ、米国（Ａ　Ｔ　ＣＣ）にそれぞれ受託番号６８１．９１ ．６８１９２および６８１９３として寄託した。これらの寄託は、特許手続上の 微生物の寄託に関するＡＴＣＣの承認に基ついて与えられる条件に基づいて行な ったものであり、それによって、その寄託は、米国成文法３５条１２２および米 国規制基準３７条１．１４に従って米国特許商標局長に対して利用可能にさせる ものであることおよび米国特許証の公的発行に対して利用可能にさせるものであ ることが補償され、それによって寄託が維持されることが必要とされる。寄託さ れた菌株の入手可能性は、いかなる政府のその特許法による代理権に基づいて付 与された権利に違反して本発明を実施する許可として解釈するべきではない。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：レーン・ド・ワール・マレフィト（Ｒｅｎｅ　ｄｅ　ＷａａｌＭ ａｌｅｆｙｔ）、ディ・フエイ拳シュー（Ｄｉ−Ｈｗｅｉ　Ｈｓｕ）、アンネ拳 オーガラ（Ａｎｎｅ　Ｏ’　Ｇａｒｒａ）およびハーゲン・スピッツ（Ｈｅ　ｒ ｇｅｎ　Ｓｐ　ｉ　ｔ、５）（ｉ　ｉ）発明の名称二数血症性ショックを治療す るためのインターロイキン−１０の使用 （ｉ　ｉ　ｉ）配列の数：２ （ｉｖ）宛先； （Ａ）住所：ステイーブン・シー・マセヴイッツ・ＤＮＡＸリサーチ・インステ イトウート（Ｓｔｅｐｈｅｎ　Ｃ，Ｍａｃｅｖｉｃｚ、ＤＮＡＸＲｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）（Ｂ）地区：カルフォルニア・アジｚ＝ｘ−（Ｃａｌ ｉｆｏｒｎｉａＡｖｅｎｕｅ）９０１ （Ｃ）車名：パロ・アルド （Ｄ）州名：カリフォルニア （Ｅ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：９４３０４ （Ｖ）コンピューター読取り形式： （Ａ）中型＝３．５インチ小型ディスク（Ｂ）コンピューター二マツキントツシ ｓ　（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）ＳＥ（Ｃ）操作システム：マツキントラシュ６．　 ０．　１（Ｄ）ソフトウエア二マイクロソフト・ワード（ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷ ｏｒｄ）４．０ （ｖｉ）現行出願資料： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願口： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願資料： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ステイーブン・シー・マセヴイッツ（Ｓｔｅｐｈｅｎ　ＣｌＭａｃ ｅｖｉｃｚ） （Ｂ）登録番号＋３０，２８５ （Ｃ）照会／事件整理番号：ＤＸＯ２２１（ｉｘ）通信情報： （Ａ）電話：　（４１５）４９６−１２０４ＣＢ）ファクシミリ：　（４１５） ４９６−１２００（２）配列番号＝１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６０アミノ酸 ＣＢ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖： （Ｄ）トポロジー二線状 （ｘｉ）配列種類：配列番号＝１ ５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　 Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　’Ｉ’ｈｒ　Ｈｌｓ　ＰｈｅＳ　１０　１５ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｉｊｕ　Ｐｒｏ　、Ａｓｎ　間ｅｔ　Ｌａｕ　Ａｒｇ 　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＡｒｑＡｓｐ　Ａｌａ　ｔｈｅＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌ ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｇ１ｘｉ　＋勿ＣＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｐ　ＡＳｎＬａｕ　ｔＩＡｕ　Ｉｊ！ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｅ：　 Ｉｚｕ　ｔａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕｓ ｏ　ｓｓ　６゜ Ｇｌｙ　ＣＹＳ　ＧＬＩＩ　ＡＬａ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　冷ｃ　Ｉｌｅ　 Ｇｉｎ　Ｐｈｉ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＶａｌ　１−ｋｎ　Ｆ’ｒｏ 　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ 　ＬＹＳ　Ａｌａ　）ｕｓ８０　Ｅ１５　９０ ＡｒｇＡｒｇＯ／Ｓ　）ｌｉｓ　ｆｉＸｑ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｃｐｓ　 Ｇｌｕ　鳩Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａｌｌｏ　１１５　１２０ １１＊　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｗｔ　５ｅｒ　Ｇｌｕ　ＰｈｅＡｓｐ　Ｉｌ ｅ　Ｐｈａ　ｌｉｅ　Ａｓｎ　’Ｐｙｒ　ｌ１ｅＧｌｕ　ＡＬａ　Ｔｙｒ　ｗｔ 　Ｔｈｒ　ＩＪｋしＬｙｓ　ＸＬｅんη鳩（２）配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４７アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖： （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列種類：配列番号＝２ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ入ａｎ　Ｐｈｉ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ｈ セーＡｒｇ　Ａｓｐ　ｔａｕ　Ａｒｇｐｓｐ　Ｕａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｆ’ｈｅ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ 　ＧｌｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｌａｕ　ｔａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ｔｈｅ　ＬｙｓＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌ ａｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｓｓｒ　Ｇｌｕ　ｔｍｔ　Ｉ ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　ＴｙｒＬａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　閃ｅｔ　Ｐｒ ｏ　ＧＩＪ’ｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　ｋｓＰ　Ｆ’ｒｏ　Ｇｌｕ 　ＡｌａＬｙｓ　ｆｉＥｐ　）ｕｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ｌｊｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　馳ｕ　ｋ１Ｌａｕ　Ａｒｇ　ＸＡｕ 　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　）Ｌｉｓ　Ａｒｑ　Ｐｈｅ　ｔａｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙ ｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＬｙｓＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ 　工１ｅ　Ｌｙｓ　ＡＳｎ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇ１ｎ Ｇｌｕ　Ｉ、ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｆ’ａｃ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｉ　Ａｓｐ　１１ｅ　Ｐｈａ　ｌ１ｅＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ 　Ｇｌｕ　Ａｉａ　Ｔｙｒ　階ｔ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ＡＬａ　Ａｒｇａ Ｉ ＦＩＧＵＲＥ　１ １ＦＮ丁、　ｎｑ／ｍＬ ＦＩＧ、２Ａ ＴＮＦｃｘ、　ｐｇ／ｍ１ ＦＪＧ、２Ｂ ＦＩＧｔＪ日２３Ｂ ＄　ＩＬ−２＋　ｈｌＬ−１０ ０２０４０６０Ｂ□ Ｃｐｍ　ｘ　ｉｏ’ ＦＩＧ、４Ｂ１ Ｃｐｍ　ｘ　１０’ ＦＩＧ、４８２ １ＦＮ７．　ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮＹ、　ｎｇ／ｍｌ ＦＩＧＵＲＥ　７ ＦｆＧ、８Ｂ ＦＩＧ、ＢＣ ＦＩＧ、８Ｄ ＦｊＧ、８Ｅ −　抗ＩＬ−１０ ＦｆＧ、９Ａ ＦＩＧ、１１ 蛍光強度 ＦＩＧ、１３Ａ ｉｏｏ　１０１　１０２１０３１０４ 蛍光強度 ＦｆＧ、１３Ｂ 蛍光強度 ＦＩＧ、１３Ｇ 蛍光強度 ＦＩＧ、１３Ｄ 抗原提示細胞 ＩＦＮ−ｙ　（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、１４Ａ 応答性Ｔ細胞 ＩＬ−２（単位／ｍ１） ＦＩＧ、１４Ｂ ＦＩＧ、　１５Ａ Ｆ　ＪＧ、　１５８ ＦＩＧＵＲＥ　１６０ ０１ＬＩＯＩＬ４　０１ＬＩＯＩＬ４ ＦＩＧ、１７Ａ ＩＬ−６（ｎｇ／ｍＬ） ＦＩＧ、１８Ａ ＩＬ−６（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、１８Ｂ ＩＬ−１０（単位／ｍ１） ＦｊＧ、１９４ ウェル当りのマクロファージ数 ＦＩＧ、　１９Ｂ ２４　４８　７２　２４　４８　．７２時間（時）　時間（時。

ＦＩＧＵＲＥ　２０Ａ　ＦＩＧＵＲＥ　２０ＢＦＩＧＵＲＥ　２０ＣＦＩＧＵＲ Ｅ　２０ＤΔ　ＰＢＳ ＩＩＯ・０５μ９１Ｌ−１０ ｏ　Ｏ，１Ｊ、Ｌ９１Ｌ−１０ Ａ　０．５　ｇｇ　ＩＬ−１０ ｏ　１．Ｏｇｇ　ＩＬ−１０ ・１０．Ｏｐｇ　ＩＬ−１０ ＦＩＧＵＲＥ　２１　。

州　辿　Ｉｔ（積） 州　＃−井　（次） ＬＰＳ注射後の時間（時） ＦＩＧＵＲＥ　２３ １００　１０ｔ　１ｏ２’　１０３　１０４Ｉ　ｆ　Ｇ、　２４Ａ １ｇＭ ＦＩＧ、２４Ｂ １ｇＭ ＦｆＧ、２４Ｇ １ｏｏ　１０１　１０２　１０３　１０４ｇＭ ＦｆＧ、２４Ｄ 実験動物 ＦＪＧ、２６Ａ 実験動物 ＦＩＧ、２６Ｂ ＣＤ３ Ｆ　ｆＧ、　２７Ａ ＣＤ３ ＦＩＧ、２７Ｂ ＣＤ３ ＦＩＧ、２７Ｃ ＣＤ３ Ｆ　ＩＧ、　２７Ｄ 実験番号 Ｆ　ＩＧ、　２８Ａ 実験番号 ＦＩＧ、２８Ｂ の 実験番号 ＦＩＧＵＲＥ　３２ 実験番号 ＦＩＧＬＪＲＥ　３３ ＦＪＧ、３４Ａ 峙 Ｆ　ＪＧ、　３４８ 時 ＦＩＧ、３４Ｇ 時 ＦＩＧ、３４Ｄ ○　２０４０　６０　８０ 時 Ｆ　ＩＧ、　３４Ｅ 時 Ｆ　ＩＧ、　３４Ｆ １９Ｍ Ｆ　ｆＧ、　３６４ ＦｆＧ、３６Ｂ １ｇＭ ＦＩＧ、３６Ｃ １９Ｍ　ＩＱＭ Ｆ　ｆ　Ｇ、　３７Ａ　Ｆ　ＪＧ、　３７８ＩｇＭ　ＩｇＭ Ｆ　ＪＧ、　３７ＣＦ　ｊＧ、　３７ＤＦ　ｆＧ、　３８Ａ　Ｆ　ＩＧ、　３８ ８ＪｇＭ　ＩＱＭ Ｆ　ＩＧ、　３８ＣＦ　Ｉ　Ｇ、　３８Ｄ令（週） ＦＩＧＵＲＥ　４０ ＦＩＧ、　４２Ａ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　４２８ 脛 箱 細体４１＠−（ま） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．宿主における炎症またはＴ細胞媒介免疫機能を調節する方法であって、該宿 主に対して有効量のインターロイキン−１０またはその類似体、アゴニスト若し くはアンタゴニストを投与する工程を含む上記方法。
2. ２．前記の炎症またはＴ細胞媒介免疫が、腫瘍壊死因子アルファの異常濃度を伴 う請求項１に記載の方法。
3. ３．前記の投与がインターロイキン−１０に関する請求項２に記載の方法。
4. ４．前記の炎症が腫瘍壊死因子アルファの異常濃度を伴う、炎症の調節に関する 請求項１に記載の方法。
5. ５．前記の投与が、インターロイキン−１またはインターロイキン−６の濃度を 更に調節する請求項４に記載の方法。
6. ６．前記の異常濃度を上昇させる請求項４に記載の方法。
7. ７．前記の異常濃度が微生物感染を伴う請求項４に記載の方法。
8. ８．前記の異常濃度が、発熱、低血圧症、組織壊死、代謝性アシドーシスまたは 器官機能不全を伴う請求項４に記載の方法。
9. ９．前記の微生物感染が、敗血症性ショック、毒素性ショック、髄膜炎菌性髄膜 炎またはマラリアの症状を引起こす請求項７に記載の方法。
10. １０．前記の宿主が細菌に感染している請求項４に記載の方法。
11. １１．前記の細菌感染がグラム陰性細菌による請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記の細菌感染が敗血症性ショックの症状を示す請求項１１に記載の方法 。
13. １３．前記の細菌感染がグラム陽性細菌による請求項１０に記載の方法。
14. １４．前記の細菌感染が敗血症性ショックの症状を示す請求項１３に記載の方法 。
15. １５．宿主における敗血症性ショックを治療する方法であって、有効量のインタ ーロイキン−１０を投与することを含む上記方法。
16. １６．宿主における毒素性ショックを治療する方法であって、有効量のインター ロイキン−１０を投与することを含む上記方法。
17. １７．宿主における自己免疫疾患を治療する方法であって、有効量のインターロ イキン−１０アンタゴニストを投与することを含む上記方法。
18. １８．前記の自己免疫疾患がＢ細胞に媒介される請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記の自己免疫疾患がＴＮＦαに媒介される請求項１７に記載の方法。
20. ２０．前記のインターロイキン−１０アンタゴニストが抗体分子である請求項１ ７に記載の方法。
21. ２１．前記の抗体分子がインターロイキン−１０に対して結合しうる請求項２０ に記載の方法。
22. ２２．前記の投与が、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−６またはイン ターロイキン−１の少なくとも１種類を調節する請求項１７に記載の方法。
23. ２３．前記の宿主がマウスである請求項１７に記載の方法。
24. ２４．前記のマウスがＮＺＢ／Ｗである請求項２２に記載の方法。