JPH07502112A - 悪性及び前悪性状態の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 悪性及び前悪性状態の検出 本発明は、子宮頚部の悪性及び前悪性状態の検出に関し、より詳細には、頚部の 塗床より得た細胞標本の観察に基づく検査方法に関する。

子宮癌は、世界中の問題であり、いくつかの国では婦人の癌死の主要な原因とな っている。その初期及び前悪性状態においては、子宮上皮内異常増殖（ＣＩＮ段 階１〜３）として知られ、この病気の治療は、安全がっ成功裡に行い得る。

従って、早期かつ正確な診断の重要性が強調される。

悪性または前悪性の異常細胞を検出する標準的方法は、一般的にパップテストと して知られるパパニコロー検査である。この検査法は、１９４０年代に導入され たが、今日まで、子宮頚部の初期病巣の指標としての精度、及び信頼性を調べる 大規模な臨床試験が、全く行われていなかった。しかし、疫学的証拠により、こ の検査には不穏な程高率な誤差があることが示唆された（ミソチェル及びメドレ ー（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　＆　Ｍｅｄｌｅｙ）、Ｂｒ、Ｍｅｄ、Ｊ、３３７，２６ ５−２６７）。この方法は、子宮頚部から組織サンプルを採り、顕微鏡用スライ ドガラスに塗床し、染色する手順から成っている。この方法に対する主たる批判 は、この方法が、最適条件のサンプリングと、細胞学者による経験を積んだ主観 的診断に依存することである。本検査では、長時間のうんざりする顕微鏡観察が 行われ、その退屈さゆえに、結果的に観察に誤りを生じさせる。何よりもこの方 法は、定量的ではない。ＤＮＡ染色を基礎とする測定や、異数性の度合いの推定 を含む、それに代わる試みが行われたが、これらの方法の多くは時間を要し、ま た診断を高度な装置に依存するため、自動化が困難となっている。

本発明は、既知のパップ・テストより精度が高く、信頼できる、前記医学的状態 の検出方法を提供することを目的とする。

本発明の他の目的は、検査中の患者の状態の定量的評価を可能とする、前記方法 に類する検査方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、自動化手順に修正可能な、前記方法に類する検査方 法を提供することである。

本発明は、頚部細胞サンプルの観察によって頚部の悪性又は前悪性状態を調べる 検査方法から構成され、この検査は、主として上皮細胞を含むサンプルの分画に ついて実施される。検査する所望の細胞分画からの頚部細胞サンプルは、従来の パップテストと同様に、頚部の塗床によって得ることが好ましい。

検査及び試験を目的として、もとのサンプル中に存在する細胞の上皮分画を選択 するためには、種々の方法が可能である。選択には、不要な細胞物質からの所望 の分画の物理的除去が含まれるが、事実上選択が検査手順自体の一部として行わ れる別法が可能である。上皮細胞を分離する明瞭な行程を要しない検査方法にお いては、例えば流動細胞計測法を使用してもよい。流動細胞計測法は、後続の検 査のため、サイズによって細胞を分離するために用いることができる。従って、 上皮細胞あるいは抗体又は他の試薬とともにその中に存在する物質は、混入物の 物理的除去の前行程を必要とせずに、これら細胞を分離し、検査することを可能 とする。例えば、定常的な塗床によって得た細胞をＰＢＳ等の塩溶液中に希釈し 、十分注入して単一細胞懸濁液を得ることができる。これは、固定し、異種細胞 へ結合しても又はしなくてもよい種々の蛍光抗体を用いて染色できる。洗浄後、 細胞懸濁液について、流動細胞計測を行うことができる。酵素等の重要な細胞成 分へ蛍光抗体を生じさせることにより、流動細胞計測によって細胞種を選択する ことができる。もし、他の成分に対して他の蛍光抗体が生じるならば、同一細胞 集団中で同時に二種の抗体を測定することが可能であろう。

細胞の所望の分画は、以下により詳しく述べる方法による細胞の検査に先行する 別個の手段により、他成分と分離することが好ましい。浮遊密度法は、本発明の 目的の上皮細胞の分離に極めて適している。特に効果的な方法は、密度勾配遠心 分離である。この種の方法は、研究対象たる異常性の判定を妨害する炎症性細胞 、細胞破片及び粘液等の物質の除去に極めて有効である。

各種分画の明瞭なバンドを得るためには、不連続勾配遠心分離は極めて有効であ るが、連続勾配法は利用性が低く推奨できない。勾配用の物質は広範囲にわたっ て使用可能であり、本発明による使用には、細胞、特に上皮細胞に対して損傷を 与えない所定濃度での浸透圧モル濃度に依存して、適当な物質を容易に選択でき る。塩化セシウム等の一般的な無機塩勾配は、グリセロール、蔗糖、デキストラ ン、牛血清アルブミン及び、パーコール（ＰｅｒｃｏｌｌＸファルマシア社のコ ロイドシリカ製品）及びフィコール（フォルマシア社提供の蔗糖とエピクロルヒ ドリンの共重合体）、メトリザミド（Ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）及びナイコデン ズ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）　（ナイエガード（Ｎｙｅｇａａｄ）社のヨウ素化芳香 族化合物製品）として知られる特許物質を含む有機物質に対しては、あまり好ま しくない。パーコール及びフィコールは、本発明の目的に優れた結果を生じ、極 めて好ましい。

分離すべき所望の細胞バンドは、パーコール密度勾配で測定した場合に約１゜０ ３５から約１．０５５ｇ／−の密度範囲の分画であるか、またはそれに相当する ものであることが見出されている。密度勾配性以外の方法は、前記パーコール密 度勾配によるものに相関する分画を分離するために代用して使用することができ る。

所望の分画の分離後、種々の細胞検査法を利用することができる。分離した分画 中の異常な性質を有する細胞の割合は、細胞計数によって測定できる。しかし、 本発明の重要な目的は、病気が進行していると思われる段階の定量的判定法を提 供することであることが理解されなければならない。本発明の定量的利用方法は 、二つの主たるカテゴリーに分けられる。これらのうちの第一は、記載の都合上 、本文において細胞化学的方法と呼ぶ、無傷細胞に対して行った検査を含むもの である。これらの方法は、例えば、一般的な細胞染色方法が用いられた場合のよ うに、細胞全体中に形成され、または細胞全体により吸収されたマーカー物質の 判定を通常含むものである。細胞化学的方法は、吸光分光分析又は比色法、ある いは例えばミクロデンシトメトリー及び流動細胞計測等、他の方法で測定可能な 生成物を形成する、無傷細胞中で実施される生化学反応を用いることができる。

本発明による定量的利用方法の第二のカテゴリーには、溶解細胞及び細胞抽出物 に対して行われる検査がある。生化学反応と言えるこれらの反応は、極めて好ま しい方法である。生化学的方法は、正常細胞と異常細胞との相違を検出するため 、上皮細胞の生化学的モニタリングを必然的に伴う。この関連において特に重要 なものは、その発現が細胞増殖条件下における正常値以上に上昇する、つまり活 性面又は量的面、又はその両面で上昇する、ある種の酵素又は他のタンパク質の 含量の測定方法である。この目的のため、酵素又は他のタンパク質の蛍光モノク ローナルあるいはポリクローナル抗体結合を含めた、生化学的または蛍光検定法 を用いることができる。かかる酵素の適当な例は、ベントースリン酸経路酵素、 オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）及びリボヌクレオ チドレダクターゼ（ＲＮＲ）である。現在、ＯＤＣとＴＫ双方の検定の標準法は 、放射性物質の使用を必要とする。これらの方法は、ＯＤＣについてはスコツト （Ｓｃｏｔｔ）　ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、７９．４０９３　（１９８２）、 ＴＫＩ：ライてはイベス（Ｉｖｅｓ）ら、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２８． １９２（１９６２）により報告されている。比色又は蛍光分析法あるいは抗体生 成による別法における非放射性物質の使用は、極めて好ましい。現在好ましい選 択は、ベントースリン酸経路酵素の１又は２以上、特にグルコース−６−リン酸 デヒドロゲナーゼ及び／又は６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼである。

かかるデヒドロゲナーゼ検定を実施するため、細胞を界面活性剤及び検定に用い た抽出物中で、例えばＮＡＤＰ”とグルコース−６−リン酸または６−ホスホグ ルコネートのみから成る基質を用いて溶解してもよい。フェナジンメトスルフェ ート（ＰＭＳ）等の循環性電子受容体及びジクロロフェノインドフェノール（Ｄ ｃＰＩＰ）又はニトロブルーテトラゾリウム（ＮＥＴ）等の最終電子受容体を酸 化することもできる。活性の測定は、６００ｎｍ分光光度分析又は５４０ｎｍの ミクロデンシトメトリーで行うことができる。

前記のごとき酵素検定は、生化学的検定キット用として、慣行の方式で試薬が別 々の容器に入ったキットの形で供給される試薬を用いて容易に実施することがで きる。各試薬は、−回の試験に必要な単位量あるいは試験を連続して実施する場 合アリコツトの分配が可能な複数単位で、別個に包装してもよい。前記試薬に関 し、これら試薬の不存在下でのいかなる反応をも回避するため、使用が好ましい 基質濃度は、細胞化学的及び生化学的検定のいずれについても、２．５〜３゜５ ｍＭのグルコース−６−リン酸又は６−ホスホグルコネート、０．４５〜０゜５ ５ｍＭのＮＡＤＰ”、０．０５５〜０．０６５ｍＭのＤｃＰＩＰ又はＮＢＴ、０ ．１０〜Ｏ：　１８ｍＭのＰＭＳの範囲内である。

オペレーターの便宜のため、検定用試薬に加えて、前記キットには、上皮細胞の 予備的遠心分離に必要な勾配物質を含まれることが好ましい。これらは、例えば パーコールに関して前記した不連続勾配法に必要な密度範囲に及ぶ所望の濃度へ 復元するため、溶液の形で、あるいは乾燥物質として与える。

従って、本発明は（ｉ）本試験を妨害する混入物質からの子宮頚部の上皮細胞の 分離、及び（ｉ　ｉ）これら分離細胞の異常の鋭敏な検出方法の開発、に基づい て、前悪性状態の簡易かつ信頼度の高い検査方法を提供することであると理解さ れる。

また、本発明により、生化学的方法の感度を、酵素比の測定によって増幅するこ とができる。従って、前記それらの酵素の検定は、悪性または前悪性細胞中で抑 制された他酵素の活性レベルを測定して補うことができる。用語「抑制された」 とは、活性又は量的面のいずれかで抑制されたレベルにあることを意味する。

二組の酵素の比（減少に対する増加）は、細胞の異常性の鋭敏な指標となる。か かる抑制された酵素の例は、例えばカタラーゼについて、過酸化水素の存在下で の酸素の発生等の既知方法により簡便に測定できるカタラーゼ及びキサンチンオ キシダーゼである。

前記生化学的方法を用い、ベントースリン酸経路の酵素を、増幅リサイクル技術 を用いて分光光度法によって測定し、カタラーゼを過酸化水素濃度の減少あるい は酸素を極装置中での酸素の発生のいずれかによって定量する。

診断目的に用いる活性比を得るために検討した細胞分離方法及び反応系の実施例 を以下に記載する。

実施例１：サンプリング及び勾配分離 サンプリング 定期的に健康診断を受けている健康な婦人、及び異常の疑いがあるために対象と された膣鏡臨床患者から頚部組織を得る。サンプルを木製スパーチル、ジョーダ ンスパーチルまたは各種の細胞ブラシを用いて採取し、直ちに減菌した冷リン酸 緩衝液を含む、通錆のビンへ入れる。これらサンプルの処理は、６時間までは遅 らせることは可能だが、採取後直ちに実施することが好ましい。但し、サンプル の一部を処理し、５〜１ｏ％ＤＭＳＯ中で凍結すれば、酵素活性の僅かな消失を 伴うものの、数日後に所望の検定を行うことも可能である。

酵素活性の消失が最小となることを明らかにするため、哺乳動物上皮細胞株を用 いて各種保存条件について試験した。Ｇ６ＰＤ活性に関する結果を表１に表す。

表１ 保存条件　検定時期　Ｇ６ＰＤ活性 （処理後口数）　（単位／分／１０′細胞）保存なし　直後（対照＞　０．１０ ０ −７０’Ｃ４０ −７０６Ｃ（＋１９６ＤＭＳＯ）　４　０．１９０−７０’　Ｃ（＋１０％ＤＭ ＳＯ）　４　０．０７ＯＮｚ　４　０．００４ Ｎ２　（＋１％ＤＭＳＯ）　４　０．０２１Ｎ＊（＋１０％ＤＭＳＯ）　４　０ ．０６５前記表において、細胞は確立された細胞系に由来し、密度勾配分離処理 を要しないものである。臨床の頚部材料の場合、類似の保存方法を密度勾配分離 の前後のいずれにも用いることができる。これは、もしこの試験の婦人科の臨床 または膣鏡での実用化を考慮するならば、前記方法における重要な段階である。

勾配分離 異なる密度のパーコール溶液（ファルマシア製、＜２５ｍＯｓ／Ｋｇ水、密度１ ．１３０ｇ／ｄ）を調製し、混じらないよう、また密度の下降を避けるため、互 いの頂部に注意深く層を形成して、不連続密度勾配を得る。

希釈液の調製に用いた式を以下に示す。

Ｐ−（ｏ、１ｘＰ、。）−０，９ 式中、 ｖ０＝パーコールの容積（原液）ｒｄ ■＝最終作用溶液の容積− Ｐ＝最終溶液の所望の密度ｇ／ｍ１ Ｐｏ＝パーコールの密度（原液）　ｇ／ｒｒｄ！Ｐ、、＝１．５Ｍ食塩の密度＝ １゜０５８　ｇ／ｍｌ従って、１００−の最終作用溶液（Ｖ）及び原液パーコー ル（Ｐ、）の所望の密度（Ｐ）１．０８５ｇ／−及び密度１．１３０ｇ／ｍｌに 対して、加える原液パーコール量は、６０．９２−である。その浸透圧モル濃度 は、１．５Ｍ食塩（Ｐ、。）１０−の添加によって維持される。蒸留水で最終容 積を１００−にする。

頚部細胞の分離に最も適当な密度は、１．０８５ｇ／ｍｌ、１．０５５ｇ／ｒｎ ｌ、１．０３５ｇ／ｄ、１．０２５ｇ／ｒｄであることが見出されている。これ らの密度は、もし出発物質中の混入が最小であるならば、その密度の１又は２を 省略してもよい。同様に、もし出発物質が高濃度の混入物を含むならば、勾配分 離の反復か必要となる。各溶液は、他の溶液の頂部へ注意深く層を形成する。

細胞懸濁液をブラシ又はスパーチルで、ＰＢＳ溶液中へ振って取り出す。細胞を 分散させるため、２１ＧＸ１．５“の針の付いた１ｒｎｌの注射器を使って静か に注入したのち、懸濁液全体を、５分間ベンチトップ遠心分離機中で８００〜１ ０００’ｒｐｍ（４００ｇ）で遠沈する。上清を慎重に除き、およそ１艷の細胞 懸濁液を残す。これを慎重に予め調製した不連続密度勾配上に層とし、１０分間 ２０００ｒｐｍ（９００ｇ）で遠沈する。

これにより、数個の異なる細胞のバンドが得られ、これらを別々の管中へ取り除 く。最上層には、細菌・炎症性及び上皮細胞の混合物が含まれる。中央のバンド は、主として上皮細胞と、時折数種の基底細胞を含み、これらの細胞は重要であ る。これらの中央のバンドは、三本まで存在することができ、それらは形聾上他 のものと区別できない。これらは通常結合している。最下層には、赤血球細胞、 死滅細胞及び細胞破片が含まれる。これら細胞をＰＢＳで二度洗浄し、パーコー ルを取り除く。この方法による精製では、さらに混入する白血球細胞の除去を行 う。これは、しばしばさらに分離段階を必要とし、同じ勾配中へそれらを二度通 すか、あるいはそれらを分離するため（４００ｇｌＯ分間での遠心分ｌｌｉ＃） フィコール勾配を用いるかのいずれかの方法がある。この場合、白血球細胞は表 面に残り、上皮細胞は底へ沈殿する。本勾配調製物は全く自動化に適し、数回実 施した不連続勾配を凍結し、そして浮遊密度特性の損失なしに融解することがで きる。

実施例２・全細胞中の６ＰＧＤ活性の細胞化学的測定細胞化学的定量の利点は、 測定されるベントースリン酸経路の酵素の活性が、実際に分離された細胞から得 られることが確認できることである。この場合、グルコース−６−リン酸を解糖 系によって実質的に代謝できる長い培養期間があるため、経路中の第２の酵素が 測定される。従って細胞化学的判定は、ベントースリン酸経路活性の判定基準と して、６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを用いる。

物質は、実施例１で述べたように得、同様に不連続のパーコール密度勾配を通過 させる。細胞の選択及びその細胞の洗浄後、これらの疎らな集団を予め洗浄した スライド上に塗床し、風乾する。

この系での最終電子受容体は、生化学的反応系におけるＤｃＰＩＰの代るＮＢＴ である。ＮＥＴは、黄色の複合体であり、還元されて青色の沈殿を生成する。

この連続反応は以下のとおりである。

（ｉ）６−ホスホグルコネート＋ＮＡＤＰ＋２Ｈ″″−−→リブロースー５−リ ン酸十ＮＡＤＰＨ。

（ｉｉ）　ＮＡＤＰＨｚ　＋ＦＭＳ−→ＰＭＳＨ，＋ＮＡＤＰ（ｊｉＤＰＭｓＨ ，＋ＮＢＴ−ＰＭＳ十還元Ｍホルマザン（黄色）　（青色沈殿、最大光学密度５ ４０　ｎｍ）このホルマザンの沈殿は、５４０ｎｍで特徴的な最大吸収を持ち、 細胞質内に光学Ｗ！微鏡で不溶性粒子として見ることができる。染色の程度は、 酵素活性に比例し、個々の細胞ごとに異なる。６ＰＧあるいはＮＡＤＰ中のいず れかが存在しなければ染色は起こらない。５４０ｎｍでの吸収は、コンピュータ ー化したミクロデンシトメトリーによって測定する。簡単に言えば、この方法は 、オペレーターによって選択された細胞のデジタル像の同一スライドからのブラ ンクの背景との比較を用い、全吸光度及び平均吸光度が得られる画像成分の個々 の吸光度を計算することからなる。ビデオ画像は、狭いバンドの干渉フィルタ（ λ＝５４０±１０ｎｍ）（グレン・スペクトラ・リミテッド）及びＩＯＸの対物 レンズを用いるツァイス光学顕微鏡に、ヒタチＫＰ４ビデオカメラを取り付けて 撮影した。

明度データは、ＣＹＴＡＢＳ版プログラム（著作ｍＤＪｓ）を採用する、ＰＤＰ １１／２３＋ホストコンピューターへ連動した、インチレフト２００画像分析装 置で処理した。

パーコール試薬には以下を要する。

グリシルグリシン緩衝液　０．５Ｍ水溶液（４°Ｃ）６０ｄ　Ａ（１）８８．　 ５） ６−ホスホゲルコネー）　１０ｍＭ水溶性凍結ビン（−２０°Ｃ）（６ＰＧ酸ナ トリウム塩）　２（７Ｂ ＮＡＤＰ”　５ｍＭ水溶性凍結ビン（−２０℃）（ナトリウム塩”）　１０ｒＩ ＬＩＣ ニトロテトラゾリウムブルー　１％水溶性凍結ビン（−２０°Ｃ）（ＮＥＴ）　 ｌ　Ｏｄ　Ｄ フェナジンメトスルフェート　４．３■凍結ビン（−２０°Ｃ）　Ｅ（ＰＭＳ） 試験手順は以下のとおりである。

■９分離した細胞を、清浄なスライドガラス上に塗沫し、風乾させる。

２、褐色容器中でＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ及び蒸留水ｌＯ−を混合する。

３、スライド上にサンプル当たり１ｍｊの混合液を慎重に加え、塗床細胞全体を 覆う。

４　これを直ちに暗室中、３７°Ｃで４０分間インキュベートする。

５、反応混合液を静かに捨て、蒸留水で２回慎重に洗う。

６、エタノール中で固定する（７０％１分、９０％１分；９５％１分及び１００ ％１分）。

７、キシレン中で洗浄する。

８　デペックス（Ｄｅｐｅｘ）マウント媒質中にマウントする。

正常組織の塗床の場合、大部分の細胞の吸光度は低い。対照的にＣＩＮが１．２ 又は３等の異常論法の多くは、著しく高い吸光度をもった細胞を一定比率含んで いる。光学濃度単位０．１５のカットオフ点を取り、この値より大きい染色度の 細胞数を計数することにより、正常サンプルと前癌性サンプルの結果を比較でき る。これを自動化行程として含めるプログラムの調整は容易に行える。この方法 で分析した試験材料の例を以下に示す。

表２ 診断　全細胞数　０．　Ｄ、５４ｏ＞ｏ、１５　全細胞数に対するである細胞数 　百分率 正常　１１９　０　０ 正常　１０５　０　０ 正常　＋０４　０　０ 正常　１１６　３　２．６ 正常　９７　３　３ 正常　１２７　５　３．９ 正常　１０１　４　４ 正常　１２４　１１　８．９ 正常　１１２　１１　９．８ 正常　１０４　１９　１８．３ ＣＩＮＩ　１１４　１　０．９ ＣＩＮ１　１０５　９　８．６ ＣＩＮ＋　１０２　１３　１２．７ ＣＩＮＩ　１０７　１７　１５．９ ＣＩＮＩ　７０　１１　１６．０ ＣＩＮＩ　１０４　１７　１６．４ ＣＩＮＩ　１０２　２３　２３．０ ＣＩＮ２　１０３’　６　５．８ ＣＩＮ２　．６６　８　１２．０ ＣＩＮ２　１０５　１５　１４．３ ＣＩＮ２　１００　、　１２　、　１２．０ＣＩＮ２　１１６　２１　１８．０ ＣＩＮ２　１１１　２８　２５、０ ＣＩＮ２　１０５　３０　２９．０ ＣＩＮ２　１１６　３８　３３．０ ＣＩＮ３　１０　２０　１９．６ ＣＩＮ３　１１６　２３　１９．８ ＣＩＮ３　１０４　２９　２７．９ （ｌＮ３　１３１　４１　３１．３ （ｌＮ３　１２０　４０　３３．４ ＣＩＮ３　１０１　３５　３５．０ ＣＩＮ３　１１３　４１　６．３ ＣＩＮ３　１１８　４５　３８．Ｉ ＣｌＮ３　１１２　６３　５６．３ 測定した全細胞数に対する百分率として表した場合、本方法は、生化学的試験（ 実施例３参照）の場合と類似した分布を示した。生化学的検定（実施例３参照） では、はぼ１，０００倍多い細胞が測定されることを考慮すると、細胞化学的検 査結果は、正常サンプルとＣＩＮサンプルとの間に、より多くの重複を生じてい る。細胞化学的検査のために開発されたミクロデンシトメトリープログラムの進 歩により、細胞の大集団を短時間で測定でき、それにより、この方法の感度は生 化学的検査の感度に比して増加している。

実施例３：溶菌化上皮細胞中の０６ＰＤ活性の生化学的測定（１）計数及び後続 の細胞溶解 この方法は、０．４−のＰＢＳ、５０μｌの２％トリパンブルー及び５０μｌの 細胞懸濁液を含存する小型の管を必要とする。分離した細胞を血球計で計数し、 トリバンブルーの吸収を調べ、存在する白血球数を推定する。細胞を再度遠沈し 、細胞を溶解するため０．　１％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０界面活性 剤０゜５ｍｌで置き換える。細胞溶解液を攪拌し、氷上に載せる。

（２）生化学的方法 用いた方法は、核酸の合成に不可欠な前駆物質であるリボース−５−リン酸と同 様に、脂質の生合成及び他の還元反応に必要なＮＡＤＰＨを生じるグルコース代 謝の再利用経路である、ベントースリン酸回路の最初の段階に基づ０てνする。

この経路は、ＤＮＡ合成の必要性が増すと、細胞増殖において刺激される。

この検定法は、二つの基質（ＧａＰ及びＮＡＤＰ”’）　、循環性電子受容体及 び最終電子受容体を用いる。最終電子受容体は有色の複合体であり、還元１二よ り色を失う。色の消失の速度は、被験サンプル中の酵素活性に比例する。二つの 電子容体は、フェナジンメトスルフニー）−（ＰＭＳ）及び２．６−ジクロロフ エノインドフエノール（ＤｃＰＩＰ）であり、反応は以下のとおりである。

（ｉ）グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤＰ＋２Ｈ”　−６−ホスホグルコネート ＋ＮＡＤＰＨ。

（ｉｉ）ＮＡＤＰＨｔ　十ＰＭＳ→ＮＡＤＰ＋ＰＭＳＨス（ｉｉｉ）ＰＭＳＨ， ＋ＤｃＰＩ？　−一一→ＰＭＳ＋ロイコーＤｃＰＩＰブルー最大光学濃度６００ ｎｍ）（無色）この青色の消失は、分光光度測定により６００ｎｍでモニターさ れる。細胞処理及び酵素測定から成る一般的方法には、細胞の最終密度勾配遠心 分離とその後の細胞計数、細胞溶解及び分光光度法による測定が含まれる。

グリシルグリシン緩衝液　０．　５Ｍ（ｐＨ８，５）　２０ｙｄ、４℃　Ａグル コース−６−リン酸　５９ｍＭ水溶性凍結ビン６Ｊ、−２０″ＣＢ（０６Ｐ、ナ トリウム塩） ＮＡＤＰ◆　（ナトリウム塩）　１０ｍＭ水溶性凍結ビン５ｄ、−２０℃　Ｃジ クロロフェノインドフェノール　２ｍＭ水溶性凍結ビン２．８ｄ。

（ＤｃＰ’ＩＰ）　−２０°Ｃ（暗色容器中に保存）　Ｄフェナジンメトスルフ ェート　暗色容器中１２■（ＰＭＳ） ノニデットＰ４０　０．１％液１００ｒｎｌ、（４°Ｃ）グルコース−６−リン 酸　０．　１％ノニデットＰ４０溶液中に５０ｍ１デヒドロゲナ一ゼ酵素探準品 　Ｐ２Ｏ（４°Ｃ）前記に加えて、調製したパーコール密度（１，０８５，１， ０５５，１，０３５及び１．０２５ｇ／ｄ）の４本から、各２０−を実施例１の 要領で、細胞分離に供する。

分光光度計の波長を６００ｎｍへ設定する。波長と時間記録を設定して、固定す る。レコーダーを目盛りを検定する。密度勾配上の細胞を記載どおり分離する。

細胞の計数 細胞密度によって、０．　５ｒＩＬｌ又はｌ−のＰＢＳのいずれかを、細胞ベレ ットへ添加する。小管へ０．４−のＰＢＳ及び５０μｍの細胞懸濁液を加える。

血球系中で数える。希釈倍率を考慮して、全細胞数を計数する。細胞懸濁液を回 転して沈殿させる。ＰＢＳを除き、各サンプル及び渦へ０．５−の冷０．１％ノ ニデットＰ４０を加える。氷上へ置く。Ｇ６ＰＤ標準品を取り、氷上へ置く。

反応混合液の調製 全アンプルを解凍し、ＤｃＰＩＰ及びＰＭＳが極めて光感受性なため、光から保 護されるよう確認する。Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、及び５０ｄの蒸留水を混合する。この 混合液を光から保護する。これを分光光度計の付いた２５°Ｃの水浴上へ置く。

ＰＭＳ　（Ｅ）に蒸留水を加えて４−にする。光から保護する。

測定 ＤｃＰＩＰの強度の減少を６００ｎｒｎで測定する。二個のセルへ２．９５−の 反応混合液を加える。両セルへ５０−のＰＭＳ　（Ｅ）を加える。逆さにして混 合する。一方のセルへ０．　５１ｎ１ＯＮＰ４０を慎重に加える。泡がないこと を確かめる（逆さにする）。これをサンプルの断片中へ置く。別のセルを対照の 断片中へ置く。このセル中へ０．５１ｎｌの界面活性剤サンプルを加え、円形の プラスチックパドルで混合し、直ちに零点調整し、２分間の比（吸光度の減少） を測定する。

漂準品 前記のとおり反復するが、界面活性剤で希釈したＧ６ＰＤ酵素のみ、代わり（ご 用いる。

この方法を用いる我々の結果は、定期的に保健所に訪れる患者から採取した正常 な塗床から得たサンプルが、ＣＩＮの場合に比較して極めて低１，１Ｇ６ＰＤ活 性をもつことを示す。ＣＩＨのすべてのものを、従来の組織学的方法で診断した 。

下記データは、ＣＩＮの程度の識別は行わないが、陽性及び陰性の誤判定を最小 にするためへの、本方法の可能性を示している。

正常　ＣＩＮＩ　ＣｌＮ２　ＣｌＮ３　侵入悪性上皮性腫瘍０　２０　３０　２ ３０　１０．０００１．４　８２０　４５０　８０３ ２．０　８９０　９１７ ８．９ ６．０ ７．０ ９．７ ２７、０ ３６、０ この組み合わせの測定には、オペレーターは、Ｇ６ＰＤの測定のために提供され たキット形式を必要とし、また０、１Ｍ過酸化水素溶液、酸素電極、３７°Ｃの 水浴及びチャートレコーダーを必要とする。もし酸素電極のチャンバーが、１゜ ９−の容積を取るならば、細胞溶解液が１．５−を占めるであろう。過酸化物（ ０，１Ｍ）２００μｌを加え、モニター及びチャートレコーダーの検定後に比を める。

測定した活性が存在する酵素量に相関することを仮定した場合、活性の代わりに 、細胞中に存在するＧ６ＰＤの量の測定が、流動細胞計測によって定量できる、 ヒトＧ６ＰＤの蛍光抗体の使用によって可能である。この方法は、細胞集団間の 識別を可能にする流量細胞計測の容易性ゆえに、極めて早い判定、単−細胞分析 及び細胞分離の省略可能性等の利点を育する。

実施例４：酵素比法　Ｇ６ＰＤ／カタラーゼ前記実施例中に記載した検定法の変 形には、感性細胞中で減少する第２のパラメータの同時測定がある。キサンチン オキシダーゼ及びカタラーゼ等の酵素は簡単に測定され、異常性の検出は、増加 した酵素と減少した酵素活性を比で表すことにより改善される。例として、分離 細胞中でのカタラーゼの同時測定を記載する。

細胞を前述したように生化学的検定、すなわち勾配分離、細胞計数及び溶解等の 処理を行った。サンプルを分け、溶解液の半分を０６ＰＤの測定に用い、溶解液 の他の半分をカタラーゼ活性の測定に用いた。カタラーゼは、過酸化水素を容易 に酸素と水へ分解する。

２ＨｔＯｘ　−一−−−→２ＨｚＯ＋Ｏ□生成した酸素は酸素電極で簡単にモニ ターできる。生成した酸素量は酸素生成％／分／１０４細胞Ｘｌ０−’で、表さ れる。従って、カタラーゼ活性に対する例えばＧ６ＰＤの比は、以下のように表 せる。

１０’細胞ＸＩＯ”当たり分当たりＧ６Ｐ比　Ｇ６ＰＤ活性１０’細胞×１Ｏ− ｉ当たり分当たりカタラーゼ比　カタラーゼ活性カタラーゼと同時的Ｇ６ＰＤ定 量の例を、以下に示す。

表４ 診断　カタラーゼ　Ｇ６ＰＤ　比 ％０．／分１０’細胞×１Ｏ−ＩｕＺ分１０’細胞Ｘｌ０−’　Ｇ６ＰＤ／カタ ラーゼ正常　１７　０　０ 正常　５６　０　０ 正常　２７　０　０ 正常　３０’　ＯＯ 正常　３２　０　０ 正常　３９　０　０ 正常　５９　０　０ 正常　９８　０　０ 正常　ｉｏｏ　ｏ　。

正常　２３３　０　０ 正常　４３５　０　０ 正常　５３９　−　０　０ ＣＩＮＩ　３６　０　０ ＣＩＮＩ　２３　１３９　６．４ ＣＩＮＩ　３６　４５３　１２，６ ＣＩＮ２　’７３　２０２３　２８．０ＣＩＮ２　６　４００　６７．０ ＣＩＮ２　０゜４４　１６３　３７０．０ＣｌＮ３　３３　２３８　７．２ ＣＩＮ３　３６　４５８　１３．０ ＣＩＮ３　３３　４４０　１３．３ ＣＩＮ３　１９　４３５　２３．０ ＣＩＮ３　９．３　５００　５４．０ ＣＩＮ３　４．７　２８４　６０．０ 国際珈審報牛 ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１７６８ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１１５２７ 　６８０７−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＮｉ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ ，ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、 　ＣＨ，Ｃ５゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ 、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、 ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳＩ （７２）発明者　ジョナス　ジンジャ　カーリンイギリス国　ミドルセックス　 エイチェイ１４デイーニス　バーロウ　パトラ− ロード　２５ビー （７２）発明者　スレイター　トレバー　エフイギリス国　ミドルセックス　エ イチェイア　２アール　ジー　スタンモア　オールド　チャーチ　レイン　６９ 　スタンバーンハウス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．主として上皮細胞から成るサンプルの分画について試験する、頸部細胞サン プルの観察による頸部の悪性又は前悪性状態の検査方法。 ２．前記上皮細胞が、浮遊密度法により分離されていることを特徴とする請求項 １項に記載の方法。 ３．分離が密度勾配遠心分離によって行われることを特徴とする請求項２項に記 載の方法。 ４．不連続勾配が用いられることを特徴とする請求項３項に記載の方法。 ５．分離した分画が、バーコール密度勾配中で測定した場合、約１．０３５から 約１．０５５ｇ／ｍｌの範囲の密度をもつ分画であるか、又はそれに相応するも のであることを特徴とする請求項１ないし４項のいずれかに記載の方法。 ６．分離細胞を、さらに勾配遠心分離によって精製することを特徴とする請求項 ３，４又は５項に記載の方法。 ７．精製または再精製が、バーコールまたはフィコール勾配上で行われる請求項 ５又は６項に記載の方法。 ８．異常な特性を有する分離分画中の細胞の割合を測定することから構成される 、先行する請求項のいずれかに記載の方法。 ９．検査が、無傷の細胞に対して行われることを特徴とする、先行する請求項の いずれかに記載の方法。 １０．流動細胞計測を用いる請求項９項に記載の方法。 １１．細胞中に形成され、または細胞によって吸収されたマーカーの定量的推定 から構成される請求項９又は１０項に記載の方法。 １２．前記推定が、細胞染色法により行われる請求項１１項に記載の方法。 １３．前記検査を溶解した細胞で行うことを特徴とする請求項１ないし８項のい ずれかに記載の方法。 １４．前記検査が、増殖中の細胞に関連した酵素の異常レベルに対して行われる ことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。 １５．試験された酵素が、ペントースリン酸経路酵素、オルニチン脱炭酸酵素、 チミジンキナーゼ及びリボヌクレオチドレダクターゼのいずれかであることを特 徴とする請求項１４項に記載の方法。 １６．被験酵素が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び／又は６−ホ スホグルコネートデヒドロゲナーゼである請求項１４項に記載の方法。 １７．本検査の感度を高めるため、電子共役系を用いることを特徴とする請求項 １４項ないし１６項のいずれかに記載の方法。 １８．検査条件下で抑制される酵素のレベルを測定し、及び二種酵素のレベルの 比を測定することから構成される請求項１４項ないし１７項のいずれかに記載の 方法。 １９．抑制された酵素が、カタラーゼ又はキサンチンオキシダーゼである請求項 １８項に記載の方法。 ２０．光学的定量方法を用いることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに 記載の方法。 ２１．上皮細胞を選択し、頸部の状態の定量的指標を与える細胞又は細胞組成物 の細胞化学的又は生化学的反応により、頸部の状態を検査することから構成され る、頸部細胞サンプルの観察による頸部の悪性又は前悪性状態の検査方法。 ２２．上皮細胞が、前記サンプルから分離されることを特徴とする請求項２１項 に記載の方法。 ２３．分離細胞を計数し、溶解し、そしてその溶解液を、増殖細胞中に前記正常 レベルの活性又は量で存在する、少なくとも一種の酵素の定量的推定に用いるこ とを特徴とする請求項２２項に記載の方法。 ２４．前記酵素が、ペントースリン酸経路酵素である請求項２３項に記載の方法 。 ２５．前記酵素が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ又は６−ホスホグ ルコネートデヒドロゲナーゼである請求項２４項に記載の方法。 ２６．前記サンプルの不連続勾配遠心分離を行い、パーコール勾配での測定で、 １．０３５〜１．０５５ｇ／ｍｌの範囲内の密度をもつ、細胞の結合分画に相当 する細胞を採取し、その採取した細胞を計数し、また溶解し、検査条件下で一方 が高められ、他方が抑制されている溶解液中の二種の酵素の量を測定し、及び二 種の酵素の量比を算出することから構成される、請求項２２〜２５項のいずれか に記載の方法。 ２７．被験条件下で、増加レベルにある酵素基質、酵素の循環性電子受容体、サ ンプル中に存在する前記酵素レベルに相関する測定可能な指標を還元状態で与え る最終電子受容体から構成される、頸部細胞サンプルから得られた上皮細胞の検 査による頸部の前悪性又は悪性状態の検出に用いる試薬キット。 ２８．前記細胞サンプルからの落屑性及び／又は基底上皮細胞の遠心分離に用い る勾配物質を含む、請求項２７項に記載の試薬キット。 ２９．不連続勾配へ適当な密度範囲を与える勾配物質の分離溶液、又は該溶液へ 溶解するための乾燥物質を含む、請求項２８項に記載の試薬キット。 ３０．１．０３５〜１．０５５ｇ／ｍｌの密度範囲に及ぶパーコール勾配用の物 質、又はそれに同等の他の勾配物質を含む請求項２９項に記載の試薬キット。 ３１．前記酵素が、ペントースリン酸経路酵素、オルニチン脱炭酸酵素、チミジ ンキナーゼ及びリボヌクレオチドレダクターゼから選択される請求項２７〜３０ 項のいずれかに記載の試薬キット。 ３２．前記酵素が、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及び／又は６−ホ スホグルコネートデヒドロゲナーゼである請求項３１項に記数の試薬キット。 ３３．上皮細胞を溶解する試薬を含む、請求項２７〜３２項のいずれかに記載の 試薬キット。 ３４．被検条件下で抑制される酵素レベルを定量するための１又は２以上の試薬 を含む、請求項２７〜３３項のいずれかに記載の試薬キット。 ３５．前記抑制された酵素がカタラーゼであることを特徴とする請求項３４項に 記載の試薬キット。 ３６．前記循環性電子受容体が、フェナジンメトスルフェートであることを特徴 とする請求項２７〜３５項のいずれかに記載の試薬キット。 ３７．前記最終電子受容体が、２，６−ジクロロフェノインドフェノール又はニ トロブルーテトラゾリウムであることを特徴とする請求項２７〜３６項のいずれ かに記載の試薬キット。 ３８．２．５ないし３．５ｍＭのグルコース−６−リン酸又は６−ホスホグルコ ネート；０．４５ないし０．５５ｍＭのＮＡＤＰ＋；０．０５５ないし０．０６ ５ｍＭのＤｃＰＩＰ又はＮＢＴ；０．１０ないし０．１８ｎＭのＰＭＳの範囲内 の基質濃度を、細胞化学的及び生化学的検定の双方に用いることを特徴とする２ ７〜３７項のいずれかに記載の試薬キット。