JPH07502167A - 抗体セグメントレパートリー由来でファージに表示される抗自己抗体の産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

抗体セグメントレパートリ−由来でファージに表示される抗自己抗体の産生 本発明は自己抗原に対する抗体分子例えばヒト自己抗原に対するヒト抗体の単離 に関する。抗体分子を選択するのに用いるファージ表示法は国際特許願公開第＠ ０９２１０１０４７号、国際特許願第ＰＣＴ／Ｇ［ｌ９２１００８８３号、国際 特許願第ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１７５５号および英国特許願第９２０６３７２． ６号に記載されている。出願人らは、自己抗原に対する抗体が）１−ジ表示法を 用いて単離することができることを見出したのである。 ヒト抗自己抗体（ａｎｔｉｓｅｌｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、生体内治療および 診断を行うのに特に価値がある。というのは、異種の抗体例えばウスの抗体の抗 原性から起こる問題が回避されるからである。治療用に最も有用なヒト抗体は、 細胞表面分子例えば受容体、付着因子（ａｄｈｅｓｉｎ）およびインテグリンに 対する抗体、ならびに循環生物エフェクター分子例えばホルモン、成長因子およ びサイトカインに対する抗体である。このような自己抗原に対するヒト抗体を得 ることは極めて困難であった０本発明はこのような抗体を得る強力な方法を提供 するものである。 自己抗原に対して特異性を有する抗体フラグメントを単離することは厳しい仕事 である。動物は通常自己抗原に対して抗体を産生せずこの現象は寛容と呼ばれて いる（Ｇ、　Ｊ、　Ｎｏ５ｓａｌ＋　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４５巻。 １４７〜１５３頁、１９８９年）。自己免疫疾患は寛容性の破壊が原因である。 −触に自己抗原で予防接種をしても循環抗体を産生じない、それ故に、自己抗原 に対する抗体を、特にヒト中に生成させることば困難である。特にヒト抗原がマ ウスのような動物内の同等物に対して著しく密接な関係がない場合、その動物内 にヒト抗原を認識する抗体を生成させることは可能である。ヒト抗体が必要な場 合は、例えばＣＤＲグラフティング法（英国特許第２１８８６３８８号）によっ てその抗体を人間化（ｈｕ＠ａｎｉｓｅ）する必要がある。 国際特許願公開第［９２１０１０４７号に記載されているファージ抗体法はこの ようなヒト抗体を直接単離する技術を提供している。この出願において、我々は 第一に、自己抗原に対する抗体は、例えば非免疫化起源から誘導されるファージ ライブラリーならびに■遺伝子の配列の合成的組換え、好ましくはＤＨとＪＲに よるＶｌ（の組換えおよび几配列によるＶＬの組換えによって得られるライブラ リーから単離できるこを示している。これらの抗体はそれらの抗原に対して特異 的である。この出願は、上記の方法による単一のライブラリーが異種抗原および 自己抗原の両方の起源として利用することができ、あらゆる抗原に対する抗体を 単離する大きな普遍的なライブラリーの可能性を開くものであることを示してい る。 抗体フラグメントはバクテリオファージの表面に表示することが可能で抗原を補 捉するということは国際特許願公開第同９２１０１０４７号に開示された。抗体 フラグメントはこの特性を利用して直接選択することができる。このように、抗 体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ　、　５ｃＦｙおよびＶｌｌ）は、繊維状バクテ リオファージの表面へのそれらの表示を利用して単離できるということは、従来 単離することが困難かまたは不可能であった抗体の特異性（すなわち特定の抗原 に対する抗体）を単離する可能性を開いたのである。特に国際特許願公開第Ｗ０ ９２１０１０４７号には、抗体特異性は、ヒトが通常暴露されることがない２− フェニル−５−オキサシロンのような抗原に対する特異性でさえも、特別に免疫 化されていない（゛′非免疫化）ヒトから単離できることが示されている。 本発明の実施態様において、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、愚な どのような哺乳類の種由来の天然もしくは合成の抗体レパートリ−が、複製可能 な遺伝表示パッケージ（ｒｅｐ目ｃａｂｌｅｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｐｌａｙ　 ｐａｃｋａｇｅ　：　ｒｇｄｐ）の表面に表示され、自己（ｓｅｌｆ）に対する 結合特異性は自己抗原に対する結合で選択される。このプロセスで、■遺伝子の レパートリ−は、生体外または生体内で再配列された■遺伝子から誘導されるか 、または再配列されたＶ遺伝子の突然変異によって誘導される。その■遺伝子レ パートリーの重要な特徴は、配列が極めて多様であり通常１０６を上まわる異な るメンバーがあることである。充分に大きなライブラリーは、あらゆる自己抗原 に対する特異性の起源を提供することは実際に可能である。 そのＶ遺伝子レパートリ−は、抗体レパートリ−がｒｇｄｐの表面に表示される ようにｒｇｄｐ　（例えば繊維状ファージのベクター）中にクローン化される。 抗自己（ａｎｔｉｓｅｌ　ｆ）に結合するまれな抗体特異性をコードするｒｇｄ ｐは自己抗原に対する結合性によって選択することができる。抗体レパートリ− は、国際特許願公開第−０９２１０１０４７号および国際特許願第ＰＣＴ／ＧＢ ９２１００８８３号に記載されているように、単一レプリコンまたは二重レプリ コンのフォーマット中にクローン化することができる。 ■遺伝子は、ｒｇｄｐの遺伝物質にクローン化され、単一領域として、例えば単 一重鎮可変領域いわゆる単一領域リガントまたは“ｄＡｂ”（国際特許願公開第 Ｗ０９０１０１５４４号参照）として、または関連抗体（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ 　ａｎｔｉｂｏｄｙ）の重鎮と軽鎖の可変領域として発現させることができる。 これらの二つの領域は、別個のポリペプチド連鎖として（Ｆａｂフラクラント中 に、領域の非共有結合および／またはジスルフィド結合によって結合されている ）または上記連鎖の一部分として（二つの領域が同しポリペプチド連鎖内に含ま れている単一連鎖のＦｖフクラメント）表示することができる。 国際特許願公開第−０９２１０１０４７号およびこの出願の実施例１〜８におい て、我々は、抗体フラグメントの表示と選択と行うため、抗体フラグメントと、 繊維状バクテリオファージの遺伝子３タンパク質との融合を利用した。別の方法 しては、抗体フラグメントを、繊維状バクテリオファージの遺伝子８タンパク質 などの表面分子に融合させる方法がある。 ヒト抗原に対するヒト抗体の単離は厳しい仕事である。ＷＩ環しているヒト抗体 が自然に見つけられるヒト抗原の数はごく限られている。抗体はヒト起源の非自 己抗原に対して存在している。ヒト血液型Ｂに対する抗体は、血液型０の被検者 から作製したファージ表示ライブラリーから単離されている（Ｊ、　Ｄ、　Ｍａ ｒｋｓ　ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、＋２２２巻、５８１〜５９７頁、　１ ９９１年）そして血液型０は血液型Ｂの抗原を異種のものとして認識する。 本発明は、関連する抗原に対して特異的な、自己抗原に対する抗体の一般的単離 方法に関する。多くの患者は、かなりの濃度の循環自己抗体を示す、正常で健康 な個体中の８９７８球の１０〜３０％が自己抗体を作ることに関与していると推 定されている（１．　Ｒ，ＣｏｈｅｎおよびＡ、　Ｃｏｏｋｅ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、　Ｔｏｄａｙ＋　７巻、　３６３〜３６４頁、　１９８６年）。 しかし産生される゛天然の自己抗体′は、ＩｇＭの場合が多く低アフィニティー で多反応的（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）であるから治療用途にはむいていない （Ｐ、Ｃａ５ａｌｉおよびＡ、　Ｌ、　Ｎｏｔｋｉｎｓ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　 ｌ５ｕｓｕｎｏ１．＋７巻、５１５〜５３１頁、　１９８９年；Ｓ、　Ａｖｒａ ｗｅａｓ、　ｆｎｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ＋　１２巻、１５４〜１５９頁）、自 己に対する免疫応答は、自己免疫疾患中または感染後に生しることがあり、自己 抗原に対する少数のモノクロ−ナル抗体が、自己免疫疾患がみられる患者から単 離されている（に、　Ｊａｍｅｓおよび６１丁、　Ｂｅ１ｌ、　Ｊ、　ｆｎｕｎ ｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１００巻、５〜４０貝、１９８７年）、これらの自 己抗体は特異的な場合が多いが、抗原の限られた範囲のエピトープにした結合し ない（Ｍ、　Ｂｏｕａｎａｎｉ　ら、＾ｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、、　３ ４巻、　１５８５〜１５９３頁、　１９９１年）。 ＩｇＧ（またはｒｇＭ）抗体を分泌する形質細胞のｄＮＡ由来のＶ遺伝子ライブ ラリーを作製すると、自己抗体由来の抗体フラグメントを単離できるようになる かもしれない０例えば抗自己抗体は自己免疫疾患がみられる患者から単離される かもしれない０例えば抗アセチルコリン受容体抗体は、重症筋無力症の患者のＩ ｇＧ■ＲＮＡから作った抗体レパートリ−から単離されると予想される０例えば “ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに対して特異的な抗体フラグメントが、甲状腺自 己免疫疾患がみられる患者由来のバクテリオファージスライブラリ−から単離さ れている（Ｓ、　Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｂｊｏｃｈｅｓ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ｒｅｓ。 Ｃｏ＠ｓｕｎ、、　１７９巻、　３７２〜３７７　Ｌ　１９９１年）、シかしこ の単離には、１個のクローンを得るのに２００，０００個のプラークの広範囲な スクリーニングを行う必要があった。その上に、このライブラリーは甲状腺の組 織から誘導されたが、大部分の場合には容易に適用できない方法である。 これに対して、ファージ系を用いて利用できる選択力（国際特許願公開第−０９ ２１０１０４７号に説明されている）によって、疾病がみられないドナーの末梢 血液リンパ球のＩｇＭｄＮＡから自己抗体を容易に単離できる。我々は、ヒトチ ログロブリン（自己免疫症の徴候があるかまたはないヒトの血清中に見つけるこ とができる）に結合する抗体は、免疫化されていないヒトから作製したファージ レパートリ−から単離できることを実施例２に示す、多くのヒトのなかにチログ ロブリンの自己抗体が存在しているにもかかわらず、ヒトをヒトチログロブリン で免疫化することによって、ヒトチログロブリンに対する抗体を得ることができ るとは必らずしも予想できることではない、正常な血清中のチログロブリンに対 する自己抗体が高度の多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉ　ｔｙ）をもってい ることが多いと報告されている（Ｓ、　Ａｖｒａｓ＋ｅａｓの１９９１年の前記 文献）、これに対して、ファージ抗体法を行う本発明の方法を用いて単離される 抗体は（例えば実施例２参照）、チログロブリンに対して特異的である。 また本願では、我々は、ヒト腫瘍壊死因子−αに対する抗体でさえも、千ログロ ブリンに対する抗体と同じライブラリーから、実施例１に述べるように単離でき ることを示す、多くの自己抗原は、検出可能な関連循環自己抗体をもっていない 、さらに、実施例３には、自己抗原のムチン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびＣ ［１４に対する抗体の単離を示すが、これらの抗体は正常な血清には報告されて いない。 さらにこれらの抗体は特異的であるが、時には見られる天然の自己抗体中で高度 に多反応性であることが多い、大部分の自己抗原は検出可能な関連循環自己抗体 をもっていない、したがって本発明に記載されている抗自己抗体の単離によって 、循環ホルモンに結合してその作用を遮断、改変または強化する抗体、または細 胞表面抗原に結合して、例えば癌細胞を映像化するかもしくは殺す抗体のような 、多くの目的のためにヒト抗原に結合するヒト抗体を直接単離する可能性が開か れる。 ファージ表示ライブラリーから単離される抗自己抗体に関与する■遺伝子の起源 は明らかでない。免疫系による自己抗原に対する寛容性（自己抗体に対する抗体 の生成を防止する）は、自己反応性Ｂリンパ球のクローン欠失または官能性失活 （アネルギー）によって仲介される（Ｄ、＾、　Ｎｅｍａｚｅｅおよびに、　Ｂ ｕｒｋｉ、　ＮａＬｕｒｅ＋　３３７巻。 ５６２〜５６６頁、　１９８９年；Ｃ，Ｃ，Ｇｏｏｄｎｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ、 　３３４巻、６７６〜６８２頁、　１９８８年ｉ　Ｓ、　Ｂ、　１（ａｒｔｌｅ ｙら、ＮａＬｕｒｅ＋　３５３巻、　７６５〜７６９頁、　１９９１年；口、　 Ｍ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３５４巻、　３０８〜３１１頁、 　１９９１年）。いずれの場合も、大部分の抗原に対する循環抗自己抗体はほと んど検出できない。しかし、アネルギーの場合、Ｂ細胞系由来の官能性が失活し た自己反応性細胞は、末梢リンパ系器官に残り、循環してＢ細胞になる。抗自己 特異性を有するこれらのまれなリンパ球は、抗自己特異性を有するファージ抗体 に対する重鎮もしくは軽鎖のパートナ−（または両者のパートナ−さえも）を提 供する。あるいはこのような抗自己特異性は、ｖＨＮ域とりＬ領域のライブラリ ーの組合わせから生じ、天然に生じる場合には通常欠失している特異性を与える 。このため、国際特許願公開第ＷＯ９２１０１０４７号に記載されているような 組合わせライブラリーと°“連鎖がシャツフルされた（ｃｈａｉｎ−ｓｈｕｆＮ ｅｄ）″ライブラリーが、抗自己抗体の特に豊富な起源である。ファージ抗体が 提供するような強力な選択法が、かようなまれな抗自己抗体を得るのに必要であ る。 本願においてファージ法で単離された抗自己抗体フラグメントに見られる体細胞 突然変異の程度は、いくつかの抗体は生殖系列配列をもっているので処女Ｂ細胞 から生じたことを示している。本願でファージ抗体法によって単離された他の抗 体は、体細胞の高度の突然変異（ｈｙｐｅｒｓｕｔａｔｉｏｎ）を示し、これは ■遺伝子が、抗原の異種交差反応性抗原または他の異種の抗原によって刺激され たことを示している０両方の場合、ファージ法を用いて単離された抗体フラグメ ントは通常、Ｂリンパ球には本来存在していなかったＶＨとＶＬの領域の組合わ せであり、本願に記載されているファージ法の力によってこの単離が可能になる 。 本発明は、哺乳類の種の自己抗原である抗原に対して結合特異性を有する抗原結 合部位をもっている、特異的結合対のメンバー（ｓｂｐメンバー〕を得る方法で あって； （ａ）復製可能な遺伝表示パンケージ（ｒｇｄｐ）のライブラリーを準備し、各 ｒｇｄρはその表面にｓｂｐメンバーを表示し、そして各ｒｇｄρは、哺乳類の 前記種由来の配列を有する核酸を含有し、かつそのｒｇｄｐの表面に表示された ｓｂｐメンバーの要素部分であるポリペプチド連鎖をコードし；次いで （ｂ）前記自己抗原との結合によって、前記自己抗原に対し結合特異性を有する 一つ以上のｓｂｐメンバーを選択する；ことからなる方法を提供するものである 。 各ｒｇｄｐ内の核酸がコードするポリペプチド要素部分は、抗体のＶＨ領領域し くはｖＬ６１域であるか、または単独で、もしくは一つ以上の他の要素部分との 組合わせで、抗体を捕捉することができる抗体フラグメントを形成する抗体の部 分である。それ故に、上記のようにｓｂｐメンバーの要素部分として使用可能な ポリペプチド連鎖の例としては、ＶＦＩおよびＶＬの領域に加えて、ＶＬ　Ｃｔ 　、Ｖｎ　ＣＭ　１，５ｃＦｖのフラグメント、Ｐａｂフラグメントなどが挙げ られる。 ｒｇｄｐの表面に表示される前記の各ｓｂｐメンバーは、ＶＨｅｌ域と■Ｌ領領 域含有する抗体フラグメントである。 各抗体フラグメントは、５ｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、抗体の単 一アームのｖＬと■８の領域からなるＦ、フラグメント、特に重鎮可変領域（Ｆ ｄ）で構成されているかもしくはＦｄを含有しているリガンドを捕捉する単一領 域、またはエピトープもしくは抗原を捕捉することができる他のフラグメントで ある。 ｒｇｄｐのライブラリーを提供するステップは、（ｉ　）　ｒｇｄｐの要素に融 合されたｓｂρメンバーの第一ポリペプチド連鎖要素部分であって、組換え宿主 細胞生物内で発現する際に前記第−ポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団 を　表示し、またはｒｇｄｐの前記要素に融合された前記第一ポリペプチド連鎖 要素部分の集団を表示する上記第一ポリペプチド連鎖要素部分と、（ｉｉ　）ｓ ｂｐメンバーの第二ポリペプチド連鎖要素部分もしくはこのような第二ポリペプ チド連鎖要素部分の集団とを結合させ、ｒｇｄｐの表面に表示されるｓｂρメン バーのライブラリーを形成させ；前記第一もしくは第二のポリペプチド連鎖要素 部分またはその集団の少なくとも一つが、ｒｇｄｐの前記要素を使用してパフケ ージすることができる核酸によってコードされている；ことからなるステップで ある。 ｒｇｄｐのライブラリーを提供するステップは、ｒｇｄｐの要素に融合されたｓ ｂｐ部材の第一ポリペプチド連鎖要素部分またはかような第一ポリペプチド連鎖 要素部分の集団であって、ｒｇｄｐの表面で前記ポリペプチド連鎖要素部分を表 示する上記第一ポリペプチド連鎖要素部分を＆１１換え宿主生物内で発現し； 前記第一ポリペブチ１′連鎖要素部分もしくは集団と、ｓｂｐメンバーの第二ポ リペプチド連鎖要素部分もしくはかような第二ポリペプチド連鎖要素部分の集団 とを結合させて、その表面にｓｂｐメンバーを表示する各ｒｇｄｐのライブラリ ーを形成し、前記ポリペプチド連鎖要素部分の少なくとも一つが、ｒｇｄｐの前 記要素を用いてパフケージできる核酸から発現される；ことからなるステップで ある。 ｓｂｐメンバーがＦａｂフラグメントの場合、第一・と第二のポリペプチド連鎖 要素部分は■、およびＣ５の領域からなるポリペプチドであり、そして第二ポリ ペプチド連鎖要素部分は〜ｒ、ｌおよびＣ□ｌの領域からなるポリペプチドであ る。 第一と第二のポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団の結合は、第一要素部 分をコードする配列および第二要素部分をコードする配列を各々内部に導入され た発現ベクターにより核酸レベルで行われる。一方、この結合は、第一要素゛部 分が第二要素部分と同じベクターから発現されない場合ポリペプチドレベルで行 ってもよい。 実際には、第一および第二の要素部分の一方もしくは他方が可溶性ライブラリー として利用される。利用される各種のホーマットの詳細は、国際特許願公開第− ０９２１０１０４７号および国際特許願第ＰＣＴ／ＧＢ９２１００８８３号に記 載されている。 ライブラリーを提供するステップは、 （ｉ　）　ｒｇｄｐの要素に融合されたｓｂｐメンバーの第一ポリペプチド連鎖 要素、またはｒｇｄｐの要素に融合されたかような第一ポリペプチド連鎖要素部 分の集団をコードする核酸を、（ｉｉ　）　ｓｂｐメンバーの第二ポリペプチド 連鎖要素部分またはその集団をコードする核酸と結合させて、核酸のライブラリ ーを形成させ、前記ライブラリーの核酸はｒｇｄｐの前記要素を用いてパッケー ジすることができ；組換え宿主生物内で、ｒｇｄｐの要素に融合された前記第一 ポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団、およびｓｂｐメンバーの前記第二 ポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団を発現させて、その表面にｓｂｐメ ンバーを表示し、かつその表面に表示されるｓｂｐメンバーの第一と第二のポリ ペプチドの連鎖要素部分をコードする核酸を有する各ｒｇｄｐのライブラリー形 成させる；ことからなるステップである（特に、ここで述べた方法のさらに詳細 を知りたい場合は国際特許１１罰９２１０１０４７号を参照のこと）。 本発明の一実施態様では１、第一と第二のポリペプチド連鎖要素部分の両方また はその集団はｒｇｄｐの前記要素を使用してパッケージすることができる核酸か ら発現される。これは、これらの要素部分がともにＦａｂフラグメントを形成す る場合か、または通常、ｒｇｄｐの表面に表示されている前記の各ｓｂｐメンバ ーが５ｃＦｖ抗体フラグメントの場合である。 一つの実施態様では、前記第二ポリペプチド連鎖要素部分またはその集団は各々 、前記第一ポリペプチド連鎖要素部分またはその集団が発現される核酸とは別の 核酸から発現される。第一ポリペプチド連鎖要素部分をコードする上記核酸は、 第二ポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸と同じ発現ベクター上にあって もよいが、例えばＦａｂフラグメントを産生させるには別個にする。あるいは第 一ポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸は第二ポリペプチド連鎖要素部分 をコードする核酸とは異なる発現ベクター上にあってもよい、第一と第二のポリ ペプチド連鎖要素部分が、両者ともに同じ発現ベクター上にコードされている場 合、これらの要素部分は５ｃＦｙフラグメントとして発現される。この場合ｖＨ 頭域がポリペプチドリンカ−によってＶＬ領領域連結されその結果各５ｃＦｙは 単一ポリペプチド連言貞である。 ｒｇｄｐの表面に表示される各ｓｂｐメンバーはＦａｂ抗体フラグメントである 。 核酸は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、大または ヒトの非免疫化哺乳類の例えば再配列された■遺伝子から誘導することができる 。哺乳類の種は好ましくはヒトである。 というのはヒトの自己抗原を認識する（すなわちヒトの自己抗原と特異的に結合 する）抗体を得ることが最も困難だからである。 核酸は、■遺伝子のセグメント（生殖細胞系の■遺伝子の配列でもよい）の人工 もしくは合成の組換えによって製造されたライブラリーから誘導できる。 （ｂ）のステップで選択されｒｇｄｐの表面に表示されたｓｂｐメンバーは、選 択もしくはスクリーニングされて、個りのｓｂｐメンバー、またはそれぞれのｒ ｇｄｐにて前記ｓｂｐメンバーもしくはそのポリペプチド連鎖をコードする核酸 と結合された前記ｓｂｐメンバーの混合集団を提供する。（ｂ）のステップで選 択されたｓｂｐメンバーを表示するＲｇｄｐファージは、増殖させてその数を増 やしてからさらに選択もしくはスクリーニングを行ってもよい０選択されたかま たはスクリーニングされたｓｂｐメンバーをコードし、かつその表面に選択され たかもしくはスクリーニングされたｓｂｐメンバーを表示するｒｇｄｐから誘導 される核酸は、ｓｂｐメンバーまたはその誘導体のフラグメントを組換え宿主生 物内で発現させるのに使用できる。 本発明には、自己抗原との結合によってライブラリーから選択される一つ以上の ｒｇｄｐから核酸を採取し、個々のｓｂｐメンバーもしくはｓｂｐメンバーの混 合集団またはそのインコーディング核酸（ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｉｃ　 ａｃｉｄ）を得るための他の方法（本発明の実施態様にしたがってまたはしたが わずに行う方法）にイン−コーディング核酸を提供するのに使用する方法が含ま れる。 発現の最終産物すなわち選択されたｓｂｐメンバーは、改変させて、その誘導体 を産生させることができる。 発現の最終産物またはその誘導体は、治療用もしくは予防用の医薬または診断用 製品を製造するのに使用できる。 本発明には、本発明にしたがって本願に記載された方法を用いて得られる、全抗 体および酵素との融合体を含めて抗体フラグメント、その誘導体が含まれる。 本発明の態様によって、ｒｇｄｐ内にパッケージすることができ、ｒｇｄｐの表 面に表示して抗体のポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸からなる各ベク ターのライブラリーを有するキットの、本願に記載の本発明の実施態様によるす べての方法での使用が提供される。 また本発明は、抗体の少なくとも一つのポリペプチド連鎖要素部分をコードする 核酸を含有する各ｒｇｄｐのライブラリーを有するキントの、本願に記載の本発 明の実施態様によるすべての方法での使用を提供するものである。 本発明は、一般に複製可能な遺伝表示パッケージ（ｒｇｄｐ）またはかようなｒ ｇｄｐの集団を産生ずる方法であって；下記ステップすなわち （ａ）特異的結合対および抗自己抗体のメンバーである結合分子をコードするヌ クレオチド配列を、ウィルスのゲノム内に挿入し；（ｂ）前記ヌクレオチド配列 を含有するウィルスを培養して前記結合分子をウィルスによってその表面で発現 させ表示させる；ステップからなる方法を提供するものである。 また本発明は、特定の自己抗原エピトープに対して特異的なｒｇｄｐを選択する 方法であって、このようなｒｇｄｐの集団を製造し、およびこの集団を前記エピ トープに接触させて所望の特異性を有する個々のｒｇｄｐを前記エピトープに結 合させることによって、抗自己抗体である前記結合分子を選択する追加のステッ プを行うことからなる方法を提供するものである。この方法には、（ｉ）捕捉さ れたｒｇｄｐをエピトープから分離させ；（ｉｉ）分離させたｒｇｄｐを回収し ；次いで（ｉｉｉ）分離されたｒｇｄｐからの挿入ヌクレオチド配列を組換え系 に用いてウィルスから分離した結合分子を製造する；という一つ以上の追加のス テップが含まれている。この選択ステップによって所望の特異性を有する結合分 子をコードするヌクレオチド配列を単離できるが、これは前記結合分子が、前記 のインコーディング核酸を含有しているウィルスの表面に関連して発現されるか らである。 また本発明は、抗自己抗原である特異的結合対（ｓｂｐ）の多量体メンバーの製 造方法を提供するものである。この方法は、前記ｓｂｐメンバーの第一ポリペプ チド連鎖、または分泌される複製可能な遺伝表示パンケージ（ｒｇｄｐ）の要素 に融合されその結果前記ポリペプチドをパッケージの表面に表示する、前記ｓｂ ｐメンバーの遺伝的に多様な集団を組換え宿主生物内で発現させ；次いで前記多 量体の第二ポリペプチド連鎖を組換え宿主生物内で発現させ次いでこれらポリペ プチド連鎖に共に前記多量体を前記ｒｇｄｐの部分として形成させるか形成でき るようにすることからなり；前記ポリペプチド連鎖の少なくとも一つが前記要素 を用いてパッケージできる核酸から発現され、その結果前記の各ｒｇｄｐの遺伝 物質が前記ポリペプチド連鎖をコードする方法である。 前記連鎖はともに同じ宿主生物内で発現することができる。 前記多量体の第一と第二の連鎖は、それらのそれぞれの核酸を含有する単一ベク ターから別個の連鎖として発現させることができる。 前記ポリペプチド連鎖（またはポリペプチド連鎖要素部分）の少なくとも一つは ファージベクターから発現させることができる。 前記ポリペプチド連鎖の少な（とも一つはファージミドベクター（ｐｈａｇｅｍ ｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ）から発現させることができ、その方法はへルバーファージ または相補的ファージ遺伝子を発現するプラスミドを用いて前記ファージミドゲ ノムをパッケージするのを促進させる方法であり、そしてｒｇｄｐの前記要素は そのためのキャプシドタンパク質である。このキャプシドタンパク質は、ヘルパ ーファージ中には存在しないか、欠陥があるか、または条件的に欠陥がある。 上記の方法は、前記の第一ポリペプチド連鎖を発現することができるベクターを 、前記第二ポリペプチド連鎖を遊離形態（ｆｒｅｅ　ｆｏｒｖ）で発現する宿主 生物中に導入するか、または前記の第二ポリペプチドを遊離形態で発現すること ができるベクターを、前記第一ポリペプチド連鎖を発現する宿主生物中に導入す ることからなる方法である。 ポリペプチド連鎖は各々、前記要素の融合生成物を用いてｒｇｄｐとしてパッケ ージできる核酸から発現可能で、その結果、前記の両ポリペプチド連鎖のインコ ーディング核酸はそれぞれのｒｇｄｐ中にツク・ンケージされる。 上記の融合体は、ｒｇｄｐ表示要素、おそらく野生型で発現されるキャプシドが ないときに発現される。 このキャプシドタンパク質はへルバーファージには存在しな（１力１、欠陥があ るかまたは条件的に欠陥がある。 宿主細胞は、遺伝の多様性をｓｂｐメン／ｓ＋−の核酸に導入する突然変異誘発 菌株（ｍｕｔａｔｏｒ　５ｔｒａｉｎ）である。 ｒｇｄｐはバクテリオファージであり、宿主は細菌であり、およびｒｇｄｐの前 記要素はバクテリオファージのキャプシドタン）＜り質である。ファージは繊維 状ファージでもよい、ファージ番よ、クラスＩのファージｆｄ、　Ｍ１３．　ｆ ｌ、　Ｔｆｌ、　Ｉｋｅ、　ＺＪ／Ｚ、　Ｐｆおよびクラス■のファージＸｆ、 　ＰｆｌおよびＰｆ３から選択される。ファージ番よｆｄまた番よｆｄの誘導体 でもよい、この誘導体はテトラサイクリン耐性である。前記ｓｂｐメンバーまた はそのポリペプチド連鎖は、ファージｆｄの遺（立子■キャプシドチンパク賞ま たは他の繊維状ファージ中のその対応物との融合体として発現される。　ｓｂｐ メンノく−また番よそのボＩＪペプチド連鎖は、成熟、キャプシドタンパク質の Ｎ末端領域中の分泌ＩＪ−ダーペプチドの下流に挿入される。その配列１成熟タ ン、＜り質のアミノ酸＋１の後に挿入される。挿入部位には、挿入される）ム酸 の各末端にある配列に対応する短かい配列が隣接してしする。 宿主はイー・コリ（Ｈｏｃｏｌｉ）でもよい。 ｓｂｐメンバーのポリペプチドをコードする核酸番よ、抑ｉｌｌ的翻訳終止コド ン（Ｓｕｐｐｒｅｓｉｂｌｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　５ｔｏｐ　ｃｏｄ ｏｎ）を通じて、ウィルスキャプシドタンパク質の下流に連結され、終止力（抑 ＩＩされる条件下では、ｓｂｐメンバーのポリペプチドとウィルスキャプシドタ ンパク質を含有する融合タンパク質が産生され、一方非抑制条件下では、遊離形 態のｓｂｐメンバーのポリペプチドが産生される。 選択系と検定方式については本明細書の別のところで考察する。 これらの系と方式では、所望の特異性を有する結合分子（例えば抗体）をコード する遺伝子配列は、その結合分子が特定の標的（例えば抗原もしくはエピトープ ）に結合するということによって、ある範囲の特異性を有するｒｇｄｐの一般集 団から分離される。したがって、前記発現によって形成されたｒｇｄｐは選択も しくはスクリーニングされ、個りのｓｂｐメンバー、または前記ｓｂｐメンバー またはそのポリペプチド連鎖をコードする核酸を有するそれぞれのｒｇｄｐ内に て会合された前記ｓｂｐメンバーの選択された混合集団を提供する。このｒｇｄ ｐは前記ｓｂｐメンバーに相補的なメンバーに対するアフィニティーによって選 択される。 前記第二メンバーに捕捉されたｒｇｄｐは溶離剤で洗浄することによって回収で きる。その洗浄条件は、前記エピトープに対して異なる結合アフィニティーを有 するｒｇｄｐを得るために変えることができる。 あるいは、例えば高いアフィニティーのｒｇｄｐを得るには、相補的メンバー（ 例えばエピトープ）が、結合メンバーにすでに結合されているｒｇｄｐ　（例え ばｐＡｂ）の集団に提供される。そしてこの場合エピトープに対して高いアフィ ニティーを有するｐＡｂがすでに捕捉されている結合メンバーを置換する。した がって前記溶離剤は、前記相補的ｓｂｐメンバーへの結合について前記ｒｇｄｌ ）と競合する分子を含有している。ｒｇｄｐは、前記相補的ｓｂｐメンバーに対 する結合につ０て、前記パッケージと競合する分子の存在下で前記相補的ｓｂｐ メンノイーに加えられる。選択もしくはスクリーニングされたｒｇｄｐ由来の核 酸は、前記ｓｂｐメンバーまたはそのフラグメントまたは誘導体を組換え宿主生 物内に発現させるのに用いられる。一つ以上のｒｇｄｐから核酸を採取し、個々 のｓｂｐメンバーもしくはｓｈρメンバーの混合集団またはそのためのインコー ディング核酸を得る前記方法にインコーディング核酸を提供するのに用いられる 。発現のＪ！ｌ終生酸生成物飾してその誘導体を製造することができる。 非免疫化ヒトから多様なライブラリーを生成させるのには好ましい起源はＩｇＭ ｍＲＮＡである。七面鳥の卵のりリチウムおよび２−フェニル−５−オキサシロ ンに対する抗体フラグメントは、ＩｇＧｓＲＮ＾から製造されたライブラリーよ りはるかに容易に、非免疫化ヒトドナー由来のＩｇＭｍＲＮＡから誘導されたフ ァージライブラリーから単離されることは、国際特許願公開第ＷＯ９２１０１０ ４７号の実施例４３に記載されている。さらに、２−フェニル−５−オキサシロ ン結合抗体フラグメントは、非免疫化マウスのＩｇＧａＲＮ＾から製造した２０ ０万個のファージ抗体クローンのライブラリーからは全く単離できなかった（Ｔ 。 Ｃ１ａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、　３５２巻、　６２４〜６２８頁、　１９ ９１年）。本願の実施例１〜３では１ｇＭライブラリー由来の自己抗原に対して 特異的な抗体の単離を示す、これらの試料では抗自己特異性は、雫−レプリコン 方式で単一連鎖Ｆｖフクラメントとして選択されたが、抗体特異性は、単一レプ リコン方式、または二重組合せの二重レプリコン方式（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら の１９９１年の前記文献）例えばＩｏｘｐ系による＆［］換え（国際特許願第Ｐ ＣＴ／ＧＢ９２１００８８３）を用いて、Ｆａｂ　７ラグメントとして選択でき た。 自己に対する抗体が豊富なファージライブラリー・を製造することができる。８ ９７８球は、抗原によって刺激される前に表面１ｇＭと表面１ｇＤを発現するが 、可溶性のＩｇ）ｌまたはＩｇＤをほとんど発現しない、これらの未刺激細胞は 、抗自己特異性を有す、Ｓ抗体遺伝子を含有しているようである。これに対して 、可溶性抗体を分泌する最終分化形質細胞は表面免疫グロブリンをほとんど発現 しない。表面ＩｇＭまたは表面ＩｇＤに対して特異的ｄプライマーを用いてファ ージライブラリー標品用のｃＤＮＡを製造すると、７Ｍ域をコードする未変性の 未選択遺伝子を豊富に有する抗体遺伝子のレパートリ−が産生される。自己に対 し暴露することによって機能を抑圧された８９７８球では、表面ｒｇＭのレベル は大きく減少したが表面１ｇＤのレベルは変化しなかった（Ｃ，Ｃ，Ｇｏｏｄｎ ｏ−らの前記文献）、シたがって表面１ｇ口に対して特異的なプライマーは抗自 己抗体を単離するのに特に適している。 しかし、本願に述べるように、未選択の末梢血液リンパ球由来のＩｇＭｍＲＮＡ は抗自己特異性のＶ遺伝子の好ましい起源の一つである。 このような抗自己抗体の他の起源は胎児＋ｍＲＮＡまたは調帯血＊ＲＮＡである （Ｐ、　Ｍ、　Ｌｙｄｙａｒｄ　ら、５ｃａｎｄ　Ｊ、　Ｉｍ曽ｕｎｏ１．＋　 ３１巻、３３〜４３頁。 １９９０年）。 ＰＣＲを用いかつＶＵとν！、の領域を発現する細胞内にこれらの領域をコード する遺伝子を連結することによって、ＶＨとＶＬの領域のもとの絹合わせを使用 して、ファージ表示のためのレパートリ−を作れる可能性がある０元のνＨ／Ｖ Ｌの対合が保持される場合の、’　Ｉｎ　ｅｅｌｌＰＣＲ’の原理は、国際特許 願第ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１４８３号およびＥ＋ｗｂｌｅｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　２０巻、　３８３１〜３８３７頁、１９９２年 に記載されている。このことは、抗自己抗体を発現するクローンが欠失する前に 白血球をステージで選択できる場合特に有用である。 本発明の一実施態様では、■遺伝子の配列またはＶ、ＤおよびＪの配列の合成組 換えによって製造されたライブラリーさえも使用できる。これらは抗自己抗体の 豊富な起源の役目を果たす、５〜７の実施例で我々は、ＴＮＦに対する抗自己特 異性、ヒト抗アヵゲザルＤ抗体（０＾に３）およびヒトチログロブリンが、Ｖ、 ＤおよびＪのセグメントを合成で結合することによって製造したファージ抗体ラ イブラリーから単離できることを示す、実施例５〜７に示すように、この目的の ために生殖系の■遺伝子を使用することは、可溶性自己抗原に対する８９７８球 が機能を抑圧され、かつ多価メンプランに捕捉された自己抗原に対するリンパ球 が排除されているいくかの証拠があるので（Ｓ、　Ｂ、　Ｈａｒｔｌｅｙらの前 記文献ＨＤ、　Ｍ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　らの前記文献）、抗自己抗体を単離する のに価値があるはずである。したがって、生体外でのνＨ，Ｄ）Ｉ、　ＪＨ４） Ｖに、　ＪＫもしくはＶＬ、几の組換えまたはこれと均等の方法で作製した合成 ライブラリーを使用することは、多価メンプランに捕捉された自己抗原に対する 抗体を単離するのに特に有利である。 実施例５〜７において、我々は、ランダム塩基の配列をＶ−Ｄ−■連結領域に組 込んだ合成Ｖ）Ｉ　ＣＤ　Ｒ３セグメントを使用し、これを生殖系ＶＨ遺伝子配 列に連結した。ランダム配列の各ＣＤＲループを作るかまたは公知の標準的な構 造のＣＤＲループを作り（Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ＋　３４２巻、 　８７７〜８９３頁、　１９８９年）次いでランダム配列要素を組込むような他 の戦略を使ってもよい、ＶとＪのセグメントの生殖系の性質は、その配列に特異 的なまたはランダムを変更を配列に組込むかまたは体細胞で突然変異を誘発され た■遺伝子領域を用いることによって変えることができる。実施例５〜７で用い た戦略は、■遺伝子のセグメントのループ構造が明確な折り畳みおよび折り畳み の組合わせを限定された数しか生成せず（Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ、　Ｍｏｌ 。 Ｒｉｏｌ、、　２２７巻、７７９〜８１７頁、　１９９２年）、このループ構造 の生成で恐らく安定性が得られ、かつ抗原の構造に適合させるのに好適の結合部 位の分布と範囲が生成するという利点を有する。さらに、合成ヒト抗体の重鎮と 軽鎖の両者のフレームワーク領域と最初の二つの高変異性ループは多くの異なる 個体で同一のようにである。このような合成ヒト抗体は完全に人工の構造体より 免疫原性が低いであろう。 上記の天然および合成のファージ表示ライブラリーに代わるものとして余り好ま しくないが、ファージに表示され、一つもしくはいくつかのヒト抗体分子から誘 導されたランダム突然変異誘発ライブラリーを製造し、そのライブラリーから抗 自己抗原特異性を選択する方法がある。 ■−訳 ある抗原に対して所望の特異性を発現する個々のｒｇｂｐ例えばｐＡｂは通常の スクリーニング法を用いてライブラリーから単離することができる（例えば、Ｈ ａｒｌｏｗ、　Ｅ、およびＬａｎｅ＋　Ｄ、の１９８８年の前記文献ｉ　Ｇｈｅ ｒａｒｄｉ、　Ｅ、ら、Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　ｗｅｔｈ−＋　１２６巻、６ １〜６Ｂ頁、　１９９０年に記載されている）。 まだ本願の出願人らは、ｒｇｄｐが独得の特性を有しているので実用的な選択法 を発明した。いくつかのスクリーニング法の概略を、ｒｇｄｐの例としてｐＡｂ を用いて図５に示す。 スクリーニングされるｐＡｂの集団／ライブラリーは、免疫化されたかまたは他 の動物から生成させることができ、または既存のファージ抗体の突然変異誘発を 行うことによって生体外で生成させることができるが〔オリゴヌクレオチド指向 性突然変異誘発法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ。 Ｊ、ら、１９８９　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　１．ａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）のような当該技術分野で公知の方法を用いて行える 〕、外のところで述べているように、免疫化されていないヒトまたはヒト■セグ メントの人工的組換えから誘導することが好ましい。この集団は、図５を参照し て以下に述べる一つ以上の方式でスクリーニングして、この抗原結合特性が試料 Ｃと異なる個々のｐＡｂを誘導することができる。 持金■権離 図５（ｉ）は個体表面（ｓ）に結合された抗原（ａｇ）を示し、その固体表面（ Ｓ）はベトリ皿、クロ゛７トグラフイーのビーズ、磁気ビーズなどによって提供 される０次にｐＡｂの集団／ライブラリーをａｇ上に通過させる。結合している 個体ｐは、洗浄後も保持され、検出装置ｄで任意に検出される。抗ｆｄ抗血清に 基づいた検出装置が用いられる（例えば国際特許願公開第Ｗ０９２１０１０４７ 号の実施例４参照）。 捕捉された集団ｐの試料を緊縮条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ）を増大しながら取出した場合、各試料が示す結合アフィニティーは増大する。 緊縮性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を増大した条件は、例えば、浸漬時間を増やす かまたは浸漬溶液のｐＨを変えるなどして得ることができる。 韮−金 図５（ｉｉ）では、抗原ａｇが固体支持体Ｓに結合されかつ元の結合分子Ｃが結 合して飽和している。変異体ｐＡｂの集団（または−組の非類縁のｐＡｂ）が上 記の複合体に与えられると、抗原ａｇに対してＣより高いアフィニティーを有す るものだけが結合する。大部分の例では、少数の集団だけが集団ｐ由来の個体に よって置換される。Ｃが伝統的な抗体分子の場合、すべての捕捉された物質は回 収することができ、捕捉されたｐは、適切な細菌を感染させるかおよび／または ＰＣＲのような標準の方法を用いて、回収される。 有利な用途は、ａｇが受容体として使用され、Ｃが対応するりガントとして使用 される場合である。その場合捕捉されて回収された集団ｐは、構造上受容体の結 合部位および／またはリガンドに関連がある。この種の特異性は医薬産業で非常 に有用であることが知れている。 他の有利な用途は、ａｇが抗体であり、Ｃがその抗原の場合である。 その場合捕捉されて回収された集団ｐは抗イデイオタイプ抗体であり、これは研 究および診断および医薬産業に多くの用途がある。 現在、抗イデイオタイプ抗体を直接選択することは困難である。 ｐ、　Ａ　ｂは、ｐＡｂライブラリー〔例えばナイーブ（ｎａｉｖｅ）なライブ ラリー〕をＢ細胞（その表面に抗体を発現する）に結合させ次いで充分に結合し たファージを単離することによって、直接上記の選択を行う性能を示す。 いくつかの例では、集団ｐを前もって選択しておくと有利であることが分かって いる９例えば上記の抗イデイオタイプの例の場合、ｐは、抗原を捕捉しないＮ縁 抗体に対して吸収されることがある。 しかし、ＣがｐＡｂの場合、Ｃとｐのどちらかまたは両方に何らかの方法で標識 をつけて、両者を識別し捕捉されたＣよりも捕捉されたｐを選択することが有利 である。この標識付けは、物理的に例えばｐにビオチンで予め標識を付けること によって行うことができるが遺伝子による標識の方が一層有利である０例えばＣ はＥｃｏ　Ｂ制限部位で標識を付けることができ、一方ｐはＥｃｏ　Ｋ制限部位 で標識を付けることができる（Ｃａｒｔｅｒ、　Ｐ、ら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ 　Ｒｅｓ、＋　１３巻。 ４４３１〜４４４３頁、　１９８５年参照）、捕捉されたｐ＋ｃが抗原から溶離 されて適切な細菌に感染させるために使用されると集団Ｃ（すなわちこの例にお けるＥｃｏ　Ｂ制限細菌）の制限がある（したがって増殖しない）、増殖するい ずれのファージも高い結合アフィニティーを有する、ｐ由来の個体が著しく豊富 になる。あるいは遺伝子による標識付けはｐを新しい配列で標識を付けることに よって行われ、この標識はＰＣＲ法を用いてｐ混合物から特別に増幅するのに利 用することができる。 捕捉されたｐＡｂは、例えばＰＣＲ法または細菌感染法を用いて増幅することが できるから、充分な個体がｔｉｌｔ捉されていない場合でさえも所望の特異性を 保持しすることが可能であり、通常の方法によって検出することができる。 所望の特異性またはアフィニティーを有するタンパク質分子を表示するファージ を選択する好ましい方法としては、リガンドによってアフィニティーマトリック スから溶離する方法が多い。したがって自己抗原またはそのフラグメントは、マ トリックスに捕捉された自己抗原から特異的なファージ抗体をＲＲするのに使用 される。あるいは異なる種由来の相同抗原をマトリックスに結合させ、ファージ 抗体ライブラリーを結合させ、次いで自己抗原に対して特異的なファージ抗体を 自己抗原を使って溶離させる。例えば、ウシ抗原をマトリックスに結合させ、ヒ トファージ抗体ライブラリーを結合させ、次いでヒト抗原が溶離に使用される。 このようにして単離された抗自己抗体は、ウシとヒトの抗原に共有されているエ ピトープに対して特異的である。その外のあまり好ましくない代わりの方法とし ては、ファージをカラムに非特異的に結合させて自己抗原で溶離する方法である ６例えば、Ｆａｂファージライブラリーを抗Ｐａｂアフィニティーカラムに結合 させた場合、カラムを、非特異的ファージを溶離しないｐＨで洗浄し、次に、自 己抗原を含有することを除いて同じ溶液で洗浄し、自己抗原に対する抗体を発現 するファージの、移動相に対する高いアフィニティーによって溶離する。 これらの各方式の場合、増大した濃度のリガンドによる溶離を行うとアフィニテ ィーが増大した結合分子を表示するファージを溶離するはずである。しかし例え ばｐＡｂがその抗原に対して高いアフィニティーまたは結合力（ａｖｉｄｉｔｙ ）でその抗原に結合しているとき（または他のタンパク質がその結合パートナ− に結合しているとき）、その抗原に類縁の分子で、ｐＡｂをアフィニティーマト リックスから溶離することは不可能である。換言すれば充分に高い濃度で製造で きる適切な特異的ＷＪＨ分子はない、このような場合、例えば抗原−抗体複合体 に特異的でない溶離法を使用する必要がある。一般に使用されるいくつかの非特 異的溶離法は、例えばファージの生存度を低下させ、ファージの生存度はｐＨ１ ２において時間の経過とともに低下する（Ｒｏｓｓｏ＊ａｎｄｏ、　Ｅ、　Ｆ、 およびＺｉｎｄｅｒ　Ｎ、　Ｄ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ！、。 ３６巻、３８７〜３９９頁、　１９６８年）。例えば抗体とアフィニティーマト リックス間に、ファージの感染能を完全に除去しなければ破壊できない相互用が ある場合がある。このような場合には、例えば抗体抗原の相互作用の破壊に依存 しないファージを溶離する必要がある。 それ故、ファージの構造を破壊しない緩和な条件下（ジチオトレイトールによる ジチオール基の還元）で捕捉されたｐＡｂを溶離できる方法が発明された（国際 特許願第−０９２１０１０４７号の実施例４７）。 上記の緩和な溶離法では、ファージ抗体集団の、ビオチニル化抗原への結合とス ルシブタビジン磁気ビーズへの結合が利用される。 洗浄して非結合のファージを除去してから、ファージ抗体を溶離し、それを用い て細胞に感染させて選択されたファージ抗体集団が得られる。ビオチンと抗原分 子間のジスルフィド結合はジチオトレイトールによって緩和な溶離を行うことが できる。この選択を行うのに特に有利な方法は、ビオチニル化抗原を過剰に用い るが、抗原−抗体の結合に対する所望の解離定数に相当する濃度もしくはそれよ り低い濃度で用いる方法である。この方法は高アフィニティーの抗体を選択する のに有利である（Ｒ，Ｅ、　Ｈａｗｋｉｎｓ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌお よびＧ、　Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ＋、＋　２２６巻、　８８ ９〜８９６頁、　１９９２年）、また抗体は、（Ｒ，Ｅ、　Ｈａｈｋｉｎｓ　ら の１９９２年の前記文献）に記載されているように抗原を選択するオフレート（ ｏｆｆ　ｒａｔｅ）を遅くするのに選択される。ビオチニル化された抗原の濃度 は徐々に低下させてより高いアフィニティーを有するファージ抗体を選択した。 別の方法として、ファージ抗体は、Ｊ、　Ｋ、　５ｃｏｔｔおよびＧ、　Ｐ、　 ５ｗ１ｔｈ、　５ｃｉｅｎｃｅ２４９巻、３８６〜３９０頁、　１９９０年に記 載されている、ペプチドファージのビオチニル化抗体に対する競合と類似の方式 でファージ抗体が結合について競合するため、ビオチニル化抗原を越える過剰な 量で用いられる。 このｆ’４Ｎ方法は緩和な条件下の溶離法の一つの実施例に過ぎない。 特に有利な方法は、挿入された異種の遺伝子（この場合は抗体フラグメントの遺 伝子）と、遺伝子■の残りの配列との間を高度に特異的なプロテアーゼで切断す るための認識部位を構成するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を導入する 方法である。このような高度に特異的プロテアーゼの例はＸ因子とトロンビンで ある。ファージをアフィニティーマトリックスに結合させ次に溶離して非特異的 な結合し７ているファージと弱く結合しているファージを除いた後、上記開裂部 位を消化するのに通した条件下でカラムをプロテアーゼで洗浄することによって 、強く結合したファージを除去する。このようにしてファージ粒子から抗体フラ グメントを切断して、ファージを溶出させる。これらのファージは、そのプロテ アーゼ部位だけが特異的に導入された部位なので伝染性であると予想される。強 く結合しているファージは次いで例えばイー・コリ宿主細胞に感染させることに よって回収することができる。 上記の方法の代わりの方法は、強く結合Ｌ７たｐＡｂを保持したアフィニティー マトリツクスを取り出して、例えばＳＤＳ溶液中で煮沸ｒることによってＤＮＡ を抽出する方法である。抽出されたＤＩＩＡは次にイー・コリ宿主細胞を直接形 質転換するのに使用することができ、あるいは抗体をコードする配列を、例えば 本願に開示したような通切なプライマーを用いＰＣＲ法を利用して増幅し、次い でその後の試験に用いる可溶性抗体またはその後のラウンドの選択のためのｐＡ ｂとして発現させるのに用いるヘクターに挿入することができる。 アフィニティーによる他の好ましい選択方法は、少量のりガントを含有するアフ ィニティーマトリックスに結合させることによる方要条件ではないことを意味す る。上記の方法によれば結合特異性側法である。 そのリガンドに対して高いアフィニティーを有するタンパク質分子を表示するフ ァージの集団から選択したい場合に、好ましい戦略は、ファージの集団を少量の りガントを含有するアフィニティーマトリックスに結合させることである。マト リックス上のりガントに対する結合について、高アフィニティータンパク質を表 示するファージと低アフィニティータンパク質を表示するファージの競合がある 。高アフィニティータンパク質を表示するファージは優先的に捕捉され、低アフ ィニティータンパク質は洗い流されてしまう、その高アフィニティータンパク質 は次にリガンドによるｍＭ、またはファージをアフィニティーマトリックスから 溶離する別の方法にょっ°ζ回収される（国際特許願公開第−０９２１０１０４ ７号の実施例３５はこの方法を示す）。 パッケージされたＤＮＡのアフィニティーのステップによる回収について要約す ると、パッケージは、簡単に溶離することができ、相補的ｓｂｐメンバーに対す る結合について前記パッケージと競合する相同ｓｂｐメンバーの存在下で溶離す ることかでき、煮沸することによって除くことができ、タンパク質の分解反応に よって除去することができ、そしてその他の方法としては、例えば基質と相補的 ｓｂｐメンバー間の結合を破壊して前記のパッケージされたＤＮＡとｓｂｐメン バーを放出する方法があるが当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。い ずれにしろ、目的は、ＤＮＡをパンケージから得て、直接または間接的に使用し てコードされているｓｂｐメンバーを発現させることである。 ｐＡｂに対するこの選択法が有効であることと非常に大きなライブラリーを作る ことができるということは、問題の抗体を産生ずる選択された細胞の比率を増大 するために開発された免疫化法が絶対色マウスのＴＮＦに対する抗体が製造され ている（国際特許願第ＰＣＴ／ＡＵえば抗原結合特異性を迅速に単離することが できる。そしてこれらの特異性には従来の方法例えば触媒性もしくは抗イデイオ タイプの抗体によっては単離が困難もしくは単離できないものがある。免疫レパ ートリ−の完全なライブラリーが一旦構築されたならば動物を完全に排除するこ とも今や可能である。 ツー　に　・　る　の　゛ 細胞表面要素に対するヒト抗体のような抗体の特異性を単離することは、例えば 抗体の天然のエフェクター機能を用いて例えば癌細胞の細胞キリングを仲介する 薬剤を製造するのに特に有用である。 また抗自己抗体は、例えば放射性同位元素を用いる、診断用生体内影像形成剤（ ｉｍａｇｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ）を製造するのに価値がある。 特異的なＴ細胞のサブセントの細胞表面要素に対する抗体は、例えば慢性関節リ ウマチを起こすＴ細胞の作用を防止する治療に用いることができる（Ｄ、　Ｗｒ ａｉｔｈ　ら、Ｃｅ１ｌ、　５７巻、　７０９〜７１５巻、　１９８９年；　Ｌ 、　５ｔｅｉｎ蒙ａｎおよびＲ，Ｍａｎｔｅｇａｚｚａ、　ＦＡＳεＢＪ、、４ 巻、　２７２６〜２７３１頁、　１９９０年）。 且シ虜」銀ｍ飢改亥ｊるヒ１に生 ホルモン、成長因子および受容体のような自己分子の、分子上の特異的エピトー プに結合することによる作用を改変する抗体を単離することができる。多官能性 タンパク質は、特に治療に用いられる場合、望ましい特性と望ましくない特性の 両方をもっている０例えばリンホカインｕｐ（ＩＩ！瘍壊死因子）は、少なくと も二つの異なるクラスの細胞受容体、すなわら血管内皮細胞に通常見られる受容 体とＩ１１瘍細胞に通常みられる受容体に結合するるＴＮＦが内皮細胞受容体に 結合するのを防止し、一方ＴＮＦを腫瘍細胞に結合させ、その結果、内皮細胞に よって仲介される毒性副作用なしで腫瘍を攻撃できる、９０１００３３７号）。 ホルモンもしくは成長因子の分子の抗体改変因子を治療に用いる場合、このよう な抗体改変因子は、ファージライブラリーからの選択によって直接単離されたヒ ト抗体特異性をもっていることが好ましい。 ヒトーイディオ　イブ 抗イデイオタイプ抗体（ヒト抗体の可変領域によって形成された抗原結合部位に 対する抗体）は、通常、抗原に対する抗体を単離し次にこの単離された抗体を免 疫原として用いてそれに対する抗体を生成させることによって製造される。元の 抗体がホルモンまたは成長因子に対する抗体である場合、抗原と抗体結合部位の 関係は、その抗イデイオタイプがいくつかの点でホルモンもしくは成長因子とよ く似ており、これらの分子の受容体と結合することを意味する。 しかし受容体に対するホルモンの結合性を似せることができる抗イデイオタイプ の抗体の両分は小さいと予想される。さらに抗自己リンパ球が欠失していること は、抗イデイオタイプへの通常の経路を用いて、ヒト受容体を捕捉する分子によ く似ているヒト抗イデイオタイプ抗体を単離することは困難であることを意味す る０本願において我々は、ヒト抗体の可変領域によって形成された抗原結合部位 に対する抗体は、実施例１と４に示すようにファージ抗体表示ライブラリーから 直接単離することができ、そして受容体に対する結合性についてスクリーニング することによて、ホルモンの結合がよく似ている抗イデイオタイプ抗体を直接同 定できるはずであることを示す。 また抗イデイオタイプは自己免疫疾患を治療するのに有用である。 これは循環している自己抗体に結合させるのに用いることができる。 しかし、例えば細胞表面マーカーならびに抗イディオタイプ特異性に対する二重 特異性抗体を使用して、抗体産生細胞を直接攻撃することが好ましい、あるいは 、血漿分離交換法を用いて、循環抗体および治療される細胞を直接除くことがで きる。 叉１卦刃ｌ目鍬１？Ｆ血生 受容体に結合してリガンドの機能を阻止もしくは該機能に拮抗するヒト抗体は、 免疫化されていないドナー由来の抗体を表示するファージライブラリーから直接 選択することができる。 ・　ｊ、ｈ）坑井− 主要組織適合性複合タンパク質に対する抗体は、拒絶反応を阻止するため、移植 を行った後の患者または移植を行う前の器官を治療するのに用いることができる 。いくつかのリンパ球細胞の表面マーカーに対する抗体が、移植物例えばＣＤ４ ５．　ＣＤ３．　ＣＤ４．　ＣＤ８およびインターロイキン−２受容体の拒絶反 応を阻止するのに使用された。 実施例３は、ＣＤ４に対する抗体がファージ表示ライブラリーから直接単離でき ることを示す。 サイトカイン　に・　るヒト サイトカイン頻に対するヒト抗体は、ヒトの疾病、例えば抗−ＴＩＩＦ抗体およ び抗−インターロイキン１抗体による敗血痙性ショ・ツクの治療に有益である。 実施例１と６は、ＴＮＦに対するヒト抗体は、免疫化されていないヒト由来のま たはＶ、ＤおよびＪフラグメントの合成＆Ｉｌ換え由来のファージ抗体ライブラ リーから直接単離することができることを示す、多くの場合、これらのサイトカ イン分子、例えばトランスフォーミング成長因子（丁ＧＦ−β）は種にまたがっ て強く保存され、マウス内でさえ、ヒト分子に対する抗体を単離することは困難 であることが分かっている０本発明に記載されているヒト抗自己抗体の単離法は 、上記特異性を有するヒト抗体を得る方法を提供する。 必３１１１久縫斯（事Ｉ杉口１比ｉ旦」−註血絣成分、例えばフィブリンに対す るヒト抗体は、放射能で標識をつけたときに血餅の映像を形成させるのに有用で あり、または例えばウロキナーゼのような血餅を溶解する酵素に連結した場合は 血餅を溶解するのに有用である。 支ｌ生ｑ機ｌ玉」」）なゴ仁（底生 細胞受容体に結合して細胞の生物学的応答をトリガーする抗体を選択することが できる。このことは以下に一層詳細に記載され、実施例日にはかような抗体の単 離が記載されている。 増殖と選択のサイクルによって、細胞受容体に結合するこれらｒｇｄｐは単離さ れる。これらのｒｇｄｐのい（つかは、受容体をトリガーする可能性を有する結 合特異性を（単独もしくは他の結合特異性と組合わせて）コードしている。細胞 受容体をトリガーするこれらの結合特異性は単独もしくは組合せで試験される。 リガンド例えばホルモン、成長因子またはペプチドが結合すると生物学的事象例 えばチロシンキナーゼの活性の活性化またはイオンチャネルの開放をトリガーす る各種の細胞受容体がある＠　ｔａｇ９は、例えば細胞受容体を表示する細胞を 使用し、または固体相に固定化された可溶性受容体を用い、または受容体の領域 またはペプチドエピトープを用いて、細胞受容体（または他の種由来のような表 面の保存部分を有する類縁受容体）に結合させるために選択することができる。 受容体は（トリガーするのに必要であるから）架橋形で提供するのが理想的であ る。 細胞表面の受容体をトリガーするとタンパク質またはサブユニットの相対的移動 を起こすことが多いようである。例えば神経伝達物質依存性受容体では、メンプ ランの位置に対称的に配列されている五つのサブユニットはイオン経路を中心に 向かって形成している。 神経伝達物質が結合すると、アロステリック転移でサブユニ・／ト間の小さい再 配列を起こすことによって中央イオンチャネルの大きさが変化すると考えられる 。チロシンキナーゼ受容体の場合、そのリガンドは受容体のオリゴメリゼーシツ ン（ｏｌｉｇｏｗｅｅｒｉｓａｔｉｏｎ）を駆動するようである。したがって受 容体に対する結合特異性を有する抗体はアロステリック変化を促進するかまたは オリゴメリゼーションを促進する可能性がある。また受容体のオリゴメリゼーシ ツンしよ二価または二重特異性の抗体を用いて促進することができる。 可溶性の抗体または抗体フラグメントは一価のフラグメントで例えば−末鎖のＦ ｖフクラメントもしくはＦａｂフラグメントであるか、または二価のフラグメン ト例えばＰａｂｔもしくは完全抗体フラグメントである。またこの二原子価は他 の方法で促進することができる。 例えば（１）モノマーのフラグメントのＮ末端また

【よＣ末端に自己会合する（ ｓｅｌｆ　ａｓｓｏｃｉａｔｅ）ペプチドもしくはチンノでり質（例え番ｆ二量 体チンパク質のサブユニット）のようなタグ（ｔａｇ）をコードさせることによ って；　（２）−価のフラグメントに結合する二（市の抗体を、例えば共通のＣ 末端タグにに用いることによって；またＧよ抗体の定常領域に（３）化学的架橋 を用いることによって促進することができる。 二重特異性抗体または二重特異性フラグメントも二価フラグメント用に作ること ができる（二重特異性の抗体もしくはフラグメントを小さな細胞中で発現させる ためには、両方の特異性をコードする遺伝子をともに導入する必要がある）。異 なる抗体の″アーム”番よ、同じ受容体例えば異なるエピトープまたは二つの異 なる受容体に（ハイブリッド受容体をトリガーするため）対して指向させること ができる。 本発明に述べられているようにしてファージライブラリー力Ａら抗自己抗体を直 接単離することは、多数の抗体を、それらがトリガーする受容体について調べる のに重要である０本願に記載され、および本発明の態様として提供される、受容 体をトリガーする抗体を作ることは、°“抗イデイオタイプのルート”と区別す ることが適切である。この抗イデイオタイプルートでは、ヒトを含む動物に特異 的抗原を接種することによって生成させた特異的抗体自体が他の動物に接種する のに使用され、抗イデイオタイプ抗体（Ａｎｔｉ−Ｉｄ）と呼ばれる新しい抗体 が産生され、その抗体は第一セットの抗体を認識してこの抗体に結合することが できる。これらの＾ｎｔｉ−１ｄのいくつの種は元の抗原の特異的生物学的特性 に似せることができる０例えば抗原がペプチドホルモンもしくは細胞受容体の場 合、このホルモンもしくは細胞受容体の抗原に対する＾ｎｔｉ４ｄは細胞の応答 を引出すことができる（Ｇａｕｌｔｏｎ、　Ｇ、　Ｎ、およびＧｒｅａｎｅ、　 Ｍ、　１．＋　１９８６年。 Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　ｍｉ＋ｍ１ｃｒｙ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｃ ｅｐｔｏｒｓ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ｆｎｕｎｏｌ、。 ４巻、　２５３〜２８０頁；　Ｓｅｇｅ、に、およびＰｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｐ、 　Ａ＋　１９７８年、　Ｌｌｓｅｏｆ　ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ　ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ　ａｓ　ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｒｏ ｂｅｓ＋Ｐｎｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５巻、 　２４４３〜２４４７頁参照）。 抗原の模擬体（ｍｉｍｉｃ）としてＡｎｔｉ−１６を現在教示している本質は、 Ａｎｔｉ−１ｄが元の抗原の抗体に対する抗体を構築する結果産生されるという ことである。しかしこのような抗イデイオタイプが元の抗原に正確に似ているか 否かについては議論の余地がある（Ｓ、　Ｊ、　Ｄａｖｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、 　３５８巻、７６〜７９頁、　１９９２年）。 それ故に、成長因子もしくはホルモンのような抗原によく似ている、抗イデイオ タイプルートで製造された抗体と、受容体に対して直接製造され受容体をトリガ ーする抗体には明確な差異がある。抗イデイオタイプルートによって誘導される 抗体は抗原（ホルモン、成長因子）を必要とし、ホルモンと同じ、受容体上のエ ピトープに結合するが、受容体に結合することによって誘導される抗体は、受容 体をトリガーするのに同じエピトープに結合する必要がない、実際には、かよう な抗体は、これら抗体の特異性または受容体に対する結合性〔エピトープ、オン −レート（ｏｎ−ｒａｔｅ）またはオフレートに特徴がある〕または血液クリア ランスが異なっているようなので、公知のホルモンまたは成長因子に似ている必 要がない、またこれら抗体の製造方法も全く異なっている。抗イデイオタイプ抗 体は、動物を免疫化することによって古典的に作られているが、上記の抗体は、 上記のようにファージ表示ライブラリーから直接単離することができる。自己受 容体に対する抗体は■遺伝子のライブラリーからしＥ記のようにし、て）選択す ることによって製造される。 受容体結合によって直接誘導される抗体は、抗イデイオタイプルートをしのぐ利 点のみならず、天然のホルモンまたは成長因子をしのぐ利点さえもっている。し たがって、天然のホルモンもしくは成長因子の結合に欠陥がある受容体（例えば 遺伝病の受容体）は異なるエピトープで結合する抗体でトリガーすることができ る。 分子の特異性に対して応答可能な可変領域を保有する抗体もしくは抗体フラグメ ントの各種のイソタイプは、治療剤として、それらが偵でいる生物活性部分を越 える利点を有する多数の特性をもっている０例えば、天然のホルモンと異なり、 循環中の半減期は容易に改変できる０選択される抗体のイソタイプもしくはフラ グメントによって、その患者内での循環中の半減期は数分間へ数週間の範囲であ る。長期の使用または短期間のクリアランスが必要な場合、半減期は、適切な抗 体イソタイプを選択することによって、移植物もしくは連続静脈輸液装置などの ような徐放装置を使用する必要なしで容易に適合させることができる。 さらに、多くのホルモンもしくは組織成長因子もしくは抗原は、一般に各種の特 異的機能を有する各分子の異なるエピトープによって、機能が複雑である。抗体 模擬体のクローンはこの点については一官能性なので第二の作用（患者に対して 不都合の場合がある）なしでホルモンの一つの特異的な生物学的作用を生成させ るのに使用できる。したがって、リンホカイン↑ＮＦ（腫瘍壊死因子）は、二つ の異なるクラスの細胞受容体すなわち血管内皮細胞に普通存在するものおよびｌ Ｉｌ瘍細胞に普通存在するものに結合する。ＴＮＦが改変され、その結果内皮細 胞受容体に結合できないが腫瘍細胞受容体には依然として結合できる場合、腫瘍 は血管受容体を通じて仲介される毒性が非常に強い副作用を同時に誘発すること なく攻撃される（このことはオーストラリアでの国際特許願第ＰＣＴ／Ａｌｌ９ ０１００３３７に記載されている）、腫瘍細胞受容体を認識できる抗体の模擬体 は、非常に特異的であり、血管内皮によって仲介される毒性副作用を誘発するこ となく腫瘍細胞を殺すと予想される。というのは、このような模擬体は１１１１ ％細胞の受容体に結合するＴＮＦエピトープに全く似ていないかこの項で考察す る用語の多くは適切な場合に本明細書に記載されるつ ｍ屡工り 自己抗原は、抗体の可変領域によって形成される抗原結合部位に結合することが でき、かつ動物の種のメンバー間に保存され、身体に固有の抗原もしくはエピト ープである。 免疫系は、自己抗原に対する抗体を作るごとは避けようとする。 （ｉ）生殖系の■遺伝子セグメントの配列は、異種の例えば病原体、抗原および エピトープに対する圧力下で発生し、自己抗原を捕捉する抗体を提供できなくな り、および（ｉｉ）このことに加えて、発生する、抗自己抗体をコードする遺伝 子セグメントの結合が、免疫寛容によって、欠失するかまたはアネルギー状態に なる（ａｎｅｒｇ　１ｓｅ）ことが示唆されている。その結果、例えば疾病状態 例えば自己免疫疾患の場合を除いてこれらの抗原に対する循環抗体は通常存在し ない、自己抗原は、一つの種の個体間では変らない抗原である。また自己抗原は 集団を通じて通常の対立遺伝子の変動（ａｌｌｅｌｉｃνａｒｉａｔｉｏｎ）が ある抗原である。自己抗原を有する種の一つの個体を免疫化した場合、寛容が恐 らくゆっくり破壊される場合を除いて、抗原に対する抗体が生成しまたは検出さ れるようになるとは通常考えられない。自己抗原に対する抗体は、自己免疫疾患 にかかつている個体にのみ存在している。一方、一つの種の正常な個体のサブ集 団に、その循環抗体が見られるいくつかの自己抗原がある。 自己抗原は、Ｂ細胞の表面抗体によって認識される抗原であるが、循環している のが見られる抗体には認識されない。おそらく個体が自己免疫の疾患または症状 にかかっているときを除いて、自己抗原に対する循環抗体を検出または得ること は不可能である。 抗自己抗体もしくは抗自己抗体フラグメントは、自己抗原に対して結合特異性を 有する抗体もしくは抗体フラグメントである。この抗体は、自己抗原にのみ見ら れるエピトープをＬ？２ｍし、または種の個体が異種として認識する抗原に対し て交差反応性である０本発明は自己抗原のみを１捉する抗体フラグメントを製造 し単離するのに特によく適している。 Ｕ實Ｍ灯 この用語は天然に得られるかまたは合成で製造される一対の分子（各々特異的な 結合対のメンバーである）を意味する０分子の対の一方は、他方の分子の特定の 空間の極性組織と特異的に結合しそのため相補的に形成されている表面上の領域 または空どうを有し、そのためこの対は互いに特異的に結合する特性をもってい る。特異的結合対のタイプの例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン −ホルモン受容体、受容体−リガント、酵素−基質、ＩｇＧ−プロティンＡであ る。 多１目１ケｊンバー この用語は、遊離形態で発現されるおよび／または基質の表面に発現されるとき に少なくとも第二ポリペプチドと会合する第一ポリペプチドを意味する。基質は バクテリオファージによって提供される。二つの会合したポリペプチドがある場 合、その会合したポリペプチドの複合体は二量体であり、三つの会合ポリペプチ ドの場合二量体であるなどである。二量体、二量体、多量体などまたは多量体の メンバーは特異的結合対のメンバーで構成されている。 多量体メンバーの例は、免疫グロブリン分子に基づいた重領域、免疫グロブリン 分子に基づいた軽領域、Ｔ細胞受容体のサブユニットである。 複Ｍ３ＪＬＬｉ　−只バ・・　−ジ　Ｒｄこの用語は、複製する性能を有する粒 子を提供する、遺伝情報を有する生物学的粒子を意味する。この粒子はその表面 にポリペプチドの少なくとも一部を表示することができる。そのポリペプチドは 、その粒子に固有のおよび／または粒子もしくはその祖先に人口的に入れられた 遺伝情報によってコードされる。その表示されたポリペプチドは、特異的結合対 のメンバーであり、例えば免疫グロブリン分子に基づいた重鎮もしくは軽鎖の領 域、酵素または受容体などである。 粒子はウィルスでもよく、例えばｆｄもしくは＋１１３のようなバクテリオファ ージである。 パヨα乙二乏 この用語は、粒子がその表面に特異的結合対のメンバーを表示している再生可能 な遺伝表示パッケージを意味する。このパッケージはその表面に抗原結合領域を 表示すバクテリオファージである。この種のパッケージはファージ抗体（ｐＡｂ ）と呼ばれている。 パー生 この用語は、天然のまたは一部分または全体が合成によって産生されるか否かに かかわらず免疫グロブリンを意味する。またこの用語は、免疫グロブリン結合領 域であるかまたはこの領域に相同の結合領域を有するタンパク質を含む、これら のタンパク質は天然の起源から誘導できるかまたは一部分または全体が合成で製 造することができる。 抗体の例は、免疫グロブリンのイソタイプ、そのＦａｂ、　Ｐ　（ａｂ’）　ｔ ＋５ｃＦｖ　、Ｆｖ　、　ｄＡｂ、　Ｆｄのフラグメントである。 グロブ１ンスーパーフアミリー この用語はポリペプチドのファミリーを意味し、そのファミリーのメンバーは、 免疫グロブリン分子の可変領域まは定常領域の構造に類縁の構造を有する少なく とも一つの領域をもっている。その領域は二つのβシートと通常保存ジスルフィ ド結合を含有している（Ａ、　Ｆ、　Ｗｉｌｌｉａ＋＊ｓおよびＡ、　Ｎ、　Ｂ ａｒｃｌａｙ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、６巻。 ３８１〜４０５頁、　１９８８年参照）。 免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例はＣＤ４、血小板由来の成長 因子受容体（ＰＤＧＰＲ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）である。 特にことわらない限り、本願で引用される免疫グロブリンおよび免疫グロブリン 同族体には、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーとその同族体が含 まれる。 」旗止 この用語は２．その−次、二次または三次のｔｌ！想において対応する立置に同 し残基または保存残基を有するポリペプチドを意味する。 またこの用語には相同のポリペプチドをコードする二つ以上のヌクレオチド配列 も含む広い範囲が含まれている。 相同ペプチドの例は免疫グロブリンのインタイブおよび７１Ｍバレル酵素である 。 景皿桓１ｂｎ　ｃ旦匹紅Ｌ ｒｇｄｐの表面に表示されるｓｂｐメンバーについて、この用語はｓｂｐメンバ ーが折畳まれた形態で従供され、折畳まれた形態では、その補的ｓｂｐメンバー に対して特異的なその結合領域はその未変性の形態と同じかまたはよく類似し、 その結果それは相補的ｓｂｐメンバーに対して同じ特異性を示す。 遺伝煎拉炙様星１皿 ｓｂｐメンバーまたはそのポリペプチド要素については、この用語は、細胞もし くは生物の天然集団中に存在する多様性を意味するだけでなく、生体内もしくは 生体外の人工突然変異によって作り出すことができる多様性も意味する。 生体外の突然変異としては例えば変化させることが所望の配列のランダム突然変 異を有するオリゴヌクレオチドを用いるランダム突然変異誘発がある。生体内の 突然変異誘発には、例えばＤＮＡを入れるのに宿主微生物の突然変異誘発菌株を 使用する（国際特許願公開第−０９２１０１０４７号の実施例３８参照）、用語 “ユニーク集団（ｕｎｉｑｕｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）″は、複数の例えば遺伝 的に多様でないすなわちすべて同じであるポリペプチド連鎖を示すのに使用する 。制限集団は、多様であるが、動物の全レパートリ−または合成もしくは他の方 法によるライブラリーより多様性が低い集団である。その多様性は、例えば抗原 結合特異性を使用して、前に選択することによって減少領域は、それ自体内で折 畳まれているタンパク質の一部分であり、同しタンパク質の他の部分から独立し かっ相補的結合メンバーから独立している。折畳まれた単位はα−らせんおよび ／またはβ−シート構造の特異的な組合わせである。領域と折畳み単位は、−次 構造で隣接していないアミノ酸を接合する構造をもっている。 産販星 この用語は復製可能な遺伝表示パッケージによって表示されないポリペプチドの 状態を意味する。 によ　ては　が　る　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）この用 語は、−組の条件下で欠陥ポリペプチドを発現するが、別の組の条件下では異な っているが類縁の欠陥がないポリペプチドを発現する遺伝子を意味する。−例は 、非抑制宿主または抑制宿主それぞれにおいて発現されるアンバー突然変異を含 む遺伝子である。 あるいは、遺伝子は、−組の条件下では欠陥があるが他の組の条件下では欠陥が ないタンパク質を発現する。−例は温度域受性突然変異を有する遺伝子である。 皿五負用駅笠止ユヱｌ この用語は、−組の条件下ではコドンの下流のヌクレオチドを翻訳させるが、他 の組の条件下ではそのコドンにおいて翻訳が終るコドンを示す、抑制的翻訳停止 コドンの例は、アンバー、オーカーおよびオパールのコドンである。 ’！”　”　ｍｕｔａｔｏｒ　５ｔｒａｉｎこれは、その中で複製されたＤＮＡ に、その親［ＩＮＡについて突然変異を起こさせる遺伝欠陥を有する宿主細胞で ある。突然変異誘発菌株の例はＮＲ９０４０ｎｕｔ　０５およびＮＲ９０４６ｎ ｕｔ　Ｔｌである（国際特許願公開第罰９２１０１０４７号の実施３８参照）。 ヘルパーファージ これは、欠陥ファージゲノムを有する細胞に感染させるのに用いられ、その欠陥 を補足する働きをするファージである。その欠陥ファージゲノムは、なんらかの 機能をコードする遺伝子配列が除去されたファージミドまたはファージである。 ヘルパーファージの例は、Ｍ１３ＫＯ７，Ｍ１３ＫＯ７遺伝子■３号；およびキ ャプシドタンパク質に融合された結合分子を表示またはコードするファージであ る。 ベクター これは、宿主生物内で複製することができるＤＮＡ分子であり、これに遺伝子が 挿入されて組換えＤＮＡ分子が構築される。 ファージベタ　− これはファージゲノムを改変ずことによって誘導されるベクターであり、バクテ リオファージの複製開始点を含有しているがプラスミドの復製開始点はもってい ない。 ファージミドヘクター これは、プラスミドゲノムを改変することによって誘導されるベクターであり、 バクテリオファージの複製開始点およびプラスミドの復製開始点を含有している 。 八′・される　５ｅｃｒｅｔｅｄ） これはｒｇｄｐ上に表示されるｓｂｐのメンバーと会合するｒｇｄｐもしくは分 子を意味し、その中には、ｓｂｐメンバーおよび／または該分子が折畳まれ、そ してパッケージが細胞のサイドシルの外側に組立てられる。 配置された　グロフ゛リン゛　云　のレパート１−天然産のヌクレオチド例えば 動物内で発現される免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列のコレクショ ンである。この配列は、例えば１（鎖のＶ、　Ｄおよび、１のセグメントならび に例えばＪのＶおよびＪのセグメントを生体内で再配列することによって生成さ れる。あるいは１．これらの配列は、生体外で免疫化された細胞系から生成させ ることができ、そして免疫化に応答して再配列が細胞間でクローン中のヌクレオ チド例えばＤＩｒ＾配列のコレクション；またはポリペプチドの遺伝的に多様な コレクン９ン；または特異的な結合対のメンバー；または選択もしくはスクリー ニングが可能なｒｇｄｐ−Ｅに表示され、個りのポリペプチドもしくはｓｂｐ　 、１ンハーまたはポリペプチドもしくはｓｂｐメンバーの混合集団を提供するポ リペプチドまたはｓｂｐメンバーである。 人工煎拉再配刀１五人　グロブ１ン゛　−のレバー上ユニ動物由来の再配列され た免疫グロプリ二／の配列以外の起源から全体または一部を誘導されたヌクレオ チド例えばＤＮＡ配列のコレクションである。これには例えば未再配列の■セグ メントをＤおよびＪのセグメントと結合することによるＶＨ領領域コードするＤ ＮＡ配列わよび■とＪのセグメントを結合することによるｖシｓｆｆ域をコード するＤＮＡ配列が含まれている。 これらＤＮＡ配列の一部またはすべてはオリゴヌクレオチド合成法によって誘導 される。 分秘ｉ−゛−ペプチド これはポリペプチドのＮ末端に連結されたアミノ酸の配列であり、そのポリペプ チドをサイドシルから移動させる。 傳鳳皿 これは二つの分子間の結合を切断するのに用いられる溶液である。 その結合は非共有結合でも共有結合でもよい、その二つの分子はｓｂｐのメンバ ーであってもよい。 誘導体 これは、選択されたｒｄｇｐ内のＤＮＡでコードされる他のポリペプチドから誘 導されるポリペプチドである。この誘導体ポリペプチドは、インコードされたポ リペプチドに対してアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入を行うかまたは他 の分子を連結することによって得られるインコードされたポリペプチドとは異な っている。これらの変更はヌクレオチドもしくはタンパク質のレベルで行われる ０例えば、インコードされたポリペプチドは他の起源由来のＦ、テールに連結さ れるＦａｂフラグメントである。あるいは酵素、フルオレセインなどのようなマ ーカーを例えばＦａｂ　、　５ｃＦｖのフラグメントに連結してもよい。 ２１匡４１創免舷朋− 図１は、ウシチログロブリン（上方バネール）、ヒトＴＮＦα（中央パネル）ま たはヒ）ｍＡＢ　Ｆｏｇ−１（γ−１，ｋ）上での選択によって未免疫化ライブ ラリーから単離された可溶性−末鎖Ｆ　ｖｉ　（ｓｃＦ　ｖｓ）の特異性のＥＬ ＩＳＡ法による分析結果を示す、結合性は、下記、下記タンパク質のパネルに対 する結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。ｌ−プラスチック；２−雌ニワトリの卵 のトリプシンインヒビター；３−キモトリプシノーゲンＡ；４−雌ニワトリの卵 のオボアルブミン；５−キーホールリンペットヘモシアニン；６−ウシチログロ ブリン；７−ヒドＴＮＦα；８−七面鳥の卯の卵白リリチウム；９−ウマ心臓の シトクロムｃ；１０−ウシ血清アルブミン；　１１−ｍＡｂ　Ｆｏｇ−１ｅ図２ は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）　（上方パネル）　、）ＩＩＩｃＩペプチド（ Ｐｒｉｃｅらの１９９０年の前記文献）（中央パネル）またはヒｌ−ＣＤ４　（ 下方パネル）上での選択によっζ、未免疫化ライブラリーから単離した可溶性５ ｃＦｖｓの特異性のＥＬＩＳＡ法による分析結果を示す、結合性は下記タンパク 質のパネルに対する結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。 １−１ｋｌ！ニワトリの卵のトリプシンインヒビター；２−キモトリプシノーゲ ンＡ；３−［ニワトリ卵オボアルブミン；４−キーホールリンペットヘモシアニ ン；５−ＣＥ＾；６−ヒト多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）を含有する原油出物；７ −ウシチログロブリン；８−雌ニワトリ卵白リゾチーム；９−ウシ血清アルブミ ン；１０−４−ヒドロキシ−３−二トロフェニル酢酸にカンプリングしたニワト リＴグロブリン；１１−ヒト組換え可溶性ＣＤ４　。 図３は、ヒトモノクローナル抗体Ｆｏｇ−１（ＩｇＧ１．　ｋ　）上での選択に よって単離した３種の５ｃＦｖｓの、下記各種のイソタイプのヒト抗体のパネル への結合性をＥＬＩＳＡ法で検定した結果を示す。１−Ｆｏｇ−１；　２−Ｈｕ ｌｙｓｌｌのＦＷフクラメント；　３−Ｈｕｌｙｓ１１抗体（ＩｇＧｌ、ｋ　） ；　４−ＲｅｇＡ　（ＩｇＧ１．　ｋ）　；　４−ＲｅｇＡ　（ＩｇＧｌ、ｋ） 　；５−ＦｏｇＣＣ１ｇＧ３゜ｋ　）　；　６−Ｐａｇｌ　（ＩｇＧ１．　λ） ；７−骨髄腫プラズマから精製した１ｇＧ２．　λ抗体（Ｓｉｇｍａ社）　；　 ８−０ａｋ３　（１ｇＧ３．　λ）：９−骨髄腫プラズマから精製した１ｇＧ４ ．　λ（Ｓｉｇｍａ社）　；　１Ｏ−ＦＯＮＩ　（ＩｇＭ、λ）；１１　Ｆｏｍ Ａ　（ＩｇＭ、λ）。 図４は、合成ライブラリー創製中の■。遺伝子の組立てを示す。 図５はｐＡｂの選択法を図式的に示す。５０）は結合／溶離のシステムを示す； ５（ｉｉ）は競合のシステムを示す（Ｐ　＝ｐＡｂ　；　ａｇ＝ｐＡｂによる結 合が必要な抗原；Ｃ＝競会合体集団例えば抗体、ｐＡｂ、リガンド；Ｓ＝基材（ 例えばプラスチックビーズなど）；ｄ−検出システム）。 本発明を下記の実施例で説明する０本願で述べるオリゴヌクレオチドとプローブ は表■に列挙した。表１〜■は実施例日の後に記載しである。 実施例１は、未免疫化ヒト由来の一末鎖Ｆｖフラグメントのファージライブラリ ーからの、ヒト腫瘍壊死因子−αに対する抗体およびヒトモノクローナル抗体の 単離を示す。 実施例２は、未免疫化ヒト由来の一本ＭＦｖフラグメントのファージライブラリ ーから得たヒトチログロブリンに結合する抗体の単離を示す。 実施例３は、未免疫化ヒト由来の一本１１　Ｆ　、フラグメントのファージ表示 ライブラリーからの、自己抗原ＭＵＣＩムチン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および 組換え可溶性ＣＤ４　（ｒｓＣＤ４）に対する抗体フラグメントの単離を示す。 実施例４は、ＤＮＡの配列決定およびアフィニティーの測定による、選択された 抗自己抗体のフラグメントのその後の特性決定を示す。 実施例５は、生殖系ＶＨ上セグメント用いた合成ヒトライブラリーの創製を示す 。 実施例６は、ヒト生殖系合成ライブラリーからの、ヒト腫瘍壊死因子−αに結合 する抗体フラグメントの単離を示す。 実施例７は、異なる長さのＶＨＣＤＲ３配列を含有するヒト生殖系ＶＨセグメン トを用いて行う合成ヒトライブラリーの創製、ならびにヒトチログロブリンに結 合する一本ＩＪ　Ｆｖフクラメントとヒトモノクローナル抗体の単離を示す。 実施例８は、受容体の機能をトリガーするヒトインターロイキン−１受容体分子 に対するヒト抗体の単離を示す。 ！施撚上 ヒ）　ＰＢＬから単離された天然産の■遺伝子は、ドナーが暴露されたことがな い抗原に対して反応性を存する抗体フラグメントの大きなライブラリーに横築す ることができる（国際特許願公開第−０９２１０１０４７号実施例４２）、我々 は、これらのライブラリーが、除去されていなかった自己反応性Ｂ細胞から生じ るか、またはＶ［ｌとＶ［、の連鎖の組換えからもたらされる。非天然産フラグ メントとして生じる自己抗原に対する反応性も有していることを発見した。この ことを試験するため、我々は、ヒトＴＮＦαおよびヒ）ｒｇＧ八免へグロブリン に対するファージミドの表面に表示される大きなヒト５ｃＦｖライブラリーのパ ニングを行った。 方−広 一イブー１−のレスキュー　Ｂ胚ｙ工 ｓｃ　Ｆ　ｖｓのライブラリーはヒトＰＢＬのＲＮＡから構築されすでに報告さ れている（国際特許願公開第−０９２１０１０４７号の実施例４２）、抗体フラ グメントを表示するファージをレスキューするため、ファージミドを有する約１ ０”個のイー・コリを用いて、１％グルコースと１００Ｂ／ｍ１（７）７ンビシ リンを含有する２ＸＴＹ　（２ＸＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）　５０ｍ１ニ接種し、 振盪しながら０．Ｄ、が０．８に達するまで増殖させた。この培養物５１を用イ ア２ＸＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬ［Ｉ　５０＊Ｉニ接種し、デルタ遺伝子３ヘルパー（ Ｍ１３Ｄ遺伝子■、国際特許願公開第−０９２１０１０４７号参照）２Ｘ１０’ ＴＵを添加し、次いでその培養物を、振盪せずに３７°Ｃにて４５分間インキュ ベートし続いて振盪しながら３７℃にて４５分間インキュベートした。得られた 培養物を４００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間インキエヘートし、生成したペレット を、１００　ｍｇ／ｍｌのアンピシリンと５（ｌｌ１ｇ／ｍｌのカナマイシンを 含有する２ＸＴＹ２＋中に再懸濁させ一夜培養した。ファージはすでに報告した のと同様にして調製した（国際特許願公開第−０９２１０１０４７号実施例４２ ）　、　Ｍ１３Ｄ遺伝子■は以下のようにして調製した。 ＭＩ３Ｄ遺伝子遺伝子式ヘルパーファージ子■タンパク質をコードしていない。 したがって抗体フラグメントを表示するファージ（ミド）は抗原に結合する一層 大きな結合力をもっている。伝染性のＭ１３Ｄ１３Ｄ遺伝子■、ファージの形態 形成中に野生型ｇｍタンパク質を供給するｐ［Ｉｃ１９誘導体を含有する細胞中 でヘルパーファージを増殖させることによって調製する。その培養物を振盪せず に３７℃で１時間インキュベートシ、次いで振盪しなから３７°Ｃでさらに一時 間インキュベートシた。ｍ胞を遠心分ｇｌ　（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ８．４００ Ｏｒ、ｐ、ａｉ、、１０分間）、１００　ｍｇ／＋ｍｌのアンピシリンおよび２ ５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ＸＴＹブｔ’７．（２ＸＴＹ−＾ＭＰ −ＫＡＮ）　３００　ｍｌ中に再懸濁し、次いで３７°Ｃで振盪しながら一夜培 養した。ファー・ジ粒子を、ＰＥＧ−沈澱法（Ｓａ請ｂｒｏｏｋらの１９９０年 の文献）に２回付して、培地から精製し濃縮し、ＰＢＳ　２■ｌ中に再懸濁し、 ０．４５ｍ５フイルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ　ＮＭＬ　；　５ａｒｔｏｒｉｕｓ 社）を通過させて、約１０”の形質導入単位／　ｗ　ｌの最終濃度（アンピシリ ン耐性クローン）を得た。 ｉ４ブラ」：づηシと乙久 １００　ｓｇ／ｇ＋１もしくは１０ｍｇ／＠ｌのＰＢＳ中組換えヒトＴＮＦ−α ４１、または１０ｍｇ／ｍｌのＦｏｇ−１、、ヒト赤血球’Ｒｈ（Ｄ）抗原を認 識するヒトＩｇＧ／に免疫グロブリン４＋ｍｌを用いて、ＰＢＳ中で免疫試験管 （Ｎｕ＊ｃ）を−夜コートした。これら試験管を２％Ｍａｒｖｅｌ　ＰＢＳで３ ７°Ｃにて２時間ブロックし次にＰＢＳ中で３回洗浄した。ファージ約１０１３ 　Ｔｔｌを試験管に加え、次いで室温で３０分間、上下に動くターンテーブルで タンプリングしながらインキュベートシ、次にさらに１．５時間静置した。試験 管をｌ’Ｂｓ　Ｏ，１０％τ−ｅｅｎ　−２０で１０回洗浄し次にＰＢＳで１０ 回洗浄した。１００＋ＪトリエチルアミンＩｗｌを添加することによってファー ジを７８Ｍし、上下動タンブラ−で１５分間回転させ、得られた溶液を１．０　 Ｍ　）リスＩＩｃＩ　（＋）ｆｌ　７．４　）　０．５　＋ｗｌで直ちに中和し た。溶離されたファージをｍ１ｄ−ｌｏｇイー・コリＴＧＩ　１０ｍ１　ととも に３７°Ｃにて３０分間培養することによってファージを上記細菌に感染させた 。そのイー・コリを、１％グルコースおよび１００　ｍｇ／　ｓｏｌアンピシリ ンを含有するＴＶ！！プレート上にプレートした。得られた細菌ライブラリーを 先に述べたようにしてδ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューして、次の選択 ラウンドに用いるファージを調製した。上記プロセスを繰返し、合計４ラウンド のアフィニティー精製を行ったが、試験管の洗浄は３ラウンドと４ラウンドにお いて、ＰＢＳ、　Ｏ，１％Ｔｗｅｅｎ−２０による洗浄を２０回に増やしかつＰ ＢＳ　４ごよる洗浄を２０回に増やして行った。 バイン゛−の ３ラウンドと４ラウンドの選択ステップから溶出されたファージを用いてイー・ コリ８８２１５１に感染させ、可溶性５ｃＦｖを検定用に単コロニーから産生さ せた（Ｍａｒｋｓ　らの１９９１年の文献）　、　ＴＮＦの場合もファージは単 コロニーからレスキューした。５抛門重炭酸塩ｐｉ９．６中１０μｇ／剛１のヒ トＴＮＦ−αまたはＰＢＳ中１０μｇ／＋ｉｌのＦｏｇ−１でコートした微量滴 定プレートを用い、すでに述べたようにしてＥＩｊＳ八法をへ施した。ＥＬＩＳ 八法でへ性のクローンをＰＣＲフィンガープリント法（国際特許願公開第−０９ ２１０１０４７号実施例２０）次いで配列決定を行ってさらに特性を決定した。 跋狂梧来 ＴＮＦ　：　１５３６個のコロニーから得た可溶性５ＣＦＶと１１５２個のコロ ニーから得たファージをＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。結果を図１に示す 。その主要事項は前記図面の簡単な説明の項に記載されている。　ＴＮＦ−αと の結合について陽性のクローンをＰＣＩＩフィンガープリンティング法と配列決 定によってさらに特性を決定した。この方法によって１５種のバインダーを同定 した。これらのうち４種は配列を決定した。　Ｆｏｇ−１：　９６１個のクロー ンから得た可溶性５ｃＦｖをＥＬＩＳ八法でへクリーニングし、陽性のクローン はＰＣＲフィンガープリンティング法と配列決定によってさらに特性決定を行っ た。この方式で４種のバインダーを同定し配列を決定した。 裏施拠又 バ久天史ｍ−ジｆｄ上の六　いて′−゛　ヒトチログロブ１ンに・する　゛フラ グメント　の、５ｃＦｖフーグメントの一イブプ丈二友ム久皇皿 国際特許願公開第−０９２１０１０４７号の実施例４４には、５ｃＦｖフラグメ ントのライブラリーからの、ウシチログロブリンに対する抗体５ｃＦｖフラグメ ントの選択が記載されている。これらのものは未免疫化ヒトから誘導し、ファー ジｆｄの表面に発現させ、ウシチログロブリンに対してパニングすることによっ て単離された。試験結果しよ、個体°　がかって暴露されたことがない抗原を捕 捉する未免疫化個体の抗体フラグメント由来のライブラリーから単離できること を示した。 このパニングによってウシチログロブリンに対して特異的であることが見出され た１６個のクローンを、ヒトチログロブリンに対する結合性についてＥＬＩＳＡ 検定法で分析した（国際特許願公開第ＷＯ９２１０１０４７号の実施例４４に記 載されているようにして行った）、またこれらのクローンのうちの９個は、基質 を添加して１２分後に１．０〜１．６の吸収シグナルを示し、ヒトチログロブリ ンに強く結合した。 交差反応性（９０分後にｏ、ｏｏｓ未溝のシグナル）は、非類縁の抗原：雌ニワ トリ卵リゾチーム、ＢＳＡ　、オボアルブミン、キモトリプシノーゲン、シトク ロームＣ１キーホールリンペットヘモシアニン、インツユリン、カルシオリビン およびＤＮＡに対して全くみられな力１つた。 このように、ヒト自己抗原千ログロブリンのエピトープに対して特異性を有する 抗体は、未免疫化のヒトから調製したライフ゛うＩＪ−から単離することができ る。 ヒトとウシのチログロブリンの両方に結合する二つのクローン：α−Ｔｈｙ２３ およびα−Ｔｈｙ２９　、ならびにウシのチログロブリンにのみ結合する二つの クローン二α−Ｔｈｙ３２およびα−Ｔｈｙ３３の配列を決定した。 実１−九亀 旦」ニ第１ヱＬｌｌｌ）７）（７）−７ｙ立ヒ九児二虹ｉ□□□１−鴫ユ」二」 １−ξ己」力；、ｔｕ良ｊづ仏　１日　−ＣＥＡ）および　え口櫂並ＣＤ４　（ ｒｓＣＤ４）に・　る　フラグメヱ上匁岸１実施例１に使用した未免疫化ヒトド ナー由来の一末鎖ＦＷフラグメントのファージ表示ライブラリーを、自己抗原Ｍ ＵＣＩムチン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および組換え可溶性ＣＤ４　（ｒｓｃＤ ４）に対する抗体フラグメン］・を単離する選択に利用した。 ｉＡブラ」：ゴＩ乙＆虹ムニ ライブラリーをレスキューするのに、δ遺伝子３ヘルパーファージ（Ｍ１３Ｄ遺 伝子■）ではなくて標準のへルバーファージＭ１３ＫＯ７（５ＸＩＯ”ｐｆｕ） を使用したことを除いて、実施例１と同様にしてライブラリーをレスキューした 。 ＭＵＣＩおよび　１ＣＥ＾）に・して　ｒなフ　−ジの゛ファージは、（Ｍａｒ ｋｓ　らの１９９１年の文献）とほとんど同様にして抗原をコートした免疫試験 管（Ｎｕｎｃ　；　Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を用い結合性についてパニングを行うか 、または抗原のカラムで選択した（Ｊ、　ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒ ｅ＋　３４８巻、　５５２〜５５４頁、　１９９０年）。 下記の抗原を用いた。すなわちヒ）ＫＭ換え可溶性ＣＤ４　（ｒｓＣＤ４）（Ａ ｍｅｒｔｃａｎ　Ｆｌｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、がバクロウィル ス中に発現させ、ｔｈｅ　ＭＲＣＡＩＤＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　 ［ＡＤＰ６０８］　が供給している）；ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）　；および ２０アミノ酸ペプチド（Ｍ、　Ｒ，Ｐｒ１ｃｅら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉｍ＋＊ｕｎ ｏ１．、２７巻、　７９５〜８０２頁、　１９９０年）〔ヒトＭＩＪＣＩムチン （ＩＩ瘍関連多形性上皮ムチンもしくはＰＥＭ）中の繰返しモチーフに対応して いる〕である（Ｓ、　Ｇｅｎｄｌｅｒら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＠、＋　２ ６３５ｙ１２８２０〜１２８２３頁、　１９８８年：Ｊ−ＲｏＧｕｍ　ら、Ｂｉ ｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ５ｕｎ、、　１７１巻、　４０７〜４１５頁、　１９９０年） 。 ＣＥＡ　（２０ｍｇ／ｍｌ）とｒｓＣＤ４　（１０ｍｇ／ｍｌ）を、リン酸緩衝 食塩水中、室温下−夜、免疫試験管にコートした０選択の最初の２ラウンドでは 、試験管はＰＢＳ、　０．１％（ｖ　／　ｖ　）　Ｔｗｅｅｎ２０で１ｏ回およ びＰＢＳでｉ。 回洗浄した。その後に続く選択のラウンドでは、試験管はＰＥ５．０．１％（ｖ 　／　ｖ　）　Ｔｗｅｅｎ２０で２０回およびＰＢｓで２０回洗浄した。ファー ジは、（Ｍａｒｋｓ　らの１９９１年の文献）に記載されているのと同様に１１ ００ＩＩトリエチルアミンで溶離した。溶離されたファージ（通常１０’〜１０ ’の形質導入単位）を用いてイー・コリＴＧＩ細胞に感染させた。 約１０９個の感染した細胞は次のレスキューでの接種物として使用した。ライブ ラリーを３〜５ラウンドのレスキューに付し、次いで各抗原を選択した。 ＭＵＣＩペプチドに結合するファージを選択する場合、ペプチドをセファＯ−ス ４Ｂ　（Ｍ、　Ｒ，Ｐｒ１ｃｅより提供された）に化学的にカッ７’ｌＪングさ せた。１＋＋１のカラムを作製し、次いでファージを、ＭｅＣａｆｆｅｒｔｙら の１９９０年の前記文献に記載されているようにして選択した。要約すると次の とおりである。セファロース−ｌｌカラムを２％の脱脂乳粉末を含有するＰＢＳ 　（ＭＰＢＳ）で洗浄し次いでファージを同じ緩衝液１　ｓｒＩ中ニ入レタし　 ソレソｔＬ容ａカ１０＊Ｉ（７）、ＭＰＢＳ、　ＰＢＳ　ｐＨ７，２、５０ｗＭ ）　！Ｊ　ス−）１ｃＩ１５００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ８，０、オヨび５０ｍＭ 　ト’Ｊ　ス−ＨＣｌ１５００ｍＭＮａＣ１ｐｌ（９，０で連続的にカラムを洗 浄した後、ファージを、１００　ｍＭのトリエチルアミン５＃ｌで溶離し、次い で０．５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，８で中和した。５ラウンドの選択 を行った。 クローンのスフ１−ニングと　１ 溶離されたファージを感染させたイー・コリＴＧＩ由来のアンピシリン耐性の単 コロニーを、ファージ（Ｃｌａｃｋｓｏｎらの１９９１年の文献）または可溶性 ｓｃＦνフラグメント（Ｍａｒｋｓらの１９９１年の文献）の結合についてスク リーニングした。抗体フラグメントをコードする遺伝子は、アンバーコドンによ って、ファージのコートタンパク質をコードする遺伝子に連結しているので、可 溶性フラグメントを、ファージが感染した細菌の非サプレッサー菌株から分泌さ せることができる（）Ｉｏｏｇｅｎｂｏｏｓ　；の１９９１年の文献）。細菌上 澄み液中での可溶性５ｃＦｖｓの抗原への結合は、マウスｍＡｂ　９Ｅ１０　（ １１１ｇ　／ＩＩＩ　）　（Ｃ末端ペプチドのタグを認識する（Ｍｕｎｒｏおよ びＰｅｌｈａｍ＋　Ｃｅ１１．４６巻。 ２９１〜３００頁、　１９８６年）〕およびペルオキシダーゼ接合抗マウスＦ、 抗体（Ｓｉｇｍａ社）を−ａｙｄらの１９８９年の文献に記載されているように 用いて検出した。プレートを、抗原：　Ｐｏｇｌ、　ＴＮＦａ、ウシチログロブ リンおよびｒｓＣＤ４で前記免疫試験管について記載したのと同様にコートし、 次いで５ｍｇ／ｍｌのＣＥＡでコートした。ヒト多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）を 含有する原油出物を、約ＩＱｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で用いた。 単離されたクローンの特異性は、各種のタンパク質でコートしたプレートを用い て可溶性５ｃＦｖフラグメントをＥＬＩＳＡ法で検査した。 さきに述べたようにして、プレートを、抗原：　Ｆｏｇ−１、ＴＮＦａ、ウシチ ログロブリン、ｒｓＣＤ４．　ＣＥＡおよびＰＥＭでコートした。他のタンパク 質は、ＰＢＳ中ＩＢ／ｍｌの濃度〔シトクロムｃ　（Ｓｉｇｍａ社）〕または５ ５０ｍＭＮａＨＣＯ３，ｐＨ９，６中ｌｌ１ｇ／ｍｌの濃度〔ウシ血清アルブミ ン、七面鳥卵白リリチウム、雌ニワトリ卵白リリチウム、雌ニワトリオボアルブ ミン、キーホールリンベットヘモシアニン（ＣａｌＢｉｏ−ｃｈｅｗ社）、キモ トリプシノーゲンＡ、ニワトリ卵白トリプシンインヒビター（Ｓｉｇｗ＋ａ社） 、４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル酢酸にカップリングさせたニワトリＴ− グロブリン〕で室温下で一夜コートした。陽性のＥＬＩＳＡ　シグナルを示すこ とが見出されたクローンを、Ｍａｒｋｓらの１９９１年の前記文献に記載されて いるように、ＰＣＲと制限酵素Ｂｓ　ｔＮ　Ｉによるフィンガープリントによっ てスクリーニングして異なるクローンを同定した。異なる制限パターンを有する クローンの例を選択し、次いで５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｋｉｔ　（ＵＳＢ社）また はＴａｇ　ＤｙｅＤｅｏｘｙ丁ｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎ ｃｉｎｇ　ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＡｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３７３ａ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｅｅｒを用 いて重鎮と軽鎖の配列を決定した。 配列を決定したクローンを、プログラムＭａｃＶｅｃｔｏｒ　３．５　（ＩＢＩ Ｋｏｄａｋ社、米国、コネティカット州、ニューヘブン）を使ってさらに分析し た。そのＶＨ遺伝子は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ　ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 、　２２７巻、７７６〜７９８頁、　１９９２年に記載されているＶＨディレク トリ−中に存在する８３個の生殖系遺伝子セグメントと同等であった。　ＶＬ遺 伝子はすでに発表されている３４個のに生殖系遺伝子セグメントとすでに発表さ れている１３個のλ遺伝子セグメントと同等であった。　ＰＣＲプライマーがコ ードするＶ遺伝子の領域は上記の析結果には含まれていなかった。 ゛　されたヒト　フラグメントは　に・して　い主１ ２〜５ラウンドの選択を行った後、イー・コリ細胞に溶離されたファージを感染 させ、次いで個々のクローンによって産生された抗体フラグメントを、ＥＬＩＳ Ａ法によって結合についてスクリーニングした。２０アミノ酸のＭＵＣＩペプチ ド（Ｐｒｉｃｅらの１９９０年の前記文献）〔ヒ）　ＭＵＣＩムチン（腫瘍関連 多形性上皮ムチンまたはＰＥ１１）の繰返しモチーフに相当する（Ｇｅｎｄｌｅ ｒらの１９８８年の前記文献ＨＧｕｍらの１９９０年の前記文献）］で選択され たファージを、ヒ）　ＰＥＭに対する結合についてスクリーニングした。したが ってこのファージは、ペプチドとタンパク質の両方に結合する。結合活性を有す るクローンの■遺伝子の配列を決定し、次いで１つのクローンをＣＥＡ、　ＰＥ ＭおよびｒｓＣＤ４の各抗原に対して同定した（表Ｉ）、数ラウンドの選択を行 った後でも、ＣＥＡ、　ＰＥＭおよびヒト組換え可溶性ＣＯ＾（ｒｓｃｃＤ４） に結合するごく少数のクローンが出現するということは、ヘルパーファージとし て（他の抗原に使用したＡ１３０ｇ　ｍヘルパーの代わりに）ＶＣ５−Ｐ１１３ 　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用したことを反映しているのかもしれない１ Ａ１３Ｄｇ　ｍ　（ｐ　ｍを産生できない）でレスキューすることによって産生 されたファージ（ミド）粒子の集団は、ＶＣ３−Ａ１３によるレスキューによっ て産生されたファージより平均結合が高い（ヘルパーファージによってコードさ れている野生型ＰＩＩＩが５ｃＦｖ　ｐｍ融合体と競合できる場合）。 次に５ｃＦｖフラグメントを他のタンパク質抗原のパネルに対する結合について スクリーニングしたところ高度に特異的であることが見出された。このことは、 ヒトＣＥＡ、　ＭｊＪＣｌおよびヒトｒｓＣＤ４に対して結合活性を有する単ク ローンによって図２に示す（主要事項については図面の簡単な説明（前記）参照 ）。 このように、腫瘍マーカーであるヒト自己抗原ＣＥ＾およびＭｔｌＣｌ。 ならびにｒｓＣＤ４に対する抗体フラグメントは同しライブラリーから誘導する ことが可能で、そしてこれら抗体フラグメントはすべて抗原に対して高い特異性 をもっている。 去振■土 ＤＮ＾の　１　およ艷血服艮亙工ｌ詰治　による　゛　フーグムＺ１叫得且火足 実施例１，２および３で単離した抗自己抗体フラグメントをＤＮＡの配列決定お よび抗原結合性によって特性を決定した。 自己特異性を有するいくつかのクローンの配列を実施例３と同様にして測定した が、にとλの軽鎖をともに含有している（表■）。 隣接生殖系Ｖ遺伝子のセグメントの配列を比較すると、いくつかの異なるフファ ミリーが使われていることを示している（Ｖｌ（１，３゜４および５；’／１１ ．２および３）、いくつかの場合では、その■遺伝子は完全に生殖系であり、例 えばａＴｈｙ−２９のＶｌｌとＶｌの両方の遺伝子であるうじかし大部分の■遺 伝子は、ヌクレオチドとアミノ酸のレベルの両方に、隣接生殖系■遺伝子セグメ ントとはいくつか相違点があるＣ表■）。そしてこのことは、それらのＶ遺伝子 が体細胞的に突然変異をしたＢ細胞から誘導されていることを示唆している。 いくつかの突然変異がＰＣＲ増幅と組立てプロセスを行っているときに起こった かもしれない０例えばａＦＯＧｌ−Ｃ８とａＭＵｃｌ−１のＶＨ遺伝子とａＴｈ ｙ−３３のＶＫ遺伝子は、ＰＣＲ増幅中の二つのＶ遺伝子間の交差から恐らく生 成したのであろう（表■）、さらに、大きな相異（例えば３６個のヌクレオチド が異なるａＦＯＧｌ−８６のＶに）は未知のＶ遺伝子セグメントを使用したこと が原因かもしれない、　ａＴＮＦ−ＡＩとａＴＮＰ−Ｅｌの重鎖のＣＤＲ３には 著しい相同性がある。すなわち生殖系Ｖ遺伝子は異なっているが、同しＪｌｌセ グメントが使用され、ＣＤＲ３の１１／１６の残基が同一である。このことは両 者の５ｃＦｖフラグメントがＴＮＰの同じエピトープに結合していることを示唆 している。 フーグメン　は西じ　ンパク　の　免ｉＬ竪ヒ＝Ａ臣ｌ走旦エバゑ 実施例２で得た、ウシチログロブリンに対する５ｃＦｙフラグメントを、ヒトチ ログロブリンに対する結合についてスクリーニングした。そしてヒトチログロブ リンはプロトマー中の単一アミノ酸残基の６個だけが異なっている（Ｍａｌｔｈ ｉｅｒｙ、　Ｙ、およびＬｉ５ｓｉ　ｔｚｋｙ＋　ｓ、。 Ｆｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６５巻、　４９１〜４９８頁、　１９ ８７年）、１２個のクローンのうち、４個（ａＴｈｙ−２９を含む）がヒトチロ グロブリンに結合したが、残り（ａＴｈｙ−３２とａＴｈｙ−３３を含む）はヒ トチログロブリンと結合しなかった（データは記載せず）、同様に、ヒト抗体Ｆ Ｏト１に結合するフラグメントを、重鎮と軽鎖のインクイブが異なっている一群 の他の抗体への結合についてスクリーニングした（図３）（その主要事項につい てはさきに述べた図面の簡単な説明参照）。 フラグメントａＦＯＧ１−Ａ４は、重鎖ｇｌ、２および３のイソタイプのすべて に結合したがｇ４またはｍには結合しなかった。対照的に、フラグメントａＰＯ Ｇ１−Ｈ６とａＦＯＧｌ−Ａ３は、ＦＯＧ−１と同しイソタイプの抗体を含む他 の抗体のいずれにも結合しなかった。このことは、これらのフラグメントがＦＯ Ｇ−１の可変領域に関連していることを示唆している。 ｉｉ−れた５ｃＦｖフーグメントの　−次のクローンａＦＯＧ−Ｈ６，ａＦＯＧ ｌ−Ａ３．　ａＴＮＦ−Ｒ７およびａＴｈｙ−２９を大規模な精製とさらに特性 決定を行うために選択した。適切なファージミドを含有する非サプレッサーイー ・コリ菌株ＨＢ２１５１のコロニーを用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン およびＯ，１％グルコースを含有する２ｘＴＹ２１に接種した。培養物を培養し 、次いで誘導しく　１ｎｄｕｃｅ）（Ｄｅ　Ｂｅ１ｌｉｓ、　ｏ、およびＳｃｈ ｗａｒｔｚ、　１．、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、＋　１８巻。 １３１目ｑ、　１９９０年）、次いで夕、グされた５ｃＦｖフラグメントを、Ｃ １ａｃｋｓｏｎらの１９９１年の上記文献および国際特許願公開第ＷＯ９２１０ １０４７号に記載されているようにして、稲＾ｂ　９Ｅ１０を用いて精製した。 ヒトＲｈ抗原に結合する１２５１−Ｐｏｇｌの、アフィニティーで精製された５ ｃＦｖフラグメントａＦＯＧ１−Ｈ６とａＦＯＧｌ−Ａ３による阻害を、下記の 改変を行って、Ｇｏｒｊｃｋ＋　Ｂ、　Ｄ、＋　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ＋　Ｋ、　Ｆ ｌ、ｌ　Ｍｅｌａｍｅｄ、　Ｍ、　Ｏ，およびＨｕｇｈｅｓ、　Ｊ、　Ｎ、、　 Ｖｏｘ、　Ｓａｎｇ、　５５Ｌ　１６５〜１７０頁、　１９８８年に記載の初期 の方法とほとんど同じ方法で行った。１２５１−ＦＯＧＩ　Ｏ，０１４８μｇを 、種々の量の精製されたａＦＯＧｌ−８６またはａＦＯＧｌ−Ａ３　ｓｃ　Ｆ　 ｖフラグメント（０〜１６μｇ）とともに、３７°Ｃにて１．５時間、前インキ ュベートを行い、次にＲＩＲ２細胞（またはｒｒ細胞を対照として）０．５μｍ 添加した。得られた混合物を、常に混合しながら、３７℃でさらに１．５時間イ ンキュベートし、最後に細胞を上澄み液から分離した。 対照として、七面鳥卵白リリチウムに対して、精製５ｃＦｖフラグメン［によっ て滴定を行った（ａ置９）　（Ｍａｒｋｓ　らの１９９１年の前記文献）。 動的測定を表面プラスモン共鳴（Ｂｌ＾Ｃ０ｒｅ＋　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉ ｏｓｅｎｓｏｒＡＢ）を利用して行った（ＪＯｎｓｓｏｎ＋　Ｕ、、　Ｆ；ｉｇ ｅｒｓｔａｔ＋　Ｌ、、　Ｉｖａｒｓｓｏｎ。 Ｂ、Ｌｕｎｄｈ、　Ｋ、、　ＬｏｆＡｓ、　ｓ、Ｉ　Ｐｅｒｓｓｏｎ＋　Ｂ＋　 Ｒｏｏｓ＋　Ｈ，＋　Ｒ６ｎｎｂｅｒｇ、　１．＋ＳｊＯ＋ａｎｄｅｒ、　ｓ、 Ｉ　Ｓｔｅｎｂｅｒｇ＋　Ｅ、、　Ｓｔｊｈｌｂｅｒｇ、　ＬＩ　ＬＩｒｂａｎ ｉｃｚｋｙ＋　Ｃ１＋ｄｓｔｌｉｎ、　Ｈ，およびＭａｌｍｑｖｉｓｔ、　Ｍ、 ＋　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＋　１１巻、６２０〜６２７頁、　１９９１年 ｉ　Ｔｕｒｎｅｒ、＾１編集”Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＢｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃＩ ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ″、Ｊ＾Ｉ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、社、米国、サンディエ ゴ、２巻。 ２９１〜２３６頁、　１９９２年における１ｎｓｓｏｎ＋　Ｕ、およびＭａｌｍ ｑｖｉｓｔ、　Ｍ。 の報告〕、モノマーと多量体の種を分離するために、精製された５ｃＦｖフラグ メントを限外濾過で濃縮し、次いでＰＢＳ、　０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で校正 した５ｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で分画 した。 ゲル濾過は、２８０ｎ−における吸光度とセンサーチップに固定化された抗原を 用いるＢｌ＾ｃｏｒｅへのオンラインによって監視した。 動的実験を二つの異なる形態で行った。第一に可溶性５ｃＦｖの結合性を分析す るために、異なる抗原をセンサーチップに共有結合的に固定化した（ｍＡｂ　Ｆ ｏｇ−１の場合は、ウサギ抗マウスＩｇＧ１でコートしたセンサーチップを用い 、マウス抗ヒトに軽鎖−＾ｂを通じて、抗体を固定化した）、第二に、可溶性胃 Ａｂ　ＦＯＧＩの結合性を分析するため、ａＦＯＧｌ−Ｈ６ｓｃＦｗをチップ表 面に固定化した。 抗原は、＾ｍｉｒ＋ｅ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｖａｃｊａ　Ｂ ｉｏｓｅｎｓｏｒ　ＡＢ）を用い、抗原のアミン基を通じてＣＭ５センサーチッ プにカップリングさせた（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、　Ｂ、　Ｌｅｆｔｓ、　Ｓ、およ びＬｉｎｄｑｖｉｓｔ、　ｃ、ｌ　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋。 １９８巻、　２６８〜２７７頁、　１９９１年）、その抗原を１０５Ｍ酢酸緩衝 液ｐＨ５，０で約２５μｇ／■１まで希釈し、次いでＴＮＦ　（３８０５共鳴単 位（Ｒ１１）　）、ヒトチログロブリフ　（６２４９ＲＬＩ）およびＦＯＧＩ　 （５２７９ＲＩＪ）を固定化した。 Ｐｏｇ−１の生物特異性を表示するため、アフィニティー精製がなされたウサギ 抗マウスＩｇＧ１　（Ｐｈａｒｗａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ＡＢ）をチッ プ表面にカップリングさせ、続いてマウスｓＡｂ抗ヒトに（２３００ＲＬＩ）と Ｆｏｇ−１（２０５０ＲＵ）を順にカップリングさせた。ウサギ抗マウスＩｇＧ １のマウスｍＡｂへの結合は１０ｍＭ　）ＩＣＩによって元に戻せるので、複合 体は各分析サイクルごとに再構築した。５ｃＦｖ抗−Ｆｏｇ−１（１５３８ＲＵ ）をＣＭ５表面にカップリングさせた。測定はすべて、ＰＢＳ、　０．２−−Ｅ ＤＴＡ、　０．０５％Ｂ１＾ｃｏｒｅ界面活性剤Ｐ２０中、２５℃にて、一定流 量１０μｇ／園ｉｎで実施し、試料の注入容量は３５μｌであった。５ｃＦｖフ ラグメントは迅速に解離するので、抗原を、ウサギ抗マウスＩｇＧ１によって生 物特異的に表示するためｌｏｍＭ　ＨＣＩを用いて３分間再生させる場合を除い て、抗原を再生させる必要はなかった。 ５ｃＦｖモノマーの分析は１００〜５００１１Ｍの濃度範囲で行い、二量体の分 析は、Ｆｏｇ−１を生物特異的に表示するため二量体５ｃＦｖの濃度が０．２５ 〜１．２６μＭの場合を除いて４０−２００　ｎＨの範囲で行った。　ＦｏｌＢ −１はの分析は、ａＰＯＧｌ−＋１６　ｓｃ　Ｆ　ｖの表面で１０〜２００　ｎ Ｍの濃度範囲で行った。濃度はすべて２Ｂ０　ｎｍの紫外線吸光度から計算した （０．７Ｂ／ｍｌ　５ｃＦｖはＡ２８０＝　１を示しくＭａｃｈ、　ｎ、＋　Ｍ ｉｄｄａｕｇｈ、　ｃ、　Ｒ，およびＬｅｗｉｓ、　Ｒ，Ｖ、＋　Ａｎａｌ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２００巻、７４〜８０頁、　１９９２年）、かつｓｃＦマ モノマーの訃は３０にＤで二量体の肚は６０ＫＤであるとして計算した）。活性 タンパク質の両分に対する補正は行わなかったのでオンレー１−　（ｏｎ−ｒａ ｔｅ）は低く見積っである。データの動的評価をＫａｔｌｓｓｏｎ、　Ｒ，＋　 ＭｉｃｈａｅＬ３ｓｏｎ＋　Ａ、およびＭａｔｔｓｓｏｎ＋　Ｌ、ｌ　Ｊ、　１ ｍｍｕｎｏｌ。 Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１４５巻、　２２９〜２４０頁、　１９９１年にしたがって 行い、プログラムＯｒｉｇｊｎ１．　Ｌ　（Ｍｉｃｒｏｃａｌ　Ｉｎｃ、社、米 国、マサチューセッツ州。 ノーサンプトン）で評価した。 二つの　フーグメン　くヒトｗＡｂＦｏ−１のイー′イオ　イブに・しエム又速 旦工公ゑ Ｒｈ　Ｄ抗原を有するヒト赤血球に対する１２５１−Ｆｏｇ−１抗体の結合は、 ａＦＯＧＩ−Ｈ６およびａＦＯＧｌ−Ａ３の５ｃＦｖフラグメントの両方によっ て阻害することができる。したがって、ａＦＯＧｌ−８６とａＦＯＧｌ−Ａ３の 両者は部位関連抗イデイオタイプ抗体であり、Ｆｏｇ−１の抗原結合部位と結合 して複合体を生成する。　１２５１−Ｆｏｇ−１のＲｈ　Ｄ抗原（ヒトＲＩＲ２ 赤血球上の）に対する結合の阻害度は、アフィニティー精製がなされたａＦＯＧ ｌ−Ｈ６およびａＦＯＧｌ−Ａ３の５ｃＦｖフラグメントによる滴定で測定した 〔対照として、七面鳥卵白リゾチームに対して５ｃＦｖフラグメント（ａ置９） （Ｍａｒｋｓ　らの１９９１年の前記文献）を使用したところ、１２５１−Ｆｏ ｇ−１の結合の回置は全く認められなかった〕。最大値１６μｇのｓｃＦｖ（１ ２５１−Ｆｏｇ−１に対して１０００倍の過剰モル量）によって、該結合は、ａ ＦＯＧｌ−＋１６の場合１４．２％およびａＦＯＧｌ−Ａ３の場合２０．９％阻 害された。このことは、これらフラグメントのＦｏｇ−１に対するアフィニティ ーは、−価で結合する（Ｇｏｒｉｃｋらの１９８８年の前記文献）　、Ｆｏｇ− １のＲｈ　Ｄ抗原に対するアフィニティー（Ｋａ＝２．２　ＸＩＯ’　Ｍ−’） よりはるかに低いことを示唆している。これらフラグメントの１００％が活性の 場合、この２つのフラグメントのＦｏｇ−１に結合するアフィニティーは、ａＦ ＯＧｌ−Ｈ６についてはＫａ＝　３　ＸＩＯ’　Ｍ−’およびａＦＯＧｌ−Ａ３ についてはＫａ＝　６　ＸＩＯ’　Ｍ”’と推定され、このことは他の動的測定 でも同じである（下記説明と表面参照）。 ″ｔＳＣＦｖフーグメン　は　モノマーおよび二　の　゛パｌ　るーと（る 可溶性抗体フラグメントは、アフィニティークロマトグラフィーを用い、Ｃ末端 ペプチドタッグをｍＡｂ　９Ｈ１０に結合することによって、細菌上澄み液から 精製した。限外濾過を行った後、フラグメントは５ｕｐｅｒｄｅｘ　７５　（Ｐ ｈａｒ＋５ａｃｉａ社）によってＦＰＬＣゲル濾過（Ｐｈａｒ＋ｍａｃｉａ社） を行うことによってさらに精製し、次いで紫外線吸光度（２８０ｎｍ）およびＢ ＩＡｃｏｒｅのセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｔｏｓｅｎｓｏｒ　Ａ Ｂ）上に固定化した抗原に対する結合性の両方によってオンラインで検出した。 この試験は、５ｃＦｖフラグメントが、モノマーと二量体に大きさが対応する。 二つのピークで出現することを示した。その二量体は、そのより大きな結合力に よって、モノマーより強力に固定化抗原に結合する。５ｃＦｖ二量体は、非還元 性ＳＯＳゲル上では七ツマ−と同様に走行するのでジスルフィド結合によって結 合されることはない、二つのピークがゲル濾過で見られるので、この場合、モノ マーと二量体は迅速には相互変換を行わないようである。恐らく、この二量体は 、重鎮と軽鎖を連結するフレキシブルリンカ−（ｆｌｅｘｉｂｌｅｌｉｎｋｅｒ ）によって、または、他方の５ｃＦｖ分子の軽鎖に会合した一方の５ｃＦｖ分子 の重鎮によって、インターロックされた５ｃＦｖフラグメントであろう、我々に は細菌内に形成された抗体Ｆａｂフラグメントも多量体化することができること が分かっている（未発表データ）。 ５ｃＦｖフラグメントはミクロモルのアフィニティーを　ている。 ５ｃＦｖのモノマーと二量体が共存すると、固相法を用いた場合、結合アフィニ ティーを過大評価することがある。それ故、５ｃＦｖフラグメントの、抗原でコ ートされた千ノブに対する結合のアフィニティーと速動性（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ） を表面プラスモン共鳴を用いてめるために、我々はこのフラグメントをゲル濾過 によって精製した（表■）。二量体については、オフレート定数が約１０−”　 ｓ−’と測定され、そして５ｃＦｖ二量体のオンレート定数は約１０’〜１０’ 　Ｍ−’　Ｓ−１と測定された（試料は完全に活性であると仮定）　、　ａＦＯ Ｇｌ−１１６の場合、抗原（ｍＡｂ　Ｆｏｇ−１）は、２つの方法すなわち直接 にまたはウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体を通じてセンサーチップに固定化した。得 られた結果は、どちらの方法でもほとんど同一であって（表面参照）。しかし３ ＣＦＶフラグメントの活性画分はかなり変化し、オンレート（および結合のアフ ィニティー）の過大評価をもたらすことがある０例えばフェニルオキサシロンに 対して、いくつかの５ｃＦｖフラグメントによる蛍光消光滴定法を用いたところ 、我々は５ｃＦｖ分子当り０．０６〜０．３８の官能性の結合部位しか検出しな かった（未発表データ）。 実際に、ａＦＯＧｌ−８６フラグメントとＦｏｇ−１抗体の会合について計算し たオンレート定数は、抗体（Ｋｏｎ　２．２　ＸＩＯ’　Ｍ−’　ｓ−’）また は５ｃＦｖフラグメント（Ｋｏｎ　１．　Ｏｘ１０６Ｍ−’　ｓ−’）がセンサ ーチップ上に固定化されているか否かに依存しており（表ＩＩＩ）、このことは ａＦＯＧｌ−Ｈ６フラグメントがＦｏｇ−１抗体より活性が低いことを示してい る。 ３（Ｆｖのモノマーの場合、結合シグナルは低かったので、ａＴｈｙ−２９モノ マーの解１１１［ＣＫｏｔｔ　＝２Ｘ１０−ｆｓ−’）の場合を除いて、表面へ の結合の連動性を追跡することは困難であった。しかし、ａＴｈｙ−２９フラグ メントの二量体の安定性が４倍であるということは（下記の事項参照）、他のモ ノマーのオフレト定数が１０−２　Ｓ−１未満、おそらくは１０−’　ｓ−’で あることを示唆している。 ５ｃＦｖ二量体がセンサーチップ上でモノマーと比べて安定性が大きいというこ とは、二量体が二価であることを示している。それ故、５ｃＦｖの二量体は抗体 １ｇＧの二つの頭部（ｈｅａｄ　）に似ており（しかし頭部間の間隔は異なって いる）、それらの結合力はＫｏｎ／Ｋｏｆｆから約１０’　Ｍ−’と推定した（ 表１［１）、モノマーのアフィニティーは、表面からの解離が速いことから低い はずである。　ａＴｈｙ−２９モノマーの場合、オンレート定数が二量体の場合 と同じあると仮定すると（Ｍａｓｏｎ、　ｏ、　ｗ、およびＷｉｌｌｉａｍｓ、 　Ａ、　Ｆ、、　Ｋｊｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ＡｎＬｔｂｏｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ ｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａ ｎｔｉｇｅｎｓ、　ＢｌａｃｋｈｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オックスフォー ド、　１９８６年）、我々はアフィニティーが約３　ＸＩＯ’　Ｍ−’であると 推定できる。これらのアフィニティーは、表面プラスモノ共鳴法で測定された速 度定数から計算されるが、蛍光消光法によって溶液で測定されたアフィニティー と類似しているようである。ｆｊ４えば七面鳥リゾチームに結合して（同じライ ブラリーから誘導された）モノマー５ｃＦｖフラグメントの置９　（Ｍａｒｋｓ らの１９９１年の文献）の結合アフィニティーは、表面プラスモン共鳴法を用い て３．９　ｘｌｏｆｆ　ｙ−＋と推定され（表ｍ）、および蛍光消光法（Ｍａｒ ｋｓ　らの１９９１年の前記文献）によって１．２Ｘ１０’Ｍ月と推定された。 単離された抗体のアフィニティーはマウスの一次免疫応答由来の抗体の一般的な アフィニティーである（Ｆｏｏｔｅ、　Ｊ、およびＭｉ　ｌ５ｔｅｉｎ。 Ｃ０＊　Ｎａｔｕｒｅ＋　３５２巻、　５３０〜５３２　Ｌ　１９９１年）、抗 体フラグメントのタンパク質自己抗原に対する解離の連動性（１０５〜１０’　 Ｍ−’ｓ−’）も、さきに特性決定がなされたＡｂ−タンパク質の相互作用の一 般的な速動性である。しかし解離の速動性（１ｆＩ”ｓ−’）はＡｂ−タンパク 質の相互作用の場合は比較的高い（しかし両者の速度は多くのＡｂ　−ハプテン の相互作用に比べ低い）。我々は、”モノマーの“のファージが、洗浄中、固体 支持体上に保持されると予想していなかったので、このような高いオフレートで ５ｃＦｖフラグメントを単離できるということは、−見して驚くべきことである 。しかし５ｃＦｖフラグメントは、ファージ上に、特にＭ１３Ｄｇ　ＩＩへルバ ーファージを用いて多原子価的に表示され、かつ溶液中で二量体を形成する傾向 のあるいくつかの５ｃＦｖ！もファージ上に二量体を形成できる。抗原との多原 子価的相互作用はファージを保持する働きをし、インコードされたｓｃＦｗファ ージが単離できるようになる。 免疫化された動物のｍＲＮ八由へのランダム組合わせＶ遺伝子レパートリ−は抗 原結合部位の一部をコードする重鎮もしくは軽鎖が豊富であるので、ファージ法 を用いて抗原結合フラグメントを単離し易いが、各Ｂリンパ球のＶ遺伝子の組合 わせは大部分破壊されるようである。また抗原結合部位は、未免疫化ヒトドナー からの、異種抗原に対する５ｃＦｖフラグメントの単離によって示されるように （Ｍａｒｋｓらの１９９１年の前記文献）、連鎖のランダム組合わせによって新 たに生成させることができる。 “天然の自己抗体”すなわち健康なドナーから単離される自己反応性抗体は、ア フィニティーが低くしかも多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）の傾向がみら れかつＢ細胞の離散性サブセットによってかなり産生され、その内部活性セット （Ｈｏｌ＋ｗｂｅｒｇ＋　Ｄ、および（＋）ｕｔｊｌｉｈｏ＋＾。 Ｉｍ＋＊ａｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ＋　６巻、　３５６〜３５７頁、　１９８５年 ）は一部分がＣＤ５＋Ｂ細胞の影響を受ける（Ｃａｓａｌｉ、　Ｐ、および１ｌ ｏｔｋｉｎｓ、＾、　Ｌ、、　Ａｒ＋ｒ＋ｕ。 Ｒｅｖ、　Ｉ＊ａ＋ｕｎｏ１．、７巻、　５１３〜５３５頁、　１９Ｂ９）　、 これに対して我々が作製した抗自己５ｃＦｖフラグメントは、ミクロモルのアフ ィニティーしかもっていないにもかかわらず抗原に対する結合については高度に 特異的である。このことは驚くべき価値のある発見である。これらのアフィニテ ィーはおそらく生体外で改善できるであろう。例えばファージライブラリーから 誘導され（ならびに本願に記載された抗自己抗体と同様に比較的オフレートが高 い）ｓｃＦｖフラグメントのハプテンフェニルオキサシロンに対するアフィニテ ィーは、連鎖のシャンフリングによって（国際特許願公開第Ｗ０９２１０１０４ ７号；Ｍａｒｋｓ　ら、ＢｉｏＬｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋　Ｈｏ巻、　７７９〜７ ８３頁、　１９９２年ｂ）、Ｋａが３．　Ｉ　Ｘ１０６　Ｍ−’から９．　Ｉ　 ＸＩＯ”　Ｍ−’まで改善された。このようにして、ヒトの治療に用られる、高 特異性でかつ高アフィニティーを有する、自己抗原に対するヒト抗体を創製する ことができる。 ス五−例」− 金底旦」ブ旦ユニ少■製 繊維状ファージの表面に抗体レパートリ−を表示させ次いでそのファージを抗原 寞で選択することによって、我々は、免疫選択２゛３に似せて、未免疫化ドナー −の再配列された■遺伝子からヒト抗体を作ることができる。ヒト抗体は、現在 、明確に分かっているＶ遺伝子の要素から合成によって製造されている。４９個 のヒト生殖系■鮪遺伝子セグメントのレパートリ−を、５個のランダムアミノ酸 残基からなる合成の“Ｄセグメント”およびＪ、セグメントに連結することによ って生体外で再配列して、８個の残基からなる合成の第三の相補性決定部位（Ｃ ＤＲ）を創製した。この再配列された■イ遺伝子を、ファージ表示のための一末 鎖ＦｖフラグメントとしてヒトνＩａｓｂｄａ３の軽鎖でクローン化した。１０ ″　のファージのライブラリーを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とハプテン２ −フェニル−オキサゾール−５−オン（ｐｈｏｘ）の接合体でパニングを行い、 ｐｈｏｘ−ＢＳＡに対して特異的な結合活性を有しかつｐｈＯｘ−γ−アミノ酪 酸（ｐｈＯｘ−ＧＡＢ＾）に対してミクロモルの範囲のアフィニティーを有する フラグメントをコードするファージを単離した。ユニーク配列を有する２１個の クローンを比較したところ、ハプテンに対する生体外での°“免疫応答”は、Ｃ ＤＲ３の残基９８における芳香族の非変異残基（Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ） によってＶ１１２６セグメント（ＶＨ３ファミリー）６に大部分制限されること が分かった。生体外で再配列された■遺伝子を用いると、既知の構造の抗原の結 合に対してバイアスされた抗体ライブラリーを設計することが可能になり免疫原 性が低下した治療用のヒト抗体を創製することができる。 抗体の可変領域は、超可変配列またはＣＤＲ’の三つのループを有するβ−シー トのフレームワークで構成されている。これらのループは、平坦な表面７〜ポケ ント３の範囲の各種の形態の抗原結合部位を生成する。ヒト重鎮の場合、最初の 二つのＣＤＨの配列多様性は、約５０個の生殖系■□上セグメントレパートリ− によってコードされている（Ｔ、　Ｍ、　Ｔｏ＋５ｌｉｎｓｏｎらの前記文献） 。三番目のＣＤＲは、これらのセグメントの、約３０個のＤセグメントおよび６ 個のフラグメント９による組換えから生成する。そして、その配列は高度に可変 性であるが、ループの＾５ｐｌｏ１からフレームワーク１°のＡ、、９４への塩 橋（ｓａｌｔ　ｂｒｉｄｇｅ）を含有している場合が多い、最初の二つのＣｒＪ Ｒの構造と長さは制限されているが＋ｏ、＋＋　、ＣＤＲ３の構造と長さは大き く異なり、長さは４〜２５の残基Ｓの範囲内にある。 単一のＶｌａｍｂｄａ　（参照文献１２）の軽鎖を組合わせてＡ３ｐｌＯ１を含 む８個の残基からＣＤＲ３を用いて再配列されたＶＨ遺伝子を創製した６ヒ）Ｖ Ｍ　レパートリ−（Ｔｏｌｔｎｓｏｎ　らの前記文献）の大部分をコードする４ ９個の生殖系■８セグメントを各々、ポリメラーゼ連鎖反応１３および合成のＤ セグメント（ｖＭ上セグメント３′末端におけるランダム配列の１５個の塩基） とフラグメント〔ともに８個の残基のＣＤＲ３ループをコードする（図４）〕を 用いて増幅させた。再配列されたセグメントをプールし、ヒトＶｉａ麟ｂｄａ３ 軽鎖によるファージ表示のためクローン化し、１０７個のファージクローンから なる合成ライブラリーを創製した。免疫系と同様に、１０７個のファージクロー ンからなる合成ライブラリーは、潜在性多様性の小画分しかタップできない、し たがって、その多様性は恐ら＜　４９ｘ３２’　＝　１．６　ｘｌ、Ｏ”の異な るヌクレオチド配列すなわち４９Ｘ２０’　＝　１．６　ＸＩＯ”の異なるアミ ノ酸配列である。 このライブラリーは、４ラウンドの増殖を行わせ１次いでｐｈｏｘ　−ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）でコートした試験管上でパニングし、次にクローンを、Ｅ ＬＩＳＡ法４を用いｐｈＯｘ−ＢＳＡに対する結合活性について、可溶性１４の 一本１１Ｆｖフラグメント１Ｓ・１にとしてスクリーニングした。第３と第４の ラウンドを終ってから、１４／９６と６１／９６のクローンはそれぞれｐｈＯｘ −ＢＳＡに対する結合活性で固定し、これら（２９個を試験した）のうちどれも 他のタンパク質と結合しなかった（一覧表Ｂ参照）＃さらにこれらのｐｈＯｘ− ＢＳＡでコートされたプレートへの結合は、可溶性ハブテンと競合する（表Ｂ） 。 配列決定を行った結果、ｐｈＯｘバインダーの多く　（２１／２９）はユニーク 配列であり、８個の残基Ｃ１）１１３を有し、ＶＮ４ファミリーからの一つのセ グメントまたはＶＭＳファミリーからの三つのセグメントのうちの一つを利用し ている（表Ｂ）ことが明らかになった。全体として、これらのセグメントは、ヒ ト■６セグメントの最初の二つの超可変性ループに利用可能な７個の゛規定（ｃ ａｎｏｎｉｃａｌ）”折畳みのうちの３個を利用する（Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａらの 上記文献）、ユニーククローンの大部分（１６／２１　）はＶ）１２６セグメン ト６から誘導され、かつ第三の超可変性ループ中に類縁配列をもっている。ずな わぢ、このグループ内で、第一の残基は、分枝した脂肪族の側鎖（１５／１６） をもつ傾向があり、第二の残基はリシンまたはアルギニン（１１／１６）である 傾向があるが、第四の残基は常に芳香族の残基である（最も頻度が高いのは千ロ ジンである）。 ρｈｏ＋ｒ−ＧＡＢ＾に対する一層強力なバインダーのうちの二つ（Ｏｘ１３お よび０ｘ−３１、表Ｂ）のアフィニティー（Ｋｄ）は、蛍光消光滴定法１７で測 定した結果それぞれ３．１±０．２μＭおよび６．７±０．７μＭであった。合 成の抗体ライブラリーは、多様なＶＨ−ＣＤＩ？３の長さと生体内で製造された 抗体の異なる軽鎖を欠いているが、ｐｈＯｘ−ＢＡＢ＾に対するアフィニティー は、未免疫化ヒトドナー４から製造した（ファージ）抗体の０．５μＭまたはマ ウスの一次免疫応答ＩＩ′由来のいくつかのハイブリドーマの１μＭと同等であ る（しかし一覧表Ａの注意事項参照）、これらのアフィニティーを改善するため に、選択された多くの異なるｐｈｏχ抗体（表Ａ）を組織的に変更することがで きる（以下の説明参照）。 原則として、生体外で再配列されたＶ遺伝子のファージ表示ライブラリーを使用 すると、生体内４で再配列されたのに代わる興味深い■遺伝子が得られる。第一 に、該ライブラリーから創製された合成ヒト抗体の重鎮と軽鎖の両者のフレーム ワーク領域と最初の二つの超可変性ループはほぼ生殖系である。これは、生体内 で再配列されたヒト■遺伝子からタップされた“−次”ファージ抗体と異なり、 体細胞の突然変異の程度が広く４変化した。多形性を考えなければ、そのＶ）Ｉ 遺伝子のセグメントは異なる個体と同一であり、かつその合成抗体は免疫原性が 恐らく低いであろう０重鎖と軽鎖のＣＤＲ３ループの長さと配列を変更するか、 または他のＣ［ＪＲ小ループ最少突然変異を局在化させるか、または合成の“生 殖系”軽ｇ＋４・ｔｏでシャラフリングを行うことによって、その生殖系の特性 を保持しながらそのアフィニティーを改善することが可能である。 第二に、両方の種類のライブラリーは高度にバイアスされている。 °゛天然”ライブラリーでは、このバイアスは、我々の制御の範囲外にあり、例 えば対立遺伝子の変化、欠失多形性および自己反応性クローンの欠失によって与 えられる。合成のライブラリーでは、このバイアスは組織的に導入することがで きる。例えば、ＶＨ遺伝子のセグメントはすべて選択され、その結果、第一と第 二の超可変性ｌレープの折畳み、すなわちＶＨ−ＣＤＲ３とその軽鎖の長さと多 様性力（固定される。多様な合成ライブラリーの製造方法がし）りつか示唆され ているが２、設計原理をコードされた構造に組込むことが可能でな番すればなら ない、抗原の形態が知られている場合、はぼ相補的な結合部位のエンベロープを 設計して明確にわかっている■遺伝子の要素で構築できる。このような“デザイ ナ−”ライブラリーを使用することは高アフィニティーを有する抗体を単離する のに有利である。 表−Ａ Ｖ８２　１　２７　１．０（９） ＶＨ４９６３−７１２，６（２３） ＶＨ５１７３１，４（１２） Ｖ、６　１　７４　１．９（１７） 合計：　４９　１１．３　（１００） 傘簡略にするため、■やセグメントはＴｏｍｌｉｎｓｏｎらの前記文献のＤＰ命 名法にしたがって列挙しである。 ＬＬＵｊ＠旦乙工ｊユニ■■底 ４９個のヒト■エセグメント（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ　らの前記文献）を使用した 。すなわちＶＮ　２．ＶＭ　５およびＶｌｌ６の各遺伝子ファミリーには１個の セグメントを使用し、残りの三つのファミリーに番よ多数のセグメントを使用し 、ファミリーごとにクローン化した。各ファミリーのｖＨ上セグメントらのクロ ーンを、挿入断片の有無につし）てについて検査しく平均８５％存在する）、表 Ｂに示すように単一の大きなライブラリーにプールし、所定の遺伝子ファミリー に対して（制御された）バイアスを作った。したがってＶＨ２，ＶＭ　５゜ＶＨ ６のファミリー由来のセグメントは、残りのファミリー由来のセグメントに比べ て″過剰に存在している（　ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎ　ｔｅｄ）”。 未選択のライブラリー由来の３５個のクローンの配列を決定して、各ファミリー 由来の■。セグメントが存在し、かつヌクレオチドが予想された比率でＤセグメ ント中に存在しているがＣセグメントについては僅かにバイアスがみられること を確認した。（各コドンの第一と第二の位置には、Ａが２１．３％；Ｇが１７． ９％；Ｃが３３．７％およびＴが２７．１％であり、第三の位置にはＧが４２． ６％およびＴが５７．４％であった）。これら抗体フラグメントの発現レベルも 検査し、そしてｖＨ上セグメント、検出可能な発現レベルで、例えばＶ、　１　 （ＯＰ−７）。 Ｖｌｌ　２　（ＤＰ−２７）、Ｖｌｌ　３　（ＤＰ−２９，３５，３８，４４， ４７，５１，５３）、Ｖｌｌ　４（［１Ｐ−６３，６９）　、ＶＭ　Ｓ　（ＤＰ −７３）およびＶ、　６　（ＤＰ−７４）でクローン中に同定した。 方−広 クローンは、挿入断片の有無について、オリゴヌクレオチドＬＭＢ３とｐＨＥＮ −３ＥＱ　（参照文献４）を用いＰＣＲスクリーニング法！１によって検査し、 次いでオリゴヌクレオチドＬＩＮＫＳＥＱ（５’　−ＣＧＡ　ＴＣＣＧＣＣＡＣ ＣＧＣＣＡＧＡ　Ｇ−３’　）を用いジデオキシチェインターミネーション法８ ２によって二本鎖ＤＮＡから配列を決定したく表中の番号は挿入断片について修 正されている）、可溶性３ｃＦｖフラグメントの発現は、イー・コリＨＢ２１５ １　（参照文献１４）中に一夜誘導された培養物の上澄み液１０μｍを、スロッ ト−プロット装置（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ　ｎ　、　５ｃｈｌｅｔｃｈｅｒａｎｄ　 ５ｃｈｕｅｌ１社）を用いてニトロセルロースフィルタ上にスボ・ノドし、次い で結合した、ペプチドをタグした５ｃＦｖフラグメントを、９Ｅ１０抗体■およ びペルオキシダーゼで標識をつけた抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ社）で検出するこ とによって検査した。 ０Ｘ−３１Ｖｌ３　ＤＰ−４２１１２６傘ＴｏｍＩｉｎｓｏｎらの前記文献；　 Ｃｈｏｔｈｉａらの前記文献。 φ（ｔｔ　ｍ　）　、　ｐｈＯｘ−ＧＡＢＡを用い競合ＥＬＩＳＡ法によって測 定。 且はＦｌ？３におけるＶ６７Ａの突然変異を示す。 １は測定されなかったことを示す。 Ｂ−ム　−イブ−１−か′　れたｈ吸二べ（７久二フアージはシＣ３−Ｍ１３で レスキューすることによってライブラリーから製造し、参照文献４のようにして 、ｐｈＯｘ−ＢＳＡでコートされた試験管内で数ラウンド、パニングを行った。 ｐｈｏｘに結合する２１個のファージの配列が、４個の生殖系Ｖ）Ｉセグメント 、すなわちＤＰ−４２，４５゜４７（νＨ３ファミリー）およびＤＰ−６７（ν ■４ファミリー）を示した。　ＤＰ−４７はＶＨ２６と同一であるが（参照文献 ６．参照文献２４で修正’）　、ＤＰ−４２，ＤＰ−４５および叶−６７はそれ ぞれ、８−ＩＢ　（参照文献２５）　、６５−２（参照文献２６）またはＶｌ（ ４，２２（参照文献２７）とは、】っまたは数個のフレームワーク残基だけが異 なっている。　ＤＰ４７Ｖｌ＋セグメントを用いかつＣＤＲ３の特徴的なパター ンを欠いているライブラリーからのクローンはｐｈＯｘに結合しなかった。試験 された２１個のｐｈｏχバインダーのうちどれも、ＢＳＡ、　ＮＩＰ−ＢＳＡ、 プラスチック、キモトリプシノーゲンＡ１シトクロムＣ１ウシチログロブリン、 キーホールリンペットヘモシアニンまたは七面鳥卯白リゾチームに結合しながっ た。　ＢＳＡに結合した（しかしｐｈＯｘには結合しなかった）４個のクローン は汚染物（参照文献４からのαＢ５Ａ３のクローン）であることが分かった。 方−広 参照文献４のようにして、５ｃＦｖフラグメントの相対アフィニティーを阻害Ｅ ＬＩＳＡ法ｚｓによって測定した。４−Ｔ−アミノ酪酸−メチレン２−フェニル −オキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ−ＧＡＢＡ）の連続希釈を６〜４００μＭ の濃度範囲で、４％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて行い、次いで５ｃＦｖ上澄み 液を添加した。ｐｈｏｘ−ＢＳＡに結合するシグナルが５０％減少するに至るｐ ｈＯｘ−ＧＡＢＡの濃度（Ｉｓ。）を記録した。クローン０ｘ−１３と０ｘ−３ １のｐｈＯｘ−ＧＡＢＡに対するアフィニティーを、ｃ＠ｙｃタグ（参照文献４ ）によって精製した５ｃＦｖを用いて蛍光消光滴定法で測定した。理想的にｐｈ ｏｘ−ＢＳＡ接合体に対するアフィニティーが直接測定され、またはｐｈＯｘ− カプロン酸に対するアフィニティーも測定されたが、ｐｈＯｘ−ＧＡＢＡを用い て参照文献１日のハイブリドーマのデータと比較した。ｐｈＯｘ接合体またはｐ ｈＯｘ−カプロン酸に対する抗体のアフィニティーはｐｈＯｘ−ＧＡＢＡに対し て測定されたアフィニティーより優れているようである。 合成のオリゴヌクレオチド５ＹＮＬＩＢＩ　（表■参照）は、５個の残基のラン ダムアミノ酸配列を有するＤセグメント、ＪセグメントおよびＸｈｏ　Ｉ制限部 位を、４９個のヒト■。生殖系セグメントの各々の３′末端に導入した（Ｔｏｏ ｆｉｎｓｏｎらの前記文献）、ポリメラーゼ連鎖反応１にはプライマーを使用し 、そのプライマーは、ＨｕＶＨＩＢａｃｋＳｆｉから）１ｕＶＨ６ＢａｃＫＳｆ 　ｉまでのＶ９ファミリーヘースのバックプライマー（ＶＨＢＡＣに）でありＮ ｃｏ　１部位４をもっている。各Ｖ、ｌセグメントのクローン（１１３ベクター 中、−末鎖の鋳型として提供される）を、別々に、９４°Ｃで１分間、５０°Ｃ で１分間および７２℃で１．５分間のサイクル２５サイクルをＰＨＣ−３サーモ サイクラ−（Ｔｅｃｈｎｅ）で行って増幅した。各増幅はアガロースゲルの電気 泳動法で検査し、同じファミリーの■８セグメント由来のＤＮＡの１ｉｔ（ｆｌ ｕした量をプールし、Ｎｃｏ　ＩとＸｈｏｌで消化し、ＢＳＡ４に結合する５ｃ Ｆｖフラグメントから取出した、再配列ＶＩａｓｂｄａ３軽鎖可変領域（ＩＧＬ Ｖ３Ｓ１　、参照文献１２）を保有するベクターＰＨＥＮＩ　（参照文献１４） 中にクローン化した。 ランダムオリゴヌクレオチドの代わりに、ＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチ ド例えばげっ歯頚由来のものが使用される場合は、その非ヒトＣＤＲが産物の合 成ヒトライブラリーにインプリント（ｉｍｐｒｉｎｔ）される。 ・　５で？　しだ＾ １　、　ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、　Ｊ、、　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、　Ａ、　Ｄ、 、　Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ、　＆　ＣｈｉｓｗｅｌｌＤ、　Ｊ、　（１９９０）、 ハ旦■、　３４８．５５２−５５４゜２、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，（＋９９ ０）、　Ｐｒｏｃ　ＲＳｏｃ　Ｌｏｎｄ　Ｂｉｏｌ、　２３９＋　１−１６゜３ 、　Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ、　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ（１９９１）、　Ｎａ ｔｕｒｅ、　３４９．２９３−２９９゜４、　Ｍａｒｋｓ、　Ｊ、　Ｄ、、　ｅ ｔ　ａｌ　（１９９１）、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、　２２２．５８１−５９７ ゜Ｇｏｊｔｅｓ＊ａｎ＋　Ｋ、Ｓ、Ｓｅ　ｕｅｎｃｅｓ　ｏｒ　ｒｏｔｅｉｎｓ 　ｏｆ　ｉ＋ｎ＋ｕｎｏｌｏ　１ｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ　（ＵＳ　Ｄｅｐａｒ ｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ｌ（ｕ＊ａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、 ＵＳＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　０ｆｆｉｃｅ、１９８７）　。 ６、Ｍａｔｔｈｙｓｓｅｎｓ、Ｇ、＆　Ｒａｂｂｉｔｓ、Ｔ、Ｈ，（１９８０） 、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　ＵＳＡ、７７．６５６１−６５６５゜ ７　、Ａｍ＋　Ｌ　＾、Ｇ、＋　Ｍａｒｉｕｚｚａ＋　Ｒ，Ａ、＋　Ｐｈ１ｌｌ ｉｐｓ、ｓ、Ｅ、＆　Ｐｏ１ｊａｋ。 ９、Ｉｃｈｉｈａｒａ、ｙ、＋　Ｍａｔｓｕｏｋａ、Ｈ，＆　Ｋｕｒｏｓａｗａ 、Ｙ　（１９８８）。 −９１７゜ １１、Ｃｈｏｔｈｉａ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ　（１９８９）、　Ｎａｔｕｒｅ　 ３４２．８７７−８８３゜１２、Ｆｒ１ｐｐｉａｔ、Ｊ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ　（ １９９０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＋　１８＋７１３４゜ ４１３３−４１３７゜ １５、Ｈｕｓｔｏｎ、Ｊ、　Ｓ、、　ｅＬ　ａｌ　（１９８８）、　Ｐｒｏｃ　 Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ上１１ｓＡ　８５゜５８７９−５８８３゜ １９、ＣＩａｃｋｓｏｎ＋　Ｔ、、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ，Ｒ，、Ｇｒｉｆ ｆｉｔｈｓ、＾、Ｄ、＆Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ　（１９９１）、　Ｎａｔｕｒｅ、 　３５２．６２４−６２８゜２０、Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ａ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａ ｌ　（１９９２）、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　＋　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ。 ２１、ＧＬ１３３ＯＮｌ　ロ、＆　Ｃ１ａｃｋｓｏｎ、Ｔ、（１９８９）、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１７゜４０００゜ ２２、Ｓａｎｇｅｒ、　Ｐ、＋　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ 、　Ａ、　Ｒ，（１９７７）、　Ｐｒｏｃ川り匙俣Ｓｃｉ竪り、　７４．５４６ ３−５４６７゜２３、Ｍｕｎｒｏ、　Ｓ、　＆　Ｐｅｌｈａｍ、　Ｈ，Ｒ，Ｂ、 　（１９８６）、　Ｃｅ１１．４６．２９１−３００゜２４、　Ｃｈｅｎ、　Ｐ 、　Ｐ、＋　Ｌｉｕ、　Ｍ、　Ｆ、、　５ｉｎｈａ、　Ｓ、　＆　Ｃａｒｓｏｎ 、　Ｄ、　Ａ、（１９８８）。 ＾ｒｔｈｒｉｔｉｓ　ＲｈｅＩ！Ｌ３１．　１４２９−１４３１゜２５、Ｒｅｒ ｉ＋ａｎ、　Ｊ、　Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ　（１９８８）、　Ｅｍｂｏ　Ｊ、　７ ．７２７−７３８゜２６、　Ｍａｔｓｕｄａ、　Ｆ、、　ｅＬ　ａｌ　（１９９ ０）、　Ｅｍｂｏ　Ｊ　９．２５０１−２５０６゜２７、５ａｎｚ、　１．、　 ｅｔ　ａｌ　（１９８９）、　Ｅｍｂｏ　Ｊ、　８．３７４１−３７４８゜２Ｂ 、　Ｒａｔｈ、Ｓ、、５ｔａｎｌｅｙ、　Ｃ，Ｍ、　＆　Ｓｔｅｗａｒｄ、Ｍ、 　ｋ４．　（１９８８）。 Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ＋　１０６＋　２４５−２４９゜亥ｍ 旧ｌ鳳五辺ｌ二１ぶ・して　・な　フーグメ乙り塵ユ生窟及竺トム　−イブ−１ −か伝悲亀除 ＩＩＩ瘍壊死囚子−「に対して特異的な抗体フラグメントをコードするクローン を生殖系ヒト合成ライブラリーから単離した。このライブラリーは、オリゴヌク レオチド５ＹＮＬＩＢ２を５ＹＮＬＩＢＩの代わりに用いたことを除いて実施例 ５に記載されているようにして製造した。 したがって５個のアミノ酸のＶＨＣＤＲ３が生成した。このライブラリーは、未 免疫化ヒト由来のライブラリーについて実施例１に記載したのと同様にして、腫 瘍壊死因子−αに対してパニングを行った。 ４ラウンドのパニングを行った後、ファージ抗体（および対応する可溶性フラグ メント）を、ＴＮＦに対する結合活性によって単離した。 ５ｃＦｖフラグメント（αＴＮＦ−１０）のＶＨ８Ｊ域をＶＯ上セグメントＰ− ４５から誘導した（Ｔｏｌｉｎｓｏｎらの１９９２年の上記文献）。ハプテン結 合クローンαＮＩＰ−６、αＮＩＰ−１２，ｃｒｏｘ−１５およびαｏｘ−１８ も上記のセグメントから誘導したが、それにもかかわらずこれらの各フラグメン トはハブテンまたはＴＮＦに対する結合について特異的であった。 このことは、全く異なった特異性を有する抗原結合部位が、ＣＤＲ３だけを置換 することによって同じ抗体フレームワーク上に創製することができることを意味 する。非特異的抗原に対する結合は、実施例１に記載されているのと同様にＥＬ ＩＳＡ法で評価した。 左施■１ １人が昇卒るＶＨＣＤＲ３配置を１　る−殖＼ヒ辷的え九（Ａ孟ユニからの、ヒ トチログロブ１ンおよびヒトモノクロ−ル　に　ムするー　Ｆｖフクラメントの 生殖系ヒト合成一本１ｉＩＦｖフラグメントライブラリーを、実施例５のライブ ラリーと同様の方法で調製した。すなわち生殖系ＶＨ上セグメント合成のＤＩｌ とＪＨの領域を含有させ、４〜１２個のアミノ酸からなるｖｕ　ＣＤＲ３６１１ 域を生成させた。生殖系の再配列された一本鎖の軽鎖が得られた。このファージ ライブラリーは、抗ヒト特異性を有する抗体フラグメントの起源として使用した 。 ５０個の生殖系遺伝子ＶＨ上セグメント実施例５の場合と同様、Ｔｏ＋ｗｌ　１ ｎｓｏｎらの１９９１年の前記文献）をオリゴヌクレオチドを用いて増幅して、 長さが４〜１２残基の範囲で変化する完全にランダム化したＣＤＲ３を導入した 。最初のＰＣＲ反応において、各遺伝子はそのファミリーの特異的ＶＨＢＡＣＫ −ブライ７−　（ＶＨＩＢＡＣＫＳｆｉ−ＶＨ６ＢＡＣＫＳｆｊのうちの１つＨ ＭａｒｋＳらの１９９１年の前記文献；国際特許願公開第−０９２１０１０４７ 号）を用い５′末端で増幅し、次いで３′末端においてシリーズ５ＹＮＬＩＢ４ −５ＹＮＬＩＢ１２　（表■）の各オリゴヌクレオチドの一つをアニールした。 このＰＣＢでは、２５０８Ｍ　ｄＮＴＰ、　１０ｍＭ　ＭＣ１，１０ｗＭ（ＮＨ ４）２Ｓ０４１２０ＩＩＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，８）　、２＋ｉＭ　ＭｇＣ ｈ、　１００　μｇ／ｍｌ　ＢＳＡおよびｌｕｌ　（１単位）のタグＤＮＡポリ メラーゼ（Ｃｅｔｕｓ社）各々２．５ｐｍｏｌづつ用いた。鋳型は、適切な生殖 系■遺伝子をコードするＭＢファージクローンを感染させたイー・コリの菌株１ μｌであった。増幅のサイクルは９４℃で１分間、５５°Ｃで１分間および７２ °Ｃで１．５分間のサイクルであった。２５サイクルの後、同ＵＶＨＢＡＣＫオ リゴヌクレオチド３０ｐ＊ｏｌおよびＪＨ５ＡＬ（表ＩＶ）　３０ｐｍｏｌを添 加し、次いでＰｃｔ？を１５サイクル続け、Ｓａｌ＋クローン化部位をν■遺伝 子の３′末端に導入した。適切な大きさのバンドがアガロースゲルの電気泳動で 認められたことを確認した後、同じ５ＹＮＬＩＢプライマーで行った全増幅のＰ ＣＲ産物を集め、Ｎｃｏ　［と５ａｌｌで切断し、次いで実施例５の場合と同様 に、Ｎｃｏｌ−Ｘｈｏｌ　で切断したｐ）ＩＥＮＩ−Ｖ３　（クローン化ＩＧＬ ν３ｓ１を含有するｐＨＥＮＩ）中にクローン化した。このようにして、９個の ライブラリー（各々一つの特定のＣＤＲ３の長さを有する）を作製した。各々５ Ｘ１０６〜５Ｘ１０’個のクローンを含有していた。 １−訳 実施例３に記載したのと同様にしてＶＣ５−Ｎ１３でレスキューすることによっ て、９個の異なるライブラリーからファージを調製した。 ９個の個々のライブラリーから得たファージを混合して一つの大きなライブラリ ーとして、二つの抗原の各々の−っでパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）行った。すな わち免疫吸着試験管（ｉｓｍｕｎｏｓｏｒｐ　ｔｕｂｅ）を、炭酸緩衝液（０， Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　、　１００　ＩＩ　ｇ　／＋ｎｌでｐ）１９．６）中０ ＡＫ３　（ヒト抗−Ｒｈｅｓｕｓ　Ｄ抗体、１ｇＧ３．　Ｋ）で−夜コートする か、またはヒトチログロブ１ン（ＰＢＳ中１００　μｇ／−１でコートする）で コートした。 選択は実施例３と同様に行った。 スクリーニング ＥＬＩＳＡ法をＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらの１９９１年の前記文献に記載されてい るようにして実施した。ＥＩＪＳＡ法のプレートは、ＰＢＳ中１００　ｕ　ｇ　 ／ｍｌのグロブリンで室温にてコートした。 試屈益来 ０ＡＫ３をコートした試験管での選択を４ラウンド行った後、溶離されたファー ジを用いて１（Ｂ２１５１に感染させ、次いで可溶性５ｃＦｖフラグメントをＥ ＬＩＳＡ法によって結合性について分析した。　５９／９６のクローンが０ＡＫ ａ　ＥＬＩＳＡ法で陽性と判定された。 また生殖系ヒト合成ライブラリーには、ヒトチログロブリンでコートされた試験 管で５ラウンドの選択が行われ、８０／９６のクローンが、シＣ３−Ｍ１３でレ スキューされた個々のクローンのファージＥＬＩＳＡ試験によって陽性と判定さ れた。 上記の各陽性クローンのうちの二つを、一連の抗原（ＯＡＫ３、ヒトチログロブ リン、ｐｈｏｘ−ＢＳＡ、　ＮＩＰ−ＢＳＡ、　ＢＳＡ、　オホ７　Ｂｖブミン 、キモトリプシノーゲンＡ１ストレゾタビジン、シトクロムＣ，ＸＬＨ，七面鳥 の卵白リリチウム）に対する結合性についてＥＬＩＳＡ法で分析した。 上記の二つの０ＡＫ３結合クローン（可溶性５ｃＦｙフラグメントとして）はと もにＥＩＪＳＡ法での０ＡＫ３のバックグランドの約３倍の高いシグナルを示し た。上記の二つのチログロブリン結合クローン（ファージに表示されたｓｃＦ、 フラグメントとして）はともにＥｌ、ＩＳＡ法におけるチログロブリンのバック グランドの約５倍の高いシグナルを示した。これらのクローンはすべて、それら が選択された抗原に対して著しく特異性であることが判明した。ファミリー特異 的プライマーとハイブリッドを形成させることによって（Ｊ、　Ｄ、　Ｍａｒｋ ｓ　ら、Ｅｕｒ。 Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、＋　２１巻、９８５〜９９１頁、　１９９１年）、上記 ４種の全クローンのＶｌ（セグメントはＶｌ（３フアミリーのセグメントである と同定された。各クローンのＣＤＲ３の長さは、オリゴヌクレオチドのＣＤＲＦ ＯＲとＣＤＲＢＡＣＫ　（表Ｖ）を用いてＣ［ｌＲ３を増幅することによって分 析し、次いで産物を８％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。我々は、二つの ａＡＫ３結合クローンは長さが４もしくは７個のアミノ酸残基の長さであるが、 チログロブリン結合クローンはともに１０個の残基のＣＤＲａ長を使用している ことを見出した。 したがって、ヒトモノクローナル抗体とヒト自己抗原に結合する抗体５ｃＦｖフ ラグメントがヒト生殖系合成ライブラリーから単離されたのである。 ｌ飾遺■ イン　−ロイキン−１六　の゛±Ｌ二ｔｉ鹿良ムｉＬＪ　７上食単崖 実施例１に記載した、未免疫化ヒト由来の一末鎖Ｆｖフラグメントのライブラリ ーを使用し°ζ、インターロイキン−１受容体の活性をトリガーする抗体を選択 する。まず、Ｔ細胞のインターロイキン−１受容体（ＩＬ−ＩＲ）の可溶性外部 領域に結合する抗体フラグメントを＃離する。このようにして同定される抗体ク ローンを、次にインターロイキン−１のタイプの生物活性についての検定法で分 析する。 マウスおよびヒトのＴ細胞のＩＬ−１１７は、インターロイキン−１αおよびイ ンターロイキン−１βの両者を捕捉する著しく相同性の８０ＫＤの細胞表面塘タ ンパク質である。マウス受容体外部領域のＮ末端の３１６個のアミノ酸をコード するｃＤＮ＾クローンをＨｅＬａ細胞（ｓ、に、　Ｄ。 ｗｅｒら、Ｊ、　ｌｍ５ｕｎｏ１．＋　１４２巻、　４３１−４〜４３２０頁、 　１９８９年）に発現させた。このようにして発現させた可溶性ＩＬＩ−Ｒ分子 を精製したが、全長のＩＬ−ＩＲ分子と区別できない結合特性を示し、単一の可 溶性ＩＬＩ−Ｒ分子とＩＬ−１との複合体が形成され−Ｃいる。この可溶性受容 体分子はヒ（・インターロイキン−１に結合する。ヒトＴ細胞インターロイキン １受容体はＪ、　Ｅ、　Ｓｉ＃ｓらによってクローン化されて配列が決定されて いる（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ＋　８６巻、 　８９４６〜８９５０頁。 １９８９年）、ヒトＩＬＩ受容体の可溶性外部領域（１〜３１６のアミノ酸）を 、ＨｅＬａ細胞中で発現させ、マウス受容体について記載したのと同様にして精 製する。 レスキューされた未免疫化ヒトライブラリーを、まずＩＬ−１受容体の外部領域 に相当する組換えヒト可溶性ＩＬ−１受容体に対して選択する。免疫試験管を、 上記の可溶性ルー１受容体で（１μ８／１）実施例１に記載されているのと同様 にしてコートし、次いで合計４ラウンドのアフィニティー選択に対して実施例１ に記載されているのと同様にパニングを実施する。 可溶性ＩＬ−１受容体に結合するクローンは、実施例３にＴＮＦ−αについて記 載したのと同様にして、Ｍｉ換え可溶性ＩＬ−１受容体（１０μｇ／’ｍｌ）を コートした＠量滴定プレートを用いＥＬＩＳＡ法によって特性を決定した。次に 可溶性ＩＬ−１受容体によって著しいＥＬＩＳＡシグナルを示すが非特異的抗原 によってＥＬＩＳ＾シグナルを示さない抗体フラグメントを次の試験を行うため に選択する。 このようにして単離した抗体クローンを可溶性５ｃＦｖフラグメントとしてイー ・コリ中で発現させ、次に＋ｍＡｂ　９ＥＩＯアフイニテイークロマトグラフイ ーによって、実施例４に記載されているのと同様にして精製する。ヒト受容体に 対する結合性は、１′■で標識を付けた抗体フラグメントの、インターロイキン −１受容体を発現するヒト繊維芽細胞系ＴＩＧ−１に対する結合性を、利用して 評価する。なおこの方法は、これら細胞系の受容体に対する”’　Ｉ　−ＩＬＩ 　αのアフィニティーを測定するＴ、　Ｔａｋｉｉらが報告している方法（Ｂｕ ｒ、　Ｊ。 ｌｍ５ｕｎｏ１．＋　２２巻、　１．２２１〜１２２７頁、　１９９２年）と基 本的に同しである。 受容体結合性を示す精製抗体フラグメントは、ヒト上皮細胞を用いる生物学的ス クリーニング検定法に用い、Ｅ、　Ｄｅｊａｎａ　らが報告しているようにして （Ｂｌｏｏｄ、　６９巻、　６９５〜６９９頁、　１９８７年）、プロスタサイ クリン（ＰＣｌ３）および血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成の刺激についてこ れらのフラグメントを試験する。これらの試験によって、受容体活性をトリガー する＋１．−１受容体に対して抗自己特性を有する抗体フラグメントが同定され る。この活性は、ＩＬ−１αに対する標準の生物検定法を用いて、ヒトインター ロイキン−１αに対して定量することができる。なおこの生物検定法としては例 えば３Ｈ−チミジン取り込を利用する０１０５−、ルバーＴ細胞系の増殖法（Ｓ 、　Ｆ、０ｒｅｎｃｏｌｅおよびＣ，Ａ、　Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、　Ｃｙｔｏｋ ｉｎｅ、　１巻、１４〜２２頁、　１９８９年）またはＱ、　Ｊ、Ｇｅａｒｉｎ ｇらが報告している変換増殖検定法（Ｊ。 １＋ａ＋＊ｕｎｏ１．　ＭｅＬｈｏｄｓ＋　９９巻、　７−１１頁、　１９８７ 年）がある。 表１　２末九１日ｓｃＦ、ライブラリーカつ　されたクローンを′後ｃ」１１１ １１度 ＴＮＦ　α　（ヒト）　−１２２／１９２０　８３／１９２　９２／９６　−　 ７ＣＥＡ　（ヒト）　−０／９６　１／９６　２／９６　１ｒｓＣＤ４　（ヒト ）　−−−−８／９６　１上記の比率は選択の各ラウンドの後にクローンを捕捉 する頻度を示す。ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージが用いられるＣＥ＾、　ＭＵ ＣＩおよびｒｓｃＤ４の選択の場合を除いて、ファージミドは１１１３Ｄｇ　Ｉ ［Ｉヘルパーファージでレスキューした。 ＳＣＦ　フーグメン　のＶ゛　−王ユＬ支た、−生及糸ｐ振生および　、宣六然 、・異例程農 すべての重鎮生殖系遺伝子に対する参照記号はＴｏｍｌｉｎｓｏｎらの１９９２ 年の文献に記載されている。軽鎖の参照記号は、ＶＬ２．１　（Ｂｒｏｃｋｌｙ らの１９８９年の文献）　；　［ＧＬＶＩＳ２　（Ｂｅｒｎａｒｄらの１９９０ 年の文献）；ＩＧＬＶ３Ｓ１　（Ｆｒｉｐｐｉａｔらの１９９０年の文献）；　 Ｌ８　（Ｖｄ）およびＬ５　（Ｖｂ）（Ｐｅｃｈ　らの１９８４年の文献）　１ Ｌ１２　（Ｉ（Ｋ１０２）　（ＢｅｎｔｌｅｙおよびＲａｂｂｉｔｓの１９８０ 年の文献）　；　Ｂ３　（ＶＨＶ）　（Ｋｌｏｂｅｃｋらの１９８５年の文献） ；０２および０４　（Ｐａｒｇｅｎｔらの１９９１年の文献；　Ｌｌｌ　（Ｓｃ ｏｔｔらの１９９１年の文献）；Ｈｕ＋５ｌｖｌＬｌ　（Ｄａｌｅｙ　らの１９ ９２年の文献）である。 ａ）これらの遺伝子はＰＣＲ増幅中に二つの■遺伝子間の交差によって生成した ようである。それ故、組合わせ（ｍａ　ｔｃｈ）を二つの推定されている生殖系 セグメント：ＣＲすなわちフレームワーク、　ＣＤＲすなわち相補性決定領域を 用いて決定した。 Ｂｅｎｔｌｅｙ、　Ｄ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｒａｂｂｉｔｓ、　Ｔ、　Ｈ，（１９ ８０）　Ｎａｔｕｒｅ、　２８８．７３０−３、Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｆ、、Ｃｈｕ ｃｈａｎａ、ｐ、、Ｆｒ１ｐｐｉａｔ、Ｊ、Ｐ、ｔ　Ｂｕｌｕｗｅｌａ、Ｌ、ａ ｎｄＬｅｆｒａｎｃ＋　Ｍ、　Ｐ、　（１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ＋　１８＋　７１３９゜Ｂｒｏｃｋｌｙ＋　Ｆ、＋　八Ｉｅｘａｎｄ ｒｅ＋　Ｄ、、Ｃｈｕｃｈａｎａ＋　Ｐ、、Ｂｕｃｋ、Ｓ、、ＬＩＪｒａｎｃ。 Ｇ、　ａｎｄ　Ｌｅｆｒａｎｃ、　Ｍ、　Ｐ、　（１９８９）　Ｎｕｃ　ｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＋　１７＋　３９７６゜Ｆｒ１ｐｐｉａＬ、　Ｊ、　Ｐ、 ＋　Ｃｈｕｃｈａｎａ、　Ｐ、、　Ｂｅｒｎａｒｄ、　Ｆ、、　Ｂｕｌｕｗｅｌ ａ、　ＬＩＬｅｆｒａｎｃ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｌｅｆｒａｎｃ＋　Ｍ、　Ｐ、　 （１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＋１Ｂ、　７１３４゜ にＩｏｂｅｃｋ、　Ｈ，Ｇ、　Ｂｏｒｎｋａ＋ｓ＋ｇ、　Ｇ、　Ｉｆ、、　Ｃｏ ５ｂｒｉａＬｏ、　Ｇ、、　Ｍｏｃｉｋａｔ、　Ｒ，。 Ｐｏｈｌｅｎｚ、　Ｈ，Ｄ、　ａｎｄ　Ｚａｃｈａｕ、　Ｈ，Ｇ、　（１９８５ ）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＋１３、６５１５−２９゜ Ｐａｒｇｅｎｔ＋　Ｈ，、Ｍｅｉｎｄｌ、　ＬＩ　Ｔｈ１ｅｂｅ、　Ｒ−＋　Ｍ ｉｔｚｅｌ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｚａｃｈａｕ。 Ｉｌ、　Ｇ、　（１９９１）　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍ＋ｎｕｎｏｌ、　２１．１８２ １−７゜Ｐｅｃｔ＋、　Ｍ、、　Ｊａｅｎｉｃｈｅｎ、　Ｈ，Ｒ，、Ｐｏｈｌｅ ｎｚ＋　Ｈ，Ｄ、Ｎｅｕ＊ａｉｅｒ、　Ｐ、　Ｓ、。 ）［１ｏｂｅｃｋ、　Ｈ，Ｇ、　ａｎｄ　Ｚａｃｈａｕ、　（１９８４）　Ｊ　 Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、　１７６、１８９−２０４゜５ｃｏＬＬ＋　Ｍ、Ｇ、＋　Ｃ ｒ１ｍ＊ｉｎｓ、ｏ、Ｌ、、ＭｃＣｏｕｒｔ、Ｄ、Ｈ，、Ｃｈｕｎｇ＋　Ｇ、。 ５ｃｈａｂｌｅ、Ｋ、Ｆｌ　丁ｈｉｅｂｅ、Ｒ，、Ｑｕｅｎｚｅｌ、Ｅ、Ｍ、、 Ｚａｃｈａｕ＋　Ｈ，Ｇ。 ａｎｄ　Ｎａｈｗ、Ｍ、Ｈ，（１９９１）　Ｊ　Ｉｆ＊＋５ｕｎｏｌ、４７．　 ４００７−１３゜Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、１．Ｍ、Ｗａｉｔｅｒ、ｃ、ｌ　Ｍａｒ ｋｓ＋　Ｊ、ｎ、ｌ　Ｌｌｅｗｅｌｙｎ、Ｍ、８゜ａｎｄ　Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、 （１９９２）　Ｊ、門ｏｆ、Ｂｉｏｌ、＋　２２７＋　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ。 浄書（円台に変更なし） 抗原 浄書（内容に変更なし１ 抗原 抗原 浄ご（白で７にπ更ない 抗原 抗原 浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） 平成６年６月２１日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類の種の自己抗原である抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位 をもっている抗体または抗体フラグメントである特異的結合対のメンバー（ｓｂ ｐメンバー）を得る方法であって；ａ）複製可能な遺伝表示パッケージ（ｒｇｄ ｐ）のライブラリーを提供し、各ｒｇｄｐはその表面にｓｂｐメンバーを表示し 、そして各ｒｇｄｐは、哺乳類の前記種由来の配列を有する核酸を含有し、かつ そのｒｇｄｐの表面に表示されるｓｂｐメンバーの要素部分であるポリペプチド 連鎖をコードし；次いで ｂ）前記自己抗原との結合によって、前記自己抗原に対し結合特異性を有する一 つ以上のｓｂｐメンバーを選択する；ことからなる方法。
2. ２．ｒｇｄｐのライブラリーを提供する前記方法が、（ｉ）ｉｉ組換え宿主細胞 生物内で発現される際にｒｇｄｐがその表面で表示する、ｒｇｄｐの要素に融合 されたｓｂｐメンバーの第一ポリペプチド連鎖要素部分またはｒｇｄｐの要素に 融合されたｓｂｐメンバーの前記第一ポリペプチド連鎖要素部分の集団を、（ｉ ｉ）ｓｂｐメンバーの第二ポリペプチド連鎖要素部分またはこのような第二ポリ ペプチド連鎖要素部分の集団と結合させて、ｒｇｄｐの表面に表示されるｓｂｐ メンバーのライブラリーを形成させ； 前記第一もしくは第二のポリペプチド連鎖要素部分またはその集団の少なくとも 一つが、ｒｇｄｐの前記要素を使用してパッケージすることができる核酸によっ てコードされている；ことからなる請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ｒｇｄｐのライブラリーを提供する前記方法が、（ｉ）ｒｇｄｐの要素に融 合されたｓｂｐメンバーの第一ポリペプチド連鎖要素、またはｒｇｄｐの要素に 融合されたかような第一ポリペプチド連鎖要素部分の集団をコードする核酸を、 （ｉｉ）ｓｂｐメンバーの第二ポリペプチド連鎖要素部分またはその集団をコー ドする核酸と結合させて、核酸のライブラリーを形成させ、前記ライブラリーの 核酸はｒｇｄｐの前記要素を用いてパッケージすることができ；組換え宿主生物 内で、ｒｇｄｐの要素に融合された前記第一ポリペプチド連鎖要素部分もしくは その集団、およびｓｂｐメンバーの前記第二ポリペプチド連鎖要素部分もしくは その集団を発現させて、その表面にｓｂｐメンバーを表示し、かつその表面に表 示されるｓｂｐメンバーの第一と第二のポリペプチドの連鎖要素部分をコードす る核酸を有する各ｒｇｄｐのライブラリーを形成させる；ことからなる請求の範 囲第一項記載の方法。
4. ４．ｒｇｄｐの表面に表示される前記ｓｂｐメンバーが各々Ｖ■領域およびＶＬ 領域からなる抗体フラグメントである請求の範囲第１，２または３項に記載の方 法。
5. ５．前記第一と第二のポリペプチド連鎖要素部分の両方またはその集団が、ｒｇ ｄｐの前記要素を使用してパッケージすることができる核酸から発現される請求 の範囲第２項記載の方法。
6. ６．ｒｇｄｐの表面に表示される前記ｓｂｐメンバーが各々ｓｃＦｖ抗体フラグ メントである請求の範囲第１〜５項のいずれか一つに記載の方法。
7. ７．前記第二ポリペプチド連鎖要素部分またはその集団が、前記第一ポリペプチ ド連鎖要素部分またはその集団をコードする核酸とは別個の核酸によってコード されている請求の範囲第２または３項に記載の方法。
8. ８．ｒｇｄｐの表面に表示される前記ｓｂｐメンバーが各々Ｆａｂ抗体フラグメ ントである請求の範囲第１または７項に記載の方法。
9. ９．核酸が、未免疫化哺乳動物の再配列されたＶ遺伝子から誘導される請求の範 囲第１〜８項のいずれか一つに記載の方法。
10. １０．核酸が、Ｖ遺伝子の配列の人工的もしくは合成の組換えによって製造され るライブラリーから誘導される請求の範囲第１〜８項のいずれか一つに記載の方 法。
11. １１．ライブラリーが生殖系Ｖ遺伝子の配列から誘導される請求の範囲第１０項 記載の方法。
12. １２．哺乳動物の前記種がヒトである請求の範囲第１〜１１項のいずれか一つに 記載の方法。
13. １３．（ｂ）のステップで選択されたｒｇｄｐの表面に表示されるｓｂｐメンバ ーが選択もしくはスクリーニングされて、ｓｂｐメンバーを表示する個々のｒｇ ｄｐまたは前記ｒｇｄｐの混合集団を提供し；各ｒｇｄｐが、その表面で表示さ れるｓｂｐメンバーもしくはそのポリペプチド連鎖をコードする核酸を含有して いる請求の範囲第１〜１２項のいずれか一つに記載の方法。
14. １４．選択もしくはスクリーニングされたｓｂｐメンバーをコードし、かつ選択 もしくはスクリーニングされたｓｂｐメンバーをその表面に表示するｒｇｄｐか ら誘導される核酸を使用して、組換え宿主生物内に、ｓｂｐメンバーまたはその フラグメントもしくは誘導体を発現させる請求の範囲第１〜１３項のいずれか一 つに記載の方法。
15. １５．一つ以上のｒｇｄｐから核酸を採取し、これを用いて、個々のｓｂｐメン バーもしくはｓｂｐメンバーの混合集団またはそのためのインコーディング核酸 を得る別の方法に用いるインコーディング核酸を提供する請求の範囲第１４項記 載の方法。
16. １６．発現最終産物を改変してその誘導体を製造する請求の範囲第１４項または １５項に記載の方法。
17. １７．発現最終産物またはその誘導体を使用して治療用もしくは予防の医療また は診断用製品を製造する請求の範囲第１４，１５および１６項のいずれか一つに 記載の方法。
18. １８．ｒｇｄｐ中にパッケージすることが可能で、かつｒｇｄｐの表面で表示す る、抗体のポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸配列のライブラリーが含 まれているキットの、請求の範囲第１〜１７項のいずれか一つに記載の方法での 使用。
19. １９．抗体の少なくとも一つのポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸を含 有する各ｒｇｄｐのライブラリーが含まれているキットの、請求の範囲第１〜１ ７項のいずれか一つの記載の方法での使用。