JPH07502484A - 哺乳動物免疫不全ウイルスの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物免疫不全ウィルスの検出 この発明は、哺乳動物免疫不全ウィルスの検出方法に関し、とりわけ、そのよう なウィルスに対する抗体の検出のためのイムノアッセイに使用するのに適したペ プチドに関する。

背景技術および従来技術 １９８１年にヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が認識されて以来、その原 因ウィルス、以前はヒトＴ細胞リンパ趣向性ウィルスタイプ■（ｈｕｍａｎ　Ｔ −ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　ＩＩＩ）　（ ＨＴＬＶ−Ｉ［［）またはリンパ節障害関連ウィルス（ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐ ａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ）　（ＬＡＶ）として知られていた ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に対して鋭意研究がなされてきている。いまや 、ＨＩＶ特異的な抗体がＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連症候群の殆どの患者の血清 中のみならず該ウィルスに暴露された非症候性の個体の血清中にも存在すること がわかっている。

さらに最近では、ＨＩＶ−２として知られる変種ウィルスもＡＩＤＳを引き起こ し得ることがわかってきているｅＨＩＶウィルスによりコードされる種々のポリ ペプチドを利用したＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ法が、診断およびスクリー ニングに広範に用いられてきている。たいていの場合、これらポリペプチドはウ ィルス材料から直接調製するか、または組換えＤＮＡ技術を用いたインビ）・口 発現系から得られるものであるが、そのような材料は理想的ではない。ウィルス 調製物から得た材料は生存能力のあるウィルスによって汚染されているかもしれ ず、それゆえ、そのような材料を用いる人には危険が伴う。組換え由来の材料は 非ＨＩＶタンパク質で汚染されているかもしれず、その結果、特異性が失われる 可能性がある。

この問題を克服する試みにおいて、ＨＩＶのポリペプチドが化学的な合成手段を 用いて製造されている０種々のＨＩＶ抗原のペプチド断片が、ンエネティソク・ システムズ・コーポレーション（Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＳｙｓｔｅｍｓＣｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ）によるオーストラリア特許出願第５９７８８４　（５７７３３／８ ６）号、および米国特許第４７３５８９６号および第４８７９２１２号（ともに ユナ・ｒティラド・バイオメディカル（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　 Ｉｎｃ、）による）に開示されている。とりわけ、これら３つの明細書には、ｇ ｐ４１糖タンパク質の保存された免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）領 域、ＨＩＶ−１の主要なエンベロープタンパク質の領域が開示されている。ＨＩ Ｖ−２のｇｐ３６タンパク質の類似の領域も合成されている。これら領域（エン ベロープタンパク質の縁膜部分に対応する）は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の 優先的な診断を可能にし、非常に高い感度と特異性のアッセイを提供する。

レトロウィルス感染、とりわけ免疫不全疾患の関連するレトロウィルス感染に関 する研究は、免疫不全ウィルスが哺乳動物種の間に広く広がっていることを示し ている。たとえば、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ株）がマカーク、ギポン、お よびチンパンジーなどの種々の旧世界のサル種で見つかっている。同様のウィル スがウシ科の動物（ウシ免疫不全ウィルス、ＢＩＶ）およびネコ科の動物（ネコ 免疫不全ウィルス、ＦＩＶ）に感染することもわかっている。ＦＩＶは家庭のネ コから最初に単離されたレトロウィルスであり、ＨＩＶ−１と同じグループに属 することが示されている（ベダーゾン（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ、　Ｎ、　Ｃ，）ら： ５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３５　７９０）。このウィルスは、試験したすべ ての国の家庭のネコで見つかっており、ＡＩＤＳ患者で認められているのと類似 の健康状態と関係している；しかしながら、認められる感染は、家庭のネコで通 常みられるもののみである。クリプトコツカス症などの真菌感染はとりわけ共通 しており、症候処置によく対応している。

ＦＩＶはＨＩＶを有するヒトにみられるような破局的な感染には至らないが、ま た該ウィルスはその発見までに少なくとも２０年間ネコ集団中に存在したと思わ れるが、感染は非常に広範囲にわたっており、有意の苦痛および苦悩を引き起こ す。池の長期間での意味合いがあるのかもしれない。

たとえば、ＦＩＶ抗体は、動物園の集団および自由に分布する動物の両方におい て、ライオン、ジャガー、ヒョウおよびピューマなどの大きなネコ科の動物に広 く分布することが最近わかってきた（バー（Ｂａｒｒ　Ｍ、　Ｃ，）　、カル（ Ｃａｌｌｅ　Ｐ、Ｒ，）ら；　Ｊ、Ｚｏｏ　ａｔｕｊ　Ｖ／１ｌｄｌｉｆｅ　Ｍ ｅｄ、　（１９８９）　２０２８５；サビン（Ｓ　ａｂｉｎｅ　Ｍ、　）および ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ　Ｃ，）　；Ｔｏｄａｙ’ｓ　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎ ｃｅ、１９９１　３　３４）、サビンおよびウォーカーによるオーストラリアの 研究では動物園の動物と家庭のネコとの接触を排除することはできないが、バー およびカルらによる研究における合衆国の動物園のネコ科の動物は家庭のネコお よび他の感染した外国産のネコのいずれとも接触をもっていなかった。家庭のネ コにおけるＦＩＶ感染の明示とは対照的に、大きなネコ科の動物では該ウィルス と臨床的疾患との間にいかなる相関関係をも示さなかった。多くの大きなネコ科 の動物種が滅亡の危機に瀕しているという事実を考慮するとき、野性集団の健康 および成有効率に対してＦＩＶ感染が有意の影響を及ぼしているか否かを決定す ることは非常に重要である。

ＦＩＶは抗原の面ではＨＩ　Ｖと関係しないが、またＦＩＶタンパク質はＩ］Ｉ Ｖのタンパク質とは類似していないが、ＨＩＶアッセイの開発の過程で得られた 経験によりＦＩＶアッセイの開発も迅速になることが可能となった。

ｐ２６抗原を利用したＦＩＶのためのＥＬＩＳＡ試験キットが市販されている（ ”ペットチェック（Ｐｅｔ　Ｃｈｅｋ）”　、イデックス・コーポレーション（ ｌ　ｄｅｘｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　）　、　ＨＩ　Ｖ＠染の場合のよ・ うに、ＦＩＶの感染には、宿生体内でのウィルスの持続的な存在とともに抗体の 産生が続くことがわかっている。しかしながら、この試験を用いると、ヒトにお いてＨＩＶウィルスの類似の試験で認められるものに比べて偽陰性が一層頻繁に 起こることがわかった。

家庭のネコにおいてＦｌ〜ｒは、ヒトにおけるＨＩＶと同様の仕方でＴ細胞に影 響を与える。この理由から、ＦＩＶは、たとえばワクチンや治療剤の試験におい てＡＩＤＳの実験モデルとして提唱されている。ＦＩＶの迅速で正確な診断がそ のような目的には必須である。

ＦＩＶの４つの株についてヌクレオチド配列が報告されている。これら公知の単 離物において一つの配列が保存されているが、いずれかの末端において変異が存 在する。ＦＩＶペタルア　（Ｐ　ｅｔａｌｕｍａ）およびＦＩＶ−ＰＰＲと呼ば れる合衆国由来の２つの株が以下の文献に記載されている：オルムステッド（Ｏ ｌｉｓｔｅｄ、　Ｒ，Ａ、　）　、バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ、　Ａ、　Ｋ、）　 、ヤマモト（Ｙａｍａｏ＋ｏｔｏ、　Ｊ　、　Ｋ、　）　、ヒルシュ（Ｈｉｒｓ ｃｈ、　Ｖ、　Ｍ、　）　、バーセル（Ｐｕｒｃｅｌｌ。

Ｒ，Ｈ，）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｐ、Ｒ，）　（１９８８）　ネ コ免疫不全ウィルスのモレキュラークローニング、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６・２４４８−２４５２；オルムステッド、ヒルシュ、 バーセルおよびジョンソン（１９８９）ネコ免疫不全ウィルスのヌクレオチド配 列分析ニゲツム組成および他のレンチウィルスとの関係、Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａ ｔｌ、　Ａ　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　ＩＪ　Ｓへ８６　：　８０８８−８０９２ 　；タルポット（Ｔａｌｂｏｔｔ、　Ｒ，Ｌ、　）　、スバーガー（Ｓｐａｒｇ ｅｒ、　Ｅ、　Ｅ、）　、ラプラス（Ｌｏｖｅｌａｃｅ、　Ｋ、　Ｍ、　）　、 フ４−／チュ（Ｐ　１ｔｃｈ、　Ｗ、　Ｍ、　）　、ビータ−セン（Ｐｅｔｅｒ ｓｅｎ、　Ｎ、　Ｃ，）　、ルシウ（Ｌ　ｕｃｉｗ、　Ｐ　。

Ａ、）およびエルグ−（Ｅｌｄｅｒ、　Ｊ、Ｈ，）　（１９８９）　、ネコ免疫 不全ウィルスのヌクレオチド配列およびゲノム組成、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ８６　：　５７４３−５７４７、まｆニーＦ ＩＶ　ＴＭｌおＩＪＪＦＩＶ　ＴＭ２と呼ばれる日本由来の２つの株は、マキ（ Ｍａｋｉ、　Ｎ、　）、ミャザワ（Ｍｉｙａｚａｖａ、　Ｔ、　）、フカサワ（ Ｆｕｋａｓａｗａ、　Ｔ、　）　、フカサワ（Ｆ　ｕｋａｓａｗａ、　Ｍ、　） 　、ハセガワ（Ｈａｓｅｇａｗａ、　Ａ、　）　、ハヤミ（Ｈａｙａｍｉ、　Ｍ 、　）　、ミキ（Ｍｉｋｉ、　Ｋ、　）およびミカミ　（Ｍｉｋａｍｉ、Ｔ、） 　（１９９２）　Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、１２３　：　２９−４５、ネコ免疫不 全ウィルス単離物の分子的特徴付１プおよび不均一性、に記載されている。

これら単離物のｅｎｖタンパク質は、縁膜領域に下記配列を有する二アミノ酸番 号　配列　単離物 ＋　６７８−７０８１　ＫＶＥＡＫＥＫＦ　ＬＹＴＡＦＪＩＪ４ＱＥＩ、ＧＣＮ ＱＮＱＦ　ＦＣＥ　Ｘ　ＰＫＥ　Ｐ　ＰＲ＋６８０−７１１１　にＶ丁ソリ（１ ！ＦＪＬＹＴ入ＦＡＭＱＥＬＧＣＮＱＮＱＦＦＣＫ工ＰＬＥ　Ｐｅヒａ１ｕｒｎ ａ（６７９−７１０）　ＫＹＩｌａλ工ＥＫＦＬＹＴ八ＦＡＭＱへＬＧＣＮＱＮ ＱＦＦＣＦＪＰＰＳ　ｌｒＭＩ＋７７９−７１０）　Ｒ■込工ＥＫＦＩ、ＹＴ灯 甜ＱＥＩ、ＧＣＮＱＩＪＱＦＦＣＫＩＰＰＳ　笥２ウシ免疫不全ウィルス（ＢＩ Ｖ）は、ＡＩＤＳを引き起こすＨＩＶに近縁であり、ＨＩ　ＶおよびＦＩＶと同 様、レンチウィルス群の成員である（ガーベイ（Ｇａｒｖｅｙ、　Ｋ、　Ｊ　、 　）ら；　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９９０）エヱ５　３９１−４０９）。それは 、抗原的にＨＴＶと交差反応し、培養ヒト細胞に感染することができる。レンチ ウィルスは、乳を介して吸乳動物に容易に伝播する。ごく最近にＢＩＶは化学的 に特徴付けがなされ、それゆえ、同定および単離が可能となった。ウシの群れに おける慢性的な疾患との関連性についての研究が米国において進行中である（ウ ェットストーン（Ｗｈｅｔｓｔｏｎｅ、　Ｃ，Δ、）ら；Ａｒｃｈ。

Ｖｉｒｏｌ、　１９９１　（印刷中））。

ＢＩＶは白血球の比率の大きな増大を引き起こし、このためウシ白血病ウィルス （ＢＬＶ）により引き起こされる癌と間違えられることがある。ＢＩＶは、ファ ンデルマーテン（ＶａｎＤｅｒＭａａｔｅｎ）らがウシビスナウィルスと名付け たウィルスをウソにおいて発見した（ファンデルマーテンら；Ｊ　ｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　１　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ １９７２）　４旦１６４９−１６５７）１９７２年に最初に発見された。該ウィ ルスが培養中のヒト細胞に感染すること（ンヨーンアド（Ｇ　ｅｏｒｇｉａｄｅ ｓ、　Ｊ　、　Ａ、　）ら；Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　（１９７８）　３旦３７５−３８１）、該ウィルスが旧Ｖと抗原 的に交差反応すること（アンポルスキー（Ａ　ｍｂｏｒｓｋｉ、　Ｇ　、　Ｆ　 、　）ら。

Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８９）　２０　２４ ７−２５３）　、および該ウィルスがビスナよりもＨ３Ｎ２に系統発生論的に近 いこと（ゴング（Ｇ　ｏｎｄａ。

発見された後、その名前はウシ免疫不全ウィルスと変えられた。

ＨＩＶの存在は、真菌感染、微生物感染およびウィルス感染、並びに免疫系によ り通常制御されている癌の影響を悪化させるので、ＢＩＶは慢性疾患およびウシ の幾つかの癌において同様の影響を有するように思われる。米国農務省により出 版されたばかりの論文において、“成育の悪い（ｐｏｏｒ　ｄｏｅｒｓ）”一つ のウシ集団において７８頭のうち３４頭がＢＩＶに対する抗体を有することがわ かり、南部米国の８つの州からの１９９７頭の主として乳牛の調査において４％ ＢＩＶの罹患率が決定された（ウェットストーンら；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ　（１９９０）　６４３５５７　３５６１）。

他の種におけるレンチウィルスの場合のように、ＢＩＶの経済効果は間接的であ ろうし、他の微生物が関与しているかもしれないと考えるのは妥当な推測である 。ＨＩＶとの関連に基づき、ＢＩＶの存在を示す明らかな条件は慢性的な悪い成 長、慢性的な下痢、癌の経歴のあるウシ集団、重篤なヨーネ病、持続的なマイコ プラズマ感染、およびパリのウシにおけるイエンブラナ病（Ｊ　ｅｍｂｒａｎａ 　ｄｉｓｅａｓｅ）である。ＢＩＶの罹患率が決定され疾患との関連性が確定さ れるまでは、ＢＩＶを拡散させることの経済効果、またはＢＩＶを除去すること の実行可能性および費用を推定することは不可能である。

効率的な試験および人工的な飼育により、ヤギおよびヒツジの群れから関節炎脳 炎ウィルスを比較的低コストで除去することは比較的に簡単であった。

ＢＩＶの他の可能な経済効果は、とりわけウシ海綿様脳症（ＢＳＥ）（狂牛病（ ｍａｄ　ｃｏｗ　ｄｉｓｅａｓｅ）　）がイギリスの生産業に打撃を与えたヨー ロッパにおいて、遅発性ウィルス（ｓｌｏｗ　ｖｉｒｕｓ）に対する公衆の恐怖 である。ＡＩＤＳウィルスに関連するレンチウィルスが乳を介して伝播し得ると いう事実が知られたなら、ウシ集団がＢＩＶフリーであると言明されることに対 する公衆の強い要求が現れるであろうと思われる。単に“ＢＩＶが存在しないこ とおよびおそらくヒトには有害な影響はないであろうこと”を宣言するだけでは 、もはや産業にとって充分ではないであろう。英国ではＢＳＥの拡散の制御に失 敗したがために２０，０００頭以上のウシが屠殺されている。

それゆえ、ウソ集団の大スケールのスクリーニングに使用するのに適した、ウシ におけるＢＩＶに対する抗体の検出のための迅速で経済的な試験に対して緊急の 必要性が存在する。このタイプの試験キットは、ＢＩＶが根源的な原因かどうか を調べるために慢性的な不健康の発生率の高いウシ集団をスクリーニングするう えで特に有用であり、また、これまでＢＩＶフリーであったウシ集団の地理的領 域または国にＢＩＶが輸入されることを防ぐために動物をスクリーニングするう えで有用である。

ＢＩＶおよびＦＩＶの両方のための現在利用できる試験系では、全ウィルスに由 来するかまたは組換え由来タンパク質に由来するポリペプチド物質、またはその ようなポリペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体を利用している。

たとえば、イデックス・コーポレーションによる国際特許出願第Ｗ０９０／１３ ５７号および第Ｗ０９０１０６５１０号（その全開示が参照のため本明細書中に 引用される）を参照。それゆえ、費用を削減し人に対する危険を回避するため、 合成ペプチド抗原を利用した迅速で便利で経済的なアッセイに対する緊急の必要 性が存在する。血液試料の不必要な操作（それ自体、該物質を操作する人に危険 を与え得る）を回避するため、全血試料で行うことのできるアッセイが特に有利 である。そのようなアッセイは、アジエン・リミッティッド（Ａｇｅｎ　ｌ、１ ｍ１ｔｅｄ）による我々の以前のオーストラリア特許出願第２２２２４／８８号 および第２４１８２／８８号に記載されており、ＳｉｍｐｌｉＲＥＤの名称で市 場に出されている。

我々は、いまや、哺乳動物免疫不全ウィルスのエンベロープタンパク質の縁膜部 分の高度に保存された領域中の免疫優性領域を同定することができることを予期 せず見いだした。この配列は、通常のポリペプチド合成法を用いて合成すること ができ、該ウィルスに向けられた抗体を検出するためのイムノアッセイにおいて 用いることができる。この知見は、これらタンパク質における差異が知られてい ることおよび異なる種からの免疫不全ウィルスの抗原性における差異が知られて いることを考慮すると驚（べきことである。

発明の簡単な記載 大発明の一つの態様によれば１．哺乳動物免疫不全ウィルスのエンベロープタン パク質の免疫優性領域のジスルフィドループペプチドが提供される。

好ましくは、このペプチドは、有蹄動物かまたはネコ科動物のいずれかに感染す る免疫不全ウィルスに由来する。この明細書の目的のためには、“有蹄動物”は 、ウングラータ（Ｕｎｇｕｌ、ａｔａ）科の全部、たとえばウシ、バッファロー 、スイギュウおよびヤクを含むウシ科動物；ヒツジ：ヤギ；ウマ；ラフダニトナ カイ、アカシカ、ダマシカおよびノロを含むシカ；アンチローブ；ラマ、アルパ カ：ビクーニャ；およびグアナコを包含するものである。“ネコ科動物”なる語 は、家庭のネコ、ライオン、トラ、ジャガー、ヒョウ、ピューマ、オセロットな どを含むネコ目の全成員を包含するものと理解されるべきである。

免疫不全ウィルスがＦＩＶの場合、該ペプチドは、下記ｘＶＥＡＭＥＫＦＬＹＴ ＡＰＡＭＱＥＬＧＣＮＯＮＱＦＦＣＫ工ＰＬＥのようにＦＩＶペタルマ株のｅｎ ｖ　ｇｐ４０タンパク質のアミノ酸６８０〜７１１、または該配列内の８または それ以上、好ましくは１０〜２０、さらに好ましくは２０〜２５、最も好ましく は２５〜３５アミノ酸の配列からなるのが好ましい。

免疫不全ウィルスがＢＩＶの場合、該ペプチドは、下記・のようにｅｎｖ　ｇｐ ４２タンパク質のアミノ酸６２５＝−６６０、または該配列内の８またはそれ以 上、好ましくは１０〜２０．さらに好ましくは２０〜２５、最も好ましくは２５ 〜３５アミノ酸からなるのが好ましい。

ＦＩＶおよびＢＴＶの両方に対して、対応する領域を包含する他の単離物を用い ることもできる。

上記配列は、表１に示すように、１文字のアミノ酸コードで表しである。

表１ アミノ酸　１文字略号 アスパラギン酸　Ｄ 本発明によるペプチドは、ＢＩＶやＦＩＶなどの適当なウィルスの配列に由来す る対応ＤＮＡ配列を利用した組換えＤＮＡ法を用いて合成することもできるが、 通常の固相ペプチド合成法を用いて化学的に合成するのが好ましい。

本発明の第二の側面に従い、哺乳動物免疫不全ウィルスのエンベロープタンパク 質の免疫優性領域のジスルフィドループペプチドに対して向けられたポリクロー ナルまたはモノクローナル抗体が提供される。そのような抗体は、当該技術分野 てよく知られた種々の通常の方法により調製することができる。

使用できる抗体としては、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、またはＦ （ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、またはＶＨ７ラグメントを含む免疫 学的に機能を有するそのフラグメントが挙げられる。フラグメントは、通常の方 法または組換えＤＮＡ法により調製することができる。

本発明の第三の側面に従い、上記ペプチドを包含する試薬を使用する工程からな る、該ウィルスに暴露された哺乳動物からの生物学的試料中の哺乳動物免疫不全 ウィルスに対する抗体を検出するためのイムノアッセイが提供される。好ましく は、該イムノアッセイは試験キットの形態で提供される。

そのようなアッセイには、たとえば、ＥＬＩＳＡ、粒子凝集アッセイ、自己赤血 球凝集アッセイ、他の凝集アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光イムノ アッセイが含まれる。本発明の特に好ましい態様において、該アッセイは、オー ストラリア特許出願第２２２２４／８８号および第２４１８２／８８号（その全 開示が参照のため本明細書中に引用される）に記載されているように、直接また は間接の全血凝集アッセイである。

本発明の第四の側面に従い、上記ペプチドに対して向けられた抗体からなる、哺 乳動物免疫不全ウィルスのための免疫吸着体が提供される。

本発明はＦＩＶおよびＢＩＶに言及して特に記載しであるが、本発明はその範囲 内に他の哺乳動物免疫不全ウィルスのｅｎｖタンパク質の縁膜部分の対応免疫優 性領域を包含することが明らかに理解されるであろう。

さらに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と同様に、Ｆ、Ｉ　Ｖ、ＢＩＶまたは他の 哺乳動物免疫不全ウィルスのサブタイプのペプチドも本発明は包含することが理 解されるであろう。

さらに、上記で言及した特定のペプチドは、特定された配列を含む約３５のアミ ノ酸からなるが、適当な抗体により認識されるコンフォメーションが保存される 限り、本発明のペブグ′ドが類似体または該配列中に列挙されたアミノ酸の保存 的な置換体を包含することは理解されるべきである。また、該配列は、上記配列 のいずれの末端に対してもアミノ酸がさらに付加することによって伸長すること ができること（とりわけ、適当なｅｎｖタンパク質の公知の配列に由来する伸長 ）、または該配列はいずれかの末端からアミノ酸を欠失させる二とにより修飾す ることができることが理解されるべきである。

発明の詳細な記載 つぎに、本発明を下記非限定的実施例のみを参照し、また添付の図面を参照して 記載する。

添付の図面中、図１は合成Ｆ’ＴＶペプチド抗原およびＦＩＶ陽性の抗血清を用 いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。

実施例１　ペプチドの合盛 Ｂｏｃ−アミノ酸を用いたアブライドバイオンステムズ自動化ペプチド合成機を 用い（ケンブ（Ｋｅｍｐ、　Ｂ、　Ｅ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２ ４１　１３５２−１．３５４）、固相合成のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄ）法を用いて上記ＦＩＶ　（６８０−７１１１）およびＢ　ＩＶ　（６２５ −６６０）を合成した。

当業者によく知られているように、たとえばＦ　ｍｏｃや他の保護アミノ酸誘導 体を用いる方法などの別の化学的方法を用いることもできる。

４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用い、ペプチドをカルボキン末端アミン として調製した。このペプチドを固相樹脂から開裂させ、同時に無水フッ化水素 で処理して脱保護した。遊離になったペプチドを、そのアミノ酸組成に応じてカ チオンまたはアニオン交換クロマトグラフィーのいずれかにより、ついて０１％ トリフルオロ酢酸かまたはＱ、１Ｍ重炭酸アンモニウムのいずれかの中での逆相 クロマトグラフィーにより精製した（ケンブおよびピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ　 Ｒ，Ｂ、）　；タンパク質リン酸化（ハンター（Ｔ。

Ｈｕｎｔｅｒ）およびセフトン（Ｂ、Ｍ、　５ｅｆｔｏｎ）　）中の“プロティ ンキナーゼのためのペプチド基質の設計および使用”、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｔｏｇｙ％　１９９１λ旦旦１２１−１３４）。

この手順に従って合成したペプチドは、それぞれＦＩＶおよびＢＩＶに対する抗 体に対して高度に反応性であり、自己赤血球凝集、粒子凝集、エンザイム・イム ノアッセイおよびラジオイムノアッセイを含む種々のイムノアッセイに用いるこ とができる。

これら配列を有するペプチドは、内部のジスルフィド結合を含んでいる。これら ペプチドは、酸化形または還元形のいずれか、または結合基または保護基ととも に用いることができる。たとえば、これらペプチドは、担体分子と結合させるこ とができる。

ＢＩＶ　ｐ２６抗原からのペプチドは、比較目的のために同様の方法を用いて合 成し、ＦＩＶについで以前に行われたように（ＷＯ９０／１３５７参照）エピト ープの存在についてスクリーニングする。

炭酸緩衝液中または３０％酢酸中の０．２５〜１ｇのペプチドでマイクロタイタ ープレートのウェルをコーティングした。試験血清をウェル中で１１００の希釈 にてインキュベートシた。第二の試薬はプロティンへ−西洋ワサビペルオキシダ ーゼであった。反応液をＡＢＴＳで２０分間展開し、マイクロタイタープレート リーダーで４０５ｎｍにて読み取った。結果を以下のようにして定義した ”陽性”結果は０．３より大きい光学密度を有していた。

“近接した（ｃｌｏｓｅ）”結果は０２と０．５の間の光学密度を有していた。

“強い”結果は１０と３０の間の光学密度を有していた。

感染したネコからの力価は通常８００〜１６００であったが、６４００までの範 囲であった。

粗製のペプチド抗原を用いて得られた結果を図１にまとめて示す。１μｇのペプ チドおよび１１００の血清希釈を標準として選択して通常のスクリーニングに使 用した。

西オーストラリアで単離したウィルスの試料で皮下注射することにより、８匹の 子猫をＦＩＶで実験的に感染させ、接種後にＥＬＩＳＡを用いて試験した。

２週間ですべての子猫は血清陰性であったが、４週間後には血清陽性であった。

力価は６週間後にピークに達し、４００〜６４００の範囲であった。

実施例３　ＦＩＶ　ｐ２６タンパク質についてのＥＬＩＳＡアッセイとの比較３ ６アミノ酸のペプチドを用いたＥＬＩ　ＳＡを、ＦＩＶ　ｐ２６抗原に基づく市 販のＥＬＩＳＡ（“Ｐｅｔ　Ｃｈｅｋ”　：イデソクス・コーポレーション）と 比較した。この比較は、表２にまとめたように、幾つかの不一致の結果を示した 。

表２ ３６アミノ酸のペプチド　“Ｐｅｔ　ＣＨＥＫ”［ＦＩＶ　（６８０−７１１） ］ 上記１６の不一致の結果のうち１４は、一方または両方の試験に基づいてカット オフ値に近いものであった。これら結果は、優れた感度（Ｐｅｔ　Ｃｈｅｋアッ セイでは示されなかった陽性反応を検出することができたという点で）および優 れた特異性（Ｐｅｔ　Ｃｈｅｋアッセイは偽陽性の結果を示したと思われる点で ）のオーストラリア特許出願第２２２２４／８８号および第２４１８２／８８号 に記載されているように、またウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｋ、　Ｍ、　）ら 、Ｊ。

Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９９１　１旦旦１１９−１２８にも 記載されているように（その全開示を参照のため本明細書中に引用する）、ネコ 血液試料を全血凝集アッセイを用いても試験した。本発明の合成ＦＩＶペプチド およびネコ赤血球細胞に対して向けられた抗体を用いることにより、この方法を ＦＩＶおよびネコ血液と使用するのに適合させた。この抗体は、通常の方法を用 いて免疫することにより調製した。

ＦＩＶのための全血凝集アッセイ試験キット成分・ １　抗赤血球抗体・　Ｈ７４，５３，４Ｃ１／１８０吸光係数１．０ ２　抗ペプチド抗体 ａ）アフィニティーカラムおよび西洋ワサビペルオキソダーゼ標識・Ｋ２Ｏ，８ ３，４Ｄ４／４−９１　１ｇＧ１、吸光係数１．６５ｂ）陽性コントロール・Ｋ ２１．８３．１Ｂ５／２５　１ｇＭ３、ＦＩＶペプチド ＫＶＥＡＭＥＫＦＬＹＴＡＦＡＭＱ Ｅ　Ｌ　Ｇ　ＣＮ　Ｑ　Ｎ　Ｑ　Ｆ　Ｆ　ＣＫ　Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｅ　−ＮＨ。

ＦＩＶ　６８０−７１１　（ｇｐ４０）の主要なコートタンパク質の免疫優性領 域に対応 （ａ）赤血球結合分子Ｈ７４，５３，４Ｃ１／１８０の調製ネコ赤血球細胞に対 して向けられた抗体を、通常の免疫およびスクリーニング手順を用いて調製した 。マウスをネコ赤血球細胞で免疫し、免疫した動物の牌臓細胞をマウスミエロー マ細胞と融合することによりモノクローナル抗体を製造した。これら抗体をスピ ン凝集アッセイによりスクリーニングした。スピン凝集は、ファイアット（Ｗｙ ａｔｔ）とストリート（Ｓ　ｔｒｅｅｔ）の方法（ＡｕｓｔＪ　Ｍｅｃｌ　Ｌａ ｂ　５ｃｉＳ４　４８　５０）の変法により行った。５０μＩの細胞培養上澄み 液を５０μｌの１％赤血球細胞懸濁液とマイクロタイタープレート中で混合した 。この実施例では、グリコホリンには結合したが凝集はしなかった抗体を選択し た。３８４のウェルのうち、５０の主要なりローンを選択した。

その後に吸光研究を行い（５０のネコ全血試料）、モノクローナル抗体Ｈ７４゜ ５３．４ＣＩ／１８０　（４Ｃ１／１８０）を選択した。

完全な抗体をＰｒｏｓｅｐ　Ａ製造法により精製した。精製したモノクローナル 抗体４Ｃ１／１８０を１％Ｗ／Ｗペプシンで３７℃にて４０分間消化した。この 抗体を１／１０　１２％酢酸でｐＨ３，５まで酸性にした。３．５Ｍ）リス緩衝 液（ｐＨ８，０）を添加してｐＨを８まで上げることにより反応を停止させ、Ｆ （ａｂ）ｚフラグメントを５２００ゲル濾過クロマトグラフイーにより精製した 。

Ｆ（ａｂ）２フラグメントを最終濃度が１０ｍＭのメルカプトエチルアミンとと もに３７℃にて３０分間インキュベートして還元した。部分的に還元したＦａｂ フラグメントを、１０ｍｇ／ｍｌのＤＴＮＢとともに室温にて３０分間反応させ 、ついで最終濃度が３０ｍＭのヨードアセトアミドを室温にて３０分間添加する ことにより安定化した。ついで、得られたＦ　ａ　ｂ−ＴＮＢ−Ａｃフラグメン トをウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。

（ｂ）ＦＩＶペプチドの調製 ＦＩＶ　６８０−７１１　（ｇｐ４０）（上記配列）の主要なコートタンパク質 の免疫優性領域に対応するペプチドを、０．５Ｍジチオトレイトールで室温にて ３０分分間光した。１０ｍＭＨＣ］を添加して反応を停止させた。この混合物を 、１０ｍ１の４０　：　６０　アセトニトリル　ＨＣＩ溶液で処理した５ｅｐ− ｐａｋ　Ｃ１８カートリツジ（ミリボア・ウォーターズ）に適用した。還元した ペプチドをＳ　ｅｐ−ｐａｋに３回循環させ、２０ｍ１の１０ｍＭＨＣＬで洗浄 し、ついで５ｍｌの４０６０アセトニトリル：ＨＣＩで溶出した。ついで、還元 したペプチドを一夜、凍結乾燥した。

（ｃ）ペプチドと抗体の結合およびＦＩＶ試薬の精製：上記ピのペプチドを６Ｍ グアニジノーＨＣＬ中に溶解し、上記（ａ）からの４ＣＩ／１８０　Ｆａｂ−Ｔ ＮＢ−Ａｃｆｉ＆物と０．５　（１，０）：　１．０ペプチド：抗体のモル比に て室温にて１分間混合した。最終濃度が３０ｍＭのヨードアセトアミドを室温に て３０分間添加することにより反応を停止させた。

クルトロゲルＡｃＡ４４ゲル瀘過カラム上で最初の精製を行って遊離のペプチド を除き、ついで抗ペプチド抗体カラム（Ｋ２Ｏ，８３゜４Ｄ４／４−９１）上で アフィニティー精製を行って遊離の４ＣＩ／１８０抗体を除いた。ついで、クル トロゲルＡｃＡ４４ゲル濾過カラム上で最終精製を行った。

（ｄ）ＦＩＶ試薬の調合およびアッセイ手順ニリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，４； 　１０μｇ／ｍ１（７）２−ＮＢＡ、０．５％ｉ：べ、および０．５ｍｇ／ｍｌ の３Ａ１／４８　Ｆａｂ−Ａｃダブ０フカー抗中でＦＩＶ試薬を１５μｇ／ｍｌ に調合した。

アッセイのため、凝固阻止処理した血液をプラスチックスライド上に置き、２５ μｌのＦＩＶ試薬を加え、混合した。スライドを２分間振動させ、凝集を読み取 った。表３および表４は、それぞれＦＩＶ陽性試料およびＦＩＶ陰性試料を試験 した結果を示す。

表３ 陽性試料を試験した結果の要約： 試料　陽性の数　感度（％と ＦＩＶ陰性試料を試験した結果： 試料　陰性の数　特異性（％） 西オーストラリア感染前　２４／２４　１００％チャッツウッド獣医外科　１８ ／１８　１００％血漿 陰性血漿　９１／９１　１００％ 試験した全試料　１８０／１８２　９８．９％＊これら試料のうちの一つは最初 の収集では陽性であると確認されたが、その後のサンプリングでは陰性であった 。

実施例５　ＦＩＶの合成ペプチド（６２０−７１１）を用いたＥＬＩＳＡアッセ イの感度および特異性 ＦＩＶの合成ペプチド（６８０−７１１）を用い、ＥＬＩＳＡアッセイの感度お よび特異性を評価するためさらに研究を行った。マイクロタイタープレートのウ ェルを炭酸緩衝液中または３０％酢酸中の１μｇのペプチドでコーティングした 。試験血清をウェル中で１　：　１００の希釈にてインキュベートした。

第二の試薬はプロティンＡ−西洋ワサビペルオキソダーゼであった。２，２°ー アジノジー（３−エチルベンズチアゾリン）スルホン酸（シグマ）で２０分間反 応を展開し、マイクロタイタープレートリーダーで４２０ｎｍにて読み取った。

９１の陽性試料および９１の陰性試料を試験した結果を表５に示す。結果は以下 に定義する通りであった “陰性”結果は０　５未満の光学密度を有していた。

“近接した”結果は０．５と１，５の間の光学密度を有していた；“陽性”結果 は１　５を越える光学密度を有していた。

Ａ　４２０ｎｍで読み取った吸光度 ＊これらの血漿のいずれもＦＩＶ試薬とは陽性の凝集を示さなかった（実施例４ 参照）。

＊＊一つの試料は２週間の実験的感染からのものであり、他の３つの試料は陰性 であることが確認された。

実施例７ＢＴＶペプチド ＥＬＩＳＡアッセイおよび全血凝集アッセイの両方を用い、上記ＦＩＶについて 記載したようにしてＢＩＶ　ｇｐ４２ペプチドを試験しＢＩＶ　ｐ２６抗原と比 較した。

ＢＩＶタンパク質ｐ２５を比較のための試験抗原として選択した。というのは、 実験的な感染においては、それがウェスタンブロッティングによって検出される 主要な抗原であり、自然の感染においてはｐ２６に対する抗体が全ての自然に感 染したウシに存在するからである（ウェットストーンら；　Ｊ　ｏｕｒｎａｌｏ ｆ　ＶｉｒｏｌｏｇＹ　（１９９０）６４　３５５７−３５６１）。

自然に感染したウシおよび実験的に感染させたウシの両方からの血清を試験した 。

全血凝集アッセイについては、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて最も有用であると同 定されたペプチドをウシ赤血球に結合するモノクローナル抗体に結合させる。

発明の利点 本発明によるペプチドは、全ウィルスまたはウィルス溶解液のいずれを用いる必 要もなく化学的に合成または組換えタンパク質発現により製造される。ペプチド の使用は、ウィルス溶解液または不純なタンパク質調製物の使用に比べ、汚染タ ンパク質のため、または検出には必要でないウィルスタンパク質の本質的でない 領域の存在により引き起こされる非特異的な交差反応性のための偽陽性の結果を 回避する。本発明の好ましい態様のペプチドは合成的に調製されるので、品質を 制御することができ、それゆえ試験結果の再生性が保証される。

この発明のペプチドはまた、強い体液性免疫反応および細胞性免疫反応を引き起 こすことがわかった。たとえば、ヒツジを繰り返し免疫すると１　：　５０００ ０の力価で免疫血清が誘発された。それゆえ、本発明のペプチドは免疫吸着体と して有用であることが期待される。

本発明は、一般的概念であって、本明細書の前記具体的記載に限定されないこと は明らかに理解されるであろう。

ＬＬ＋１４５Ｏｔ７　’Ｇ″Ｏ ＋ｍａｒ＋　ｖｍ　Ａ帥−＃Ｉｌ＃ＩＴＩＥ、　ＰｅＴＩＡＩＪ　曽υ泣ｔ＠６ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／Ａ６１Ｋ　３９／３９ ５　Ｄ　９２８４−４Ｃ３９２８４−４Ｃ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、　ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　ヒルヤード、カーメル・シュディスオーストラリア国４０６４ クイーンズランド、パブイントン、ガリバー・ストリート２１番（７２）発明者 　リラット、デニス・プライアンオーストラリア国４１１４クィーンズランド、 ウッドリッジ、ホープ・ストリート３番（７２）発明者　バンドセン、ピータ− ・グレゴリ−オーストラリア国４０６９クイーンズランド、フィッグ・ツリー・ ポケット、ゲームズ・ストリート１９番

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物免疫不全ウイルスのエンベロープタンパク質の免疫優性領域のペプ チドであって、該ペプチドはジスルフィドループを含むもの。
2. ２．有蹄動物かまたはネコ科の動物のいずれかに感染する免疫不全ウイルス由来 のものである請求項１に記載のペプチド。
3. ３．下記配列： 【配列があります】 を有するネコ免疫不全ウイノレスのｅｎｖｇｐ４０タンパク質のアミノ酸６８０ −７１１からの少なくとも８連続アミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド。
4. ４．下記配列： 【配列があります】 を有するウシ免疫不全ウイルスのｅｎｖｇｐ４２タンパク質のアミノ酸６２５− ６６０からの少なくとも８連続アミノ酸からなる請求項１に記載のペプチド。
5. ５．１０〜２０のアミノ酸からなる請求項３または請求項４に記載のペプチド。
6. ６．２０〜２５のアミノ酸からなる請求項３または請求項４に記載のペプチド。
7. ７．２５〜３５のアミノ酸からなる請求項３または請求項４に記載のペプチド。
8. ８．組換えＤＮＡ注を用いる工程からなることを特徴とする、請求項１〜７のい ずれか１に記載のペプチドの調製法。
9. ９．化学的合成法を用いる工程からなることを特徴とする、請求項１〜７のいず れか１に記載のペプチドの調製法。
10. １０．請求項１〜７のいずれか１に記載のペプチドに対して向けられたポリクロ ーナルまたはモノクローナル抗体または免疫学的に機能を有するそのフラグメン トまたは抗体類似体。
11. １１．請求項１〜７のいずれか１に記載のペプチドからなる試薬を用いる工程か らなることを特徴とする、該ウイルスに暴露された哺乳動物からの生物学的試料 中の哺乳動物免疫不全ウイルスに対する抗体の検出のためのイムノアッセイ。
12. １２．オーストラリア特許出願第２２２２４／８８号および第２４１８２／８８ 号に記載されているように、該凝集アッセイが直接または間接の全血凝集アッセ イである請求項１５または請求項１６に記載の凝集アッセイ。
13. １３．請求項１１または請求項１２に記載のイムノアッセイを行うための試験キ ット。
14. １４．請求項１０に記載の抗体からなることを特徴とする、哺乳動物免疫不全ウ イルスに対する免疫吸着体。