JPH07503961A - 血栓症抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、１９９２年２月１４日付で出願された係属中の米国特許出願ｔｓ０ ７／８３６．１２３号「血栓症−誘発血小板凝集の抑制剤」の部分継続出願であ り、該米国特許出願の明細書および図面もこの出願の一部を成すものである。

発明の分野 一つの観点によれば、本発明は血栓症または因子Ｘａの強力な抑制剤である化合 物に関する。別の観点によれば、本発明は新規なペプチドアルデヒド類似体、薬 学的に許容されるこれらの塩、および哺乳類の血液凝固の強力で特異的な抑制剤 としての有用な該類似体または塩を含有する薬学的に許容される組成物に関する 。さらに別の観点によれば、本発明は、異常な血栓症によって特徴づけられる哺 乳類の疾患用治療剤としてのこれらの抑制剤の使用方法に関する。

発明の背景 正常な止血は、クロットの形成過程（血液凝固）とクロットの溶解過程（線維素 溶解）の間の複雑なバランスの結果からもたらされる。血球、特異的血漿タンパ ク質および血管表面の間の複雑な相互作用によって、けがや出血がおこらない限 り、血液の流動性は保持される。

血液凝固は、血漿中のセリンプロテアーゼの数種の特異的酵素前駆体がタンパク 質限定加水分解によって活性化される一連の増幅反応の完結である［ネマージン およびノッセル、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、　、第３３巻、第４７９頁（１ ９８２年）参照］。この一連の反応は、初期の止血栓の安定化に必要な不溶性フ ィブリンマトリックスの形成をもたらす。活性化反応の相互作用と伝搬は、凝固 の外因性および内因性経路を経ておこなわれる。これらの経路は、セリンプロテ アーゼである因子Ｘａの形成においては、高度に相互依存的で収束的である。因 子Ｘａは、血液凝固多段階の最後から二番目の段階であって、セリンプロテアー ゼトロンビンの形成段階に触媒作用をもたらす。この段階はプロトロンビナーゼ 複合体のアセンブリーの次に起こる（該アセンブリーは因子Ｘａ、非酵素的補因 子Ｖａ、および付着された活性化血小板の表面または全身を循環する膜質微粒子 の表面に集合した基質プロトロンビンから成る）。

酵素前駆体である因子Ｘのその酵素的に活性な形態（因子Ｘａ）へのタンパク分 解活性は、内因性または外因性の凝固経路のいずれかによっておこなわれる。内 因性経路は本質的なものと呼ばれるが、その理由は、凝固に必要な全ての要因が 血中に存在するからである［サイトウの報文「正常な止血機構」、止血障害、第 ２７頁〜第２９頁、グラン・アンド・ストラットン社発行（ラトノフおよびホル ベス編、１９８４年）参照］。この経路には、酵素前駆体セリンプロトロチアー ゼ（因子■およびＸＩ）および非酵素的補因子（因子■）が含まれる、内因性経 路の開始によって、因子刀からＸｌａへの活性化がもたらされる。因子Ｘ［ａは 、因子■から因子Ｘｌａへの活性化に触媒作用を及ぼす。因子ｘ［ａは、適当な リン脂質表面上の活性形態の因子■と共にテナーズ（ｔｅｎａｓｅ）複合体の形 成をもたらす。この複合体は、酵素前駆体である因子Ｘからセリンプロテアーゼ （因子Ｘａ）の形成に触媒作用を及ぼし、該因子Ｘａは次いで凝塊を形成させる 。

外因性経路は非本質的なものと呼ばれるが、その理由は、因子■に結合してその 活性化を促進する組織因子が血液外からもたらされるからである（サイトウの前 記文献参照）。この経路に含まれる主要な成分は酵素前駆体セリンプロテアーゼ （因子■）および膜結合タンパク質（組織因子）である。後者は、この酵素に対 して不可欠な非酵素的補因子として作用する。この経路の開始は、痕跡量の活性 化因子■（因子■ａ）による酵素前駆体因子■の活性化によってもたらされる自 触媒現象と考えられている。この場合、両方の因子は、血管の損傷部位の膜表面 上に新たに出現する組織因子と結合する。因子■ａ／組織因子複合体は、酵素前 駆体（因子Ｘ）からのセリンプロテアーゼ（因子Ｘａ）の形成に対して直接的に 触媒作用を及ぼす。損傷組織からの出血は、外因性経路による血液凝固を開始さ せる。

酵素前駆体（因子Ｘ）からその触媒的に活性な形態（因子Ｘａ）へのタンパク分 解活性は、重鎮サブユニットのアミン末端から５２番目のアミノ酸活性ペプチド を遊離させる。内因性の活性化反応は、非酵素的補因子（因子■ａ）との高分子 複合体中の因子ＩＸａによる触媒作用を受ける。外因性経路を経由する因子Ｘａ の形成は、因子■ａと組織因子との触媒性複合体による触媒作用を受ける。両方 の反応は、適当なリン脂質表面上において、カルシウムイオンの存在下で起こら なければならない。因子Ｘの内因性または外因性の活性化によって形成される活 性生成物はα−因子Ｘａである。自触媒現象と考えられている第二のタンパク分 解開裂は、重鎮のカルボキシ末端から１４番目のアミノ酸ペプチドの遊離を伴う β−因子Ｘａの形成をもたらす。いずれの形態の活性分子も、血漿中での凝固促 進能またはペプチジル色素原基質の加水分解能の点で同等の触媒活性を有する。

トロンビンの形成は、触媒性のプロトロンビナーゼ複合体のアセンブリーに従っ て因子Ｘａの触媒作用を受ける［マンらの報文「ビタミンに依存性酵素複合体の 表面依存性反応」、Ｂｌｏｏｄ、第７６巻、第１頁〜第１６頁（１９９０年）参 照］。この複合体は因子Ｘａ、非酵素的補因子Ｖａおよび基質プロトロンビンか ら成り、これらの成分は適当なリン脂質表面上で合体する。高分子複合体が効率 的な触媒作用に必要な要件を備えることにより、自然の抗凝固機構、例えば、ヘ パリン−アンチトロンビン■で媒介される阻害等から因子Ｘａは保護される［タ ンテとローゼンベルグの報文「ヘパリン−アンチトロンビン複合体による因子Ｘ ａの中和からの保護」、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　、第７１巻、第１３８ ３頁〜第１３９１頁（１９８３年）参照］。さらに、プロトロンビナーゼ複合体 中の因子Ｘａのキレート化合物形成は、抗凝固効果を引き出すためにアンチトロ ンビン■も必要とする外因性ヘパリン治療効果による阻害に対する耐性を該複合 体にもたらす。

トロンビンは血栓形成の一次メディエイター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）である。トロ ンビンは直接的に作用して、循環するフィブリノゲンから不溶性フィブリンを形 成させる。

さらに、トロンビンは酵素前駆体因子χｍを活性なトランスグルタミナーゼ因子 Ｘ■ａに活性化し、該因子ＸＩ［Ｉａは、増大する血栓をフィブリン線維の架橋 によって共有結合的に安定化させる作用をする［ローランドおよびコニシ、Ａ　 ｒｃｈ、Ｂ　１ｏｃｈｅ■。

Ｂｉｏｈｙｓ、　、第１０５巻、第５８頁（１９６４年）参照〕。フィブリン含 有量の多い凝塊の形成と安定化における直接的な役割のほかに、該酵素は、脈管 系と血液中の多数の細胞成分に対して大きな生体調節効果を及ぼすことが報告さ れている［シューマン、Ａｒ＋ｎ、　ＮＹ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、第４０５巻 、第３４９頁（１９８６年）参照〕。

トロンビンは血小板活性の最も効果的なアゴニストであると考えられており、ま た、トロンビンは、血小板依存性の動脈血栓形成の基本的な病態生理学的メゾイ エイタ−であることが証明されている［ニブイトら、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓ ｔ、　、第８４巻、第１８頁（１９８９年）参照］。トロンビンで媒介される血 小板活性によって、リガンドにより誘発される血小板間凝集がもたらされる。該 血小板間凝集は主として、付着性リガンド（例えば、フィブリノケンおよびフィ ブロネクチン等）と血小板インテグリンレセブタ−（例えば、トロンビン活性を 伴う活性な立体配座を有する糖タンパク質等）との間の二価相互作用に起因する ［ベルントおよびフィリップス、「プレイトレッツ・イン・バイオロジー・アン ド・パソロジー」、第４３頁〜第７４頁、エルセヴイーア／ノース・ホランド・ バイオメディカル・プレス（ゴートン編、１９８１年）参照］。トロンビンで活 性化された血小板は、それぞれ非酵素的補因子Ｖおよび■のトロンビン媒介活性 を伴う完全な活性血小板および血小板誘導微粒子の膜表面上における新たなプロ トロンビン効果およびテナーゼ（因子ＩＸａ、因子■ａおよび因子Ｘ）の触媒性 複合体のアセンブリーを介してトロンビンの製造も促進する［タンスら、Ｂｌｏ ｏｄ、第７７巻、第２６４１頁（１９９１年）参照］。この正フィードバックプ ロセスによって、血栓の近接部において高濃度のトロンビンが局部的に生成され 、これによって、血栓の増大と拡張が促進される［マンら、Ｂｆｏｏｄ、第７６ 巻、第１頁（１９９０年）参照］。

プロトロンビン効果とは異なり、トロンビンは止血に対して別の観点から影響を 及ぼすことが知られている。この種の作用には、生理学的に重要な抗凝固因子と しての作用が含まれる。トロンビンの抗凝固効果は、内皮細胞膜糖タンパク質（ トロンボモジュリン）に対するトロンビンの結合によって示される。この効果に よりトロンビンの基質特異性が変化し、これによって、トロンビンは循環性タン パク質Ｃを認識してこれをタンパク分解的に活性化させて活性化タンパク質Ｃ（ ａＰＣ）を生成すると考えられている［ムスシら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、第２７巻、第７６９頁（１９８８年）参照］。ａＰＣは、非酵素的補因子Ｖａ およびｔ’ｌａを選択的に不活性化してそれぞれプロトロンビナーゼ触媒性複合 体およびテナーゼ触媒性複合体によるトロンビン形成の下方調節をもたらすセリ ンプロテアーゼである［エスモン、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、第２３５巻、第１３４８ 頁（１９８７年）参照］。トロンボモジュリンの不存在下でのトロンビンによる タンパク質Ｃの活性化は劣る。

トロンビンはまた、血管の平滑筋細胞のような間葉起源の細胞を含む多種類の細 胞に対して有効な直接的分裂誘発因子としても知られている［ケンおよびブカナ ン、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、第７２巻、第１ ３１頁（１９７５年）参照］。トロンビンと血管平滑筋との直接的相互作用によ って血管収縮がもたらされる［バルンら、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐｌ、Ｂｉｏ ｌ、　Ｍｅｄ、　、第１８０巻、第５１８頁（１９８５年）参照］。トロンビン は、組織プラスミノケン活性化因子を含む血管内皮細胞からの多数の生物活性物 質の放出を誘発する直接的な分泌促進剤としても作用する〔レビンら、Ｔｈｒｏ ｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、　、第５６巻、第１１５頁（１９８６年）参照］。血 管細胞に及ぼすこわらの直接的な効果のほかに、該酵素は、トロンビン誘発活性 化を伴う血小板α−顆粒からの類種の強力な成長因子（例えば、血小板−誘導成 長因子および表皮性成長因子等）の放出によって、血管平滑筋細胞に対して強力 な分裂誘発因子活性を間接的に誘発する［ロス、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、Ｊ。

Ｍｅｄ、第３１４巻、第４０８頁（１９８６年）参照］。

多くの重要な疾患は異常な止血に関連している。冠状動脈の血管系に関しては、 確立されたアテローム性動脈硬化性プラクの破裂に起因する異常な血栓形成は急 性心筋梗塞および不安定アンギナの主要な原因である。さらに、血栓融解治療ま たは経皮的な経内腔的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）による閉塞性の冠状動脈血栓 の治療には、緊急の消散を必要とする冒された血管の急性血栓症的再閉鎖を伴う 場合が多い。静脈血管系に関しては、四肢の下部または腹部領域において大手術 を受ける患者の多（は、冒された四肢への血流の低減と肺塞栓症へ導く疾病素質 をもたらず静脈血管系に形成される血栓で患っている。散在性の血管向凝固障害 は、いずれの血管系においても、敗血性ショック、特定のウィルス性感染および 癌で患っているときにみられ、また、該凝固障害は、凝固因子の急激な消費およ び広範囲に及ぶ器官不全症へ導く血管系内での生命の危険をもたらす血栓の形成 によって特徴づけられる。

動脈血管系における病原性血栓症は、今日の医学の分野においては、臨床上重大 な関心事となっている。西欧諸国における主要な死因の一つである急性心筋梗塞 の主要な原因は病原性血栓症である。周期的に起こる動脈血栓症は、血栓融解剤 およびＰＴＣＡによってそれぞれ治療される閉塞冠状動脈の酵素的および外科的 再疎通化によってもたらされる不全症の主要な原因の一つである［「トロンボシ ス・イン・カージオバスキュラー・ディスオーダー」（フルターおよびフェアス トレーテ編、サランダース社（Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、　）発行：１ ９９１年）の第３２７頁に記載のロスの報文および第３８９頁に記載のガリフと ウィラーソンの報文参照］。静脈血管系における血栓症の場合とは異なり、動脈 血栓症は、血液凝固多段によって形成されるフィブリンと細胞成分、特に血小板 との複雑な相互作用であって、高い確率で動脈血栓に導く相互作用の結果もたら される。急性の動脈血栓症または再血栓症の有効な治療法または予防法は現在の ところ知られていない。何故ならば、生体内投与される臨床的な抗凝固剤として 最も広（使用されているヘパリンはこの症状に対して一般的に有効であることは 証明されていないからである［プリンスおよびヒルシュ、Ｊ、　Ａｔ　Ｃａ１１ ．　Ｃａｒｄｉｏｌ、　、第６７巻、第３Ａ頁（１９９１年）参照］。

ＰＴＣＡの後で一般的に発生する予測できずに周期的に起こる血栓症的再閉塞の ほかに、この手術を受けた患者の３０〜４０％において、再疎通化血管に顕著な 再発狭窄症がみられる［カリフら、Ｊ、　Ａ＋ｓ、　Ｃａ１１．　Ｃａｒｄｉｏ ｌ、　、第１７巻、第２８頁（１９９１年）参照］。これらの患者には、新たに 生じた狭窄症を治療するためにＰＴＣＡを繰り返すか、または冠状静脈バイパス を設ける手術が必要となる。物理的な力によって損傷を受けた血管の狭窄症は血 栓症的突起によるものではなく、周囲の平滑筋細胞における過剰増殖性応答の結 果であり、該平滑筋細胞は経時的に、筋肉マスの増加による冒された血管の内腔 径の減少をもたらす（カリフらの上記文献参照）。動脈血栓症に関しては、物理 的な再疎通化に伴う血管の再発狭窄症を予防するのに有効な薬理学的処置は現在 のところ知られていない。

安全で有効な治療用抗凝固剤の必要性は、一つの観点においては、セリンプロテ アーゼトロンビンが形成される血液凝固多段の最後から２番目の段階における因 子Ｘａの触媒としての役割に注目している。

トロンビンに対する最も好ましい天然の基質は、Ｐ３認識サブサイトにおける非 荷電アミノ酸を含むとされている。例えば、以下に示すように、トロンビンに対 して生理学的に基本的な基質であるフィブリノケンのＡαα上上トロンビン開裂 サイトにはグリシン残基が含まれるが、Ｂβ鎖上の開裂サイトにはセリン残基が 含まれることが知られている： Ｐ４　Ｐ３　Ｐ２　ＰＩ　Ｐｉ’ Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｇｌｙ　フィブリノケンＡα鎖Ｐｈｅ−５ｅ ｒ−Δｌａ　−Ａ　ｒｇ／　Ｇ　ｌｙ　フィブリノケンＢβ鎖トロンビンの活性 サイトに結合してフィブリノケンのフィブリンへの変換と細胞の活性化を阻害す る非荷電残基を２３位に有するペプチジル誘導体が知られている。さらに、Ｐ１ アミノ酸と結合したアルデヒド官能基、クロロメチルケトン官能基またはホウ酸 官能基を有するペプチジル誘導体も知られている。基質様ペプチジル誘導体、例 えば、Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニナル（Ｄ−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−ａｌ）、Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニン−クロロメチ ルケトン（Ｐ−ＰＡＣＫ）およびアセチル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル− ホーロアルギニン（Ａｃ−（Ｄ　−Ｐｈｅ）　−Ｐｒｏ−ｂｏｒｏＡｒｇ）がト ロンビンの活性サイトに直接結合することによって該酵素を阻害することが知ら れている。例えば以下の文献参照： バジャス”／、Ｓｙｍｐｏｓｉａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｈｕｎｇａｒｉｃａ、 第２５巻、第２７７頁（１９８４年）、バジャスツら、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅ ｌｌｌ、　、第３３巻、第１７２９頁（１９９０年）；バジャスツら、夏ｎｔ、 Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　、第１２巻、第２１７頁（ １９７０年）−ケラトナーおよびショー、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　 、第８０巻、第８２６頁（１９８７年）；ケラトナーら、ＥＰ２９３，８８１号 明細書（１９８８年、１２月７日発行）；ケラトナーら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｗ、　、第２６５巻、第１８２０９頁（１９９０年）。これらの分子が、血 小板を多く含む動脈血栓症の予防において、有効な抗凝固剤であることが知られ ている［ケリーら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　、第６５巻、第７ ３６頁および第２５７頁（１９９１年）参照〕。

トロンビンの活性サイトのインヒビターであるが、Ｐ３認識サブサイトに非荷電 アミノ酸を有するペプチジル化合物とは構造が異なるペプチジル化合物が知られ ている。アルガトロバン（２Ｒ，４Ｒ−４−メチル−１−［Ｎ−２−（３−メチ ル−１，２，３，４−テトラヒドロ−８−キノリンスルホニル）−Ｌ−アルギニ ナル］−２−ビペルジンカルボン酸とも呼ばれる）もトロンビンの活性サイトに 直接結合するので、該酵素の非ペプチジルインヒビターとしては最も効果的で選 択性のある化合物であるとされている［才力モトら、Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏ１１ｓｕｎ、　、第１０１巻、第４４０頁（１，９８１ 年）参照］。アルガトロバンは、急性動脈血栓症のいくつかの実験的モデルにお いては、抗血栓症剤として有効であるとされている［ジヤツクら、Ｃ３ｒｃｕｌ ａｔｉｏｎ、第８１巻、第２１９頁（１９９０年）およびＣ１ｒｃ、　Ｒｅｓ、 　、第６７巻、第１５５２頁（１９９０年）参照］。

トロンビンのインヒビターであって、該酵素の活性サイトと他のサイトに結合す ると考えられているペプチジル化合物が知られている。ヒルジンとその種々のペ プチジル誘導体は、トロンビンの活性サイトとエキソサイトまたはエキソサイト のみに結合することによって、フィブリノケンからフィブリンへの変換および血 小板の活性化を阻害すると言われている［マークワルト、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａ ｅｍｏｓｔａｓ。

、第６６巻、第」４１頁（１９９１年）参照］。ヒルジンは、最初はヒルの唾液 腺抽出物から単離された６５アミノ酸ポリペプチドであって、既知のトロンビン インヒビターのうちで最も効能の高いものの一つであると言われている［マーキ およびワリス、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　、第６４巻、第３４４ 頁（１９９０年）参照］。

この化合物は、相互に異なって離れたアニオン結合性エキソサイトと触媒活性サ イトの両方へ結合することによって、トロンビンを阻害すると言われている（ラ イデルの前記文献参照）。ヒルジンは生体内で有効な抗血栓症剤であるとされて いる［マークヮルトら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、第４３巻、第２０２頁（１９８８ 年）およびケリーら、Ｂｌｏｏｄ、第７７巻、第１頁（１９９１年）参照］。抗 血栓症的効果のほかに、ヒルジンは、アテローム性動脈硬化症を患うウサギの大 腿動脈に物理的な損傷を与えたときにもたらされる平滑筋の増殖とこれに関連す る再発狭窄症を有効に阻害すると言われている［サレムボックら、Ｃ１ｒｃｕｌ ａｔｉｏｎ、　第８４　巻、第２３２頁（１９９１年）参照］。

ヒルジンは、ヒルジンのアニオン性カルボキシ末端から誘導されるペプチドであ ると言われている。ヒルジンは、トロンビンのアニオン結合性エキソサイトのみ に結合することによって、フィブリンの形成を阻害するが、該酵素の非ブロツク 化活性サイトに接近する小さな合成基質の触媒的代謝回転は阻害しないと言わレ テイル［マラガノアら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ（、第２６４巻、第８６９２ 頁（１９８９年）およびナスキら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ、　、第２６５巻 、第１３４８４頁（１９９０年）参照］。Ｘ線結晶学的分析によれば、ヒルジン によって表現されるヒルジンの領域は、トロンビンのエキソサイトに直接的に結 合すると言われている［スクルジブクザークージャンクンら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈ ａｅｍｏｓｔａｓ、　、第６５巻、アブストラクト５０７、第８３０頁（１９９ １年）参照］。さらに、ヒルジンの結合によって、特定の小さな合成基質のトロ ンビンによる触媒的代謝回転が促進されることも報告されており、このことは、 酵素活性サイトにおける立体配座の変化がエキソサイトの占有を伴うことを示す ［リウの前記文献参照］。ヒルジンは、トロンビンによって仲介される血小板の 凝集をブロックすると言われている〔ヤクポウスキおよびマラガノア、Ｂ　１ｏ ａｄ、第７５巻、第３９９頁（１９９０年）参照〕。

ヒルログ（ｈｊｒｕｌｏｇ）は、トロンビンに対して好ましい基質認識サイトに 基づくペプチド（Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−アルギニン）にグリシン− スペイサ−領域を介して結合されたヒルジン様配列を含む合成キメラ分子である とされている。ヒルジン様配列は、このペプチドのＣ−末端を介して該ペプチド に結合すると言われティる［マラガノンら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２ ９巻、第７０９５頁（１９９０年）参照］。ヒルログは、フィブリンの多い血栓 症および血小板の多い血栓症のいずれの予防においても有効な抗血栓症剤となり 得ると言われている［マラガノンら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅ＋＋＋ｏｓｔａｓ 、　、第６５巻、アブストラクト１７の第６５１頁（１９９１年）参照］。

発明の概要 一つの観点によれば、本発明は抗血栓症剤として有用な化合物に関する。即ち本 発明は、次式： ％式％ （式中、ＡｅＲは疎水性アシル基を示し、Ａ、はグルタミン酸（Ｇｌｕ）もしく はアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはＧ１．ｕもしくはＡｓｐの等価物を示す）で 表わされ、ｌ・ロンビンおよび／または因子Ｘａに対して約２００ｎＭもしくは それ以下のＩ　Ｃｓｏを有し、また、プラスミンに対して、トロンビンもしくは 因子Ｘａに対する比較的小さなＩＣ，、よりも大きなＩＣ，。を有する化合物に 関する。これらの化合物は血栓症の抑制剤として有用である。

好ま］、２い観１！λによ第１ば、本発明による化合物には、次式で表わされる 化合物および薬学的に許容される該化合物の塩類が含まれる：式中、Ｒ１は炭素 原子数約５〜約１０のアルキル基、炭素原子数約６〜約１２のアリールによって 置換された炭素原子数約１〜約３のアルキル基、または炭素原子数約５〜約８の 環状アルキルによって置換された炭素原子数約１〜約３のアルキル基を示し、ｌ は１または２を示し、炭素原子約１〜約４の低級アルキル基または炭素原子数約 ６〜約１４のアラルキル基を示す）、Ｒ３は−（ＣＨ２）ｓ−ＮＨＣ（＝ＮＨ） −ＮＨｔを示す。

ペプチジルアルギニンアルデヒドは水溶液中では、次式で示すように、４種の平 衡構造（Ａ：アルギニンアルデヒド、Ｂ：水和アルデヒド、ＣおよびＤ二アミノ シクロール）で存在することが知られている［バジャスッら、Ｊ、　Ｍｅｄ、Ｃ ｈｅｗ、、第３３巻、第１７２９頁（１９９０年）参照］。

Ｒは本発明に含まれる所定の化合物の残余の部分を示す。本発明によるペプチド アルデヒドには、これらの定義内における全ての平衡形態のものも包含される。

別の観点によれば、薬学的に有効量の上記化合物および薬学的に許容されるキャ リヤーを含有する薬剤組成物が本発明には含まれる。さらに別の観点によれば、 哺乳類における血液凝固プロセスを伴う障害によって特徴づけられる疾患を予防 または治療するために上記化合物および薬剤組成物の使用方法が本発明には含ま れる。

本発明によってここで使用する下記の用語は、特に言及しない限り、次の様に定 義される。

［アルキル士・・直鎖、分枝鎖および環状鎖を含む飽和脂肪族基、「アリール」 ・・・共役π電子系を有する少なくとも１個の環を有する芳香族基であって、随 意に置換されていてもよい炭素環式アリール基、ペテロ環式アリール基およびビ アリール基が含まれる。

［アラルキル士・・アリール基によって置換されたアルキル基。適当なアラルキ ル基には、随意に置換されていてもよいベンジル基およびピコリル基等が含まれ る。

［メチレン十・・−ＣＨｌ−０ 「アルキレン士・・２価の直鎖状または分枝鎖状の飽和脂肪族残基。

さらに、以下の略語は次の意義を有する。

ｒＡｌａ（Ｔｚｌ）ｔ・・・（Ｒ）−３−テトラゾリル−２−アミノプロピオン 酸。

ｒＡｒｇ−ａｌｌ・・・Ｌ−アルギニナル。

ｒＡｓｐＪ・・・ｌ、−アスパラギン酸。

ｒＡｓｐ（ＯＣＨｓ）十・・Ｌ−アスパラギン酸β−メチルエステル。

ｒＢｎ士・・ベンジル。

ｒＢｏｃ士・・ｔ−ブトキシカルボニル。

ｒＢｏｃＰｒｏ−ＯＨＪ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン。

ｒＢｏｍ士・・ベンジルオキシメチル ｒＢＯＰＪ・・・ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルア ミノ）−ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート。

「ブライン（　Ｂ　ｒｉｎｅ）十・・塩化ナトリウムの飽和水溶液。

ｒ　Ｃ　ｂｚ　Ｊ・・・ベンジルオキシカルボニル。

ｒｃＤＩＪ・・・カルボニルジイミダゾール。

ｒＣｈｘＡｃ士・・１−ンクロヘキシルアセチル。

ｒＣｈｘＰＡＪ・・・３−シクロヘキジルブロパノイル。

ｒＤｃＭＪ・・・ジクロロメタン。

ｒＤＩＥＡＪ・・・ジイソプロピルエチルアミン。

ｒＤＭＦＪ・・・Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド。

ｒＥｔＯＡｃＪ・・・酢酸エチル。

［Ｆ■十・・９−フルオレンメチル。

ｒＨＣＡ士・・３−フェニルプロパノイル。

ｒｌＰＡＪ・・・イソプロパツール。

［αＭｅＨＣＡＪ・・・２−メチル−３−フェニルブロノ（ノイル。

ｒＭｅＯＨ士・・メタノール。

ｒ４ＭｅＶＪ・・・４−メチルベンタイノル。

ｒＮａＯＡｃ士・・酢酸ナトリウム。

ｒＮＭＭＪ・・・４−メチルモルホリン。

ｒＯｃｔ十・・オクタノイル。

［Ｐｈ士・・フェニル基。

ｒＰｒｏ士・・Ｌ−プロリン。

ｒＺＰｒＰｅｎｔ士・・２−プロピルペントイル。

ｒＴＥＡ士・・トリエチルアミン。

ｒＴＦＡ士・・トリフルオロ酢酸。

ｒＴＨＦＪ・・・テトラビトロフラン。

図面の簡単な説明 図１は、本発明による１種または２種以上の化合物を調製するの（こ使用した固 相試薬の製造法を示す反応スキームである。図１にお”Ｃ、Ｂｎｌｉベンジルを 示し、ｔ−Ｂｕはｔ−ブチルを示し、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニルを示す。

図２は、本発明による１種または２種以上の化合物の調製に用いた化合物の合成 法を示す反応スキームである。図２において、「ｉ」はｒｐＴｓＯＨ／ＦｍＯＨ 、トルエン／還流」を示し、「■」はｒＢｏｃ−Ａｓｐ−βーベンジルエステル ／ＢＯＰ／ＮＭＭ／ＤＭＦＪを示し、「出」はｒｌ−リエチルアミン／還流」を 示す。

図３は、本発明による化合物の液相法による合成例を示す反応スキームである。

図３において、ｒｉＪはｒｃＤＩ／ｌ−プチルカルパゼート」を示し、ｒｉｉＪ はｒＴＦＡ／ＤＣＭＪを示し、「迅」はｒ（１）／ＮａＯＡｃＪを示し、ｒｉｖ Ｊは「遊離酸（例えば図２の（２３））としての保護ペプチド（または類似体） ／ＢＯＰ／ＮＭＭ／ＤＭＦＪを示し、ｒｖＪはｒＨ２／ＰｄＪを示し、「匍はｒ Ｈ．ｏ’Ｊを示し、ｒｖｉＪは「トリメチル酢酸／Ｄ　Ｃ　Ｃ／　１−ヒドロキ シベンゾトリアゾール／ＤＭＦＪを示す。あるいは、図３において、ｒｖＪがｒ ＨＦ／アニソール」を示し、「■」が「ホルムアルデヒド／　Ｈ　ｓＯ゛」を示 してもよい。

好ましい観点によれば、本発明は次式：％式％ （式中、ＡｃＲは疎水性アシル基を示し、ＡＨはグルタミン酸（Ｇｌｕ）もしく はアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはＧｌｕもしくはＡｓｐの等価物を示す）で表 わされ、トロンビンおよび／または因子Ｘａに対して約２００ｎＭもしくはそれ 以下のＩＣＳ。を有し、また、プラスミンに刻して、トロンビンもしくは因子Ｘ ａに対する比較的小さなＩＣ．。よりも大きなＩＣ６。を有する化合物に関する 。

「等価物」は、アミノ酸の一般式Ａ１または疎水性アシル基の変形物であって、 所定のアミノ酸または疎水性アシル基の使用と比べて、当該化合物の阻害能に有 害な影響をほとんど及ぼさない変形物を含むことを意味する。一般に、適当な疎 水性アシル基は、アシル（カルボニル）炭素原子のほかに、少な（とも約５個の 炭素原子を有し、また、有効な阻害能を発揮するのに十分な疎水性を有する。Ｇ ｌｕまたはＡｓｐはカルボキシル化された非環式アミノ酸およびその等価物であ る。このような等価物には、グルタミン酸のγ−Ｒ゛エステル、アスパラギン酸 のβ−Ｒ゛エステルまたはＧｌｕもしくはＡｓｐのカルボン酸基の代わりにテト ラゾールが置換されたＲｏ−置換テトラゾールが含まれる。この場合、Ｒｏは水 素原子、炭素原子数１〜６の低級アルキル基または炭素原子数約６〜約１５のア ラルキル基を示す。

本発明の一つの観点によれば、特定のペプチドアルデヒドのＮ−アシル誘導体が 提供される。この種の化合物は次式（Ｉ）で表わされる：Ｐ４　Ｐ３　Ｐ２　Ｐ ｉ ＋１＋ 式（１）で表わされる好ましい化合物には、Ｒ，がー（ＣＨｘ）ｓ　ＮＨ　Ｃ（ ＝ＮＨ）−ＮＨ２である化合物、即ち、ＰｌがＬ−アルギニナルである化合物が 含まれる。

また、別の好ましい化合物にはＰ２残基がＬ−プロリンである化合物が含まれる 。

さらにまた、別の好ましい化合物には、鵬が１または２であり、原子数約１〜約 ６の低級アルキル基または炭素原子数約４〜約１４のアラルキル基を示す）を示 す化合物が含まれる。特に好ましい化合物は、Ｒｏが水素原子またはメチル基を 示す化合物である。

本発明による好ましい化合物にはＰ４基がＮ−アシル基である化合物が含まれる 。好ましいＰ４残基には、Ｒ，が炭素原子数約５〜約１０のアルキル基、炭素原 子数約６〜約１２のアリール基によって置換された炭素原子数約１〜約３のアル キル基、または炭素原子数約５〜８の環状アルキル基によって置換された炭素原 子数約１〜約３のアルキル基を示す化合物である。特に好ましい化合物には、了 りール基がフェニル基である化合物または環状アルキル基がシクロヘキサンであ る化合物が含まれる。式（１）で表わされる好ましい化合物には下記の化合物が 含まれる： することができる。あるいは、実施例１４と１５に示すように、本発明による化 合物は、）、（Ｆ　／アニソールを用いる処理によって、脱保護セミカルバゾン の形態で固相から脱離させ、次いＣ１該セミカルバゾンを希塩酸中でホルムアル デヒドを用い工処理することによって本発明による化合物に変換させる。

本発明によるペプチドアルデヒドは溶液相法によって合成してもよい。好ましい 方法の概要を図２および図３に示す。図２は、本発明による化合物の合成に用い る化合物の合成プロセスを示す。図３は、本発明による化合物を溶液相で合成す るための好ましいプロセスを示す。ペプチドアルデヒドを溶液合成する別の方法 は、例えば、次の文献に記載されている：マッコネルらの前記文献、第８７頁お よび該文献の引用文献、バジャスツら、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　、第３３ 巻、第１７２９頁（１９９０年）、カワムラら、Ｃｈｅｗ、Ｐｈａｒｔ　Ｂｕｌ ｌ、　、第１７巻、第１９０２頁（１９６９年）、および ソメノら、Ｃｈｅｔ　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　、第３４巻、第１７４８頁（ １９８６年）。

有用性および製剤 本発明による化合物は、トロンビンまたは因子Ｘａを阻害するが、プラスミンは 実質的に阻害しないことによって特徴づけられる。

本発明による化合物を緩衝液中に溶解させることによって、アッセイ濃度がＯ〜 １００μＭの溶液を調製する。トロンビン、因子Ｘａおよびプラスミンに対する アッセイにおいては、発色性の合成基質を、被験化合物と問題となる酵素を含有 する溶液に添加し、該酵素の残余の触媒活性を分光光度法によって測定する。

化合物のＩＣ，。は基質の代謝回転から決定される。ＩＣｓ。は、基質の代謝回 転の５０％を阻害する被験化合物の濃度である。本発明による化合物は、トロン ビンまたは因子Ｘａのアッセイにおいては、好ましくは約２００ｎＭのＩＣ５ｏ を有するが、プラスミンのアッセイにおいては、トロンビンと因子Ｘａに対する 比較的小さなＩＣ，。よりも小さくないＩＣ，。を有するのが好ましい。好まし い化合物は、トロンビンもしくは因子Ｘａのアッセイまたは両方のアッセイにお いて、約１０ＱｎＭもしくはそれ以下のＩＣ，＠を示す。

本発明には、異常な血栓症によって特徴づ１ノられる哺乳類に治療上有効量の本 発明による化合物または薬剤組成物を投与することを含む、該哺乳類の予防また は治療方法が含まれる。

投与に必要な該組成物の治療上有効な量は、投与経路、彼処ＩＩ’哺乳類の種類 、および問題となる特定の哺乳類の身体的特徴等によって左右される。これらの 要因および投与量を決定する該要因との関係は、医学の分野における当業者にと っては周知である。

異常な血栓症によって特徴づけられる症状には、動脈管系および静脈管系のもの が含まれる。

冠状動脈管系に関しては、異常な血栓形成は、急性心筋梗塞および不安定アンギ ナの主要な原因である確立されたアテローム性動脈硬化性プラグの破裂、並びに 血栓融解療法またはＰＴＣＡの結果もたらされる閉塞性の冠状血栓形成によって 特徴づけられる。

静脈管系に関しては、異常な血栓形成は、四肢の下部または腹部領域において大 手術を受ける患者であって、冒された四肢への血流の低減と肺塞栓症へ導く疾病 素質をもたらす静脈血管系に形成される血栓で患っている患者においてみられる 症状によって特徴づけられる。異常な血栓形成はまた、敗血症ショック、特定の ウィルス性感染および癌で患っているときにいずれの血管系においてもみられる 散在性の血管向凝固障害、並びに凝固因子の急激な消費および広範囲に及ぶ器官 不全症へ導く微細血管系内での生命の危険をもたらす血栓形成がみられる症状に よって特徴づけられる。

本発明による薬剤組成物は、経口投与用には錠剤、カプセル剤またはエリキシル 剤として、直腸内投与用には生薬として、注射投与用には無菌溶液または懸濁液 として製剤化して使用してもよい。投与量および投与方法は最適な効能が得られ るように適合させてもよいが、体重、ダイエツト、同時投薬および医学の分野に おける当業者が認識している他の因子によって左右される。

本発明によって選択開示された化合物は、トロンビンおよび因子Ｘａからのトロ ンビンの発生のインヒビターとして有効であると共に、異常な血栓症によって特 徴づけられる症状の予防または治療にも有効である。

本発明には、薬学的に許容されるキャリヤーまたは希釈剤に本発明による化合物 を治療上有効な量配合した貯蔵用または投与用組成物が含まれる。治療用に許容 されるキャリヤーまたは希釈剤は薬学の分野においては周知であり、例えば、「 レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ」（マッグ・パブリッ シング社発行、：ジエンナロ編、１９８５年）に記載されている。防腐剤、安定 剤、染料および香味剤を該薬剤組成物に配合してもよい。例えば、安息香酸ナト リウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として 添加してもよく、さらに、抗酸化剤および沈澱防止剤を配合してもよい（上記文 献、第１４４９頁参照）。

本発明方法を実施するに際しては、上記の化合物または組成物を単独で使用して もよく、また、併用してもよ（、さらに、他の治療剤または診断剤と併用しても よい。これらの化合物は生体内（通常は哺乳類の体内）、好ましくはヒトの体内 で使用してもよく、あるいは生体外で使用してもよい。これらの化合物を生体内 使用する場合には、該化合物または組成物を種々の方法、例えば、非経口投与法 、静脈内投与法、皮下投与法、筋肉内投与法、結腸内投与法、直腸内投与法、鼻 腔内投与法または腹腔内投与法等によって、種々の投与形態で投与すればよい。

当業者には明らかなように、有効な生体内投与量および特定の投与形式は処置さ れる哺乳類の年令、体重および種、使用する化合物の種類および該化合物を使用 する特定の用途等によって左右される。有効投与量、即ち、所望の効能を得るの に必要な投与量の決定法は当業者の技術的範囲内の事項である。典型的には、化 合物の投与量は、比較的低い量から始め、所望の効能が得られるまで増量して決 定される。

本発明による化合物の投与量は、所望の効能や治療的な指示に応じて広範囲に変 化させることができる。典型的には、投与量は約０．０１〜１００１ｇ／ｋｇ（ 体重）、好ましくは約領　０１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。好ましい投与 は一日ずつの投与量を非経口投与、例えば静脈内投与する方法である。

注射形態の製剤は常套の形態、例えば、液状溶液または懸濁液、注射前に溶液ま たは懸濁液にするのに適した固体状形態、またはエマルション形態に調製するこ とができる。適当なエキシビエントとしては、水、塩類液、デキストロース、マ ンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウムおよ びシスティンハイドロクロリド等が例示される。さらに、所望により、注射可能 な薬剤組成物は少量の非毒性の補助物質、例えば、湿潤剤およびｐＨ１ｌ衝剤等 を含有していてもよい。また、所望により、吸収促進剤、例えば、リポソーム等 を使用してもよい。

本発明を理解するのを補助するために、以下の実施例において一連の実験の結果 を説明する。本発明に関する以下の実施例は本発明の範囲を特に限定するもので はな（、当業者が理解し得る範囲内において、現在知られており、また今後開発 される本発明の種々の変形態様も、本明細書に開示されて以下の請求の範囲に記 載されている本発明に包含されるものである。

本発明を以下の実施例においてさらに説明する。実施例１〜７の概要を図１に示 す。

α−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ’−ニトロアルギニナルの製造Ａ、互生１ α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ１−ニトロアルギニナル（１）の合成のための 以下の方法は、Ｂｏｃ−アミノ酸アルデヒドの一般的製造法の例である。バテル 等、Ｂｉｏｃｈｉｗ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、、第７４８巻、第３２１頁 〜第３３０頁（１９８３年）参照。Ｂｏｃ−Ｎ’−ニトロ−アルギニン１２．７ ｇ（４０ミリモル）およびカルボニルジイミダゾール（ＣＤ　Ｉ）７．０ｇ（４ ３ミリモル）を、室温で乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ）−１Ｆ）２００鳳りに加 え、３０分間撹拌した、反応混合物を一７８℃に冷却し、ＬｉＡｌＨ４のＬＭ− ＴＨＦＨＦ溶液３５奢Ｌ０分間かけて滴下した。反応は一７８℃において撹拌下 で更に１時間行った。次に、アセトン１８■Ｌを加え、混合物を素早＜ＩＮのＨ Ｃ１４００ｍＬに加えた。この混合物を酢酸エチル１０ＱｍＬで２回抽出した。

酢酸エチル抽出物を混合し、次いで水１００■Ｌ１飽和ＮａＨｃＯ，溶液１００ ｍＬおよび飽和ＮａＣ１溶液１００謬りを用いる洗浄処理に２回付した。得られ た溶液をＭｇ５Ｏ＜を使用して乾燥させ、泡状物に濃縮した。α−ｔ−ブトキシ カルボニル−Ｎ”−ニトロアルギニナルの粗製物６．３６ｇ（２１ミリモル：収 率５２％）を得た。

Ｂ・哀広又 化合物（］）は、フェーレンツおよびカスドロの方法［Ｓ　ｈｎｔｈｅｓｉｓ、 第６７６頁（１９８３年）ｔ−照］の修正法によって合成した。

Ｎ−メチルピペリジン１１．４ｍＬを、約０℃に冷却したジクロロメタン７５１ １Ｌ中にＮ、Ｏ−′）メチルヒドロキシルアミン８．４２ｇ（９４ミリモル）を 加えた懸濁液に撹拌下でゆっくりと加えた。溶液を２０分間撹拌して、遊離のヒ ドロキシルアミンを生成させ、次の工程において使用のために冷却保存した。

別のフラスコ中において、Ｂｏａ−４Ｊ’−ニトロアルギニン３０．０ｇ（９４ ミリモル）をテトラヒドロフラン約１４００ｍＬ中に加熱溶解させ、該溶液を窒 素雰囲気下で０℃まで冷却した。Ｎ−メチルピペリジン１１．４ｏＬおよびイソ ブチルクロロホルメート１２．１４ＩＩＬ（９４ミリモル）を加え、混合物を１ ０分間撹拌した。

先に製造したヒドロキシルアミンを一時に加え、反応混合物を室温まで暖めた後 、−夜撹拌した。

生じた沈澱を濾取し、ついでテトラヒドロフラン２００■して洗浄した。濾液を 真空下で約１５０ｍＬまで濃縮後、酢酸エチル２００ｍＬを加え、続いて氷で溶 液を冷却した。冷却した酢酸エチル相を、０．２Ｎの塩酸を７５ｍＬずつ用いて ２回洗浄し、次に０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を７５−Ｌずつ用いて２回洗浄 した後、ブライン７５ｉＬで１回洗浄し、次いで無水硫酸マグネシウムを用いて 有機相を乾燥した。真空下で濃縮することによって、固体状のＢｏｃ−Ｎ’−ニ トロアルギニン−Ｎ−メチル−〇−メチルカルボキサミド２２．７ｇ（収率７０ ％）を得た。

ジクロロメタンとメタノールの９；１混合液を用いるシリカゲル上での薄層クロ マトグラフィー分析は１つの斑点を示した。

フラスコを窒素雰囲気下で、−５０℃まで冷却し、次いでＩＮ水素化アルミニウ ムリチウムのテトラヒドロフラン溶液７０膳Ｌ（７０ミリモル）および乾燥テト ラヒドロフラン５００＋ａＬを入れた。乾燥テトラヒドロフラン中にＢｏｃ−Ｎ ’−ニトロアルギニン−Ｎ−メチル−〇−メチルカルボキサミド６６ミリモルを 含む溶液５０＋ｓＬをゆっくり加えた。この場合、反応混合物の温度は一５０℃ に維持した。冷却剤の除去により０℃まで反応混合物を暖めた後、これを−３０ ℃まで再冷却し、この温度で２Ｎ硫酸水素カリウム溶液１００■Ｌ（０，２モル ）を約１０〜１５分間撹拌しながら加えた。反応混合物を次いで室温で２時間撹 拌した。沈澱を濾取後、濾液を真空下で１０ｔ）ｓＬまで濃縮した。濃縮物を酢 酸エチル８００ｍＬ中に注ぎ、これをＩＮ塩酸を５０ｍＬずつ用いて２回洗浄し 、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液を５０ｍＬずつ用いて２回洗浄した後、ブラ イン５０ｍＬで１回洗浄した。−緒にした水性抽出物を酢酸エチルを１００■Ｌ ずつ用いて３回抽出した。酢酸エチルの全洗浄液を一緒にし、これを無水硫酸マ グネシウムを用いて乾燥した。混合物を真空下で濃縮することによって、化合物 （１）を１８．５ｇ（収率：９５％）得た。

実施例２ トランス−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカルボン酸ベンジルエステル −バラ−トルエンスルホネート塩の製造 トランス−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカルボン酸５０ｇ（０，３１ ８モル）、ｐ−トルエンスルホン酸６１．７ｇ（０，３２４モル）、ベンジルア ルコール２５０ｍｌ、（２，４モル）およびトルエン２５０ｍＬを混合し、撹拌 した。混合物を２４時間還流し、遊離水をディーンースターク装置を用いて共沸 除去した。透明な溶液を５時間還流後に得た。該溶液を室温まで冷却し、生成物 を結晶化した。

混合物を真空濾過処理に付した後、エーテルで洗浄し、次いで真空乾燥器中で乾 燥させることによって標記化合物を１２８．ｉ２ｇ（収率９６％）得た。

１）１−ＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ）δ：　１．０５（ｍ、２Ｈ）、１．４３（ｍ、　 ２Ｈ）、１．．５９（ｓ。

１■１）、１．８５　（ｍ、　２　Ｈ）、２．０３（ｍ、２Ｈ）、２．３３　（ ｍ、　ｉ　Ｈ）、２．３５　（ｓ、　３　Ｈ）、２．７５（ｄ、　２Ｈ）、５． ０９（ｓ、２Ｈ）、７゜２３（ｄ、２Ｈ）、７．３２（ｍ、　５Ｈ）、７゜６９ ｃｄ、　２Ｈ）。

融点：　１５４〜１５６℃。

グリーンスタインおよびヴイニッツの報文［ケミストリー・オブ・ジ・アミノ・ アシソズ、第２巻、第９４２頁（ｉ９８６年）］参照。

カルボニルジイミダゾール（ＣＤ　Ｉ　）３．２４ｇ（０，０２モル）を窒素雰 囲気下で室温においてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４５鳳りに溶解させた。

ＤＭＦ４５■Ｌ＋、：ｔ−プチルカルバゼード２．４８ｇ（０，０２モル）を加 えた溶液を滴下した。固体状ベンジルエステル（２）８．３８ｇ（０，０２モル ）を加え、次いでトリエチルアミン（ＴＥＡ）３．０６ｏ＋Ｌを３０分間かけて 滴下した。反応は窒素雰囲気下で室温において、撹拌下で１時間行った。水（１ ００■Ｌ）を加え、混合物を酢酸エチル５０ｍＬで３回抽出した。酢酸エチル層 を合わせて、これをＩＮ　ＨＣＩ、ＨｔＯ１ＮａＨＣＯｓ溶液およびＮａＣ１溶 液を順次７５１Ｌずつ用いる抽出処理に２回付し、次いでＭｇＳＯ４を用いて乾 燥させた。混合物を濾過し、濾液を濃縮して、油状物を得た。該油状物は、酢酸 エチル／ヘキサン混合溶媒を用いる再結晶により精製した（融点：１０６〜１０ ８℃）。該油状物は次の工程において直接使用してもよい。

’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ：　０．９４（＋ｃ、　２Ｈ）、１．４２（ｍ、 　２Ｈ）、１．４５（ｓ、９Ｈ）、１．８１（ｗ、２Ｈ）、２．０２（ａ＋、２ Ｈ）、２．２７（＋＊、　Ｉ　Ｈ）、３．１　？Ｑ、　２Ｈ）、５、０９（ｓ、 　２Ｈ）、５．５１（ｔ、ＩＨ）、６．４６（ｓ、　２Ｈ）、７゜３４（ｍ、４ Ｈ）。

実施例４ ｌ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−３−セミカルバジブイル−トランス−４−メ チ上記の実施例３で得られた粗製Ｂｏｃ−ベンジルエステル（３）に、メタノー ル（ＭｅＯＨ）２５０■Ｌおよび活性炭にパラジウムを１０％担持させた触媒５ ００ｍｇを加えた。水素圧５　ｐｓｉｇの条件下において、ヒドロゲネーターを 用いて１時間振盪後、混合物を微細ガラス濾過器を通してセライトで濾過した。

濾液を濃縮し泡状物とし、これにメチレンクロリドを加え、沈澱を形成させた。

混合物を５℃で６５時間保管した。結晶化した試料をエーテルで濾過し、標記化 合物を粗生成物として４．０ｇ（１２，７ミリモル：化合物（２）からの全収率 ６２％）得た。

’　Ｈ−Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ｓ　ＯＤ　）δ：　０．９６（ｍ、２Ｈ）、１．４ ２（ｓ、２Ｈ）、１．４６（Ｓ。

９Ｈ）、　１．８　２（菖、２Ｈ）、　１．９７（ｍ、２Ｈ）、　２．１８（ｍ 、ＬＨ）、　３．０（ｔ、２Ｈ）。

融点：１８５〜１８９℃。

衷廊−五 セミカルバジブイル−トランス−４−メチルシクロヘキサンカルボン酸トリフル 化合物（４）３１５ｍｇ（１ミリモル）を、０℃でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ） １０＋ｉＬに加え、得られた溶液を３０分間撹拌した、その後、溶液をエーテル ７５＋ｏＬに滴下した。生成した沈澱物を混合物から濾別し、エーテルで洗浄す ることによつ’ＨＮＭＲ（ＣＤｓＯＤ）δ：　１．０（＋ａ、２Ｈ）、１．３８ （！１．２）１）、１．４３（ｍ、ＩＨ）、１．８４（ｍ、　２Ｈ）、２．０１ （ｍ、　２Ｈ）、２．２２（ｍ、ＩＨ）、３．０４（ｄ、２Ｈ）。

融点：　１５４〜１５６℃。

実施例６ ａ−（ｔ−ブトキンカルボニル）−Ｎ’−ニトロアルギニナルーセミカルバゾニ ルートランス−４−メチルシクロヘキサンカルボン酸の製造水４５鵬りを含むエ タノール１３５ｍＬ中に化合物（５）１３．７ｇ（４１，６ミリモル）および粗 製化合物（１）１８、Ｏｇ（約５９ミリモル）含む溶液を、Ｎａ０Ａｃ９．４１ ｇ（６９ミリモル）で処理し、１時間還流した。この溶液を冷却した後、０．ｌ ＮＨＣｌ中へ注ぎ、酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相をブラインを用 いて順次洗浄した後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、次いで濃縮した。この濁った混合物 を５℃で一夜放置して、生成物を沈澱させ、該生成物を濾過により分離した後、 真空下で乾燥することによって標記化合物を９．９ｇ得た（（５）に基づ（収率 ：４７％）。

ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）δ：　１．　ｏｃｍ、　２Ｈ）、１．４３（ｓ、　 ９Ｈ）、１．４５−２゜２０（１，１３）（）、３．０９（ｄ、　２Ｈ）、３． ３０　（ｍ、　２　Ｈ）、４．１８（ｂｓ、　ＩＨ）、７゜１０（ｄ、ＩＨ）。

融点、１６２〜１６３℃。

固相試薬（７）を、反応容器中にメチルーベンズヒドラルアミン（ＭＢＨＡ）樹 脂０、８ｇ（０，５ミリモル、０．６２ｇ１モル）を入れ、ジクロロメタン（Ｄ ＣＭ）で１回、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３回、１０％ジイソプロピル エチルアミン（ＤＩＥＡ）／ＤＭＦで２回、およびＤＭＦで４回洗浄することに より製造した（これらの洗浄処理は、いずれも洗浄液１０ｅＬを用いて撹拌下で １〜２分間行う）。

ＤＭＦ５ｍＬ、４−メチルモルフォリン（１０２μｌ）１ミリモル、ベンゾトリ アゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムへキサ フルオロホスフェート（ＢＯＰ試薬）（４４３ｍｇ）　１ミリモル、および化合 物（６Ｘ５００ａ＋ｇ）１ミリモルを加え、回転輪を用いて１６時間混合し、次 いでＤＭＦで３回、１０％ＤＩＥＡ／ＤｋｉＦで２回およびＤＭＦで３回洗浄し た。得られた樹脂は、ＤＣＭ、メタノール、およびエーテルを用いて順次洗浄し た。

得られた樹脂（７）は、ニンヒドリンにより９８〜９９％のカップリング収率を 示した。

この樹脂のＮ−末端は、以下の実施例に示すように、常套のペプチドシンセサイ ザーを用い、標準的なｔ−Ｂｏａ法の手順に従って、アミノ酸またはアミノ酸類 似物によって延長した。ペプチド類似体の合成は、アプライド・バイオシステム ダ社製４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーを使用し、該４３０Ａ型のユーザーマ ニュアルに記載のｔ−Ｂｏｃの化学的条件下において行った。得られた保護ペプ チドアルデヒドはホルムアルデヒドを用いてキャリヤーから切断することができ 、また水素／Ｐｄを用いて脱保護することができる。ニトロ基は、アルデヒドの 還元を伴うことなくグアニジン基から除去し得る。

実施例８ Ｎ−（４−メチルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル−し−プロリル−し−アル ギアブライド・バイオシステムダ社製４３０Ａ型ペプチドシンセサイザーを使用 してペプチドアルデヒド（８）を合成した。使用したＢｏｃの化学的条件は該装 置のユーザーマニュアルに記載の条件に従った。

Ｂｏａ保護基を５０％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン溶媒）を用いる処理に より除去することによって樹脂（７）０．５００ｇを使用のために調製した。洗 浄し、１０％ジイソプロピルエチルアミン（ジクロロメタン溶媒）を用いて処理 することによって酸性度を中和した後、以下の手順に従って、市販のＢｏｃ−保 護アミノ酸をキャリヤー試薬（およびアミノ酸キャリヤー延長鎖）にカップリン グさせた。

Ｎ−Ｂｏａ−Ｌ−プロリンをジシクロへキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシ ベンゾトリアゾール（ジメチルホルムアミド溶媒）を用いて樹脂に結合させ、次 いで５０％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン溶媒）を用いて処理することによ ってＢｏｃ保護基を除去し、洗浄後、１０％ジイソプロピルエチルアミン（ジク ロロメタン溶媒）を用いて酸性度を中和した。同様にして、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ア スパラギン酸−β−ベンジルエステルをカップリングさせ、脱保護処理を行った 。４−メチル吉草酸を、ジシクロへキシルカルボジイミドと１−ヒドロキシベン ゾトリアゾール（ジメチルホルムアミド溶媒）を用いて、固相上のペプチドにカ ップリングさせた。

テトラヒドロフラン５ｍＬ、酢酸１ｍＬ、ホルムアルデヒド１ｍＬおよびＩＮの ＨＣＩ　０．１００ａＬから成る混合物を用いて、撹拌下で１時間処理すること によってペプチドアルデヒドを固相から離脱させた。この混合物を濾過処理に付 した後、樹脂をテトラヒドロフラン１０■Ｌを用いて洗浄した。全濾液を水１０ ０ｍＬを用いて希釈した後、酢酸エチルを用いて抽出した。酢酸エチル相をＮａ Ｃ１飽和水溶液を用いて洗浄し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥した後、真空下 で濃縮した。

ペプチドアルデヒドのベンジル保護基とニトロ保護基を脱離させるために、濃縮 したペプチドアルデヒドを水１０％含有メタノール１０ｍＬ、ＩＮ　ＨＣＩ　０ ゜３００ｍＬおよび活性炭担持パラジウム触媒０．２００ｇから成る混合物に加 えた後、水素（５ｐｓｉ）を用いて４５分間処理した。この混合物をセライト（ （：６１ｉｔｅ）を有する微細なガラスフィルターを用いる濾過処理に付し、濾 液を水１０％含有メタノールを用いて洗浄した後、濃縮することによって粗製ペ プチドアルデヒドを得た。

得られたペプチドアルデヒドを逆相ＨＰＬＣ（粒径１０ミクロンで、孔径３００ オングストロームのＣ−１８カラム）を用いて精製した。この場合、トリフルオ ロ酢酸を０，１％ずつ含む水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った（アセ トニトリル、５〜４０％）。カラム留分を分析用ＨＰＬＣを用いて分析し、純粋 な生成物を含有する留分を捕集し、凍結乾燥して生成物（８）を得た。フープ（ ＦＡＢ）質量分析による生成物の分子量は４６８．２ａ、ｍ、ｕ、であった（計 算分子量：４６３．３ａ、１１．ｕ、）。

ペプチドアルデヒド（９）を、実施例８に記載の手順に準拠して合成し、精製し た。

Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アス パラギン酸−β−ベンジルエステルを結合させた。５０％トリフルオロ酢酸（ジ クロロメタン溶媒）を用いる処理によってｔ−Ｂｏｃ保護基を脱離させ、次いで 、酸性度を洗浄によって中和した後、４−メチル吉草酸の代わりにオクタン酸を 固相上のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護して精製することによ って標記化合物を得た。ファブ質量分析による生成物の分子量は４９６．３ａ、 ■、ｕ、であつた（計算分子量：　４９６．３ａ、ｔｕ、）。

ペプチドアルデヒド（１０）を、実施例８に記載の手順に準拠して合成し、精製 した。

Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アス パラギン酸−β−ベンジルエステルを結合させた。５０％トリフルオロ酢酸（ジ クロロメタン溶媒）を用いる処理によってｔ−Ｂｏｃ保護基を脱離させ、次いで 、酸性度を洗浄によった中和した後、４−メチル吉草酸の代わりに３−フェニル プロピオン酸を固相上のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護して精 製することによって標記化合物を得た。ファブ質量分析による生成物の分子量は ５０２゜２ａ、鳳Ｕ、であった（計算分子量＋５０２．３ａ、閣、Ｕ、）。

ペプチドアルデヒド（１１）を、実施例８に記載の手順に準拠して合成し、精製 した。

Ｎ−Ｂｏｃ〜Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−ＢＯＣ−Ｌ−アス パラギン酸−β−ベンジルエステルを結合させた。５０％トリフルオロ酢酸（ジ クロロメタン溶媒）を用いる処理によってｔ−Ｂｏｃ保護基を脱離させ、次いで 、酸性度を洗浄によって中和した後、４−メチル吉草酸の代わりに、（＋／−） −２−メチル−３−フェニルプロピオン酸を固相上のペプチドにカップリングさ せた。さらに、脱保護して精製することによって標記化合物を得た。ファブ質量 分析による生成物の分子量は５１６．３　ａ、　ｔａ、　ｕ、であった（１１算 分子ｊｉ：５１６．３ａ、ｍ、ｕ、）。

実施例１２ Ｎ’−４１−シクロヘキシルアセチル）−Ｌ−アスパルチル−し−プロリル−し −アルギニナルの調製 ペプチドアルデヒド（１２）を、実施例８に記載の手順に準拠して合成し、精製 した。

Ｎ−Ｂｏａ−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アス パラギン酸−β−ベンジルエステルを結合させた。５０％トリフルオロ酢酸（ジ クロロメタン溶媒）を用いる処理によってｔ−Ｂｏｃ保護基を脱離させ、次いで 、酸性度を洗浄によって中和した後、４−メチル吉草酸の代わりに、シ知ヘキサ ン酢酸を固相上のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護して精製する ことによって標記化合物を得た。ファブ質鳳分析法による生成物の分子量は４９ ４．５ａ。

ｔｕであった（計算分子量＋　４９４．６ａ、ａ、ｕ、）。

実施例１３ Ｎ−（３−フエ：、ルブロピオニル）−Ｌ−グルタミル−し−プロリル−し−ア ルキペプチドアルデヒド（１３）を、実施例８に記載の手順に準拠して合成し、 精製した。

Ｎ−Ｂｏａ−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アス パラギン酸−β〜ベンジルエステルの代わりにＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸− β−ベンジルエステルを結合させた。５０％トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン 溶媒）を用いる処理によってｔ−Ｂｏｃ保護基を脱離させ、次いで、酸性度を洗 浄によつて中和した後、４−メチル吉草酸の代わりに、３−フェニルプロピオン 酸を固相上のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護して精製すること によって標記化合物を得た。ファブ買量分析法による生成物の分子量は５１６． ２ａ、ｔｕ、であった（計算分子量＋　５１６．３ａ、ｔｕ、）。

本発明による化合物の中間体を固相から脱離させる別の方法は実施例１４および １５において説明する。

害施例１４ Ｎ−（３−シクロヘキサンブロピオニル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリル− し−アルギニナルーセミ力ルバゾニルートランス−４−アミノメチルシクロベキ サ実施例８に記載の手順に準拠して、化合物（１４）を樹脂（７）上で合成した 。

Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アス パラギン酸−β−ベンジルエステルを結合させた。５０％トリフルオロ酢酸（ジ クロロメタン溶媒）を用いる処理によってｔ−Ｂｏｃ保護基を脱離させ、次いで 、酸性度を洗浄によって中和した後、４−メチル吉草酸の代わりに３〜シクロヘ キサンプロピオン酸を固相上のペプチドにカップリングさせた。

ＭＢＨＡ（メチルベンズヒドリルアミン）樹脂に保持されたペプチド３００＋ｇ を秤量してテフロン製円筒状反応容器に入れ、アニソール３００μＬを添加した 後、反応フラッシュをねじ山を介してＨＦ装置に取り付けた。無水ＨＦを一２０ ℃で容器内に凝縮させた。反応混合物を一２０℃で０．５時間磁気的に撹拌させ 、０℃まで昇温させた後、さらに１時間撹拌を続行した。ＨＦを窒素気流で除去 した後、粗製生成物を０．ＩＮ炭酸水素アンモニウム溶液５０ｍＬを用いて樹脂 から抽出した。この水性抽出物をジエチルエーテルを用いて洗浄しく３Ｘ２５■ ｌ）、凍結させ、次いで、凍結乾燥させることによって、粗製生成物を白色泡状 物として得た。このセミカルバゾンを逆相ＨＰＬＣ（粒径１０ミクロンで孔径３ ００オングストロームのＣ−１８カラムを使用）を用いて精製した。この場合、 水（１５ｓＭ炭酸水素アンモニウム含有水、ｐＨ７，１）−アセトニトリルを用 いる傾斜溶離を行った（アセトニトリルの濃度は４５分間で１５％から４０％に 変化させた）。カラム留分を分析用ＨＰＬＣを用いて分析し、生成物含有フラク ション（保持時間＝１８分間）を捕集し、凍結させ、次いで凍結乾燥させること によって白色粉末を６０ｍｇ（０，０８５ミリモル）得た。

セミカルバゾン（１４）６０ｏ＋ｇ（０，０８５ミリモル）を、ＴＦＡ水溶液（ ｐＨを１に緩衝化した水溶液）１４．１ｍＬと３７％ホルムアルデヒド（８，５ ミリモル、１００当量）６３６μＬとの混合物を用いて処理した。この処理混合 物を２３℃で０．５時間撹拌した後、０．２μｍフィルターを用いて濾過した後 、逆相ＨＰＬＣ（粒径が１０ミクロンで孔径が３００オングストロームのＣ−１ ８カラムを使用）を用いて精製した。この場合、水（０，１％トリフルオロ酢酸 含有）−アセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った（アセトニトリルの濃度は４ ５分間で１０％から３０％に変化させた。カラム留分を分析用ＨＰＬＣを用いて 分析し、生成物含有留分（保持時間、１７分間）を捕集し、凍結乾燥後、標記化 合物を２０ｍｇ（０，０３９ミリモル）得た。該生成物のマススペクトル分析に おいて、Ｍ＋ｌのピークは５０９、２ａ、ｍ、ｕ、に現れた。

ペプチドアルデヒド（１６）を、実施例１４および１５に記載の手順に準拠して 合成し、樹脂から脱離させ、脱保護し、精製した。

Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−アス パラギン酸−β−ベンジルエステルを結合させた。５０％トリフルオロ酢酸（ジ クロロメタン溶媒）を用いる処理によってｔ−Ｂｏｃ保護基を脱離させた後、酸 性度を洗浄により中和させ、次いで、４−メチル吉草酸の代わりに２−プロピル ペンタン酸を固相上のペプチドにカップリングさせた。さらに、脱保護して精製 することによって標記化合物を得た。ファブ質量分析法による生成物の分子量は ４９６゜２　ａ、　ｒｓ、　ｕ、であった（計算分子量＋　４９６．３ａ、ｍ、 ｕ、）。

本発明による特定の化合物の液相合成法は実施例１７〜４６において説明する。

１フ ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２２５ｍＬ中にカルボニルジイミダゾール（Ｃ ＤＩ）１６．２ｇ（０，１０モル）加えた溶液を室温で調製し、窒素雰囲気下で 撹拌した。

ＤＭＦ２２５＋ｅＬ中にｔ−プチルカルバゼート１３．２ｇ（０，１００モル） 加えた溶液を３０分間かけて滴下した。次いで、ＤＭＦ１００＋＋Ｌにジフェニ ルメチルアミン１８．３ｇ（０，１０モル）加えた溶液を３０分間かけて滴下し た。反応は窒素雰囲気下、室温において、撹拌下で１時間行った。この反応混合 物に水１０ｍＬを添加し、これを真空下で約１５０ｍＬまで濃縮した。このａｒ ｍ溶液を水５００■Ｌ中に注ぎ、酢酸エチル４００ＩＩＬを用いて抽出した。酢 酸エチル相を各々７５禦りのＩＮ　ＨＣＩ、Ｈ２０、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液お よびブラインを順次用いる抽出処理に２回付した後、Ｍｇ５（Ｌを用いて乾燥さ せた。この混合物を濾過処理に付し、濾液を濃縮して白色泡状物を２９．５ｇ得 た（収率８５％）。この生成物は酢酸エチル／ヘキサン混合溶媒を用いる再結晶 によって精製可能であったが、この状態でも次の反応工程で直接使用するのに十 分な純度であった［ｍｐ：１４２〜１４３℃：　Ｃ＋　＊　Ｈ２ｓ　Ｎ　３０３ に対する元素分析に計算値：Ｃ６６，８４、Ｈ６，７９、Ｎ１２゜３１（実測値 ：Ｃ６６，４６、Ｈ６，７５、Ｎ１２．９０）］。

化合物（１７）３．４３ｇ（１０ミリモル）をジクロロメタン１２．５１Ｌに加 えた溶液をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１２．５■Ｌを用いて０℃で処理し、こ の温度において３０分間撹拌した後、この溶液をエーテル７５■Ｌ中に滴下した 。沈澱物を形成させ、混合物を濾過処理に付した後、エーテルを用いて洗浄する ことによって粗製生成物（Ｑ：１８２〜１８４℃）を２．７ｇ得た。

実施例１９ α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ’−ニトローアルギニナルーセミカル バニ化合物（１８）２．６５ｇ（７，８ミリモル）および化合物（１）（α−Ｎ −（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ’−ニトロアルギニナル）２．３６ｇを水６ ＩＩＬ含有エタノール２０ｍＬに加えた溶液を酢酸ナトリウム１．２ｇ（８，８ ミリモル）を用いて処理し、１時間還流を行った。この溶液を冷却した後、水中 に注ぎ、次いで、酢酸エチルを用いて３回抽出した。−緒にした有機相を水、０ ．１Ｎ　ＨＣｌおよびブラインを用いて順次洗浄した後、ＭｇＳＯ４を用いて乾 燥し、次いで、濃縮した。白色固体状残渣をアセトニトリル 化合物（＋＋＋ｐ・７８〜７９℃）３．２ｇ得た（化合物（１８）に基づく収率 ニア８％）。

Ｎ１−ニトローアルギニナルーセミカルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタント 化合物（１９）０．　５　３ｇ（１．、　０ミリモル）をジクロロメタン５■Ｌ に加えた溶液をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）５鵬Ｌを用いて０℃で処理し、この 温度で３０分間撹拌した後、この撹拌溶液をエーテル４ｏ■Ｌ中に滴下した。沈 澱物を生成させ、この混合物を濾過処理に付し、エーテルを用いて洗浄すること によって、純粋な白色固体（ｍｐ：１５９〜１６０℃）を０．５１．ｇ得た（収 率：９７％）。

実施例２１ Ｌ−プロリン−９−フルオレンメチルエステルｐ−トルエンスルホン酸塩の調製 し一プロリン１５．９９ｇ（１３９．０ミリモル）、９−フルオレンメタノール ３０、　０ｇ（１５　２．　９　ミリモル）およびｐ−トルエンスルホン酸をト ルエン６００■Ｌに加えた溶液を還流させ、水をディーンースターク（Ｄｅａｎ 　−　Ｓ　ｔａｒｋ）　トラップを用いて除去した。２６時間後、反応生成物を 濃縮することによって油状物を６４ｇｉｌだ（粗収率：９９％）。該油状物は次 の反応工程においてそのまま使用した。

実施例２２ α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチル−β−ベンジルエステ ル−Ｌ−プロリン−９−フルオレンメチルエステルの調製Ｌープロリンー９ーフ ルオレンメチルエステルｐ−）ルエンスルホン酸塩（２１）１５、　４　４ｇ（ ３　３．　２ミリモル）、α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスノぐ ラギン酸−β−（ベンジルエステル）９．　３　５ｇ（４　１．　９ミリモル） およびベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホ スホニウム−へキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ試薬）　１８．　６ｇ（４　 ２．　０ミリモル）をＤＭＦ　ｉ　ＯＯ■Ｌに加えた溶液を水浴中で撹拌し、こ の撹拌溶液を１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物０．　４　５ｇ（３．　 ３　４ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン１９．０ＵＡＬ（１９８ミ リモル）を用いて処理した後、反応を撹拌下において、０〜５℃で１．５時間行 った。次いで、反応混合物を酢酸エチル６０ＱｍＬ中に注しＸだ後、クエン酸の 飽和水溶液、水、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液およびブラインを用いて順次 洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４を用いて乾燥した後、真空下で濃縮することによ って油状物を１８ｇ得た（粗収率：９１％）。該油状物はそのまま次の反応工程 で使用した。

実施例２３ α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アス１＜ルチル−β−（ベンジルエ ステル）」二紀の粗製油状物α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスノ くルチル−β−（ベンジルエステル）Ｌ−プロリン−９−フルオレンメチルエス テル（２２）１７。

５ｇ（２　９．　２　ミリモル）をトリエチルアミン２　５　０ｓ＋Ｌ中に懸濁 させ、還流を１時間行った後、この反応混合物を油状物まで濃縮し、これを酢酸 エチル６００１１Ｌに溶解させた。酢酸エチル相をクエン酸水溶液とブラインを 用いてそれぞれ１回ずつ洗浄し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させた後、濃縮して得 られた油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０〜２０％ＴＨＦ／ ＤＣＭ）によって精製することによって標記化合物を７．５ｇ得たし化合物（２ １）からの全収率３８％］。

α−Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエス テル）−Ｌ−プロリン（２　３）　１　１．　２　９ｇ（２　６．　９ミリモル ）をＤＭＦ６０■Ｌに溶解させた溶液をＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）１１． ９鵬Ｌ（１０８ミリモル）、ＢＯＰ　１１．　９ｇ（２　７ミリモル）および化 合物（２０）１４．６４ｇ（２８ミリモル）を用いて処理した後、撹拌下で２時 間反応を行った。反応混合物を酢酸エチル７００■Ｌ中に注ぎ、ＩＮクエン酸水 溶液、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液、水およびブラインを用いて順次洗浄した後、濃 縮することによって泡状物を得た。該泡状物をカラムクロマトグラフィー（シリ カゲル、６〜２０％ＩＰＡ／ＤＣＭ）によって精製することによって標記化合物 を１２。５ｇｉ１だ［化合物（２３）からの全収率：３８％］。

Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｎ’−二ト ロ０℃に冷却した５０％トリフルオロ酢酸溶液（ジクロロメタン溶媒）にα−Ｎ −（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル） −Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｎ’−ニトローアルギニナルーセミカルバゾニルー４−Ｎ −ジフェニルメタン（２４）を添加し、この温度で１．５時間撹拌した後、エー テル１０００■Ｌ中に注いで沈澱物を生成させた。該沈澱物を濾別し、エーテル で洗浄することによって標記化合物（２５）を得た。

Ｌ−アスパルチル−β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｎ’−ニト ロ−アルギニナルーセミ力ルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタン（２５）０． ９１ｇ（１，０８ミリモル）をＴＨＦ２０■Ｌに加えた溶液を乾燥ピリジン０． １６醜りおよび３−フェニルプロパノイルクロリド０．２９７■Ｌ（２，２ミリ モル）を用いて処理した後、湿気を遮断した雰囲気下で１時間撹拌した。この反 応混合物を水中に注いだ後、酢酸エチルを用いて抽出した。抽出物をＩＭ　ＨＣ Ｉ水溶液、水、ＮａＨＣＯｓ飽和水溶液およびＮａＣ１飽和水溶液を用いて順次 洗浄した後、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥し、次いで減圧下で濃縮し、該濃縮物をフ ラッシュクロマトグラフィー（イソプロパツールの１０％ジクロロメタン溶液） によって精製することにより３−フェニル（プロピオニル）−Ｌ−アスパルチル −β−（ベンジルエステル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｎ’−ニトローアルギニナル ーセミヵルバゾニル−４−Ｎ−ジフェニルメタンを０．７ｇ１Ｊｌだ。

実施例２７ Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル−し−プロリル−アルギ ニ実施例２６の化合物（２６）を、アニソール０．７０ｍＬと共にテフロン製の ）（Ｆ容器へ移し、乾燥窒素気流下で一７８℃まで冷却した。無水ＨＦ（約１０ ｍＬ）を該容器内に凝縮させ、反応は、撹拌下で系の温度を一２０℃まで昇温さ せた後、この温度に３０分間保持することによって行った。反応物の温度を０℃ まで昇温さｆ、ＨＦを乾燥窒素気流下で蒸発させた後、０．１Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ ３水溶液５０■Ｌを添加して得られた溶液をジエチルエーテルを用いて３回抽出 した。３−フェニル（プロピオニル）−Ｌ−アスパルチル−し−プロリル−し− アルギニナル−セミカルバゾンを含有する水性層を氷酢酸４．９膳し、ＬＭ　Ｈ ＣＩ水溶液５．６−Ｌおよび４７％ホルムアルデヒド水溶液２．７ｓ＋Ｌを用い て処理し、この粗製反応混合物を３００−一×５０１の混合型カラム［オールチ ク社（Ａｌｌｔｅｃｋ）製、カタログ＃Ｃ−６０００Ｂ］にかけ、５０醜Ｍリン 酸塩緩衝液を用いて溶離させた。標記化合物を含有する留分を一緒にした後、蒸 発処理に付して得られたペプチドアルデヒドを逆相ＨＰＬＣ（粒径１０ミクロン で孔径３００オングストロームのＣ−１８カラム）を用いる脱塩処理に付した。

この場合、トリフルオロ酢酸を各々０．１％含有する水とアセトニトリルを用い る傾斜溶離を行った（アセトニトリルの濃度は５〜４０％に変化さゼた）。カラ ム留分を分析用ＨＰＬＣを用いて分析し、純粋な生成物を含有する留分を捕集し 、これを凍結乾燥することによって標記化名物を得た。ファブ質量分析による生 成物の分子量は５Ｑ２ａ、ｍ、ｕ、であった（計算分子量＋　５０２ａ、ｍ、ｕ 、）。

２日 乾燥熱Δくメタノ−・ル（１００鵬Ｌ）を、窒素雰囲気下、水浴中で撹拌しなが ら、金属ナトリウム０．２６ｇ（１０，８ミリモル）を用いて処理した。金属ナ トリウムが溶解した後、α−Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエステ ル３．２ｇ（１０，０ミリモル）を無水メタノール２０ｉＬに加えた溶液を添加 し、この溶液を撹拌処理に付した後、ＴＬＣによるエステル交換反応に付した。

約２０時間後、氷酢酸１ｍＬを添加し、反応物を濃縮した。この残渣を０．５Ｍ 　ＨＣＩ水溶液中に注ぎ、酢酸エチルを用いて抽出した。酢酸エチル相を水およ びブラインを用いて順次洗浄し、Ｍｇ　Ｓ　Ｏａを用いて乾燥した後、濃縮させ て得られた生成物（約３ｇ）を次の反応工程において使用した。

実施例２９ α−Ｂｏｃ−Ｌ−アスパルチルーβ−（メチルエステル）−Ｌ−プロリンベンジ ルエ化合物（２８Ｊ（α−Ｂｏａ　−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル ））８．９ｇ（３６ミリモル）、ＢＯＰ１５．９ｇ（３６ミリモル）およびＬ− プロリンベンジルエステル８．７ｇ（３６ミリモル）をＤＭＦ９０ｍＬに加えた 溶液をＮＭＭ１９．７腸りを用いて処理した。この処理溶液を３時間撹拌し、Ｉ Ｍ　ＨＣＩ水溶液中に注いだ後、酢酸エチルを用いて抽出した。有機相をＬＭ　 ＭＣＩ水溶液、ＬＭ　ＮａＯＨ水溶液、水およびブラインを用いて順次洗浄し、 Ｎａｇ　Ｓ　０４を用いて乾燥した後、濃縮することによって粗製生成物を１６ ．８ｇ得た。該生成物の’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）のデータは次の通りである ：δ１．４２（ｓ、　９Ｈ）、２．０（ｍ、３Ｈ）、２．２（ｓ。

ＩＨ）、２．６５（ｍ、２Ｈ）、３．６７（ｓ、３Ｈ）、３．７６（ｍ、２Ｈ） 、４．５７（＊、ＩＨ）、４．８６　（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、５．１５（ｄｄ、　２ Ｈ）、５．４０（ｄ、ＩＨ）、７．３５（■、５Ｈ）。

実施例３Ｏ Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ・−アスパルチル−β−（メチルエステ ル）−化合物（２９）８．４ｇ（１９，３ミリモル）を７５％ＴＦＡ／ＣＨｓＣ １ｉｌＯＯｓＬに加えた溶液を水浴中で１．５時間撹拌した後、濃縮して油状物 を得た。この油状残渣をトルエンに溶解させ、これを濃縮して過剰のＴＦＡを除 去した。該濃縮物をＴＨＦ７５■Ｌに溶解させ、これに３−フェニルプロパノイ ル酸クロリド２１．６ミリモルを添加した後、Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ飽和水溶液１０ ０ｍＬを添加した。この混合物を７０分間激しく撹拌した後、酢酸エチルとＮａ ＨＣＯｓ飽和水溶液との混合物中に注ぎ、得られた混合物を振盪させ、有機相を 水およびブラインを用いて洗浄し、次いでＭｇＳＯ４を用いて乾燥した後、ａ縮 し、残渣をフラッシュクロマトグラ’：＃　−（０〜２％ＣＨｓＯＨ／ＣＨ２Ｃ ｌりによッテ精製した。ＴＬｃ（シリカ）によるＲｆは０．５であった（２％Ｍ ｅＯＨ／ＣＨｚＣ１ｚ）。

化合物（３０）２．８ｇ（６，０ミリモル）をメタノール１２５ｍＬに加えた溶 液に活性炭担持１０％パラジウム触媒２８０＋ｏｇを加え、これを振盪下におい て、水素ガス（１５ｐｓｉｇ）を用いて１．５時間処理した後、懸濁液を濾過処 理に付し、濃縮することによって標記化合物を得た。該化合物の’Ｈ−ＮＭＲ（ ＣＤＣＩｓ）のデータは次の通りである：δ２．１　（ｍ、　３　Ｈ）、２．２ （１，ＩＨ）、２．５３（ｔ、３）（）、２゜９Ｈｔ、３Ｈ）、２．６−２．９ （ｍ、　２Ｈ）、３．６５（ｓ、　３Ｈ）、３．７（ａ＋、２Ｈ）、４゜３８（ ｄｄ、　Ｉ　Ｈ）、４．８６（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、５．０５　（ｍ、　２　Ｈ）、 ７．２３（ａ＋、５Ｈ）、８．３フエニルメタンの調製 化合物（３１）１．７ｇ（４，５ミ’Ｊモル）、ＢＯＰ２．０ｇ（４，５ミ！Ｊ モル）および化合物（２０）２．３ｇ（４，５ミリモル）をＤＭＦ１３鵬りに加 えた溶液をＮＭＭ２．３１１Ｌを用いて処理した溶液を３時間撹拌し、次いで水 中に注いだ後、酢酸エチルを用いて抽出した。有機相をＩＭ　ＭＣＩ水溶液、Ｉ Ｍ　ＮａＯＨ水溶液および水を用いて順次洗浄し、Ｍｇ５Ｏ，を用いて乾燥した 後、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（０〜１０％ＣＨｓ　ＯＨ ／　ＣＩ４１　Ｃｌ　ｔ　）によって精製して得られた標記化合物は、メタノー ル１０％溶液（ジクロロメタン溶媒）を用いるシリカゲル上でのＴＬＣにおいて 、Ｒｆ＝０．３７の単一スポットを与えた。

実施例３３ Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル ）−実施例３２で得られた化合物（３２）全量をアニソール０，７０■Ｌと共に テフロン製ＨＦ容器内に移し、これを乾燥窒素気流中、−７８℃まで冷却し、次 いで無水ＨＦ（約１０ｓＬ）を該容器内に証縮させた。反応系の温度を０℃まで 高めた後、乾燥窒素気流下でＨＦを蒸発させた。次いで、Ｏ，ＬＭ　Ｎ８４ＨＣ Ｏ３水溶液５０■Ｌを添加し、得られた溶液をジエチルエーテルを用いて３回抽 出した。３−フェニル（プロピオニル）−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエス テル）−Ｌ−プロリル−■、−アルギニナル−セミカルバゾンを含有する水性相 を氷酢酸４．９ｍＬ。

ＩＭ　ＨＣＩ水溶液５．５ｍＬおよび４７％ホルムアルデヒド水溶液２．７■Ｌ を用いて処理した溶液を１時間撹拌することによってセミカルバゾンを加水分解 させ。

得られたペプチドアルデヒドを逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ（粒径１０ミクロンで孔径３０ ０オングストロームのＣ−１８カラム）を用いて精製した。この場合、トリフル オロ酢酸を各々０．１％含有する水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った （アセトニトリルの濃度は５％〜４０％に変化させた）。カラム留分を分析用１ −（Ｐ　Ｌ　Ｃを用いて分析し、純粋な生成物を含有する留分を捕集し、凍結乾 燥することによって標記化合物を得た。ファブ實量分析による該化合物の分子量 は５１６ａ、ｍ、ｕ、であった（計算分子量：　５１６ａ、Ｉｌ、ｕ、）。

実施例３４ Ｎ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル ）−化合物（３０）８．４ｇ（１９，３ミリモル）を７５％ＴＦＡ／ＣＨｚＣ１ ２１００ａ＋Ｌに加えた溶液を水浴中で１．５時間撹拌した後、濃縮して油状物 とした。この浦状物をトルエンに溶解させ、次いで該溶液を濃縮処理に付すこと によって過剰のＴＦＡを除去した。得られた濃縮物を、２−プロピルペンタン酸 ２，４４■Ｌ（１５，６ミリモル）、ＢＯＰ（６，９１ｇ）およびＮＭＭ（７８ ミリモル）をＤＭＦ３５■Ｌ中に加えた混合物中に添加し、これを１．２時間撹 拌した後、実施例３３と同様の処理を行った。生成物をフラッシュクロマトグラ フィー（１０〜５０に酢酸エチル／ヘキサン）によって精製することによって、 標記化合物を油状物（４０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるＴＬＣにおけるＲｆ ＝０．３）を２．０ｇ得た。

化合物（３４）２．０ｇ（４，３４ミリモル）をメタノール９ＱｍＬに加えた溶 液を、活性炭にＰｄを１０％担持させた触媒を用いて処理し、これを水素ガス（ １５ｐｓｉｇ）で１．５時間処理した。反応生成物を濾過処理に付した後、濃縮 することによって標記化合物（ａ＋ｐ１５７〜１５９℃）を得た。

化合物（３４）１．６７ｇ（４，５ミリモル）、ＢＯＰ２．Ｏｇ（４，５ミリモ ル）および化合物（２０）２．３ｇ（４，５ミリモル）をＤＭＦ１３ｍＬに加え た溶液をＮＭＭ２．　３ｔｉＬを用いて処理した。この溶液を２時間撹拌し、次 いで水中に注いだ後、酢酸エチルを用いて抽出した。有機相をＩＭ　ＨＣＬ　Ｉ Ｍ　ＮａＯＨ溶液および水を用いて順次洗浄し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥し、濃 縮後、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（０〜８％ＣＨ＊ＯＨ／ＣＨｔＣ１ ＊）により精製することによって標記化合物を１．２ｇ得た。該化合物は、ジク ロロメタン中にメタノールを１０％含有する溶媒を用いるシリカゲル上でのＴＬ Ｃにおいて、Ｒｆ＝０．５４の単一スポットを示した。

実施例３７ Ｎ−（３−フェニルプロパノイル）−Ｌ−アスパルチル−β−（メチルエステル ）実施例３６で調製した化合物（３６）を脱保護処理に付した後、実施例３３に 記載のようにして精製することによって標記化合物を得た。該化合物のファブ質 量分析による分子量は５１０．３ａ、■、ｕ、であつた（計算分子量：５１０． ３ａ、醜、Ｕ、）。

Ｂ ペプチドアルデヒドは当該分野では既知化合物である［パジャスッら、Ｆｏｌｊ ａＨａｅ＋＊ａｔｏ１．Ｌｅｉｐｚｉｇ、第１０９巻、第１６頁（１９８２年） ；バジャスッ、ｓｙ■ｐｏｓｉａ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｈｕｎｇａｒｉｃａ 、第２５巻、第２７７頁（１９８４年）：バジャスツら、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈ ｅｗ、　、第３３巻、第１７２９頁（１９９０年）〕。この化合物は、実施例Ａ およびＢのアッセイにおけるコントロールとして使用するために、次の方法によ って調製した。

ペプチドアルデヒド（３８）を実施例８に記載の手順に準拠して合成し精製した 。

Ｎ−Ｂｏａ−Ｌ−プロリンを樹脂（７）に結合させた後、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄ−フェ ニルアラニンを結合させた。最後のカップリング後の５０％トリフルオロ酢酸を 用いる処理は省略した。さらに、脱保護し、精製することによって標記化合物を 得た。

該化合物のファブ質量分析による分子量は５０２ａ、＋ａ、ｕであった（計算分 子量：５０２ａ、ｔｕ、）。

Ｂｏａ−Ｌ−アスパラギン２０．Ｏｇ（８６ミリモル；１当量）を乾燥ピリジン １２０ｍＬに溶解させ、次いでジシクロへキシルカルボジイミド２０．０ｇ（９ ７ミリモル、１．３当量）を乾燥ピリジン６０ｍＬに溶解させた溶液を３０分間 かけて滴下した。反応は、２３℃において撹拌下で３時間おこない、反応混合物 はナイロン製フィルター（２μｍ）を用いる濾過処理に付し、濾液を回転減圧蒸 発器を用いて濃縮し、該濃縮液に水１００＋Ｌを加えた。この溶液のｐＨを、４ ０％ＮａＯＨ水溶液を用いて１０に調節した後、さらにナイロン製フィルター（ ２μ−）を用いる濾過処理をおこなった。濾液をＤｏｗｅｘ５０Ｘ８−４００イ オン交換樹脂床（１２０ｓＬ）を通過させ、該樹脂を、カラム体積の４倍量の混 合溶媒（メタノール：水＝１：１）を用いて洗浄した。濾液を真空下で濃縮する ことによって、標記化合物を白色固体として１７５ｇ得た（収率：９５％）。生 成物の’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ｓ　ＯＤ）は次の通りである：４．４０ｐ、ｐ 、■、（■、ＩＨ）；２．　９５ｐ、ｐ、ｗ、（１１，２Ｈ）：１．４０ｐ、ｐ 、ｍ、（ｓ、　９Ｈ）。

実施例４０ ３−テトラゾリル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）メタンアミドプロピオン ３−ンアノー２−（１，１−ジメチルエトキシ）メタンアミド−プロピオン酸（ ３９）１７．５ｇ（８２ミリモル、１当量）をＴＨＦ１２５ｍＬに溶解させ、次 いで、トリブチル錫アジド４０．５ｇ（１２９ミリモル：１，５当量）を添加し た。反応混合物を３日間還流させた後、揮発分を回転減圧蒸発器を用いて除去し た。残渣を０゜５ＭＮａＯＨ水溶液３００ｍＬ中に溶解させ、この水溶液を酢酸 エチルを用いて洗浄した（４Ｘ１００ｍＬ）。水性層をＤｏｖｅｘ５０Ｘ８−４ ００イオン交換樹脂床（１２５■Ｌ）を通過させ、該樹脂をカラム体積の４倍量 の混合溶媒（メタノール：水＝１＝１）を用いて洗浄した。揮発分を回転減圧蒸 発器を用いて除去することによって標記化合物を白色固体として１７．９ｇ得た （収率：８５％）。生成物のＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤｓＯＤ）のデータは次の通りで ある：４．　５５ｐ、ｐ、亀（ｓ、　Ｉ　Ｈ）：３．　４０ｐ。

ｐ、ｔ（ｍ、２Ｈ）；１．　４０ｐ、ｐ、１．（ｓ、９Ｈ）。この化合物は固相 ペプチド合成法に使用するのに適している。

実施例４１ ３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾリル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）メタ ンアミドプロピオン酸メチルエステルおよび３−（Ｎ−３−メチル）テトラゾリ ル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）メタン−アミドプロピオン酸メチルエス テルの３−テトラゾリル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）メタン−アミドプ ロピオン酸（４０）１．５ｇ（５，８ミリモル；１．０当量）を乾燥ＤＭＦｉ３ ＠Ｌに溶解させ、次いで、炭酸セシウム３．　９ｇ（１２，０ミリモル：２．１ 当量）を添加した後、ヨウ化メチル９３０μ１（１４，５ミリモル；２．５当量 ）をンリンジを用いて添加ｊノだ。この反応混合物を２３℃で３時間撹拌し、次 いで０．５Ｍ　ＨＣｌ５０＋ｍＬ中に注いだ後、酢酸エチルを用いて抽出した（ ３　Ｘ　５　Ｃ１＋Ｌ）。−緒にした有機相を０．５Ｍ　ＭＣＩ、ＮａＨＣＯｓ の飽和水溶液５０ｍｌ、およびブライン５０ｍＬを出いて順次洗浄し９、硫酸す ）・リウムを用いて乾燥させた後、有機相をデカントさせ、揮発分を回転減圧蒸 発器を用いて除去することによって標記化合物の混合物を黄色油状物とし、て得 た。該異性体はシリカ上でのクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン ）によって分離させｔ−０一方の異性体が最初に溶出した（Ｒｆ＝０．　３）。

他方の異性体のＲｆは０．１５である。純粋な生成物を含有する留分を一緒にし 、揮発分を回転蒸発器によって除去することによって、純粋な各標記化合物を０ ６０ｇ得た。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１，）のデータは以下の通りである：（二番 目に溶出した異性体） ５、８ｐ、ｐ、ｍ、（ｄ、ＩＨ）；４．　７５ｐ、ｐ、園、（ｍ、ＩＨ）；４． 　０５ｐ、ｐ、ｍ、（ｓ、　３Ｈ）；３゜７５ｐ、ｐ、ｍ、　（ｓ、　３　Ｈ） ；３．４１）ｐ、閣（ｓ、２Ｈ）；１．　５ｐ、ｐ、ｗ、（ｓ、９Ｈ）。

（最初に溶出した異性体） ５、　７５ｐ、ｐ、ｍ、（ｄ、ＩＨ）；４．　７５ｐ、ｐ、■、（■、ＩＨ）； ４．３０ｐ、ｐ、ｓ、（ｓ、３Ｈ）：３、７５ｐ、ｐ、ｍ、（ｓ、３Ｈ）；３． 　６５ｐ、ｐ　腸−（ｍ、２Ｈ）；１．　７ｐ、ｐ、ｍ、（ｓ、９Ｈ）。

４２人　４２Ｂ ３−（Ｎ−２−メチル）テトラゾリル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）−メ タンアミドプロピオン酸メチルエステルまたは３−（Ｎ−３−メチル）テトラゾ リル−２−（１，１−ジメチルエトキン）−メタンアミドプロピオン酸メチルエ ステル１５ｇ（１，７５ミリモル：１．０当量）をメタノール１２＋Ｌに溶解さ せ、次いで１．ＯＭ　ＬｉＯＨ水溶液２．３閤Ｌ（１，３当量）を添加し、２３ ℃で撹拌を２時間おこなったところ、出発物質はＴＬＣ分析（シリカゲル上での １：ＩＥｔＯＡｅ／ヘキサン）によって確認できなかった。反応混合物をＤｏｖ ｅｘ５ＱＸ８　４００イオン交換樹脂床（１０■Ｌ）を通過させ、該樹脂を、カ ラム体積の４倍量の溶媒（メタノール：水＝１：１）を用いて洗浄した。溶媒を 減圧下で除去させることによって標記化合物を得た。

３−テトラゾリル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）−メタンアミドプロピオ ン酸（４０）１．６６ｇ（６，５ミリモル；１当量）を乾燥ＴＩ−ｆＦ２６ｍＬ に溶解させ、次いで、カルボニルジイミダゾール３．１４ｇ（１９，４ミリモル ：３当量）を添加し、さらに、イミダゾール８８■ｇ（１，３ミリモル；０．２ 当量）を添加し、反応混合物を２３℃で３．５時間撹拌した。さらにメタノール ２０■Ｌを加えた混合物を０．　５時間撹拌した。揮発分を回転減圧蒸発器を用 いて除去した後、粗製生成物を酢酸エチル１００ｍＬに加えた。有機相を０．５ Ｍ　ＨＣＩを用いて洗浄しく２Ｘ２５ｍＬ）、硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ 、デシカント（ｄｅｓｓｉｃａｎｔ）からのデカンテーションの後、有機相を真 空下で濃縮させ、生成物をシリカ上でのクロマトグラフィー（２〜１０％ＭｅＯ Ｈ／ＣＨｚＣ１＊、１％酢酸）によって精製することによって標記化合物を７２ ０ｍｇ１ｌた。該化合物のＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）のデータは次の通りであ る＋５．　８ｐｐｍ（ｄ、　Ｉ　Ｈ）、　４．　７５ｐｐｍ（ｓ、　Ｉ　Ｈ）、 　３．　８ｐｐｍ（ｓ。

３　Ｈ）、　３．　５５ｐｐｍ（ｍ、　２Ｈ）、　１．　４ｐｐｍ（ｓ、　９　 Ｈ）。

実施例４４ ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（１，１−ジメチル エトキシ）メタンアミドプロピオン酸メチルエステルおよび３−（Ｎ−３−ベン ジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）メタンア ミドプロ３−テトラゾルー２−（１，１−ジメチルエトキシ）−メタンアミドプ ロピオン酸メチルエステル（４３）１．２８ｇ（４，７ミリモル；１当量）を乾 燥ＴＨＦ９．５ｍｌ、に加え、次いで、ベンジルオキシメチルクロリド０．６５ ＋５Ｌ（５，６ミリモル；１．２当量）をシリンジを用いて添加した後、ジイソ プロピルエチルアミン１．０５ａＬ（６，１ミリモル；１．３当量）を添加した 。この反応混合物を２３℃で１時間撹拌した後、酢酸エチル１．ＯＯｍＬを用い て希釈した。有機相をＱ、５ＮＨＣ１（２Ｘ　５０＋ｏＬ）、ＮａＨＣＯ３飽和 水溶液（５０ａＬ）およびブライン（５０ａＬ）を用いて順次洗浄した後、硫酸 ナトリウムを用いて乾燥させた。有機相をデカントし、減圧下で濃縮した。濃縮 物をクロマトグラフィー（１：Ｉ　ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：シリカ）によって処 理することによって標記化合物を得た（Ｒｆ＝０．４の留分・１．０５ｇ、Ｒｆ ＝０．２５の留分：０．６７ｇ）。いずれの異性体も以後の反応で使用する３− （Ｎ−２−ベンジルオキツメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロステ ルの調製 ４−メチル吉草酸２．ＯｇをオキサリルクロリドＩＯ＋Ｌに加え、この混合物を ２３℃において、窒素雰囲気で一夜撹拌した後、乾燥トルエン１００■Ｌを添加 し、揮発分を減圧下で除去することによって酸クロリドを得た。該酸クロリドは 以下のようにして使用した。

３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（１，１−ジメチル エトキシ）メタンアミド−プロピオン酸メチルエステルまたは３−（Ｎ−３−ベ ンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（１，１−ジメチルエトキシ）メタン アミド−プロピオン酸メチルエステル（４４）１．０ｇ（２，５ミリモル；　１ 当量）を−５℃でトリフルオロ酢酸１０ｍＬに加え、この溶液を０．５時間撹拌 した後、減圧下で濃縮した。粗製トリフルオロ酢酸塩をトルエンと混合し、再度 濃縮することによって残余のトリフルオロ酢酸を除去した。粗製トリフルオロ酢 酸塩を乾燥ＴＨＦ５１１Ｌに加え、次いで、前述のようにして調製した４−メチ ルバレロイルクロリド０、５２ｇ（３，８ミリモル：１．５当量）を加えた後、 トリエチルアミン１．０７鳳りを添加した。この反応混合物を２３℃で２時間撹 拌した後、酢酸エチル５０■Ｌで希釈した。有機相を領５Ｍ　ＨＣＩ（２Ｘ２５ ｗＬ）、Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ飽和水溶液（２５曽Ｌ）およびブライン（２５ａＬ） を用いて順次洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。デカンテーション 後、有機相を減圧下で濃縮し、次いで、クロマトグラフィー（１：Ｉ　ＥｔＯＡ ｃ／ヘキサン；シリカ）により精製することによって標記化合物を得た。

実施例４６ ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロ イルアミド）プロピオン酸または３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラ ゾ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレ ロイルアミド）プロピオン酸メチルエステルまたは３−（Ｎ−３−ベンジルオキ シメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバー０イルアミド）プロピオン酸メ チルエステル（４５）の領１５Ｍメタノール溶液に１．５当量の１ＭＬｉＯＨ水 溶液を添加した。反応混合物を出発物質がＴＬＣによって検出されなくなるまで 撹拌しく約３時間）、次いで、Ｄｏｗｅｘ　５０Ｘ８−４００イオン交換樹脂を 通過させ、該…脂をカラム体積の４倍量の溶媒（１：１メタノール／水）を用い て洗浄し、濾液を減圧下で濃縮することによって対応する標記化合物を得た。

Ｎ’−ニトローアルギナルーセミカルバゾニルー４−Ｎ−ジフェニルメタントリ フルオロ酢酸塩（２０）５．０ｇ（９，６ミリモル：　１当量）、Ｎ−ｔ−ブト キシカルボニル−し−プロリン２．１５ｇ（１１，５ミリモル；１．２当量）、 ＢＯＰ試薬５゜５３ｇ（１２，５ミリモル；１．３当量）およびＮ−ヒドロキシ ベンズトリアゾールモノハイドレート０．１５ｇ（０，９６ミリモル；０，１当 量）を乾燥ＤＭＦ３８■Ｌに加え、次いで、Ｎ−メチルモルホリン６．３閣Ｌ（ ５７，６ミリモル；６当量）をシリンジを用いて添加した。反応混合物を３時間 撹拌した後、酢酸エチル３００■Ｌで希釈した。有機相を４Ｍ　ＨＣＩ（３０醜 Ｌ）、１ＭＮａＯＨ水溶液（２Ｘ３０謹Ｌ）およびブライン（３０■Ｌ）を用い て順次洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。有機相をデカントした後 、減圧下で濃縮することによって粗製生成物を得た。該生成物はクロマトグラフ ィー（１：１０　ＭｅＯＨ／メチレンクロリド：シリカ）によって精製した。

実施例４８ ３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロ イルアミド）プロピオノイル−し−プロリル−Ｌ−Ｎ”−ニトローアルギニナル ーセミカルバゾニルー４−Ｎ−ジフェニルメタンまたは３−（Ｎ−３−ベンジル オキシメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオノ イル−し−プロリル−Ｌ−Ｎ’−ニトローアルギニナルーセミカルバゾニル−４ −Ｎ４日 Ｂｏｃ−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｎ’−ニトローアルギニナルーセミカルバゾニルー ４−Ｎ−ジフェニルメタン（４７）２．５ミリモル（１当量）を−５℃でトリフ ルオロ酢酸１０■Ｉ７に加え、この溶液を０．５時間撹拌した後、減圧下で濃縮 した。粗製トリフルオロ酢酸塩をトルエンと混合し、再濃縮によって残余のトリ フルオロ酢酸を除去した。３−（Ｎ−２−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル −２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸または３−（Ｎ−３−ベン ジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピ オン酸（４６）３ミリモル（１，２当量）、ＢＯＰ試薬３．２５ミリモル（１， ３当量）およびＮ−ヒドロキシベンズトリアゾールモノハイドレート０．２５ミ リモル（０，１当量）を乾燥ＤＭＦ１０ａＬに加え、次いで、Ｎ−メチルモルホ リン１５ミリモル（６当量）をシリンジを用いて添加した。反応混合物を３時間 撹拌した後、酢酸エチル１００ｍＬで希釈した。有機相をデカントした後、減圧 下で濃縮することによって粗製生成物を得た。該生成物をクロマトグラフィー（ １：１０　ＭｅＯＨ／メチレンクロリド；シリカ）により精製することによって 対応する標記化合物を得た。

実施例４９ ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオノイル−Ｌ− 上記の実施例で得られた全生成物（４８）をアニソール０．７０■Ｌと共にテフ ロン製！（Ｆ容器内に入れ、乾燥窒素気流下で一７８℃まで冷却し、無水ＨＦ（ 約１０＠Ｌ）を該容器内で凝縮させ、反応混合物を撹拌した後、−２０℃まで昇 温させ、この温度に３０分間保持した。反応混合物を０℃まで昇温させ、乾燥窒 素気流下でＨＦを蒸発させた後、０、ＩＭ　ＮＨ＜ＨＣＯｓ水溶液５０＋ａＬを 加え、得られた溶液をジエチルエーテルを用いて３回抽出した。２−（４−メチ ルバレロイルアミド）プロピオノイル−し−プロリル−し−アルギニナルセミカ ルバゾンを含有する水性相を氷酢酸４．９ｍＬ、ＬＭ　ＨＣＩ水溶液５．５ｍＬ および４７％ホルムアルデヒド水溶液２．７ｍＬを用いて処理した。この溶液を １時間撹拌することによってセミカルバゾンを加水分解させた。得られたペプチ ドアルデヒドを、粒径が１０ミクロンで孔径が３００オングストロームのＣ−１ ８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。この場合、トリフルオロ酢酸 をそれぞれ０．１％含有する水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った（ア セトニトリルの濃度は５〜４０％の間で変化させた）。カラム留分を分析用ＨＰ ＬＣによって分析し、純粋な生成物を含有する留分を捕集し、凍結乾燥すること によって標記化合物を得た。

該化合物は実施例５０〜５６に記載の方法によって合成してもよい。

Ｃｂｚ−Ｌ−アスパラギン１５．　Ｏｇ（５６，４ミリモル；　１当量）を乾燥 メチレンクロリド１００ｍＬに溶解させた溶液にオキサリルクロリド５０＋Ｌ（ ５７３ミリモル、１０当量）を１０分間かけて滴下した。反応を２３℃において 撹拌下で４時間行った後、揮発分を回転減圧蒸発器を用いて除去し、次いで、メ タノール１００■Ｉ、を加え、この混合物を２３℃において０．５時間撹拌しま た。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗製生成物をフラッシュクロマトグラフィー （０〜５％メタノール／メチレンクロリド）によって精製することによって標８ 己化合物を１２．４５ｇ得た。該化合物の’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）のデータ は次の通りであるニア、４＋）、９゜１１（！１．５Ｈ）、　６．　：１．り、 １）、ｍ（ｄ、１．　Ｈ）、　５．８ｐ、ｐ、ｍ（ｄ、２Ｈ）、　５．１ｐ、ｐ 、ｍ（ｓ、２Ｈ）A ４、６ｐ、ｐ、ｓ＋（ｔ　Ｉ　Ｈ）、３．７５ｐ、ｐ、ｓ（ｓ、　３Ｈ）、２． ８５ｐ、ｐ、ｍ（ｍ、　２Ｈ）。

Ｃｂｚ−Ｌ−アスパラギンメチルエステル（５０）５．０ｇ（１７，９ミリモル ；１当量）を乾燥ピリジン１０■Ｌに溶解させた溶液にベンゼンスルホニルクロ リドをシリンジを用いて添加した。反応を５０℃において撹拌下で３時間行った 後、ＩＭＨＣＩ　５０■Ｌを加え、水溶液を酢酸エチルを用いて抽出した（２Ｘ １００■Ｌ）。

有機相を一緒にし、ＬＭ　ＨＣＩ　５０■Ｌ、ＮａＨＣＯｓ飽和水溶液５０−Ｌ およびブラインを用いて順次洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。デ カンテーション後、有機相を減圧下で濃縮した。粗製生成物をフラッシュクロマ トグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／メチレンクロリド、Ｒｆ＝０．４５）により 精製することによって標記化合物を４．１ｇ得た。該化合物の’Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ ＤＣ１３）のデータは次の通りである＋　７．４ｐ、Ｉ）、＋ａ（ｍ、　５１（ ）、５．７ｐ、ｐ、ｍ（ｍ、　Ｈ（）、５　、１　ｐ、　ｐ、　ｍ（ｓ。

２Ｈ）、４．６ｐ、ｐ、ｍ（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、３．８ｐ、ｐ、ｗ（ｓ、　３Ｈ） 、３．　Ｏｐ、ｐ、ｍ（ｍ、　２Ｈ）。

実施例５２ ３−テトラゾリル−２−ベンジルオキシメタンアミドプロピオン酸メチルニス３ −シアノ−２−ベンジルオキシメタンアミドプロピオン酸メチルエステル（５１ ）２．５ｇ（９，４５ミリモル：１当量）を乾燥ＴＨＦ１０ｓＬに溶解させた溶 液にトリーｎ−ブチル錫アジド３．　Ｏｇ（９，５４ミリモル；１当量）を添加 した。反応を７２時間還流させることによって行った後、減圧下で濃縮した。１ ＭＮａＯＨ水溶液５０ｍＬを添加した後、酢酸エチルを用いる抽出処理（３Ｘ　 ５０ｍＬ）を行った。

水溶液のｐＨを４Ｍ　ＨＣＩを用いて１にした後、酢酸エチルを用いて抽出した （４×６０■Ｌ）。硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、有機相をデカントし、 減圧下で濃縮することによって標記化合物を２．５ｇ得た。該化合物の’Ｈ−Ｎ ＭＲ（ＣＤＣ１，）のデータは次の通りであるニア、ａｐ、ｐ、鳳（鵬、５Ｈ） 、６．１９．ｐ、冒（−、Ｉ　Ｈ）、５．１ｐ、ｐ、ｍ（ｓ、２Ｈ）、　４．８ ｐ、ｐ、ｍ（＋＋、ｌ　Ｈ）、　３．８ｐ、ｐ、ｍ（ｓ、３Ｈ）、　３．５ｐ、 ｐ、５（（３−テトラゾリル−２−アミノプロピオン酸メチルエステルヒドロク ロリドの３−テトラゾリル−２−ベンジルオキシメタンアミドプロピオン酸メチ ルエステル（５２）０．５３ｇ（１，７４ミリモル；１当量）をメタノール３ｏ ＩＩＬニ溶解サセた溶液に濃塩酸１ｍＬを添加した。反応容器内に窒素ガスを流 し、活性炭にＰｄを１０％担持させた触媒８０ｅ１ｇを添加した後、４Ｑｐｓｉ の条件下で水素化を２時間行った。触媒を濾去した後、減圧下で濃縮することに よって標記化合物を３５４ｍｇ得た。該化合物のＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）の データは次の通りである：４．７ｐ。

ｐ、　＋ｉ（ｍ、Ｌ　Ｈ）、　３．　８ｐ、ｐ、ｍ（ｓ、３Ｈ）、　３．　６ｐ 、ｐ、＋ａ（ｍ、２　夏］）。

実施例５４ ３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸メチルエ ステルの調製 ３−テトラゾリル−２−アミノプロピオン酸メチルエステルヒドロクロリド（５ ３）３５３−ｇ（１，７４ミリモル：　１当量）、４−メチル吉草酸２６２μＬ （２，０９ミリモル；１．２当量）、ＢＯＰ試薬１．０ｇ（２，２６当量）およ びＮ−ヒドロキシベンズ１−リアゾールモノヒトレート２７ｍｇ（０，１７４ミ リモル；０．１当量）を乾燥ＤＭＦ５ｍＬに加え、次いで、Ｎ−メチルモルホリ ン９６０μＬ（８，７ミリモル、５当量）をシリンジを用いて添加した。反応混 合物を２３℃で１８時間撹拌した後、酢酸エチル１０ＱｍＬを用いて希釈した。

有機相をクエン酸２０％水溶液（１０ｍ＋Ｌ）およびブライン（１０■Ｌ）を用 いて洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。デカンテーション後、有機 相を減圧下で濃縮し、粗製生成物をシリカ上でのクロマトグラフィー［ＭｅＯＨ ／メチレンクロリド（２〜１０％、１％酢酸）］により精製することによって標 記化合物を２３０ｍｇ得た（Ｒｆ＝０．３０；１０％ＭｅＯＨ／メチレンクロリ ド、１％酢酸）。該化合物の’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）のデータは次の通りで ある：　７．　Ｏｐ、ｐ、ｌｌ（ｄ、　Ｉ　Ｈ）、５．０５ｐ、Ｉ）、＋ｉ（＋ ａ、ＩＨ）、３゜８　ｐ、　ｐ、　ｏ＋（ｓ、　３　Ｈ）、３．６ｐ、ｐ、＋ａ （ｍ、　２Ｈ）、１．５ｐ、ｐ、ｍ（ｍ、　３Ｈ）、０．８ｐ、ｐ、＋ｏ（ｄA 　６ Ｈ）。

３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン酸メチルエ ステル（５４）５１＋ｇ（０゜１９ミリモル；　１当量）および水酸化リチウム １６易ｇ（０゜３８ミリモル：２当量）を水１．５ｍＬに加え、撹拌を２時間行 った後、ＩＭＨＣｌを３５μＬ添加し、この溶液を減圧下で濃縮することによっ て標記化合物を得た（以下の反応においては、この化合物はそのまま使用した） 。該化合物の１）（−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）のデータは次の通りである：４．６ ｐ、ｐ、■（ｍ、ＩＨ）、３．４ｐ、ｐ。

ｍ（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、３．２ｐ、ｐ、１１（＋＋＋、　ＩＨ）、２．１５（ａ、 　２Ｈ）、１．４ｐ、ｐ、ｓ（ｍ、　３Ｈ）、０゜８ｐ、ｐ、ｌｌ（ｄ、　６Ｈ ）。

実施例５６ ３−（Ｎ−３−ベンジルオキシメチル）テトラゾリル−２−（４−メチルバレロ イルアミド）プロピオノイル−し−プロリル−Ｌ−Ｎ’−ニトローアルギニナル ーセミカルバゾニルー４−Ｎ−ジフェニルメタンの調製Ｂｏｃ−Ｌ−プロリル− Ｌ−Ｎ”−ニトローアルギニナルーセミ力ルバゾニル−４Ｎ　’））エールメタ ン（１９）１２０ｍｇ（０，２８ミ’Ｊモル；　１当量）を−５℃でトリフルオ ロ酢酸５ｍＬに加え、これを０．５時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。粗製ト リフルオロ酢酸塩をトルエンと混合し、再濃縮により残余のトリフルオロ酢酸を 除去した。３−テトラゾリル−２−（４−メチルバレロイルアミド）プロピオン 酸（５５）４８ｍｇ（０，２３ミリモル；１．２当量）、１−（３−ジメチルア ミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド４８１ｇ（０，２５ ミリモル：１．３当量）および４−ジメチルアミノピリジン２＋ｇ（０，０２ミ リモル二０゜１当量）を乾燥ＤＭＦ３ｍＬに加え、次いで、ジイソプロピルエチ ルアミン１００μＬ（０，５７ミリモル；３当量）をシリンジを用いて添加した 。反応混合物を２３℃で１８時間撹拌した後、クエン酸２０％溶液１０■Ｌ中に 加えた。この水性液を酢酸エチルを用いて抽出しく６Ｘ１５腸Ｌ）、−緒にした 有機相を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。デカンテーシ町ン後、有機相を減 圧下で濃縮し、粗製生成物を２■瀞の分取ＴＬＣシリカゲルプレート上でのクロ マトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／メチレンクロリド、１％酢酸）によって処理 した。Ｒｆが０．２５のバンドを１０％メタノール／酢酸エチルに溶解させた後 、濾過し、揮発分を減圧下で除去することによって、標記化合物を３０■ｇ得た 。該化合物のＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ）のデータは次の通りであるニア、３ｐ 、ｐ、−（■、１０Ｈ）、７．ｉｐ、ｐ、濡（ｄ、ＩＨ）、６．１ｐ、ｐ、ｓ（ ｓ、　Ｉ　Ｈ）、４．７ｐ、ｐ、＋ｗ（ｍ、　Ｉ　Ｈ）、４．５ｐ、ｐ、＊（ｍ 、　Ｉ　Ｈ）、４．３ｐ。

ｐ、　＠（ｍ、　ｌ　Ｈ）、３．６ｐ、ｐ、＊（閣、ＩＨ）、３．２ｐ、ｐ、ｗ （■、２Ｈ）、２．８ｐ、ｐ、＋ｇ（ｓ、　ＩＨ）、２、ｉｐ、ｐ、ｗ（−１３ Ｈ）、　１．２−１．９ｐ、ｐ、閣（膳、１３Ｈ）。

実施例５６において得られた全化合物（５６）をアニソール０．７０＋ｏＬと共 に、テフロン製ＨＦ容器内に入れ、乾燥窒素気流下で一７８℃まで冷却した後、 無水＋−ＩＦ（約１０＋＋Ｌ）を該容器内で凝縮さぜた。反応混合物を撹拌し、 次いで、−２０℃まで昇温させ、この温度で３０分間保った後、０℃まで昇温さ せ、乾燥窒素気流下でＨＦを蒸発させた。ＨＦを蒸発させた後、０．１Ｍ　ＮＨ ４ＨＣＯ３Ｈ４ＨＣＯ３水溶液５リ −（バレロイルアミド）プロピオノイル−し−プロリル−Ｌ−アルギニナル−セ ミカルバゾンを含有する水性相を氷酢酸４．９■Ｌ，ＩＭ　ＨＣＩ水溶液５．６ ■Ｌおよびホルムアルデヒド４７％水溶液２．７■Ｌを用いて処理した後、１時 間撹拌してセミカルバゾンを加水分解させた。得られたペプチドアルデヒドを、 粒径が１０ミクロンで孔径が３００オングストロームのＣ−１８カラムを用いる 逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。この場合、トリフルオロ酢酸をそれぞれ０．１ ％含有する水とアセトニトリルを用いる傾斜溶離を行った（アセトニトリルの濃 度は５〜４０％の間で変化させた）。分析用ＨＰＬＣを用いてカラム留分を分析 し、純粋な生成物を含有する留分を捕集し、凍結乾燥することによって標記化合 物を得た。

ファブ質量分析による該化合物の分子量は４　９　２ａ．ｍ．ｕ．であった（計 算分子量：４９２ａ．■，Ｕ、）、。

トロンビン、因子Ｘａおよびプラスミンの触媒活性に対するインヒビターとして の本発明化合物の障害能は、精製したヒト酵素の酵素活性の５０％を阻害する濃 度（　Ｉ　Ｃｓ５）を決定することによって評価した。

全てのアッセイにおいては、緩衝液としてＨＢＳＡ（ＨＥＰＥＳ　１０■Ｍ，ｐ Ｈ７、５、塩化ナトリウム１５０ｍＭ，牛血清アルブミン）を使用した。ＩＣ， 、を決定するアッセイは、適当なウェルを有するコーニング社製のマイクロタイ タープレートにおいて、ＨＢＳＡ　５０μＬ，ＨＢＳＡで希釈した広範囲にわた る特定濃度の被験化合物溶液［非阻害速度Ｖｏを測定する場合にはＨＢＳＡのみ ］５０μＬおよびＨＢＳＡで希釈した酵素５０μＬを混合することによって行っ た。周囲温度においてインキュベーションを３０分間行った後、以下に記載する 特定濃度の基質５０μＬをウェル内に加え、最終的な全体積を２００μＬとした 。発色性基質の加水分解の初期速度は、４０５１ｍにおける吸光度の変化を、カ イネティック・マイクロプレート・リーダー［テルモ・マックス（Ｔｈｅｒｍｏ 　ＭａｘＸ登録商標）」を用いて５分間（この間、添加した基質の５％以下の酵 素が消費された）測定することによって決定した。加水分解の初期速度を５０％ 低下させる添加インヒビターの濃度をＩ　Ｃｓｅとして定義した。

トロンビンアッセイ トロンビンの触媒活性は、発色性基質ペファクロム（Ｐｅｆａｃｈｒｏ＋５ｅ） ｔ　−　ＰＡ［ＣＨ，Ｓｏ，−Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシル−し−アル ギニン−ｐ−ニトロアニリ；ペンタファーム社（Ｐｅｎｔａｐｈａｒ＋＋　Ｌｔ ｄ．　）製］を用いて測定した。この基質はアッセイに先立って、脱イオン水と 混ぜた後、ＨＢＳＡを用いて、最終的な濃度が３００ａＭ（約１０倍のＫ１１） になるように希釈した。精製したヒトのα−トロンビンとしては、エンザイム・ リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ．　Ｉｎｃ．　）製のものを使用した。この酵素は、アッセイに先 立７てＨＢＳＡを用いて、最終濃度が０．２５ＨＭになるように希釈した。

因子Ｘａアッセイ 因子Ｘａの触媒活性は、カビ・ジアグノスチカ社（Ｋａｂｉ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｊｃａ）製の基質ｒＳ　２　７　６　５Ｊ（Ｎ−α−ベンジルオキシカルボニル −Ｄ−アルギニニル−Ｌ−グリンルーし一アルギニンーｐーニトロアニリドジヒ ドロクロリド）を用いて測定した。この基質はアッセイに先立って、脱イオン水 と混ぜた後、Ｈ　Ｂ　Ｓ　Ａを用いて、ｉ＆終濃度が２５０ＩＪＭ（約５倍のＫ ｍ）になるように希釈した。ヒトの因子Ｘａは、エンザイム・リサーチ・ラボラ トリーズ社製の精製したヒトの因子Ｘからポックらの方法によって調製した［ポ ックら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｊｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｓ．　。

第２７３巻、第３７５頁（１９８９年）参照］。この酵素はアッセイに先立って 、Ｈ　Ｂ　Ｓ　Ａを用いて、最終１度が０．５ａＭになるように希釈した。

プラスミンアッセイ プラスミンの触媒活性は、カビ・ジアグノスチ力社製の発色性基質ｒＳ−２２５ １Ｊ（Ｉ）−バリル−Ｌ−ロインルーし一リジンーｐーニトロアニリドジヒドロ クロリド）を用いて測定した。この基質はアッセイに先立って、脱イオン水と混 ぜた後、Ｉｉ　Ｂ　Ｓ　Ａを用いて、最終濃度が２００ａＭ（約５倍のＫＬｌ） になるように希釈した。精製したヒトのプラスミンとしては、エンザイム・リサ ーチ・ラボラトリーズ社製のものを用いた。この酵素は、アッセイに先立って、 Ｈ　Ｂ　Ｓ　Ａを用いて、最終濃度が１．０ａＭになるように希釈した。

以下の表１に、選択された被験化合物と対照化合物［Ｂｏｃ−（Ｄ−Ｐｈｏ）− Ｐｒ。

−Ａｒｇ−ａｌｌのｉｃ，。の測定値を示す。

表１ １Ｃ．。（ｎＭ） 化合物　トロンビン　因子Ｘａ　プラスミン４ＭｅＶ−＾１ａ（Ｔｚｌ）−Ｐｒ ｏ−＾ｒｇ−ａｌ　８８　６４．　５　５００４ＭｅＶ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−＾ｒ ｇ−ａｌ　１４６．　５　５７　８４３ＩＣ＾−＾５ｐーＰｒｏー＾ｒｇ−ａｌ 　２３４　９１．　５　３２６＋１ｃＡ−Ａｓｐ（ＯＣＲｓ）−Ｐｒｏ−＾ｒｇ −ａｌ　４３．　７　２１３　５４６２ＰｒＰｅｎｔ−＾５ｐーＰｒｏー＾ｒｇ −ａｌ　８．　５　１７３　２８３２ＰｒＰｅｎｔ−＾５ｐ（ＯＣＲｓ）−Ｐｒ ｏ−＾ｒｇ−ａｌ　１．２　２９３　３２６ＣｈｘＰＡ−＾５ｐーＰｒｏー＾ｒ ｇ−ａｌ　５２．　９　３１　８３０ＣｈｘＰ＾−＾１ａ（Ｔｚｌ）−Ｐｒｏ− ＾ｒｇ−ａｌ　１７．　５　３１　４７ＣｈｘＰ＾−＾５１）−Ｐｒｏ−＾ｒｇ −ａｌ　５３．　９　１３０　１４０Ｂｏｃ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｐｒｏ−＾ｒｇ −ａｌ　４．　６　５３００　１０００表１から明らかなように、これらのイン ヒビターは、血液の凝固過程に関係する選択酵素のインヒビターとして有用であ る。

匡塗虜の実験的モデル 実施例１０記載の化合物（ＨＣＡ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ａｌ）の抗血栓症 特性は、急性動脈血栓症を誘発された以下の確立された実験的モデル（ＦｅＣ１ ｇで誘発された血小板依存性の動脈血栓症のラット）を用いて評価した。

このモデルは、血小板依存性の動脈血栓症によって十分に特徴づけられたモデル であって、有効な抗血栓症化合物、例えば、直接型トロンビンインヒビターの評 価において利用されている［クルツら、Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　、第６０巻 、第２６９頁〜第２８０頁（１９９０年）参照］。臓器を体外に露出させたシャ ントモデルとは異なり、このモデルにおいて発生する血栓はヘパリンの影響を比 較的受けない。

このことは、このモデルが、気球による血管形成または酵素による血栓崩壊の後 に新たに再疎通化された冠状血管において臨床上みられるタイプの血栓症を示す ことを意味する。このモデルの場合、濾紙に吸収させた調製直後のＦｅＣ１５溶 液を用いて処理したラットの頚動脈のセグメントには、血小板に富む閉塞性血栓 が形成される。Ｆ　ｅＣ１，は処理された頚動脈のセグメント内へ拡散して脱内 皮化を引き起こすことによって血栓を形成させるものと考えられている。ＦｅＣ １５の投与後に発生する閉塞性血栓形成に対する被験化合物の効果は、超音波に よるフロートメトリー（ｆｌｏｗｔｏ■ｅｔｒｙ）によってモニターし、該効果 を主要な評価尺度として用いた。フロートメト・リーは、凝塊形成を熱的に検知 する方法の修正法である［クルツら、Ｔｈｒｏ＠ｂ、　Ｒｅｓ、　、第６０巻、 第２６９頁〜第２８０頁（１９９０年）参照］。

雄のラットしバーラン・スプラグ・ドーリ−・ラット（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａ ｇｕｅ　Ｄａｖｌｅｙ　ｒａｔ）］を使用の少なくとも７２時間前から順応させ 、手術の１２時間前から水以外は接種させないようにした。このようにして準備 したラットに「ネムブタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）　Ｊを用いて麻酔をかけた。

この場合、血圧および麻酔薬と麻痺の伝搬をモニターするだめのカテーテルを埋 め込んだ。左側の頚動脈を次のようにして取り出した。即ち、頚部の正中線に沿 って切開した後、鈍的剥離させ、次いで、常套法によって頚動脈鞘から血管のセ グメント（２ｃ鴫）を取り出した。絹の縫合糸を単離した血管の基部と末梢の端 部の下に挿入することによって、血管の基部端の周囲に超音波流プローブ［「ト ランソニック（Ｔ　ｒａｎｓｏｎｉｃ）］を導入するための間隔を形成させた。

該プローブは固定アームを用いて固定させた。

手術後、食塩水を注入した対照群と実施例１０で調製した化合物で処理した被験 群において、ラットは無作為に選んだが、各群の単位投与あたり少なくとも６匹 のラットを用いた。超音波流プローブを導入し、凝塊形成刺激剤を投与する前３ ０分間被験体を安定化させた後、被験化合物を投与した。調製直後のＦｅＣｌ３ の３５％水溶液ｌＱｍＬを吸収させた直径３ｍ＋ｍの濾紙（ワットマン＃３）を 、超音波流プローブに接する単離した頚動脈末梢セグメントに付着させた（１＝ ０）。血圧、血流、心臓の鼓動速度および呼吸を６０分間にわたってモニターし た。

血液の流れの停止によって定義される閉塞の発生を主要な評価尺度として記録し た。観察を６０分間行った後、超音波流プローブを抜去し、間隙を過剰の流体で 渦だした。末梢および基部の縫合糸を縛び、動脈クランプをセグメントの末梢と 基部の先端部に載置した。単離したセグメントを切り出し、濾紙上で吸液乾燥さ せた後、秤量した。凝塊を除去した後、セグメントを再び秤量し、その差から凝 塊の全重量をめた。使用したラットは安楽死させた。

上記の生体内モデルに抗血栓症剤としての実施例１０の化合物の効能は、以下の 表２に示すように、閉塞の発生の抑制と凝塊の大きさの低減によって裏づけられ る。

表２ ＦｅＣ１，でラットに誘発される血栓症に対する実施例１０の化合物の抑制効果 処理グループ（ａ）　閉塞の発ｆｆ１ｂ）　凝塊の大きＪｏ）対照　１０／１０ 　６８．６５±３．７５グループ１　５／６　４８．３８±２４．７１グループ ２　１１５（＊）　２２．３８±２１．ｄ＊）（＊）（８）グループ３　０１５ （＊）　３．３８±５．４７＊）（＊Ｘ＊）（ａ）対照３１０１０３３１５．非 処理グループ１．、、．２５μｇ／ｋｇ／分　生体内注入グループ２．、、、５ ０μｇ／ｋｇ／分　生体内注入グループ３．、、、１００μｇ／ｋｇ／分　生体 内注入（ｂ）閉塞は頚動脈の処理セグメントを通る血流の停止によって定義され る。

（Ｃ）凝塊の大きさは次式で定義される。

（（単離された凝塊）／［（完全なセグメント）−（空のセグメント月ｌＸ１０ ０数値は平均値±Ｓ、Ｅ、　Ｍ、　（ｎ＝６）（本）両側ｐく領００５対対照［ フィッンヤーズの完全検定（Ｆｉｓｈｅｒｓ　ＥｘａｃｔＴｅｓｔ）］ （本）（本）（ネ）ｐ＜０．０１対対照［ニューマン−コイルス検定（Ｎｅｖｍ ａｎ−ＫｅｕｌｓＴｅｓｔ）による一方向ＡＮＯＶＡコ 以上の生体内での試験データは、実施例１０の化合物が、２つの十分に確立され た実験的な血栓症モデルにおいて抗血栓症的効能を示すことを証明するものであ る。

ＦＩＧ、　１ フロントベージの続き （７２）発明者　ピアソン、ダニエル・アンドルーアメリカ合衆国９２０７５カ リフオルニア、ソラナ・ビーチ、ティー−１４、サウス・ナート６６９番

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．次式で表わされる化合物または薬学的に許容される該化合物の塩：▲数式、 化学式、表等があります▼ 式中、Ｒ１は炭素原子数的５〜約１０のアルキル基、炭素原子数的６〜約１２の アリールによって置換された炭素原子数約１〜約３のアルキル基、または炭素原 子数的５〜約８の環状アルキルによって置換された炭素原子数約１〜約３のアル キル基を示し、ｍは１または２を示し、Ｒ２は−ＣＯ２Ｒ′、▲数式、化学式、 表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼を示し（Ｒ′は水素 原子、炭素原子約１〜約４の低級アルキル基または炭素原子数的６〜約１４のア ラルキル基を示す）、Ｒ３は−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２を示 す。
2. ２．Ｒ１が炭素原子数５〜８のアルキル基、またはフェニルまたはシクロヘキサ ンによって置換された炭素原子数１もしくは２のアルキル基である請求項２記載 の化合物。
3. ３．Ｒ１が３−メチルブチル、４−へブチル、２−シクロヘキシルエチルおよび ２−フェニルエチルから成る群から選択される請求項２記載の化合物。
4. ４．Ｒ２が−ＣＯ２Ｈである請求項３記載の化合物。
5. ５．Ｒ２が−ＣＯ２ＣＨ３、−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３または−ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ２ ＣＨ３である請求項３記載の化合物。
6. ６．Ｒ２が−ＣＯ２ＣＨ３である請求項５記載の化合物。
7. ７．Ｒ２が ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼（ 式中、Ｒ′は水素原子またはメチル基を示す）である請求項３記載の化合物。
8. ８．Ｒ′が水素原子である請求項７記載の化合物。
9. ９．Ｒ′がメチル基である請求項７記載の化合物。
10. １０．下記の化合物群から選択される化合物：▲数式、化学式、表等があります ▼， ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼，および▲数式、化学式、表等があります▼
11. １１．次式： ＡｃＲ−Ａ１−Ｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ａｌ（式中、ＡｃＲは疎水性アシル基を示 し、Ａ１はグルタミン酸（Ｇｌａ）もしくはアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはＧ ｌｕもしくはＡｓｐの等価基を示す）で表わされ、トロンビンおよび／または因 子Ｘａに対して約２００ｎＭもしくはそれ以下のＩＣ５０を有し、また、プラス ミンに対して、トロンビンもしくは因子Ｘａに対する比較的小さなＩＣ５０より も大きなＩＣ５０を有する化合物。
12. １２．治療上許容されるキャリヤーおよび治療上有効量の請求項１〜１１いずれ かに記載の化合物を含有する、異常な血栓症によって特徴づけられる哺乳類の症 状の予防用または治療用薬剤組成物。
13. １３．異常な血栓症によって特徴づけられる症状の哺乳類に治療上有効量の請求 項１〜１１いずれかに記載の化合物を投与することを含む、該症状の予防法また は治療法。
14. １４．異常な血栓症によって特徴づけられる症状の哺乳類に治療上有効量の請求 項１２記載の組成物を投与することを含む、該症状の予防法または治療法。