JPH07504561A - リパーゼの製造のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リパーゼの製造のための方法 発明の分野 本発明は、インビトロで活性リパーゼ酵素を製造するための方法、リパーゼをエ ンコードするＤＮＡ　Ｉｌｌ築体、このＤＮＡ構築体を含む組換ベクター、及び このベクターで形質転換された宿主細胞に関する。 発明の背景 リパーゼは、上りグリセリドの中のエステル結の加水分解を触媒して、ジグリセ リド、モノグリセリド、グリセリン及び遊離脂肪酸の形成をもたらしめる酵素で ある。一部のリパーゼはエステル結合にかかわっているその他の反応、例えばエ ステル結合の合成又はエステル交換反応も触媒する。リパーゼは幅広く様々な生 物により生産される。特に微生物リパーゼは、食品産業及び洗剤の如きの脂肪の リボ分解が所望されている様々な目的にとって実用的にかなり有用である。 布帛からの脂肪のしみ又は汚れの除去のための洗剤の中に含まれるのに特に好都 合であると見い出されているある特定のリパーゼは、之五二上玉±ス　セパシア （貞徂厖桓は郵ｒ−９狸出：１ａ）−ノ株にヨリ生産されるリパーゼである。　 ＢＰ２１４７６１号において（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）、このリ パーゼは６０°Ｃ以下の温度で活性であるリパーゼとして開示されており、これ は重要であり、なぜなら最近は布帛は６０°Ｃ以下の温度で洗浄されているから である。 洗剤添加剤として利用するのに別の重要な之五二工至土７．　（Ｆ／＜２ヱ　リ パーゼは、ＷＯ３９１０１０３２（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）にお いて部位非特異性リパーゼとして開示されているもの、即ち、トリグリセリドの ３個の脂肪アシル基金てと反応できるものである。 ’Ｊｓ二上天±入　セパシア　リパーゼ生産を助長するために、組換ＤＮＡ技術 を、例えば酵素をエンコードするＤＮＡ配列を発現せしめる強力なプロモーター を導入することにより、又はより効率的なリポソーム結合部位もしくはシグナル ペプチドコード配列を導入することによりリパーゼ発現を最適化するために、あ るいは酵素の生産のための、培養し易い（例えば標準の生産性生物、例えば大腸 菌を選ぶこと）又は高めのリパーゼ収率をもたらしめる宿主生物を選ぶために、 採用することが好都合でありうる。 しかしながら、以下に説明する通り、かかる手法は時折り予測の結果を得ること に失敗することが、例えば課題のタンパク質をコードする構造遺伝子の他に１又 は複数の遺伝子がその遺伝子生成物の生産にある程度の役割を担っているときの ケースにおいてありうる（かかる遺伝子の例は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ） のｓａｃ及びｉｅｐ遺伝子、並びに９Ｌｙ７”ｉ二４　（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ）プルラナーゼ及び大腸菌ヘモリシンの生産にとって必要な遺伝子である）。 別の一致ｊビニ上」Ｌ尤２１の種、シュードモナス　ヱ立ヱ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ紅組ｕからのリパーゼ遺伝子のクローニングは、例えばＳ、　Ａｏｙａｍ ａら（１９８Ｂ）及びＨ，Ｋｕｇｉｍｉｙａら（１９８６）より公知となってい る。しかしながら、ｐ、ｌ旦玉より生産されるリパーゼは、ヱ、セパシアより生 産されるそれとはそのアミノ酸配列において相違しており、そしてこれらの文献 において、宿主生物の中で有意な量のリパーゼの生産を達しめるのに１又は複数 の更なる遺伝子が必要でありうることの示唆はない。 ＥＰ３３１３７６号は、之五二上ｉ九ス　セパシア　リパーゼをエンコードする 組換ＤＮＡ及びこのリパーゼの生産にかかわるタンパク質を開示する。 Ｗ０９０１００９０８号は、宿主細胞の中で発現されるポリペプチドによるを開 示しており、そのポリペプチドはリパーゼ生産の調節因子として働いている。 発明の概要 驚くべきことに、組換宿主細胞により生産される活性リパーゼ酵素の収率は、そ の細胞から回収されたリパーゼを変性、それに続くシャベロン（ｃｈａｐｅｒｏ ｎｅ）分子の存在下での再生に付したときに高めることが可能であることが見い 出された。 従って、本発明はインビトロで活性リパーゼ酵素を製造するための方法に関連し 、この方法は （ａ）リパーゼ酵素をエンコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を、 そのリパーゼが不活性又は部分的に活性な状態で生産されるのに適する条件のも とで培養し、その培養物からこのリパーゼ酵素を回収し、次いでその回収された リパーゼ酵素を変性に付する、 （ｂ）この変性したリパーゼ酵素をシャペロン分子と混ぜ合わせる、そして （ｃ）工程（ｂ）の混合物を再生に付して、活性リパーゼ酵素を生成すること、 を含んで成る。 他方、本発明はインビトロで活性リパーゼ酵素を製造するための方法に関連し、 この方法は （ａ）リパーゼ酵素をエンコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を、 そのリパーゼ酵素が不活性又は部分的に活性な状態で生産されるのに適する条件 のもとで培養し、次いでそのリパーゼ酵素をこの培養物から回収する、 （ｂ）この回収されたリパーゼ酵素をシャペロン分子と混ぜ合わ性リパーゼ酵素 を生成すること、 を含んで成る。 更なる態様において、本発明はインビトロで活性リパーゼ酵素を製造するための 方法に関連し、この方法は（ａ）リパーゼ酵素をエンコードするＤＮＡ配列及び シャペロン分子をエンコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を、その リパーゼ酵素が不活性又は部分的に活性な状態で生産されるのに適する条件のも とで培養し、次いでリパーゼ酵素シャペロン分子混合物をこの培養物から回収す る、 （ｂ）任意的にこの混合物への更なる量のシャペロン分子の添加を伴って、工程 （ａ）の混合物を変性、それに続く再生に付し、活性リパーゼ酵素を生成するこ と、 を含んで成る。 上述した通り、本発明は、タンパク質又はタンパク質複合体の天然のコンホメー ションが常にそのタンパク質のアミノ酸配列によってのみ決定されるわけではな いことの発見に基づいている。従って、あるケースにおいては、シャペロン分子 と呼ばれているアクセサリ−タンパク質が別のタンパク質又はタンパク質複合体 の適正なる三次構造の形成を仲介するのに必要であるが、それら自体は最終機能 構造体の成分ではない（Ｅｌｌｉｓ　ら、１９９１）　。 本明細書において、「シャペロン分子」なる語は、かかるアクセサリ−タンパク 質、即ち、他のポリペプチドのそのほどかれた状態の保持を助長することに、そ の適正なトランスメンプラン標的化又は折りたたみ及びオリゴマー集成を可能と することに、並びにタンパク質複合体の解離にかかわるタンパク質を意味するこ とを意図している（Ｒ，Ｊ、　Ｅｌｌｉｓ　とＳ、　Ｍ、　Ｈｅｍｓｉｎｇｓｅ ｎ　（１９８９）、　Ｊ、　Ｅ、　Ｒｏｔｈｍａｎ（１９８９）、　Ｍｏｒｉ＋ ｗｏｔｏら（１９９０）を参照のこと）、一般に、標的タンパク質又はタンパク 質複合体の、共有修飾はシャベロン分子の作用によっては観察されていないが、 本発明の方法において用いるシャベロン分子がかかる共有修飾を及ぼしめること が可能であることを排除することはできない。従って、本明細書で用いている「 シャペロン分子」なる語は、リパーゼ酵素の非共有及び共有修飾を及ぼしめるシ ャベロン分子を包括することを意図している。 別の観点において、本発明は、リパーゼ酵素をエンコードする第−ＤＮＡ配列を 含んで成るＤＮＡ構築体に関連し、この第−ＤＮＡ配列は、シャペロン分子をエ ンコードする第二ＤＮＡ配列に、このリパーゼ酵素及びシャペロン分子又はそれ らの機能性部分が、そのＤＮＡ構築体で形質転換された適当な宿主細胞の培養に 基づき、単一の融合タンパク質として発現されるような状況で融合されている。 発明の詳細な開示 前述の工程ｂ）における回収及び任意的に変性されたリパーゼ酵素に添加すべき シャペロン分子は、シャペロン分子をエンコードするＤＮＡ配列で形質転換され た宿主細胞をそのシャペロン分子を生成するのに適する条件のもとで培養し、次 いでそのシャペロン分子をその培養物から回収することを含んで成る方法によっ て生成されることが好都合である。更に、変性リパーゼ酵素にシャペロン分子を 添加するとき、そのシャペロン分子自体が変性していることが好都合でありうる 。従って、本発明の方法は、シャペロン分子を工程ｂ）における変性リパーゼ酵 素と混ぜ合わせる前に、それを変性処理に付する更なる工程を含んで成りうる。 本明細書において、リパーゼ酵素について用いている「部分的に活性な状態」と は、リパーゼが、例えば後述するｐＨスタンドを利用する力価検定による活性測 定による決定に従い、完全ではないがある程度の活性を有することを意味してい ることを意図している。完活性リパーゼタンパク質の対応の調製品に比して低い 比較性を有する意味としてとられる（この二つの調製品は、総量が同じリパーゼ タンパク質を含む）。 不活性又は部分的に活性なリパーゼ酵素及び任意的なシャベロン分子の変性（こ れは、本発明の方法に従い、別々に、又はこの２種の成分の混合物に基づいて実 施されうる）は公知の方法で実施されうる０例えば、その変性は、その混合物を 変性側（例えば８Ｍの尿素）の作用に付し、次いでその薬剤を例えば透析により 除去することによって獲得されうる。 本発明の方法による製造にとって好適なリパーゼは、シェードモ去ス種又は−９ ｏ％ｉ＜／）　−（Ｃｈｒｏｙｍｏｂａｃｔｅｒ）種に由来する。特に、このリ パーゼ酵素は、２五二上天丈ス　セパシア、−２」とニ上」Ｌ±！ヨ久火ム（ｈ シ貞１凹鼾」山邊封）（例えばＥＰ４０７２２５に記載）、シューＦｉ力囚　ア エルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　ａｅｒｕｔ慰旦）　、もしくは−クー０ ％Ｒ））　−ビスコスム（Ｃｈｒｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｓｇ）　リ パーゼ、又は前記リパーゼ酵素の誘導体でありうる。特に、リパーゼ酵素は２五 二上天±ス　セパシアの株、例えばＩ！Ｐ２１４７６１号に開示の発明に関係し てトイチェ　サムルンク　フォノ　ミクロオルカニズメンに寄託されている寄託 番号ＤＳＭ　３３３３−３３３７及びＤＳＭ　３４０１の株、並びに、ＷＯ３９ １０１３０２に開示されている発明に関連してトイチェ　サムルンクファン　ミ クロオルカニズメンに寄託されている寄託番号ＤＳＭ　３９５９の株に由来する ものである。 本明細書において、「誘導体」なる語は、天然のリパーゼから、その天然リパー ゼをコードするＤＮＡ配列を適宜改変せしめ、その天然タンパク質のＣ−及びＮ −末端のいづれか又は両者に１又は複数のアミノ酸を付加を得ること、天然アミ ノ酸配列における１又は複数の異なる部位において１又は複数のアミノ酸の置換 を得ること、天然タンパク質の末端のいづれかもしくは両者において、又はその アミノ酸配列の中の１又は複数の部位において欠失を得ること、あるいは天然ア ミノ酸配列における１又は複数の部位において１又は複数の挿入を得ること、に より誘導された、リボ分解活性を有するタンパク質を意味することを意図する。 天然タンパク質についてコードするＤＮＡのかかる修飾はよく知られており、そ して当業界において幅広〈実施されている。典型的には、この誘導体のアミノ酸 配列は、天然リパーゼタンパク質のそれと相同性である、即ち、例えばかなりの 度合いの相同性を示すか、又はその誘導体は、その天然リパーゼに対して発生せ しめた抗体と反応するであろう。 本発明の方法において用いられる宿主細胞はあらゆる適当な細菌であって、培養 により大量のリパーゼを生産するものでありうる。 適当な細菌の例にはグラム陽性細菌、例えばバチルス　久１土ユ困（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　５ｕｂｉｔｉｌｓ）、バチルス　１シエニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ １ｉｃｈｅｎｉ包びセα、ｌ立丸止ス　ｋ２ジ（ム入（ハは追及し釦」１吐、バ ±ヱ土文ス　−去且ｒｙ入（堕−己旦ジ旦り−Ｕヱ劃側でありうる。大腸菌は高 収率の、即ち総細胞タンパク質の少なくとも５％の（細胞内）リパーゼを生産す ることができ、従って好適な宿主生物である。大腸菌において、リパーゼ酵素は 封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ）の状態で生産されるのが典型的で ある。細菌の形質転換は例えばプロトプラストの形態転換により、又はコンピテ ント細胞の利用により、公知の方法で行われうる。その他の適当な細菌宿主細胞 は、シュード至±λ種の細胞、例えばシュードｉ九囚　セパシア、之五二工天± 他方、宿主細胞は菌類、即ち酵母又は糸状菌類の細胞でありうる。 この酵母宿主細胞は例えば−竺Ｊ二笠旦に仁どメエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅ ｓ）　属（７）！ｌＩ胞、例えば旦、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｔｓｉａｅ ）でありうるΦ糸状菌類の宿主生物は好適には組換タンパク質を生産するのに従 来から宿主として利用されてきたもの、例えばアスペルギルス（幻」且す１ｕ旦 り一種の株、例えば人、二が←（Ａ、　ｎ几肛）１人、−二」ゴし乞７７、（Ａ 工ｎ１ｄｕｌａｎｓ）又は人、主１犬（紅」■且畦でありうる。菌類の宿主細胞 を形質転換するのに及び組換タンパク質の発現を獲得するのに利用されている技 術はＥＰ２３８０２３号に記載されているものが適当でありうる。 宿主細胞の中でのタンパク質の発現にとって、このタンパク質をエンコードする ＤＮＡ配列にプロモーターが先行していてよい、このプロモーターは選ばれた宿 主の中で強力な転写活性を示すあらゆるＤＮＡ配列であってよく、そして細胞外 又は細胞内タンパク質、例えばアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、 リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素をエンコードする遺伝子に由来しうる。 タンパク質の発現にかかわるその他の配列には、終止及びポリアデニル化配列、 並びにリポソーム結合部位が含まれ、そしてプロモーターと同じ起源に由来する のが適当でありうる。 本発明の方法において、リパーゼ酵素及び／又はシャペロン分子をエンコードす るＤＮＡ配列には、バチルス　スーアロサーモフ　ルλ　マルトジェニック　ア ミラーゼ遺伝子、バチルス　−史２エニホｙｌ入　α−アミラーゼ遺伝子、バチ ルス　アミロｉ　）　シエンス　α−アミラーゼ遺伝子、バチルス　スフ±ｌ− アルカリンプロテアーゼ遺伝子、もしくはバチルス　プミルス　キシロシダーゼ 遺伝子のプロモーターが、又はファージラムダＰえもしくはＰＬプロモーター、 ファージエフ遺伝子１０プロモーターもしくは大腸菌１ａｃプロモーターが先行 しているのが好都合である。リパーゼ酵素及び／又はシャペロン分子をエンコー ドするＤＮＡ配列には、バチルス２ａ≦ｒｏ＋−二元１工仁火２２　マルトジェ ニック　アミラーゼ遺伝子、バチルス　１シエニホルミス　α−アミラーゼ遺伝 子、バチルスアミロ１　ファシェンス　α−アミラーゼ遺伝子、バチルス　入１ 土工入　アルカリンプロテアーゼ遺伝子、バチルス　プミルス　キシロシダーゼ 遺伝子、ファージＴ７遺伝子１０又は大腸菌１ａｃ遺伝子のリポソーム結合部位 が先行していてよい。 本発明に従うと、シャペロン分子は之五二ｎ±入　リパーゼ調節タンパク質、好 ましくは之五二上玉±ス　セパシア　リパーゼ調節因子（１１０９０１００９０ ８号に開示）、之五ニ上玉土ム交土Ｌ　リパーゼ調節因子及び之五二ヱ至±ス　 アエルギノーザ　リパーゼ調節因子より成る群から選ばれるもの、又は任意のか かるリパーゼ調節因子の誘導体であることが好都合である。 本明細書において、リパーゼ調節因子の誘導体は、リパーゼ酵素の誘導体に関し て上記したのと同じ状況である、即ち、前記の通りに、天然リパーゼ調節因子に ついてコードするＤＮＡ配列を適宜改変することにより天然リパーゼから誘導さ れたシ中ベロン活性を有するタンパク質であると理解される。この誘導体のシャ ペロン活性は、例えば本明細書に記載の通り、活性リパーゼ酵素の生産における その誘導体の能力の分析により決定されうる。 本発明にかかる方法の好適な態様において、リパーゼ酵素は２五二上天丸ム　セ パシア　リパーゼ又はその誘導体であり、そしてシャペロン分子は’／ｚ二上至 ±入　セパシア　リパーゼ調節因子（又はその誘導体）でありうる（共に１．　 Ｗ０９０１００９０８号に開示）。 リパーゼ酵素及び／又はシャペロン分子をエンコードするＤＮＡ配列を含んで成 る本発明のＤＮＡ構築体はゲノム又はｃＤＮＡ起源であってよく、例えば適当な 生物のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを用意し、そしてリパーゼ又はシャペロ ンの全体又は一部をコードするＤＮＡ配列を、標準の技術に従う（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら、１９８９を参照のこと）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイ ブリダイゼーションによりスクリーニングすることによって得られるものである 。 本発明のＤＮＡ構築体は確立されている標準的な方法、例えばＳ、　Ｌ。 Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）　、Ｍａｔｔｈｅｓら（１９８４）により述べ られているホスホアミジット法により合成的に製造することもできうる。ホスホ アミジット法に従うと、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置で合成 し、精製、リゲートそして適宜のベクターの中にクローンする。 最後に、このＤＮＡ構築体は合成とゲノムとの複合物、合成とｃＤＮＡとの複合 物、又はゲノムとｃＤＮＡとの複合物であって、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源 のフラグメント（適宜）を、この全ＤＮＡ構築体の様々な部分に対応するフラグ メントに、標準の技術に従ってリゲートすることによって製造したものでありう る。 本発明のＤＮＡ構築体において、リパーゼ構築体をエンコードするＤＮＡ配列は 之五二上至±λ種又は９０％Ｒ／）色二種に由来するものであってよい０例えば 、前記第−ＤＮＡ配列は、２五二ヱ至±、ｘ−ｈ旦　リパーゼ、又は上記のリパ ーゼ酵素の誘導体をエンコードするものでありうる。前記第二ＤＮＡ配列は、２ 五二ヱ至±入　セパシア　リパーゼ調節因子、−２」ビニ上−１−九ノ、グルメ 　リパーゼ調節因子、２五二）’−Ｅ−±入　アエルギノーザ　リパーゼ調節因 子、もしくはその他の２五二上至±ム　リパーゼ調節因子タンパク質、又は任意 のこれらの調節因子の誘導体をエンコードするものでありうる。 最も好ましくは、この第−ＤＮＡ配列は’／ｓニヱ至±ス　セパシアリパーゼ又 はその誘導体をエンコードし、そして第二ＤＮＡ配列は引用することで本明細書 に組入れる１１０９０１００９０８号に記載の之五二ヱ至土ム　セパシア　リパ ーゼ調節因子又はそれらの誘導体をエンコードする。 特に好適なりＮＡ構築体は本明細書に添付したＳＥＱ　１０　Ｎｏ、５に示す配 列を有するものである。この配列は常用の方法に従って改変されていてよい、こ のＤＮＡ配列の適当な改変の例は、ヌクレオチド置換であって、リパーゼ又はリ パーゼ調節因子のアミノ酸配列を別のものにはしないが、そのＤＮＡ構築体を導 入する宿主生物のコドン用法に対応しうる置換、又はヌクレオチド置換であって 、リパーゼもしくはリパーゼ調節因子のいづれもの性質を損うことなく、別のア ミノ酸配列による、それ故、可能としては、別のポリペプチド構造にする置換で ある。その他の可能な改変の例は、配列への１又は複数のヌクレオチドの挿入、 配列のいづれかの末端での１又は複数のヌクレオチドの付加、及び配列の末端又 は配列内のいづれかでの１又は複数のヌクレオチドの欠失である。 更なる観点において、本発明は前記のＤＮＡ構築体を含んで成る組換発現ベクタ ーに関連する。リパーゼ及び／又はシャペロン分子をエンコードするＤＮ＾配列 を保有する発現ベクターは、一定の宿主生物の中での自己複製可能な任意のベク ター、典型的にはプラスミド又はバクテリオファージでありうる。ベクターにお いて、リパーゼ及び／又はシャペロン分子をエンコードするＤＮＡ配列は適当な プロモーター配列に作動連結しているべきである。このプロモーターは宿主細胞 の中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、そして宿主生物に対して 同種又は異種のいづれものタンパク質をエンコードする遺伝子に由来しうる。こ のプロモーターは好ましくは）＜ｆｙス　エ入ｊゴｒｏｇ−二ｉクエ仁止メ、マ ルトジェニック　アミラーゼ遺伝子、バチルス　！シェニホルミス　α−アミラ ーゼ遺伝子１．Ｒｆ／Ｌ／７．　アミロ１　フ　シエンス　α−アミラーゼ遺伝 子、バチルスプミルス　キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージラ ムダＰつもしくはＰ、プロモーター、ファージエフ遺伝子１０プロモーター、又 は大腸菌１ａｃプロモーターである。 このベクターは選択マーカー、例えば遺伝子であってその生成物が抗生物質耐性 、例えばアンピシリン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性を 授けるもの、又は８．３もしくは旦、ユク」三−ｙｈ）ｂ支７由来の止り一遺伝 子も含んで成りうる。 更なる別の観点において、本発明は活性状態におけるリパーゼの製造方法に関連 し、この方法は、上記のＤＮＡ構築体で形質転換された宿主細胞をこのリパーゼ を生産するのに適する条件のもとで培養し、次いでこの培養物からリパーゼを回 収し、任意的にこのリパーゼ／シャペロン融合タンパク質の変性及び再生が後に 続くことを含んで成る。 細胞の培養に用いられる培地は細菌の増殖にとって適当な任意の常用の培地であ りうる。リパーゼはこの培地から、常用の手順、例えば、必要ならば細胞内生成 物を回収するための細胞の破壊の後の遠心もしくは濾過により、塩、例えば硫酸 アンモニウムによる上清液もしくは濾液のタンパク質性成分の沈殿、それに続（ 様々なりロマトグラフィー手順、例えばイオン変換クロマトグラフィー、アフィ ニティークロマトグラフィー等による精製により、分離せしめることによって回 収されうる。 活性リパーゼ酵素の調製におけるシャペロン分子の利用は組換ＤＮＡ技術に関連 して特に重要であるが（前記に説明した通り）、シャベロン分子の存在は、リパ ーゼ酵素の製造方法にかかわらず、本明細書記載の活性リパーゼ酵素が所望する 任意の変性及び再生処理に関連して重要である。従って、例えば変性処理に付す べき天然又は遺伝子操作にかけられていない生物の常用の発酵により生産される リパーゼ酵素に関して、その後の再生処理におけるシャペロン分子の存在は重要 であると信じられている。 従って、更なる一般的な観点において、本発明はリパーゼ酵素を変性及び再生す る方法に関連し、この方法はａ）リパーゼ酵素を変性処理に付する、Ｃ）工程ｂ ）の混合物を再生に付して、活性リパーゼ酵素を生成すること、 を含んで成る。 従って、リパーゼ酵素の変性／再生処理はａ）変性及び再生処理に付するべきリ パーゼ酵素をシャベロン分子と混ぜ合わせる、そして ｂ）工程ａ）の混合物を変性、それに続く再生に付して、活性リパーゼ酵素を生 成すること、 により実施されうる。 図面の簡単な説明 本発明を、添付の図面を参考にしながら下記で説明する。ここで図１はプラスミ ドｐＡＨｆ！２を示し；図２はプラスミドｐＡＨＥ８を示し； 図３はプラスミドｐＡＨＥ１０を示し；図４はプラスミドｐＣＢＥ６を示し； 図５はプラスミドｐｃＢＥ７を示し； 図６はプラスミドｐｃＢＥ１２を示し；図７はプラスミドｐｃＢＥＬ８を示し； 図８はプラスミドｐｃＢＥ１９を示し；図９は例３に記載の通りに実施した大腸 菌ＪＡ２２１において発現さセタタンパク質の５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析の結果を示 し、ここでそれらのレーンは： Ａ＆Ｓ　分子量マーカー；　４５．３６．２４及び２０Ｂ　ｐＪＷ２　（ベクタ ー） ＣｐｓＪ１５０　（ｐＵｃ中のオリジナルのリパーゼ構築体）Ｄ　ｐＡＨＥ２　 ３０℃　１．０時間（ｈｒ）Ｅ　ｐＡＨＥ２　４２°Ｃ１，０ｈｒｓＦ　ｐＡＨ Ｅ２　４２℃　１．５ｈｒｓＧ　ｐＡＨＥ２　４２℃　２．０ｈｒｓＨ，Ｍ＆Ｒ ヱ、皇バ之１由来の精製リパーゼＩ　ｐＡＨＥｌｏ　３０℃　１．０ｈｒｓＪ　 ｐＡＨＥｌｏ　４２℃　１．０ｈｒｓＫ　ｐＡＨＥｌｏ　４２°Ｃ１，５ｈｒｓ Ｌ　ｐＡＨＥ２　４２℃　２．０ｈｒｓＮ　ｐｃＢＥ６　−ＩＰＴＧ　１．Ｑ　 ｈｒｓＯ、ｐＣＢＥ６　＋ＩＰＴＧ　１．ＯｈｒｓＰ　ｐｃＢＥ６　＋ＩＰＴＧ 　１．５　ｈｒｓＱ　ｐＣＢＥ６　＋ＩＰＴＧ　２．Ｏｈｒｓ図１０はＬｉｐ抗 体を利用した例３記載の通りに実施したイムノプロット分析の結果を示し、ここ でレーンは：Ａ　ｐＪＷ２　（ベクター） Ｂ　ｐｓＪ１５０ ＣｐＡＨＥ２　３０”Ｃ１，Ｏｈｒ Ｉ）　ｐＡＩＩＥ２　４２°Ｃ１，０ｈｒＥ　ｐＡＨＥ２　４２”Ｃ１，５ｈｒ ｓＦ　ｐＡＨＥ２　４２°Ｃ２，ＱｈｒｓＧ、　Ｌ、　Ｑ、　Ｓ　Ｐ、皇バ２ヱ 由来の精製リパーゼ（ＩＯＬＩＩ）ＨｐＡＨＥｌｏ　３０’Ｃ１，Ｏｈｒ Ｉ　ｐＡＨＥｌｏ　４２℃　１，０ｈｒＪ　ｐＡＨＥｌｏ　４２’Ｃ１，５ｈｒ ｓＫｐＡｌ（Ｅｌｏ　４２°Ｃ２，ＱｈｒｓＭ　ｐｃＢＥ６　−ＩＰＴＧ　１． ＯｈｒＮ　ｐＣＢＥ６　＋ＩＰＴＧ　１．ＯｈｒＯｐｃＢＥ６　＋ＩＰＴＧ　１ ．５　ｈｒｓＰ　ｐＣＢＥ６　＋ＩＰＴＧ　２．ＯｈｒｓＲｐＡＩＥ２　＋　ｐ ＡＨＥｌｏ、　４２　”Ｃ１，５ｈｒｓ　；図１１は、リパーゼのイムノプロッ ト分析により決定された工、土バシアの中でのＬｉ−への細胞所在（図１１ａＬ 並びにｐ、　−ｔ−４之ヱの細胞内（細胞質及び細胞内膜）、ペリプラズマ及び 細胞外画分においてオレイルアルコールで誘発されたＬｉｍ　（図１１ｂ）を示 す。等量のタンパク譬を、０．０１．１７及び２１％のそれぞれに対応する各レ ーンに添加した。（ａ）において（リパーゼ　イムノプロ・ノド）、レーンは以 下を含んでいた： Ａ　Ｐ、セパシア由来の精製リパーゼ Ｂ　細胞内画分 Ｃベリプラズマ画分 Ｄ　細胞外画分； （ｂ）において（Ｌｉ−イムノプロット）、レーンは以下を含んでいた： Ａ　ｐ１３８より発現された１１醜 Ｂ　細胞内画分 Ｃベリプラズマ画分 Ｄ　細胞外画分； 図１２はプラスミドｐＡＦＩＥ１９を示し；図１３はプラスミドｐＡ）ｌＥ２２ を示し；図１４はプラスミドｐＡｆｌＥ１６を示し；図１５はプラスミドｐＡｌ （８２３を示し；そして図１６はプラスミドｐｃＢＦ１−６を示す。 本発明を下記の実施例で更に説明するが、これらは本発明の請求の範囲を限定す ることは意図しない。 方法および材料 人１ｉＪｉ　ＴＧＩ　５ｕｐＥ　ｈｓｄ−５ｔｈｉ−（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）　 Ｆ’　［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ＋１ａｃｌｑＩａｃＺ−Ｍ２Ｓ）（Ｇｉｂｓｏ ｎ、　１９８４）大［ＪＡ２２１　（Ｃ１ａｒｋｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｂｏｎ＋　 １９７８）太Ｊ［［ＢＬ２１　（ＤＥ３）　Ｂ株すソゲン、　ｐｌａｃＵＶ５− Ｔ７　ＲＮＡｐｏｌ　（ＩＰＴＧ誘発性）　（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　１９９０）プ ラスミド ｐｓＪ１５０−Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）ｐＪＷ２−Ｈ ａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）ｐＥＴ３ａ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８７）ｐＴ７−７−３ｔａｎ　Ｔａｂｏｒ、　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　Ｈａｒｖａｒｄ　ＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌよ り入手 ｐＬｙｓＥとｐＬｙｓｓ−ｐＡｃＹｃ１８４：　：ｐｔｅｔ及び対立配向由来の Ｔ７リゾチーム（Ｓｔｕｄｉｅｒ、　１９９０）。 −船方法 標準ＤＮＡ操作は、本質的にＳａｗｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載の通りに実 施した。　。 制限酵素、Ｔａ　ＤＮ＾リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ■　（フレノウフラグメ ント）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｂｅｉ−又はＰｒｏｍｅｇａより入手 し、そしてその供給者の推奨の通りに用いた。 ニワトリ卵白リゾチームは５１ｇ５＋ａより入手した。 プラスミドの調製及び大腸菌の形質転換はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記 載の通りに実施した。 Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載の通りに５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ルを用意し、電気泳動し、そして染色した。 タンパク質分子量マーカーはＳｉｇｍａより購入した。 リパーゼ分析 リパーゼ活性は、グリセロールトリブチレート又はオリーブ油エマルションのい づれかと、ブリリアントグリーンを含むプレート上で検出した。リパーゼ活性は 基質としてグリセロールトリブチレートを用いてｐＦ＋−スタット法により測定 した。ＩＬＩＩ（リパーゼユニット）は、下記の条件のもとて１分当り１μ５ｏ ｌｅの滴定可能な酪酸を遊離せしめる酵素の量である： 濃度　３０６０℃ ｐＨ７，０ 乳化剤　アラビアゴム、　５０ｍ１／　１（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　ら、１９９１ ）　。 リパーゼスクリーニングアッセイはマイクロタイターディツシュの中で下記の手 順に従って実施した： まず乳化試薬を作る： １７．９　ｇのＮａＣｌ　＋０．４１８のＫＨｚＰＯ，＋　６．０　ｇのアラビ アゴム＋５４０　ｍｌのグリセロールを、脱ミネラル水で１０１００Ｏの最終容 量にする。 リパーゼアッセイ試薬を下記の通りに作る：１２．５ｓ＋１の上記の乳化試薬＋ ３．７５ｍ１のグリセロールトリブチレート＋０．２５ｍ１（７）プリＩＪ　７ ７トグリー７　（ｎｚｏ中テ４０ｍｇ／ｍｌ）　＋５０ｍ１（７）１０−Ｎのト リスｐＨ９，ｏをＵｌｔｒａ　Ｔｕｒｒａｘ乳化器の中で１分間乳化させる。 実際のアッセイは、ＩＯＱ■！のこのアッセイ試薬を１００　ｍｌのリパーゼサ ンプルと混合することにより実際する８発色を、既知のリパーゼサンプルのそれ と比較した。 ブリリアントグリーンプレートは１５ｍ１のＬＢアガーより成り、１０％のオリ ーブ油エマルシッン０．３ｍｌと蒸留水中の４０ｍｇ／ｍｌのブリリアントグリ ーン溶液０．Ｌｌとを含む３■ｌのＬＢアガーのトップ層を有する。オリーブ油 エマルシッンは、オリーブ油１抛Ｉ＋アラビアゴム１ｇ＋脱イオン水９抛ｌであ り、ＩＪｌｔｒａ　Ｔｕｒｒａｘ乳化器を用いて混合した。 高レベル発現のための大腸菌培養物の誘発ａ　Ｊ−２ベースと　るブースミ゛ −夜培養物をオービタルシェーカーの中で２５０　ｒｐ−で３０”Ｃで増殖させ 、１：１００に希釈し、そして０．５のＡ６００が達せられるまで３０”Ｃで３ 〜４ｈｒ増殖させた。１組のデュブリヶート培養物のうちの一方をタンパク質合 成の誘発のために４２℃に移した０両培養物がらサンプルを、誘発後０．３０． ６０．９０及び１２０分において取った。 ｂ　ＥＴ３ａ　Ｔ７−７　ベースと　るブースミド−夜培養物をオービタルシェ ーカーの中で２５０　ｒｐｓ＋で３０”Ｃで増殖させ、ｌ：５０に希釈し、そし て０．５のＡ６００が達せられるまで３０″Ｃで増殖させた。１＆Ｉｌのデュブ リケート培養物のうちの一方にＩＰＴＧを１、５　ｍＭの最終濃度となるまで加 えた。ＩＰＴＧの添加の１５ｍｔｎ後に、誘発培養物にリフアビジンも１００μ ｇ／■ｌの最終濃度となるように加えてよい。両培養物から、誘発後０．３０． ６０．９０及び１２０分の時間においでサンプルを取った。 タンパク質サンプルの処理及び調製 サンプルを直ちに０゛Ｃに冷やした。細胞をマイクロ遠心機で１２、０００　ｇ 、５分、４℃での遠心により回収した。細胞ペレットをラエムリサンブルバッフ ァーの中に再懸濁させ、そして−２０°Ｃに連結した。タンパク質をその上清液 から、等容量のアセトンの添加、及び氷上で３０ｍ１ｎの放置、それに続＜−１ ５ｍ１ｎ　、　１２．０００ｇ、４℃での遠心により沈殿させた。沈殿タンパク 質をラエムリサンブルバッファーの中に再懸濁し、そして−２０°Ｃで連結した 。 ５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質の分析タンパク質サ ンプルを、１２％の５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲルに載せる前に５　ｍａｉｎ 煮沸した。ゲルをトリス−グリシンの中で、染色先端がゲルの端に到達するまで 電気泳動し、そして０．２５％のクマジーブリリアントブルーで染め、次いで１ ０％の酢酸の中で脱色した。 ウェスタン分析 利用した方法はＴｏｗｂｔｎら（１９７９）のそれと同等である。タンパク質サ ンプルを１２％のＳＯ３−ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動し、そして ニトロセルロースに電気泳動的に転写させた。フィルターをブロッキングバッフ ァーとブレインキュベートし、次いで抗リパーゼ抗体とインキュベートした０次 にアルカリホスファターゼコンジュゲート化、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ　（Ｓｉｇ ｍａ）をフィルターとインキュベートした。ニトロブルーテトラゾリウムと５− ブロモ−４−クロロ−インドイルホスフェート（共にＳｉｇｍａ由来）を用いて タンパク質を識別化させた。 細胞溶解のための方法：　Ｍａｒｓｔｏｎ　（１９８７）から採用−夜培養物を １００　ｍｌのＬＢ培地にｌ：１００に希釈し、次いで０．５のｏＤ６００値へ と増殖させた。　ｐＡＨＥ２及びｐＡＨＥｌｏのケースにおける熱による、並び にｐＣＢＥ６のケースにおけるＩＰＴＧによる誘発を２時間行った。その培養物 を次にｓｏｏ　ｇで１５分、４°Ｃで遠心した。その上清液を除去し、そしてそ のペレットを秤量した。大腸菌細胞の各グラム（ウェット重量）に対して３■ｌ の溶解バッファーを加え、そしてそのペレットを再懸濁させた。溶解バッファー は５０＠Ｍのトリス、　ｃｉ。 １ｍＨのＥＤＴＡ、　１００　ｍＭのＮａＣ１を含んでいた。 細胞の各グラム当り、８■ｌの５０■ＨのＰＭＳＦストック及び８０μｌのリゾ チーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、そして２０分撹拌した。４ｅ＋Ｈのデオキシ コール酸を細胞のグラム当りに連続撹拌しながら加えた。そのリゼートを３７℃ に置き、そしてガラス棒で撹拌した。そのリゼートが粘稠となったら、２０μｌ のＤＮＡａｓｅ　［（１ｔａｇ／園１）を細胞のグラム当りに加えた。そのリゼ ートをもほや粘稠でなくなるまで室温で放置した（約３０分）、そのリセードを 次いで必要となるまで４℃で保存した。 封入体の精製及び洗浄：　（）１６ｒｓｔｏｎら、１９８４　）細胞リゼートを １２．０００ｇ、　１５分、４°Ｃで遠心した。その上清液をデカントし、そし てそのペレットを、０．５％のトリトン及び１０ｍＭのＥＤＴＡを含む９容量の 溶解バッファー（ｐＨ８，０）の中に再懸濁させた。 室温で５分保存後、１２，０００ｇ、　１５分、４℃で遠心した。その上清液を デカントし、そして横に置き、そしてそペレットを１００μｌのＨ２Ｏに再懸濁 させた。その上清液及び再懸濁ペレットから１０μｌのサンプルを取り、そして １０μｌの２ＸのＳＤＳゲル装填用バッファーと混ぜ、そして５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動によって分析して、課題のタンパク質のほとんどがペレ ット中にあるかを調べた。 ｐＡＨＥ２のリパーゼ活性がペレット画分の中にほとんどあるかを調べるために リパーゼスクリーニングアッセイも実施した。 封入体の可溶化及び再生：　ＣＭａｒｓｔｏｎら（１９８４）より採用）０．１ 鵬りのＰＭＳＦ　（加えたばかり）、８Ｍの尿素（脱イオン化）及び０．１Ｍの ベーターメルカプトエタノールを含む１００μｍの溶解バッファーを洗浄したベ レッＩ・に加え、そして室温で１時間保存した。 リパーゼ活性スクリーニングアッセイは、タンパク質が全体的に変性したことに 基づいてリパーゼ活性が消失したかどうかを調べるために実施した。５０μｍづ つの変性タンパク質サンプルを透析用チューブに入れた。タンパク質サンプルを ５０−ＭのＫＨ！ＰＯ４（ｐＨ１０，７）　、１−ＨのＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０ ）　、５０ｍＭのＮａＣ１，並びに８Ｍの尿素及び０．１ＭのＢＭＥも含むバッ ファーの中で透析した。ｐＨはＫＯＨで１０．７に保っておいた。８Ｍの尿素の 中での最初の透析は一夜行った。低めの濃度の尿素（即ち、６Ｍ；４Ｍ；２Ｍｓ ＯＭ）を用いる更なる透析はＢｌ’ｌＩ！抜きの上記のバッファーの中で行った 。これらの透析反応体のｐＨはＨＣＩを用いて８．０に保っておいた。更なる濃 度の尿素それぞれの中での透析は６時間行った。コントロール実験として、デュ ブリケー］・のサンプルを上記の通りに実施したが、ただし尿素とＨＥは無しで 行った。 変性サンプルを透析チューブから取り出し、そしてこれらのサンプルのリパーゼ 活性をグリセロールトリブチレート及びブリリアントグリーンプレート上で調べ た。そのリパーゼ活性も、マイクロタイターリパーゼスクリーニングアッセイを 用いて検査した。 ５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質の回収−５ＯＳ−ポリアクリ ルアミドゲルからのタンパク質の回収の手順はＨａｇｅｒとＢｕｒｇｅｓｓ　（ １９８０）に記載しである。タンパク質サンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上で電気泳動させた。電気泳動後、そのゲルをトレイに移し、水ですすぎ、 そして水冷の２５０　ｍＨのＭＣＩ及び１ｍ？１のＤＴＴで１０分染めた。その ゲルを１ｍＭのＤＴＴを含む冷水で脱色し、次いで対象のタンパク質バンドを切 り取った。（ゲルの一部はクマジーブルーで染めて、適正なバンドを切り取った かを確実とするために分子量標準品を染めた）、そのゲルをＧｌＢの針の付いた １ｍｌのシリンジを通じて破砕し、そして０．１％のＳＯ３，５０１１Ｍのト！ Ｊ　ス／ＨＣＩ（ｐＨ７，９）　、０．１１１Ｍ（７１ＥＤＴＡ、５　ｍＭ＜７ ）ＤＴＴ及び２００　ｍＭ（７）ＮａＣ１しながら、２５℃で少な（とも１時間 溶離させた。その混合物を簡単に遠心して破砕ゲルをペレット化させた。そのタ ンパク質を上清液から、４容量の冷アセトンを加え、次いで一７０℃で２０ｍ１ ｎインキュベートすることにより沈殿させた。沈殿タンパク質を遠心し、そして そのペレットを乾した。 ウサギの中での抗−ＬｉｍＡ抗血清の作製ＬｉｍＡに対する抗体を発生させるた め、３羽のウサギに精製Ｌｉ曽Ａタンパク質を、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ　（１ ９８１）に述べられているのと類似のスケジュールに従うで注射した。Ｌｉ■Ａ タンパク質を調製５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルから精製した。１日目におい て、１０５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２中のＬｉ霧を完全フロインドアジ ュバントと混ぜ、そして各ウサギの背中に１０箇所において皮肉注射した。２１ 日目に、不完全フロインドアジュバントと混ぜたブースター注射を各ウサギの足 に筋肉内注射した。同一のブースターを同じようにスケジュールの３１日目に注 射した。試験車は抗−Ｌｉ−抗体が作製されたことを示した。 培地 Ｂ リッター当り：１０ｇのバタトートリブトン５ｇのバクトー酵母抽出物 １０ｇのＮａＣ１ プレートは２％のアガーを含んだ。 実施例 例１ 高レベルのＬｉｐ＾発現のための構築 （ａ）１１Ｒ１」二ＹＬｉ配ユ　＾ＨＥ２　と　へＨＥ８プラスミドｐＡＨＥ２ 　（図１）を、ｐｓＪ１５０　（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　ら、１９９１　）由来の １ｉｐＡ　＋ｌｉｅ＾の両者をエンコードする２、２６４　ｋｂのＮ５ｉｌフラ グメントをＮｄｅｌ−消化ｐＪＷ２　（Ｗａｎｇら、１９９０）にサブクローン することによって構築した。リゲーション体を大腸菌ＴＧＩに３０°Ｃで形質転 換せしめ、次いで適正な配向においてインサートを有するプラスミドを同定する ためにＤＮ＾ミニ調製品を利用した。ｐＡＨＥ２は獲得したいくつかの適正な構 築体のうちの一つである。　ｐＡｌ（Ｅ２において、リパーゼ遺伝子の開始コド ンはファージエフリポソーム結合部位のすぐ下流にある。 Ｆ５７はｐＡＨＥ２で形質転換した大腸菌株Ｊ＾２２１である。Ｈ５７を高レベ ルのタンパク質生産のために誘発せしめたとき、リパーゼタンパク質がＳＤＳポ リアクリルアミドゲル上で同定でき（ウェスタン分析により）、そしてリパーゼ 活性がブリリアントグリーン及びグリセロールトリブチレートプレート上で、並 びにマイクロタイターアツセイ及びｐＮスタンド法により検出できた。 プラスミドｐＡｌｌＥ８　（図２）は、ｐＡＨＥ２由来のｌｉｐ＾十ｌ　ｉｗＡ をエンコードする２、２６４　ｋｂのＮｄｅｌフラグメントを、、　Ｎｄｅｌで 消化しておいた発現・＼クターｐＥＴ３ａにサブクローンすることによって構築 した。リゲーション体を大腸菌株ＴＧＩに形質転換せしめ、そしてプラスミドＯ Ｎ＾をその形質転換体から調製して適正なプラスミドを同定した。 Ｅ７３はｐＡ）ＩＦ５　テ形質転換された大腸菌株Ｂ１−２１　（ＨＥ３）　ｐ Ｌｙｓ　Ｓである。Ｅ７３を高レベルのタンパク質生産のために誘発せしめたと き、リパーゼタンパク質（およその？ｊＷ３４ＫＤ　）が５Ｉ）Ｓ−ポリアクリ ルアミドゲル上で認められ、そしてリパーゼ活性がブリリアント　グリーン及び グリセロールトリブチレートプレー１・上で、並びにマイクロタイター　アッセ イで検出できた。 （ｂ）１ｉｓ＋Ａ　わないｌｉＡ：ＡＨＩｌ！１０プラスミドｐＡＨＥ１０　（ 図３）は、ｌｉｇｍＡ遺伝子のコード領域の２／３が欠失しているｐＡＨＥ２の 誘導体である。プラスミドｐＡＨＥ１０は、ｐＡＨＥ２を制限酵素Ｃ１ａｌ及び Ｎｏｔｌで消化し、続いてマングビーン（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで 処理することによって構築した。サイズ６．３ｋｂのＤＮＡを、エチジウムプロ ミドで染めたアガロースゲルからバンドとして切り出した。ＤＮＡをＧｅｎｅ　 Ｃ１ｅａｎキツトを用いて精製し、リゲートし、そしてコンピテント大腸菌ＴＧ Ｉに形質転換せしめた。プラスミドＤＮＡミニ調製品を適正なりローンを同定す るために用いた。 Ｅ６８はｐＡＨＥｌｏで形質転換された大腸菌ＪＡ２２１である。Ｅ６８を高レ ベルのタンパク質生産のために誘発せしめたとき、リパーゼタンパク質は、ｐＡ ＨＥ２由来のものと同量で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上及びウェスタン分 析により認められたが、リパーゼ活性は検出されなかった。 例２ 高レベルのＬｉｍＡ発現のための構築：　ｐｃＢｔ！６　、　ｐＣＢＥ？　、　 ｐｃＢＥ１２゜ｐｃＢＥ１８及びｐｃＢＥ１９ １　ｉｅ＋Ａのみが発現されるプラスミドｐＣＢＥ６　（図４）を、ｐｓＪ１５ ０由来の１．１ＴｋｂのＣ１ａ（５ｐｈｌフラグメントをプラント末端フラグメ ントとして、ＮｄｅＩで消化し、次いでプラント末端を作り上げるためにフレノ ウで処理しておいた発現ベクターｐＨＴ３ａにサブクローンすることによって構 築した。大腸菌株Ｅ１０２はｐＣＢＥ６で形質転換させた株ＢＬ２１（ＨＥ３） 　ｐＬｙｓ　Ｓである。 プラスミドｐＣＢＥ７　（図５）は、同じ１．２ｋｂのＣ１ａＩ−３ｐｂＩフラ グメントを発現ベクターｐＴ？−７にサブクローンすることによって構築した。 　［！１０３はｐＣＢＥ７で形質転換されたＢＬ２１　（ＤＩ！３）　ｐＬｙｓ 　Ｓである。 ＥＩＯ２及びＥＩＯ３の誘発により、約３２ＫＤの分子量のタンパク質が観察さ れた。 プラスミドｐｃＢＥ１２　（図６）は、ｐｃＢＥ７のＢｇｌ　Ｉｆ　−Ｂａｗｌ 　ＩフラグメントをｐＡｃＹｃ１７７にサブクローンすることによって構築した 。Ｌｉ−は、ｐｓＪ５１Ｂ　（賀０９０１００９０ＢのＦｉｇ、　３に記載）か ら発現されたリパーゼに対してトランスにおいてｐｃＢＥ１２から発現し、そし てｐＡｔｌＥｌｏはリパーゼ活性をもたらしめた。 プラスミドｐｃＢＥ１Ｂ及び１９（図７及び８）は、ｐｃＢＥ７のＢｇｌＩＩ− ＢａｍＨＩフラグメントをｐＬｙｓ　ＳのＢｃ１１部位にサブクローンすること によって構築した。Ｌｉ■はｐＡＩＩＢ１０由来のリパーゼに対してトランスで ｐｃＢＥ１８及び１９から発現し、リパーゼ活性をもたらしめた。 例３ 高レベルのタンパク質発現を獲得するための増殖／誘発実験下記の通りに培養物 を誘発せしめて高レベルのＬｉｐＡ及びＬｉｍＡの両者を生成せしめた。大腸菌 株Ｅ５７　（ＪＡ２２１／ｐＡＨＥ２）及びＥ６８　（ＪＡ２２１／、ＡＨＥＩ Ｏ）を３０℃で２５Ｏｒｐｍにて一夜増殖させた。その培養物を１＝１００に希 釈し、そしてＡ６００が０．５となるまで３０°Ｃ，２５０ｒｐｍで増殖させた ０次にその培養物を４２℃で増殖するようにした。大腸菌株Ｅ１０２　（ＢＬ２ １　（ＤＥ３）　ｐＬｙｓ　Ｓ／ｐｃＢＨ６）は３７°Ｃで一夜増殖させ、１： １００に希釈し、そしてＡ６００が０．５となるまで増殖させた０次いでＩＰＴ Ｇをこの培養物に１．５−Ｈの最終濃度となるまで加えた。１５分後、リファン ピシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるまで加えた。その培養物を３７℃でイ ンキュベートし、且つその増殖中２５０　ｒｐ−で振った。各培養物を誘発の６ ０．９０及び１２０分目において取った。 サンプルを、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びリパーゼに対して 発生せしめた抗血清を用いるウェスタン分析により分析した０図９及び１０を参 照のこと、リパーゼタンパク質はｐＡＨＩ！２　又はｐＡＨＥｌｏのいづれかを 含む株において同量で誘発されることが観察された。大多数の約９５％のリパー ゼが、２五ニエ至丸入皇バ之ヱより単離された成熟リパーゼよ、り大きく、そし てそのサイズは完全プレリパーゼについて予測されるそれと一致した。マイクロ タイターアッセイによってリパーゼ活性についてもサンプルをアッセイした。リ パーゼ活性はＥ５７の培養物（ｐＡＨＥ２　、１ｉｐＡ＋ｌｉ■Ａ）から観察さ れたが、Ｅ６８　（ｐＡＨＥｌｏ、　１ｉｐＡのみ）又はＥＩＯ２（ｐｃＢＥ６ 　、　ｌｉｍＡ）の培養物からは観察されなかった。 結果が示すには、リパーゼタンパク譬は１１■Ａ遺伝子の存在下及び非存在下に おいて同量で作られるが、しかしｌｉｍＡの非存在下ではリパーゼ活性は検出さ れなかった。活性リパーゼはｌｉ■Ａ遺伝子も存在しているときにのみ生産され た。 例４ Ｌｉｐ及びＬｉ−の精製 ＪＡ２２１／ｐＡＥＨ２：ＪＡ２２１／ｐＡＥＨ１０；　ＢＬ２１／ｐＬｙｓ　 Ｓ／ｐｃＢＥ６及びＢＬ２１の一夜培養物を１００　ｍｌのＬＢ培地に１：１０ ０に希釈し、そして０．５の００６００値に増殖させた。　ｐＡＨＥ２及びｐＡ ＨＥｌｏの場合における熱による誘発、並びにｐＣＢＥ６の場合におけるＩＰＴ Ｇによる誘発を２時間実施した０次にその培養物を５００　ｇ、　１５分、４℃ で遠心した。 細胞を記載の方法により溶解せしめた。　Ｌｔ−タンパク質は細胞リゼートの可 溶性画分の中で見い出された。リパーゼは封入体において残っていることが見い 出された。封入体はＭａｒｓ　ｔｏｎら（１９８４）より採用した方法により用 意した。純粋なリパーゼ及びＬｉｌ１タンパク質を、封入体及び可溶性リゼート 画分それぞれのＳＯ３−ＰＡＧＥを経て、ＨａｇｅｒとＢｕｒｇｅｓｓ　（１９ ８０）記載の方法により調製した。サンプルは１２％の５Ｏ３−ＰＡＧＥにより 分けた。電気泳動後、そのゲルをトランスファーバッフｙ　（１０ｗＭのＣＡＰ Ｓ、　１０％のメタノール、　ｐＨ１１）に２０ｓｉｎ浸した。そのゲルを、１ ００％のメタノール（５〜１０秒）及び蒸留水（２Ｘ１ｍｉｎ）で予備処理して おいたプロプロット上にエレクトロプロットし、次いでトランスファー−バッフ ァーに浸した。エレクトロプロットをトランスファーバッファーの中で室温で３ 時間、２００　ｍＡで実施した。プロットをサンドイッチから取り出し、蒸留水 、次いでメタノールの中ですすいだ（５〜１０秒）。次にそのプロットを１％（ Ｖ　／　Ｖ　）の酢酸、４０％（Ｖ／Ｖ）のメタノール中のアミドブラック（０ ，１％Ｗ　／　Ｖ　）の中で１　ｗｉｎ染色した。そのプロットを蒸留水を頻繁 に交換しながらすすぎ、風乾し、次いで濾紙の層の間で＝２０°Ｃで保管した。 　ＬｉｗＡ及びプレリパーゼに相当するバンドを切り出し、そしてＡｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　４７７Ａタンパク質シーケンサ−で直接配列決定し た。 下記の配列が得られた。 ＬｉｍＡ　（ｐＣＢＥ６）　：　ＴＡＲＧＧＲＡＰＬ−ＲＲＡＶＶＹＧＡＶＧ　 （ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　６）ｐｒｅＬｉｐＡ　（ｐＡＨＥ２）　：　ＡＲＴＭＲ ３ＲＶＶＡＧＡＶＡ−ＡＭＳＩＡ　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　７）ｐｒｅＬｉｐＡ 　（ｐＡｌ（ＥＩＯ）：　ＡＲＴＭＲＳＲＶＶＡＧＡＶ−−ＡＭ−ＩＡ　（ＳＥ ｏ　１０　Ｎｏ　８）Ｎ−末端メチオニンが削除されていることを除き、その配 列はＤＮＡ配列から推定したＬｉｍＡ及びｐｒｅＬｉｐＡについての予測通りの 配列であった。 方法の欄に記載の通りに、ポリクローナル抗体を発生するためにゲル精製Ｌｉｌ １タンパク質を使用した。 タンパク質の純度を更なるＳＯ５−ＰＡＧＥ分析によりチェックした。 例５ ｐＡＦＩＥ２及びｐＡＨＥｌｏ　ＬｉｐＡの変性及び再生変性／再生実験を、ｐ ＡＨＥ２又はｐＡＨＥｌｏのいづれかに由来のＬｉｐＡ（封入体の中に存在）と 、ＬｔｍＡ　（ｐＣＢＥ６　、そして細胞リゼートの中に存在）とにより実施し た。６０μｌの封入体を様々な容量のｐＣＢＥ６細胞リゼート（０〜３０μｌ） ”と混ぜ、そして８Ｍの尿素の中で一緒に可溶化させた。再生は、濃度の低まっ ていく尿素に対する透析により実施した。実験は５％のグリセロールの存在下及 び非存在下で実施した。リパーゼ活性をｐＨスタットを利用して測定した。 実験結果は（下記に示す）、リパーゼ活性の％の上昇は、増加してい（ＬｉｍＡ Ｏ量の存在下での変性／再生により回復すること、及びグリセロールの存在はリ パーゼ活性の回復に影響しないことを示唆した。 ＡｌＨ３びＡＨＥｌｏＬｉＡについての封体未希釈；リゼート由来のＬｉｍＡ 棗五」１口１生 ｐＡＨＥ２　＋　０μ　ＩＬｉｍＡ　７．５　５．３　５．３ｐＡｌ（Ｅ２　＋ １０ｔＩＩ　ＬｆＡ　７．５　９．３　８．３ｐＡＨＥ２　＋２０μＩ　Ｌｉｓ ＋Ａ　７．５　１２．３　９．０ｐＡＨＥ２　＋３０μＩ　ＬｉｍＡ　７．５　 １３．２　１３．５ｐＡＨＥＺ　＋無−Ｌｉ−＾ リゼート、　３０ｔｔ　Ｉ　７．５　５．Ｏｎｄ。 ｐＡＨＥ１０＋　ＯｐＬ　ＬｉｍＡ　Ｏ，００，００，０ｐＡＨＥｉｌｏ　＋　 １０μＩ　ＬｉｍＡ　Ｏ，０６，５１０，５ｐＡＨＥ１０＋２０μ　Ｉ　Ｌｉ５ Ａ　Ｏ，０Ｂ、３　８．５ｐＡＨＥ１０　＋３０μ　ｌ　Ｌｉ−八　〇、０　１ ６．０　１１．０ｐＡＨＥ１０＋無−ＬｉｍＡ リゼート、　３０ｔｔ　ｌ　Ｏ，００，Ｏｎｄ。 例６ ｐＡＨＥ２及びｐＡｔｌＥｌｏ　ＬｉｐＡの変性及び再生この一式の実験のため に、封入体画分を１：１０に希釈した。ｐＡＩＩＥ２及びｐＡＨＥｌｏ　（ｌｉ ｐ）封入体並びにｐＣＢＥ６　（Ｌｉｏｒ）細胞リゼートのサンプルを５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。変性／再生実験において用い たタンパク質の量を同定するためにＢｉｏｒａｄタンパク質アッセイを利用した 。　１０ｕ　ＩのｐＡＨＥ２封入体は１０ｕｇのタンパク質を含むことが決定さ れた；１ｏμＩのｐＡＨＥ１０封入体は８μｇのタンパク質を含んでいた；そし て１０μｌのｐＣＢＥ６リゼートは２５μｇの総タンパク質を含んでいた。 この実験の結果は（下記に示す）、変性／再生反応におけるＬｉ間への量の上昇 は、リパーゼ活性の回復率の初期上昇をもたらすことを示唆する。更なる量のＬ ｉｍＡの反応への付加は阻害的である。 ＡｌＢ２　びＡＨＨＩＯｌバーゼにつぃ　の封入体は１：１０に希釈；リゼート 由来のＬｉｌ１＾ｐＡＨＥ２１０μｌ０１４ ｐＡＨＥ２　ｚ　＋１０μＩ　ＬｉｍＡ　５．６１）ＡｌＢ２　＃　＋１５ｕ　 ｐ　ＬｉｍＡ５．７ｐＡＨＥ２　−　＋２０μ　Ｉ　ＬｉｍＡ　４．５ｐＡＨＥ ２　＃＋３０μｌ　Ｌｉ騰＾９．５１１ＡＦＩＥ２　’　＋４０ｕ　ｌ　Ｌｉｍ Ａ　３．２ｐＡＨＥ１０１０μＩ　Ｏ，０ ｐＡＨｆ！１０　〃　＋　１０μ　ｌ　ＬｉｍＡ　２．５ｐＡＨＥ１０　〃＋　 １５μＩ　Ｌｉｇ＋Ａ　７．８ｐＡＨ［＋１０　〃　＋２０μ　Ｉ　ＬｉｍＡ　 ７．３ｐＡＨＥ１０　＃　＋３０μｌ　ＬｉｍＡ　３．５ｐＡＨＥ１０　＃　＋ ４０μＩ　ＬｉｍＡ０．５例７ ２＾二上天丈入　セパシア　ＤＳＭ　３９５９由来のリパーゼ及びプレリパーゼ Ｐ、セパシア　ＤＳＭ　３９５９　（それよりｌ１ｐＡ及び１ｉｍＡをクローン した株）を誘発して、８０ｇ／Ｉのオレイルアルコールを添加したＬＢ培地の中 での増殖によりリパーゼを生産させ、次いで細胞外、ベリプラズマ及び細胞内画 分をＮｅ−とＨｅｐｐｅｌ　（１９６５）に記載の通りに単離しイムノプロット （図１１）及びリパーゼ活性分析は、細胞外画分は活性な成熟リパーゼのみを含 み、一方、細胞内画分は不活性なプレリパーゼのみを含むことを示した。 タンパク質％ 両分　リパーゼ活性　−プレリパーゼ　リパーゼ細胞内　１００　ｎｄ 細胞外　＋　ｎｄ　ｉｏ。 ＬｉｍＡが大腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ３）　ｐＬｙｓ　Ｓ　ｐＣＢＥ６の抽出物と して供されたとき、Ｐ、セパシア由来の成熟細胞外リパーゼはＬｉｍＡの存在下 においてのみ、変性／再生後に定量的に再活性化されることができた。 同一の実験において、ＬｉｍＡを伴って又は伴わないで細胞内プレリパーゼを利 用したときは、下記の表から明らかな通りリパーゼ活性は認められなかった。 Ｐ、セパシアの細胞画分　変性前のＬＵ　再生後のＬＵ細胞内画分（プレリパー ゼ） ２０μｌ　＋　Ｏｐ　Ｉ　ＬｉｍＡ　Ｏ，００，０２０ｕ　Ｉ　＋１０μ　Ｉ　 ＬｉｗＡ　Ｏ，００，０２０ｕ　Ｉ　＋２０μ　ｌ　ｌ、ｉｍＡ　Ｏ，００，０ ２０ｕ　Ｉ　＋３０．ｃｚ　Ｉ　ＬｉｍＡ　Ｏ，００，０２０μＩ　＋３０ｔｔ 　ｌ無−ＬｉｍＡ　’）ゼートｏ、ｏ　ｏ、。 細胞外画分（成熟リパーゼ） ２０ｕ　ｌ　＋　０７ｚ　Ｉ　ＬｉｍＡ　１．５　０．０２０μＩ　＋１０μＩ 　Ｌｉｓ＋Ａ　１．５　０．４２０ｕ　Ｉ　＋２０μＩ　ＬｉｍＡ　１．５　０ ．８２０μ　１　＋３０μ　Ｉ　ＬｉｍＡ　１．５　１．３２０ａ　Ｉ　＋３０ ．ｃｉ　Ｉｆｉ−ＬｉｍＡ　’Ｊ（’　−ト１．５　０．０再生実験中でのＬｉ ｍＡによる、Ｐ−ｔ−五之ヱ由来のプレリパーゼではなくリパーゼの活性化は、 大腸菌の中で生産されたリパーゼタンパク質を利用しての結果と一致した。大腸 菌リパーゼサンプルは約５％の成熟タンパク質及び９５％のプレリパーゼより成 る。変性前（ｐＡＨＥ２のみ）及び再生後（ｐＡＨＥ２及びｐＡＨＥｌｏ　）に 観察されたリパーゼ活性の値は、Ｓ０５−ＰＡＧＥで認められたリパーゼタンパ ク質の総量より予測される値のほぼ５％に相当した。 例日 成熟ＬｉｐＡタンパク質の発現のための構築シグナルペプチドを欠く形態、即ち 成熟リパーゼとしてリパーゼＬｉｐＡが発現されるプラスミドを構築した。これ らは成熟リパーゼをエンコードするｌ　ｉｐＡ遺伝子の改変バージョン、それに 続＜ＩｉｍＡ遺伝子を含むｐＡＩＩＥ１９　（図１２）、及び１ｉ＊Ａ抜きの成 熟リパーゼをエンコードするｐＡＨＥ２２　（図１３）である、それらは下記の 通りに構築した：下記のＤＮＡフラグメ；／トを合成した（標準方法）：く旧ｕ ｌ＞　＜Ｈｉｎｄｌｌ？ ５　’　−ＣＧＣＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡ ＡＴＣＡＴＧＧＣＣ−３’−ＡＴＴＣＧＡＡＧＴＧＴＡＡＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣ ＣＴＣＴＴＡＧＴＡＣＣＧＧ−（Ｍｌｕｌ） ＧＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＧＧＣＧＡ　−３’　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　９）ＣＧ ＡＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣ−５’　（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　１０） このＤＮＡフラグメントは基本的には、バチルス　−”Ｊ　ｓ　’−；ｈ　）Ｌ ／　Ｑ。 ：ｌ　ａｓｙＬリポソーム結合部位及び開始コドンを、成熟ＬｉｐＡタンパク質 のＮ末端由来のアミノ酸ＡＡＧＹＡＡ　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　１１）をエンコ ードする配列の前に含む。 このＤＮＡフラグメントを、旧ｕｌ消化ｐｓＪ４２０　（ＷＯ９０１００９０Ｂ に記載のｐｓＪ４１６と同一）にリゲートし、そしてｐｓＪ８３８をプラスミド として単離した。その中の合成りＮＡフラグメントにおける旧ｎｄｎ［部位はｐ ｓＪ４２０上のａｍｙＬプロモーターに近位する。 ｐＳＪ８３８はａｍｙＬプロモーター、　ａｍｙＬ　ＲＢＳ　、　ＬｉｐＡの最 初の６コドンに融合したａｍｙＬシグナルペプチド、ａｍｙＬ　ＲＢＳ−、成熟 １　ｉｐＡ及びｌｆＡを保有する。 ｐＳＪ８３Ｂからの組換により（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、１９９０に本質的に記 載の通り）プラスミドｐｓＪ８９７を獲得し、これはａｍｙＬプロモーター、ａ ｗｙＬＲＢＳ及び成熟＋ｔｐ＾、それに続＜　ＬｉｍＡを含む、　ｐＳＪ８９７ 上のａｍｙＬ　ＲＢＳからのすぐ上流に制限酵素Ｎｄｅｌに関する認識配列があ る。 ｐＡＨＥ１９を、ｐＪＷ２の４．９ｋｂのＮｄｅ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメント 、ｐＳＪ８９７の０．４６ｋｂ（７）Ｎｄｅｌ　−Ｂ’ａｓＨＩフラグメント及 びｐｓＪ１５０の２．０７ｋｂのＢａｇ■Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントのリゲー シッンにより構築した。 ｐＡＨε２２を９４１（［！１９から、ＣＩａＩ＋Ｎｏｔｌ消化及びリゲーショ ン、それに続く末端をプラント化するためのエクソヌクレアーゼＳ１処理により む大腸菌Ｊ＾２２１からリパーゼ活性が認められた。 例９ ＬｉｍＡを伴う及び伴わないでの成熟ＬｉｐＡの変性及び再生成熟リパーゼを、 方法において記載した細胞の誘発、回収及び溶解を経た可溶性画分として用意し 、そして方法において記載した通り、Ｌｉ■＾含有細胞リゼーすの存在下及び非 存在下での変性／再生実験において利用した。 この実験の結果（下記の表）、Ｌｉ−の存在下で大腸菌で生成された成熟Ｌｉｐ Ａのみが、活性リパーゼ酵素をもたらしめるように再生されうることを示した。 ｐＡＨＩ！１９　：成熟ＬｉｐＡ、　ＬｉｍＡ。 ｐＡＨＢ２２　：成熟［、ｉｐＡ。 変性前のＬＵ　変性後のＬｌｌ ｐＡＨＥ１９（１００μｍ　）　０．５　０．５ｐＡＨＥ１９（１００μ　１　 ）　＋ＬｉＩＩＡ　（１０ｔ！　ｌ　）　０．５　０．５ｐＡＨＥ１９（１００ μ　１　）　＋Ｌｉａ＋Ａ　（２０／７　１　）　０．５　０．７５ｐＡＨＥ１ ９（１００，ｃｒ　ｌ　）　＋ＬｉｍＡ　（３０ｕｌ　）　０．５　０．７５ｐ ＡＨＥ１９（１００μｌ　）十無−Ｌｉｅ＾　リゼート　０．５　０．２５（３ ０μｍ） ｐＡＨＥ２２（１００ｕ　ｌ　）　０．０　０．０ｐＡＨＥ２２（１００μ　ｌ 　）　＋ＬｉｍＡ　（１０，ｃｒ　Ｉ　）　０．０　０．５ｐＡＨＨ２２（１０ ０μｍ　）　＋ＬｉｍＡ　（２０ｕｌ　）　０．０　０．７５ｐＡＨＥ２２（１ ００μＩ　）　＋ＬｉｍＡ　（３０ｕ　Ｉ　）　０．０　０．７５ｐＡＨＥ２２ （１００μｍ　）十無−ＬｉｍＡ　リゼートｏ、ｏ　ｏ、。 （３０μｌ） 例ＩＯ Ｐ　−土％＞ヱＤＳＭ　３４０１がらの１ｉｐＤ及びｌ　ｉｍＤのクローニング 及び配列株７５−１０Ａとも呼んでいる旦工皇バ之ヱ、ＤＳＭ　３４０１の別の 単離体は、ＤＳＭ　３９５９由来のＬｉｐＡに類似なリパーゼを生成する。 ＤＳＭ　３４０１由来のリパーゼエンコードＤＮＡのクローニング及び配列決定 （１１０９０１００９０８に記載の標準方法を採用）は、１ｉｐＡ及びＬｉｍＡ に対して比較的高い相同性を有する以降１ｉｐＤ及びｌ　ｉｍＤと呼ぶ二本の遺 伝子を示した。 極端なるＤＮＡのＧＣ含有に基づき、その配列は決定することが困難であり、従 っていまだに部分的に未決定な配列が残っている一１ｉｐＱ遺伝子における４位 、及びＩｉｍＤ遺（芸子における２箇所の位置。 Ｉ　ｆ＊Ｄ開始コドンは、ｌ１ｐＡ及びｌ　ｉｍＡの場合のように、ｌｉｐ［ｌ 停止コドンから３塩基対下流に位置する。 １ｉｐＤをエンコードするＤＮＡ配列をＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１に、そしてＳＥ Ｑ　ＩＤＮ０３に対応のタンパク質配列を示す、　１ｉｍＤをエンコードするＤ ＮＡ配列をＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２に、そしてＳＥＱ　１０　Ｎｏ　４に対応の タンパク質配列を示す。 ＬｉｐＡと１ｊｐＤのアミノ酸配列の整合研究より、１ｉｐＤアミノ酸配列が推 定できない５つの箇所に加えぞ、酵素の成熟部において２２箇所の相違があった 。 ＬｉｍＡとＩｉｍＤのアミノ酸配列の整合研究により、ｌｉｍＤのアミノ酸配列 が推定できない２つの箇所に加えて、３２箇所の相違があった。 これらの研究に基づき、１ｉｐＤとＬｉｐＡ、及び１　ｉｍＤとＬｉ−＾は相同 性ではあるが、しかしながら異なるリパーゼ及びリパーゼ調節因子タンパク質で あることが明らかとなった。 従って、ＬｉｍＡが変性／再生実験において１ｉｐＤを活性化できるかが課題と なった。 例ＩＩ Ｐ、セパシアから精製した１ｉｐＤによる変性／再生実験株７５１０−Ａ　（＝ ＤＳＭ　３４０１）由来の１ｉｐＤを、標準のタンパク質精製法を利用して、Ｄ ＳＭ　３４０１からの部分精製タンパク質として用意した。 Ｌｉ−への存在下及び非存在下で、株７５１０−Ａの由来のリパーゼを用いて変 性／再生実験を行った。１８ＬＵを、様々な比のＬｉｍＡにより変性及び再生し 、そして回復リパーゼ活性を測定した。リパーゼ活性はｐｉ（スタットで測定し た。コントロールとして、尿素の非存在下でも実験を行った。 結果が示すには、７５１０〜八リパーゼをＬｉｍＡの非存在下で変性及び再生す ると、リパーゼ活性は有効に回復しなかった。高めたレベルのＬｉ−＾を７５１ ０−Ａリパーゼに加えると、高められたレベルのリパーゼ活性が認められた。し かしながら、回復したリパーゼ活性の％は非常に低いままであった。 ７５１０−Ａ　Ｉパーゼについての １３．０ＯＯＬＵ／■ｌのストックを使用；リゼート由来のＬｆＡ７５１０Ａ　 １５μｍ　−１８０，２５１，４７５１〇八　〃　＋　５μ　Ｉ　ＬｉｍＡ　１ ８　０，２５　１．４７５１０＾　〃＋１０μｌ　ＬｉｍＡ　１８　０．４　２ ．２７５１０＾　〃　＋１５μ　Ｉ　Ｌｉ−＾　１Ｂ　０．３５　２．０７５１ ０Ａ　〃　＋３０μ　ｌ　ＬｉｍＡ　１Ｂ　０．４５　２．５リパーゼ活性の低 い回復率についての説明は後にする。特定の調製品中のリパーゼは、変性／再生 の際に劣化することが認められ、従って実験を、ＤＳＭ　３４０１由来のリパー ゼ及び誘発したＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓ　Ｓ　ｐＣＢＥ６由来のＩ、ｆ＊ Ａの新たな部分精製調製品で繰り返した。以下の結果は、ＬｉｅｉＡが１ｉｐＤ をよ（活性化できることを示す。 変性前ＬＳＩ　再生後ＬＵ　％回復率 ＋ｉｐＤ　（１０ｕｌ　）　＋　８０　０．１　０．０８１ｉｐＤ　（１０μｌ ）＋５μｌ　ＬｉｍＡ　８０　４４　３５１ｉｐＤ　（１０μ　１）＋１０μ　 ｌ　ＬｉｍＡ　８０　４５　３６１ｉｐＤ　（１０μｍ）＋２０μｌ　ＬｉｍＡ 　８０　５６　４５１ｉｐＤ　（１０ｔＩ　１　）　＋３０μ　ｌ　ＬｉｍＡ　 ８０　５５　４４１ｉｐＤ　（１０μ　ｌ）＋４０μ　ｌ　ＬｉｍＡ　８０　５ ３　４２例１２ １ｉｐＤの発現のための構築 ＬｉｐＡ配列は成熟ＬｉｐＡ配列における７個のアミノ酸に対応する位置におい てＭｌｕ１部位を、そしてｌｉｐ＾停止コドンの後にＣｌａｌ部位を含む。 １ｉｐＤ配列は同じ位置にＭｌｕＩ及びＣｌａｌ部位を含む。 従って、プラスミドは前者のｌ　ｉｐＡ発現ベクターに基づき、バイブリドタン パク質の発現を可能とするために、１ｉｐＡ　Ｍｌｕｌ−ＣＩａＩフラグメント の代りに、成熟タンパク質における最初の７個のアミノ酸のみがＬｉｐＡに由来 しており、一方、成熟タンパク質の残りがｌ　ｉｐＤに由来している１ｉｐＤ　 Ｍｌｕｌ−Ｃ１ａｌフラグメントの挿入により簡単に構築できうる。 ｐＡＨＥ１６　（図１４）はＬｉｐＡ−１ｉｐＤバイブリドリパーゼをＬｉｍＡ と共に発現し、そして前述の通りのＭｌｕｌ　Ｃ１ａｌフラグメントの交換によ りｐＡＨＥ２から構築されたものである。　ｐＡＨｆ！２３　（図１５）はＬｉ ｐＡ−１ｉｐＤバイブリドリパーゼのみを発現し、そしてＬｉ−タンパク質は発 現しないる。これはｐＡ）ＩＩ！１６より、Ｌｉ−＾のＣ１ａｌ−Ｎｏｔｌフラ グメントの欠失により構築されたものである。 例１３ １ｉｐ＾−１ｉｐＤバイブリドリパーゼの変性／再生ｐＡＨＨ１６及びｐＡＨＥ ２３から発現させた１ｉｐＡ−１ｉｐＤバイブリドタンパク質を、方法において 記載の通りにＬｉｗＡを加えた及び加えていない変性／再生実験に用いた。 この実験に用いたリパーゼサンプルは、ｐＡＨＥ１６又はｐＡｔｌＥ２３のいづ れかを含む誘発大腸菌Ｊ＾２２１細胞の溶解を経た可溶性画分である（誘発に基 づいて大多数のリパーゼタンパク質は封入体に残っていたが、可溶性画分は若干 のリパーゼをまだ含んでおり、そして封入体よりも可溶画分の中に比較的多くの 成熟リパーゼがあるようであった）。 Ｌｉ１Ｉ＾はＢＬ２１　（ＤＨ３）　ｐＬｙｓ　Ｓ　ｐＣＣ５０誘発培養物より 得た。 下記に示す結果は、ＬｉｍＡが変性／再生実験においてＬｉｐＡ−ＬｉｐＤハイ ブリドリパーゼを活性化できることを示す。 変性前のＬＵ　再生後のＬｌｌ ｐＡ［（Ｅ１６　（３０ｕｌ　）　＋　０．５　０．５ｐＡｌｌＥ１６　（３０ μ　ｌ　）　＋ＬｉｍＡ　（１０μ　１）　０．５　０．７５ｐＡｌｌＩ！１６ 　（３０μｌ　）　＋Ｌｉ■Ａ（２０μｌ）　０．５　０．７５ｐＡＨＥ１６　 （３０μ　ｌ　）　＋ＬｉｍＡ　（３０μ　１）　０．５　０．７５ｐＡＨＥ１ ６　（３０μｌ　）　＋Ｌｉ■＾（４０μｌ　）　０．５　１．０ｐＡＨＥ２３ 　（３０μｍ）＋　０．０　０．０ｐＡＨＥ２３　Ｃ３０ｕ　ｌ　）　＋Ｌｉｍ Ａ　（１０μｍ　）　０．　ＯＯ，７５ｐ＾■［２３（３０μｌ　）　＋ＬｉＬ ｉｍＡ０μｍ）　０．０　０，７５ＰＡＨＥ２３　（３０μ　１）＋ＬｉＬｉｍ Ａ３０μ　ｌ　）　０．０　１．０ＰＡＨＥ２３　（３０μｍ　）　＋ＬｉｍＡ 　（４０μｍ　）　０．０　１．０ｐＡＨｆ！２３　（３０μｌ）十無−Ｌｉ■ Ａ細胞すゼート　ｏ、　ｏ　ｏ、　。 （４０ｔＩｌ　） 例１４ １ｉｐ−ｌｉｍ融合体の構築 プラスミドｐｓＪ７２１はｐＳＪ３７７の欠失誘導体であり、そのｘｓｂｐはＣ ｌａＩ部位において欠失しており、１ｉｐＡの停止コドン及びＩｉ−の最初の３ 個のアミノ酸についてのコドン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、　１９９１）を欠いて いる。従って、ｐｓＪ７２１は、１　ｉｐＡのＣ末端においての５ｐｈｌ部位に 続く８個のアミノ酸に融合されたＬｉ−タンパク質をエンコードする。 ｐＪＪ７２１の８３８　ｂｐの５ｐｈｌ−Ｎｏｔｒフラグメント（これはｌｉｍ の大部分に融合したｌｉｐのＣ末端を含む）及びｐｓＪ１５０の９１５　ｂｐの ＭｌｕＩ−５ｐｈｌフラグメント（これはりゼートコード配列の大部分を含む） を、Ｍｌｕｌ及びＮｏｔｌで消化しておいたｐＡｌｌＢＢにリゲートし、１ｉｐ −１ｉ園融合プラスミドを作った。　ｌｉ＊Ａｉｎ子の始まりにおいて通常存在 しており、且つｐｓＪ７２１になく、そして１ｉｐ−１ｉ園融合プラスミドにお いてないべきであるＣｌａｌ部位の欠失について形質転換体をスクリーンした。 制限酵素分析からいくつかのプラスミドが適正であることが認められた。そのう ちの６個をｐｃＢＦｌ−６と命名した（図１６）。 大腸菌ＢＬ２１　（ＤＥ３）　ｐＬｙｓ　Ｓを各融合プラスミドにより形質転換 させ、次いでその形質転換体を増殖させ、そしてＩＰＴＧで誘発した。トリブチ リンプレートでのプレート及び培地サンプルにおける活性の分析は、これらのプ ラスミドが誘発に基づきリパーゼ活性を示すことを示した。細胞及び培地の両者 に由来するタンパク質サンプルを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル及び抗リパー ゼ抗血清を用いるウェスタン分析により分析した。サイズにおいてｐＡＨＥ２又 はｐＡＨＨ８により生成されたプロセスを受けていないリパーゼと同一であるリ パーゼタンパク質のみが検出された。誘発実験のタイムコースの初期に採取した サンプルにおいても、期待の高分子量のタンパク質は認められなかった。おそら く、人工１ｉｐ−１ａｌ融合体はタンパク質の連結部でタンパク質分解を特に受 け易いのであろう。 文−藍 Ｃ１ａｒｋｅ、Ｌ、ａｎｄ　Ｃａｒｂｏｎ、Ｊ、（１９７Ｂ）　Ｊ、Ｍｏ１．、 Ｂｉｏｌ、１２（Ｌ　５１７−５３４　。 Ｅｌｌｉｓ、Ｒ，Ｊ、＆　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｉｅｓ、Ｓ、Ｍ、（１９９１）＋ 　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６０．　３２ １−３４７゜Ｈａｇｅｒ、Ｄ、＾、ａｎｄ　Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｒ，Ｒ，（１９８ ０）　Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍ　５ｏｄｉ’ｕｍ　ｄ ｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｐｈａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｔｓ、 ｒｅｍｏｖａｌ　ｏｆｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｐｈａｔｅ、ａｎ ｄ　ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｚｙ＋＊ａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ 　：　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｉｔｈ　ｓｉｇｍａ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　Ｅｓｃ ｈｅｒｉａ　ｃｏｌｔ　ＲＮＡｐｏｌｙｗｅｒａｓｅ、ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ　 ＤＮＡ　ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｅｎｚｙｖＩｅＳ ＋Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０９．　７６−８６　。 Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ＋　Ｓ、＋’５ｋｏｖ、Ｋ、Ｈ，ａｎｄ　Ｄｉｄｅｒｉｃｈ ｓｅｎ＋　８．　（１９９１）　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　 ｅｘｐｒｅｓｓｔｏｎ　ｏｆ　ａ　１ｉｐａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ二１肛譚Ｌ：　１ｉｐａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　 ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｈｏｓｔｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｓｔ＠ｏ　Ｐｉｅｕｄ ｏ＋ｍｏｍｎａｓ　ｇｅｎｅｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｓｒｉｏｌ、１’７３＋　５５９ −５６７ｅＭａｒｓｔｏｎ＋　Ｆ、Ａ、Ｏ，（１９８７）　Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｊｄｅｓ　ｅｘ ｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ、ｃｏｌｔ、Ｉｎ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：Ａ　 ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　（ｅｄ　ロ、　Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ）＋ 　ｖｏｌ、３＋　ｐ、５９．　１ＲＬＰｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ　。 Ｍａｒｓｔｏｎ、Ｆ、Ａ、０．＋　ｐ、Ａ、Ｌｏｗｅ、Ｍ、Ｔ、Ｄｏｅｌ、Ｊ、 Ｍ　Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒ。 １９８４、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｆ　ｐｒｏｃｂｙｗｏｓｉ ｎ　５ｙｎｔｂｅｔｉｚｅｄ　ｉｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ。 ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２　：　８００　。 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｈ，、Ｃｈｕｉ、Ｄ、ｓ、ｌ　Ｌｉｕ、Ｓ＋−Ｗ、ｌ 　Ｄｕｎｎ、Ｊ、Ｊ、＋　ａｎｄＳｔｕｄｉｅｒ、Ｆ、Ｈ，（１９８７）　Ｖｅ ｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｃｌｏ ｎｅｄ　ＤＮＡ５　ｂｙ　Ｔ７　ＲＮＡ　Ｐｏ１ｙｓｅｒａｓｅ、Ｇｅｎｅ　５ ６１２５−１３５　。 Ｓａｓ＋ｂｒｏｏｋ、Ｊ、＋　Ｆｒ１Ｌｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔ ｉｓ−＋　Ｔ、（１９８９）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　１ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎＶａｔｔｕｋａｉ ｔｔｓ、（１９８１）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋＊ｏｌｏｇｙ　２Ｌ 　４６−５２Ｈａｎｇ、　＋１．、　ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、　Ｄ、　Ｊ、　ａｎ ｄ　Ｏ，Ｍａｂｏａｙ、　Ｄ、　Ｊ、（１９９０）Ａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｅ ｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔ７ｇｏｎｅ　１０　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　１ｎｉｔｉ ａｔｉｏｎ　１ｅａｄｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅ ｓ、１８．　１０７０　。 Ｎｅｕ、Ｒ，Ｃ，、Ｈｅｐｐｅｌ、Ｌ、　Ａ、（１９６５）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ、　２４０．３６８５−３６９２゜ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｐ、　Ｌ、＋　Ｈａｎｓｅｎ＋　Ｃ，Ｋ、　Ｐｏｕｌｓｅ ｎ＋　Ｇ、　Ｂ、＋　Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ。 Ｂ、（１９９０）、Ｇｅｎｅ、９６．　３７−４１゜Ｓ、Ａｏｙａｍａ　ら、Ｆ ＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４２　（１）、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９８８．　ｐ ｐ、３６−４０−１　Ｋｕｇｉｍｉｙａ　ら、Ｂｔｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ 、Ｒｅｓ、Ｃｏ５５＋、１４１　（１）、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２６．１９８６．ｐ ｐ、１８５−１９０Ｒ，Ｊ、　Ｅｌｌｉｓ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｍ、　ＨｅｍｍＨｅ ｍｍ１ｎ＋　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、↓什１９８９、ｐｐ、 ３３９−３４２　； Ｊ、Ｅ、ＲｏＬｈｍａｎ、Ｃｅ１１　５９．　１９８９．　ｐｐ、５９１−６０ １Ｒ，Ｍｏｒｊｍｏｔｏ　ら　ｉｎ　５ｔｒｅｓｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　 Ｂｉｏｌｏ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｒ。 Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、ｅｄｓ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９０．　 ｐｐ、１−３６）Ｓ１−３６）Ｓａら＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　 ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｆｌａｒ ｂｏｒ、１９８９Ｓ、Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈ ｅｒｓ＋　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２＋１９８１、ｐｐ、 １８５９−１８６９゜Ｍａｔｔｈｅｓ　ら、　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３．１ ９８４．　ｐＰ、　８０１−８０５以下の配列表において ＳＥＱ　１０　ＮＯ１は１ｉｐＤのヌクレオチド配列であり；ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ２はＩｉ蒙りのヌクレオチド配列であり；ＳＥＱ　１０　ＮＯ３はＩ　ｉｐＤ のアミノ酸配列である。その配列はプレリパーゼのそれであり、成熟リパーゼの 第１アミノ酸残基はＡである（アミノ酸残基４５）。 ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ　４はＩｉ−〇のアミノ酸配列であり；ＳＥＱ　１０　Ｎｏ 　５は１ｉｐ−１ｉ閣融合遺伝子のヌクレオチド配列であり；３８口１０　Ｎｏ 　６−８は例４に説明したペプチドフラグメントであり；そして ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ９−１１は例８に示すヌクレオチド及びアミノ酸配列である 。 配列表 （１）一般情報：ノボ　ノルディスク　Ａ／５（ｉ）出願人： （Ａ）名称：ノボ　ノルディスク　Ａ／５（Ｂ）通り：ノボ　アレ （Ｃ）市　：バグスバード （Ｅ）国　：デンマーク （Ｆ）郵便番号：Ｄに−２８８０ （Ｇ）電話：　＋４５　４４４４８８８８（１１）テレファックス：　＋４５　 ４４４９　３２５６Ｎ）テレ７クス　：　３７３０４ （ｉり発明の名称：活性リパーゼの製造のための方法（ｉｉ）配列の数　：１１ （ｉｖ）コンピューター読み取り方式：（Ａ）媒体のタイプ　：フロッピーディ スク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢ？Ｉ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）作動システム ：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−００５（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン　リリー ス＃１．０、バージラン４１．２５　（ＥＰＯ） （ｖｉ）先の出願のデータｍ： （Ａ）出願番号：　Ｎｏ　ＰＣＴ／ＤＫ９１１００４０２（Ｂ）出願日　：　１ ９９１年１２月２０日（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１についての情報：（１） 配列の特徴： （Ａ）長さ：　１０９２　塩基対 （Ｂ）種Ｗ４＝核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子の型：ＤＮ＾　（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０ （ｎｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｖｉ）起源： （Ａ）’ｌ：シュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：　ＤＳＭ　３４０１ （ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１：＾ＴＧＧＣＣＡＧＡＴ　Ｃ ＧＡＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧ　ＧＣＡＧＧＧＧＣＡＧ　ＴＧＧＣＡ ＴＧＣＧＣ５０ＧＡＴＧＡＧＣＧＴ（：　ＧＣＧＣＣＧＴＴＣＧ　ＣＧＧＧＧＧ ＣＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧＡＴＧ　ＡＣＧＣＴＴＧＣＧ＾　１００ＣＧＡＣＧＣＡ ＣＧＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧ　ＧＣＧＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＡＣＧＡ　Ｃ ＴＡＣＧＣＧＡＣＧ　１５０ＡＣＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＡＴＣＡＴＣＣＴ　ＣＧ ＴＧＣＡＣＧＧＧ　ＣＴＣＡＣＧＧＧＴＡ　ＣＣＧＡＣＡＡＧＴＡ　２００ＣＧ ＣＧＧＧＣＧＴＧ　ＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴ　ＧＧＴＡＣＧＧＣＡＴ　ＣＣＡＧＧ ＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣ２５０ＡＴＧＧＣＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＧ ＴＣＧＣＧＡＡＣＣＴＧＴ　ＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡ　ＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣ３０ ０ＧＧＧＣＣＧＡＡＣＧ　ＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡ　ＡＣＡＧＴＴＧＣＴＣＧＣＧ ＴＡＣＧＴＧＡ　ＡＧＡＣＧＧＴＧＣＴ　３５０ＣＧＣＧＧＣＧＡＣＧ　ＧＧＣ ＧＣＧＡＣＣＡ　ＡＧＧＴＣＡＡＴＣＴ　ＣＧＴＣＧＧＣＣＡＣＮＣＧＣＡＧＧ ＧＣＧ　４００ＧＧＣＴＣＡＣＧＴＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＴ　ＧＣＧＧＣＴＧＴ ＣＧ　ＣＧＣＣＣＧＡＴＣＴ　ＣＧＴＣＧＣＧＴＣＧ　４５０ＧＴＧＡＣＧＡＣ ＧＡ　ＴＣＧＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧＣＮ　ＮＣＣＧＡＧＴＴＣＧ　Ｃ ＣＧＡＣＴＴＣＧＴ　５００ＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧ　ＣＴＣＧＣＡＴＡＣＧ　Ａ ＴＣＣＧＡＣＣＧＧ　ＧＣＴＴＴＣＧＴＣＡ　ＴＣＧＧＴＧＡＴＣＧ　５５０Ｃ ＧＧＣＧＴＴＣＧＴ　ＣＡＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡ　（：ＧＡＧ ＣＡＧＣＡＧ　ＣＣＡＣＡＡＣＡＣＧ　６００ＡＡＣＣＡＧＧＡＣＧ　ＣＡＣＴ ＣＧＣＧＴＣＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧ　ＣＴＧＡＣＧＡＣＣＧ　ＣＣＣＡＧＧＣＣ ＧＣ６５０ＣＧＣＧＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＡＴＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＧ　 ＣＣＴＣＧＧＴＧＣＧ　ＣＣＧＧＧＣＡＧＴＴ　７００ＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧ　 ＣＮＮＮＣＣＧＡＣＧ　ＧＡＡＡＣＣＧＴＧＣＧＧＴＮＣＡＡＣＡＣＧＣＡＴＣ ＴＧＣＴＧ　７５０ＴＡＴＴＣＧＴＧＧＧ　ＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＣＡ ＧＣＣＧ　ＡＣＧＣＴＣＴＣＣＧ　ＴＧＴＴＣＧＧＴＧＴ　８００ＣＡＣＧＧＧ ＣＧＣＧ　ＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡ　ＧＣＡＣＣＡＴ丁ＣＣＧＣＴＣＧＴＣＧＡＴ 　ＣＣＧＧＣＧＡＡＣＧ　８５０ＣＧＣＴＣＧＡＣＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＴ　 ＧＣＧＣＴＧＴＴＣＧ　ＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＴＣ９００ＡＡ ＣＣＧＣＧＧＣＴ　ＣＧＧＧＣＣＣＧＡＡ　ＣＧＡＣＧＧＧＣＴＣＧＴＡＴＣＧ ＡＡＧＴ　ＧＣＡＧＣＧＣＧＣＴ　９５０ＧＴＡＣＧＧＣＣＡＧ　ＧＴＧＣＴＧ ＡＧＣＡ　ＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡ　ＧＴＧＧＡＡＣＣＡＴ　ＡＴＣＧＡＣＧＡＧ Ａ　１０００ＴＣＡＡＣＣＡＧＴＴ　ＧＣ丁ＣＧＧＣＧＴＧ　ＣＧＣＧＧＣＧＣ ＧＡ　ＡＴＧＣＧＧＡＡＧＡ　ＴＣＣＣＧＴＣＧＣＧ　１０５０ＧＴＧＡＴＣＣ ＧＣＡ　ＣＧＣＡＴＧＣＧＡＡ　ＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧ　ＣＴＧＧＣＧＧＧＣＧ 　ＴＧ　１０９２（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２についての情報：（ｉ）配列 の特＠： （Ａ）長さ：　１０３２　塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）ハイポセティカル＝Ｎ。 （ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｖｉ）起源： （Ａｎ：Ｉｆシュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：　ＤＳＭ　３４０１ （ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２：＾τＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴ ＧＡＡＧＧＧＣＧ　ＣＧＣＧＣＣＧＣＴＧ　ＧＣＧＣＧＧＣＧＣＧ　ＣＴＧＣＡ ＧＴＣＴＡ　５０ＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧ　ＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧ　ＣＧＡＴＣＧ ＣＣＧＧ　ＣＧＴＣＧＣＧＡＴＧ　ＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧ　１００ＣＧＧＧＡＴ ＧＧＣＡ　ＴＣＧＣＧＧＴＡＣＧ　ＧＧＴＡＧＣＧＴＣＧ　ＧＣＧＡＡＧＣＧＣ ＣＣＧＡＴＧＣＧＧＣＧ　１５０ＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧ　ＧＣＧＴＧＧＣＴＧＣ ＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧ　ＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧ　ＴＧＣＣＧＧＣＧＡＧ　２００ ＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧ　ＣＣＧＴＣＧＴＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧ ＣＧＣＣＧ　ＣＧＣＧＴＧＣＣＧＣ２５０ＴＣＧＡＴＧＣＧＧＧ　ＣＧＧＣＣＡ ＴＣＴＣＧＣＧＡＡＧＧＴＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧ　ＣＧＡＴＴＴＣＴＴＣ３ ００ＧＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＧＣＧＣＡ　ＧＡＧＣＧＡＣＣＴＣＡＧＴ ＧＣＧＧＣＣＧ　ＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣ３５０ＡＣＴＣＧＴＣＧＴＧ　ＣＧＣＧ ＡＧＡＴＴＧ　ＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴ　ＣＧＡＣＧＧＣＡＣＧ　ＧＣＧＧＣＧＣ ＡＧＧ　４００ＣＣＧＡＧＧＣＧＣＴ　ＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧ　ＣＡＴＣＧＣＴ ＡＴＣＧＴＧＣＧＴＡＴＣＴ　ＣＧＡＣＧＣＧＣＴＣ４５０ＧＣＧＡＡＡＣＴＧ ＣＧＣＧＡＴＧＣＣＧＧ　ＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧ ＣＧＣＧＣＴ　５００ＧＣＡＧＣＴＣＧＣＧ　ＣＴＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡ ＴＣＧＡＴ　ＣＧＣＧＴＡＴＣＧＣＡＣＧＣＴＣＧＧＣＧ　５５０＾ＣＴＧＧＡ ＧＣＣＡ　ＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＣＡ　 ＧＣＧＣＴＡＣＧＡＴ　６００ＣＴＣＧＣＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＧＣ ＡＧＧＡＴＣＧＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＧ　ＡＴＧＣＧＣＡＧＡＡ　６５０ＧＧＣ ＣＧＡＡＣＧＧ　ＣＴＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡ　ＧＡＴＧＣＣＧ ＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＧＣＧ　７００ＣＧＧＣＴＣＡＧＣＡ　ＧＧＣＧＧＴＣＧ ＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＧ　ＣＣＧＣＧＡＴＣＧＡ　ＣＣＡＧＡＧＴＣＣＧ　７ ５ＯＮＡＧＴＴＧＣＡＧＡ　ＡＧＡＧＣＧＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＧＡＴ　ＧＣ ＧＡＴＧＣＧＣＧ　ＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣ８００ＧＣＡＧＡＣＧＣＴＣＧＧＧＣ ＣＣＧＡＧＧ　ＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧ　ＣＧＴＣＧＧＣＣＡＧ　ＡＴＧＣＡＧＣ ＡＧＧ　８５０ＡＣＧＡＣＧＣＡＴＣＧＴＧＧＣＡＧＡＧＮ　ＣＧＣＴＡＣＧＣ ＧＧ　ＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＣＧ　９００ＣＡＧＡＴＣＧＡＧ Ｔ　ＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴ　ＧＴＣＧＣＣＧＣＡＧ　ＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧ　Ｃ ＧＣＡＧＡＴＣＧＣ９５０ＣＧＣＡＣＴＧＣＧＧ　ＣＡＧＣＧＣＧＴＧＴ　ＴＣ ＡＣＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＧＧ　１０００ＣＧＴ ＣＡＣＴＣＧＡ　ＴＣＧＣＧＧＧＧＣＧ　ＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧ　１０３２ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：３６４アミノ酸 （Ｂ）種１１二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ　）分子の型：タンパク質 （ｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０ （ｉｔｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメントの型；内部 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：シュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：　ＤＳＭ　３４０１ （ｘｉ　）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　３：Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ 　Ｖａｌ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：３４４アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）Ｉの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （Ｍｉ）ハイボセティカル：Ｎ。 （ｉｎ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：シュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：ＤＳ台３４０１ （ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　４：丁ｒｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＡｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。 Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　 Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ８０　Ｂ５　９０ ＾１ａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａ ｓｐ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇ ｌｕ　Ｇｉｎ　ＴｒｐＡｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌ ａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ１１ｅ 　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ 　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＡｌａＶａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　 Ｇ１ｎ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：　２１１８　塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）Ｉの数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｊ）ハイボセティカル＝ＮＯ （ｉｉｉ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　５：＾ＴＧＧＣＣＡＧＧＡ　Ｃ ＧＡＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧ　ＧＣＡＧＧＧＧＣＡＧ　ＴＧＧＣＡ ＴＧＣＧＣ５０ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＧＣＧＣＣＧＴＴＣＧ　ＣＧＧＧＧＡＣＧ ＡＣＣＧＣＧＧＴＧＡＴＧ　ＡＣＧＣＴＣＧＣＧＡ　１００ＣＧＡＣＧＣＡＣＧ ＣＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧ　ＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＧＧ　ＣＴＡ ＣＧＣＧＧＣＧ　１５０ＡＣＧＣＧＴＴＡ（：ＣＣＧＡＴＣＡＴＣＣＴ　ＣＧＴ ＧＣＡＣＧＧＧ　ＣＴＣＴＣＧＧＧＴＡ　ＣＣＧＡＣＡＡＧＴＡ　２００ＣＧＣ ＣＧＧＣＧＴＧ　ＣＴＣＧＡＧＴＡＴＴ　ＧＧＴＡＣＧＧＣＡＴ　ＣＣＡＧＧＡ ＧＧＡＣＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡ　２５０ＡＣＧＧＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＡＣＧ ＴＣＧＣＧＡＡＣＣＴＧＴ　ＣＧＧＧＴＴＴＣＣＡ　ＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣ３０ ０ＧＧＣＣＣＧＡＡＣＧ　ＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡ　ＡＣＡＧＴＴＧＣＴＣＧＣＴ ＴＡＣＧＴＧ＾＾ＧＡＣＧＧＴＧＣＴ　３５０ＣＧＣＧＧＣＧＡＣＧ　ＧＧＧＧ ＣＧＡＣＣＡ　ＡＧＧＴＣＡＡＴＣＴ　ＣＧＴＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧ ＣＧ　４００ＧＣＣＴＣＴＣＧＴＣＧＣＧＣＴＡＴＧＴＴ　ＧＣＴＧＣＣＧＴＣ Ｇ　ＣＧＣＣＣＧＡＴＣＴ　ＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧ　４５０ＧＴＧＡＣＧＡＣＧ Ａ　ＴＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＡＴＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧ　ＣＣＧ ＡＣＴＴＣＧＴ　５００ＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧ　ＣＴＣＧＣＧＴＡＣＧ　ＡＴＣ ＣＧＡＣＣＧＧ　ＧＣＴＴＴＣＧＴＣＡ　ＴＣＧＧＴＧＡＴＣＧ　５５０ＣＣＧ ＣＧＴＴＣＧＴ　ＣＡＡ丁ＧＴＧＴＴＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡ　ＣＧＡＧＣＡＧ ＣＡＧ　ＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣ６００ＡＡＣＣＡＧＧＡＣＧ　ＣＧＣＴＣＧＣＣ ［；ＣＡＣＴＧＣＡＧＡＣＧ　ＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧ　ＣＡＣＧＧＧＣＣＧＣ６ ５０ＣＡＣＧＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＡＴＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＧ　ＣＣＴ ＧＧＧＴＧＣＧ　ＣＣＧＧＧＣＡＧＴＴ　７００ＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧ　ＴＧＣ ＧＣＣＧＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＣＧ　ＧＣＧＧＣＡＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＣ ＴＧ　７５０ＴＡＴＴＣＧＴＧＧＧ　ＣＣＧＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣ Ｇ　ＡＣＧＣＴＣＴＣＣＧ　ＴＧＴＴＣＧＧＣＧＴ　８００ＣＡＣＧＧＧＣＧＣ Ｇ　ＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡ　ＧＣＡＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＴＣＧＡＴ　ＣＣ ＧＧＣＧＡＡＣＧ　８５０ＴＧＣＴＣＧＡＣＣ丁　ＧＴＣＧＡＣＧＣＴＣＧＣＧ ＣＴＧＴＴＣＧ　ＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＴＣ９００ＡＡＣＣＧ ＣＧＧＣＴ　ＣＣＧＧＧＣＡＧＡＡ　ＣＧＡＣＧＧＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＡＡＧ Ｔ　ＧＣＡＧＴＧＣＧＣＴ　９５０ＧＴＡＣＧＧＣＡＡＧ　ＧＴＧＣＴＧＡＧＣ Ａ　ＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡ　ＧＴＧＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＧＡＣＧＡＧ＾　１０ ００ＴＣ＾＾ＣＣＡＧＣＴ　ＧＣＴＣＧＧＣＧＴＧ　ＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴ　Ａ ＴＧＣＧＧＡＡＧＡ　ＴＣＣＣＧＴＣＧＣＧ　１０５０ＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡ　 ＣＧＣＡＴＧＣＧＡＡ　ＣＣＧＧＣＴＧ八＾Ｇ　ＣへＧＧＣＧＧＧＧＧ　ＣＡＣ ＧＡＧＧＡＧＧ　１１００＾ＣＧＣＧＣＧＣＣＧ　ＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧ ＣＣＧＴＧＧＴ　ＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧ　１１５０ＣＧＧ ＣＧＡＴＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＣＧ　ＡＴＧＴＧＧＡＧＣＧ　Ｇ（：ＧＣＧＧ ＧＣＣＧ　ＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧ　１２００ＡＣＧＧＧＣＧＣＡＴ　ＣＣＧＧＣ ＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＴＧＣＧ　ＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＣＧＧＡＣＣＧＧＣ １２５０ＴＧＣＣＧＣＡＣＣＧ　ＣＣＧＣＡＧＧＣＣＧ　ＣＣＧＴＧＣＣＧＧＣ ＡＡＧＣＡＣＧＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＴ　１３００ＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧ　 ＣＴＣＣＡＧＣＧＣＧ　ＣＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧＧＣＧ ＧＣＣＡＴ　１３５０ＣＴＣＧＣＧＡＡＧＧ　ＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴ　ＧＣＧＧ ＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡ（：ＴＡＣＴ　ＧＣＣＴＧＡＣＣＧＣ１４００ＧＣＡＧ ＡＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＧＧ　ＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡ　ＴＧＣＧＴＴＣＧ ＴＣＡＴＧＣＧＣＧＡＧＡ　１４５０Ｔ丁ＧＣＣＧＣＡＣＡ　ＧＣＴＣＧＡＣＧ ＧＧ　ＡＣＣＧＴＴＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＧＡＣＧＴＧ　１５ ００ＴＧＧＣＡＣＣＧＧＴ　ＡＴＣＧＣＧＣＧＴＡ　ＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡ　Ｃ ＴＣＧＣＧＡＡＡＴ　ＴＧＣＧＣＧＡＴＧＣ１５５０ＣＧＧｔ’：ＧＣＧＧＴＣ ＧＡＣＡＡＧＴＣＧＧ　ＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣＧＣＴ ＣＧＡＣＣ１６００ＡＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＣＣＧＧＴＧＧＣ ＴＣＧ　ＧＣＧＡＣＴＧＧＡＧ　ＣＣＡＧＣＣＧＴＴＣ１６５０Ｔ丁ＣＧＧＴＧ ＣＧＧ　ＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧ　ＧＣＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＣＴＣＧＣＧＣＧ ＧＣＴＧＡＡＧＡＴ　１７００ＣＧＣＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＡ　Ｃ ＧＧＡＴＧＣＧＣＡ　ＧＡＡＧＧＣＣＧＡＡ　ＣＧＧＣＴＣＧＣＧＧ　１７５０ ＣＧＣＴＣＧＡＡＣＡ　ＧＣＡＧＡＴＧＣＣＧ　ＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＧＣＧＣ ＣＧＣＧＣＡ　ＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣ１８００ＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＧ ＧＣＧＡＴ　ＣＧＡＣＣＡＧＡＴＣＧＣＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧ 　１８５０ＧＧＣＧＡＣＧＣＣＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＣＧＣＧＣＡＣＡＡＣＴ　 ＧＡＣＧＣＡＧＡＣＧ　ＣＴＣＧＧＣＣＣＣＧ　１９００ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＣＧＣＧＴＣＧＣＧ　ＣＡＧＡＴＧＣＡＧＦ　ＡＧＧＡＣＧＡＣＧＣＡＴＣＧ ＴＧＧＣＡＧ　１９５０＾ＧＧＣＧＣＴＡＣＧ　ＣＧＧＡＣＴＡＣＧＣＧＧＣＧ ＣＡＧＣＧＴ　ＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧ　ＡＧＴＣＧＧＣＣＧＧ　２０００ＣＣＴ ＧＴＣＧＣＣＧ　ＣＡＧＧＡＴＣＧＣＧ　ＡＣＧＣＧＣＡＧＡＴ　ＣＧＣＣＧＣ ＧＩ’：ＴＧ　ＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧ　２０５０ＴＧＴＴＴＡＣＧＡＡ　ＧＣＣ Ｃ：ＧＧＣＧＡＡ　ＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧ　ＣＧＧＣＡＴＣＧＣＴ　ＣＧＡＴＣ ＧＣＧＧＧ　２１００ＧＣＧＧＧＣＡＧＣＧ　ＣＧＣＧＧＴ＾＾　２１１８（２ ）　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：６についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；１９　アミノ酸 （Ｂ）種ＩＩ二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ　）分子の型：ペプチド （山）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス：Ｎｏ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：シュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：　ＤＳＭ　３９５９ （ｘｉ）配列の詳細？　ＳＥＱ　Ｉｌｌ　ＮＯ：　５：Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ 　Ｇｌｙ （２）ＳＥＱ　１０　ＮＯニアについての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９　アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖 （ｉｉ）分子の型；ペプチド （ｉｉ）ハイボセティカル＝ＮＯ （ｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｖｉ）起源： （Ａｌ’ｌｈ：シュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：　ＤＳＭ　３９５９ （ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１：Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ＾ １ａ （２）　ＳＥＱ　１０　Ｎ０＝８についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：１７　アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ　）分子の型：ペプチド （ｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｊ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｖｉ）起ｆｌ： （Ａ）生物：シュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：　ＤＳＭ　３９５９ （ｘｉ　）配列の詳細：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　８：Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ 　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍｅｔｌ　５　１０　１５ １１ｅ　Ａｌａ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：５６　塩基対 （Ｂ）種類二核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｊ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｔｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｘｉ　）配列の詳細：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　９：ＣＧＣＧＴＡＡＧＣＴ　 ＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡ　ＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧ　ＡＡＴＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧ ＧＣＴＡＣＧ　５０ＣＧＧＣＧＡ　５６ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１０についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：５６　塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ　）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス：　ＹＥＳ （ｖ）フラグメントの型：内部 （ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１ｏ：ＣＧＣＧＴＣＧＣＣＧ　 ＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＴ　ＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴ　ＴＴＣＡ ＡＴＧＴＧＡ　５０ＡＧＣＴＴＡ　５６ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６　アミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｊｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （山）アンチセンス：Ｎｏ （ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物：シュードモナス　セパシア（Ｂ）株　：　ＤＳＭ　３９５９ （ｘｉ　）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１１：Ｆｉｇ、　１ Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ Ｆｉｇ、　４ Ｆｉｇ、　５ く ＡＢ　ＣＤ　リバーぜ Ｆｉｇ、１１ Ｆｉｇ、　１２ Ｆｉｇ、　１３ Ｆｉｇ、　１６ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年に月　２θ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インビトロで活性リパーゼを製造するための方法であって（ａ）リパーゼ酵 素をエンコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を、そのリパーゼが不 活性又は部分的に活性な状態で生産されるのに適する条件のもとで培養し、その 培養物からこのリパーゼ酵素を回収し、次いでその回収されたリパーゼ酵素を変 性に付する、 （ｂ）工程（ａ）で得られたこの変性したリパーゼ酵素をシャペロン分子と混ぜ 合わせる、そして （ｃ）工程（ｂ）の混合物を再生に付して、活性リパーゼ酵素を生放すること、 を含んで成る方法。 ２．インビトロで活性リパーゼ酵素を製造するための方法であって、 （ａ）リパーゼ酵素をエンコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を、 そのリパーゼ酵素が不活性又は部分的に活性な状態で生産されるのに適する条件 のもとで培養し、次いでそのリパーゼ酵素をこの培養物から回収する、 （ｂ）この回収されたリパーゼ酵素をシャペロニン分子と混ぜ合わせる、そして （ｃ）工程（ｂ）の混合物を変性、それに続く再生に付して、活性リパーゼ酵素 を生成すること、 を含んで成る方法。 ３．前記シャペロン分子が、このシャペロン分子をエンコードするＤＮＡ配列で 形質転換された宿主細胞を、このシャペロン分子が生産されるのに適する条件の もとで培養し、次いでこの培養物からそのシヤペロン分子を回収することによっ て生成されたものである、請求項１又は２に記載の方法。 ４．前記シヤペロン分子が、工程（ｂ）において変性リパーゼに加えられる前に 変性処理に付されている、請求項１−３のいづれか１項に記載の方法。 ５．インビトロで活性リパーゼ酵素を製造するための方法であって （ａ）リパーゼ酵素をエンコードするＤＮＡ配列及びシャペロン分子をエンコー ドするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を、そのリパーゼ酵素が不活性又は 部分的に活性な状態で生産されるのに適する条件のもとで培養し、次いでリパー ゼ酵素シャペロン分子混合物をこの培養物から回収する、 （ｂ）任意的にこの混合物への重なる量のシャペロン分子の添加を伴って、工程 （ａ）の混合物を変性、それに続く再生に付し、活性リパーゼ酵素を生成するこ と、 を含んで成る方法。 ６．前記リパーゼ酵素がシュードモナス種又はクロモバクケ一種に由来するもの である、請求項１〜５のいづれか１項に記載の方法７．前記リパーゼ酵素が、シ ュードモナスセパシア、シュードモナスフラギ、シュードモナスグラジオリ、シ ュードモナスフルオレセンス、シュードモナススタッツェリ、シュードモナスア ルカリゲンス、シュードモナスシュードアルカリゲンス、シュードモナスプチダ 、シュードモナスグルメ、シュードモナスアエルギノザもしくはクロモバタービ スコスムのリパーゼ、又は前記のリパーゼ酵素の誘導体である、請求項６に記載 の方法。 ８．リパーゼ酵素の生産のためのに前記の宿主細胞が大腸菌である、請求項１− ７のいづれか１項に記載の方法。 ９．前記のリパーゼ酵素をエンコードするＤＮＡ配列に、バチルスステアロサー モフィルスマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルスリシェニホルミスα− アミラーゼ遺伝子バチルスアミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子、バチ ルススブチリスアルカリンプロテアーゼ遺伝子もしくはバチルスプミルスキシロ シダーゼ遺伝子のプロモーターが、又はファージラムダＰＲもしくはＰＬプロモ ーター、ファージＴ７遺伝子１０プロモーター、又は大腸菌Ｉａｃプロモーター が先行している、請求項８に記載の方法。 １０．前記リパーゼ酵素をエンコードするＤＮＡ配列に、バチルスステアロサー モフィルスマルトジェニック遺伝子、バチルスリシェニホルミスα−アミラーゼ 遺伝子、バチルスアミロリケファシエスα−アミラーゼ遺伝子、バチルススブチ リスアルカリンプロテアーゼ遺伝子、バチルスプミルスキソロソダーゼ遺伝子、 ファージＴ７遺伝子又は大腸菌Ｉａｃ遺伝子のリボソーム結合部位が先行してい る、請求項８に記載の方法。 １１．前記リパーゼ酵素が細胞内で高収率で生産される、請求項１−１０のいづ れか１項に記載の方法。 １２．前記リパーゼ酵素が封入体の形態で生産される、請求項１１に記載の方法 。 １３．前記シヤペロン分子がシュードモナスリパーゼ調節因子又はその誘導体で ある、請求項１−５のいづれか１項に記載の方法。 １４．前記シャペロン分子が、シュードモナスセパシアリパーゼ調節因子、シュ ードモナスグルメリパーゼ調節因子、シュードモナスアエルギノーザリパーゼ調 節因子又はそれらの誘導体より成る群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。 １５．前記シャペロン分子の生産のための宿主細胞が大腸菌である、請求項３に 記載の方法。 １６．前記のシャペロン分子をエンコードするＤＮＡ配列に、バチルスステアロ サーモフィルスマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルスリシェニホルミス α−アミラーゼ遺伝子、バチルスアミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子 、バチルススブチリスアルカリンプロテアーゼ遺伝子もしくはバチルスプミルス キシロシダーゼ遺伝子のプロモーターが、又はファージラムダＰＲもしくはＰＬ プロモーター、ファージＴ７遺伝子１０プロモーター、又は大腸菌Ｉａｃプロモ ーターが先行している、請求項１５に記載の方法。 １７．前記シャペロン分子をエンコードするＤＮＡ配列に、バチルスステアロサ ーモフィルスマルトジェニック遺伝子、バチルスリシェニホルミスα−アミラー ゼ遺伝子、バチルスアミロリケファシエスα−アミラーゼ遺伝子、バチルススブ チリスアルカリンプロテアーゼ遺伝子、バチルスプミルスキシロシダーゼ遺伝子 、ファージＴ７遺伝子又は大腸菌Ｉａｃ遺伝子のリボソーム結合部位が先行して いる、請求項１５に記載の方法。 １８．前記シャペロン分子が細胞内で高収率で生産される、請求項１３−１７の いづれか１項に記載の方法。 １９．前記リパーゼ酵素がシュードモナスセパシアリパーゼであり、そして一方 、前記シャペロン分子がシュードモナスセパシアリパーゼ調節因子である、請求 項１−１８のいづれか１項に記載の方法。 ２０．ＤＮＡ構築体であって、シャペロン分子をエンコードする第二ＤＮＡ配列 にリパーゼ酵素をエンコードする第一ＤＮＡ配列が、そのリパーゼ酵素及びシャ ペロン分子又はその機能的な一部がこのＤＮＡ構築体で形質転換された適当な宿 主細胞を培養することで単一の融合タンパク質として発現されるように融合して その第一ＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構築体。 ２１．前記リパーゼ酵素をエンコードする第一ＤＮＡ配列がシュードモナス種又 はクロモバクタ一種に由来するものである、請求項２０に記載のＤＮＡ構築体。 ２２．前記第一ＤＮＡ配列が、シュードモナスセパシア、シュードモナスフラギ 、シュードモナスグラジオリ、シュードモナスフルオレセンス、シュードモナス スタッツェリ、シュードモナスアルカリゲンス、シュードモナスシュードアルカ リゲンス、シューデモナスプチダ、シュードモナスグルメ、シュードモナスアェ ルギノザもしくはクロモバクターピスコスムのリパーゼ、又は前記のリパーゼ酵 素の誘導体をコードするものである、請求項２１に記載のＤＮＡ構築体。 ２３．前記第二ＤＮＡ配列が、シュードモナスリパーゼ調節因子又はその誘導体 をエンコードするものである、請求項２０に記載のＤＮＡ構築体。 ２４．前記第二ＤＮＡ配列が、シュードモナスセパシアリパーゼ調節因子、シュ ードモナスグルメリパーゼ調節因子、シュードモナスアエルギノーザ調節因子又 はそれらの誘導体をエンコードするものである、請求項２３に記載のＤＮＡ構築 体。 ２５．前記第一ＤＮＡ配列が、シュードモナスセパシアリパーゼ又はその誘導体 をエンコードし、そして他方、前記第二ＤＮＡ配列がシュードモナスセパシアリ パーゼ調節因子又はその誘導体をエンコードする、請求項２０−２４のいづれか １項に記載のＤＮＡ構築体。 ２６．本明細書に添付のＳＥＱＩＤＮＯ．７に示す配列を有する請求項２５に記 載のＤＮＡ構築体。 ２７．請求項２０−２６のいづれか１項に記載のＤＮＡ構築体を含んで成る組換 発現ベクター。 ２８．請求項２０−２６のいづれか１項に記載のＤＮＡ構築体又は請求項２７に 記載の組換発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ２９．大腸菌の株の細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。 ３０．前記のＤＮＡ構築体に、バチルスステアロサーモフィルスマルトジェニッ クアミラーゼ遺伝子、バチルスリシェニホルミスα−アミラーゼ遺伝子、バチル スアミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子、バチルススプチリスアルカリ ンプロテアーゼ遺伝子もしくはバチルスプミルスキシロシダーゼ遺伝子のプロモ ーターが、又はファージラムダＰＲもしくはＰＬ、プロモーター、ファージＴ７ 遺伝子１０プロモーター、又は大腸菌Ｉａｃプロモーターが先行している、請求 項２９に記載の宿主細胞。 ３１．前記ＤＮＡ構築体に、バチルスステアロサーモフィルスマルトジェニック 遺伝子、バチルスリシェニホルミスα−アミラーゼ遺伝子、バチルスアミロリケ ファシエスα−アミラーゼ遺伝子、バチルススプチリスアルカリンプロテアーゼ 遺伝子、バチルスプミルスキシロシダーゼ遺伝子、ファージＴ７遺伝子又は大腸 菌Ｉａｃ遺伝子のリボソーム結合部位が先行している、請求項２９に記載の宿主 細胞。 ３２．活性状態におけるリパーゼを製造するための方法であって、リパーゼを生 産するのに適する条件のもとで請求項２８−３１のいづれか１項に記載の宿主細 胞を培養し、そしでこの培養物からリパーゼを回収することを含んで成る方法。 ３３．リパーゼ酵素を変性及び再生する方法であって、（ａ）リパーゼ酵素を変 性処理に付する、（ｂ）工程（ａ）において得られた変性リパーゼ酵素を、任意 的に変性処理に付しておいたシャペロン分子と混ぜ合わせる、そして（ｃ）工程 （ｂ）の混合物を再生に付して、活性リパーゼ酵素を生成すること、 を含んで成る方法。 ３４．リパーゼ酵素の変性及び再生処理のための方法であって、ａ）変性及び再 生処理に付するべきリパーゼ酵素をシャペロン分子と混ぜ合わせる、そして ｂ）工程ａ）の混合物を変性、それに続く再生に付して、活性リパーゼ酵素を生 成すること、 を含んで成る方法。