JPH07504885A

JPH07504885A - 治療用化合物

Info

Publication number: JPH07504885A
Application number: JP5509061A
Authority: JP
Inventors: エペネトス，アガメムノン　アントニオ
Original assignee: インペリアル　キャンサー　リサーチ　テクノロジィ　リミテッド
Priority date: 1991-11-12
Filing date: 1992-11-10
Publication date: 1995-06-01
Also published as: GB9123947D0; DE69226646D1; GB2275928A; GB9409156D0; EP0613379A1; WO1993009813A1; GB2275928B; ES2125275T3; DE69226646T2; EP0613379B1; DK0613379T3; ATE169504T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】治療用化合物本発明は治療用化合物に関し、新生物（すなわち癌及び腫瘍）、ウィルス性疾患および他の症状の治療に有用なものである。

少なくとも理論的には、アンチセンスｆａｎｔｉｓｅｎｓｅｌオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の投与は、生体内において、対応するセンスｆｓｅｎｓｅ）ヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の機能の抑制につながることが知られている。このようなアンチセンスヌクレオチドはチュリス（Ｔｕｌｌｉｓ）により、ＥＰ９２５７４Ｂ１に開示されている。

今回私たちは、このようなオリゴヌクレオチドを組み入れた改良された化合物を提供するものである。

本発明は、化合物を細胞内の核酸に方向付ける手段と、隣接する生物学的物体、特に核酸、を破墳する能力のある放射性部分とを有する化合物を提供する。

この化合物を方向付ける手段は、アンチセンスヌクレオチドを含むものであることが望ましい。

アンチセンスヌクレオチドは−ＩＩＩの核酸であり、これは相補的な核酸配列に特異的に結合することができる。適当な標的配列に結合することにより、ＲＮＡ −ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、あるいはＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成される。このような核酸は、しばしばアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）とよばれるが、これはこうした核酸がセンス（ｓｅｎｓｅ）、言い換えれば遺伝子をコードする鎖について相補的であることによる。近年、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖に結合する際に、三重らせんを形成し得ることが確認された。オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重らせんの主要溝ｆｓａｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅｌにおける配列を認識できることが明らかになったのである。このようにして、三重らせんが形成された。このことは主要溝の水素結合部所を認識することによって、二重１１ＤＮＡに特異的に結合する配列特異性分子の合成が可能であることを示唆している。標的核酸に結合することにより、上記のオリゴヌクレオチドはこの標的核酸の機能を抑制することができる。このことは例を挙げれば、転写、プロセッシング、ポリ（Ａ）付加、複製、移転を阻害することおよび、ＲＮＡ分解の促進等、細胞の抑制機構を促進することにつながるであろう。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ある細胞の機能を選択的にサプレスするために用いることがてきる０例えば、癌形質転換細胞において、癌遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドはその発現をサプレスする。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子を過ＩＩＩ発現させるヒトの前骨髄球の白血球の細胞系であるＨＬ６０中のｅ−ｍ３Ｊｃタンパク質の発現を阻害することが示されている。用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡの領域に相補的であった。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞とは異質の核酸の複製および発現を阻害するのにも使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは実験室〒調製され、それから、例えば細胞培養培地から細胞への微小注入や摂取によって細胞内に導入される。あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス遺伝子を運ぶプラスミドやレトロライスルを用いたトランスフェクション後、細胞中で発現させられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラウス肉腫ウィルス、水庖性口内炎ウィルス、単純へルベウイルスタイプ１、サルのウィルス、及びインフルエンザウィルスのＩＩｒ！培養におけるウィルスの複製または発現を阻害することが最初に見いだされた。それ以来、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳の阻害は、ウサギの網状赤血球の溶解物およびコムギ胚芽の抽出浦に含有されている無細胞系において広く研究されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウィルス機能の阻害は、ＡＩＤＳ　ＨＩＶ　レトロウィルスＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの使用によりインヴイトロで証明されている（グツドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）　、Ｊ、１９８１１　＝アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるヒトの免疫不全ライスルの複製の阻害”、　Ｐｒｏｃ、Ｎ１ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｅ４．（υ５Ａ１８５＋１５１．５５０７−１１１．グツドチャイルドの研究は、最も有効なオリゴヌクレオチドはポリ（Ａ）シグナルに相補的であり；また、プライマー結合部位及びプライマー結合部位近傍であって、特にキャップと５′の翻訳されていない領域といった、ＲＮＡの５°末端を標的とするものも有効であることを示した。

キャップ、５°の翻訳されていない領域及びポリ（Ａ）シグナルは、レトロウィルスＲＮＡ　（Ｒ１１域）の末端で反復された配列中に存在しており、これらに相補的なオリゴヌクレオチドはＲＮＡに２回結合していてもよい。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドであればよく、例えば、次のものに関する遺伝子の一部を特異的に形成するＲＮＡ又はＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドが挙げられる・変異したｒａｓタンパク賓、変異したｐ５３タンパク賀、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）と急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）とに存在するフィラデルフィア染色体の特性をホしているＢＣＲ−ＡＢＬ融合されたｍＲＮＡ、又はＨＩＶ　ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ　若しくは　ｓｏｒ遺伝子のＭ物等の１（ＩＶ　（ヒト免疫不全ウィルス）タンパク、° 特異的に１とは、相補的なりＮＡやＲＮＡは、正常細胞（１１１１１細胞でない細胞、またはウィルス感染していない細胞）内において普通は現れないということを意味している。アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡのための標的としては、さらに、ＨＩＶのｔＲＮＡ　（Ｌｙｓ）のプライマー結合部位、ｍＲＮＡのスプライシングの供与又は受容部位、ポリＡ領域、及び上記のＨＩＶ遺伝子の開始コドンを含む。

それゆえ、ＣＭＬの場合、オリゴヌクレオチドＧＣＴＯＡＡＧＯＧＣＴＴ−ＴＴＯＡＡＣＴＣＴＧＣＴＴＡは、ＢＣＲエキソン３／ＡＢＬとエキソンＩ夏の結合配列とに対合する；そして、オリゴヌクレオチドＧＣＴＧＡＡＯＯＧＣＴＴ−ＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＯＡＴＧは、ＢＣＲエキソン２−Ａ　Ｂ　ＬとエキソンＩ＋の融合配列に対合している。ＡＬＬの場合には、オリゴヌクレオチドＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴ−ＣＴＧＣＧＴＣＴＣＣＡＴが、ＢＣＲ／ＡＢＬの接合に対合している。

上記の配列において、曲アクセント記号（″）は、ＢＣＲエキソンとＡＢＬエキソンとの接合を意味している。

選択的に、つぎの配列が使われてもよい　ＣＴＧＧＴＣＴＡ、ＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣ（ＢＢＯ１と呼ぶ）；及び０ＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＯＡＧＧＣＴＴＡ（ＢＢＯ２と呼ぶ）、コントロールは、つぎに示す配列を有することも可能であった：　ＣＡＧ、ＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＯＴＣＡＧＴ　（ＢＢＯ３と呼ぶ）、１ＢＢＯ１はＨＩＶのキャップや開始コドンと相補的であり、ＢＢＯ２は、ＨＩＶのゲノムＲＮＡのポリ（Ａ）シグナルと相補的である。キャップや、ポリ（Ａ）シグナルは、ＨＩＶ　ＲＮＡ　ｆＲＩｌｌ域）の末端で繰り返される配列内にある。ＢＢＯ３は、ＨＩＶ　ＲＮＡに相補的でない２０−マー（ｅ＠ｒｌである。ＢＢＯ３をテストした結果、不活性であることが示された（グツドチャイルド、Ｊ、ｇｕｐｒａ）　＊さらにＨＩＶオリゴヌクレオチドは次のものも含まれる：　ＣＴＧＣＴＡＧＡＯＡＴｄｄＴ　；　ＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣ；ＴＴＣＡＡＯＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡＡＡｉ　ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣ（ＩｃｃＧｃｉ　ＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴＡＡ　、ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ；及びこれらの同等物０選択的に、オリゴヌクレオチドは、本来のウィルスの構築に不可欠なプロテアーゼをコードしているＨＩＶのヌクレオチド配列を標的とすることができる。３°末端においてｄｄＴでブロックされたオリゴデオキシヌクレオチド又はイソ尿、１１．％若しくは他の鎖ターミネータ−は、より効果的な阻害因子となるであろう、一般に、ウィルスの複製や遺伝子発現（例えばタンパク合成）に不可欠な情報をコードしているＨＩＶゲノムの高度に保存されたどの領域も、相補的なオリゴデオキシヌクレオチドにとって潜在的な標的である。さらに、オリゴヌクレオチドはウィルスｍＲＮＡや、組み込まれているか組み込まれていないプロウィルスＤＮＡの一重鎖や、ＤＮＡ−ＲＮＡやＲＮＡ−ＲＮＡの二重鋼に相補的なものとなり得る。

同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの接合体は、他のウィルス、例えばヘルペスの治療の際のヘルペスウィルス、のＷＩＩＩや発現を阻害するために使うことができる。また、ＤＮＡウィルスの場合、オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに相補的なものとなりうる。

本発明の他の態様は核酸を提供するものであるが、ＤＮＡが細胞内の核酸（ＤＮＡ）と咀同的組換えを行うことができるような細胞内の核酸に関するＤＮＡが好適に提供される。このＭ４１においては１本発明のＤＮＡＬｔｌＯＯヌクレオチド〜５００００ヌクレオチドの間の原長を含んでいることが望ましく、さらには５００〜１００００、あるいは１０００〜５０００の間のヌクレオチド頗がより好ましい１ＤＮＡＬｔ＋二重鎖であるとさらに良い。

本発明のこの態様のＤＮＡは、標的とされる細胞内の特異的なりＮＡ配列と相同的に組替えが起こるように設計されてもよい、特にクロス染色体修飾ｆｇｒａｓｓ　ｃｈｒｏ園ｏｓｏｓａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）を含んでいる細胞がＤＮＡの標的候補を提供するが、この修飾は例えば、染色体のｔｏｏｂｐ〜１００ｋｂの間の部分を変えたり、１００ｂｐ〜１００ｋｂの間に挿入したりこの部分を削除したり、あるいは染色体間あるいは染色体内での転座である。

したがりて、モのような染色体修飾を有する細胞が標的となりうる。そのような細胞の例としては、ｂａｒ遺伝子の部分とａｂｌ逮伝子の部分とを並列する転座を特徴とする、フィラデルフィア染色体（上述）を有する慢性骨髄性白血病細胞がある。融合がフィラデルフィア染色体上のｂｃｒ−ａｂｌ融合体の配列に対応するように、１０００〜５０００ｂｐの間のａｂｌ遺伝子に融合された１０００〜５０００ｂｐの間のｂｃｒ遺伝子を含有する本発明のＤＮＡは、ＣＭＬの治療に役に立つであろう。

上記の方法は、癌やウィルス感染以外の病気の治療に利用されてもよい、そして、以下に示すように感染症の治療に適用されてもよい。

Ｔ　Ｎ　Ｆ−８発疾患、例えば敗血症を予防しまたは抑制するのに用いることのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、ＴＮＦ　ＤＮＡまたはＴＮＦ　ＲＮＡに相補的なものである。ｆＰ４えば、以下のものに相補的なオリゴヌクレオチドを用いることができる。すなわち、ＴＮＦメツセンジャーＲＮＡの５°末ＭＦｌ＆辺の配列、ＴＮＦタンパク胃のトランスメンブラン　ドメインをコードしたｍＲＮＡの領域内及び開始部における配列、および１７ｋＤ分子のコード領域内の配列である。上記のｍＲＮＡＩＩＩ域に相補的な特異性オリゴヌクレオチド配列の例は、５’ＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧσｒＧＡＧＧＡＡｃＡＡ３’。

５゛口℃ＡＧＣＴＴＧＡＧＧＧＴｒｒＧＣ３°；及ヒ５ゴＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧＣ３゜である。

当業者には明らかなように、上記疾患の治療、および他の用途に用いるオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドのいずれかであり得る。他の要因のなかでは、合成の状態、効能、相対的な安定性、および特定の系におけるそのオリゴヌクレオチドの特別な利点に依存する選択が行われるであろう、更に、このオリゴヌクレオチドはＤＮＡ１ｋた１ｔＲＮＡのいずれかに相補的であり得る。また、これは−重鎖または二重鎖核酸のいずれかまたは双方に結合していてもよい、このＤＮＡまたはＲＮＡは問題の細胞に固有のもの（細胞のもの）であってもよく、または宿主細胞に見いだされる外来の核酸であってもよい、このＤＮＡは、Ｓ胞のまたは外来の感染性ＤＮＡ、例えばウィルス、ａｍ、酵母、菌類、および他の寄生体のものでありてもよい、このＲＮＡはゲノムＲＮＡまたはメツセンジャーＲＮＡ、例えばレトロウィルスのゲノムＲＮＡまたは外来のまたは細胞のｍＲＮＡであり得る。オリゴヌクレオチドがゲノム性ＤＮＡまたはＲＮＡに結合されているか相補的である場合は、この核酸が複製されることを阻止しまたは予防する。核酸の複製を妨害または阻止することによって、このオリゴヌクレオチドはタンパク質合成におけるそのＤＮＡまたはＲＮＡの下流の発現を妨害しまたは阻止する。オリゴヌクレオチドがメツセンジャーＲＮＡに相補的である場合は、ｍＲＮＡがタンパク質合成において発現されることを妨害しまたは阻止する。

もちろん、このオリゴヌクレオチドは「変性オリゴヌクレオチド」であってよここで「変性オリゴヌクレオチド」とは、ホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉ。

ａｔｓ＋、メチルホスホナート（ｓｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、または他のホスフォルアミジット　インターヌクレオシブイック＋ｐｈｏｓｐｈｏｒａｓｉｄｉｔｓ　１ｎｔｅｒｎｕｃｌｓｏｓｉｄｉｅ）結合を、通常のホスホジエステル結合と同様に、またはその代わりに含んでいてもよいことを意味する。

このようなインターヌクレオシブイック結合は、ヌクレオリティック（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）劣化を受け難くするか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドに、他の好ましい果物動態学的特性を付与することができる。上記の変性の代わりに、またはこれに加えて行うことのできる池の変性は、標的核酸に介在することができて、これによって、得られた（アンチセンスオリゴヌクレオチド）（ＩＩ的核酸）ハイブリッドを安定化することができる成分の付加である。この介在成分は好ましくはアクリジンである。

このアンチセンスオリゴヌクレオチドを、または細胞内の核酸にこの化合物を方向付ける他の手段を、放射性にすることによって、強化された阻止効果が得られる。

この放射性残基はリン−３２からなるものであってもよい、しかし、更に好ましくは、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１，レニウム−１８６、レニウム−１８８またはイツトリウム−９０，または他の任意の、近隣の細胞、オルガネラまたは核酸を破壊するに十分なエネルギーを輻射する同位元素である。

好ましくは、これらの同位元素および本発明の化合物における放射性原子の密度は、４０００ｃＧＦ以上（好ましくは少なくとも６０００．８０００または１゜０００ｃＧｙ）の投与量が細胞およびそのオルガネラ、特に核に供給される程度とする。

この放射性原子（群）は公知の方法で本発明の化合物に合体させることができる０例えば、最初の部分は生合成されてもよいし、又はインビトロ合成によって合成されてもよく、それぞれの場合で、適当な、例えば放射性ヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基が用いられる。予め形成されたオリゴヌクレオチドであれば、Ｔ４ポリヌクレオチド　キナーゼおよびγ−［１ｉＰ］　ＡＴｐを用いてＩＩＦで欅織することができる。

ＥＤＴＡまたは他のキレート剤を５′−リン酸基に付け（ＦＥＢＳレターズ（１９８４）、１７２．４３−４６）、これを”’Ｉｎまたは”Ｙを付けるために用いてもよい、チロシンは３°−水酸基にエステル化して、■６■または＋１１１で欅識することができる。

この化合物は、この化合物を一般的にはｊＩ胞に、又は所望のｌｌ１ｌｌタイプに、化合物の標的を合わせることのできる部分を付加的に有していてもよい。

ここで「できる」とは、その標的合わせ部分が本発明の化合物の一部をなしているときに、上証のような化合物の標的合わせができることを意味する。

この標的合わせ部分は、細胞タイプ特真性の実体に特異的に結合してもよく、または標的となる特異性細胞タイプによって特異的に受容されてもよい。

認識される実体は細胞一般の特性を有するものであってよく、こめ場合はアンチセンスオリゴヌクレオチドは簡単に細胞に受容されるので、従って例えば細胞外のヌクレアーゼに曝されることが少ない、そこで、化合物の特異性はアンチセンスオリゴヌクレオチドから全面的に供与される。

あるいはまた、この認識される実体は、腫瘤細胞、ウィルス感染細胞、病瑠学的微生物、遺伝子療法の一部として導入される組りまたはいかなる理由であれ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入がめられる身体の特定な正常細胞であっても、それによって特異的に発現される好適な実体であればよい、しかし、この実体は、オリゴヌクレオチドの導入を望まない細胞には発現されないか、または少なくともあまり多い頻度では発現されないものである。Ｉ！識される実体は、しばしば抗原であるだろう、これら抗原の例は下記の表１に示すものを含む、非特異性抗原は、トランスフェリン受容体であり、ＥＰ２２６４１９が示すように、これに抗体が集まる。これらの抗原の多くに特異的に結合するであろうモノクローナル抗体は既に知られいるが（例えば表に示されたもの）、いずれにせよ、モノクローナル抗体工学に関する今日の技術をもってすれば、はとんどの抗原に対する抗体を調製することが可能である。抗原特異性部分は、抗体全体（通常、便利さと特異性のために、モノクローナル抗体）、それらの部分または部分群（例えばＦ、断片、Ｆ　（ａｂ’）ｒ　、ｄａｂまたは「最小認識単位」）または合成抗体またはその部分であり得る。抗体の部分のみからなる化合物は、２１部に起因する非−特異性結合が起こりにくいので有利である６選択された抗原に対する好適なモノクローナル抗体は、例えば「モノクローナル抗体・技法の指導書」、Ｈ。

シラ（Ｚｏｌａｌ署（ＣＲＣ出版社、１９８８）および「モノクローナル　ハイプリドーマ抗体：技法と応用Ｊ、Ｊ、Ｇ、Ｒ，バレル（Ｎｕｒｒｅｌ１１著（ＣＲＣ出版社、１９８２）に記載されているような公知の技術によって調製することができる０本明細書に述べられた全ての参照文献は参考文献として列挙されている。パイスペシフィック（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、細胞融合によって、−価の断片の再結合によってまたは抗体全体の化学的架橋によって、得られたパイスペシフィック抗体の一部分が細胞−特異性抗原に方向付けられ、他方がオリゴヌクレオチドに方向付けられるようにして調製することができる。このパイスペシフィック抗体はオリゴヌクレオチドと結合して投与することもできるし、またはこれを最初に投与し次いでオリゴヌクレオチドを投与することもできる。

前者が好ましい、パイスペシフィック抗体の製法はコーヴアラン（Ｃｏｒｖａｌａｎ）他（１９８７）　Ｃａｎ’ｃｅｒ　Ｉｍ−ｕｎｏｌ、１ｓｍｕｎｏｔｈｅｒ、　２４．１２フー１３２および１３３−１３７および１３Ｂ−１４３に記載されている。パイスペシフィック抗体、キメラ性抗体および単鎖抗体については一般に、ティブチツク（Ｔｉｂｔｅｃｈｌ中のウィリアムス（１１ｉ１１ｉａｓｓ）、１９８８年２月、第６巻、３６−４２、ノイバーガー（Ｎｅｕｂｓｒｇｅｒｌ他、（第８回国際バイオテクノロジーシンポジウム、１９８８、第２部、７９２−７９９＞およびタン（Ｔａｎ）およびモリリン（Ｍｏｒｒｉｇｏｎ）　（Ａｄｖ、ドラッグデリバリ−レビューズ（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｇｌ　２、（１９８８）、１２９−１４２）に記載されている。好適にｌｌｌ製された非−ヒト抗体は、公知の手段で、例えばマウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体の枠組み中に挿入することによって「ヒト化」することができる、ＩｇＧ群抗体が好ましい。

Ｌユ１、　！ＬｔｌＳＩｌｔＬＩ！！ｔｔＬｊｌｌ　匠孫　風Ｕ里諷瘍−胚　（Ｃ４６７メルンヤム（八−５ｒｓｈａ園）　大腸ｌ直腸腫瘍のイメージング抗原　（８５Ａ１２ｘ二八０ス（Ｕｎｉｐａｔｈｌ　＆治療胎盤アルカリ　Ｈ１７Ｅ２　（ＩＣＲＦＪラバ゛−精巣及び卵巣癌のイメージングホスファターゼ　ス及び亦゛シ゛マー（Ｔｒａｖｃ＋ｒｓ　＆　＆治療Ｂａｄ■ｅｒ）皿腫瘍　ＮＲ−ＬＵ−１０小細胞肺嚢癌を含む各種腫瘍の（ネオＲｘ　（ＮｅｏＲｚ）社）　イメージング＆治療多質上皮ムチン　ＨＭＦＧ　１　卵巣癌、胸膜法８のイメージン（ヒ　ト乳脂肪　（ティラー・へ〇へ〇ン゛ミトリウ（丁ａｙｌｏｒ−グ＆治療グロブリン）　Ｐａｐａｄｉｓ＋１ｔｒｉｏｕ）、　Ｉ　ＣＲＦ　）β−ヒト　Ｗ１４　ヌードマウス中のヒト異種移植絨毛性性腺刺激　片じゅう毛癌への酵素（ＣＰＧホルモン　２）の標的合わせ、（ジアール（Ｓｅａｒｌ＋）他（１９８１）ｌｌｒ、Ｊ、ｃａｎｃｓｒ４４．１３７−１４４）　。

ヒト腫瘍上の　Ｌ６　（ＩｇＧ２ａ）’　アルカリホスファターゼの標的炭水化物　合わ曽。

（ｔンター（ｌｉｅｎｔｅｒ　ｆｉ（１９１１８１Ｐ、Ｉｌ、Ａ、Ｓ、ｌ１５．４８４２−４８４６）Ｂリンパ腫上の　ＩＦ５　（ＩｇＧ２ａ）’　アルカリホスファターゼの標的合わせ。

ＣＤ２０　抗１１［（ｔンター他（１９８８１Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、８５．４８４２（通常及び新生　−４８４６）物性）１ヘルストローム（ｌ（ｅｌｌｓｔｒｏｓ）他（１９８６１Ｃａｎｅｅｒ　Ｒｅｓ、４６．３９１７−３９２３１クラーク（Ｃ１ａｒｋｅｌ他（１９８５１Ｐ、Ｎ、Ａ、ｌｉ、８２．１７６６−１７７０他の抗原はアルファフオエトプロテイン（ａｌｐｈａｆｏｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｃａ−１２５と前立腺特定抗原を含む。

２、免１亙ｌ弧１皿Ｔリンパ球　０ＫＴ−３（オルトＴＯｒｔｈｏ））　腎臓移植の抗−拒絶治療用表面抗原（ＣＤ３）Ｂ−リンパ球　ＲＦＢ４（ノーｖツノ−（ＪａｎｏｇｓＦ）＋　Ｂ　Ｓ１胞リンパ腫の免疫毒索治蒙表ｆ抗原　Ｕイヤに７リー（Ｒｏｙａｌ　Ｆｒｅｅ）病院）（ＣＤ　２２）ｆｆｉＴリンパ球　Ｈ６５（＄”ビマー、ノールス′　急性移櫨岨織対ホスト痢、憬表面抗原　ｆＫｎｏｗ’１ｅｓｌｌｃＲＦ、ソ゛−７社（Ｘｏ■ａ　性関節リウマチの免疫毒素処理（ＣＤ　５　）　Ｃｏｒｐ、）、米国　にライセンス供与）３　、　−　゛耳下腺炎　抗−肩下！１１１１　肩下ｌＩ炎の処理におけるジフテウイルスー関連　多クローン性抗体　リア毒素に共役した抗体ＢＴＭ肝炎　抗ＨＢｇ　Ａｇ　肝癌に対する免疫毒素表面抗原もし、ＣＭＬ又はＡＬＬの処理に適用するならば、分子を結合する配位子は、白血病に会合された抗原に対してモノクローナル抗体であり得る。これらの例としては　マー＞　（ＦｏａｎｌｌＫ、Ａ、他１９８６　Ｂ１ｏｏＤ６８（１１，１ −３１，’レビーＬ　（Ｒｅｖｉｓｗｌ：白血病とリンパ腫の免疫学会ＷＡ″に記載された抗−ＣＡＬＬＡ　（共通急性リンパ芽球白血病−会合抗原）、＋５、ＢＡ−３，ＲＦＢ−１、ＢＡ−２，５Ｊ−９Ａ４　Ｄｕ−ＡＬＬ−１，抗−３− ３、抗−３−４０，ＳＮ１とＣＡＬＬ２である０分子に結合する配位子は、を髄細胞表面抗原を特定する抗体、またはＢ若しくはＴリンパ球とそれぞれ反応する抗体でもあり得る。そのような抗体の例は次のようなものである。フーン、ＬＡ、Ｉｄ中に記載されたものとしての、ヒトを１ＩＩＩｉ胞表面抗原を特定するもの、またはヒトＢ若しくはＴリンパ球と反応するものである。さらなる例の、Ｂリンパ球と反応する抗体Ｂ４３、ＣＤ２２とＣＤ１９も使用され得る。

二者択一的に、確認された存在は、抗原か若しくは抗原でないかもしれないが、確認され得、雑種の池の方法で選択的に結合され得る０例えば、それは、黒色腫細胞中に多数個見出されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）の受容体のような、特徴的細胞表面受容体であるかもしれない、細胞−特異性部分は、よって、化合物、または非免疫性センス中の実体に特異的に結合するものの部分かもしれない０例えば、細胞−表面酵素用基質若しくはｍａｔ物としてのもの、またはメツセンジャーとしてのものである。黒色腫細胞の場合、組ト特興性部分はＭｓＨそのものかＭＳＨ受容体に結合するものの一部分でもよい、そのようなＭＳＨベフチトハ、例エバ、７　ｈ　−１ヘイｆ　４　（ＡＩ−Ｏｂｅｉｄｉ　）ａ　＋１９８０）Ｊ、Ｎｅｄ、Ｃｈｅｓ、３２．１７４Ｌ：開示されている。特異性は間接的であってもよい・第１細胞−特異性抗体は、第１抗体に対して向けられた発明の化合物により施されていてもよい、好ましくは、確認された実体は流動体に関連した広さに分秘されない、なぜならば、さもなければ、必須の特異性は成し遂げられないかもしれないからである。

この発明の１１８１である化合物の榔釣合わせ部は、化合物を結合する従来の方法のいずれによって化合物の残りと結合されていてもよい、例えば上記グツドチャイルドまたはコンツリーｆｃｏｎｒ＋ｏ１１ｙｌ（（１９８５）Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｍ、　＋３（１２１，４４８５−４５０２）、あるいはＰＣＴ／ＵＳ１１５１０３３＋２に一般的に記載されたようにジスルフィド、アミド、あるいはジエステル結合などが挙げられる。チオール基は、アミノ機能化された（ａｓｉｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｓｄ）オリゴヌクレオチドの５１末鰯に導入することができる（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ＋＋　Ｒｅｓ、＋１９９１）１９，４５６１）、この基は、例えばｍ−マレイン酸イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ｍ−ｍａｌ＠１ｍ１ｄｏｂｅｎｘｏｙｌＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓａｃｃｉ旧５ｉｄｅ　ｅｓｔｅｒ　；　ＭｌｌＳ）のような試薬と架構した標準のヘテロな生体機能的な（ｈｅｔ＠ｒｏｂｉａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　）タンパク質を用いて、タンパク質（例えばモノクローナル抗体あるいは成長ホルモン）へオリゴヌクレオチドを結合させるために使用される。

これらの試薬は、通常、一方のタンパク質内のチオール晶と他方のタンパク質的のりジン残基の末端アミノ基とを結合する。

発明の化合物の投与方法としては、適当な方法なら、どのような方法でもよいが、通常非経口投与方法が用いられる０例えば、希釈液と担体の標準滅菌した非発熱性（ｎｏｎ−ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）岨成物内で、静脈内投与、腹腔内投与、または膀胱癌の場合、好ましくは膀胱的投与することができる６発明化合物は抗原性を有するかもじれないので、もし必要なら、より長期の治療を施すためにサイクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｌあるいはその他の免疫抑制系を用いることができるが、通常は必要ない。

発明のいずれの態様によっても、これにしたがって治療するのに特に遺した腫瘍としては、子宮頚、頭、首、脳神軽膠腫、乳、結腸、食道、胃、肝臓、ｍｓの癌およびこれらの転移−が挙げられる。

またもし必要なら、ヌクレアーゼから保護し、細胞膜透過を向上させるために、ＦＲ２６４９３２１で示されたように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを疎水性誘導体に接合させることができる。疎水性部分はシン（Ｚｏｎｌにより示されたようにコレステロールであってもよい（「オリゴデオキシ−ヌクレオチド：遺伝発現のアンチセンス阻害剤Ｊ　ｆ’ｏ１ｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｓｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎ５Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ’）＋　ｐｐ２３４−２４７．Ｊ、Ｓ、コヘンｆｃｏｈｅｎ）　（ｘド（Ｅｄｌ）　、ＣＲＣ出版、ボヵラトン（Ｂｏｃａ　Ｒａむｏｎｌ、ＰＬ、＋９８９１　。

オリゴヌクレオチドのポリーＬ−リジンへの接合は、ステイーブンジン（Ｓｔｅｖｅｎｓ。

ｎ）とインパージン（Ｉｖｅｒｓｅｎｌ（Ｊ、ＧｓｎＪｉｒｏｌ、７０．２６７３−２６８２１およびルメトレ（ＬｅＭａｉｔｒ＠ｌら（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬｌｓＡ　８４，６４８−６５２）によってＩＮ示されたように、上記オリゴヌクレオチドの細胞への配達ｆｄｅｌ　１ｖｅｒｙｌを増加させることもできる。

同様にしてホスホロチオアート　オリゴヌクレオチドは、ＵＳ　５１３８０４５で示されたようにこれらの細胞内取り込みを増加させる。

以下、実施例と図によりさらにｓｌＦ細に発明を説明する。＋１は、５ＫＢＲ３１１胞の生存度に対する、非放射性ランダム、ｃ−ｅｒｂ−Ｂ２センス、およびｅ−ｅｒｂ−Ｂ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示している０図２には、１１１１でラベルされたｅ−ｅｒｂ−Ｂ２アンチセンスとｃ−ｅｒｂ−Ｂ２センスオリゴヌクレオチドの効果について示している。

ＩＪＬ亘」選ばれたオリゴヌクレオチド（下記参照）は、その３′末端において、それをエステル化してチロジン基とし、周知の方法によりＩｌｌ　工でそれを欅織することにより欅膳した。接合体を形成するために、活性スルフィドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙ＋　）墨を有するオリゴヌクレオチドを合成した。好ましい実施態様にあっては、活性スルフィドリル基を有するオリゴヌクレオチドは、ＢＢＯ４，ＢＢＯ５、及びＢＢ０６に設計され、それらは、各々ＢＢＯＩ、ＢＢＯ２、及びＢＢＯ３に対応する配列を有している（上託参！ｌ１ｌ）、以下の反応条件が用いられた：ＢＢＯＩ　２０−マーＣＴＧＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＧＡＯＡＣＣＭＷアンモニウム塩　６４１７．６５２６０ｎｍでのモル吸光　１９５８０００Ｄ２６０ｎｍ＠たりのマイクログラム　３２．７８０Ｄ２６０ｎｍ当たりのピコモル　５１０７．２５塩基組成：ＡＣＧＴ　６６５３Ｔｄ　（ｂｌｏｔ）０．ＩＭＮａ＋　６２Ｔ＋ｒ＋＠０．ＩＭＮａ＋、、０００００１Ｍプローブ　５８ＢＢＯ２２０−マーＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＯＣＴＴＡＭＷアンモニウム塩　６４５３．６７２６０ｎｍでのモル吸光　１９３７０００Ｄ２６０ｎｍ当たりのマイクログラム　３３．３２０Ｄ２６０ｎｍ当たりのピコモル　５１６２．６２塩基組成＋ＡＣＧＴ　５３５７Ｔｄ　（ｂｌｏｔ）０．１ＭＮａ＋　５６Ｔｍ＠０．ＩＭＮａ＋、、ＯＯＯＯＯＩＭプローブ　６０ＢＢＯ３２０−マーＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＭＷアンモニウム塩　６４２．３．６５２６０ｎｍでのモル吸光　１９６９００ＯＤ２６０ｎｍ当たりのマイクログラム　３２．６２０Ｄ２６０ｎｍ当たりのピコモル　５０７８．７２塩基組ｆｆ１Ｉ！＝＾ＣＧＴ　５５５５Ｔｄ　（ｂｌｏｔ）Ｏ，１ＭＮａ＋　６０Ｔｍ・Ｏ，１ＭＮａ＋、、ＯＯＯＯＯＩＭプローブ　５５スルフィドリル類似体は以下の通りである：ＢＢＯ４２１−マーＸＣＴＧＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＣＭＷアンモニウム塩　６４１７．６５２６０ｎｍでのモル吸光　２２０４０００Ｄ２６０ｎｍ当たりのマイクログラム　２９．１２０Ｄ２６０ｎｍ当たりのピコモル　４５３７．２１塙基岨成：　ＡＣＧＴ　６６５３混合塩基：　Ｙ　ＲＮ　Ｍ　Ｋ　Ｓ　Ｗ　ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｘ　Ｚ　０００００Ｇ０００００１０Ｘ＝抗転移（ａｎｔｉｔｒａｎｆ＠ｒｒｎ）レセプター抗体・。

Ｔｄ　（ｂｌｏｔ）０．ＩＭＮａ＋　６３Ｔｍ＠０．ＩＭＮａ＋、、ＯＯＯＯＯＩＭプローブ　５ＢＢＢＯ５２１−マーＸＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＴＡＭＷアンモニウム塩　６４５３．６７２６０ｎｍでのモル吸光　２１７６０００Ｄ２６０ｎｍ当たりのマイクログラム　２９．６６０Ｄ２６０ｎｍ当たりのピコモル　４５９５．５９塩晶組成＋ＡＣＧＴ　５３５７混合塩基；　ＹＲＮＭＫＳＷＨＢＶＤＸＺ　０００００００００００１０Ｘ＝抗転移レセプター抗体。

Ｔｄ　（ｂｌｏｔ）Ｏ，１ＭＮａ＋　５７Ｔｍ＠０．ＩＭＮａ＋、、ＯＯＯＯＯＩＭプローブ　６゜ＢＢＯ６２１−マーＸＣＡＧＴＣＡＯＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＯＴＭＷアンモニウム塩　６４２３．６５２６０ｎｍでのモル吸光　２１５００００Ｄ２６０ｎｍ当たりのマイクログラム　２９．８８０Ｄ２６０ｎｍ当たりのピコモル　４６５１．１６塩基組成＋　ＡＣＧＴ　５５５５Ｍ合塩基：　ＹＲＮＭＫＳＷ）ＩＢＶＤＸＺ　０００００００００００１０Ｘ＝抗転移レセプター抗体。

Ｔｄ　（ｂｌｏｔ）Ｏ，１ＭＮａ＋　６１Ｔｍ＠１０．１ＭＮａ＋、、ＯＯＯＯＯＩＭプローブ　５５そのオリゴヌクレオチドは、以下の一般構造（スルフィドリル基は上記Ｘで示される）を有する同時に、スルフィドリル基は、抗−ＨＩＶ抗原抗体に添加される。オリゴヌクレオチドは、２つの化合物のスルフィド基間のジスルフィド交換反応を通してＭＡｂに共有結合される。この反応は以下に述べる。

へ　冒　、免疫グロブリンへの活性化ジスルフィド基またはチオール基の付加は、免疫毒素の合成（米国特許Ｎｏ　４，３４０，５３５）に関連して知られている。その中に、抗体へのチオール基の付加に関して開示された手順がこれによフて援用される。

エルマンｆＥｌｌ＋＋ａｎｌの試薬を、１ｍＭのＥＤＴＡを含む４０ｍＭのリン酸塩＃１ｌＩｉ剤中の抗体溶液に添加する。ＭＡｂの最終濃度は３．２ｍｇ／ｍｌであり、エルマンの試薬のそれは１ｍＭである。ｔａ合物の最終ｐＨは８である０反応を、室温で３０分間道行させる。３０分経過後に、反応混合物を、氷バケツの中で４℃に冷却し、２−イミノチオラン（２ｉ■１ｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）試薬の１０倍の過剰量を加える。

反応混合物を、４℃で一夜続行する。反応の終わりに、過剰量の試薬を、０．２ＭのＮａＣ１と１ｍＭのＥＤＴＡとを含み、ｐＨ７，６である４０ｍＭのリン酸ナトリウムを用いて平衡にされたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｏ−２５の１．５Ｘ１５ｃｍのカラム上で、分離する。

つ　Ｉ　−Ｓ−Ａ次いで、デリバタイズド（ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｄ）抗体は、ジスルフィド交換の際に、オリゴヌクレオチドのメルカプト基に共有結合する。この結合は、２つの構成要素を、４℃で一夜培養する（最終側１．４ｎＭのＭＡｂ−ＩＴ−ＴＮＢと、１１００ｎのオリゴヌクレオチド）ことによって連成される。サンプルが黄色に変わり、このことはＴＮＢ基が放出され、望ましい生産物が形成されていることを示す。

サンプルは、０．２ＭのＮａＣ１を含むｐＨが７．６の４０ｍＭのリン酸ナトリウムを用いて平衡にされたセファデックスＧ−２５樹脂の２．５Ｘ２４ｃｍのカラムを通過する。蛋白質の標準混合物の分離プロフィールは、ＭＡｂに比較される。

支ｉ史ユニー−＾　１　−　Ａ　Ａ一般に、オリゴヌクレオチド抗体接合を形成するための手順は、適当な緩衝溶液の中でマレイン酸イミド活性エステルを持つ遊離アミノ基を持つポリクローンかモノクローンのいずれかの反応する抗体からなる。望ましくは、マレイン酸イミド活性エステルは、抗体よりも約２倍のモル過剰にあり、溶液のｐＨは、非プロトン（ｕｎｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ）状態の中で抗体のアミノ基を維持するために、備かにアルカリである。チオエーテルの架橋を持つ抗体の反応は、約４０５ｎｍの波長に溶液の吸収がｆ！測されることにより、起こる。この波長の吸収の増加は、安定したアミド結合を形成するために、抗体アミンの反応、ＨＮＳＡ、脱落基のジアニオン（ｄｉａｉｉａｎ）のため引き起こされる。架橋活性エステルの加水分解がアミノ酸分解に比べ比較的遅いため、脱落基の吸収の大部分はアミド結合形成される。

集積を持つ抗体の反応は、抗体の分子当たり約０．５−３架橋モルを尋人させるために、十分である１次いで、デリバタイズド抗体は、欅単的などんな生化学分離技術を用いても、架橋から分離される。望ましくは、分離手順はゲル浦過カラムを用いて行われ、より望ましくはセファデックスＧ−２５（！！＠商標ファーマシア社（Ｐｈａｒ■ａｃｉａ　Ｃｏｒｐ、））が使用される。カラムは、クロマトグラフィーのように相溶の水性繕衝溶液で予め平衡にされている０分離されたデリバタイズド抗体は、以下に述べるメルカプト基を持つオリゴヌクレオチドと反応する。

遊離のメルカプト基を持つオリゴヌクレオチドは、反応に相溶な水性−衝溶瞭の中でデリパタイズド抗体と直接反応する。オリゴヌクレオチドと抗体の濃度、反応の継続は、抗体に結合するようにオリゴヌクレオチドの分子の数により変化− する１反応は、４℃で一夜進行させるのが好ましい。

ｌ　ゴ　−　八　八より詳細に、好適なオリゴヌクレオチド−抗体接合体の合成は以下の通り実行した。

モノクローナル抗体は、以下の如きｍａｌ−ｓａｃ−スペーサー−ｇｌｕｔ−ＨＮＳＡ−ヘテロニ価架橋剤（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ　ｃｒｏｇｓｌｉａｌｖｒ）とともに反応させた・１０ｍｇ／ｍｌのＭＡｂは、ｐＨ８の０．１Ｍリン酸ナトリウム酸中に入れたチオエーテル架橋剤の２倍モル過剰量と室温にて約２５分間、反応させた。その反応の進行は、４０６ｎｍでの吸光度の測定に依った。２５分経帽りその吸光度は０．５７に増加するであろうし、デリバタイズド抗体は、２００ｍＭのＮａＣ１を含んだｐＨ６の４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝嬢を入れたセファデックスＧ−２５カラム＜２．５ｘ１７ｃｍ）を用いたゲルろ過によって反応混合物から分離した。この材料は、反応性スルフィドリル基を有するオリゴヌクレオチドとともに、以下の記載の如く反応させた。

反応性スルフィドリル基を持つ該オリゴヌクレオチドはモル比１：２（抗体。

反応性スルフィドリル基を持つオリゴヌクレオチド）にてデリバタイズド抗体と結合させた。そのｍ液はアミコン撹拌された（Ａｌ１ｅｏｎ　５ｔｉｒｒｓｄ）限外ろ過装置を用いて濃縮した。使用した緩衝液は２００ｍＭのＮａＣ１を含んだ４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，ｓである。その反応は４℃で一夜違屓させ、その試料は次にＧＦ２５０ゲルろ過カラム（ＰＢＳ　ｐＨ７，６）にょフてクロマトグラフ化した。捕集したフラクションは、６．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、接合体は接合されない抗体よりもより大きな分子量を持つものとして底側されるてあろう。

二者択一的に、接合を最大化するために、反応性スルフィドリル基を持つオリゴヌクレオチドは、モル比ｌ・２５（抗体：反応性スルフィドリル基を持つオリゴヌクレオチド）にてデリパタイズド抗体と結合した。そのオリゴヌクレオチドと抗体の濃度は、抗体に結合するオリゴヌクレオチドの数によりて変更して良い。

加えて、その反応の後に４℃で一夜道展させ、その試料は、２００ｍＭのＮａＣ１を含んだ４０ｍＭリン酸ナトリウム液、ｐＨ６，５を入れたセファロース（登録向欅）Ｓ−３００カラム（２，２ｘ８０ｃｍ）を通してクロマトグラム化した。

このステップにより何も反応しなかった反応性スルフィドリル基を持つオリゴヌクレオチドを除去する。

遊離の抗体、もしあるとすれば、又は抗体が接合したオリゴヌクレオチドのいずれか一方を含んだフラクションは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動のような適当な分析的な技法を用いて同定することができる。そのように分離されたオリゴヌクレオチド抗体接合体は、必要に応じ、殺菌処理による結果として当該技術分野において周知の何壽かの適当な技法によって濃縮することができる。６１者はオリゴヌクレオチド抗体接合体を間隔０，２ミクロンのフィルターを通過させることによってただちに達成される。

上記接合体は、ジスルフィド架橋剤によって形成される接合体として有効であろうし、かつ接合体の両方のタイプの使用の方法は同等である。

支ム五ユ一一一ツψ ｌ此五五１以下のオリゴヌクレオチドはホスホロチオアート架橋を包含して合成した：（Ｌ）ＬｚＬ立之ス５’　−ＣＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＣ−３’この配列は遺伝子の５′末端での非転写配列に相補的である。

（ｂ）ｋ之ス５’　−０ＡＯＣＴＧＯＣＧＧＣＣＴＴＧＴＧ−３”この配列は遺伝子の５′末端での転写配列に相補的である。

（ｃ）　ｉｚｌム５−ＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＧＣＡＣＡＣＣ−３’これはランダム配列であり、しかしアンチセンスオリゴヌクレオチドのような同様の基準組成物を有する。

そのオリゴヌクレオチドは、ミエチスロウ（Ｍｉｅｅｉｙｓｌａｗ）　Ａ、　ａ（１９８１１１分析生化学（Ａｎａｌｙｔ４ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＊１ｓｔｒｙｌ　１７２．３５６−３５９）のヨードダン法（Ｉｏｄｏｇｓｎ　ｍｏｔｈｏｄ）を用いてヨウ素−１２５で放射性同位体標識される。１４型的に、ｌ１ｌｉ− 標識オリゴヌクレオチドは０．７ＭＢｑｍｇ−’の特異的な活性を持つ。

９ｃｍの培養プレートに入れた５ＫＢＲ３細胞は、１０％胎児子ウシ血清を追加して含むダルベツコの変法Ｍ　Ｅ　Ｍ　（１）ｕｌｂｅｃｃｏ’ａ　ｍｏｄｌｆｉｓｄ　ＸＥＭ）中で培養した。

融合性細胞（Ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｃｅｌｌ）はトリプシン／ベルセン（マｓｒｓ＠＋＋ｓ）を用いて分離し、２４ウエル（ｗｅｌｌ）プレート中の微量滴定ウェル（０，５ｍ１）毎に１×１０’細胞の一度で種菌した。オリゴヌクレオチド（アンチセンス、センス又はランダム）は５０μＭ又は５μＭで一加した。細胞は、空気中に１０％のＣＯ４を含む雰囲気としたインキュベータ中、３７ ℃で培養した。３日後に細胞はトリプシン／ペルセンを用いて収穫し、その時に細胞をカウントし、かつそれの生存率をトリパン青染色試験によって評価した。

第１図は標識していないランダム、センスとアンチセンスｃ−ｅ　ｒ　ｂ−Ｂ　２オリゴヌクレオチドを５ＫＢＲ３細胞の阻害に用いた時の細胞カウントを示す、そのコントロールはオリゴヌクレオチドが存在せずに同様に処理した効果を示す、アンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれのコントロールよりも細胞生存率が減じられることにおいてより重要な有効性があることを示す。

１１１２図は放射性アンチセンスオリゴヌクレオチド（”Ａｎｔｉ）が、非標識のランダム及びアンチセンスオリゴヌクレオチド又は標識センスオリゴヌクレオチド（’Ｓ＠ｎ５ｅ）よりも、より重要な有効性があることを示す、第２図において全ての細胞は以下の処理を通して〉９６％の生存率であった。その一度がそれらオリゴヌクレオチドに与えられ、非標識アンチセンスオリゴヌクレオチドの１／１０濃度での５ＫＢＲ３細胞に関する毒性効果を有していることが示されたｌｌｌニー欅識アンチセンスオリゴヌクレオチドによって結束的に示される。

Ｌ以下余白コ配列リスト（１）一般情報（ｉ１出願人：エヘネトス、アガメムノン　エイ　ｆＥｐｅｎｅｔｏｓ＋Ａｇａｍｅｍｎｏｎ＾）（ｉＨ発明の名称・治療用化合物（ｉｉｉ）配列の数＝２０（ｉｖ）通信用住所：（＾）　受信人　：　エリツク、本０ブタ−クラークジン　（Ｅｒｉｃ、Ｐｏｔｔｅｒ　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ）ｆＢｌ　通　リ　二　セント　メリース゛　コート、セント　メリース゛　ケ゛−ト　（Ｓｔ　Ｍａｒｙ’ｓ　Ｃｏｕｒｔ、ＳｔＭａｒｙ’ｓ　Ｇａｔｅ）（Ｃ）市：ノツチインガム　（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍｌ（Ｄ）州・ノツチインガムシャー　（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｓｓｈｉｒｅ）（Ｅ）国　英国（Ｆ）郵便番号・ＮＧ１１．ＬＥｈｌコンピュータ読み取り可能形１！ｌ：（Ａ）媒体タイプ二フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパチブル（ｃ）　ｔａ”レーティンク゛システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）　ソフ　ト　ウェア　：　ハ０テントイン　（ＰａｔｅｎｔＩｎ）　リリース１１．０．　へ゛−ン゛３ン　ｔｌ、２５（ｖｌ）現出覇データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類（ｖｉｉ）先行出願データ・（Ａｌ出願番号　ＱＢ　９１２３９４７．５（Ｂ）出願日：１９９１年１１月１２日（ｖｉｉｉ）弁護士／代理人情報：（＾）氏名：パラセット、リチャード　ニス　（Ｂａｓｇｅｔｔ、　Ｒ４ｃｈａｒｄ　５ｌ（Ｃ）　レフＴレンス／ビケット番号　：ＩＭＰＦ／Ｐ９９５６ＧＢ（ｉり遍距履通信情報：（Ａ）電話：＋４４　（０）６ｏ２　５８５８ｏＯ（Ｂｌファクシミリ：＋４４　（０）６０２　５８８１２２（Ｃ）テレックス：３７５４０　Ｐｏｔｔｅｒ　Ｇ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１に関する情報：（五）配列の特徴：（Ａ）長さ、２６塩基対（Ｂｌタイプ二核酸（Ｃ）　ス）ランビ数（ＳＴＩＬＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー二面線（ｉｆ）分子タイプ：ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定、なしくｉｖ）アンチ−センス：あり（ｘｉｌ配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＴＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ：２６塩基対（Ｂｌタイプ：核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー：直線（ｉｔ）分子タイプ：ｃＤＮＡからｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉｌ仮定：なしくｉｖ）アンチ−センス・あり（ｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：ＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡ　ＴＴＧＡＴＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ＝２４塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（ＤＪ　）ボロジー：直線（ｉｉ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定：なしくｉｖ）アンチ−センス：あり（ｘｉ　）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＧＣＴＯＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴ　ＣＣＡＴ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａｌ長さ＝２０塩基対（ＢＪタイプ：核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー：直線（ｉｔ）分子タイプ：ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定：なしくｉｔ）アンチ−センス：あり（ｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・９に関する情報：（ｉｌ配列の特徴：（Ａ）長さ、２５塩基対Ｔｌｌタイプ：核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー：直線（ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉＮ）仮定　なしくｉｔ）アンチ−センス　あり（ｉｌ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：ＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧ　ＣＣＡＡＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１０にｆＳＩするｔｌｌ［：（ｉ）配列の特徴（Ａｌ長さ：２０塩基対（Ｂｌタイプ・核酸（Ｃ）　ス）ランド数（ＳＴＲＡＮ［ｌＥ［１ＮＥＳＳｌ　＋　−重（Ｄ）トポロジー、直線（ｉｌ）分子タイプ、ＣＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定・なしくｉｖ）アンチ−センス・あり（夏ｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０：ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡ、ＧＴＣＧＣＣＧＣ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝１４塩基対（Ｂｌタイプ　核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー二直線（ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｔ）仮定：なしくｉｖ）アンチ−センス：あり（ｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１ＣＴＧＣＴＡＧＡＧＡ　ＴＴＡＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１２に関する情報。

（ｉｆ配列の特徴；（Ａ）長さ、２０塩基対ＣＢｌタイプ二核酸（Ｃ１又はン１゛数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー；直線（１１）分子タイプ：ｃＤＮＡ　からｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定；なしくｉｖ＞アンチ−センス・あり（ｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１２　：ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴ　ＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３に関する情報。

（ｉｌ配列の特徴。

（Ａ）長さ　２４塩基対（８１タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー、直線（ｉｉ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　からｍＲＮＡ　まで（１口）仮定　なしくｉｖ）アンチ−センス゛あり（ｘｌ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：ＴＣＴＣＣＣＴＣＴＴ　ＡＧＣＴＧＧＴＣＣＴ　ＣＴＧＣ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１４に関する情報：（ｉｌ配列の特徴。

（Ａ）長さ＝２９塩基対ＣＢ＋タイプ二核酸ｆｃ）　ストランド′数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳＩ　：　−重（Ｄ）トポロジー　直線（１１）分子タイプ　ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定　なしくｉｖ）アンチ−センス　あり（ｘｉ）配列表Ｊ己：ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ：　１４　：ＣＡ、ＴＧＣＴＴＴＣＡ　ＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧ　ＴＧＴＣＣＴＴＴ（２）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＱ：１５に関する情報。

（１）配列の特徴。

（＾）長さ：３０塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳＩ　：　−重（Ｄ）トポロジー　直線（ｉｉ１分子タイプ：ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｔｉｉｌ仮定−なしくｉｖｌアンチ−センス：あり（ｘｉ）配列表記：ＳＦ、Ｑ　ＩＤ　ＮＯ＋１５＋ＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧ　ＧＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡ（２）ＳＥＱ　ＸＤ　Ｎｏ：　１６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ＝１８塩基対（Ｂｌｌタイプ種核酸Ｃ）　ストランド数、（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重＜Ｄ）トポロジー：直線（ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉｌ仮定：なしくｉｖｌアンチ−センス：あり（ｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６：ＣＴＣＡＧＣＴＴＧＡ　ＧＧＧＴ丁ＴＧＣｃ　１８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（＾）長さ　１９塩基対（Ｂｌタイプ：核酸（Ｃ１ストランド数（ＳＴ！ＩＡＮＤＥ（ＩＩＩＥｓｓ）：　−重（Ｄ）トポロジー：直線（ｉｆ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ　からｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定：なしくｉｖ）アンチ−センス：あり（ｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７：ＴＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧＣ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１７塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（Ｄ）トポロジー・直線（ｉｔ）分子タイプ：ＣＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定：なしくｉｉ）アンチ−センス：あり（ｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８：ＣＡＣＡＡＧＧＣＣＧ　ＣＣＡＧＣＴＣ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１９に関する情報＝（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝１７塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）　Ｘ）ラン）−１［（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳＩ　：　−重（Ｄ）トポロジー：直線（ｉｔ）分子タイプ：ｃＤＮＡ　から　ｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ）仮定：なしくｉｖ）アンチ−センス：なしくｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９：ＧＡＯＣＴＧＧＣＧＧ　ＣＣＴＴＧＴＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝１７塩基対（Ｉｔｌタイプ二核酸（Ｃ）　ストランド数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：　−重（０）トポロジー：直線（ｉｉ）分子タイプ：ｃＤＮＡからｍＲＮＡ　まで（ｉｉｉ３仮定：なしくｉｖ）アンチ−センス：なしくｘｉ）配列表記：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０：ＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＧＣＡＣＡＣＣコント０イレ　ラン少−Ａ　−４＝７ス　アン−ｙｔ＞’ａＬ’Ｌ　Ｊ里表１表２補正書の翻訳文の提出書（特許法第１８４条の８）平成６年５月１２ａ

Claims

【特許請求の範囲】

１．化合物を細胞内の核酸に方向付ける手段と、隣接する生物学的物体を破壊する能力のある放射性部分とを有することを特徴とする化合物。
２．上記方向付けの手段がアンチセンスオリゴヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項１記載の化合物。
３．上記放射性部分がヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、レニウム −１８６、レニウム−１８８又はイットリウム−８０を含むことを特徴とする、請求項１又は２記載の化合物。
４．上記アンチセンスオリゴアクレオチドが、変異ｒａｓタンパク、変異ｐ５３タンパク、ＢＣＲ　ＡＢＬタンパク又はＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）タンパクに関する遺伝子の部分を特異的に形成するＲＮＡ又はＤＮＡに相補的であることを特徴とする、請求項２又は３記載の化合物。
５．一般的には細胞に、あるいは所望の細胞タイプに、化合物の標的を合わせるための標的合わせ部を付加的に有することを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の化合物。
６．上記標的合わせ部が、腫癌細胞特異性又はウイルス感染細胞特異性の実体に関して特異的なモノクローナル抗体又はその部分であることを特徴とする、請求項５記載の化合物。
７．上記実体が上記細胞の表面に発現されることを特徴とする、請求項６記載の化合物。
８．隣接する生物学的物体を破壊する能力のある放射性部分と化合物を核酸に方向付ける手段とを接合することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項記載の化合物を合成する方法。
９．請求項１から７のいずれか一項記載の化合物と薬理学的媒体とを含むことを特徴とする薬理学的組成物。
１０．破壊されるべき生物学的物体を有する哺乳類の治療の方法において、請求項１から７のいずれか一項記載の化合物を投与することを含む方法る。