JPH07504979A - 副腎自己抗原の検定法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 副腎自己抗原の検定法 本発明は副腎自己抗原に係り、特に、副腎自己抗原に伴い生じる副腎自己抗体の 免疫検定法に関する。また、本発明は更に、自己免疫性アジラン病の診断におけ る副腎自己抗原の使用法に関する。

アジフン病は、副腎の不全により特徴付けられる疾患で、しばしば、副腎皮質の 破壊と、患者の血清中における副腎自己抗体の存在とを伴う自己免疫性疾患でも ある。副腎皮質は、コルチゾル、アルドステロン、およびテストステロン等、置 数のステロイドホルモンを産生ずる役割を担っている。自己免疫性アジラン病を はじめとするこの病気では、これらのホルモンが減少する。ホルモンの減少は、 低血圧、筋力低下、皮膚への色素沈着の増加、電解質の平衡失調等の臨床的病徴 の原因となっている。

副腎皮質への自己抗体についての初めての記述は、１９５７年に、補体結合の技 術を用いたものであった１゜その後、他の研究機関が、補体結合または免疫蛍光 法を用いて、この自己抗体の存在を確認した２−４゜また、副腎の膜の粗製！ｌ ！１品を用いた放射線免疫検定法とＥＬ　Ｉ　ＳＡについても記述があるトー１ ９７３年には、ウサギ副腎の自己抗原の精製が報じられた７が、ヒト副腎の自己 抗原の単離は依然困難てあった。ヒト副腎の自己抗原は、副腎組織のホモジネー ト中、ミクロソーム画分に在り、１９８８年には、この抗原は分子量約５５００ ０の膜タンパクであることが明かとなった”ａ１９９０年には、ヒト副腎の亜細 胞性画分と副腎自己抗体との結合性の検定法が述べられている１゜この検定法は 、自己抗体が、形質膜および／またはミクロソームに由来することを示し、かつ 最終的な抗原の単離と精製に向けた、より合理的な取り組み方を提供するもので あった。

副腎自己抗体の測定は、アジフン病の診断にとつて重要であり、最近では、免疫 蛍光法が日常的に使用されている。

本発明者らは、副腎抗原の単離と特性付けとに初めて成功した。この抗原の単離 と特性付けの結果、例えば、組換え技術、抗体からの抗原の誘発、副腎の抗体の 精製と抗原の検定という手法による抗原の製造が可能となっている。この検定法 は、潜在性、あるいは真性の自己免疫性アジフン病の診断に役立つ。

本発明は副腎自己抗体の検定法に関するものである。本発明の望ましい検定法に は、ヒトまたは動物の副腎のミクロソーム画分から得られるタンパクの使用が含 まれる。このタンパクは、分子量が約５００００〜６００００とされ、副腎自己 抗体に対し抗原性を有している。また、このタンパクは、ヒト由来であることが 望ましい。

更に、本発明は、副腎自己抗体に対するエピトープを有するタンパクの使用を含 む検定法にも関する。このタンパクは、分子量が約５ｏｏｏｏ〜６００００とさ れ、 副腎を磨砕し、 この磨砕物を翼なる遠心分離にかけてミクロソーム画分を得、このミクロソーム 画分をリン酸緩衝溶液に懸濁し、この懸濁液をコール酸ナトリウムとともに遠心 分離して上清を回収し、この上清にポリエチレングリコールと更なるコール酸ナ トリウムを加えて混合し、 この混合液を遠心分離してベレットを形成させ、このベレットをコール酸ナトリ ウム水溶液に懸濁して懸濁液とし、この懸濁液をコール酸ナトリウム水溶液に対 して透析して可溶性ミクロンーム調整品とし、 この可溶性ミクロソーム調製品をカラムクロマトグラフィーにかけタンパク含有 画分を回収することにより精製して得られる。

また、このタンパクは、ヒトまたは哺乳類の副腎から得たものであることが望ま しい。

上記手法により得られるタンパクは、ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ（９４ ＳＯｃ４１）であることが実験により示されている。ステロイド２１−ヒドロキ シラーゼは、副腎皮質の糸球体−帯に顕著な酵素で、コレステロールからヒドロ コルチゾンへの代謝経路の一部を触媒している。ステロイド２１−ヒドロキシラ ーゼをエンコードするｃＤＮＡはクローニングされるとともに配列が解析され、 また、アミノ酸配列も、タンパクから誘導されている１−０上記方法で得られる 副腎タンパクは、１つ以上のアミノ酸を変化（欠失、付加、または置換）させる ことにより、副腎自己抗体への結合特性を失うことなく改変可能である。

本発明には、副腎自己抗体に対するエピトープを有するタンパクの断片も含まれ る。また、この断片には合成ペプチドも含まれる。

このタンパクは、粗製物でも精製物であってもよいが、基本的には純粋な物であ ることが望ましい。また、このタンパクは、ヒトまたは動物から得られる天然の タンパクでも、組換え体に由来するものであってもよい。

副腎タンパク、特にヒト副腎タンパクが、本発明の一側面をなしている。本発明 のタンパクは、改変されたタンパクまたは上述したようなタンパク断片であって もよい。また、本発明のタンパク（改変されたタンパクおよび断片を含む）は、 ラベルされていてもよい。このタンパクは、哺乳類のタンパクであることが望ま しく、特に、ヒトのタンパクであることが望ましい。

本発明の他の側面は、試料中の副腎自己抗体の検出キットにある。そのひとつは 、このキットが副腎タンパクを有する点である。また、本発明には、副腎自己抗 体の検出における、本発明のタンノイクまたはタン／４り断片、ある（１１よこ れらタンパクまたはタンパク断片に対する抗体の使用も含まれる。

本発明は、以後詳説するように、リンｔ４球の崩壊を含む副腎自己免疫疾患の治 療法にも適用できる。本発明は特に、本発明のタン、＜りまた１１タン、ｆり断 片、特にペプチドを薬剤として含む種々の薬品の処方を提供するものである。（ 也の観点から言えば、これは、薬剤として使用するため調剤された本発明のタン 、４りまたはタンパク断片を含む薬品の処方を提供するもので、この処方で喀よ 、活性を有するタンパクまたはタンパク断片と同様に受容可能な、希釈液、賦斤 ３剤、また（１担体の構成をとることができる。

図１は、カラムクロマトグラフから溶出したタン／くりの溶出特性図である。

図２は、カラム溶出フラクンツンを、（Ａ）副腎自己抗体を含む血清、ＣＢ）通 常の血清、と接触させたもののウェスタンプロットを示すものである。

図３は、カラム溶出フラクン曹ンをゲル電気泳動した後の、タン／ずりの染色７ ｔターンを示すものである。

図４は、カラム溶出フラクノ■ンを、（Ａ）副腎自己抗体を含む血清、（Ｂ）通 常の血清、と接触させたもののドットブロフトアツセイを示すものである。

図５は、カラム溶出フラクン１ン■を、１０種類の異なる血清と接触させたもの のドｙトブロメトアｙセイを示すものである。

図６は、カラム溶出フラクン讐ン■のウェスタンプロットを示すものである。

図７は、カラム溶出フラクン震ン■を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ電気溶出を行った もののウェスタンプロットである。

本発明は副腎自己抗体の検出法に関するものである。この検出法には、以下に詳 説する抗原性タンパクの使用が含まれる。

抗菌性タンパク 本発明に好適なタンパクはヒトまたは動物の副腎のミクロソーム画分から得られ るタンパクである。このタンパクは副腎自己抗体に対する抗原である。このタン パクは更に、見かけの分子量がおよそ５００００〜６００００、より望ましくは ５２０００〜５８０００　（例えば約５５０００）であることで特徴付けられる 。

この分子量は、９％ポリアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動を用いた分析 における、以下の標準品との対応から確認される。ミオシン（分子量２０５００ ０）、β−ガラクトシダーゼ（同１１６０００）、ホスホリラーゼｂ（同９７０ ００）、ラン血清アルブミンく同６６０００）、オボアルブミン（同４５０００ ）、および炭酸デヒドラターゼ（同２９０００）。

副腎タンパクはヒト副腎自己抗体と結合することが望ましいが、動物の副腎自己 抗体と選択的に結合するものであってもよい。

このタンパクは、ヒト副腎から抽出された天然のタンパクであるのがよいが、他 の哺乳類の副腎由来のものでもよい。また、このタンパクは以下に説明する手順 により得られる。副腎は磨砕し、この磨砕物を異なる遠心分離にかけてミクロソ ーム画分を得る。ミクロソーム画分は、例えばグリセリンを含むリン酸緩衝溶液 に懸濁する。

この懸濁液は代表的にはコール酸ナトリウムの存在下で、通常ＥＤＴＡやジチオ トレイトール（ＤＴＴ）とともに遠心分離される。遠心分離後、上清にポリエチ レングリコールおよび更なるコール酸ナトリウム、そして通常はグリセリン、Ｅ ＤＴＡ、ＤＴＴを加えて混合した後、更に遠心分離する。遠心分離の結果得られ たペレットは通常グリセリン、ＥＤＴＡ、ＤＴＴを含むコール酸ナトリウム水溶 液に再懸濁し、この懸Ｎｊｌ液を、通常グリセリン、ＥＤＴＡ、ＤＴＴを含むコ ール酸ナトリウム水溶液に対して透析する。

透析後、他の沈澱物を除去するために、可溶性ミクロソームを遠心分離すること が望ましい。また、可溶性ミクロソームｗ４製品は−７０”Ｃで保存可能である 。

この手順の間、溶液は、例えばリン酸緩衝溶液を用いてｐＨ７で処理される。

この可溶性ミクロソーム画分品は、例えば、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ を用い、例えばエマルゲンの商標で販売されている１種以上の界面活性剤を、そ の濃度が漸次増加するよう伴うリン酸緩衝ｒＢ液（グリセリン、ＥＤＴＡ、ＤＴ Ｔを含んでいてもよい。）を溶出液とするカラムククマトグラフィーにより更に 精製される。

カラムからのフラクンνンは、代表的には吸光度によりモニターされる。

副腎自己抗原を含むカラムからのフラクン謬ンはウェスタンプロブティングで同 定できる。このフラク／Ｍンは、ゲル電気泳動で分離され、引続きニトロセルロ ース上でブロッティングされる。ニトロセルロースは、患者から得た高ａｆｆの 副％ｆｉｌ己抗体を有する血清と反応され、例えば抗ヒト免疫グロブリン−ホー スラブイラン１ペルオキシダーゼ結合体とともに、化学ルミネセンスと反応され る。

化学ルミネセンスは写真用フィルムで検出される。

上記手順は本発明を専ら例示の方法で説明するために記載したものであるが、池 の実験系の結果から、粗製または精製された、らしくはほぼ純粋な抗原を得るこ とも可能である。

この例についてより詳細に述べると、ここに記載の手順で分離された副腎自己抗 原は分子量が５５０００±５０００であることが明かとなった。このタンパクは ステロイド２１−ヒドロキシラーゼの生化学的特性を有し、組換え２１−ヒドロ キシラーゼに対するウサギ抗体と、ウェスタンプロットにて反応した。ヒト副腎 抗体とヒト本来の副腎タンパクとの吸着は、後のウェスタンプロットにおける、 ヒト本来のタンパクと２１−ヒドロキシラーゼに対するウサギ抗体との反応を阻 止する。加えて、ヒト副腎自己抗体は、酵母で発現した組換え２１−ヒドロキシ ラーゼと反応する。これらの実験は、このタンパクが２１−ヒドロキシラーゼで あることを示している。

この副腎タンパクはヒト由来であることが望ましいとはいえ、本発明は動物由来 の抗原をも包含している。すなわち、この抗体は動物か、より望ましくはヒト副 腎のミクロソーム画分あるいは組換えタンパクからの発現物を精製して得られる 。

また、この抗体には、副腎自己抗体に対するエピトープを含む合成ペプチドも使 用可能である。合成ペプチドは、例えば公知のあらゆる合成方法により調製可能 である。こうした合成ペプチドは、天然もしくは改変されたタンパクの断片に相 当する。

ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ 本文中の他の箇所でも述べた通り、副腎タンパクは、ステロイド２１−ヒドロキ シラーゼと同等の免疫的特性を有している。

ステロイド２１−ヒドロキシラーゼは酵素の一種で、２１−ヒドロキシラーゼの 活性不全が、コルチゾルの合成効率低下と、フルチフトロピンの濃度上昇の原因 となることが知られている。このような２１−ヒドロキシラーゼの活性不全は、 先天的副腎過形成と呼ばれる症候群の一つで、単一の常染色体の劣性特性として 遺伝する。ウシの２１−ヒドロキシラーゼの配列をコードする部分を含むｐｃ２ １ａを示すプラスミドは、先天的副腎過形成の診断用に調製された９゜プラスミ ドｐｃ２１ｉはその後、５′末端の約３０塩基対を除く２１−ヒドロキシラーゼ の完全なｃＤＮＡをエンコードする挿入部を含むプラスミドｐｃ２１／３ｅ（ｐ ＣＤ／／ｐＣ２１／３ｅ）のｇ！２にも使用された１１゜ プラスミドｐｃ２１／３ｃの配列は解析され１１１、アメリカン　タイプ　カル チャー　コレクシ冒ン（ＡＴ　ＣＣ）に、ＡＴＣＣ番号５７４２０　（プラスミ ドを含む大腸菌の凍結乾燥品）および５７４２１　（精製されたプラスミドＤＮ Ａ）として寄託された。いずれの寄託品も公衆が自由に利用できる。

プラスミドｐＣＤ／／ｐｃ２１／３ｅ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ５７４２１）から得られ るステロイド２１−ヒドロキシラーゼの遺伝子配列の最初の１３個のアミノ酸を コードする塩基を酵母のリーダーシーフェンスをコードする塩基に置換して改変 し、これを酵母で発現するペクタに連結し、得られたペクタで５ａｃｃｈａｒｏ ■ｙｅｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅに形質転換する方法を用いることにより、Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｉ　ｃｅｒａｖｌ＠ｌａｅを、ステロイド２１−ヒドロ キシラーゼの産生に利用することができる。

前記プラスミドから得られるステロイド２１−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、望ま しくは、ｐＴＺ１８ベクタ内に１ＬｕＨＩ断片としてサブクローンされ、その結 果化じる２１−ヒドロキシラーゼの遺伝子配列を含むベクタは、２１−ヒドロキ シラーゼをコードする領域を含み、かつ酵母で発現するペクタｐＹＥＳ内に連結 された断片を得るために、コード化されていない１１塩基対とＥ１２の遺伝子配 列をコードする４２塩基対とを含む石旧−Ｌ■ｌリンカ−を用いて、１ｕＪＩＩ およびＳｍｌにより切断され、消化される。

本発明には、最初の１３個のアミノ酸をコードする塩基を酵母のリーダーシーフ ェンスをコードする塩基に置換することにより改変された、プラスミドｐＣＤ／ ／ｐＣ２１／３ｅ（ＡＴＣＣ５７４２］）から得られるステロイド２１−ヒドロ キシラーゼの遺伝子配列の、酵母で発現するペクタ内への連結を含む、ステロイ ド２１−ヒドロキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を有し、酵母で発現する ベクタの生成方法と、本発明の方法で得られるＳａｃｅｈａｒｏｍｙｅｅｉ　ｅ ｅｒａｖｌｓｌａｅの形質転換体の培養とが含まれる。

その結果、ステロイド２１−ヒドロキシラーゼは、検定や副腎自己抗体検出用の キットとして、特に、アジジン病の診断に使用可能である。また、ステロイド２ １−ヒドロキシラーゼは、副腎における０己免疫の異常に対する治療にも使用可 能である。

ステロイド調製の過程におけるウシ２１−ヒドロキシラーゼの発現は欧州特許０ ３４０８７８号（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｅａｄａｓ）に記載されている。

２１−ヒドロキシラーゼはヒト２１−ヒドロキシラーゼであることが望ましいが 、動物（例えばウシ）の２１−ヒドロキシラーゼであってもよい。２１−ヒドロ キシラーゼはヒトまたは動物由来の原料からも精製可能であるが、組換え２１− ヒドロキシラーゼであることが望ましい。２１−ヒドロキシラーゼは本来の配列 を有するか、もしくは、１つ以上のアミノ酸を変性させることにより、結果的に 副腎自己抗体に対する抗原性を失わずに改変されたものでもよい。

本発明ではまた、必要とされる抗原特性を維持している２１−ヒドロキシラーゼ 断片も使用可能である。

これらタンパクまたはタンパク断片は、粗製でも、精製されたものでも、純粋な ものであってもよい。

抗菌性タンパクのクローニング 組替えタンパクは、ポリアデニル化された副腎のｍＲＮＡを単離し、ｃ−ＤＮＡ ライブラリを作成するためにｃ−ＤＮＡに逆転写することにより調製される。

宿主生物は適当なベクタを用いてｃ−ＤＮＡにより形質転換され、また、この生 物からスクリーニングされた形質転換体は、それがクローンされたものであれば 副腎自己抗原性を示す。宿主は、例えば、Ｅ−ＧＪｌｍ、酵母、あるいはＣＨＯ 細胞のように、真核細胞でも原核細胞でもよい。もちろん、宿主がベクタにより 形質転換されるときには、そのタンパクを発現させるためのプロモータおよびオ ペレータ配列もまた導入される。得られたタンパクはグリコジル化されていても されていなくともよい。

例示した組換えタンパク提供のための手順を、例証として、より詳細に説明する 。ポリアデニル化されたｍ　−ＲＮ　Ａ配列は、逆転写酵素によりＲＮＡ配列か ら生成されたｃ−ＤＮＡ配列から単離される。このｃ−ＤＮＡは、バクテリオフ ァージベクタ（例えばラムダｇｔｌＧ、ラムダｇｔｌｌ、ラムダＺａｐ）内にク ローニングされ、副腎ｃ−ＤＮＡライブラリが作成される。このライブラリは、 副腎自己抗原の公知のアミノ酸配列を元に合成された３２−Ｐでラベルされたオ リゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングされる。このライブラリは、 （例えばラムダｇｔ１１のようなベクタにサブクローンされた場合には）逆に、 副腎皮質に対する自己抗体または単クローン抗体によりスクリーニングすること もできる。この場合には、放射線でラベルされたプロティンＡまたは酵素でラベ ルされた抗１ｇＧ抗体中に、ポジティブなプラークが確認される。

（プローブに相補的なｃ−ＤＮＡ配列または抗体結合タンパクを含む）ポジティ ブなプラークは、遠心分離により精製され、全体をコードする配列を形成するた め連結される。完全な長さのｃ−ＤＮＡ配列はサンガー法により解析され、例え ばｐＢＲ３２、ｐＴＺＩ８のようなプラスミドベクタ、またはＢｌｕｅｓｃｒｉ ｐｔ内にサブクローンされる。

あるいは、副腎自己抗原をコードする遺伝子を、ポリメラーゼチェーンリアクシ １ン（ＰＣＲ）法により合成することもできる。この方法では、第一の鎖のＣ− ＤＮＡが、逆転写酵素を用いてＲＮＡから合成され、かっＴａｑＤＮＡポリメラ ーゼによるＤＮＡ増幅のための鋳型として用いられる。増幅の各ラウンド開始の ためのプライマーは、副腎タンパクのアミノ酸に基づき合成される。この場合、 定向な（ａｎｃｈｏｒｅｄ）　Ｐ　ＣＲを用いたｃ−ＤＮＡ増幅の改良も使用さ れる。

組換えタンパクの発現のために、単離された完全な長さの遺伝子が、哺乳類て発 現するベクタ（例えばｐＲＣ／ＣＭＶ）内にクローンされる。例えばＣＨＯ細胞 は、（（ａＰＯ４沈降法等を用いて）副腎自己抗原遺伝子を含むベクタに感染さ れる。この細胞は、遠心分離およびミクロソーム調製法により集められ濃縮され る。ミクロソーム画分における組換えタンパクの存在は、副腎自己抗体を用いた ウェスタンプロ１テイングにより同定され、また、材料は、上記した天然型の副 腎自己抗原の精製に係るオクチルセファロースクロマトグラフィーを用いて精製 される。

組換えタンパクのグリコジル化は、レクチンを用い、天然型のタンパクの場合と 比較して研究可能であ。

クローニング方法の詳細は、Ｊ、Ｆａｍｂｒｏｏｋ；　Ｅ、Ｆ、Ｐｒ１Ｌｅｈお よびτ、Ｍｉｎｌａｔ１ｇ著の、分子クローニング−コールドスプリングハーバ −研究所研究室マユ１第二系二版、二ｘ　−Ｍ−り州コールドスプリングハーバ −１９８９、に見られる。

ヒ）２１−ヒドロキシラーゼの発現に固有な事項について以下に述べる。

ヒト２１−ヒドロキシラーゼは、プラスミドｐＣＤ／／ｐｃ２１／３ｅ内の２１ −ヒドロキシラーゼ遺伝子を用いて発現させることができる１０精製されたプラ スミドは、ＡＴＣＣ寄託番号５７４２１から得られる。一方、最適なプラスミド は、１ｌｈｌｔａら＋１による以下の方法により調製できる。

典型的な方法では、１１ＣＤ／／ｐＣ２１／３ｅ内の２１−ヒドロキシラーゼ遺 伝子は、始めの１３個のアミノ酸を、ｐＹＥｓ２．０　（イ／ビトーゲン）のｍ ｌプロモータによるコントロール下において、５ＴＥ２遺伝子の始めの１４個の アミノ酸に置換することにより改良される。

この方法では、２１−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ｐＣＤ／／ｐｃ２１／３ｅｐ からＴＺＩ８　（ファルマシア）ベクタ内へと−１断片としてサブクローンされ る。また、ＪＬａｚｌ（ノースウンブリア　バイオケミカル社、クラミントンＮ Ｅ２３　９ＨＬ、英国）による部分的消化と、それに続＜鋤１（ノースウンブリ ア　バイオケミカル社、クラミントンＮＥ２３　９ＨＬ、英国）の消化により、 ５゛末端から４１塩基対離れた部位に、２１−ヒドロキシラーゼを完全にコード する部分を含む大きな断片が産生される。この断片はｐＹＥＳに連結され、コー ド化されていない１１の塩基対と釘１２をコードする配列の４２の塩基対を含む も■旧−シ「リンカ−を用いて、旦■旧（ノースウンブリア　バイオケミカル社 、クラミントンＮＥ２３　９ＨＬ、英国）およびＬ１■により切断される。

ム息」ｚ１匡ｕ江■■■蔵の形質転換体（Ｃ１３＾ＢＹＳ　８Ｂ−酵母遺伝子保 存センター、カリフォルニア州バークレー）は選択培地で増殖され、ＹＥＰ−グ ルコース（２％）またはＹＥＰ−ガラクトース（２％）での発現培養のための接 種に使用される［ＹＮＤは、ディフコ研究所の窒素源＋デキストロース２％およ び酵母エキスＹＥＰ＋ペプトン２％（いずれもオキソイド）からなる］。３０” Ｃで４８時間の培養後、細胞は回収され、１％のデオ牛シコール酸ナトリウム内 にてガラスピーズとともに攪拌破壊され、５ＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くウェス タンブロッティングにより分析される。

ウシ２１−ヒドロキシラーゼは欧州特許０３４０８７８の記載中に開示されてい る。

このタンパクは、さまざまな天然型のアミノ酸を含んでいるが、その結果、副腎 自己抗体への抗原性が低下することはない。

このような改変されたタンパクは、例えば、（典型的には７〜２４塩基対の）合 成オリゴヌクレオチドを伴う、天然型の配列に補足的なものであるが、野生梨の 配列に比べ１つまたはそれ以上の塩基の変化を宵する突然変異生成により誘発さ れたオリゴヌクレオチドの使用により調製される。

オリゴヌクレオチドのプライマーのサイズは、遺伝子のうち変異が誘発される部 位に対するプライマーの安定的なハイプリダイゼーシ―ンの必要性およびオリゴ ヌクレオチドの合成法上の制限により決定される。一般に、ＤＮＡポリメラーゼ の二牛ンヌクレアーゼ活性による変異の編集を避けるに十分なサイズの、変異発 生部位から５′または３−に延びる変異発生部位における安定的かつ固有のハイ ブリダイセーフ１ンには、オリゴヌクレオチドの全体が活用される。変異の発生 に用いられるオリゴヌクレオチドは、通常７から、より一般的には１２〜２４の 、また、望ましくは１４〜２０の、より望ましくは１５〜１８塩基対を含んでい る。これらは通常、その中央または、変性あるいは失われたコドンの中央から３ ′側に隣接する位置に、少なくとも３つの塩基を含んでいる。

プライマーは、ＤＮＡ鎖に本発明のＤＮＡがクローンされた、例えばＭ２Ｓのよ うな一本鎖ファージにハイブリダイズされる。これは、ファージがＤＮＡに意味 のある鎖を有しているか否かに拘らず認められる。ファージが意味のない鎖を有 していると、プライマーは、コドンの削除を意味する誤った結合や、他のアミノ 酸をコードする三つ組を除き、変異されるべきコドンを含む鎖の意味のある部位 に等しくなる。

ファージが意味のある鎖を有しているとき、プライマーは、対をなす、あるいは 変異されるべきコドンの三つ組に特有な結合の誤りを除いて、変異されるべきコ ドンを含む相補的な意味のある鎖を有している。ハイブリダイゼーシ璽ンは、通 常０〜７０℃、より一般的には１０〜５０’Ｃの温度で行われる。

合成されたオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は計算され、ハイブリダイゼ ーンッンの温度条件の指標として用いられる。通常、鋳梨とオリゴヌクレオチド とはＴｍと見積られる温度より２０”Ｃ以上の高温でしばらく加熱される。ハイ ブリ１ドは、反応混合物の温度をＴｍ以下に下げることにより形成される。得ら れた二本鎖のへテロ二重鎖ＤＮＡは宿主細菌に直接感染され、変異体は、放射線 でラベルされた変異誘発性のオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ハイブ リダイゼータ１ンにより生じたプラークをスクリーニングすることにより同定さ れる。ハイブリダイゼーシ■ンは通常、ラベルされたオリゴヌクレオチドによる 変異体と野生型ＤＮＡとのハイブリシトが形成可能な条件下で行われる。洗浄後 の厳密さを増加させることにより、変異オリゴヌクレオチドと野生型ＤＮＡとの ハイブリブトを分離させ、オリゴヌクレオチドと必要な変異体により形成された ハイブリッドは分離させない条件を確立することが可能となる。こうして同定さ れた変異体は精製され、変異部分およびその近傍あるいはペクタにより導入され た挿入配列全体のＤＮＡ配列分析により、必要な変異の存在が確認される。

ハイブリダイゼーｖｗンの後、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ、ＤＮ Ａポリメラーゼ、リバーストランスクリブターゼ、あるいは他の適当なりＮＡポ リメラーゼとの反応により、ファージＤＮＡ中に伸長される。得られた二本鎖Ｄ ＮＡは、Ｔ、ＤＮＡリガーゼのようなりＮＡリガーゼとの反応により、閉環二本 鎖ＤＮＡに変化する。一本鎖の部分を有するＤＮＡ分子は、Ｓ】エンドヌクレア ーゼ処理により破壊される。

得られた変異へテロ二重鎖ＤＮＡは、適当な宿主生物または細胞の形質転換に使 用される。宿主によるヘテロ二重鎖の複製により、双方の鎖の子孫が得られる。

複製に続き、変異遺伝子は変異鎖の子孫から単離され、過当な発現ペクタに導入 され、ベクタは更に適当な宿生生物または細胞の形質転換に使用される。典型的 なベクタおよび宿主については上記した。

定向性の変異誘発技術についてはよく知られており、また、文献２４−■にも記 載されている。

本発明は本発明のタンパクをエンフードするＤＮＡ配列のみならず、このような 配列と副腎自己抗原の抗原決定因子をエンコードする配列とがハイブリダイズさ れたＤＮＡ配列をも包含している。このような配列は、そのタンパクが改変され ているか否かに係わらず、改変されたタンパクまたは改変されたタンパク断片を エンコードしている。ハイブリダイゼーシ叢ンの条件には、例えばＳｍ１ｔｈ　 ＭおよびＧ１１ｌｌｘｓ　Ｓ！ｓあるいはＦａｍｂｒｏｏｋ　（上記）らによる 記載がある。改変されたＤＮＡは、通常、一般的なハイブリダイズ条件下で、よ り望ましくは厳密なハイブリダイズ条件下にて、本発明のタンパクをエンコード するＤＮＡ配列とハイブリダイズ可能である。

抗原タンパクに対する抗体 検定によっては、副腎タンパクに対する抗体の利用が便利な場合がある。この抗 体は、例示するような公知の方法により得られる。

多クローン抗体は、多クローン抗体を含む血清の産生を誘発する目的で、動物を 副腎自己抗原または抗原性を示す細胞で処理することにより得られる。

単りローノ抗体は、にｏｈ　ｔａｒとＭｌｌｓｔｅｌｎ”のハイブリドーマ技術 を用いることにより得られる。より典型的な膠考文献は付帯の文献目録に掲載し た；トロ。ハイブリドーマの方法によれば、ヒトまたは他の動物のリンパ球が、 本発明のタンパクまたはタンパク断片により免疫化される。免疫化された個体か ら得られた、あるいは培養されたリンパ球はミエローマと融合されて単一の細胞 となる。得られた連続した細胞系から抗体を産生ずるハイブリッドをスクリーニ ングし、こうしたハイブリッドを培養して抗体を捕集する。

この抗体は、本発明においては、ヒト単クローン抗体を含む完全な分子のみなら ず、抗原性を有するタンパクと結合可能であれば、たとえ断片であっても、非常 に有用なものである。

２１−ヒドロキシラーゼに対する抗体は、上記のような手法（こより産生可能と なっている。

ラベリング 本発明に係る検定法は、通常、検出のためラベルされた抗原または抗体を必要と する。ラベリングには多くの方法が知られて（する力τ、如何なる公知の方法も 適用可能である。付帯の文献目録に見られるように、ラベリングについては多く の文献に記載されているＩＩｏ 典型的なラベルには、放射線ラベル、酵素、蛍光物質、イヒ学発光物質、生物発 光物質、あるいはキレート金属等がある。また、こうしたラベルの抗原また＋１ 抗体への結合には、例示のようなあらゆる公知の方法力譬使用可能である。

検定 本発明に係る検定法は、当業者に抗体の定量または定性分析として知られてｔす るものであるが、いずれの方法においても、抗原性タン）＜り（上記方法で？与 られる副腎タンパクまたはその断片）と試料との接触を含んで（Ｘる。この検定 法ζｊ競金的でも非競合的であってもよく、また、例として１ｉ、放射線免疫検 定法（ＲＩＡ）、酵素免疫検定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）およびＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋ ｅｄ　ｌｍ５ｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ｅｙ　（ＥＬＩＳＡ）等がある。各 検定法の詳細につ％Ｘて（よ文献ｓ５を参照された−）。

本発明における競合的検定法は、抗原性タンｌ（り（タン１＜り断片を含む）と 生体試料（典型的なものとしては血清または尿）との接触を含んでｔする。試料 （ｉ、列えばリン酸緩衝溶液や他の緩衝溶液により、通常試料１部１こ対し１０ 〜３０部に希釈される。そして、一度または連続的に、抗原タン／４り１こ対し ラベルさレタ抗体が添加される。ラベル抗体と他の抗体とは競合的（こ抗原１こ 結合し、競合後、結合したラベル抗体の量を測定する。この手法では、抗原性タ ンｔ４り１よ、例え１ｆ、共有結合、アミドまたはエステル結合、あるいは吸着 等により基質に固定されていることが望ましい。

本発明の検定法はまた、基質に固定された抗原性タンパクを副腎自己抗体を含む と想像される生体試料と接触させる（例えばＲＩＡ％ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡのよう な）サントイフチ検定法をも含んでいる。洗浄後、ラベルされた抗原性タンパク またはラベルされた抗副腎自己抗体抗体を添加し、そのうちのいずれかを、固定 された抗原に結合したあらゆる副腎自己抗体に選択的に結合させる。また、ラベ ルの検出には、放出される放射線の定量または定性的測定や比色分析等、適当な 方法が適用される。

他の検定法も試料とラベルされた抗原性タンパクとを接触させるものであるが、 この場合、結合したラベル抗原と結合していないラベル抗原とを（例えば抗原に 対する抗体が吸着されたカラムを用いる等して〉分離し、ラベルを定量または定 性的に測定する。

これらの検定はいずれも、抗抗原性タンパク質抗体が固定された試料と、この抗 体と結合するラベル抗原とを接触させ、固定された抗体に結合したラベル抗原ま たは試料中の抗体に結合したラベル抗原を検出するものである。

副腎自己抗体のための実例となる２つの検定法１、放射線ラベルに基づく検定法 精製された副腎自己抗原は、多くの常法のうちのひとつを用いて例えば１２町で 放射線ラベルする。ラベルされた素材を、（例えばリン酸緩衝溶液２０に対して ｌの割合で）適宜希釈された試料血清とともに（室温で１時間）保持する。試料 中に存在する副腎自己抗体は１２％１でラベルされた副腎自己抗原に結合し、ま た、形成された複合体は抗ヒトグロブリン抗体または類似物質（固相のプロティ ンＡ）の添加により沈澱する。そこで、沈澱中におけるＩ＊ｓ＋でラベルされた 抗原の量を測定する。血清試料中の副腎自己抗体の量は、沈澱中の放射線量とし て作用するので、副腎自己抗体の量は、ベレット中の放射線量として示され、ま た、より一般的には、希釈液中に副腎自己抗体を含むことが、検定を行つた血清 試料が陽性であることの基準となる。

２、酸素ラベルに基づく検定法 ＥＬｒＳＡＬｒＳ−トのプラスチック製凹部の水平面を副腎自己抗原で直接また は間接的に被覆する。間接的な被覆方法には、凹部をはじめに副腎自己抗原に対 する単クローン抗体または多クローン抗体（抗体は副腎自己抗原との結合部位と 同一の部位に結合しないものを用意する）で被覆した後、副腎自己抗原を添加す る方法も含まれる。他の間接的な被覆方法は、いずれも公知のものである。

自己抗原の被覆後、（例えばリン酸緩衝溶液２０に対してｌの割合で）適宜希釈 された試料血清を凹部に添加し、凹部を被覆する抗原に副腎自己抗体が結合する よう、（室温で１時間）保持する。

凹部を洗浄後、例えば抗ヒ）ＩｇＧをホースラデイブンニベルオキシダーゼに結 合させた試薬を添加する。（例えば１時間の）保持後、洗浄を行い、オルトフェ ニレンジアニンのような酵素基質を添加して、発色を吸光度により測定する。

試料中の副腎自己抗体の量は、最終的な発色の強さとして作用するので、結果は 吸光度として示され、また、より一般的には、希釈液中に副腎自己抗体を含むこ とが、検定を行った血清試料が陽性であることの基準となる。

本発明には、抗原性タンパクと試料との相互作用を抗原性タン／４りを含むキッ トの使用により行うことも含まれる。抗原性タン１＜りを含むキ・ノドには、通 常、基質に固定され、抗副腎自己抗体抗体または抗原性タン、ｆりがラベルされ たサントイ１チ検定法の使用が便利である。

本発明にはまた、抗原性タンパクと抗原性タンパクに対応し、かつラベルされた 抗体を含む競合検定法も適用可能である。この場合、抗原性タンパクは基質に固 定されていることが望ましい。

本発明には更に、抗原／抗体複合体の検出を含む単純な検定法に使用される、ラ ベルされた抗原性タンパクからなるキットも含まれる。本発明に係る他のキット には、基質に固定され、ラベルされた抗原性タンパクが結合する、抗原性タンパ ク抗原が含まれる。

これらのキットは固定化されたタンパクを含み、かっこのタンパクは、望ましく はプラスチック製チコーブの内側に固定される。

本発明は、抗原として２１−ヒドロキシラーゼを用いた上記検定法およびキット をも含むものである。

また、本発明の変型としては、抗原性タンパクを自己抗体に対する抗体に置換し たものがある。この変型例はあらゆる抗体と結合するのでサンドイッチ検定法の りガントとしての使用には不適当である。

本発明にはまた、ステロイド２１−ヒドロキシラーゼを検出するための本発明に 係る抗原性タンパクに対する抗体の使用も含まれる。このような検定法には、上 記検定法およびキットも適用可能である。この抗体には、ヒト単クローン抗体か 、あるいはヒト多クローン抗体もしくは動物の単または多クローン抗体が使用可 能である。本発明の検定法に用いられる抗体は、１つ以上の抗体からなっていて もよい。

中の 自己免疫疾患は、少なくとも部分的には、Ｔ細胞を持続的に活性化する自己抗原 によりひきおこされる３−自己免疫疾患における自己抗原は、抗原性物質に対す る抗体を産生ずるＢ細胞の補助機能を有するＴ細胞受容体として、あるいは免疫 自己疾患に伴う他のＴ細胞として識別される、抗原性物質のあらゆるエピトープ となり得る。

従って、副腎自己免疫疾患には、この病気に伴うＴ細胞の作用を中断させること により、対処可能である。Ｔ細胞は、例えば、副腎やリンパ組織、あるいは循環 器等に侵入し、副腎自己抗原のエピトープに対応するヘルパーＴ　（Ｔｈ）細胞 として作用可能である。このようなＴｈ細胞は、Ｂ細胞による特定の抗目己抗原 抗体の産生を補助する。Ｔ細胞はまた、細胞間の免疫応答に介在し、あるいは副 腎皮質細胞に、サイトカインの放出により、または直接的に作用する。その結果 、副腎自己抗原に特異的な細胞毒性のＴ細胞が活性化されるか、炎症性の反応が 他の種類のＴ細胞により介在されると、副腎皮質細胞が破壊される。

もし、このようなＴ細胞が抗自己抗原抗体またはＴ細胞破壊性の副腎皮質細胞の 産性を抑制するよう干渉すると、このＴ細胞は、例えば自己抗原のＴ細胞エピト ープを含み、Ｔ細胞に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合可能なタンパクま たはタンパク断片（例えばペプチド）により分解される。

このようなタンパクまたはペプチド副腎皮質内で自己抗原と競合的な拮抗者とし て作用し、それにより、副腎自己抗体の産生または細胞間に介在する副腎自己抗 原に特異的な免疫性の結果である、抗原に特異的な細胞間の相互作用を阻害する 。自己免疫性疾患に対する処理のためのタンパクの使用に関する参考例は、付帯 の文献目録に掲載した３＠−４２゜ 治療上の他の試みとしては、副腎自己抗原に特異的なＴ細胞４ト４＠またはこの ような細胞のＴＣＨに類似のタンパクもしくはタンパク断片（例えばペプチド） ４１°４１の投与による、副腎自己抗原への自己免疫応答の抑制がある。このよ うな“ワクチン”の投与は、自己免疫性Ｔｍ胞のＴＣＲに特異的なＴ細胞により 介在されると考えられる“カウンター自己免疫”を誘導する４３・４１・Ｓｌ、 ６１゜自己免疫応答は、抗副腎自己抗原Ｂ細胞またはＴ細胞と特異的に区別可能 なサプレッサーＴ（Ｔｓ）細胞によっても抑制可能であるｓ２・ＳＳ。

こうした治療は、Ｔｓ細胞の誘導機能を有する副腎自己抗原エピトープを含むタ ンパクまたはタンパク断片を患者に投与するか、副腎自己抗原−副腎自己抗原の 応答を抑制する特異的なＴ３細胞を投与することによって効果を発揮する。

これらＴ細胞のエピトープまたは副腎自己抗原は、例えば当該技術における常法 により同定可能である。

副腎自己抗原に特異的な自己免疫性ＴＣＲは、文献ｉ４に記載の方法により特徴 づけられるｓ４゜自己免疫性Ｔ細胞と副腎自己抗原との相互作用の抑制は、副腎 の自己免疫性疾患により緩和もしくは阻害される。Ｔ細胞はこうした相互作用を 中断し、かつ調製された副腎自己抗原のための自己免疫性ＴＣＲに特異的なもの であるＩｏ 本発明には、上記のようなヒトまたは動物の副腎から得られるタンパクを含む（ 獣医学を含む）薬の処方も含まれる。このタンパクは、１つ以上のアミノ酸変性 物で改変されていてもよい。本発明にはまた、例えば副腎自己抗体への抗原決定 基を含むこうしたタンパクの断片の処方も含まれる。

他の観点から見れば、本発明には、２１−ヒドロキシラーゼまたは、例えば副腎 自己抗体に対する抗原決定基を含むペプチドのような２１−ヒドロキシラーゼの 断片を含む薬の処方も含まれる。

本発明には更に、例えばＴ細胞またはＢ細胞に特異的な副腎自己抗原のＴＣＲに 結合可能なペプチドのようなリガンドを含む薬の処方も含まれる。

一方、本発明はＴ細胞への受容体に類似の副腎自己抗原およびタンパクまたはタ ンパク断片（例えばペプチド）に特異的なＴ細胞を提供するものでもある。また 、例えばこうした副腎自己抗体に特異的なＴ細胞あるいはＴＣＨに類似のタンパ クまたはその断片により誘導された、カウンターロ己免疫性Ｔ細胞も本発明に含 まれる。上述のあらゆる試薬と同様、薬に使用可能な希釈液、賦形剤、あるいは 担体等を含む薬の組成もまた、本発明に含まれる。

／パ　の　の 抗原性タンパクは、例えば、基質上にて副腎自己抗原または２１−ヒドロキシラ ーゼに吸引させ、抗体を含む試料を基質上に通過させ、抗体を外すために基質を 洗浄する等の方法により、副腎自己抗体の精製に使用可能である。

また、副腎自己抗体は、検定で使用するための副腎自己抗体への抗体の調製や、 例えばそれ自身のラベルや競合検定法への使用が可能となる組み換え副腎自己抗 体の発現を検出するための組み換え宿主細胞のスクリーニング等に使用される。

９１１１゜ 副腎ミクロソームの調製および溶解 ヒト副腎は、死体より取り外した腎臓を取り囲む組織から取り外し、小片（１０ ０ｍｇ）として−７０°Ｃで保存した。ミクロソーム画分は副腎組織の磨砕液か ら、数次の遠心分離にて…離しロー＋２．２０％のグリセロールを含むｐＨ７， ０の１００ｍＭリン酸緩衝溶液に懸濁したく当初では、緩衝溶液１ｍｌあたり、 各１ｇの副腎組織が含まれる）。次いで、タフバク濃縮を行い１−混合液の最終 濃度を、１ｍｌあたり２５〜３０ｍｇの副腎組織となるよう調節した。

６ｍｌずつ等分した溶解ミクロソームは、一時間あたり２５ｍ１の速度でカラコ ール酸ナトリウム（固体）は、最終濃度がコレート３ｍｇに対し副腎タンパク１ ｍｇとなるよう添加し、混合液は０．１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１ｍＭのジチ オトレイロール（ＤＴＴ）により最終濃度に調節した。コール酸ナトリウムは４ ℃にてマグネチックスターラーを用い１時間攪拌を行うことより溶解し、混合液 は４℃にて１１００００ｘで１時間遠心分離した。遠心分離の後、上清に、１０ ０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，０）に対する５ｏ％ＰＥＧ６０００溶液を等量 と、２０％のグリ４ｔ　ｏ　−／Ｌｌ、０．１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ（ＤＥ ＤＴＡを添加し、Ｈ製品を４℃にてマグネチｌクスターラーを用い３０分攪拌し た。４℃にて１２０００Ｘｇで１時間遠心分離の後、得られたベレットを、２０ ％のグリセロール、０．１ｍＭのＤＴＴ、Ｏ，１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍ Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，０）に対する３％コール酸す）　リウム溶液に再懸 濁しく１ｍｌが当初の副腎組１１１．３ｇに相当する）、２０％のグリセロール 、０．１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸緩衝溶液Ｃ ｐＨ７，０）に対する０、３％コール酸す）　ＩＪウム溶液（基本緩衝溶液）を 用いて４℃で一晩透析した。透析後、４℃にてｔｚｏｏｏｘｇで１５分遠心分離 してあらゆる沈澱分を除去し、ミクロソーム画分を得た。

ミクロソーム調製品は、溶解したタンパクの濃度を推計し、等分して−７０”Ｃ にて保存した。

例２ 副腎自己抗原の精製 ここでは、（ｏｍｉｎａ■ｌらの方法１ｓならびにＢｕｍｐｓおよびＤｕｓの方 法ｌを用いた。特に、オクチル−セファロースＣＬ−４８（ファルマ／アＬＫＢ ＞は、製造元の使用説明書に従い＋２０％のグリセロール、Ｏ，１ｍＭのＤＴＴ ＋　Ｏ，１ｍＭのＥＤＴＡを含む大量の５０ｍＭリン酸緩衝溶ｊ［１（ｐＨ７， ０）で洗浄した後、ｌＸｌ０ｃｍのカラムに充填し、基本緩衝溶液と平衡させた 。

−４（Ｗ）！＋−た〜そ１丁−７の障参〇　聾ＶのＴ、轟＾ｉつｎ尤今ｔｙｏ口 Ｃ出プ　１＾Ｕム内に流入させ、当初は基本緩衝溶液で溶出させた。溶出液は各 ３．３ｍｌのフラク／Ｗンに回収し、２８０ｎｍおよび４１８ｎｍの吸光度をモ ニターした。カラムの洗浄は、２１３０ｎｍの吸光度がＯ，Ｏｈ　４１８’ｎｍ の吸光度が０となるまで続けられた。また、カラムからの更なる溶出は、基本緩 衝溶液中のエマルゲのウシ新生児血清（ＮＣ３）とともに、ゆっくり振盪しなが ら３７℃で２時間反応させた。これを、０．５％のＴｖｅｅｎ２０を含むＰＢｓ とともにすすぎおよび洗浄（３％５ｍｌ）した後、高水準の副腎自己抗原を含む 患者の血清または通常の血清を、０．５％のＴｖｅｅｎ２０および１０％のＮＣ Ｓ、１０％のグリセロール、１Ｍのグルコースを含むＰＢＳで１：４００の割合 で希釈したものと、ゆっくり振盪しながら３７℃で２時間反応させ、次いで、０ ．５％のＴｖｅｅｎ２０を含む多量のＰＢＳで洗浄した。更に、これを、抗−ヒ ト免疫グロブリンとポースラディシ１ペルオキシダーゼとの混合物を０．　５％ のＴｖｅｅｎ２０を含むＰＢＳで希釈したものとともに、ゆっくり振盪しながら 室温で１時間保持した。その後、これを、ｏ、５％のＴｗｅａｎ２０を含むＰＢ Ｓで洗浄し、化学発光物質と、その物質の製造者（ＥＣＬＣメンム、アメルンヤ ムンｔｂ定の手順により反応させた。このニトロセルロース膜を写真フィルムと ともに１０〜６０分置き、フィルムを現像した。

実験はまた、組換えステロイド２１−ヒドロ亭シラーゼに対するウサギ抗体■お よびミクロソームのエポキシド加水分解酵素に対するウサギ抗体ｓ７を、抗−ウ サギＩｇＱとホースラブイン１ベルオキシダーゼとの混合物と組み合せて用いた 場合についても行った。

例３ 電気泳動ゲルの分析 図２に示す通り、副腎自己抗体は、見かけの分子量が５５０００±５ｏｏｏであ るバンドで示されるタンパクのみと反応している。更なる研究において、フラク ン璽ン■の分子ｆｆ１５５ｏｏｏのバンドをゲルから切り出し、電気溶出を行っ た後ゲル電気泳動系で再度泳動させたところ、このタンパクは分子量５５０００ の単一なバンドとなった。また、電気溶出後の物質をニトロセルロース膜上でプ ロットしたところ、副腎自己抗体と強く反応した。これらの知見は、自己免疫性 アジフン病においては、分子量５５０００のタンパクが尤な副腎自己抗原として 含まれていることを示すものである。

カラム浦出物のワラクシ１ンの電気泳動により得られたゲルζこお１するタンｌ ｆりの染色は、ワラクシ１ン■に分子量５５０００のタンＩイクが含まれて−１ にとを示シている（図３）。アラクン１ン■の周辺のワラクシ１ン１こちまた、 分子量５５０００のタンパクがより少量歯まれて−する。

フラクシ冒ン■に対する更なるウェスタンブロッティングの結果を図６１ご示す 。

ここで、レーンｌは通常の血清を集めたものとの反応を、レーン２４副腎自己抗 体に陽性な血清を集めたものとの反応を、レーン３はウサギの２１−ヒドロキシ ラーゼ抗体との反応を、レーン４は通常のウサギ血清との反応を、レーン５（１ ウサギのエポキシド加水分解酵素抗体との反応をそれぞれ示す。２１−ヒドロキ シラーゼに対するウサギの抗体が分子量５５０００のタン／くりと反応して（す るの４二対し、エポキシド加水分解酵素に対する抗体は分子量４９０００のタン ／ずりと反応していることがわかる。

同一性を確認するため、他の実験において、フラクシ璽ン■の５ＤＳ−ＰＡＧＥ 分析で得られた分子量５５にの１＜ノドをゲルから切り出し、電気溶出を行った 後ＰＡＧＥにより泳動を行い、更にウェスタンプロ・ノドにより分析した（デー タ未掲載）。溶出後の物質は副腎自己抗体に陽性な血清および２１−ヒドロキシ ラーゼに対するウサギの抗体とは強く反応するが、エポキシド加水分解酵素に対 する抗体および通常のヒト血清を集めたものならびに通常のウサギ血清と１１反 応しなかった。

これらの知見は、自己抗原がステロイド２１−ヒドロキシラーゼであることを示 すものであり、かつエポキシド加水分解酵素（英国特許願９２０５０４０．０号 ）が、ゲル中の異なったバンドから得た配列に由来することを強く示唆するもの である。

例４ 副腎抗原と副腎抗体との吸着 プロティンＡ−ガラスピーズカラムを用いたクロマトグラフィー（バイオプロセ ッシング、コンセット、英国）を用いて、通常の血清を集めたものと、個人の患 者の血清とから、ＩｇＧを精製し、精製した抗原性タンパクをこれらＩｇＧ（２ 〜５ｍｇ／ｍ１）と３７℃で１時間保持した。次いで、プロティンＡ−ガラスピ ーズのＰＢＳ！１％濁液を添加し、遊離のＩｇＧおよび副腎抗原と複合体を形成 したＩｇＧを連結させた。室温に１時間置いた後、この混合物を遠心分離（１２ ０ＱＱＸｇ、４℃、１０分）し、上清を、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびアジラン病血 清と組換え２１−ヒドロキシラーゼに対するウサギの抗体とを用いたウェスタン プロｌティングにより分析した。

ウェスタンプｅ２１トによれば、組換え２１−ヒドロキシラーゼに対するウサギ の抗体は、アジンン病血清に陽性なヒト副腎自己抗体由来のＩｇＧに予め吸着さ れた通常の副腎５５にタンパクとは反応しなかった（データ未掲載）。すなわち 、通常の血清由来のＩｇＧを予め吸着させておくと、２１−ヒドロキシラーゼに 対する抗体との反応性が失われる。

例５ 副腎自己抗原を用いた副腎自己抗体の検定法図１に示すフラクシ謬ンｌ〜■を微 量（１μｌ）ずつ分け、ニトロセルロース膜上でプロットした後、ニトロセルロ ース膜を細長く切断、洗浄し、免疫自己抗体または通常の血清を含む血清と反応 させた。

図４Ｂに示す通り、フラクシ嘗ン１〜■のドツトプロットは通常の血清と強く反 応し、フラクシ嘗ン■と通常の血清とは弱く反応している。図２に示すウェスタ ンプロ１テイングの知見では、通常の血清と副腎自己抗原とは相互作用を示さな いことになっている。従って、フラクシロンＩ〜■の結果は、明かに副腎自己抗 体の分析としての使用に不都合である。しかしながら、フラクシ璽ン■はドツト プロットにおいても通常の血清と全く反応していないことから、副腎自己抗原に 特異的な検定法の存在が示唆される。フラクシ■ン■をＭいた典型的なドブトプ ロットア１セイの結果を図５に示す。図５に示すドフトブロ１トアフセイの結果 は、興なる患者由来の血清を試料に用いて処理を行ったものである。すなわち、 試料ｌおよび２はアジラン病患者の血清、試料３は通常の血清、試料４および５ は全身性エリテマトーデス患者の血清、試料６は／Ｓシモト病病者者血清、試料 フは原発性胆石患者の血清、試料８はグラープ病患者の血清をそれぞれ試料とし ている。

表１は、アジラン病患者のグループから得られた結果をまとめたものである。

３６人分のアジソノ病血清をドブドブロットアッセイにより分析したところ、２ ６例（７２％）が陽性となった。ＩＦＪまたは３種以上の異なる方法（免疫蛍光 法、免疫沈降法、あるいはウェスタンプロット）により血清の分析を行い、ドツ トプロットで陽性な２６例の全てにおいて副腎自己抗体の存在を確認した（表１ ）。

ドブドブロットアッセイにて陰性となった１０例のアジラン病血清は、他の３種 の方法による副腎自己抗体の検定においても陰性であった（表１）。また、副腎 自己抗体の検定にて陽性となった２６人の患者は、甲状腺自己抗体の保有比率が 高かった。特に、ＴＰＯ（甲状腺ペルオキシダーゼ）自己抗体においては、２２ ／２６（８５％）、Ｔｇ（チログロブリン）自己抗体においては、１７／２６（ ６５％）、ＴＲＡｂ（甲状腺刺激ホルモン受容体自己抗体）においては、４／２ ６（１５％）であった。ＴＲＡｆｉ陽性患者のうち少なくとも２名（Ｎｏ２３お よび２６）は、甲状腺中毒の明かな病歴を有しているのに対し、副腎自己抗体の 検定にて陰性となった表１中１０名のアジラン病患者は、通常と同様の甲状Ｈ８ 己抗体存在比を示していた１０ １０名のハシモト病患者、１０名のグラーブ病患者、５名の慢性関節リューマチ 患者、５名の全身性エリテマトーデス患者、４名の原発性胆石患者、および１０ 名の健常者では、（グラーブ病患者由来の）１例の血清のみが陽性となった。

このグラーブ病患者由来の血清では、ウェスタンプロットにて、分子量５５００ ０のバンドと反応する抗体の存在が確認された。

ドブドブロットアッセイを用いた発明者らの知見は、血清に対する免疫蛍光法を 用いた過去の多くの研究１・−２才とよく一致するものであった。例えば、Ｎｅ ｒｕｐ”および旧ＺＺｉｒｄ”はそれぞれ７４％および６３％の特発性アジンン 病患者が血清中に副腎自己抗体を有していることを免疫蛍光法により見いだして いる。免疫蛍光法によれば、健常者は殆ど副腎自己抗体を有していないが、多く の研究報告２＠−１が、副腎自己免疫疾患を持たない小数のグラーブ病患者に副 腎自己抗体が見られることを報じている。これは、グラーブ病患者の血清からの ドツトプロットによる副腎自己抗体の検出という結果と一致する。

副腎自己抗体の検出 甲状腺自己抗体 注：３＝抗微小管抗体　ｂ＝抗−島細胞抗体　Ｃ＝抗−壁細胞抗体　ｄ＝抗−核 抗体ｅ＝抗−ミトコンドリア抗体　ｒ＝抗−デスミン抗体ｇ＝抗−ステロイド産 性細胞抗体　ｎｔ＝試験せず　ｎｅ（＝陰性５ａｃｃｈａｒｏ纏ｙｃｅｓ　ｃｅ ｒａｖＩｓＩｓｅ内における２１−ヒドロキシラーゼの発現酵母５ａｃｃｈａｒ ｏａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内における発現には、酵母に対するベクタ であるプラスミドｐＹＥｓ２．０　（インビトローゲンより購入）を用いた。プ ラスミドベクタ５７４２０）から得た。２１−ヒドロキシラーゼの遺伝子配列は Ｂ！■旧断片（Ｂａｌ１１１は、ノースウンブリア　バイオケミカル社、クラミ ントンＮＥ２３　９夏（Ｌ、英国より購入）により、クローニングベクタｐｙｚ ＋ａ　（ファルマシアよ０購入）にサブサブクローン後、更なる消化が、酵素５ ｐｈｌ　（ノースウンブリア　バイオヶミヵラーゼを完全にコードする部分を含 む大きな断片が産生された。

切断される）に連結することにより調製された。このリンカ−分子はオリゴヌク レオチド合成装置を用いて合成された。

ＹＥＩ’−グルコース（２％）またはＹＥＰ−ガラクトース（２％）を含むより 大規模な発現培地への接種に使用した。

酵母の細胞は、Ｉ　００ｍ１の発現培地で４８時間培養後、対数増殖期の後期に 回収ｕ、１ｍＭのフェニル−メチル−スルフォニル−フルオライド（ＰＭＳＦ） を含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８，０）で洗浄し、デオキシコール酸ナト リウム０．　１％と１ｍＭのＰＭＳＦを含む５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８， ０＞に再懸濁した。次いで、酸処理したビーズ（シグマ４５０−５００μｍ）を 加え、３０秒間ずつ１０回攪拌して細胞を破壊した。撹拌の間には、水中にて３ ０秒間のインキュベー／欝ノを行った。ガラスピーズと分離後、磨砕液を１２０ ０Ｑｘｇで２分間遠心分離し、上清を５ＤＳ−ＰＡＧＥに引続きウェスタンプＯ ，ティングにより分析した。

本願に含まれる内容は、英国特許願９２０５０４０．０号および９２１６３０文 献目録 １．　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＪＲ，Ｇｏｕｄｉｅ　ＲＢ、　Ｇｒｉｙ　ＫＧ、　Ｔ ｉｍｂｕｒｙ　ＧＣ（１９５７）　ＬＬｎｃｅＩｉ：　ｌ　P２３−１１２４ ２、Ｂ１１ｚｚａｒｄ　ＲＭ、　Ｋｙｌｅ　Ｍ　（１９６３）　Ｊ、　Ｃ１１ｎ 、　ＩｎｖｅｓＬ　４２：１６５３−１６６０゜３、Ｇｏｕｄｉｅ　ＲＢ、　Ｍ ｃＤｏｎａｌｄ　Ｅ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＪＲ，Ｇｒａｙ　Ｋ　（＋９６８） 　Ｃｌ１ｎ、　ｅｘｐ、　Ｉ高高浮獅盾■ ３：１１９−１３１゜ ４、５ｏｔｏｓｉｏｕ　Ｆ、　Ｂｏｏａｚｚｏ　ＧＦ、　Ｄｏｎｉａｃｈ　Ｄ　 （１９８０）　Ｃｌ１ｎ、　ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　R９：９７−　ｌ　 １１ ５、　Ｓｔｅｃｈｅｍｅｓｓｅｒ　Ｅ、　Ｓｃｈｃｒｂａｕｍ　ＷＡ、　Ｇｒｏ ｓｓｍａｎｎ　Ｔ、　Ｂｅｒｇ　ＰＡ　（１９８５）　Ｊ、@Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　８０：６７−７６． ６、Ｋｏｓｏｗｉｃｚ　Ｊ、　Ｇｒｙｃｚｙｎｓｋａ　Ｍ、　Ｂｏｔｔａｚｚｏ 　ＧＦ　（１９８６）　Ｃ１１ｎ、　ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎ盾戟A　６３：６７ １− ６７９゜ ７、　Ｃｅｎｔｅｎｏ　Ｅ　Ｒ，Ｓｈｕｌｍａｎ　Ｓ　（＋９７３）　Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｙ　２４　：　９０１−９１０８、　Ｂｒｉｇｈｔ　Ｇ　Ｍ　ａｎｄ 　Ｓｉｎｇｈ　Ｉ　（１９９０）　Ｊ　Ｃ１１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　 Ｍｅｔａｂ、　７０（P）　：　９５−９９ ９、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ　４７２０４５４．　ＶＡｉｔｅ　ＰＣｅ ｔ　ａｌ。

１０、　Ｖ／ｈｉｔｅ　ＰＣ，Ｎｅｗ　Ｍｌ、　Ｄｕｐｏｎｔ　Ｂ　（１９８６ ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ`　８３　：　５１ １＋− １１、Ｆｕｒｍａｎｉａｋ　Ｊ、　Ｔａ１ｂｏｔ　Ｄ、　Ｒｅｉｎｗｅｉｎ　Ｄ 、　Ｂｅｎｋｅｒ　Ｇ、　Ｃｒｅａｇｈ　ＦＭ、　Ｒｅｅｓ@Ｓｍｉ由Ｂ （１９８ｇ）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｎｓ　２３１：２５−２８゜１２、５ｃｈａｒｄ ｔ　ＣＷ、　ＭｃＬａｃｈｌａｎ　ＳＭ、　Ｍａｔｈｅｒｓｏｎ　Ｊ、　Ｒｅｅ ｓ　Ｓｍ１ｔｈ　Ｂ　（１９８２）　Ｊ@Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５：１５５−１６８゜１３−　Ｋａｊｉｕ　Ｙ、　Ｍｏｒｇ ａｎ　Ｄ、Ｐａｒｋｅｓ　ＡＢ、Ｒｅｅｓ　Ｓｍ１ｔｈ　Ｂ　（１９８５）　Ｆ ＥＢＳ　Ｌｔｔｕ　１■V：：３３４− ！４．　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｍ　（＋９７６）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　７２：２４ｇ−２５４＋５．　Ｋｏｍ＋ｎａｍＩＳ、　０ｃｈｏ　Ｈ９Ｋｏｂ ａｖａｓｈｌ’ｌ’、　Ｔａｋｅｍｏｒｉ　Ｓ　（１９８０）　Ｊ　Ｂｉｏｌ　 ＣｅP １５９（８）：３３８６−３３９４ １６、　Ｂｕｍｐｕｓ　ＪＡ、　Ｄｕｓ　ＫＭ　（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　２５７（２１）：１２６９６−１２７０４K １７、　Ｌａｅｍｍｌｉ　ＵＫ　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０ −６８４゜ｉ８．　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ　ＬＭ、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　ＤｒＷ、　 ５ａｒｓｅｒｏ　Ｄ、　Ｂｅｅｖｅｒ　Ｋ、　ＭｃＬａｃｈｌａｎ　Ｓl、　Ｒ ｅｅｓ Ｓｍｉｔｈ　Ｂ　（＋９９０）　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１２３： ４９３−４９８゜１９、　Ｂ１１ｚｚａｒｄ　ＲＭ、　Ｃｈｅｅ　Ｄ、　Ｄａｖ ｉｓ　Ｗ　（１９６６）　Ｃｌ１ｎ、　ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１：１P ９−１２８゜ ２０、　Ｎｅｒｕｐ　Ｊ　（＋９７４）　Ａｃｔａ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　 （１９７４）　７６：１４２−１５８゜２＋、　Ｓｃｈｅｒｂａｕｍ　ＷＡ、　 Ｂｅｒｇ　ＰＡ　（１９８２）　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１６： ３４５−３５２゜２２、８ａｔｅｒｌｅ　Ｃ，Ｚａｍｃｈｅｔｕ　Ｒ，Ｔｒｅｖ ｉｓａｎ　Ａ、　Ｚａｎｅｔｔｅ　Ｆ、Ｐｅｄｉｎｉ　Ｂ、’　Ｍａｎｔｅｒ潤 @Ｆ　（４由 Ｊｕｎｅ　１９８３）しｕｔｃｅｔ：　１２３８−１２４０゜２３、　Ｂａｗｒ ｌｅ　Ｃ，５ｃａｌｉｃｉ　Ｃ，Ｐｒｅｓｏｔｔｏ、　Ｆ、　Ｐｅｄｉｎｉ　Ｂ 、　Ｍｏｒｏ　Ｌ、　Ｒｉｇｏｕｏ　Ｆ、@Ｍａｎｔｅｒｏ　Ｆ （１９８８）　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　１１７：４６７−４７５゜２４、 　Ｌａｔｈｅｒ　ＲＦ、　Ｌｅｃｏｑ　Ｊ　Ｐ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｕｉｃ　Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ@１９８３　（ｐｐ３１− ５０）。

２５、　Ｓｍ１ｔｈ　Ｍ、　Ｇｉｌｌａｍ　Ｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍ■狽■盾р刀A　Ｐ ｌｅｉ＞ｕｍ Ｐｒｅｓｓ　（＋９８１）　３：１−３２゜２６、　Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦ ａｒｌａｎｄ　ｅｌ　、１１．　（１９８２）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵrＡ　７９：６４０９−１３ ２７、Ｇｉｌｌａｍｅｔａｔ、（１９８０）Ｇｅｎｅ１２−１２９−１３７゜２ ８、　Ｚｏｌｌｅｒ　Ｍ　Ｊ、　Ｓｍ１ｔｈ　Ｍ　（＋９８３）　Ｍｅ由、　Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、　＋００：４６ｇ−５００゜２９、Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ、　Ｍｉｌ ｓｔｅｉｎ　Ｃ（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−１９７゜３（ｌ 　Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ（１９７６）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６：５１１−５１９３１、　Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ、　Ｍｉｌｓ ｔｅｉｎ　Ｃ（＋９７６）’Ｅｕｒ、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６：２９２゜３ ２、　ＨａｍｍｅｒｌＬｎｇ　ｅＬａｌ、　ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄ盾高≠刀B Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８１　（ｐｐ　５６３−６８１） 。

３３−　Ｋｅｎｎｅｕ　ＲＨ，ＭｃＫｅａｒｎ　Ｔ　Ｊ、　Ｂｅｃｈｔｏｌ　Ｋ 　Ｂ　（ｅｄｉｔｏｒｓ）、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎ迫Rｏｄｉｅｓ。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（＋９８０）。

３４、　Ｍｅｌｃｈｅｒｓ　Ｆ、　Ｐｏｎｅｒ　Ｍ、　Ｗａｒｎｅｒ　Ｎ　（ｅ ｄｉｔｏｒｓ）、　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏ高≠刀A　Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ　８１　：ｌ−，２４６P１９７８１ ３５、Ｖｕｎａｋｉｓ　ＨＶ、　Ｌａｎｇｏｎｅ　Ｊ　Ｌ　（ｅｄｉｔｏｒｓ） 、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ、　Ａｃａｄ■高奄メ@Ｐｒｅｓ ｓ Ｖｏｌｓ、　７０．７３．７４．　＆４　ａｎｄ　９２　（１ｍｍｕｎｏｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｐａｒｔｓ　Ａ　（１X８０）、　Ｂ （１９８１）、　Ｃ（１９＋１１１）、　Ｄ　（１９８２）、　Ｅ　（１９８３ ）］。

３６、　Ｊａｎｅｗａｙ　Ｃ（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：４８２゜３ ７、　Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ　Ｈｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ９）　Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　７：３７１−４０５゜３ｇ、　Ｋｕｍａｒ　Ｖ　ｅＬ　 ａｌ、　（１９８９）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　７：６５７−６ ８２゜３９、　Ｕｒｂａｎ　Ｊ　Ｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ９）　Ｃｅｕ　５ ４：５７７−５９２゜４０、　Ｗｒａｉｔｈ　Ｄ　Ｃｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ９ ）　Ｃｅ１ｌ　５７：７０９−７１５−４１、　Ｗｒａｉｔｈ　Ｄ　Ｃｅｔ　ａ ｌ、　（１９８９）　Ｃｅ１１５９：２４７−２５５゜４２、　Ｕｒｂａｎ　Ｊ 　Ｌ　ａｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｃｅ１ｌ　５９：２５７−２７１゜４３、 　Ｃｏｈｅｎ　Ｉ　Ｒ（１９８６）　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、　９４：５− ２１゜４４、　（１９８６）　Ｐｒｏｇ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｖに４９１−４ ９９゜４５、　（１９８８）　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ、　２５８：５ ２−６０゜４６、　（Ｆｅｂ　１５．１９８９）　Ｈｏ５ｐ、　Ｐｒａｃ、　５ ７−６４゜４７、　Ｃｏｈｅｎ　Ｉ　Ｒｅｔ　ａｔ、　（１９８８）　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　９：３３２−３３５゜４８、　Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ　 ＡＡ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｎａｎ＋ｒｅ　３４１：５４１−５４４゜ ４９、　Ｈｏｗｄｌ　Ｍ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ９）　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２４６：６６８−６７１゜５０、　Ｓｕｎ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　 Ｎａｔｕｒｅ　３３２：８４３−８４５゜５１、　Ｓｕｎ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ、　 （１９８８）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１８：１９９３−１９９９ ゜５２、　Ｇｒｅｅｎ　Ｄ　ｅｉａｌ、　（１９８３）んｍ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１：４３９゜５３、　Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ　Ｂ　ｉｎ　Ｔｈｅ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　ＨＰ　 Ｐｕｂｌ奄唐■奄獅■@Ｃｏ　Ｉｎｃ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　＋９８３　（４９−６２）５４−　Ｂｕｒｎｓ　Ｆ　Ｊ　ｅ ｔ　ａｌ、　（＋９８９）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６９：２７゜５５、 　Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ　Ｈｅｔ　ａＵ、　（１９８９）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、 　１ｍｍｕｎｏ１．７：３７１５６、Ｈｕ　Ｍ、Ｃｈｕｎｇ　Ｂ　（１９９０） Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　４　：　８９３−８９８５７、　Ｃｒａｆｔ　 Ｊ　Ａ、　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｍ　Ｒ，Ｂｕｒｃｈｅｌｌ　Ｂ　（＋９８７）　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒｏｕ狽刀A　１５　：　７０８− ５８、　Ｋｉｎｇ　Ｋ、　Ｄｏｈｌｍａｎ　ＨＧ、　Ｔｈｏｒｎｅｒ　Ｊ、　Ｃ ａｒｏｎ　Ｍ　Ｇ、　Ｌｄｋｏｗ＋ａ　ＲＪ　（１９９０）@５ｃｉｅｎｃｅ ２５０　：　１２１−１２３ Ｉ　ＩＩＩＩＩ　ＩＶＶＶＩＶＩＩＶＩＩＩ　Ｉ　ＩＩＩＩＩＩＶＶＶＩＶＩＶ ＩＩＡ！１腎自己抗体との反応　Ｂ通常血清との反応原液１／２　１／４１１Ｂ 　原液１／２１／４１／ＢＡ副腎自己抗体との反応　８通常血清との反応図、　 副腎抗原 原液　１：４　原液　１：４ ５５に→　嗜１−−　９−　− ４３に−− 図７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｙ　７０５５−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （ＣＩ２Ｎ　９１０２ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＦＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰＩ

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の副腎自己抗体の検出法であって、試料と接触する、（１）ヒトまた は哺乳類の副腎のミクロソーム画分から得られ、見かけ上薬５００００〜６００ ００の分子量を有し、副腎自己抗体に対する抗原性を示すタンパクを含み、 （ｉｉ）この副腎タンパク（ｉ）の１またはそれ以上のアミノ酸が改変され、副 腎自己抗体に対するエピトープを含み、あるいは、（ｉｉｉ）改変された、また は改変されていない副腎タンパク（ｉ）の断片が副腎自己抗体に対するエピトー プを含む、 試料中の副腎自己抗体の検出法。
2. ２．このタンパクが約５５０００の分子量を有する請求項１に記載の方法。
3. ３．このタンパクまたにタンパク断片が組換え体に由来する請求項１または請求 項２に記載の方法。
4. ４．試料と接触する前記断片が合成ペプチドである請求項１または請求項２に記 載の方法。
5. ５．このタンパクまたはタンパク断片がラベルされ、更に、ラベルされたタンバ ク（断片）／自己抗体の複合体または、未結合のラベルされたタンパク（断片） の検出を含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
6. ６．このタンパクまたはタンパク断片と、試料およびこのタンパクまたにタンバ ク断片に対するラベルされた抗体とを接触させ、このタンパクまたはタンパク断 片と結合したラベルされた抗体を検出する、請求項１ないし４のいずれかに記載 の方法。
7. ７．このタンパクまたにタンパク断片が基質に固定されている請求項６に記載の 方法。
8. ８．このタンパクまたはタンパク断片が基質に固定され、このタンパクまたはタ ンパク断片と試量との接触後、このタンパクまたはタンパク断片を、副腎自己抗 体に対するラベルされたリガンドと接触させ、結合したラベルされたリガンドを 検出する、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
9. ９．このリガンドが、請求項１で規定されたタンパクまたはタンパク断片、副腎 自己抗体に対する抗体、抗免疫グロブリン、プロテインＡ、またはプロテインＧ である請求項８に記載の方法。
10. １０．このタンパクまたにタンパク断片がヒトのものである請求項１ないし９の いずれかに記載の方法。
11. １１．試料中の副腎自己抗体の検出法であって、試料と接触する、ａ）哺乳類の 副腎を磨砕し、 磨砕物を異なる遠心分離にかけてミクロソーム画分を得、このミクロソーム画分 をリン酸緩衝溶液に懸濁し、懸濁液をコール酸ナトリウムの存在下で遠心分離し て上清を得、この上清にポリエチレングリコールと更なるコール酸ナトリウムと を加えて混合し、 混合した上清を遠心分離してベレットを形成させ、このペレットをコール酸ナト リウム水溶液に加えて懸濁液とし、この懸濁液をコール酸ナトリウム水溶液に対 し透析して可溶性ミクロソーム調製品とし、 この可溶性ミクロソーム調製品をカラムクロマトグラフィーにより精製してタン バクを含有するカラムフラクションを得ることによって得られる、副腎自己抗体 に対するエピトープを含み、かつ見かけ上約５００００〜６０００○の分子量を 有するタンパクを含み、 ｂ）この副腎タンパク（ａ）の１またはそれ以上のアミノ酸が改変され、副腎自 己抗体に対するエピトープを含み、あるいは、ｃ）改変された、または改変され ていない副腎タンパク（ａ）の断片が副腎自己抗体に対するエピトープを含む、 試料中の副腎自己抗体の検出法。
12. １２．更に、請求項２ないし１０のうち１つ以上の特性を備える請求項１１に記 載の方法。
13. １３．試料と、固定化された、請求項１ないし３または１０のいずれかに規定さ れたタンパクあるいは請求項１ないし４または１０のいずれかに規定されたタン バク断片に対する抗体との接触を含み、この抗体が、予め請求項１ないし３また は１０のいずれかに規定されたタンパクあるいは請求項１ないし４または１０の いずれかに規定されたタンパク断片を含むラベルされたリガンドと結合され、更 に、固定化された抗体に結合したラベルされたリガンドまたは試料中の抗体に結 合したラベルされたリガンドを検出する、試料中の副腎自己抗体の検出法。
14. １４．試料と、固定化された、請求項１１に規定されたタンパクまたはタンパク 断片に対する抗体との接触を含み、この抗体が、予め請求項１１に規定されたタ ンバクまたはタンパク断片を含むラベルされたリガンドと結合され、更に、固定 化された抗体に結合したラベルされたリガンドまたは試料中の抗体に結合したラ ベルされたリガンドを検出する、試料中の副腎自己抗体の検出法。
15. １５．請求項１ないし４のいずれかに規定され、かつラベルされているタンパク 断片。
16. １６．副腎自己抗体に対するエピトープを含む合成ペプチド。
17. １７．請求項１ないし３、１０または１１のいずれかに規定されたタンパクある いは請求項１ないし４、１０または１１のいずれかに規定されたタンパク断片を 含む試料中の副腎自己抗体検出用のキット。
18. １８．このタンパクまたはタンパク断片がラベルされている請求項１７に記載の キット。
19. １９．更に、このタンパクまたはタンパク断片に対するラベルされた抗体を含み 、このタンパクまたはタンパク断片が任意に基質に固定されている請求項１７に 記載のキット。
20. ２０．このタンパクまたはタンパク断片が基質に固定され、更に、副腎自己抗体 に対するラベルされたリガンドを含む請求項１７に記載のキット。
21. ２１．このリガンドが、請求項１で規定されたタンパクまたはタンパク断片、副 腎自己抗体に対する抗体、抗免疫グロブリン、プロテインＡ、またはプロテイン Ｇである請求項２０に記載のキット。
22. ２２．請求項１ないし３、１０または１１のいずれかに規定されたタンパクある いは請求項１ないし４、１０または１１のいずれかに規定されたタンパク断片に 対する固定化された抗体を含み、この抗体が、予め請求項１ないし３、１０また は１１のいずれかに規定されたタンパクあるいは請求項１ないし４、１０または １１のいずれかに規定されたタンパク断片を含むラベルされたリガンドと結合さ れている試料中の副腎自己抗体検出用のキット。
23. ２３．活性成分として、請求項１ないし３、１０または１１のいずれかに規定さ れたタンパクあるいは請求項１ないし４、１０または１１のいずれかに規定され たタンパク断片を含み、かつ薬品として容認し得る希釈液、賦形剤、あるいは担 体である薬品の処方。
24. ２４．この活性成分のタンパク断片がペプチドである請求項２３に記載の薬品の 処方。
25. ２５．副腎自己抗原に特異的なＴ細胞の受容体に結合可能なリガンドを含み、か っ薬品として容認し得る希釈液、賦形剤、あるいは担体である薬品の処方。
26. ２６．このりかンドがペプチドである請求項２５に記載の薬品の処方。
27. ２７．ヒトまたは哺乳類の副腎のミクロソーム画分から得られ、見かけ上約５０ ０００〜６００００の分子量を有し、かつ副腎自己抗体に対し抗原性を有するタ ンバクに特異的な、単離されたＴ細胞。
28. ２８．ヒトまたは哺乳類の副腎のミクロソーム画分から得られ、見かけ上約５０ ０００〜６００００の分子量を有し、かつ副腎自己抗体に対し抗原性を有するタ ンバクに特異的なＴ細胞の受容体に類似する、タンパクまたはタンパク断片。
29. ２９．請求項２７に記載のＴ細胞、または請求項２８に記載のタンパクまたはタ ンバク断片に誘導された、単離されたＴ細胞。
30. ３０．Ｂ細胞、あるいは、ヒトまたは哺乳類の副腎のミクロソーム画分から得ら れ、見かけ上約５００００〜６００００の分子量を有し、かつ副腎自己抗体に対 し抗原性を有するタンパクに特異的なＴ細胞に特異的な、単離されたＴｓ細胞。
31. ３１．ヒトまたは哺乳類の副腎のミクロソーム画分から得られ、見かけ上約５０ ０００〜６００００の分子量を有し、かつ副腎自己抗体に対し抗原性を有するタ ンバクに特異的なＴ細胞、ヒトまたは哺乳類の副腎のミクロソーム画分から得ら れ、見かけ上約５００００〜６００００の分子量を有し、かつ副腎自己抗体に対 し抗原性を有するタンパクに特異的なＴ細胞に誘導されたＴ細胞、Ｂ細胞あるい は、ヒトまたは哺乳類の副腎のミクロソーム画分から得られ、見かけ上約５００ ００〜６００００の分子量を有し、かつ副腎自己抗体に対し抗原性を有するタン バクに特異的なＴ細胞に特異的なＴｓ細胞、もしくは、こうしたＴ細胞の受容体 に類似するタンパクまたはタンパク断片を含み、かつ薬品として容認し得る希釈 液、賦形剤、あるいは担体である薬品の処方。
32. ３２．最初の１３個のアミノ酸をコードする塩基を酵母のリーダーシークエンス をコードする塩基に置換することにより改変された、プラスミドｐＣＤ／／ｐＣ ２１／３ｃ（ＡＴＣＣ５７４２１）から得られるステロイド２１−ヒドロキシラ ーゼの遺伝子配列を、酵母で発現するベクタ内に連結し、得られたベクタにより Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換させる、ステロイ ド２１−ヒドロキシラーゼを産性し得るＳａｃｃｈａｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅの形質転換体の生成方法。
33. ３３．前記プラスミドより得られたステロイド２１−ヒドロキシラーゼの遺伝子 配列を、ｂａｍｌ断片としてベクタｐＴＺ１８内にサブクローンし、得られた２ １−ヒドロキシラーゼの遺伝子配列を有するベクタを、２１−ヒドロキシラーゼ をコードすろ領域を含み、かつ酵母で発現するベクタｐＹＥＳ内に連結される断 片を得るために、コード化されていない１１塩基対とＳＴＥ２の遺伝子配列をコ ードする４２塩基対とを含むＢａｍｈｌ−Ｎａｒｌリンカ−を用いて、ＢａｍＨ ｌおよびＳｐｈｌにより切断し、消化する請求項３２に記載の方法。
34. ３４．請求項３２に記載の方法で調製されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅの形質転換体の培養を含む、ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ の発現方法。
35. ３５．最初の１３個のアミノ酸をコードする塩基を酵母のリーダーシークエンス をコードする塩基に置換することにより改変された、プラスミドｐＣＤ／／ｐＣ ２１／３ｃ（ＡＴＣＣ５７４２１）から得られるステロイド２１−ヒドロキシラ ーゼの遺伝子配列の、酵母で発現するベクタ内への連結を含む、ステロイド２１ −ヒドロキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を有し、かつ酵母で発現するベ クタの生成方法。
36. ３６．ステロイド２１−ヒドロキシラーゼを発現可能で、かつ請求項３２に記載 の方法で得られるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換 細胞。
37. ３７．ステロイド２１−ヒドロキシラーゼを発現するようＳａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換可能で、かつ請求項３５に記載の方法で 得られる、酵母で発現するベクタ。