JPH07505041A

JPH07505041A - トリ・コクシジウムに対する継代細胞系およびワクチン

Info

Publication number: JPH07505041A
Application number: JP5501803A
Authority: JP
Inventors: クレア，ロバート・エイ; ラフバーロウ，パトリシア; ミラー，ティモシー・ジェイ
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド
Priority date: 1991-07-12
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 1995-06-08
Anticipated expiration: 2016-01-29
Also published as: EP0594743A1; ATE184912T1; WO1993001276A1; JP3129441B2; EP0594743B1; ES2137190T3; US5846527A; CA2112811C; EP0594743A4; DE69230037D1; DE69230037T2; CA2112811A1; DK0594743T3; GR3032204T3; US5674484A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２．５Ｂ−ＣＥＶ−１ゝ＼Ｐ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９７）およびそれ由来のクローンである請求項１記載の細胞系。

３．５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９５）およびそれ由来のクローンである請求項２記載の細胞系。

４．５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９６）およびそれ由来のクローンである請求項２記載の細胞系。

５、選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系。

６、選択されたトリ寄生虫に感染した５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐ　（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４９７）である請求項５記載の細胞系。

７、選択されタトリ寄生虫に感染り、た５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９５）である請求項５記載の細胞系。

８、選択サレタトリ寄生虫に感染した５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９６）である請求項５記載の細胞系。

９、寄生虫がアイメリア種由来のものである請求項５記載の細胞系。

１０、寄生虫がアイメリア・テネラである請求項９記載の細胞系。

１１、継代非リンパ性細胞中の外因性蛋白質の複製および発現を方向づけることかできる適当な調節配列の制御下で、該外因性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションしたトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系。

１２、　非！Ｊ　ンハ性細胞系が、５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９７）、５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９５）、５Ｂ−ＣＥＩＩ＼Ｇ７　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１０４９６）およびそれ由来のクローンからなる群より選択される請求項１１記載の細胞系。

１３、継代非リンパ性細胞中の外因性蛋白質の複製および発現を方向づけることかできる適当な調節配列の制御下で、該外因性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションしたトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される組換え抗原。

１４、選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養し、それから細胞培養物成分を収穫することを特徴とする抗コクシジウム症ワクチンの製造法。

１５、選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される病原体抗原組成物からなるコクシジウム症用のワクチン成分。

１６、細胞系からの全細胞抽出物またはそのサブフラクションからなる請求項１５記載のワクチン成分。

１７、細胞系からの修飾全細胞抽出物またはその修飾サブフラクションからなる請求項１５記載のワクチン成分。

１８゜家禽における感染に対する防御を誘起することができ、選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される病原体抗原組成物からなる少なくとも１種のコクシジウム症用のワクチン成分を含有するワクチンであって、該成分が適当な担体またはアジュバントと任意に組合わされているコクシジウム症用ワクチン。

１９、家禽における感染に対する防御を誘起することができ、選択されたトリ寄生虫に感染したトす・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される病原体抗原組成物からなる少なくとも１種のコクシジウム症用のワクチン成分を含有するワクチンであって、該成分が適当な担体またはアジュバントと任意に組合わされているコクシジウム症用ワクチンを有効量動物に投与することからなる、寄生虫が起こすコクシジウム症による感染に対する家禽の予防接種法。

２０、継代非リンパ性細胞中の外因性蛋白質の複製および発現能を有する適当な調節配列の制御下、トリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を、該外因性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションし、適当な培養条件下、トランスフェクションされた細胞系を培養して組換え抗原を産生ずることからなるトリ組換え抗原の製造法。

２１、トリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を選択された抗寄生虫剤に暴露し、細胞系に対する影響および寄生虫活性を試験することからなる寄生虫の選択された細胞内形体の成育を阻害または抑制する試薬のドラッグスクリーニング法。

２２、アイメリア寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することからなるアイメリア種のトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製方法。

２３、アイメリア寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養し、調節培地から寄生虫ＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質を回収することからなる細胞内アイメリア構造物から寄生虫ＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質を産生ずる方法。

２４、トリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する新規な継代非リンパ性細胞系中、選択された病原体を培養することからなる病原体の培養方法。

明　細　書トリ・コクシジウムに対する継代細胞系およびワクチン発明の分野本発明は、一般に、トリ・コクシジウムの繁殖に適用されるウィルス不含継代細胞系に関する。さらに詳しくは、本発明は、コクシジウム症に対する家禽の予防的治療に関するワクチン抗原の製造に関する細胞系の使用に関する。

発明の背景コクシジウム症は、家畜および野生動物の小腸の病気であり、急性の罹患状態を起こし、その結果成長および飼料消費が減少する。トリ・コクシジウム（アイメリア属（Ｇｅｎｕｓ　Ｅｉｏｅｒｉａ）　）は腸上皮の真性細胞内原生寄生虫である。これらの寄生虫は、−宿主性の生活環を有し、高い宿主および組織特異性を示す。家禽に関して、コクシジウムの感染は、発育阻害および皮膚の脱色による経済的損失につながる。全体として、コクシジウム症による損失および予防的薬物治療の結果、養鶏産業では毎年３億ドルを越す費用がかかる［ダンフォースおよびオーガスチン（ＤａｎｆｏｒｔｈおよびＡｕｇｕｓｔｉｎｅ）　、アニマル・ニュートリジョン・アンド・ヘルス（Ａｎｉｍａｌ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ）　、１８〜２１頁（１９８５年８月）参照コ　。

単一の宿主により一度に数十個のコクシジウム・オーシストが摂取されうる。

一旦摂取されると、寄生虫は特定の腸細胞に侵入し、そこで数回の無性複製を行い、続いて数百刃側の新しい寄生虫が真中に排出され生活環が完了するまで有性生殖が起こる。異なる種類の家禽は異なる種のコクシジウムにより起こる感染症にかかる。鶏（Ｇａｌｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）はアイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ）、アイメリア・ネカトリクス（Ｅ、ｎｅｃａｔｒｉｘ）　、アイメリア・プルネッティ（Ｅ。

ｂｒｕｎｅｔｔｉ）　、アイメリア・マクシマ（Ｅ、ｍａｘｉｍａ）　、アイメリア・アセルブリナ（Ｅ、　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）およびアイメリア・プラエコクス（Ｅ、　ｐｒａｅｃｏｘ）のコクシジウム属のいずれかに感染しうる。以下のコクシジウムは七面鳥（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ）の感染症に関連するものである・アイメリア・メロアグリミティス（Ｅ、　ｍｅｌｏａｇｒｉｍｉｔｉｓ）、アイメリア・ディスベルサ（Ｅ、ｄｉｓｐｅｒｓａ）　、アイメリア・フレアグリディス（Ｅ。

ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）　、アイメリア・ガロバボニス（Ｅ、　ｇａｌｌｏｓｐａｖｏｎｉｓ）　、アイメリア・アデノイデス（Ｅ、ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）　、アイメリア・イノキュア（Ｅ、　１ｎｎｏｃｕａ）およびアイメリア・スブロツンダ（Ｅ、　５ｕｂｒｏｔｕｎｄａ）。飼育されたアヒル（Ａｎａｓ）はチゼリア・ベルニジオサ（Ｔｙｚｚｅｒｉａ　ｐｅｒｎｉｃｉｏｓａ）による感染症にかかり、また野生のアヒル（Ａｎａｓ　ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｏｓ）から獲得されるアイメリア・アナティス（Ｅｉｍｅｒｉａａｎａｔｉｓ）による感染症にもかかると考えられる。ガチョウ（Ａｎｓｅｒ）はアイメリア・アンセリス（Ｅｉｍｅｒｉａ　ａｎｓｅｒｉｓ）　、アイメリア・ノセンス（Ｅ、　１０ｃｅｎｓ）およびアイメリア・パルブラ（Ｅ、　ｐａｒｖｕｌａ）による感染症にかかり、さらに、家禽であるガチョウはカナダガチョウからアイメリア・ヘルマニ（Ｅｉｍｅｒｉａ　ｈｅｒｍａｎｉ）、アイメリア・ストリアタ（Ｅ、　５ｔｒｉａｔａ）およびアイメリア・ファルバ（Ｅ、　ｆｕｌｖａ）により起こる感染症を獲得しうると考えられる。

コクシジウム症に対する免疫は種特異性が高く、細胞媒介プロセスの現われであると報告されている［エム・イー・ローズ（１，Ｅ、Ｒｏｓｅ）、「バイオロジイ・オブ・ザ・コクメリア’Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｃｃｉｄｉａ ”　Ｊ　、ビー・エル・ロング（Ｐ、　Ｌ。

Ｌｏｎｇ）編、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）　３２８〜３７２頁（１９８２）参照］。アイメリア・オーシストへの自然暴露により、完全保護免疫が誘起される。この応答は、第一に細胞外スポロゾイトまたはメロゾイトではなく、細胞寄生段階の発生の結果として現われる［エム・ジェンキンス（Ｍ、　Ｊｅｎｋｉｎｓ）ら、インフェクション・アンド・イムニティ−（Ｉｎｆｅｃ、　Ｉｍｍｕｎ、）　、５９　：　４０４２〜４０４８　（１９９１）参照コ。続いての攻撃感染に対しての防御を与えるオーシ制御の最近の方法としては、飼料に混合した抗コクシジウム剤を用いた一次的化学療法がある。効果的な化合物としては、スルホンアミド、キノリンおよびポリエーテルイオノフオア抗生物質が挙げられるし例えば、エル・アール・マクドガルド（Ｌ、　Ｒ，ＭｃＤｏｕｇａｌｄ）、「バイオロジイ・オブ・ザ・コクフレア ”Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｃｃｉｄｉａ”　Ｊ、３７３〜４２７頁（１９８２）参照コ。これらの化合物はその生活環の異なる段階において寄生虫の発生に影響を与える。しかし、時がたつと、薬剤耐性種の寄生虫が発生するので、薬剤の使用は厳しく制限される［ティー・ケイ・ジエファース（Ｔ、　Ｋ、　Ｊｅｆｆｅｒｓ）　、アビアン・デジーズ（＾ｖｉａｎＤｉｓ、）　、１８ニア４　（１９７４）；ティー・ケイ・ジェファース（Ｔ、　Ｋ、　Ｊｅｆｆｅｒｓ）、アビアン・デジーズ（Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓ、）　、１８：３３１　（１９７４）　；およびエイチ・ディー・チャツプマン（ＨｏＤ、　Ｃｈａｐｍａｎ）　、バタリナリー・バラシトロジー（Ｙｅｔ。

Ｐａｒａｓｉｔ、）　、１５　：　１１〜２７　（１９８４）参照］。

他のあまり確立されていない制御法としては、数種のアイメリア属のよく特質化された野生型または弱毒化株から得た生オーシストを実際に鶏に餌として与えて免疫を確立するものである。Ｃｏｃｃｉ−Ｖａｃ　［Ｓｔｅｒｗｉｎ　Ｌａｂｓ］は飼料または水に添加されるか、あるいは個々に投与された、数を制御した特定の種のニワトリアイメリアを用いる［例えば、ニス・エイ・エドガー（Ｓ、Ａ、Ｅｄｇａｒ）　、リサーチ・イン・コクシジオシス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）　、？クドガルド（ＭｃＤｏｕｇａｌｄ）ら編、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅｏｒｇｉａ）　６１７頁（１９８６）参照］。

生ワクチンを開発する別の方法としては、弱毒化寄生主極を投与する方法がある。初期オーシスト発生の選択または早発の結果、短縮された無性発生を有する種が得られ、病原性が減少する［シャー９−（Ｓｈｉｒｌｅｙ）ら、アビアン・パソロジイ（Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈ、）　、１５　：　６２９　（１９８６）　；シャージーら、リサーチ・イン・バタリナリー・サイエンス（ＲｅｓＪｅｔ、　Ｓｃｉ、）　、４４　：　２５　（１９８８）；およびヨーロッパ特許第０２５６８７８−Ａ２号参照］。ニワトリの胚におけるアイメリア種の連続した継代の結果からも病原性の減少した種が得られる［ロング（Ｌｏｎｇ）　、ジャーナル・オブ・コンパラティブ・パソコン−（Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｐａｔｈ、　）、８２　：　４２９　（１９７２）およびロング、ジャーナル・オブ・コンバラティブ・バンロジー、８２　：　４３９　（１９７２）参照］。

両方の弱毒化法は、「トリクル・ドース」投与法と組み合わせて用いられ、有効な免疫が達成される［ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、［リサーチ・イン・コクシジオシス“Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ”　Ｊ　、　ｖクドガルド（ＭｃＤｏｕｇａｌｄ）ら編、ｔｌｎｊｖｅｒｔｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅｏｒｇｉａ）　、６３４〜６４１頁（１９８６）参照］。この方法は予防接種に関して有用であることが判明しているが、これは、養鶏産業において生寄生虫の導入および維持を必要とし、そのため病原性が復帰する危険性が内在する。

活性な感染により防御免疫応答が生じるが、死菌寄生段階または構造的抗原を用いた効果的な免疫化は明らかではない。初期の研究では死んだ寄生虫からの抗原抽出物は免疫原性でないことが示されている［ロング（Ｌｏｎｇ）ら、エクスベリメンタル・バラサイトロジー（Ｅｘｐ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、）　、１６　：　１　（１９６５）　：ローズ（Ｒｏｓｅ）ら、「ヴアクンンズ・アゲインスト・バラサイツ’Ｖａｃｃｉｎｅｓ　ＡｇａｉｎｓｔＰａｒａｓｉｔｅｓ”　Ｊ　、ティラーおよびミュラー（ＴａｙｌｏｒおよびＭｕｌｌｅｒ）編、　ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏｒｄ）　、５７〜７４頁（１９８０）］。

対照的に、ヨーロッパ特許出願第０１６７４４３号は、胞子形成したアイメリア・テネラオーシストから得られる抽出物を記載し、これは筋肉内注射された場合、相同性寄生虫投与に対してニワトリを防御することを記載している。アイメリア・アセルブリナオーンストから得られる同様の抽出物は、米国特許第４７２４１４５号に記載されており、これはアイメリア・マクシマ（Ｅ、　ｚＢｘｉｍａ）およびアイメリア・テネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ）と共に該寄生虫を用いた抗原投与に対して防御応答を示す。皮下投与用の水性懸濁液中のアイメリア・タネラスボロゾイトの脱嚢抽出物は、米国特許第４８０８４０４号に記載されている。

ヨーロッパ特許出願第０１３５７１２号は、有効な免疫原としての可溶化されたアイメリア・テネラスポロゾイト抗原を記載し、ヨーロッパ特許出願第０１３５０７３号は、免疫原としての可溶化されたアイメリア・テネラメロゾイトから得た抗原の使用について言及している。ヨーロッパ特許出願第０２９１１７３号は、酢化前の鳥の卵に注射して免疫を誘起するための胞子形成したアイメリア・テネラ抽出物を記載している。米国特許出願第４８６３７３１号は、飼料添加物としての最低１種のコクシジウムからの生存胞子形成オーシストの水性濃縮物の使用を記載している。

さらに、アイメリア・マクシマの配偶子母細胞からの抗原抽出物は潜在的免疫原性に関して試験されているし例えば、ヨーロッパ特許第０２５６５１４号および第０２５６５３６号参照）コ。前記調製物は程度の異なる免疫を示すが、この調製は高度に労力を要し、大規模な製造は困難である。

最近のより実際的なワクチン開発法としては、遺伝子操作した抗原の産生および特質化がある［ビンガ−（Ｂｉｎｇｅｔ）ら、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、ＩＯＡ：１４４　（１９８６）；ブラザーズ（Ｂｒｏｔｈｅｒｓ）ら、モレキュラー・アンド・バイオケミカル・バラサイトロジー（Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、）　、２８　：　２３５　（１９８８）　；ダンフォース（Ｄａｎｆｏｒｔｈ）ら、アビアン・デジーズ（Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓ、　）、３０　：　３７　（１９８５）；ジェンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）ら、エクスペリメンタル・バラサイトロジー（Ｅｘｐ。

Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、）　、６６．：　９６　（１９８８）　；ヨーロッパ特許出願第０１６４１７６号；ヨーロッパ特許出願第０３３７５８９号およびオーストラリア特許出願第６５８６７／８６号参照コ。これらの方法ではスポロゾイトまたはメロゾイトからのｍＲＮＡの単離、ｃＤＮＡライブラリーの産生、適当な抗体を用いたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよびそれに続く発現ベクター中へのクローニングを要する。得られたクローン化抗原を微生物発酵槽中に大量に産生できる。

現在までのところ免疫原性の研究はほとんど報告されていないが、これらの抗原により部分的防御が得られることが示されている［ダンフォースおよびオーガスチン（ＤａｎｆｏｒｔｈおよびＡｕｇｕｓｔｉｎ）　、前掲；ンエンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）ら、前掲］。

全体として、これらのクローンされた構造蛋白質はせいぜい不完全な防御しか誘起せず、これらの免疫能力は一部宿主の遺伝子に依存する［フレア（Ｃ１ａｒｅ）、インフエクト・イムツール（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．）　、５７　：　７０１　（１９８９）　］。

最終的に、アイメリア・スポロゾイトに対して生じた単クローン抗体を用いた受動免疫［米国特許第４７１０３７７号〕およびアイメリア・テネラスポロゾイト由来の抗イディオタイプ単クローン抗体を用いた活性免疫［ヨーロッパ特許第０２４１１３９号］が研究中である。

寄生虫を維持する適当なｉｎ　ｖｉｔｒｏの細胞培養系がないために、宿主／（プロトシアン）寄生虫相互作用に関する理解は遅れていた。哺乳類およびトリ・コクシジウムは、種々の初代培養でよく成育し、細胞系を確立するトキソプラズマ・ボンブイ（Ｔｏｘｏｐｌ、ａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ）を除いては、両方ともｉｎ　ｖｉｔｒｏでの成育が非常に困難である［ディー・ジエイ・トラン（Ｄ、　Ｊ、　Ｄｏｒａｎ）、「ザ・バイオロジイ・オブ・ザ・コクシジウム“釦ｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏｃｃｉｄｉａ”　）、２５３〜２５７頁（１９８２）］。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのアイメリアの繁殖は今日まで制限されてきた。完全なプレパテントのコクシジウムのスポロゾイトからオーシストへの発展は、アイメリア・テネラに関して一次鳥類腎臓細胞においてのみ得られる［トラン（Ｄｏｒａｎ）ら、ジャーナル・オブ・プロトゾオロジ−（Ｊ、Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、）　、２０　：　６５８　（１９７３）］。しかし、−次ニワトリ腎臓上皮細胞系は生産法に適用できず、研究分析系としての使用には限界がある。

確立された細胞系であるメイデイン・ダービー・ウシ腎臓（ＭＤ　Ｂ　Ｋ）だけがアイメリアのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの成育に有利であると報告されているが、コクシジウムは無性発生の一世代でのみ発育する［ディー・エム・シュマツツ（Ｄ、　Ｍ、　Ｓｃｂｍａｔｚ）、アドブ・セル・カルチャー　（Ａｄｖ、Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅ）　、５　：　２４１　（１９８７）　］。

オーシストは初代宿主由来のメロゾイトを接種物として用いた場合、トリアイメリア・アセルブリナ［エム・ナクジーボンテンブス（Ｍ、Ｎａｃｒｉ−Ｂｏｎｔｅｍｐｓ）　、アン・レフ・ベト（＾ｎｎ、Ｒｅｃｈ、Ｖｅｔ、）　、７　：　２２３　（１９７６）　］およびアイメリア・フレアグリミティス［オーガスティン（＾ｕｇｕｓｔｉｎ）ら、ジャーナル・オブ・プロトゾオロジイ（Ｊ、Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、）　、２５　：　８２　（１９７８）　］ならびにウシ・アイメリア・ボビス［スピール（Ｓｐｅｅｒ）ら、ザオツシュリフト・エフ・ノくラシテンクンデ（Ｚ、Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ）　（１９７３）　］から得られる。

今日まで、無性発生の第一世代以上のアイメリアの成長に有利な確立された細胞系は報告されていない。種々の鳥類の病原性感染症の予防および治療の分野においてはアイメリア種の成分をｉｎ　ｖｉｔｒｏで繁殖させ、コクシジウムを含むこれらの病原菌に対する安全で有効なワクチンを供給する必要がある。

発明の要旨第一の態様として、本発明はトリ・コクシジウム増殖能を有する新規な継代細胞系５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐを提供する。また、この細胞系由来のクローンも記載する。

前記親細胞系から増殖した３種の別の細胞系も本発明のこの態様の一部である。

これらノ細胞系を、５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７．５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７および５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ａ２と称する。これらの細胞系由来のクローンまたはサブクローンも本発明に含まれる。

別の態様として、本発明は鳥類寄生虫、とくにコクシジウム寄生虫に持続的に感染した前記細胞系を提供する。

本発明のさらに別の態様は、感染した細胞系の１個を培養し、ワクチン組成物に用いるために細胞培養成分を回収することによりコクシジウム抗原を無性または有性発生の種々の段階において産生ずるワクチンの新規開発法を包含する。

本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載の細胞系の使用において産生される種々のトリ・コクシジウム病原菌から選択された病原性抗原組成物からなる多成分ワクチンである。

本発明のさらに別の態様は、適当な担体およびアジュバントと共に１以上の前記ワクチン組成物を含有する家禽における感染症に対して宿主防御誘起能を有するコクシジウム症に関するワクチンである。

本発明のさらに別の態様は、動物に有効量の前記ワクチン組成物を投与することからなるコクシジウム症を起こす寄生虫による感染症に対する家禽の新規予防接種法である。

適当な発現調節配列の制御下に外因性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子で細胞系をトランスフェクションし、安定にトランスフェクションされた細胞系を適当な培養条件下で培養して組換え抗原を産生ずることによる組換え抗原産生法も本発明に含まれる。

本発明の別の態様は、本発明の感染細胞系を選択された抗感染薬に接触させ、病原体に関する効果を試験することからなる、選択された細胞内寄生虫の成長を阻害または抑制する試薬のドラッグスクリーニング法を提供する。

本発明の他の態様および利点を以下の発明の詳細な記載および好ましい具体例においてさらに記載する。

発明の詳細な記載本発明は鳥類病原体および寄生虫による感染症に対する鳥類の予防接種、特に家禽におけるコクシジウムの治療および制御のための方法および組成物を提供する。本明細書において定義する「家禽」なる語は、Ｇａ１ｌｉｆｏｒｅｓ目の鳥類、例えば普通のニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、七面鳥（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ）、キジ（Ｐｈａｓｉａｎｕｓ）、イワシャコ（Ｐｅｄｒｉｘ）　、ライチョウ（Ｌａｇｏｐｕｓ）　、ホロホロチョウ（Ｎｕｍｉｄａ）およびクジャク（Ｐａｖｏ）　、ならびにＡｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ目の鳥類、例えばアヒル（Ａｎａｓ）およびガチョウ（Ａｎｓｅｒ）を包含する。

本発明は、以下の実施例１に詳細に記載する新規な継代細胞系５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐを提供する。この細胞系は細胞あたり４２個の染色糸を有し、逆転写酵素陰性である。該細胞系は小胞体と結合した非感染ウィルス粒子（Ａ型）の含有率が少ないことを特徴とする。該細胞系は、外因性哺乳類病原体に関しても陰性で、家禽発血症ウィルスの指標を示さない。さらに、該細胞系はマイコプラズマ、ノくクチリアまたはカビで汚染されていない。したがって、該細胞系は哺乳類および鳥類ウィルスを含まない。

この細胞系はまた鳥類の性質と関連した機能的特徴を有する。例えば、この細胞系は４１℃にて複製するが、これは鳥類の細胞に特徴的であり、またｉｎ　ｖｉｔｒ。

での維持のために独自の栄養要求を有する。さらに、本発明の新規細胞系はトリコクシジウム、アイメリアのプレパテント生活環（即ち、体内におｌ、％て寄生虫（こ感染してから検出されるまで期間）を高レベルで複製することができる唯一の存在する継代細胞系である。

本発明の５Ｂ−ＣＥＶ−１細胞系は、ワクチン抗原、特にトリコクシジウムの産生に関して選択されている。該細胞系はまた、外来遺伝子由来の遺伝子操作されたベクター発現組換えＤＮＡの増殖において用いる基質を提供する。

数個の細胞集団をこの親細胞系からクローンする。これらのクローンは、トリ寄生虫の繁殖および維持に関して独特な特徴を有する。さらに、これらのクローンされた細胞集団５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７．５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７および５Ｂ− ＣＥＶ−１’＼Ａ２は多核巨細胞の確率が高い。親細胞系からの別個のクローンの出現も多細胞起源を示すものであり、例えばニワトリ内臓において起こりうる異常な成長は親細胞系の起源として用いられる。しかし、これらのクローンされた「子孫」細胞系もトリコクシジウム、アイメリアのプレパテント生活環環を高いレベルで複製できる継代細胞系である。これらの細胞系は新種と同じ特徴を有すると考えられ、コクシジウムを増殖させる能力を有することも判明している。

本発明は、したがって、５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐまたは親細胞系の特定のクローンからサブクローンされるかまたはそうでなければこれら由来の他の細胞系も包含する。このような他の子孫クローンは親細胞系の重要な特徴を共有すると考えられる。このように、サブクローンは本明細書において５Ｂ−ＣＥＶ−１＼１または５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐが特に記載のある場合は親細胞系と置き換えることができる。また以下の記載において、細胞系は単数形であっても、「細胞系」またはｒＳＢ−ＣＥＶ−１細胞系Ｊ　Ｉｔ　Ｓ　Ｂ−ＣＥ　Ｖ−１＼ｐ、　そのサブクローン５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７．５Ｂ−ＣＥ　Ｖ−１＼Ｇ７または５Ｂ−ＣＥＶ −１＼Ａ２、あるいはこれらの細胞系のいずれかの他のサブクローンを包含する。

本発明の親細胞系およびそのサブクローンは、トリアイメリア種のｉｎ　ｖｉｔｒｏ発生を有利にするために用いられる。以下の開示は具体的にアイメリア・テネラ感染症に関する方法およびワクチン組成物を記載するが、ウィルスを含む他の鳥類寄生虫病原体ならびに他の動物種プロトシアンも本発明の細胞系を用いて類似の方法で産生ずることができると考えられる。したがって、該細―系はワクチン成分の研究、特質化および産生に用いられる種々の病原抗原および他の蛋白質の発原糸を提供することができる。加えて、トリアイメリアのプレパテント生活環を複製する唯一の存在する継代細胞系として、該細胞は寄生虫許容細胞系の酵素および遺伝子特性を研究するための独自の基質を提供する。

本発明の細胞系はまた、組換え鳥類ワクチン成分、例えばレオウィルス、コロナウィルス、ヘルペスウィルス、バラ−およびオルトミクソウィルス由来のサブユニット抗原の産生手段も提供する。細胞系を組換えＤＮＡ分子または選択された病原蛋白質またはペプチドをコードする発現ベクターにより通常の調節制御配列の制御下にトランスフェクションし、培養する。ついで、組換え蛋白質を培養した５Ｂ−ＣＥＶ−１細胞系またはその子孫により発現する。

該新規細胞系は、他のフイメリア種の複製のための基質も提供する。本発明のこの継代細胞系は細胞内寄生段階の独立した段階特異的成分の単離および特質化にも用いることができる。特に、この細胞系により細胞内構造から容易に入手回能な寄生虫ＤＮＡ、ＲＮ八および蛋白質の唯一の源が得られる。さらに、この細胞系は他のの望ましい選択された病原体の成長に用いられる。

本発明の５Ｂ−ＣＥＶ−：１細胞により、ニワトリ種のアイメリア・テネラおよびアイメリア・ネカトリクス、ならびに七面鳥コクシジウム、アイメリア・アデノイドおよびアイメリア、フレアグリミリスが成育できる。該細胞系により、他の種、例えばアイメリア・アセルブリナおよびアイメリア、マクシマなども成育できる。

現在細胞系の成長に好ましい培養条件としては、細胞系をＭｅｄｉｕｃ＋１９９　［アービン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　］および５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（またはＯｐｔｉｍｅｍおよび１％ＦＢＳのような均等物）中、５％ＣＯ２および４０．５℃の培養条件下で培養する。

細胞は３７℃ではずっとゆっくり成長し、融合することはほとんどなく、少なくとも１０％血清を要する。特定の栄養素、酸素圧および還元血清に関する培地組成を包含する他の培養条件をこれらの細胞の成長に用いることができ、当業者であれば選択し、最適化できる。

本発明ノ新規細胞系、５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐは、１９９０年７月３Ｓ付１ブ’Ｔ、ＡＴＣＣＣＲＬｌ、０４９７てアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　、］、２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋ−ｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託した。この細胞系の発生は、以下の実施例１に詳細に記載する。子孫細胞系５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７は、］９９９０７７３３日けで、Ａ、ＴＣＣＣＲＬ１０４９５で寄託した。子孫細胞系５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７は同様に１９９０年７月３日付（プＡＴＣＣＣＲＬ１０４９６で寄託した。これらの寄託物は、アメリカ合衆国特許庁の微生物寄託の要件に従い、外国出願の際にはブダペスト条約の要件に従うものである。

本発明はさらに、本発明の細胞系を用いることにより調製される種々のワクチン成分および組成物を提供する。本発明のとくに望ましい具体例は、アイメリア寄生虫由来のワクチン組成物である。このワクチン組成物は選択された病原体に感染した前記細胞系からの全細胞抽出物（生または不活化）またはそのサブフラクションを含有する。これらのワクチン組成物はまた感染細胞系の培養条件を修飾することにより産生される修飾細胞または寄生抗原も含有してもよい。

−具体例において、トリコクシジウム症に対するワクチンにおけるワクチン組成物の使用は、本発明の細胞系を選択された寄生虫、好ましくはアイメリア寄生虫、例えばアイメリア・テネラで感染させることにより得られる。細胞の感染は、通常に成長させた、単クローンまたは多クローン抗体を寄生虫の種々の生活環段階に用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用いることによりモニターする。感染も放射性標識したウラシルの吸収検定により測定する。ＥＬＩＳＡおよび吸収検定は共に以下の実施例２に詳細に記載する。

感染の約７２時間後、細胞および培地または細胞外分泌物を、細胞および／または培養液を収集することにより収穫する。任意の段階で、必要ならば培養液を連続凍結／′解凍サイクルによる、または濾過、変性または架橋剤、例えばベータープロピオラクトン、ホルムアルデニドまたはグルタルアルデヒドなどを添加することによるような通常の技法を用いて不活化してもよい。

この感染した細胞培養調製物のいろいろな部分をワクチン組成物において用いる：１）サブフラクション化をしない全調製物。

２）培地および培養条件を変更することにより影響を受ける修飾調製物（例えば臨界増殖期間中血清の除去、ｐＨまたはイオン変換）。

３）サブフラクション化して産生じた可溶化成分結合の細胞；および４〕サブフラクソヨン化し、修飾したワクチン成分。

本発明の一例のワクチン組成物または成分を、前記培地の感染細胞を破砕することにより破壊する。得られた破壊された細胞組成物をさらに脱水または水素添加することなしにワクチン調製物に用いる。

本発明の他のワクチン成分として、本発明の寄生虫感染細胞を培養するのに用いる培地中で、血清濃度または成分および他の栄養添加物を変えることにより前記ワクチン成分を修飾する。例えば、最少必須培地ＭＥＭ中での感染細胞の培養により初期段階の寄生虫を捕獲できる。また、化学的に限定した培地を置き換えることにより、該細胞系はワクチンにおいて用いられるべき遅い段階の寄生虫の発生を可能とする。寄生虫の発生に影響を及ぼし、本発明の細胞系中に産生される抗原蛋白質を修飾する培地の補足的栄養の変化とは、培地に１以上の、ビオチン、塩素、塩化物、インシュリンまたは非必須アミノ酸を加えるかまたは除くことである。

修飾ワクチン成分は伝統的な突然変異誘発技法、例えばアルキル化剤、キレート剤、三量化剤の添加あるいは感染細胞系の培養中葉外線光による細胞系の外部処理を適用することにより感染細胞中に産生ずることもできる。これらの試薬は細胞を遺伝子的に修飾し、該細胞の能力を変えて、異常な寄生虫を得ることができる。あるいは、細胞中の寄生虫の発生の段階に応じて、寄生虫自身を直接突然変異させて好ましいワクチン成分を産生ずることもできる。

鳥類、とくに家禽のコクノンラムに対する予防的治療に用いるためのワクチン組成物のさらに別の例は、細胞培養物から破壊された細胞および培地により形成されるサブフラクションを用いて前記方法により調製される。これらのフラクションは、細胞フラクションから、例えば遠心分離、大きさ、分子量、電荷、または種々の通常の生化学的手段により培地からまず分離することにより得られる。ついで、これらのフラクションを鳥類に与えるワクチン組成物として用いる。例えば、前記細胞培養物の一フラクションは破壊細胞を含有する培地を遠心分離することにより得られる。培地を除去し、残存する物質をペレット化して細胞成分を得る。このベレットを新しい組織培養培地中に再懸濁する。さらに、上清フラクションもワクチン成分として用いる。

１以上の前記ワクチン成分を通常のアジュバントと混合するかまたはこれに吸着させるかまたはアジュバントなしに投与することができる。アジュバントは白血球を引きつけるかまたは免疫応答を向上するための非特異性刺激物として用いる。そのようなアジュバントとじては、油および水、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、死菌ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）およびＱｕｉｌ　Ａなどのサポニンが挙げられる。現在、好ましいアジュバントはＡｍｐｈｉｇｅｎである［ハイドロニクス社（Ｈｙｄｒｏｎｉ、ｃｓ　Ｉｕｃ、　）米国特許第５，０８４．．２６９号］。

好ましワクチン用量は、約０，０５マイクログラムから１００マイクログラムの寄生虫蛋白質である。他の適当な治療上有効な用量は、前記免疫原性量、治療する症状および動物の生理学的特性に基づいて当業者には容易に決定できる。したがって、医薬調製物は、活性ワクチン成分またはその組み合わせの免疫原性量の滅菌調製物が領１〜２ｍｌの単位投与量である。別の活性剤の存在下で、これらの単位投与量は当業者により容易に調節できる。

望ましい用量は、望ましいワクチン組成物を１から２用量投与し、この場合、各フラクションの抗原含有量は前記のようであるのが望ましい。本発明のワクチンの投与方法は、ワクチンを宿主にプリバーするいかなる適当な経路であってもよい。しかし、ワクチンは皮下投与するのが好ましい。しかし、ワクチンは懸濁液の形態で飼料または水に添加して摂取させてもよい。皮肉、静脈内または筋肉内などの他の投与方法もそれが望ましい場合は用いてもよい。

しかし、特定の動物に関する具体的な投与レベル、方法およびタイミングは、動物の年令、総合的健康状態、および食事、動物の種：他の投与される医薬との相乗作用；および目的とする防御の程度を含む種々の因子に依存する。もちろん、投与は必要があれば、またはそれが望ましい場合には、適当な間隔をおいて繰り返すこともできる。

これらのワクチンの予備試験において、鳥類の能力が向上する。予備結果から、調節培地を単にデカントするかまたは５Ｂ−ＣＥＶ−１細胞を破壊し、細胞流体を遠心分離に付すことにより収穫することで形成される前記ワクチンは抗原投与の期間牛馬の能力を向上させることがわかる。さらに、前記のサブフラクションワクチンもｉｎ　ｖｉｖｏ検定において有効であることが示された。ｉｎ　ｖｉｖｏ試験は以下のようにして行う。２週令のヒヨコを１ｍｌの収穫した培地で皮下注射により免疫化する。２週間後、このヒヨコに１０，０００個のアイメリア・テネラのオーシストで攻撃する。その後の６日間に、ヒヨコを体重増加および飼料効率などの点に関してモニターする。腸の病変をその後スクリーニングし、対象をこれに基づいて評点する。この試験は以下の実施例４により詳細に記載する。

本発明の細胞系をワクチンの開発に用いることに加えて、これらの細胞系は新規抗コクンジウム薬の開発において駆虫薬のスクリーニングにおいて用いることもできる。例えば、感染細胞の培養物は通常どおり、例えば放射性分子で標識する。試験用の選択された薬物を次に細胞培養物中に混ぜる。細胞培養物を次に感染後別々の間隔をおいて収穫し、放射性前駆体の標識吸収を収穫し、シンチレーションカウンター用に処理することにより測定する。試験薬としてアルファーアマニチンを用いるドラッグスクリーニングの例は以下の実施例５に詳細に記載する。薬が特定の投与量または時間で有効である場合、（寄生物質の）吸収計数は停止する。標識吸収の抑制が観察されなければ、該薬はｉｎ　ｖｉｔｒｏでの寄生感染の制御に有効でない。

本発明の細胞系を用いて当業者に周知の他の通常のドラッグスクリーニング法を用いてもよい。

以下の実施例は本発明の新規継代細胞系の産生の例を記載するものである。これらの実施例は例示のためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１−親細胞系５Ｂ−ＣＥＶ−１＼、Ｐ、およびりｏ−ン５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７および５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７のｊｌＭＳＢ−ＣＥＶ−１細胞を２０日令の５ＰＡＦＡＳ　［Ｃ０ＦＡＬ−２４］の鶏の胚の内臓結合組織と結合した異常組織塊（約１ｃｍＸ２ｃｍ）から単離する。該組織を無菌的に除去し、コ１％Ｆ　ｕｎｇｉ−Ｂ　ａｃｔ溶液［アービン・サイエンティフィック（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　Ｉｒｖｉｎｅ、　ＣＡ）コ含有のハンクス塩基性塩溶液（ＨＢＳＳ）中ですすぐ。組織をハサミで細断し、次に０２５％ＨＢＳＳ中トリプシン（］、：２５０）を用いて酵素で分解する。分解した細胞懸濁液を１５ｍ１ウシ胎仔血清を含有する５０ｍ１遠心管中に回収してトリプシンを不活化し、７００ｇで１０分間遠心分離する。

細胞を８ｍｇ／ｌのウシインシュリン［コラボラテイブ・リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、）　Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）　コ　、　１２　ｌｌ１１／１の２００ｍＭＬ−グルタミンおよび１％Ｆ　ｕｎｇｉ−Ｂ　ａｃｔ溶液［アービン（Ｉｒｖｉｎｅ）　］を追加した５ｍｌのＷ６ｙｍｏｕｔｈのＭＡＢ８７／３培地［アービン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）コ中に再懸濁する。これを５ｍｌピペットで２５ｃｍ２のコーニング組織培養フラスコ中に移し、５％Ｃ○２中、４０．５℃で培養する。２４時間培養した後、培地を変える。この初代培養物は多くの上皮様細胞中心およびそれからのびる線維芽細胞を有する移植片含有する。

７２時間後、はとんど全面成長した培養物をＣａ”７Ｍｇ−不含燐酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で一度洗浄し、つぎにＨＢＳＳ中の０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理して細胞を分解する。得られた細胞懸濁液をデカントし、細胞を遠心分離により収集し、既に使用したＭＡＢ８７／３培地中に再懸濁する。

この培養物を次に１．１０に分け、細胞を７個の２５ｃｍ２培養フラスコおよび２個の６０ｍｍ２のベトリ皿中に移植することにより第１継代（Ｐｌ）を得る。

培養物を前記のようにして培養する。

盛んに成長している培養物に関して７２時間目にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を除去して培地を変える。１個のフラスコ中の培地を１０％ＦＢＳ追加のＭｅｄｉｕｍ１９９［アービン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　］に変える。

さらに４８時間培養した後、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９を含有する培地では細胞がさかんに成長し、ＭＡＢ８７／３培養物は静止状態であった。血清をこれらの培養物に最高１０％まで戻しても細胞の成長はＭｅｄｉｕｍ　１９９を用いた場合に観察されたレベルまで促進されなかった。従って、これ以降はＭｅｄｉｕｍ１９９　＋　１０％ＦＢＳを用いてすべての継代培養を行った。

フラスコが全面成長しこ場合、さらに継代培養を行った（第２継代〜第１１継代）。継代数が増加すると、細胞は段々ゆっくり成長し、線維芽状になり、非常に空胞化し、培地中に壊死組織片が放出される。付加追加的培地配合物（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ　、ＲＰＭＩ　１６４０＋１０％Ｆ　Ｂ　Ｓ　；　ＤＭＥＭ／　Ｈａｍ’　ｓ　Ｆ−１２＋５％ＦＢＳ）をこれらの細胞に関して試験し、この進行中の成長過程をを先制するかまたは妨害する。しかし、細胞はＭｅｄｉｕｍ　１９９で最低の劣化を示す。数個の継代（Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐｌ、Ｐ９、Ｐｌｏ）からの細胞を液体窒素中で凍結する。これらの細胞はｐＨ〜Ｐ１３で発症し、死亡する。

単離された細胞の病変をほとんど含まないｐＨ細胞の７５ｃｍ”フラスコの一つにＭｅｄｉｕｍ　１９９および１０％ＦＢＳを最後の継代培養の後５８日間繰り返し添加する。この点で、線維芽細胞様細胞はこれらの中心から外側へ向かって成長し始める。さらに１５日後、このＴ−７５フラスコ中の細胞は全面成長し、これを１：２に分けてＰｌ２を作る。

Ｍｅｄｉｕｍ１９９　［ギブコ・ラボラトリーズ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、　Ｇｒａｎｄ　’ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）コ、３．４３ｍｌ／　］の］２ＱＱｍＭＬ−グルタミおよび１％アンチバイオティック−アンチマイコティック［ギブコ・ラボラトリーズ］中、７日ごとに１：２０に分割する継代規準を用いて現在まで継代培養を続ける。細胞は上皮特性をすっかり失い、形態学的に明らかに線維芽細胞様である。発症はＷｅｙｍ。

ｕｔｈ　Ｍ、Ａ　Ｂ　８７　／　３および５％Ｆ　Ｂ　５ＸＤｕｌｂｅｃｃｏ　ＭＥＭ　［ギブコ・ラボラトリーズコおよび５％ＦＢＳおよびＥａｒｌｅ塩［ギブコ・ラボラトリーズ］および５％ＦＢＳを含むので、他の培地配合物も用いることができる。ＦＢＳ条件は第２４継代の５Ｂ−ＣＥＶ−１細胞に関しては５％に減少させ、これを９６ウエルマイクロカルチヤープレートを用いた単細胞単離を用いた希釈により継代培養する。この技法により、未調節の５％ＦＢＳを含むＭｅｄｉｕｍ　１９９中、親細胞系５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐから２５個のクローンを産生じた。これらのクローンのうち、Ｓ　Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７および５Ｂ− ＣＥＶ−１＼、Ｃ７で表わされる２個のクローンはアイメリア・テネラの無性発生に有利な例外的な能力を示す。

これらの２個のクローンは親細胞系５Ｂ−ＣＥＶ−１＼Ｐとともに前記のようにＡＴＣＣに寄託されている。第１０継代は両クローンに関して寄託され、第２０継代は親糸に関して寄託されている。数個の凍結細胞の復元に成功しているので、凍結は細胞性能に有害な影響を与えない。標準的生物学的品質管理は親糸のＰ３３からで十分である。さらに、親糸は約４２個の染色糸の核型を示し、逆転写酵素陰性であり、トリ・レトロウィルス（例えば、索類白血症）を発現せず、他の細胞外病原体（哺乳類または鳥類）を発現せず、ｎｕ／ｎｕマウスにおいて腫瘍形成性であり、細菌、かびまたはマイコプラズマ汚染が見られない。小胞体との結合が低発現率であるＡ型つィルス粒子は透過電子顕微鏡により分解される。

親糸ならびに両クローンはラクトース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ヌクレオシドホスホリラーゼ、ペプチダーゼ＾およびホスホグルコムターゼなどの酵素に関してＢＨＫ−２１細胞［ナショナル・ベテリナジー・サービシズ・ラボラトリ−（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）コと類似し、かつ５Ｌ２９細胞（形質転換したニワトリ線維芽細胞系）［ＡＴＣＣＣＲＬ１５９０］と似ていないアイソザイムフォーカシングプロフィルを示す。対照的に、両クローンおよび親５Ｂ−ＣＥＶ−１細胞系はＢＨＫ −２１およびＡＣＣ−１１１細胞と形態学的に異なる。さらに、５Ｂ−ＣＥＶ− １細胞は多核巨細胞であることが多い。最も重要なことは、５Ｂ−ＣＥＶ−１細胞はアイメリアプレパテント生活環の異なる段階から高レベルの寄生物質を産生ずることである。

実施例２−細胞系における寄生虫発生をモニターするための試験Ａ　コクソジウム蛋白質検出のための直接スポロゾイトベースの酵素結合抗体免疫吸着検定（ＳＰＺＥＬＩ　ＳＡ）では、抗原（例えば感染したあるいは感染していないＦ７細胞または破壊したスポロゾイト（Ｓ　Ｐ　Ｚ’）またはメロゾイトからの上清）を２回の連続希釈において９６ウエルトレーのウェルに付着させる。ＳＰＺ抗原を認識する抗体は、加重に応じた応答で抗原に結合する。−次抗体が結合しこ後、ヤキにおいて産生したビオチニル化したウサギＩｇＧに対する第二抗体を添加する。再び、この抗つサキ抗体はウェル中で抗原に既に結合したウサギのＮｏ、１５．１６抗ＳＰＺ抗体に結合する。抗ＳＰ２抗体は以下のようにして産生される。アイメリア・テ不うに関する精製スポロゾイト（以下に記載）を２〜５Ｘ１０’個（スポロシイｈ）　／ｍｌの濃度で血清不含の培地中に懸濁する。等容積のフロイント完全アジュバントを添加混合し、Ｑ、５ｍｌを６ｋｇのニューシーラントシロウサギ（オスメス混合）の背中に２〜４箇所皮下注射で接種する。フロインド不完全アジュバントを用いて２〜４週間間隔で同様にして追加抗原接種する（最低３回接種）。３回目の接種の２週間後に血液を血清バキュテーナ−［ベクトン・ディケンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）　］中に集める。血清を室温にて１時間で凝結させ、つぎに２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して凝塊をベレット化する。血清を除去し、試験管に１．５ｍｌずつ分け、−２０℃で保存する。二次抗体が結合した後、酵素標識した、ビオチンに結合したストレブタビジンを添加する。

基質を培養すると、ウェルに結合したストレブタビジンに結合した酵素が該基質を肉眼で見られる形態に変える。測定された色の量は試験上清中のＳＰＺ蛋白質に対して交差反応性の抗原の量に比例する。負の対照としての感染していない上清からの抗原ならびに超音波で破壊されたＳＰＺを含有する試料がプレート上に含まれる。このスポロゾイト物質は正の対照の役割をし、標準曲線を作成するのに用いられ、この曲線に対して感染していない上清中の寄生抗原を測定する。このようにして、未感染細胞上清中の寄生虫特異性物質を定量的に評価し、比較することができる。

約５０羽の３〜４週令の鳥を各々１０００００個のアイメリア・テネラオーツストで経口的に感染させる。約７．５日目に盲腸をとりだし、内容物をペプシンで消化させる。オーツストを次に２．５％重クロム酸カリウム中で３〜４日間胞子形成させ、塩素漂白により滅菌する。滅菌オーシストをＭｅｄｉｕｍ　１９９　＋２　Ｘ抗生物質中で４℃にて保存する。一般に、５０羽の鳥から、約５Ｘ１０ ’個のオーシストが得られる。この方法を３〜４週間毎に繰り返して、ビルレンスを維持する。

試験用細胞培養物抗原を以下の修飾脱嚢操作に従って産生ずる。１０ｍ１オーシスト（約３　Ｘ　１０　’／ｍｌ）を５ｍｌの０．５マイクロメーターのガラスピーズを用いて小チャンバーのビーズビータ−中で破砕し、ＰＢＳ中、０．７５Ｍシュークロースを用いて破片を分離し、続いて５０％等張パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）を用いて遠心分離することによりスポロシストを精製する。４％（Ｗ／Ｖ）タウラデオキシコール酸、０２５％（ｗ／ｖ）　トリプシン、ＨＢ　Ｓ　Ｓからなる溶液を用い、炭酸水素塩を用いてｐＨを８０に調節し、この混合物を４０．５°Ｃにて精製スポロシストと共に６０〜９０分間約１５分間隔で撹拌しながら培養することによりＳＰＺ脱嚢を行う。ついで、ＳＰＺを６０％等張パーコールを用いて集め、ベレットを血清不含培地中に再懸濁し、計数する。一般に、３Ｘ１０’個のオーシストから約７．２Ｘ１０’個の５ＰＺ（３０％）が得られる。ＳＰＺを超音波処理し、試験用の抗原源として一２０℃で保存する。

抗原の接種を以下のようにして行う。ｌ□ａ＋Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）中に調製した２００マイクロリットルの抗原を９６ウエルのヌンクイムノプレート（Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ）の最上列のウェルに添加する。残りの全てのウェルには１００マイクロリツトルのホウ酸緩衝液だけが入っている。２倍の連続希釈を８〜６列に作る。Ｈ列は緩衝液だけを含み、負の対照として用いる。ウェルをバラフィルムで覆い、４℃にて一夜培養する。ＳＰＺ対照をウェルの最上列に１０ｎｇで添加する。１％ＦＢＳを含まない抗原を１１００ｎで添加し、抗原＋１％ＦＢＳ［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　］を１１０００ｎて添加する。

未感染Ｆ７細胞からの上清抗原が各試験において負の対照として含まれている。

Ｆ７細胞の感染継代から７２時間目に収穫しこ上清も内標として各プレート中に含まれている。７２時間上清をまず５ＰＺＥＬＩＳＡにより定量し、ついでＳＰＺ対照と比較したその相対値を試験間のばらつきについてモニターし、調整するのに用いる。

次に、上清をＰＢＳ＋０．０５％ツイーン−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、２００マイクロリツトルのＰＢＳ−Ｔ中、５％脱脂粉乳（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）　）を各ウェル中に添加することによりブロックする。ウェルを３７℃でプラスチ・ツクのラップて覆って」一時間培養し、ＰＢＳ−Ｔで再び３回洗浄する。

ついで−次抗体を添加する。」００マイクロリツトルのＰＢＳ−Ｔ中、０．５％ＢＳＡ中１：　２００００に希釈したウサギ抗ＳＰＺ抗体Ｎｏ、１５．．１６を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間培養し、プラスチックのラップで覆う。再びプレートをＰＢＳ−Ｔて３回洗浄する。これに続いて、接合抗体（ＰＢＳ−Ｔ中、２％脱脂粉乳中ビオチン標識ヤギ抗ウつギｒｇｃ　（ＫＰ）の１・２０００希釈物１００マイクロリツトル）を各ウェルに添加する。プレートを再び３７℃にて１時間培養し、ついでＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。これに続いて、ペルオキシダーゼ標識ストレブタビジン［キルケガード・ぺり−（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　Ｐｅｒｒｙ）コのＰＢＳ−Ｔ中、２％脱脱脂乳乳中１：１５００希釈物１００マイクロリツトル）を各ウェルに添加する。ついでプレートを暗所で３７℃にて１時間培養し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ＴＭＢ−ペルオキシダーゼ［キルケガード・ペリーコをＨ２Ｏ２と１：１の比率で混合し、各ウェルごとに１００ミリリツトルの基質を添加する。ついでプレートを１５〜３０分間３７° Ｃにて暗所で培養する。培養時間の最後に、各ウェルごとに１００マイクロリツトルのＩＭ　ＨＣＩを添加して反応を停止させる。

４５０ｎｍでＶｍａｘを読み取る。

Ｂ　細胞中の寄生虫発生をモニターするために用いられる別の試験は、宿主ではなく寄生虫の、放射標識ウラシルをそのＲＮＡ中に取り込む能力を利用する［ディー・エムーンユーｖッツ（Ｄ、　Ｍ、　Ｓｃｈｍａｔｚ）ら、　Ｊ、Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、、３３　：　１０９−１１４　（１９８６）］。簡単には、マイクロタイタープレート中の細胞培養物をアイメリア・テネラでｌＸ１０３個（スポロゾイト）／ウェルで感染させる２４時間前に、１×１０５細胞／ｍｌで接種する。スポロゾイトを細胞と共に４０．５００にて４時間培養し、次に血清不含培地で洗浄することにより除去する。細胞を次に培地および血清にかさね、２４時間培養する。感染の２４時間後に、細胞を洗浄し、ついで［３Ｈ］−ウラシルを含有する培地を再度添加する。標識物質は２４時間かけて取り込まれ、次に細胞をセル・ノ＼−ベスター［ケンブリッジ・テクノロジー社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、　）　］を用いてフィルター上に回収する。水性シンチレーションカクテル［ベックマン・レディー・セイフ（ＢｅｃｋｍａｎＲｅａｃｌｙ　５ａｆｅ）　］を添加した後、フィルター上の放射活性をベックマンＬＳ　３８０１液体ノンチレーノヨンカウンター中で測定する。基底値および未感染細胞甲に取り込まれた放射性標識も測定する。

実施例３−トリワクチンＡ、５％ＦＢＳ　［アービン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　］を含有するＭｅｄユｕｍ１９９または１％ＦＢＳを含有するＯｐｔｉＭＥＭのいずれか３０加工を含有するＴ−１５０フラスコ中、１．０× １０５細胞／ｍｌの割合で接種した５Ｂ−ＣＥＶ−１／Ｐ宿主細胞クローンからワクチン処方物を調製する。当業者に周知の通常の技法により２４時間後に１× １０８個／ａ＋１の割合で、脱装したアイメリア・テネラスポロゾイトを接種物として用いる。スポロゾイトを２時間放置して侵入させ、その後侵されなかったスポロゾイトを穏やかに洗浄することにより除去する。新鮮な培地を各フラスコに添加する。感染後２４時間間隔で、培地を回収し、３０００Ｘｇで３０分間遠心分離し、５％アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）で応答を誘起する。この処方物（２４時間上清、４８時間上清および７２時間上清などと称する）を使用するまで４°Ｃで保存する。

Ｂ、別の処方物は、前記ワクチンから残存する細胞を用いる。３０ｍ１の新鮮な培地；　Ｍｅｄｉｕｍ　１９９またはＯｐｔｉＭＥＭをＴ−１５０フラスコに添加し、細胞を懸濁液中にかき落とす。この懸濁液を収集し、凍結／解凍サイクルに付し、５％アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）で応答を誘起する。この処方物を使用するまで４℃で保存する。

Ｃ１さらに別の処方物は、前記の分画されていないワクチンからの感染培養物を全部用いる。収穫して、感染細胞を懸濁液中にかき落とす。この懸濁液を収集し、凍結／解凍サイクルに付し、５％アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）で応答を誘起する。この処方物を使用するまで４℃で保存する。

実施例４−免疫原性データＡ、ブロイラー免疫原性研究その１アイメリア・テ不う細胞培養物由来の抗原を市販のブロイラーにおける免疫原性に関してアンフィゲンおよびフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を−次免疫化のためのアジュバントとして比較するスクリーンするための研究を行う。

３００羽の４日令の直系の市販のブロイラーを以下のようにして２０のグループに分ける（各グループは１５羽、翼を縛る）。ＰＢＳは前記実施例２において記載した直接５ＰＺＥＬＩＳＡを用いて定量した寄生虫特異性蛋白質のことである。

群　アンフィゲン処理　ＰＳＰ　群　ＦＣＡ処理　旦旦旦ＩＡ　非攻撃対照　０　μｇ／ｍｉ　Ｉ　Ｂ　非攻撃対照　０μｇ／ｍ１２Ａ　攻撃対照　０　２Ｂ　攻撃対照　０３Ａ　２４時間抗原　０．７０　３Ｂ　２４時間抗原　０．３５４Ａ　４８時間抗原　１．４０　４Ｂ　４８時間抗原　０，７０５Ａ　７２時間抗原　１．．４０　５Ｂ　７２時間抗原　０．７０６Ａ　２４／４８時間　１．１０　６Ｂ　２４／４８時間　０．６０（１：１．）　（１：１）７　Ａ　２４／４８／７２時間　１．２０　７　Ｂ　２４／４ｇ／７２時間　０，６０（１：　１　：　１）　（１：　１　：　１）８Ａ　２４時間−次抗原　０．７／１．４　８　Ｂ　２４時間−次抗原　０．３５１０．７／４８時間追加抗原　７４８時間追加抗原９Ａ　５Ｘ５００トリツクル　９Ｂ　５Ｘ５００）− リッフル１〜８群のひよこを指定どおり４日目に皮下注射（Ｓ　Ｃ）により免疫化し、同量の５％アンフィゲン中の抗原を７日目に経口的に追加投与する。対照群は両方とも５％アンフィゲンまたはＦＣＡとの１：１混合物［シグマ（ＳＩＧＭＡ）］を追加した組織培養培地（Ｇ　１ｂｃｏ　Ｍｅｃｌｉｕｍ　１９９　＋　１％ＦＢＳ）の接種物１＋＋＋１を投与する。３〜８群に関する抗原を宿主細胞クローンＦ７　（Ｐ２４〜３１）から２４時間抗原に対して調製し、Ｆ７（Ｐ２４〜２９）から４８時間抗原および７２時間抗原の両方に対して調製する。抗原を使用するまで一２０℃で保存し、凍結／解凍サイクルに付す。

９Ａおよび９Ｂ群に関するアイメリア・テネラオーシストを連続して５日間、− 日あたり５００オーシストを経口投与する（Ｌｉｌｌｙ　５ｔｒａｉｎ　６５番株、リジー社（Ｌｉｌｌｙ、　Ｃｏ）　）　［ニューハンプシャー大学（ＵＮＨ）から寄贈］。さらに、９Ｂ群の鳥に４日令で５０％ＦＣＡを皮下注射により投与する。

２〜９群には２１１日令３５．００ＯＬ、Ｓ、Ｎｏ、６５アイメリア・テネラオーシスト（番号は力価により決める）を投与する。この時に、全てのひよこの体重を測定し、プレパテントピリオド中の飼料消費量をモニターする。抗原投与の６Ｂ後に、体重、飼料消費量および盲腸病巣評点を測定する。

試験１からの臨床データを第１表および第２表に要約する。重量増加に関する最少自乗統計的比較を未免疫化／攻撃（ｔＪＩ／Ｃ）対照群間で行う。試験した主な結果は、処理、処理動物、性および処理相互作用による性である。アンフイゲンおよびＦＣＡデータの両方とも別々に試験した。両方のデータに関して、処理による著しい相互作用により、性間の分析ができる。病巣評点に関して性差は見られない。処理結果に関してのみ飼料変換率（ｆｅｅｄ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を試験する。

以下の表において、Ｕｌ／ＵＣは未免疫化／攻撃を意味し、Ａｇは抗原を表わす。

処理　Ｎ　体重増加　飼料変換率　病巣点Ｕｌ／ＵＣ１３２８７１，８０Ｕｌ／ＣＩ３　２２３　２．１　２．５２４時間Ａ、ｇ　１．４　２５５　１．９　２．９４８時間Ａｇ　１４　２２３　２．１　２．９７２時間Ａｇ　１５　２６４＃　１．５＊　２．８２４／４８時間Ａｇ　１４　２６１＃　２．０　２．８２４／４．８／７２時間Ａｇ　１４　２６２＃　２．０　２．６２４−＞４８時間　１５　２７３＊　１．９　２．６トリツクル　６　２５７　１．８　２．８＊ｐ＜０．０５ｓｐ＜ｏ　１第２表処理　Ｎ　体重増加　飼料変換率　病巣点Ｕｌ／ＵＣ１５２８６１，８０ＵＩ／Ｃ１５２４３２，１２，７２４時間Ａｇ　１５　２６０　１．９　３．０４８時間Ａ、ｇ　１４　２３３　２．１　２．６７２時間Ａｇ　１５　２３１　２．６　２．８２４／４８時間Ａｇ　１４　２５３　１．９　２．９２４／４８／７２時間Ａｇ　１５　１９６ネ　２．３２．９２４−＞４８時間　１５　２１５　２．２　２．５トリツクル　１５　２６６　１．９　１．５＊＊ｐ＜０．０５アンフィゲンをアジュバントとする細胞培養抗原を４日令目に皮下投与し、７日令目に経口投与すると、−組の禽舎において３５０００個のアイメリア・テネラオーシスト攻撃に対して著しい（ｐ＜０．０５）またはそれに近い（ｐ＜０．１）体重増加防御が生じる。２４時間抗原を皮下投与し、続いて４８時間抗原を経口投与すると、著しい体重増加が見られ、７２時間抗原では体重増加は停止し、２４／４８時間および２４／４８／７２時間の組み合わせではほとんど著しい体重増加が得られる。アンフィゲンをアジュバントとする処理のいずれも病巣評点の減少に影響を与えない。７２時間抗原を接種した群だけが著しい飼料変換率の増加を示す。トリックルオーシストで免疫化したグループは防御に関して試験しなかった。

ＦＣＡをアジュバントとして用いる細胞培養では攻撃に対して体重増加または飼料変換率で測定される著しい防御を示さない。実際、２４／４８／７２時間抗原の組み合わせで免疫化したグループでは攻撃対照群より体重増加が著しく減少する。トリックルオーシストグループだけが病巣評点において著しい減少を示す。

以下の結論はこのデータから引き出すことができる。２４時間（皮下）７４８時間（経口）ワクチン接種により、アンフィゲンをアジュバントとして用いた場合、攻撃感染に対し７て著しい体重増加防御が見られる。７２時間抗原および２４／４８時間および２４／４８／７２時間抗原の組み合わせはすべてアンフィゲンをアジュバントとして用い、体重増加で示される防御を示す。これらの知見により、各抗原調製物は異なる組成の抗原または異なる割合の類似した抗原のいずれかを含有することがわかる。

体重増加防御は病巣評点が減少しない場合に測定され、これにより、これらのパラメータは異なる機構により影響を受けることがわかる。体重増加および飼料変換効率は盲腸病巣が存在する場合でも保持される。

４８時間抗原単独では有効でない場合、この抗原は２４時間および／または７２時間抗原と組み合わされるか、あるいは７日目に経口投与すると発症して攻撃感染に対する免疫が確立される。７２時間抗原収穫物は３種の時点全ての代表的抗原組成を含有すると考えられる。

ＦＣＡは細胞培養抗原の免疫原性を強化することに成功しなかった。ＦＣＡ単独では設定されたＦＣＡデータにおけるより高い攻撃感染対照の体重増加により示されるような攻撃感染に対する非特異性応答を示す。

経口用量、投与時期、および攻撃後の成育を含めてフロアペン（ｆｌｏｏｒ　ｐｅｎ）設計における能力についてのその後の影響の重要性を、以下の研究において評価する（バートＢ）。

Ｂ、ブロイラー免疫原性試験その２この研究の目的は、数個のアイメリア・テネラ細胞培養物由来の抗原をフロアベンを用い４０日間成育させる場合の免疫原性に関してスクリーンすることである。

２５４日令の雄の市販のブロイラー雛鳥を以下のようにして１０グループ（各グループにつき２５羽、翼を縛る）に分ける。表中、ＵＩ／ＵＣ／Ｍｅｄは未免疫化／攻撃／薬物未理を意味し、ＵＩ／ＵＣ／ＵｎＭｅｄは未免疫化／攻撃／薬物未処理を意味し、Ｕ　Ｔ　／　Ｃ／　Ｕ　ｎｍｅｄは未免疫化／攻撃／薬物未処理を意味する。

群　治療　ＰＳＰ／用量Ｉ　Ｕ　Ｉ／ＵＣ／Ｍｅｄ　Ｏμｇ／ｍ１２　Ｕ　Ｉ　／ＵＣ／ＵｎＭｅｄ　０３　Ｕ　ｌ　／Ｃ／ＵｎＭｅｄ　０４　２４時間、４６　２　μｇ／ｍ］５　２４時間、４　ｄ／　７　ｄ　２　μｇ／ｍ１６　７２時間、４ｄ　２　μ ｇ／ｍ１７　７２時間、４　ｄ／　７　ｄ　２　μｇ／ｍ１８　２４／４８時間、４ｄ　２　μｇ／ｍ１９　２４／４８時間、４　ｄ／　７　ｄ　２　μｇ／ｍ１１０　２４時間、４（１２μｇ／ｍ１４８時間、７ｄ　１．６μｇ／ｍｌひよこを全て４日令口まで線上に保持する。この時点で、第１〜１０群のひよこを皮下注射で免疫化し、指定どおり清潔な敷き藁のフロアペン中に移す。第５．７．９および第１０群のひよこを７日目に経口的に追加抗原投与する。対照群に５％アンフィゲンをアジュバントとする１ｍｌの組織培養物の接種物（Ｇ　ｉｂｃ。

Ｍｅｄｉｕｍ　ｌ　９９　＋１％ＦＢＳ）を投与する。さらに、第１群は実験期間中３　ｐｐｃのステネロールで薬剤処理した飼料を与える。第４〜１０群に関する抗原は、宿主細胞クローンＦ７　（Ｐ２４−２４）から調製し、５％アンフィゲンをアジュバントとして用いる。

ひよこは全て２７日目まではスターター比で給餌し、２７〜４０日の成長期には成育比に変える。飼料および水は任意に与える。

第３〜１０群の鳥に２１日目に３５，０００　（力価により用量を決める）Ｌ、Ｓ。

Ｎｏ、　６５アイメリア・テネラオーシストで攻撃させる。この時、全ての鳥の体重を測定し、プレパテント期間中の飼料消費量をモニターする。

攻撃の６日後に、体重および飼料消費量を測定する。さらに、各ペンから５羽の鳥を盲腸病巣評点のため無作為に選択する。残りの鳥を全て成育比に変え、４０Ｅ＋、今まで続ける。この期間中、体重増加および飼料消費量をモニターする。

４０日目に、盲腸病巣評点のために全ての鳥を殺す。

試験２からの臨床データを第３表に要約する。体重増加の最小二乗の統計的比較を、未免疫化／攻撃（ＵＩ／Ｃ）対照群および各処理群（薬剤処理対照群は除く）間で行う。病巣評点または給餌臼に関しての統計はとらない（各群につき１回観察）。

第３表試験２の臨床結果（２１〜２７日）　（２７〜４０日）処理　増加　飼料　病巣　増加　飼料Ｕｌ／ＵＣ／Ｍｅｄ　３７８　１．８４　０１０　８４ｇ　２．２０Ｕ　Ｉ／ＵＣ／ＵｎＭｅｄ　３２４　１．９７　０／２．４　７６４　２．３４Ｕｌ／Ｃ／ＵｎＭｅｄ　３３４　１．９１　２．４１０．８　７１９　２．４８２４ｈ−４ｄ　３０７　１．９８　２．０／１．６　７３４　２．４９２４ｈ−４，ｄ／７ｄ　３３６　１，９０　２．８／２．０　７９１．＊　２．２６２４ｈ−４８ｈ −４ｄ　３０１　２．０１　３．０／２．２　７７４　２．３２２４／４８ｈ− ４ｃｌ／７ｄ　２８３　２．２６　１．０１０　７６７　２．３７２４ｈ−＞４８１〕２５０　２．５２　１．２１０．４　７８７＃　２．１７７２ｈ−４ｄ　２８２　２．１０　２．２１０．４　７８１＃　２．１６７２ｈ−４ｄ／７ｄ　３４２　１．８２　２．２／１．４　８９４＊＊　１．９８＊＊ｐ＜０．００１この実験の前には、アイメリア・テネラは１０個のフロアペンのこのセットにおいて実験的に用いておらず、Ｕ　Ｉ　／　Ｕ　Ｃ，／　’ＩＪ　ｎＭｅｄ群において盲腸病巣は見られなかった（アイメリア・テネラが他のペンにおいて攻撃感染前に循環している可能性がある）。しかし、アイメリア・アセルブリナは同じフロアベンのセットにおいて既に用いており、この種に特有な小腸上部病巣が。

ＵＩ／ＵＣ／ＵｎＭｅｄ群において見られる。

攻撃感染の６日後に統計的に明らかではないが、７２時間抗原を４日目（皮下）７７日目（経口）に投与した群だけが、攻撃対照よりも体重増加が高く、薬剤処理対照群よりも飼料変換率が低い。４０日の成育後、この同じ７２時間抗原接種群は体重増加の点で攻撃対照よりも高度に著しい（ｐ≦０．００１）防御および低い飼料変換率を示す。さらに、２４時間抗原を４日目に皮下投与し、続いて４８時間抗原を７日目に経口投与したものは全て攻撃対照よりも体重増加の点で著しい防御を示し、４０日の成育後攻撃対照に匹敵するかまたはそれより高い飼料変換率を示す。２４時間４日／４８時間７日抗原計画（第１０群）ならびに２４／４８時間４日（皮下）７７日（経口）処理群は攻撃の６日後の腸病巣評点が低い。成長後には腸の病巣は見られないが、攻撃対照群においては全体的に粘膜が厚くなっているのが見られる。成育期間中に測定されたアイメリア・テネラに対する防御はアイメリア・アセルブリナの循環のもとに示されると考えるのが妥当である。

以下の結論はこのデータにより引き出される。防御（体重増加）は２１日目にオーシストを投与しこ６日後のフロアベンにおいては測定が困難である。最低４０日までの成育がフロアペンにおいて著しいワクチン効率を示させるのに必要である。

４日目に一度皮下投与するかまたは４日目に皮下投与し、７日目に経口投与を２回投与すると７２時間抗原は攻撃対照よりも著しい防御を示す。７２時間抗原を二回投与したものは薬剤処理を施した対照群において測定されるのに匹敵する性能を示す。この防御はフロアベン中に循環する３５０００のアイメリア・テネラ攻撃およびアイメリア／アセルブリナの存在下に示された。これはフロアベンンステムにおける不活化コクシジウム症ワクチン効率の最初の兆候である。

４日（皮下）７７日（経口）投与された２　４／４８時間抗原、ならびに４日に皮下投与された２４時間抗原および７日に経口投与された４８時間抗原は、アイメリア・アセルブリナおよびア・イメリア・テネラの両方に関して腸病巣評点が最も減少した。この２種の４日（皮下）次いで７日（経口）のｍ１計画は単一の皮下免疫よりも優れていると考えられる。

’Ｊ７ｔＩ％Ｉ　５−　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ドラ・乙乙各クリ−Ｂ＞ｆ感染細胞のミクロカルチャー（３工（−ウラシルの存在下）を時間Ｔ＝Ｏで、５０μｇ／ｍｌで始めるアルファアマニチンの）−ｏｇ２　（希釈度）を用いて確立する。

培養物を次に感染後１時間、６時間、１２時間、２４時間および４８時間目に収穫し、放射性前駆体の標識吸収を収穫し、シンチレーションカウンティング用に処理することにより測定する。寄生虫感染症の最初の２４時間中にアルファーアマニチンが存在する場合、吸収の計測数（寄生物質）は停止する。しかし、アルファーアマニチンが２４時間後に添加される場合、標識吸収の阻害は観察されない。

実施例６−免疫測定ＵＣＤ、００３系由来の生後１日の同系ひよこ（Ｂ１＠Ｂ＋！１およびＢｓｏＢ、ｔｏＭＨＣハブロタイブ）［ニュー・ハンプシャー・ボートリー・リサーチ・センター（Ｎｅｗ　Ｉｌａｍｐｓｈｉｒｅ　Ｐｏｕ］ｔｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）　］を用いる。ひよこに薬剤処理をしないスターター／成長食および水を任意に供給する。１〜４３日令のトリを用いる。

自然免疫を模倣するために、１日令のひよこを生アイメリア・テネラ［リジー・ストレインＮｏ、　６５　（Ｌｉｌｌｙ　５ｔｒａｉｎ　＃　６５）　］オーシストを用いて連続して５日間（５００オ一シスト／日）免疫するかまたはワクチン抗原（５％アンフイゲンをアジュバントとして用いる）で種々の用量で人工的に免疫する。典型的には、１または４日令の鳥を１．ＯｍＪの用量のワクチン抗原を首の根元に皮下注射（ＳＣ）することにより免疫化し、４または７日令のひよこに１．Ｑｍｌの容積を経口的に追加抗原投与する。疑似免疫化（培地千５％アンフイゲン）したひよこを対照として用いる。いくつかの実験において、１０日令のひよこに３５０００フイメリア・テネラオーシストを経口的に接種することにより攻撃させる。

Ａ　ワクチンおよび寄生虫抗原感染後２４．４８および７２時間目に回収したアイメリア・テネラ感染Ｆ７細胞由来の培地を免疫化およびｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験の抗原源として用いる。免疫化に関しては、感染Ｆ７細胞から回収した培地は、１％ＦＢＳをａ有し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験に関して、回収した感染した培地は血清を含まない（０，１％ＦＢＳ）。抗原含有培地を遠心分離（８００ｘｇ、３０分、４℃）により清澄化し、分割し、使用するまで一２０℃で保存する。細胞不含上清を全て直接５ＰＺＥＬＩＳＡを用いて寄生虫特異性蛋白質に関して定量する。分画したサンプルをＰＳＰおよびウェスタン反応性にしたがってブー・ルする。スポロゾイト（Ｓ　Ｐ　Ｚ’）およびメロゾイト（ｍｒｚ）抗原を氷上で血清不含Ｍｅｄｉｕｍ　１９９中超音波処理し、続いて遠心分離（８００ｘ　ｇ、１０分、４°Ｃ）することにより調製する。蛋白質濃度をブラッドフォードの方法［Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７２　：　２４８−２５２　（１９７６）］に従って測定する。超音波処理した寄生虫懸濁液を血清不含ＭｅｄｉａＩ１１１９９中最終濃度を１０μｇ／＋ｎｌに調節し、分割し、使用するまで一２０℃で保存する。

Ｂ、細胞単離末梢血白血球（ＰＢＬ）および膵臓細胞を自然または人工的（ワクチン）免疫化または免疫化／攻撃した鳥から免疫化の後の様々な時点で採取する。心臓穿刺により得たＰＢＬをヘパリン化した血液サンプルのヒストパック３．０７７＜４００ｇ、１５分、室温）遠心分離により単離する。いくつかの試験では、グラジェントからの赤血球も保存し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ増殖検定用の共刺激物質としても用いた。

シリンジを挿入し、続いて低速で遠心分離しく５０Ｘｇ、１０分、室温）、引き続きヒストバック１０７７グラジエントで遠心分離することにより単個細胞胛体懸濁液を得る。生存細胞計数をトライパンブルーおよび血球計を用いて行う。

Ｃ９抗原およびマイトジェン−刺激細胞上清の産生未希釈の血清を不含抗原、種々の濃度のコンカナバリンＡまたはリボ多糖類（ＬＰＳ）、あるいは血清不含Ｍｅｃｌｉｕｎ＋　１９９　（１，０ｓｌ／ウェル）を白血球と共に４０℃、５％ＣＯ７で培養する。２４．４８および７２時間後に上清をウェルから除去し、遠心分離（８００Ｘｇ、１５分、室温）により清澄化する。アルファーメチルマンノシド（α−ＭＭ）をＣｏｎＡ含有上清に最終濃度が５０ｍＭになるように添加する。上清サンプルを１．５ｍｌ試験管中に分割し、使用するまで一８０℃で保存する。感染後０〜４８時間（２４／４８）または４８〜７２時間（７２）から産生された培地を回収し、直線的Ｎ　ａ　Ｃｌグラジェントを用いてＳ−セファロースにより分画し、ＰＳＰおよびウェスタン反応性に基づいてプールする。フラクションＩは回収した全フラクションの初めの方から抜き取った８フラクシヨンのプールを表わす。フラクションＩＩは９〜１４番のフラクションのプールを表わし、フラクションＩＩＩは１５〜１８番のプールをあられす。

Ｄ　細胞増殖試験各フラクションから合計１０マイクログラムの蛋白質を以下に記載する細胞増殖試験にお（プる反応性に関して試験する。

細胞を、間部のマツコイ５Ａおよびレイホビッツ培地、５Ｘ１０−’２−メルカプトエタノールベニ／リン／ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢ，２％リン酸）・リブドースおよび１ｍＭピルビン酸すｌ・リウムを含有する完全な血清不含レイボビッツ修飾バーン培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ　Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｈａｈｎ’　ｓｍｅｄｉａ）　（ｃＬＭＨ）中１０７細胞／山］に調節する。赤血球（１０７細胞／ｍ１）を丸底マイクロリットルプレートの全てのウェルに添加する（５ｍ１．／ウェル）。未希釈の血清不含抗原、ＣｏｎＡ、または血清不含Ｍｅｄｉｕａｌ　９　９　（Ｑ．　１ｍｌ／ウェル）を３７℃の水浴中で解凍し、４等分し、つづいてＰＢＬまたは膵臓細胞（０．０５ｍ１／ウエル）を添加する。マイトジェンおよび抗原増殖試験に関し，では、培養物を４０°Ｃ、５％ＣＯ２でそれぞれ７２または９６時間培養し、つぎに１μＣｉ／ウエル３［Ｈ］−チミジンで培養の最後の１８時間中（比活性、５　０μＣｉ／ｍｍｏ１．）標識する。細胞をガラス繊維マット上にＭＡＣＨＩＩＩハーベスタ−を用いて収穫し、放射能をバフカードマトリックス９６ダイレクトベータカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｍａｔｒｉｘ　９　６　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｂｅｔａ　Ｃｏｕｎｔｅｒ）で測定する。各サンプルに関してＣｐｍの高い値および低い値を無視する。特記しないかぎり、結果は次式にしたがって刺激指標（Ｓ．１．）で表わす。

自然免疫化した鳥から得た膵臓白血球はアイメリア・テネラ−感染し７たＳ−セファロースカラムから生化学的に分離されたフラクションに応答して増殖することが判明した。２５日令の自然免疫化された鳥から得られた膵臓白血球は、フラクションＩおよびＩＩＩに比べてフラクションＩＩについて高いＳ．１．値を示す（第４表）。

Ｅ．　Ｔ−一細胞ウニスタンプールしたフラクション７２−ＩＩを１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、溶解し、以下に記載するようにしてＴ−細胞ウニスタン増殖検定において反応性に関して試験する。

ラムおよびヤングの方法（Ｌａｍｂ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ，　Ｉｗｕｎｏｌ．、６　０：１（１９　８　７））の変法を用いて一次元イムノブロツテイングを行つ。簡単には、Ｓ−セファロースから得たプールしたフラクションを１０または１２．５％アクリルアミドゲル上還元条件下で、ドデシル硫酸すＦ・リウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離する。分離された蛋白質をニトロセルロース（孔径０．２μＭ）に移し、ニトロセルロースを異なる分子量範囲にしたがって１２個に等分する。ニトロセルロース片をＤＭＳＯ／炭酸塩−炭酸水素塩沈殿を用いてアボー−ツァイドの方法（Ａｂｏｕ−Ｚｅｉｄ、Ｊ、　ｌ＋＋ｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、、９８　：５（１９８７））に従って溶解させ、続いて脱イオンＨ２０中凍結／解凍する。溶解し、微粒子化したサンプルを血清不含ｃＬＭＨ中で３回洗浄し・、最終容積がｌ、Ｑｍｉの血清不含ｃＬＭＨ中に再懸濁する。サンプルを使用するまで一２０℃で保存する。試験するために、サンプルを室温で解凍し、血清不含ｃＬＭＨ中で１：５に希釈し、５Ｘ１０’赤血球（０，０５ｍ１／ウエル）を含有する丸底マイクロリットルプレートに４分割して添加する（０．１ｍ１／ウエル）。ＰＢＬまたは膵臓細胞（１０）細胞／ｍｌ、０．１ｍｌ／ウェル）を次にプレートに添加し、培養物を４０ ℃、５％ＣＯ２で培養する。培養物を前記のようにして１μＣｉ／ウエル３［Ｈ］−チミジンで培養の最後の１８時間中標識化し、収穫し、計測する。結果を前記式にしたがって第５表においてｓ、ｒ、で表わす。

自然免疫化した鳥から得たＰＢＬも限定された数のアイメリア・テネラ７２−ＩＩフラクションに応答して増殖する。１６日令の自然免疫化／攻撃した鳥から得られたＰＢＬは、およその相対分子量（ＭｒＳ）が６８〜７５．３８〜４１および２７〜３ＱｋＤａである抗原に対応するイムノプロットの３箇所の異なる領域について最も高いｓ、ｒ、反応性を示す（第５表）。およそのＭｒＳが２５〜２８および３８〜４ＱｋＤａである同様の寄生蛋白質も粗濃縮７２時間抗原においてこれらの自然に免疫化／攻撃した鳥から得られた血清を用いてウェスタンにより同定される。

第５表７２−ＩＩフラクションＮｏ　鼠ｒＳ領域（ｋＤａ）　Ｓ、１．値２　９７〜１５０　１．２３　７５〜９７　１．２４　６８〜７５　２．３５　５５〜６８　１．１６　４８〜５５　１．５７　４１〜４８　１．３８　３８〜４１　１．９９　３５〜３８　１．３１０　３０〜３５　１．３１１　２７〜３０　２．５１２　２２〜２６　１．２Ｆ、ＴＮＦ試験マウスＬ９２９細胞［ＡＴＣＣコをＭｃＣｏｙｓ５Ａ１５％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）中に懸濁して４Ｘ１０’細胞／ｍｌにし、０．１ｍｌを平底マイクロリットルプレートに添加する。−夜３７℃、５％ＣＯ２で培養した後、マウス組換え腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）標体［Ｇｅｎｚｙｍｅ］（２μｇ／ｍｌ初期濃度）の１ｏｇ２希釈度または試験上清をアクチノマイシンＤ（２μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で調製し、適当なウェル中に２等分する。４８時間３７℃、５％ＣＯ２で培養した後、プレートをダルベツコ・リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）中で１回洗浄し、細胞をメタノール／酢酸（３：　１）中で室温にて１０分間固定する。プレートを１０分間０．５％クリスタルバイオレット／２０％メタノールで染色し、ｄＨ，Ｏ中で数回すすぐ。洗浄後、０．１ｍｌ／ウェル酢酸（３３％）を添加し、プレートを着色がウェル全体に均一に分散するまでオービタルシュイカ−上で混合させる。ウェルの６００ｎｍでの吸光度をモレキュラ・デバイスＶ　ｍａｘ自動マイクロプレートリーダーで測定する。データを次式に従って、細胞毒性（％）で記録する：細胞毒性、１．（％）　＝Ａｃｏｓ＋−Ａｎ＋＋／Ａａａ、（式中、細胞毒性、１．（％）は所定の希釈度での細胞破壊量を表わし、Ａ１゜、は対照ウェル（培地のみ）中の吸光度を表わし、Ａ　ａ　目は試験上清の所定希釈度での吸光度を表わす）。力価は５０％の細胞毒性を達成するのに必要な希釈度の逆数と定義する。

第６表ＴＮＦ試験結果の要約処理　鳥の日令　刺激剤　細胞毒性活性＊＊５Ｘ５００＊　１０　ｍｒｚ　＋５Ｘ５００　２５　ｍｒｚ　＋７２時間　− ７２時間　− コンカナバリンＡ　− ＊＊　５Ｘ５００は５日間−日につき５００オーンストの服用量を表わす。

＊＊：（＋）は細胞毒性が存在することを示すが、力価の逆数は測定できなかった。

Ｇ、インターロイキン２試験ＩＬ２反応細胞を天然の２〜４週令Ｂ５０Ｂ３０鳥の膵臓から単離する。単細胞懸濁液を２．５　μｇ／ｍｌ　Ｃｏｎ　Ａを含有する血清不含ｃＬＭＨ中５Ｘ１０’細胞／ｍｌに調節し、４０．５°Ｃ，５％ＣＯ２でＴ−７５フラスコ中で培養する。４８時間後、付着しない細胞を２０分間４０．５°Ｃで５０ｍＭα−ＭＭで処理し、ヒストバック１０７７上遠心分離することにより芽細胞を単離する。生存細胞を血清不含ｃＬＭＨ／１００ｍＭα−ＭＭ中に再懸濁して２　Ｘ　１０　’／ｍｌにし、丸底マイクロリプトルプレートに添加する（０．１ｍｌ／ウェル）。実験室標準ＩＬ２−含有調節培地の１０ｇ２８釈物を適当なウェル中に４分割して添加し、正の対照とする。血清不含ｃＬＭＨ（負の対照）または試験上清を次に添加しく０．１ｍｌ、２５％ｖ／ｖ最終ウェル濃度つを４分割し、プレートを、４０℃、５％ＣＯ２で４８時間培養する。培養物を１μＣｉ／ウエル（０，０５ａ＋１）の３［Ｈ］−チミジンでさらに６時間標識する。前記と同様にして細胞を収穫し、計測する。各サンプルのｃｐｍの高い値および低い値を無視する。ＩＬ２に関し陽性と考えられる上清は平均ｃｐｍが各プレートの血清不含対照培地の少なくとも２倍である。

Ｈ１第二ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗体試験（ＳＩＢＡ）抗原（ＳＰＺ、ｍｒｚまたは細胞培養抗原）の１０ｇ２希釈物を１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）で初期濃度１　μｇ　Ｐ　Ｓ　Ｐ／ｍｌとなるように調製し、０．１ｍ１／ウエルをヌンクィムノーマキシソルブＥＬＩＳＡプレートに添加する。−夜４℃にて培養した後、５％脱脂粉乳（０，２ｍｌ／ウェル）を含有するＰＢＳｌｏ、０５％Ｔｖｅｅｎ　２０　（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて３７℃で２時間ウェルをブロックする。

プレートを完全ＨＢＳＳ、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７，４）中で３回、抗生物質／抗かび剤（ｃＨＢｓｓ）で１回洗浄し、滅菌フード下で少なくとも２０分間紫外線照射により滅菌する。ＰＢＬまたは膵臓細胞を２Ｘ１０’細胞／ｍｌに調整し、０．２ｍｌを第一列に添加する。細胞の希釈度の対数を血清不含ｃＬＭＨ中全プレートにわたってとり（各プレートした抗原について最終列はのぞ＜）、交差力価測定法を完了する。ウェルをｃＬＭＨを用いて最終容積０．２ｍｌまでとし、プレートを４０５°Ｃ１５％ＣＯ□で３〜５日間培養する。培養後、プレートを冷ＰＢＳ−Ｔを用いて激しく３回洗浄する。

各プレートした抗原に関して最終列を０．１ｍｌのアイメリア・テネラハイパーイミュンチキン血清（Ｐ　Ｂ　５−Ｔ１０．０５％ＢＳＡ中１＋２０００）と共に３７℃で１時間培養する。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ビオチニル化ヤギ抗ニヮトすＩｇＧ　（ＰＢＳ−Ｔ／２％脱脂粉乳中１　：　２０００）を全ウェルに添加し、培養を３７°Ｃで１時間続ける。ＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した後、ウェルを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレブタビジン（ＰＢＳ−Ｔ／２％脱脂粉乳中１：１０００）でさらに１時間処理する。プレートをＰＢＳ−Ｔ中でよ（洗浄し、ＴＭＢ／ベルオキシダーゼ基質を用いて結合した酵素を検出する。ＬＭ　ＨＣｌを添加することにより、酵素反応を１５分後に停止し、モレキュラ・デバイスＶ　ｗａｘ自動マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの光学密度を測定する。

第７表第二ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｂ細胞試験処理群　抗原　４．５０　ｎｍでの光学密度５Ｘ５００　７２時間　１．５６７Ｕｌ　Ｏ，９１０ｍｒｚ　１．７５０ＵＩ　７２時間　０９２０Ｕｌ　Ｏ，５９２ｍｒｚ　０．６８９ ■、寄生虫阻害試験（ＰＩＡ）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ／１％ＦＢＳ中で成育させたＱＴ−３５細胞系（ＱＴ−３５はペンシルバニア州大学農学部獣医学科から寄贈）を９６ウエル平底プレート中に１×１０４細胞／ウエルで接種する。４０℃、５％ＣＯ２で一夜培養した後、細胞を陽性対照調節培地または試験上清の１ｏｇ２希釈物で二回予備処理する。− 列は培地のみで処理する。２４時間予備処理した後、試験上清の新しい希釈物をｌＸｌ０’アイメリア・テネラスポロゾイトおよび１μＣｉウエル３［Ｈ］−ウラシルと共に細胞に添加する。培養物を前記のようにしてさらに２４時間培養し、収穫し、計数する。試験上清は１：８希釈物により未処理対照（培地のみ）に比較して平均ｃｐｍで３０％減少する場合に陽性と考えられる。

第８表寄生虫阻害試験処理　細胞源　鳥の日令　抗原刺激物　阻害（％）ＮＥ　ＬＰＬ　１５日　７２時間　１７％抗原なし　４７ＮＥ／ＣＬＰＩ、　１５日　７２時間　４０％抗原なし　５４％ＵＩ／ＣＬＰＬ　１５日　７２時間　７％抗原なし　４３％対照試験：ＵＩ　膵臓　２１日　ｃｏｎＡ　５４％−−−培地のみ　Ｏ％ＬＰＬ＝固有層リンパ球ＮＥ＝自然暴露（５日間毎日５００オーシストを与える）本発明の種々の変法も本明細書に含まれ、当業者には自明であると考えられる。

例えば、他の適当な鳥病原体を用いて本明細書において記載したコクシジウム抗原と類似の抗原を産生できると考えられる。このように、コクシジウム以外の病原体に対するワクチンは前記発明の知見を用いてえることができる。このような本発明の組成物および方法の修飾および変更も本発明に包含されると考えられる。

フロントページの続き（５１）　ｆａｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１００　Ｃ９２８２−４ＢＣ１２Ｑ　１／１８　６８０７−４Ｂ（７２）発明者　ラフバーロウ、パトリシアアメリカ合衆国カリフォルニア州９５８１９、サクラメント、コロマ・ウェイ６０番Ｉ（７２）発明者　ミラー、ティモジ−・ジェイアメリカ合衆国ペンシルベニア州１９３５５、マルバーン、フレストサイド・ウェイ１０２番

Claims

【特許請求の範囲】

１．トリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系。
２．ＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｐ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９７）およびそれ由来のクローンである請求項１記載の細胞系。
３．ＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９５）およびそれ由来のクローンである請求項２記載の細胞系。
４．ＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９６）およびそれ由来のクローンである請求項２記載の細胞系。
５．選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系。
６．選択されたトリ寄生虫に感染したＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｐ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１０４９７）である請求項５記載の細胞系。
７．選択されたトリ寄生虫に感染したＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９５）である請求項５記載の細胞系。
８．選択されたトリ寄生虫に感染したＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９６）である請求項５記載の細胞系。
９．寄生虫がアイメリア種由来のものである請求項５記載の細胞系。
１０．寄生虫がアイメリア・テネラである請求項９記載の細胞系。
１１．継代非リンパ性細胞中の外因性蛋白質の複製および発現を方向づけることができる適当な調節配列の制御下で、該外因性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションしたトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系。
１２．非リンパ性細胞系が、ＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｐ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９７）、ＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｆ７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９５）、ＳＢ−ＣＥＶ−１＼Ｇ７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０４９６）およびそれ由来のクローンからなる群より選択される請求項１１記載の細胞系。
１３．継代非リンパ性細胞中の外因性蛋白質の複製および発現を方向づけることができる適当な調節配列の制御下で、該外因性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションしたトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される組換え抗原。
１４．選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養し、それから細胞培養物成分を収穫することを特徴とする抗コクシジウム症ワクチンの製造法。
１５．選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される病原体抗原組成物からなるコクシジウム症用のワクチン成分。
１６．細胞系からの全細胞抽出物またはそのサブフラクションからなる請求項１５記載のワクチン成分。
１７．細胞系からの修飾全細胞抽出物またはその修飾サブフラクションからなる請求項１５記載のワクチン成分。
１８．家禽における感染に対する防御を誘起することができ、選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される病原体抗原組成物からなる少なくとも１種のコクシジウム症用のワクチン成分を含有するワクチンであって、該成分が適当な担体またはアジュバントと任意に組合わされているコクシジウム症用ワクチン。
１９．家禽における感染に対する防御を誘起することができ、選択されたトリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することにより産生される病原体抗原組成物からなる少なくとも１種のコクシジウム症用のワクチン成分を含有するワクチンであって、該成分が適当な担体またはアジュバントと任意に組合わされているコクシジウム症用ワクチンを有効量動物に投与することからなる、寄生虫が起こすコクンジウム症による感染に対する家禽の予防接種法。
２０．継代非リンパ性細胞中の外因性蛋白質の複製および発現能を有する適当な調節配列の制御下、トリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を、該外因性蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションし、適当な培養条件下、トランスフェクションされた細胞系を培養して組換え抗原を産生することからなるトリ組換え抗原の製造法。
２１．トリ寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を選択された抗寄生虫剤に暴露し、細胞系に対する影響および寄生虫活性を試験することからなる寄生虫の選択された細胞内形体の成育を阻害または抑制する試薬のドラッグスクリーニング法。
２２．アイメリア寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養することからなるアイメリア種のトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製方法。
２３．アイメリア寄生虫に感染したトリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する継代非リンパ性細胞系を培養し、調節培地から寄生虫ＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質を回収することからなる細胞内アイメリア構造物から寄生虫ＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質を産生する方法。
２４．トリ・コクシジウムのプレパテント生活環の複製能を有する新規な継代非リンパ性細胞系中、選択された病原体を培養することからなる病原体の培養方法。