JPH07505285A - エンド−β−１，４−グルカナーゼ及びＤＮＡ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンド−β−１，４−グルカナーゼ及びＤＮＡ配列本発明は、エンド−β−１， ４−グルカナーゼ、対応するＤＮＡ配列、ベクター、形質転換された宿主、エン ド−β−１，４−グルカナーゼの生産方法、酵素調製、及びエンド−β−１，４ −グルカナーゼの使用を含んで成る。

本発明は、遺伝子工学に関係し、そしてエンド−β−１，４−グルカナーゼの部 分的アミノ酸配列及び部分的ＤＮＡ配列を提供する。

エンド−β−１，４−グルカナーゼ（Ｈｅ番号３．２．１．４）は、セルロース 、リケニン、穀物９β−Ｄ−グルカン及びセルロース部分を含む他の植物材料に おける１、４−β−Ｄ−グルコシド結合のエンド加水分解を触媒する加水分解酵 素のグループである。正式名称は、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グル カノ・ヒドロラーゼであるが、その短縮用語であるエンド−β−１，４−グルカ ナーゼを、請求項と共に本明細書中で使用する。Ｒ，Ｆ、Ｇｏｕｌｄ、　”Ｃｅ １ｌｕｌａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”、　Ａｄｖ ａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５ｅｒｉｅｓ　５５．　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ（１９６９）、　Ｔ、Ｍ、　Ｗｏｏｄ 、　”Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅ　ｏｆ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅｓ”ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、　ｎｏ、　５．　ＪｏｈｎＷｉｌ ｅｙ、　ｌ１ｌ−１３７（１９７５）、　Ｙ、−Ｈ，Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｌ、Ｔ、 　Ｆａｎ“、　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｄｅ　ｏｆ　Ａｃｔｉｏｎ 　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｅ″、　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ　１ｎ　Ａ、Ｈ，Ｒｏｕｓｅ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍ ｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ 、　２８３−３３０（１９８０）、　Ｔ、−Ｍ、　Ｅｎｖｅｒｉ、　”Ｍｉｃｒ ｏｂｉａｌ　Ｃｅ１ｌｕｌａｓｅｓ’ｉｎ　Ｗ、Ｍ、　Ｆｏｇａｒｔｙ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ａ ｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　１８３−２２４（１ ９８３）を参照することができる。

セルロースは、多くのガムと関連して在り、そしてそれらは１、寒天、及び果実 ペクチンと一緒に在り、そしてそれらは、例えば、果実、野菜及び穀物において 細胞壁の成分である。

上記の部分的なアミノ酸配列は、そのような酵素を発現する生物のためのゲノム のライブラリー、又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用す ることができるＤＮＡプローブの構築のために使用されることができ、これによ り、親ＤＮＡ分子がそこから生じた微生物種内に挿入された場合に、エンド−β −１，４−グルカナーゼの過剰生産のための、又は非形質転換条件においてエン ド−β−１，４−グルカナーゼと密接に関係するいかなる酵素をも生産しない宿 主微生物内に挿入された場合に、密接に関係する酵素を伴わないでエンド−β− １，４−グルカナーゼの生産のための、いずれかのために使用することができる ＤＮＡを得ることができる。以下、明らかになろうが、上記のＤＮＡ配列は、他 の方法により確立することができる。

したがって、本発明の目的は、新規エンド−β−１，４−グルカナーゼの提供並 びに今まで可能なものよりもよりもよい収率及びより高い純度でエンド−β−１ ，４−グルカナーゼを生産する方法及び手段の提供、そして今まで可能なものよ りもより有効な植物の細胞壁組織の分解のための単独で又は他の酵素と組み合わ せのいずれかにおいてのエンド−β−１，４−グルカナーゼの使用の提供にある 。元の製品における割合と比較して、エンドβ−１，４−グルカナーゼの割合が 増加しているか又は減少しているかのいずれかにある新規製品を提供することも 、本発明の目的である。

本発明に従い得られる組み換えＤＮＡ配列は、エンド−β−１，４−グルカナー ゼ活性をもつポリペプチドをコーディングしているＤＮＡ配列、又はこのような エンド−β−１，４−グルカナーゼをコーディングしている配列と相同な実質的 配列をもつＤＮＡ配列を含んで成る。

本発明に記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、それがアスペルギルス・ アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、　ＣＢＳ　１ ０１．４３から得られる精製されたエンド−β−１，４−グルカナーゼに対して 生じた抗体と免疫学的に反応性であるということを特徴とする。

本文脈中、用語”得られた（ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ）”　とは、ＣＢＳ　１ ０１．４３株により作られたエンド−β−１，４−グルカナーゼをだけではなく 、ＣＢＳ　１０１．４３株から単離されたＤＮＡ配列によりエンコードされてお り且つそのＤＮＡ配列により形質転換された宿主生物内で作られたエンド−β− １，４−グルカナーゼをも示すことを意図される。

本発明に係る組換えＤＮＡ配列をどのように作ることができるかを、以下、詳細 に説明する。

エンド−β−１，４−グルカナーゼの精製のためにアスペルギルス・アクレアタ ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）から作られる粗酵素調製物 を、以下のように生産することができる。簡潔にするために、この粗アスペルギ ルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）調製物を 、以下、Ａ、　ａ、　ｅ、　ｐという。

遺伝子供与体としてのアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ＩＩｕ ｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　ＣＢＳ　１０１．４３株は、以下の方法により、パ イロット・プラント規模で発酵された。

以下の組成。

ペプトンＤｉｒｃｏ　６　ｇ アミノリン０ｒｔａｎａ　４　ｇ グルコース　Ｉｇ 酵母エキスＤｉｒｃｏ　３　ｇ 肉エキスＤｉｆｃｏ　１．５　ｇ ＫＨｘ　ＰＯａ　Ｍｅｒｃｋ　２０　ｇ麦芽エキスＥｖｅｒｓ　２０　ｇ イオン交換Ｈ２０１０１００Ｏまで をもつ寒天基質を、Ｐｅｒｎｂａｃｈフラスコ中で調製した。

ｐＨを、５．３０と５．３５の間に調整した。次に４０ｇの寒天Ｄｉｒｃｏを添 加し、そしてその混合物を１２０℃で２０分間オートクレーブにかけた（この基 質をＥ−寒天と名付１シる）。

Ｃａ３１０１．４３株をＥ−寒天のスラント（ｓｌａｎｔ）上で培養した（３７ °Ｃ）。

このスラントからの胞子を、滅菌スキム−ミルク中に懸濁し、そしてその懸濁液 をバイアル内で凍結乾燥した。１つの凍結乾燥バイアル内の内容物をＦｅｒｎｂ ａｃｈフラスコに移した。次にそのフラスコを３０℃で１３日間インキュベート した。

以下の組成：　。

ＣａＣＯ５１，２ｋｇ グルコース　７．２ｋｇ Ｒｏｆｅｃ（コーン・ステイープ ・リカー乾燥物）　３．６ｋｇ 大豆油　１．２ｋｇ をもつ基質を５００リツターの種母発酵槽内で調製した。

水道水を添加し、約２４０リツターの全容量とした。ｐＨをＣａＣ０ｚの添加前 に約５．５に調整した。上記の基質を種母発酵槽内で１２１″Ｃにおいて１時間 滅菌した。接種前の最終容量は′Ｐ１３００リッターであった。

上記ｐｅｒｎｂａｃｈフラスコ胞子懸濁液を、種母発酵槽に移した。種母発酵の 条件は： 発酵槽のタイプ：約２．３の高さ／直径比をもつ慣用の通気及び攪拌発酵槽 撹拌：　３０Ｏｒｐｍ（２つのタービン翼）通気：３００ｎ　リッター／分 温度＝３０〜３１″Ｃ 時間、　約２８時間 であった。

接種後２８時間目付近で、＋５０１Ｊツタ−を種母発酵槽から主発酵槽に移した 。

以下の組成： 焼いた大豆粉　９０　ｋｇ ＫＨ２ＰＯａ　２０　ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠消泡剤　１５０　ｍｌをもつ基質を２５００リツターの主発 酵槽内で調製した。

水道水を添加し、約９００リツターの全容量にした。上記の焼いた大豆粉を水中 に懸濁した。ｐＨをＮａＯＨにより８．０に調整し、そしてその温度を５０℃に 上昇させた。その後、約９２５　Ａｎｓｏｎ単位のＡｌｃａｌａｓｅｏｏ、６Ｌ を、この懸濁液に添加した。この混合液を、通気無しで及び１１００ｒｐの攪拌 を伴って、５０℃及びｐＨ＝８．ｏ（Ｎａ　ｔ　ＣＯｓ添加）において４時間放 置した。その後、残りの基質成分を添加し、そしてｐＨをリン酸により約６．０ に調整した。この基質を、主発酵槽内で１２３°ＣにおいてＭ／を時間滅菌した 。接種前の最終容積は約１０８０リツターであった。

次に、＋５０リツターの種母培養液を添加した。

発酵条件は。

発酵槽のタイプ、約２．７の高さ／直径の比をもつ慣用の通気及び攪拌発酵槽 攪拌：　２５０　ｒｐｍ（２つのタービン翼）通気：　１２０Ｏｎリツタ一／分 温度：　３０”Ｃ 時間：　約１５１時間 であった。

２４発酵時間から１１６発酵時間までに、ペクチン溶液を、約８す・ツタ−７時 間の一定速度で、主発酵槽に無菌的に添加した。以下の組成 ペクチンｇｅｎｕ　”）　２２　ｋｇ 濃リン酸　６ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ■消泡剤　５０　ｍｌつ　Ｇｅｎｕペクチン（Ｃｏｐｅｎｈａ ｇｅｎ　ｐｅｃｔｉｎ　ｆａｃｔｏｒｙ　Ｌｔｄ力１らのＩｔｔ橘類タイプＮＰ ） をもつペクチン溶液を５００リツター投与タンク内で調製した。

水道水を添加し、約３２５リツターの全容量とした。この基質を、１２ビＣにお いて１時間上記投与タンク内で滅菌した。投与開始前の最終容積は、約３６０リ ツターであった。この部分の供給力く尽きた時、他の類似の部分を作った。１回 の発酵のためのペクチン溶液の全容量は、約７２５リツターであった。

約１５１時間時間の後、発酵工程を停止した。約１８５０す・ツタ−の培養プロ スを、約５°Ｃに冷却し、そしてその酵素を以下の方法（こ従って回収した。

培養プロスを、Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土（濾過助剤）によりプ レコートされた真空ドラム・フィルター（Ｄｏｒｒ　０１ｉｖｅｒ）上でドラム 濾過した。濾液を蒸発により濃縮し、培養プロスの容量の約１５％とした。濾過 助剤として０．２５％）Ｉｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌをもつ５ｅｉｔｚ濾 過シート（タイプ５ｕｐｒａ　１００）上で、その濃縮物を濾過しｔこ（以下の 表中、濾過Ｉという）。その濾液を、５．５のｐＨにおいて５６１ｇの（ＮＨ− ）　２Ｓ０４７リツターにより沈殿させ、そして濾過助剤として４％の）ｌｙｆ ｌ。

５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土を添加した。その沈殿物及び濾過助剤を、フレーム ・フィルター上の濾過により分離する。その濾過ケーキを水中に溶解し、そして 不溶部分をフレーム・フィルター上の濾過により分離する。その濾液を、濾過助 剤として０．２５％Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌをもつ５ｅｉｔｚ濾過シ ート（タイプ５ｕｐｒａ　１００）上でチェック濾過する（以下の表中、濾過Ｉ Ｉという）。この濾液を、限外濾過装置上でダイアフィルトレートする。ダイア フィルトレージョン後、この液体を１２゜７％の乾燥物含有量に濃縮する（以下 の表中、濃縮物中の乾燥物含有量という）。

プロテアーゼ活性の部分的除去のための任意の塩基処理を、この段階において実 施することができる。塩基処理を使用する場合には、それを９．２のｐＨにおい て１時間実施し、その後そのｐＨ値を５．０に調整する。

ここで、上記液体を、細菌減少の目的のために、チェック濾過及び濾過し、そし てその濾液を、５ｔａｋｅｓからの凍結乾燥装置上で凍結乾燥する。

純粋なエンド−β−１，４−グルカナーゼは、表１に示すように、Ａ。

ａ、　ｅ、　ｐ、から得られる。

表１ β−１，４−グルカナーゼの精製 アスペルギルス・アクレアタス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）酵素ブロス↓ １：　熱処理 ６０分間、６０℃ ↓ ２：　遠心分離 １２５００°ｇ１３０分間、上澄液をプール３：　限外濾過 Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅ、濾過面積２８００ｃｍ”　、膜ＮＭＷＬ 　ｔｏ、０００↓ ４：ＩＥＣ：ＷＡＴＥＲ３ＡＣＣＥＬＬ　ＱＭＡ　ｐｔ、ｕｓ；図１（カラム７ ．５°２０ｃｍ、流量７５ｍ１／分）溶出液＝　２０ｍＭ　ＴＲ［Ｓ、　ｐＨ６ ，５，増加ＮａＣ１−グラジェント０．０Ｍ−ステップ−０，０５Ｍ−線型−０ ，３Ｍ−ステ・ノブ−０，５Ｍ↓ ５：サンプル調製 硫酸アンモニウムを１．７Ｍまで添加 ↓ ６：　ＨＩＣ：　ＰＨＥＮＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　６５０（Ｍ）：図２（カ ラム：　５　”　２５ｃｍ、流量５０ｍ１／分）溶出液＝水、減少硫酸アンモニ ウム−グラジェント：１．７Ｍ−線型−０，４Ｍ−ステップ−０，０Ｍ↓ ７：　限外濾過 Ｐｉｌｔｒｏｎλ１ｉｎｉｓｅｔｔｅ、濾過面積２８００ｃｍ”　、膜ＮＭＷＬ 　１０，０００↓ ８：　ＴＥＣ：　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＡＣＤＥＡＥ−５−ＰＷ：図３（カラム０ ．８°７ｃｍ、流量２ｍｌ／分）溶出液□　２０ｍＭ　ＴＲｌ５．　ｐＨ６，５ ，増加ＮａＣｌ−グラジェント：０．０Ｍ−ステップ−０，１Ｍ−線型−０，１ ５Ｍ−ステ・ノブ−０，５Ｍ↓ エンド−β−１，４−グルカナーゼ ステップｌの補足： エンドーβ−１，４−グルカナーゼ以外の熱不安定性タンパク質の不活性化及び 凝集 ステップ２の補足： 凝集タンパク質の除去 ステップ３の補足： 小粒子及び約４０％の色の除去 ステップ４の補足： ＩＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。このエンド−β−１，４−グル カナーゼ分画を、ステップ０．２−０．２５Ｍ　ＮａＣ１からプールする。

ステップ５の補足ニ ステップ６の調製のためのサンプル調製ステップ６の補足： ＨＩＣは疎水性相互作用クロマトグラフィーである。無色のエンド−β−１，４ −グルカナーゼ画分を、０．９−０．４Ｍ硫酸アンモニウムからプールする。

ステップ７の補足ニ ステップ８の調製のための濃縮及びバッファー交換ステップ８の補足： ［ＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。活性なエンド−β−１゜４−グ ルカナーゼの両分のみをプールし、これは、ＩＥＦ（等電点電気泳動）により及 び５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルアミド・ゲル電気 泳動）／銀上で、１つのタンパク質バンドを示す。プールされた画分は、０．１ ２〜０．１４　Ｍ　ＮａＣ１のレンジにあった。

以下に示す表２は、その濃縮率が、その精製の進行とともに、どのように増加す るかを示している。

表２ ステップ　手順　蛋白　酵素活性　比活性　酵素　濃縮率（ｍｇ）　（Ｕ−ｕｎ ｉｔｓ）　（Ｕ／ｍｇ）　収率開始　粗酵素　３３０　２４０００　０．０７３ 　１００　１４　ＡｃｃｅｌｌＤＥＡＥ６．２　１７５００　２．８２３　７３ 　３９ＱＭＡ　ｐｌｕｓ ６　ｐｈｅｎｙｌｐ　４．５　１３１００　２．９１１　５５　４０Ｔｏｙｏｐ ｅａｒ１ ６５０　（Ｍ） ８　タンパク質２．４　１０１００　４．２０８　４２　５８Ｐａｃ　ＤＥＡＥ このように精製したエンド−β−１，４−グルカナーゼを、抗体の生産のための 動物の免疫感作のために使用することができる。さらに特に、本発明に係るエン ド−β−１，４−グルカナーゼに対する抗血清をＡ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｑｕ ａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　Ｂｌ ａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　１９７３ ．　Ｃｈａｐｔｅｒ　２３　、又はＡ、　Ｊ＋）ｉｌｎｓｔｏｎｅａｎｄ　Ｒ， Ｔｈｏｒｐｅ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、 　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　 １９８２　（さらに特に２７−３１ページ）により記載ることにより作ることが できる。精製免疫グロブリンを例えば、塩析（（Ｎｌ（４）　ｘ　ＳＯ４）　、 その後の透析及び例えば、ＤＥＡＥ−ｓｈｅｐｈａｄｅｘ上のイオン交換クロマ トグラフィーにより、抗血清から得ることができる。タンパク質の免疫化学的特 徴付けは、０ｕｔＣｈｅｒｌＯｒ＋ｙ二重拡ａ、　Ｃｈａｐｔｅｒｓ　３　ａｎ ｄ　４）、又はロケット電気泳動法（Ｎ、　Ａｘｅｌｓｅｎ　ｅｔ　ａ表２中に 示すＵ単位は、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性単位であり以下のように 定義する。１単位は、３０°Ｃにおいて及び１分間に、カルボキシメチル・セル ロースを１μモルのグルコースに対応する還元炭水化物に分解する酵素量である 。

アミノ酸配列 以下の部分的アミノ酸配列は、自動配列決定法（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　４３７Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）により、その精製 されたエンド−β−１，４−グルカナーゼから決定された。

Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−工１ｅ−Ｇｌｙ−５ｅｒ− Ａｓｎ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−それ故、本発明に係るエンド−β− １，４−グルカナーゼの好ましい態様は、それが以下の部分的アミノ酸配列：Ｇ ｌｕ−Ｐｈａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌｏ　（配列番号ｌ）又はそれに相同な部分 的アミノ酸配列であってエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性をもつポリペプ チドの部分でるものを示すことを特徴とする。上記部分的配列の第１番目のＡｌ ａは、Ｎ−末端のアミノ酸であると推定される。

本文脈中、用語”同族体（ｈｏｍｏ　ｌｏｇｕｅ）“とは、ある特定条件（例え ば、５ｘＳＳＣ中で前浸漬し、そして５ｘＳＳＣ，５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶 液、　５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８及び５０Ｍｇの変性音波処理ウシ 胸腺ＤＮＡの溶液中で〜４０℃において１時間前）１イブリダイズし、その後５ ０μＣｉ　３２−Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブを補った同一溶液中で〜４０℃にお いて１８時間ハイブリダイズし、その後２ｘＳＣＣ，０，２％ＳＤＳ中で４０℃ において３０分間３回洗浄する。）下でエンド−β−１，４−グルカナーゼ酵素 をコーディングしているＤＮＡと同じプローブと／’％イブリダイズするＤＮＡ によりエンコードされているポリペプチドを示すことを意図されている。さらに 特に、上記用語は、本発明に係るエンド−β−１，４−グルカナーゼをエンコー ドしている先に示した配列に少なく七も７０％相同であるＤＮＡ配列をいうこと を意図されている。本用語は、先に示したＤＮＡ配列の修飾、例えば、エンド− β−１，４−グルカナーゼの他のアミノ酸配列を生じさせないがそのＤＮＡ構築 物が導入されるところの宿主生物のコドンの用い方に一致するヌクレオチド置換 又は異なるアミノ酸配列、そしてそれ故おそらく、その生来の酵素とは異なる性 質をもつエンド−β−１，４−グルカナーゼ変異体を生じさせることができるで あろう異なるタンパク質構造を生じさせるヌクレオチド置換を含むと意図される 。可能性のある修飾の他の例は、その配列への１以上のヌクレオチドの挿入、そ の配列のいずれかの端における１以上のヌクレオチドの付加、又はその配列のい ずれかの端における又はその内での１以上のコドンの欠失である。

エンド−β−１，４〜グルカナーゼのアミノ酸配列は、ＵＷ−ＧＣＧデータバン ク、公に利用可能なデータバンク（これに関して、ＵＷは、ライスコンシン大学 の短縮形である）の中の他のタンパク質と全く相同性を示さない。

このエンド−β−１，４−グルカナーゼは、以下に示すように、さらに特徴付け される。

図４及び図５・は、それぞれ、エンド−β−１，４−グルカナーゼのｐＨ活性及 びｐＨ安定性を示す。

このエンド−β−１，４−グルカナーゼは、ｐＨ２，５においてその最適ｐＨを もつ。その主要活性（≧８０％）は、ｐＨ２−４の間のレンジにある。

エンド−β−１，４−グルカナーゼのｐＨ安定性は、室温において１時間処理さ れるとき、ｐＨ３と≧１０．５との間で良好である。この酵素は、ｐＨ３におい て安定ではない。

図６及び図７は、それぞれ、エンド−β−１，４−グルカナーゼの温度活性依存 性及び温度安定依存性を示す。

エンド−β−１，４−グルカナーゼの最適温度は、５０−６０°Ｃ付近にあり、 そしてこの温度活性レンジは、比較的広い：２０−６５℃のレンジ内で≧８０％ 活性５−７０°Ｃのレンジ内で２５０％活性。

広い温度プロフィールと共に、より酸性のレンジ（ｐＨ２−４）内でのエンド− β−１，４−グルカナーゼの上記活性は、特により低い温度（５−２０°Ｃ）に おいて、この酵素を特にワイン及びジュースの領域に好適なちととしている。

５−５０°Ｃの温度レンジ内では、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性は、 ｐ）１４．５において１時間の処理後、穎著に影響されない（最初の活性の≧８ ０％）。

分子量・３８．０００ダルトン 等電点：　ｐＨ＜　２．８ Ｋｍ−値：そのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ−速度式及びその対応Ｌｉｎ ｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ−速度式を、それぞれ図８及び図９に示す。得られた Ｋｍ−値を、基質濃度の％において表す（モル／１においてではない、この理由 は、その基質の分子量分布が均一でなく：それ故に、その分子量について正確な 数値を計算することができなかったからである）。

その理論的及び計算されたＫｍ−値は、Ｋｍ　□　０．５４％カルボキシメチル ・セルロース（ＳＥＲＶＡ　＋６１１０）である。

本発明に係るエンド−β−１，４−グルカナーゼの好ましい態様は、このエンド −β−１，４−グルカナーゼが、２．０−４．０の、好ましくは２゜５−３．３ の最適ｐＨ，２，０−３，５の、好ましくは２．５−３．１の等電点、３０，０ ００と５０．０００の間の、好ましくは３５．０００と４５．０００の間の分子 量、及び３０と７０°Ｃの間の、好ましくは４０と６５℃の間の最適温度を示す ことを特徴とする。

本発明は、本発明に係るエンド−β−１，４−グルカナーゼをエンコードしてい ることを特徴とする組換えＤＮＡ配列をも含んで成る。

本発明に係る上記組換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、それが以下の部分的なり ＮＡ配列の少なくともｌを含んで成ることを特徴とするＧＧＣＣＧＧＣＡＧＴ （配列番号２） （配列番号４） 本発明に係る組換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、以下の部分的ＤＮＡ配列を含 んで成ることを特徴とする・ＧＣＡＴＴＣＧＧＡＡ　Ｃ？ｒＧＧＧＧＴＡＴ　Ｃ ＧＡＣＴ　（配列１号５）本発明に係る上記組換えＤＮＡ配列の好ましい態様は 、それが以下の： ａ）アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔ ｕｓ）のエンド−β−１，４−グルカナーゼのＤＮＡ挿入物ｐＨ０４ｂ）　ａ） のＤＮＡ挿入物から構成される成熟エンド−β−１，４−グルカナーゼＤＮＡの ためのコーディング領域にハイブリダイズし、そして、エンド−β−１，４−グ ルカナーゼ活性をもつポリペプチドのための構造遺伝子、並びに場合によりプロ モーター、シグナルまたはリーダー・ペプチドのためのコード領域及び／または 転写ターミネータ−を含んで成るＤＮＡ配列 ｃ）　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃ ３Ｈ）を参照することができるような比較的ストリンジェントな条件下（１，０ ｘｓｓｃ、　０．１％ＳＤＳ、　６５°Ｃ）で、請求項３中に示す配列の中の１ つにハイブリダイズするのに十分な相同性をもつＤＮＡ配列 ｄ）　ａ）　、ｂ）、若しくはＣ）中に定めたＤＮＡ配列の誘導体、または ｅ）成熟エンド−β−１，４−グルカナーゼ又はそれらのシグナル・ペプチド若 しくはリーダー・ペプチドをコードし、そしてａ）、ｂ）、又はＣ）のＤＮＡ配 列に関してその遺伝子コードの意味内で縮重しているＤＮＡ配列から選ばれたＤ ＮＡ配列を含んで成るとことを特徴とする。

また、本発明は、それが本発明に係る組換えＤＮＡ配列を含んで成るとことを特 徴とするベクターを含んで成る。

本発明に係るベクターの好ましい態様は、そのプロモーターがアスペルギルス・ オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ・プロモー ターであることを特徴とする。

また、本発明は、それかが本発明に係るベクターを含むということを特徴とする 形質転換された宿主を含んで成る。

本発明に係る形質転換された宿主の好ましい態様は、その形質転換宿主がアスペ ルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株であるということを特徴とする。これに より、エンド−β−１，４−グルカナーゼの良好な生産能力を得る。

本発明に係る形質転換宿主の好ましい態様は、その形質転換宿主がアスペルギル ス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　、アスリ 、エンド−β−１，４−グルカナーゼの良好な生産能力を得る。

本発明に係る形質転換宿主の好ましい態様は、その形質転換宿主が微生物（形質 転換されない条件下では、エンド−β−１，４−グルカナーゼを生産しないか、 又は有意でない量のエンド−β−１，４−グルーβ−１，４−グルカナーゼ活性 をもつ”あつらえの”酵素調製物及び広い範囲にわたる他の望まれる特異的酵素 活性を得ることができる。

また、本発明は、本発明に係る形質転換宿主の使用によるエンド−β−１，４− グルカナーゼの生産方法を含んで成る。この方法によって、エンド−β−１，４ −グルカナーゼを、高い収率で得ることができる。

また、本発明は、本発明に係る方法により生産されたときのエンド−β−１，４ −グルカナーゼを含んで成る。そのエンド−β−１，４−グルカナーゼを、高い 収率で得ることができる。

また、本発明は、それが本発明に係るエンド−β−１，４−グルカナーゼにより 、好ましくは、少なくとも１．１の濃縮率により、濃縮された植物細胞壁の分解 または修飾のために使用可能なペクチナーゼ調製物を含むということを特徴とす る酵素調製物を含んで成る。このやり方で、そのペクチナーゼ調製物の植物細胞 壁の分解能力の上昇を得ることができる。

本発明に係る酵素調製物の好ましい態様は、ペクチナーゼ調製物のような調製物 は、非常に良好な全液化力並びにそれ故リンゴをすりつぶしたもの及び同様の生 物学的材料の著しい粘度減少を提供することがきる。これを、そのペクチナーゼ 調製物がＡ、　ａ、　ｅ、　ｐ、である場合に、本明細書の以降の章の中で記載 する。

本発明に係る酵素調製物の好ましい態様は、エンド−β−１，４−グルカナーゼ が本発明に係る方法により生産されたエンド−β−１，４−グルカナーゼである ということを特徴とする。この調製物の生産コストは比較的低い。

また、本発明は、セルロースの分解または修飾のための剤として本発明に係るエ ンド−β−１，４−グルカナーゼを使用することを含んで成る。

本発明に係るエンド−β−１，４−グルカナーゼの使用の好ましい態様は、植物 細胞壁の分解または修飾のための剤としての使用である。

現在、植物ｉ胞壁の分解は、植物細胞壁の高い分解活性のために本発明に係るエ ンド−β−１，４−グルカナーゼの最も好ましい用途である。

また、本発明は、セルロースの分解または修飾のための剤として本発明に係る酵 素調製物を使用することを含んで成る。

本発明に係る酵素調製物の使用の好ましい態様は、植物細胞壁の分解または修飾 のための剤としての使用である。現在、植物細胞壁の分解、植物細胞壁の高い分 解活性のために本発明に係る酵素調製物の最も好ましい用途である。

図１Ｏは、プラスミドｐＹＨＤ１７のマツプであり、ここで、”ＴＰ［プロモー ター”は、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のトリ オース・ホスフェート・イソメラーゼ・プロモーターを示し、′ターミネーター ′は、その転写ターミネータ−を示し、’ＡＯＩｐ”は、アンピシリン耐性を仲 介している遺伝子を示し、”２μｏｒｉ”は、酵母プラスミド２μ複製起点を示 し、そしてＵＲＡ３“は、宿主株内のウラシル欠損を補う選択マーカーをエンコ ードしている遺伝子を示す。

より切断し、Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰでフィル・インし、 そしてＣ１ａｌにより切断した。そのＤＮＡを、アガロース・ゲル上でサイズ分 画し、そして約２０００塩基対の断片を電気溶出により精製した。

上記と同じプラスミドを、Ｃ１ａｌ／Ｐｖｕｌｌにより切断し、そして約３４０ ０塩基対の断片を電気溶出により精製した。この２つの断片を、酵母ＴＰＩプロ モーターを含むプラント末端の５ｐｈｌ／ＥｃｏＲＩ断片に連結した。

９８２、　ｐｐ、　４１９−４３４）が僅かに修飾されたプラスミドから単離し ：内部Ｓｐ旧部位を、この部位のコアを構成している４塩基対を欠失することに より除去した。さらに、そのプロモーターの上流の余分な配列を、Ｂａ１ｌエン ドヌクレアーゼ処理とこれに続＜　５ｐｈＩリンカ−の付加により、除去した。

最後に、ＥｃｏＲ［リンカ−を−１０位に付加した。

これらの修飾の後、このプロモーターは、５ｐｈｌ−ＥｃｏＲＩ断片中に含まれ る。元のプロモーターと比べたこのプロモーターの効率は、上記修飾によっては 影響されないようである。得られたプラスミドｐＹＨＤ１７を図１０中に示す。

供与体生物 十分な通気を確保するための攪拌を伴って大豆が豊富な発酵培地全ＲＮＡを約７ ｇの菌糸体から単離した。その菌糸体を、液体窒素中で凍結し、そして１ｇの石 英砂と共にすり鉢内で小麦粉のコンシスチンシーまで粉砕した。そのＲＮＡをチ オシアン酸グアニジニウムにより抽出し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８９．ｏｐ、　ｃｉｔ、中に本質的に記載されたように、ＣｓＣｌを 通して遠心分離した。ポリＡ　ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグ ラフィーにより全ＲＮＡから単離した。

ｃＤＮＡ合成 製造者の取扱説明書に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｃＤＮＡ合成キットに ｎ）の付加によりその発現ベクターに適合させ、そしてアガロース・ゲル上でサ イズ分画した。５−６００塩基対よりも大きいＤＮＡのみを、そのライブラリー の構築において使用した。この適合されたｃＤＮＡを、Ｂｓｔｘ［により切断さ れた適当なベクターに連結した。（そのライブラリーのサイズを測定するための ）テスト連結の後、そのライブラリーを５０の寒天プレート上にプレートした。

（そのライブラリーのサイズに依存して）約５００から５０００までの別個のク ローンを含むプレートのそれぞれに、３ｍｌの培地を加えた。そのバクテリアを こそげ取り、１ｍｌのグリセロールを添加し、そして５０のプールとして一８０ °Ｃで保存した。残りの２ｍｌをＤＮＡ単離のために使用した。そのＤＮＡの量 が酵母形質転換細胞の必要数（以下を参照のこと）を与えるのに不十分である場 合は、−夜繁殖させた一８０°Ｃのバクテリア株の５０μｍにより接種した５０ ０ｍ１の培地（ＴＢ）から、大規模なりＮＡを調製した。

酵母ライブラリーの構築 １以上のプールからのＤＮＡを、以下に記載するように酵母中に形質転換した。

全てのバクテリア・クローンを酵母内でテストすることを確保するために、元の プール内のバクテリア・クローンの数よりも５倍多い酵母の形質転換細胞の数を 限界として設定した。

酵母の形質転換 使用した酵母株は、ｙＮＧ２３１．　（ＭＡＴ　ａｌｐｈａ、　１ｅｕ２．　ｕ ｒａ３−５２．　ｈｉｓ４−５３９゜ｐｅｐ−ｄｅｌｔａ　１．ｃｉｒ＋）であ った。１つのコロニーを、３０°Ｃにおいて一夜１０ｍ１のＹＰＤ中で増殖させ た（この培養物は、５°Ｃにおいて数日間保存できる）。

この培養物の１０．３０及び６０μｍを、１００ｍ１のＹＰＤを含む３つの振と うフラスコに添加し、そして３０°Ｃにおいて一夜振とうしながらインキュベー トした。０．３−０．４に最も近い吸光度、。。をもつ培養物を選択した。Ｂｅ ｃｋｍａｎ遠心分離装置ｌ！（スピード６．１０分間）内の５０ｍ１チユーブ内 にその細胞を収穫し、この細胞を２ｘ５ｍｌのＨ，０中に再懸濁し、先に記載し たように遠心分離し、０．ＩＭ　ＬｉＡｃ　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、１ ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５を含む５ｍｌのバッファー中に再懸濁し、そして 再び遠心分離した。この細胞を５００μｉの上記バッファー中に再懸濁し、そし て３０°Ｃにおいて６０分間インキュベートした。２５０ｇｇの担体ＤＮＡ（滅 菌サケ精子ＤＮＡ　１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして１００μｍのアリコツト を調製した。形質転換されるべきＤＮＡ（約５μｇ）をこの１００μｌのアリコ ツトに添加し、緩やかに混合し、そして３０°Ｃにおいて３０分間インキュベー トした。７００μｌの、４０％ＰＥＧ　４０００．０．ＩＭＬｉＡｃ　、１０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐＨ７，５を添加し、そしてインキュ ベーションを３０°Ｃにおいて６０分間続けた。この形質転換混合物を、４２° Ｃにおいて５分間熱ショクに供し、マイクロ遠心分離機内で短時間回転させ、＋ ００−２００μ１Ｈｉｏ中４こ再懸濁し、そしてウラシルを含まないＳＣプレー ト上にプレートし、その後３０°Ｃにおいて３日間のインキュベーションを行っ た〇 担体ＤＮＡの調製 １００ｍｇのサケの精子ＤＮＡを計量して取り出し、そして１０ｍ１の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＩ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５（ＴＥ）中に一夜溶解した。

次にこの溶液を、粘着性がなくなるまで、氷水中のプラスチック容器内で音波処 理した。次にこの溶液を、フェノール抽出し、そしてＥｔＯＨ沈降させ、そして そのペレットを洗浄し、そして５ｍｌ　ＴＥ中に再懸濁した。この吸光度２６゜ を測定し、そしてその懸濁液を１０ｍｇ／ｍｌになるまでＴＥにより希釈した。

１００ｍ１のＹＰＤ（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８１）を、アスペルギルス・オリザしながらイン キュベーションする。この菌糸体をミラクロス（ｍｉ　ｒａｃｌｏｔｈ）を通し ての濾過により収穫し、そして２００ｍ１の０．６　Ｍ　！ＪｇＳＯａにより洗 浄する。この菌糸体を１５ｍ１の１．２　Ｍ　Ｍｇ５Ｏ＜　、１０　ｍＭ　Ｎａ Ｈ２ＰＱ４　、ｐＨ＝５．８中に再懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、そし て１２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍ　（ｆＥ１２３４．バッチ１６８７を含む１ｍｌ のバッファーを添加する。５分後、１２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　ｔｙ ｐｅ　Ｈ２Ｓ）の１ｍｌを添加し、そして、顕微鏡下で検査されたサンプル内に 多数のプロトプラストが見られるまで、緩やかな攪拌を伴うインキュベーション を、３７°Ｃにおいて１．５−２．５時間続ける。

この懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を無菌チューブに移し、そして５ ｍｌの０．６Ｍソルビトール、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐｌ（＝７．Ｏ ｆニーより重層する。遠心分離を１００ｇにおいて１５分間行い、そしてそのプ ロトプラストを上記ＭｇＳＯ４クッションの上から採取する。２容量の５ＴＣ（ １，２Ｍ／ルビトール、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ□７．５．１０ ｍＭ　ＣａＣｌ　２　）をプロトプラスト懸濁液に添加し、そしてその混合物を １０００ｇにおいて５分間遠心分離する。ブトブラスト・ペレットを３ｍｌのＳ ＴＣ中に再懸濁し、そして再ペレット化する。これを繰り返す。最後に、プロト プラストを０．２−１　ｍｌのＳＴＣ中に再懸濁する。

１００μｇのプロトプラスト懸濁液を、ｉｏμｌのＳＴＣ中で、５−２５μｇの 適切なりＮＡと混合する。プロトプラストをｐ３ＳＲ２（アスペルギルス・ニジ ュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）のａｍｄＳ遺伝子を担持するプラスミド） と混合する。この混合物を室温において２５分間放置する。０．２ｍｌの６０％ ＰＥＧ　４０００（ＢＤＨ２９５７６）、１０ｍＭ　ＣａＣ１を及びｌ０ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　。

ｐｉ（＝７．５を添加し、そして注意して混合（２回）し、そして最後に０．８ ５ｍ１の上記と同し溶液を添加し、そして注意して混合する。この混合物を室温 において２５分間放置し、２５００ｇにおいて１５分間回転し、そしてそのペレ ットを２ｍｌの１．２Ｍソルビトール中に再懸濁する。もう１回沈降させた後、 そのプロトプラストを、適切なプレート上に塗り広げる。プロトプラストを、１ ．０Ｍシュクロース、ｐＨ＝７．０、窒素源としてのｌ０ｍＭアセトアミド及び 背景増殖を阻害するための２０ｍＭ　ＣｓＣ１を含む最小プレート（Ｃｏｖｅ　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ−リ３（＋９６６）５１−５６）上 に塗り広げる。３７°Ｃにおいて４−７日間のインキュベーションの後、胞子を 袷い、そして単一コロニーのために塗り広げる。この手順を繰り返し、そして２ 回の再単離の後に単一コロニーの胞子を所定の形質転換細胞として保存する。

アスペルギルス（Ａｓｐｅγｇｉｌｌａｓ　）発現ベクターの構築ベクターｐＨ ０４１４（図１１）は、（ＥＰ　２３８０２３に記載されている）プラスミドｐ ７７５の誘導体である。このプラスミドとは反対に、Ｉ］ＨＤ４１４は、そのプ ロモーターとターミネータ−の間にユニーク制限部位のストリングをもつ。この プラスミドは、そのターミネータ−の３゛末端において約２００塩基対の長い断 片（不所望のＲＥ部位を含む）を除去することにより、そして次に、そのプロモ ーターの５″末端において約２５０塩基対の長い断片（これも不所望の部位を含 む）を除去することにより構築された。この２００塩基対の部位は、Ｎａｒｌ（ ｐＵｃベクター内に位置する）及びＸｂａｌ（上記ターミネータ−へのちょうど ３′）による解裂、その後のＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰによ るその生成末端のフィル・イン、ゲル上でのベクター断片の精製、並びにベクタ ー断片の再連結、より除去された。このプラスミドは、ｐＨＤ４１３と呼ばれた 。ｐＨＤ４１３を、５ｔｕｌ（上記プロモーターの５°末端に位置する）及びＰ ｖｕｌｌ（上記ｐＵＣベクター内のもの）により切断し、ゲル上で分画し、そし て再連結し、ｐＨ０４１４を得た。図１１は、プラスミドｐＨＤ４１４のマツプ であり、ここで、”ＡＭＣターミネータ−′は、アスペルギルス・ニガー（Ａ、 　ｎ　ｉ　ｇｅｒ）のグルコアミラーゼ・ターミネータ−を示し、そして“ＴＡ ＫＡプロモーター“は、アスペルギルス・オリ発酵プロスをｐＨ６，０において ＣＭＣ上の振動粘度計により分析する。

この方法は、ＡＰ　２７５／１中に記載されており、これは、Ｎｏｖａ　Ｎｏｒ ｄｉｓｋＡ／Ｓからの要求に対して入手可能である。単位名称はＥＧＯである。

培地 ＹＰＤ：　１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン、ＨｔＯで８１０ｍ１　とし 、オートクレーブにかけ、９０ｍ１の２０％グルコース（滅菌濾過）を添加した もの ＹＰＧ−寒天：　２５ｇ／ｌのＢａｃｔａｇａｒ、　１５ｇ／ｌのグルコース、 ５ｇ／ｌのに２ＰＯ，，０，５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４−７Ｈ２０、ｐＨを５．０に 調整し、オートクレーブにかけたもの １０ＸＢａｓａｌ塩：６６．８ｇの酵母ナイトロジエン・ベース、１００ｇのコ ハク酸、６０ｇのＮａＯＨ，Ｈ２０を加えＩｏｏｏｍｌにし、滅菌濾過したもの ５Ｃ−ＵＲＡ：　９０ｍ１のＢａ５ａｌ塩、２２．５ｍｌの２０％カザミノ酸、 ９ｍｌの１％トリプトファン、Ｈ，Ｏを加え８０６ｍ１にし、オートクレーブに かけ、３．６ｍｌの５％トレオニン及び９０ｍ１の２０％グルコースを添加した ちの５Ｃ−Ｈ寒天二アミノ酸を含まない７．５ｇ／ｌの酵母ナイトロジエン・ベ ース、＋１．３ｇ／Ｉのコハク酸、６．８ｇ／ｌのＮａＯＨ，ビタミンを含まな い５．６ｇ／Ｉのカザミノ酸、Ｏ，１ｇ／Ｉのトリプトファン及び２０ｇ／ｌの 寒天（Ｂａｃｔｏ）　、１２１°Ｃにおいて２０分間オートクレーブにかけ、オ ートクレーブ後、４５０ｍ１の寒天当たり、５５ｍ１の２２％ガラクトース溶液 及び１゜８ｍｌの５％トレオニン溶液を添加したものＹＮＢ−１寒天：　３．３ ｇ／ｌのＫＨ，ＰＯ，，１６，７ｇ／ｌの寒天、ＰＨを７に調整し、＋２１″Ｃ において２０分間オートクレーブにかけ、オートクレーブ後、４５０ｍ１の寒天 当たり、アミノ酸を含まない２５ｍ１の１３．６％の酵母ナイトロジエン・ベー ス、２５ｍ１の４０％グルコース溶液、１．５ｍｌの１％Ｌ−ロイシン溶液及び １．５ｍｌの１％ヒスチジン溶液を添加したものＹＮＢ−１プロス：　ＹＮＢ− １寒天のような組成であるが上記寒天を含まないもの ＣＭＣ重層ゲル：１％アガロース、Ｏ，１Ｍクエン酸−リン酸バッファー、ｐＨ ４，５中の１％カルボキシメチル・セルロース（ＣＭＣ）　（７ＬＰＤ）。この 重層を寒天プレート上に注ぐ前に、このゲルを沸騰させ、そして次に５５°Ｃに 冷却する。

ＦＧ−４−寒天：　３５ｇ／ｌの寒天、３０ｇ／ｌの大豆粉、１５ｇ／ｌのマル トデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ　６）、５ｇ／ＩのＢａｃｔｏペプトン、ｐ Ｈ７，１２１″Ｃにおいて４０分間オートクレーブにかけたものＰＣ−４培地： 　３０ｇ／ｌの大豆粉、１５ｇ／ｌのマルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ　 ６）、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏペプトン、１２１″Ｃにおいて４０分間オートクレ ーブにかけたもの 実施例１ ５０ブールの中の約３００．０００の別個のクローンから成るアスペルギこのラ イブラリーからの２０個の別個のクローンからＤＮＡを単離し、そしてｃＤＮＡ 挿入のための分析に供した。その挿入頻度は＞９０％であることが分かり、そし てその平均的挿入物サイズは、約１４００塩基対であった。

アスペルギルス・アクレアタスのライブラリーからのＤＮＡを、酵母中に形質転 換し、そして２０−３０．０００コロニーを含むプレートをそれぞれのプールか ら得た。そのコロニーをこそげ取り、そしてグリセロール中で一８０°Ｃにおい て保存した。

ライブラリーからの酵母細胞を、全体として約２５０．０００コロニーになるよ うにＹＮＢＮ大寒に広げた。プレート当たりのコロニー数は、５０から５００ま で変動した。培養４または５日後、その寒天プレートを、２セツトの５Ｃ−Ｈ寒 天プレート上へレプリカ・プレートした。次に、上記２セツトの寒天プレートを エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性の検出のためのＣＭＣ重層ゲルにより重 層する前に、これらのプレートを３０°Ｃ（こおいて２−４日間インキュベート した。４０’Ｃ１こおいて一夜インキュベーションの後、酵素反応を、コンゴ− ・レッド（Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄ）により可視化した。最初に、１０１０−＋５の ０．５Ｍ　ｔｒｉｓ−ホウ酸バッファーｐＨ８，４をプレート上に注ぎ、そして 約３０分後除去した。

１０１０−＋５の０．５％コンゴ−・レッド溶液を、重層上に注ぎ、そして１Ｏ −２０分後に除去した。次にこのプレートを、このプレート上に１０１０−＋５ の２Ｍ　ＮａＣ１に注ぐことによりｌ又は２回洗浄した。こ、のＮａＣｌ溶液を １５−２５分後に除去した。エンド−β−１，４−グルカナーゼ陽性コロニーは 、赤色の背景上に、透明または薄い赤色の明るい領域によりコロニーとして同定 された。

酵素陽性コロニーからの細胞を、寒天上に単一コロニー単離のために広げ、そし て酵素生産単一コロニーを同定し、そして先に記載した重層法により選択した。

エンド−β−１，４−グルカナーゼ陽性酵母単離物を同定し、そして陽性を確認 した。

単離物を、５０ｍ１のガラス試験管内の２０ｍ１のＹＮＢ−１プロス中に接種し た。この試験管を３０°Ｃにおいて２日間振とうした。この細胞を３００Ｏｒｐ ｍにおいて１０分間の遠心分離により収穫した。

この細胞を、１ｍｌの０．９Ｍソルビトール、Ｏ，ＩＩＪ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ ７゜５中に再懸濁した。このペレットをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、そ してフルスピードで３０秒間回転した。この細胞を、０．４ｍｌの０．９Ｍソル ビトール、Ｏ，ＩＭ　ＥＤＴＡ　、　１４ｍＭのβ−メルカプトエタノール中に 再懸濁した。１００μｌの２ｍｇ／ｍ！チモラーゼ（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）を添加 し、そしてその懸濁液を、３７°Ｃにおいて３０分間インキュベートし、そして ３０秒回転した。このペレット（スフェロプラスト）を、０．４ｍｌのＴＥ中に 再懸濁した。９０μｍの（１，５ｍｌの０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０，０ ，６ｍｌの２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ８，０，０，６ｍｌの１０％５ＤＳ）を 添加し、そしてその懸濁液を６５°Ｃにおいて３０分間インキュベートした。８ ０μｌの５　Ｍ　ＫＯＡｃを添加し、そして懸濁液を氷上で少なくとも６０分間 インキュベートし、そしてフルスピードで１５分間回転した。上澄を、εｔＯＨ （室温）で満たした新しいチューブに移し、その後十分であるが緩やかな混合及 び３０秒間の回転を行った。このペレットを冷７０％ＥｔＯＨにより洗浄し、３ ０秒間回転し、そして室温において乾燥させた。このペレットを５０μｌのＴＥ （Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、そして１５分間回転した。その上澄を、 新しいチューブに移した。２．５ｕｌの１０ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅを添加し、 その後３７°Ｃにおいて３０分間のインキュベーションを行い、そして緩やかな 混合を伴いながら５００μｌのイソプロパツールを添加した。

この混合液を３０秒間回転し、そして上澄を除去した。このペレットに冷９６％ ＥｔＯＨで濯ぎ、そして室温において乾燥した。このＤＮＡを、約１００μｌ／ ｍｌの最終濃度となるように５０μｍ水中に溶解した。

挿入物を切除する制限酵素）１ｉｎｄｌ［Ｉ及びＸｂａ　ｌにより分析した。

この陽性クローンのいくつかの部分的ＤＮＡ配列を決定した、請求項４を参照の こと。このクローンが精製β−グルカナーゼ上のＮ末端と同一なＮ末端アミノ酸 配列をもつタンパク質をエンコードしていることが判明した。

グルカナーゼを発現させるために、上記ＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｌによ り消化し、ゲル上でサイズ分画し、そしてグルカナーゼ遺伝子に対応する断片を 精製した。この遺伝子をその後、旧ｎｄ　Ｉ　［Ｉ／Ｘｂａ　ｌ消化ｐＨＤ４１ ４に連結し、プラスミドｐＨＤ４４６を得た。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ）内でのＤＮＡの増幅の後、このプラスミドＰＨ０４ ４６を先に記載したようにアスペルギルス・オリザエ中に形質転換した。

アスペルギルス・オリザエ（ＡｓｐｅｒｇｉＬｌｕ　ｏγ１ｚａｅ　）形質転換 細胞のＦＧ−４寒天含むペトリ皿の中心に、１３の形質転換細胞のそれぞれを接 種した。３０℃において５日間のインキュベーションの後、コルク穴あけ道具に よりそのコロニーの中心から、直径４ｍｍのプラグを取り出した。このプラグを 、ＣＭＣ重層ゲル内に埋め込み、そして４０°Ｃにおいて一夜インキユベートし た。このグルカナーゼの活性を、先に記載したように、コンゴ−・レッドにより 可視化した。最も良好な形質導入細胞は、１９ｍｍにおいて明るいゾーンをもち 、そしてこれにより、０−５ｍｍの明るいゾーンを作り出したアスペルギルス・ オリザエの背景よりもよりも高いグルカナーゼ活性を証明している。これは、ア スペルギルス・オリザエにおけるエンド−β−１，４−グルカナーゼの効率的な 発現を証明している。この最良の形質転換細胞を選び、そして接種し、そしてＹ ＰＧ−寒天上で維持した。

この形質転換細胞を、ＹＰＧ−寒天スラントから、ＦＧ−４を含む５００ｍ　！ の振とうフラスコ上に接種した。良好な通気を確保するための十分な攪拌を伴う 発酵の４日後、その培養ブロスを２０００ｇにおし１て１０分間遠心分離し、そ してその上澄みを分析した。この活性は、８　ＥＧＬＩ／ペクチンは、ゲル化及 び安定化の性質をもっており、この二とかペクチンを食品工業に有用なものとし ている。それらは、食品工業、例えば柑橘類の皮むき、リンゴの圧搾または砂糖 大根のノクルブ化の廃原料から商業的に抽出される。

酸（硫酸または硝酸）による最も普通の抽出が、ペクチンの製造のために使用さ れる。２付近のｐＨでそして上昇された温度にお（＼て、ペクチンは、植物原料 から抽出され、そして沈殿の後、アルコールにより沈殿される。

この酸抽出は、い（つかの欠点：水質汚染、腐食、上記の植物細胞壁の破壊によ る濾過の問題、所望のペクチン・ポリマーの部分的破壊（ポリマー化の程度は、 商業的ペクチンの最も重要なパラメーターの中の１つである）をもつ。したがっ て、生来のペクチン・ポリマーを壊さない酵素によるペクチン抽出が、大きな利 点をもつであろうことは自明である。

ペクチン製造のための工業的なリンゴ圧搾は、化学物質又はエンド−β−１，４ −グルカナーゼのいずれかにより抽出することができるペクチンの量を比較する ために使用された。

ペクチンの化学的抽出（従来の技術） 圧搾物の可溶化部分を溶液に運ぶために、１部の圧搾物に１９部の蒸留水を加え 、そしてその混合液を沸点まで加熱した。ｐＨ値を、２ＮＨ，ＳＯ，により１． ９に調整した。この混合物を、このｐＨにおいて、９０°Ｃにおいて２．５時間 保ち、そしてその後室温に冷却する。この混合液を濾過し、そして圧搾物残渣を １０部の蒸留水により洗浄する。

１部の濾液に６部のメタノールを添加する。３０分間放置の後、その混合物を濾 過し、そして圧縮する。アルコール不溶分（ＡＩＳ）を４部のメタノールにより 洗浄し、そして濾過し、そして再び圧縮する。

得られたＡＩＳを６０°Ｃにおいて１時間乾燥させる。

このＡＩＳから、スターチの量を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ 注文番号２０７７４８）からのテスト・キットにより測定する。

得られたペクチンの量を、上記圧搾物からの乾燥物質から得られた％におけるＡ ＩＳの量の決定することにより、そしてそのＡＩＳ中の上記スターチの量を差し 引くことにより計算した。

ペクチンの酵素的抽出 １部の圧搾物に１９部のｐＨ５，０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム・ノ＜・ソファ− （０，０２％ＮａＮ　ｚによる）を添加する。３０°Ｃにおいて、この混合物を 、本発明に係る精製エンド−β−１，４−グルカナーゼの溶液により２０時間処 理する。その後、この混合物を濾過し、そして圧搾物残渣を１０部の蒸留水によ り洗浄する。

このＡＩＳを先に記載した方法で得る。

結果 化学的抽出により１７．５％のペクチンが得られたが、一方、酵素的抽出により 、使用したエンド−β−１，４−グルカナーゼの量に依存して８と１０．５％の 間を得た。

これらの結果は、エンド−β−１，４−グルカナーゼが、植物原料からのペクチ ンの酵素的抽出のための主要な酵素の中の１つであることを証明している。また 、化学的手段により、そして全ての付随する欠点を伴って、抽出することができ るペクチンの４５−６０％が環境的に妥当な方法で酵素的に抽出され得ることも 上記から明らかである。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ノボ　ノルディスクＡ／５（Ｂ）番地二ノボ　アレ （Ｃ）市・バグスバード （Ｅ）国：デンマーク （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：　ＤＫ−２８８０（Ｇ）電話：　＋４５４４４４８ ８８８（Ｈ）ファックス：　＋４５４４４９３２５６（１）テレックス：　３７ ３０４ （２）発明の名称：エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ及びＤＮＡ配列 （ｉｉｉ）配列数＝５ （ｉｖ）コンピューター読み込み形態：（Ａ）媒体形式：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティング・システ ム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　 Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（ＥＰＯ） （２）配列番号ｌに関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１９アミノ酸 （Ｂ）形二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｖｉ）起源： （Ｂ）株名：　ＣＢＳ　１０１．４３ （ｘｉ）配列：配列番号ｌ。

（２）配列番号２に関する情報・ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝６０塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）’　（ｘｉ）配列：配列番号 ２： ＣＡＧＴＣｆｌＡＣＡＧ　ＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡ　ＧＣＴＧＣＴＴＭＣＣＴＡＣ ＴＴＧＴＴＧ　ＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＡＧＴ@６０ （２）配列番号３に関する情報 （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ、６０塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （］１）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｌ）配列：配列番号３： ＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧ　ＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡ　ＣＧＡＡＣＡＣＡＣＧ　ＡＡＧ ＣＧＧＧＣＴＴ　ＣＴＧＴＴＴＴＣＧＡ　ＡＴＧＧＡＴＣＧfＡ　６０ （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、５５塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｌ）配列：配列番号４； ＴＣＣＡＡＴＧＡＧＴ　ＣＧＧＧＣＧＣＣＧＡ　ＧｎＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＴＴ ＣＧＧＡＡ　ＣｎＧＧＧＧＴＡ丁　ＣＧＡＣＴ　５５（２）配列番号５に関する 情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７５塩基対 （Ｂ）形・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配列：配列番号５： ＴＣＣＭＴＧＡＧＴ　ＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡ　ＧｎＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＴＴＣ ＧＧＡＡ　ＣＴＴＧＧＧＧＴＡＴ　ＣＧＡＣＴ　１７５ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ ＦＩＧ、　１１ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年９月−日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔ ｕｓ）、ＣＢＳ１０１．４３から得られる精製エンド−β−１，４−グルカナー ゼに対して生じた抗体と免疫学的に反応性であるエンド−β−１，４−グルカナ ーゼ。
2. ２．以下の部分的アミノ酸配列： 【配列があります】（配列番号１） 又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくと も９０％のこの配列との相同性をもつ部分的アミノ酸配列をもつ、請求項１に記 載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ。
3. ３．エンド−β−１，４−グルカナーゼが、２．０−４．０の、好ましくは２． ５−３．３の最適ｐＨ、２．０−３．５の、好ましくは２．５−３．１の等電点 、３０，０００と５０，０００との間の、好ましくは３５，０００と４５，００ ０との間の分子量、及び３０と７０℃との間の、好ましくは４０と６５℃との間 の最適温度を示す、請求項１又は２に記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ 。
4. ４．請求項１〜３に記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼをエンコードして いることを特徴とする、組換えＤＮＡ配列。
5. ５．少なくとも１の以下の部分的ＤＮＡ配列：ａ）【配列があります】（配列番 号２）ｂ）【配列があります】（配列番号３）ｃ）【配列があります】（配列番 号４）を含んで成る、請求項４に記載の組換えＤＮＡ配列。
6. ６．以下の部分的ＤＮＡ配列： 【配列があります】（配列番号５） を含んで成る、請求項５に記載の組換えＤＮＡ配列。
7. ７．ａ）ｐＨＤ４４６中のアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のエンド−β−１，４−グルカナーゼＤＮＡ挿入物 、 ｂ）ａ）のＤＮＡ挿入物から構成される成熟エンド−β−１，４−グルカナーゼ ＤＮＡのためのコーディング領域にハイプリダイズし、そしてエンド−β−１， ４−グルカナーゼ活性をもつポリペプチドのための構造遺伝子、並びに場合によ りプロモーター、シグナル又はリーダー・ペプチドのためのコーディング領域及 び／または転写ターミネーターを含んで成る、ＤＮＡ配列、 ｃ）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨ ）を参照できるような比較的ストリンジェントな条件（１．０×ＳＳＣ，０．１ ％ＳＤＳ，６５℃）下で、請求項５中に示す配列の中の１つとハイブリダイズす るのに十分な相同性をもつＤＮＡ配列、ｄ）ａ）、ｂ）若しくはｃ）中に定義し たＤＮＡ配列の誘導体、又は ｅ）成熟エンド−β−１，４−グルカナーゼ又はそれらのシグナル・ペプチド若 しくはリーダー・ペプチドをコードし、並びにａ）、ｂ）若しくはｃ）のＤＮＡ 配列に関してその遺伝子コードの意味内で縮重している、ＤＮＡ配列、から選ば れたＤＮＡ配列を含んで成る、請求項４又は５に記載の組換えＤＮＡ配列。
8. ８．請求項４〜７に記載の組換えＤＮＡ配列を含んで成るベクター。
9. ９．プロモーターがアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒ ｉｚａｅ）のタカアミラーゼ・プロモーターである、請求項８に記載のベクター 、好ましくはｐＨＤ４４６であるベクター。
10. １０．請求項８又は９に記載のベクターを含む形質転換された宿主。
11. １１．形質転換宿主がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ１１ｕｓ）株である、請 求項１０に記載の形質転換宿主。
12. １２．形質転換宿主が、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ 　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉ ｚａｅ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏ ｒｉ）の種に属する株である、請求項１１に記載の形質転換宿主。
13. １３．形質転換宿主が、形質転換されない条件においてはエンド−β−１，４− グルカナーゼを生産しない又は有意でない量においてエンド−β−１，４−グル カナーゼを生産するだけである微生物、好ましくはバチルス・エスピー（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はサッカロミセス・セレビシ エ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１０に記載の形質転換宿主。
14. １４．請求項１０〜１３に記載の形質転換宿主の使用によるエンド−β−１，４ −グルカナーゼの生産方法。
15. １５．請求項１４に記載の方法により生産されたエンド−β−１，４−グルカナ ーゼ。
16. １６．請求項１〜３に記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼにより、好まし くは少なくとも１．１の濃縮率をもって濃縮された、植物細胞壁の分解又は修飾 のために使用することができるペクチナーゼ調製物を、含むことを特徴とする酵 素調製物。
17. １７．ペクチナーゼ調製物が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に 属する微生物、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　 ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃ ｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗ ａｍｏｒｉ）又はアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉ ｚａｅ）により生産することができる、請求項１６に記載の酵素調製物。
18. １８．エンド−β−１，４−グルカナーゼが、請求項１５に記載のエンド−β− １，４−グルカナーゼである、請求項１６又は１７に記載の酵素調製物。
19. １９．セルロースの分解又は修飾のための剤としての、請求項１〜３又は１５に 記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼの使用。
20. ２０．植物細胞壁の分解又は修飾のための剤としての、請求項１９に記載の使用 。
21. ２１．セルロースの分解又は修飾のための剤としての、請求項１６〜１８に記載 の酵素調製物の使用。
22. ２２．植物細胞壁の分解又は修飾のための剤としての、請求項２１に記載の使用 。