JPH07505529A - プローブ構成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プローブ構成物および方法 １、技術分野 本発明はプローブ構成物、および標的ポリヌクチオチドにおいて選択されたシー ケンスを検出するための該構成物を使用する方法に関する。

２、参考文献 アプライド　バイオシステムズ、ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｕｓｅｒ　Ｂｕ ｌｌｅｔｉｎ、＃１１％５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　 Ｉ）ｙｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｆｏｒ　Ｕｓ ｅ　≠刀@Ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ 　（１９８９）。

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ミラー・ピー・ニスら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｗ、１（１Ｂ？）　 （１９９０）。

ムリス・ケイら、Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　１４．６８３．２０２　（１９Ｂ？ ）。

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サイキ・アール・ケイら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０：　１３５０　（１９８５ ）。

スターチャフ・イー・ビーら、Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｗ、　５２：　４２０２ 　（１９８７）。

テラベ・ニスら、Ａｎａｌ　Ｃｈｅ（５７（４）：　８３４　（１９８５）。

タウンズ・ジエイ・ケイら、Ａｎａｌ　Ｃｈｅｗ、　６３：　１１２６　（１９ ９１）。

ホワイトリイーエヌ・エムら、ＩＩ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　１４．８８３．７５ ０　（１９８９）。

ウィンーディーンら、Ｃｌ１ｎ　Ｃｈｅｗ、　３１：　１５２２　（１９９１） 。

つ・ディ・ワイら、Ｇｅｎｏｓｉｃｓ、　４：　５６０　（１９８９）。

３、発朋皮宵景 種々のＤＮＡハイブリッド形成技法は多数のシーケンス領域を含む試料中の１個 またはそれ以上の選択されたポリヌクレオチドシーゲンスを検出するために利用 できる。断片捕獲およびｔＩ識化の簡単な方法では選択されたシーケンスを含む 断片は固定化プローブにハイブリッド形成することによって捕獲される。捕獲し た断片は検出できるレポータ一部分を含む第２のプローブにハイブリッド形成に よって標識を付けることができる。

別の広く用いられる方法はサザンプロット法である。この方法では、試料中のＤ ＮＡ断片の混合物をゲル電気泳動によって分別し、次にニトロセルロースフィル ターに固定する。フィルターを１個またはそれ以上のｔｉｌｋプローブとハイブ リッド形成条件下に反応させて、プローブシーケンスを含むバンドの存在を同定 することができる。この方法は特に、一定のプローブシーケンスを含む制限酵素 ＤＮＡ消化物中の断片を同定するため、および制限断片長条型（ＲＦＬＰＳ）を 分析するために有用である。

ポリヌクレオチド試料中の一定の単数または複数のシーケンスの存在を検出する ための別のアプローチは、ポリメラーゼ饋反応（ムリス、サイキ）によるシーケ ンスの選択的増幅を含む、この方法では、選択されたシーケンスの向かい合った 末端部分に相補的なプライマーを使用して熱循環と共に、プライマー開始複製の 次の繰り返しを進める。増幅されたシーケンスは種々の技法によって容易に同定 できる。このアプローチは特にポリヌクレオチド含有試料中の低コピーシーケン スの存在を検出するため、例えば体液試料中の病原体シーケンスを検出するため に有用である。

さらに最近、プローブ連結反応方法によって既知の標的シーケンスを同定する方 法が報告された（つ・ホワイトリイ、ランデグレン、ウィンーディーン）、オリ ゴヌクレオチド連結反応アッセイ　（ＯＬＡ）として知られている１つのアプロ ーチでは、関係のある標的領域に広がる２個のプローブまたはプローブエレメン トが標的６１Ｍとハイブリッド形成される。プローブエレメントが、プローブエ レメントの向かい合った端部にて隣接する標的塩基とく塩基対を）マツチさｉる と、この２個のエレメントが連結反応によって、例えばりガーゼを用いて処理し て結合することができる。連結したプローブエレメントを次に分析して、標的シ ーケンスの存在を証明する。

このアプローチの改良では連結したプローブエレメントは１対の相補的プローブ エレメントに対して鋳型として働く、２対の相補的プローブエレメントの存在で 変性、再アニーリングおよび連結反応の連続したサイクルを用いて、標的シーケ ンスを幾何学的に増幅し、極少量の標的シーケンスを検出および／または増幅さ せる。このアプローチはまたリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）と呼ばれる。

標的ポリヌクレオチドにおいて多数のシーケンスの各々の存在または不在を検出 する際に有用な方法に対して、例えば遺伝スクリーニングの分野において、成長 する必要がある０例えば、１５０はどの異なる突然変異体が嚢胞性繊維症と関係 していた。この病気に対する遺伝的素因についてスクリーニングする際に、“嚢 胞性繊維症”の陽性の同定を行うために、関係するゲノムＤＮＡ中の可能な異な る遺伝子シーケンスの突然変異の全部を試験することが最適である。理想的には １回のアッセイで可能な突然変異の部位の全部の存在または不在について試験し たい。

これら上述の従来技術の方法は、便利な自動化した１回のアッセイフォーマット で多数の選択されたシーケンスを検出する際に使用するために容易に採用できな い、従って、ポリヌクレオチド試料中の多数の選択されたシーケンスの存在また は不在を検出するため迅速な１回のアッセイフォーマットを堤供することが望ま しい。

他の技術領域では、ＤＮＡの塩基配列決定の処理量と自動化の程度を向上させる 試みによりキャピラリー電気泳動を使用する配列決定のアプローチの開発に導か れた、例えばファングら、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　６４巻、２１４９−２１ ５４頁（１９９２）　；スウェルドロウら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ＋　１８巻、１４１５−１４１９頁（１９２０）等。これらのアプ ローチを広く応用するための主な障害は、キャピラリーの分離媒体にゲルを使用 する必要があることである。これは非常に時間を要し、信鯨できる便利な配列決 定のために十分に均一な品質をもつようにキャピラリー中にゲルを充填および／ または形成することが難しい０診断に応用するため、あるいはゲノム分析のため の高速ＤＮＡ塩基配列決定は、ゲル分離媒体に関連する時間や品質コントロール の問題なくキャピラリーに容易に充填できる篩分けしない液体媒体中で電気泳動 により大きさが異なるポリヌクレオチドを分離することができる手段が入手でき るならば、大きく前進するだろう。

４、発労色概！ 本発明は結合ポリマーのｔ荷／並進摩擦抵抗の割合を変えるための一般的方法に あり、これにより他の状態では！荷／並進摩擦抵抗の割合が実質的に等しい結合 ポリマーを篩分けしない液体媒体で電気泳動により分離することができる０通常 結合ポリマーはポリヌクレオチドまたはその’ｌｌ４Ｑ体である。好ましくは、 結合ポリマーのｉｔ電荷／並進摩擦抵抗、電荷／並進摩擦抵抗がこの結合ポリマ ーのものとは異なるポリマー鎖を結合ポリマーに結合させて変えられる。本発明 によれば、異なる種類の同じ大きさの結合ポリマーを、異なるポリマー鎖を各種 類の結合ポリマーに結合させて分離することができ、各種類の得られた共役物は 電荷／並進Ｗｌ擦抵抗が独特の比である。逆に言えば、異なる大きさの結合ポリ マーは篩分けしていない液体媒体中で実質的に同じポリマー鎖を各大きさの種類 の結合ポリマーに結合させて電気泳動により分離することができ、各種類の得ら れた共役体は篩分けしていない液体媒体中で独特の比の電？ｉｉｉ／並進摩擦抵 抗を有する。後者の例は特にＤＮＡ塩基配列決定に応用できる。

本発明は、１面では、篩分けしていない媒体中で異なるシーケンスのポリヌクレ オチドを電気泳動により識別する方法を含む０本方法を実施する際に、（ト）検 出できるレポーター標識および（ｉ　ｉ）各異なるシーケンスのポリヌクレオチ ドに電荷／並進摩擦抵抗の特有の比を分与する結合ポリマー鎖を含む、１または それ以上の異なるシーケンスのポリヌクレオチドを形成する。形成される異なる シーケンスのポリヌクレオチドは篩分けしていないマトリックス中でキャピラリ ー電気泳動によって分別され、それらの観察された電気泳動移動率に従って検出 される。

この方法に使用するポリマー鎖は実質的に非荷電の水溶性鎖、例えば異なるシー ケンス結合ポリマーに結合した鎖が異なる数のポリマー単位を存する、ポリエチ レンオキシド（ＰＥ○）単位から成る鎖またはポリペプチド鎖であってもよい。

また、荷電または非荷電の連結基によって連結した多数のサブユニットの単位か らなるポリマーも含まれる。

一般的な具体例では、本方法は核酸の塩基配列決定を行うために使用され、普通 の５°末端をもつ標識ポリヌクレオチドの混合物を大きさによって電気泳動で分 離する。好ましくは、同じポリマー鎖は標識ポリヌクレオチドと合わせて、次に キャピラリー電気泳動によって分離される共役体を形成する。以下に詳細に述べ るように、この具体例に関連した構成物は結合したポリマー鎖をもつプライマー を含む、１の具体例では、ポリヌクレオチドはスペクトルにより解像できる染料 を用いて、共役的に標識を付けたジデオキシヌクレオチドをもつ３°末端で終わ っており、各ポリヌクレオチドの３゛末端ヌクレオチドを識別することができる 。

２番目の一般的な具体例では、本方法は試料中の１またはそれ以上のシーケンス を検出するために使用される０本方法を実施する際に、１またはそれ以上のシー ケンス特異的プローブを標的ポリヌクレオチドに添加し、各プローブは標的ポリ ヌクレオチドにおける標的シーケンス中の隣接領域に結合するために有効な第１ と第２のプローブオリゴヌクレオチドを有する。第１と第２のプローブオリゴヌ クレオチドの１個はポリマー鎖で誘導される。プローブは、各プローブ中の第１ と第２のオリゴヌクレオチドをそれらの特異的標的シーケンスに結合するために 有効な条件下に標的ポリヌクレオチドと反応する０次に標的ポリヌクレオチドに 結合する第１と第２のオリゴヌクレオチドは、それらの末端サブユニットが隣接 標的塩基と塩基対であるとき、オリゴヌクレオチドの末端サブユニットを連結す るために有効な条件下に連結する０次にこのように形成した連結プローブは、続 く電気泳動分離と検出のため、標的ポリヌクレオチドから脱離する。

好適例では、ポリマー鎖は各プローブの第１のプローブのオリゴヌクレオチドに 共役結合し、各第２のプローブのオリゴヌクレオチドにレポーター標識を付ける 。

２番目の好適例では、連結プローブはプローブ結合と連結反応のサイクルを繰り 返して増幅される。連結したプローブは標的シーケンスに対して連結していない プローブを繰り返して結合し連結することによって線状に増幅される。あるいは 、連結したプローブは、共に選択された連結プローブに相補的であるシーケンス を作る第】と第２のプローブオリゴヌクレオチドの第２の対の存在で、プローブ の結合と連結のサイクルを繰り返して、指数関数的に増幅することができる。

別の具体例では、各プローブの第２のオリゴヌクし／オチドは、（＋）会合した 標的シーケンスの同じ部位において代替シーケンスに相補的であり、そして（ｉ 　ｉ）異なる検出できるレポーターを用いて誘導される、２個の代替シーケンス オリゴヌクレオチドを含む、この方法は標的シーケンスの突然変異状態を、（ａ ）そのプローブと会合した標的シーケンスを同定する各プローブのサイン電気泳 動の移動度、および（ｂ）その標的シーケンスの突然変異状態を同定するサイン レポータ一部分に従って決定することができる。

３番目の一般的な具体例では、本方法は試料中の１またはそれ以上の標的シーケ ンスを検出するためのものである。この方法では、１またはそれ以上のシーケン ス特異的プローブを標的ポリヌクレオチドに添加し、各プローブは、それぞれ標 的ポリヌクレオチド断片の相補的鎖の向かい合った末端領域と混成するために有 効な第１と第２のシーケンス特異的プライマーオリゴヌクレオチドをもつ、各プ ローブ中の第１のブライマーオリゴヌクレオチドはプローブ特異的ポリマー鎖を 用いて誘導される。プローブは標的ポリヌクレオチドに両方のプライマーオリゴ ヌクレオチドを結合するために有効な条件下に、標的ポリヌクレオチドと反応し 、そして標的ポリヌクレオチド中の標的断片はプライマー開始ポリメシーゼ鎖反 応によって増幅される０次に標的ポリヌクレオチドにおける選択されたシーケン スの存在は電気泳動分離および増幅シーケンスの検出によって決定することがで きる。

Ｉの具体例では、各第２のブライマーオリゴヌクレオチドにレポーター標識を付 け、電気泳動により分離され検出される異なるシーケンスのポリヌクレオチドは 二重鎖である。

増幅シーケンスにレポーター標識を付けるため、レポーター標識を付けたヌクレ オシドトリホスフェートの存在で増幅を行うことができる。あるいは、増幅され た標的シーケンスに、−末鎖の形で、１またはそれ以上のレポーター標識を付け たシーケンス特異的プローブを用いてハイブリッド形成によって、または二本鎖 の形で、臭化エチジウムのようなレポーターを共役または非共役結合によって標 識付けすることができる。

４番目の一般的な具体例では、試料中の１またはそれ以上の標的シーケンスの存 在を検出するため、ｌまたはそれ以上のシーケンス特異的プローブを標的ポリヌ クレオチドに添加し、各プローブは第１の一本鎖ＤＮＡ断片、および一本５ＩＲ ＮＡを含む第２の断片を含む、１の具体例では、ポリマー鎖は第４の断片に結合 し、検出できるレポーター標識は第２の断片に結合する。プローブは、第１と第 ２の断片をそれらの特異的標的シーケンスに結合するために有効な条件下に標的 ポリヌクレオチドと反応させ、ハイブリッド形成プローブをＲＮＡ／ＤＮＡ基質 に特異的なＲＮａ５ｅ酵素と反応させて、ポリマー鎖を欠いている修飾標識プロ ーブを形成する０次にプローブを電気泳動分離のための標的ポリヌクレオチドか ら脱離する。

第２の具体例では、ポリマー鎖とレポーター標識を各プローブ中の第１の断片に 結合し、ＲＮａ５ｅ酵素とハイブリッド形成プローブと反応し、第２の断片を欠 （修飾標識プローブを生成する。

酵素開裂を使用する他の具体例では、ポリマー鎖とレポーター標識を各プローブ の第１の断片の５゛末端に隣接する塩基に結合することができ、ハイブリッド形 成プローブを処理してプローブから標識塩基を酵素により開裂し、特有の電荷／ 並進摩擦抵抗をもつ標識プローブを形成する。

５番目の一般的な具体例では、試料中の１またはそれ以上の標的シーケンスを検 出するため、標的ポリヌクレオチドを固体支持体上で固定する。

１の具体例では、１またはそれ以上の異なるシーケンスのプローブを標的ポリヌ クレオチドと反応させ、そこでは各プローブは（１）検出できるレポーター標識 および（ｉ　ｉ）各異なるシーケンスのプローブに電荷／並進摩擦抵抗の特有の 比を分与する結合ポリマー饋を含む、標的ポリヌクレオチドをプローブとの反応 前または後に固体支持体上に固定することができる。固定標的ポリヌクレオチド を洗浄して非特異的結合プローブを除去した後、標的ポリヌクレオチドを変性し て標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成したプローブを脱離する０次に脱離 プローブを電気泳動により分離し検出する。好ましくは、プローブは実質的に同 じ長さである。

標的ポリヌクレオチドにおける複数の異なるシーケンスの１またはそれ以上を検 出する際に使用するためのプローブ構成物もまた本発明の１部を形成する。この 構成物は複数のシーケンス特異的プローブを含み、各々は（ａ）選択された結合 条件下に、標的シーケンスの１にポリマーを塩基特異的結合するために設計され たサブユニットのプローブ特異的シーケンスをもつ結合ポリマー、および（ｂ） 結合ポリマーに結合し、結合ポリマーの電荷／並進摩擦抵抗の比とは異なる比を もつポリマー鎖によって特徴づけられる。

１の具体例では、さらに各シーケンス特異的プローブは第２の結合ポリマーを含 み、そこではシーケンス特異的プローブ中の前述の第１および第２の結合ポリマ ーが塩基特異的方法で、選択された標的シーケンスの隣接し接触する領域に結合 するために有効であり、シーケンス特異的方法で標的シーケンスに結合したとき ２個の結合ポリマーが連結することができる。好ましくは第２の結合ポリマーは 検出できる標識を含み、第１の結合ポリマーに結合したポリマー鎖は各連結した プローブ対に、電荷／並進摩擦抵抗の特有の合わさった比を分与する。

他の具体例では、さらに構成物中の各シーケンス特異的プローブは第２の結合ポ リマーを含み、そこではシーケンス特異的プローブ中の前述の第１および第２の 結合ポリマーが、選択された二重の標的シーケンスの向かい合った鎖の向かい合 った末端領域に塩基特異的方法で結合するために有効であり、各鎖の標的領域の プライマー開始重合を可能にする。好ましくは第２の結合ポリマーは検出できる 標識を含み、第１の結合ポリマーに結合したポリマー鎖は各連結プローブ対に、 ｉ！電荷／並進摩擦抵抗特有の合わさった比を分与する。

他の具体例では、各シーケンス特異的プローブは結合ポリマー、結合ポリマーに 結合したポリマー鎖、および結合ポリマーに結合したレポーターを含む。

本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、次の本発明の詳細な説明を添付図 面と共に読むとき一層明らかになるだろう。

区屓Ω間車ｆ賑呵 図ＩＡ−ＩＤは本発明の方法の種々の具体例を行う際に使用される３つの一般的 なタイプのプローブおよびプローブエレメントを示す；図２は選択された数のへ キサポリエチレンオキシド（ＨＥＯ）ユニットを有スるポリエチレンオキシドポ リマー鎖の合成方法を示す；図３はＨＥＯユニットがビスウレタントリル連鎖に よって連結されているポリエチレングリコールポリマー鎖の合成方法を示す；図 ４Ａおよび４Ｂは図２および３のポリマー饋をポリヌクレオチドの５°末端に、 それぞれ結合するためのカンプリング反応を示す；図５は、ホスホジエステル連 鎖によって、続いて蛍光標識を付けて、ＨＥＯユニットを連続してオリゴヌクレ オチドに付加するための反応行程を示す２図６はへキサエチレンオキシド（ＨＥ Ｏ）ユニットのｌ　（ビーク２）、２（ビーク３）、および４　（ビーク４）ユ ニットを用いて誘導化する前（ビーク１）および後の２４塩基オリゴヌクレオチ ドの、篩分けしていない媒体中のキャピラリー電気泳動による電気泳動図であり ； 図７Ａ−７Ｄは標的シーケンスが塩基適合プローブエレメントの連結（ＯＬＡ） によって検出される本発明の具体例を示す；図８は図７の方法でみられる理想化 された電気泳動パターンを示し、標的ポリヌクレオチドは２個の異なる標的領域 に突然変異体を含む；図９は、ポリペプチドポリマー鎖をもち、標的分子上の隣 接プローブの連結反応によって形成された標識プローブの、篩分けしていない媒 体中の、キャピラリー電気泳動による、電気泳動図であり；図１０Ａ−１０Ｃは 本発明の具体例を示し、突然変異体は本発明によるリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）に より塩基適合プローブの連結反応によって検出される；図１１は、ポリエチレン オキシドポリマー鎖をもち、ＬＣＲ反応によって形成された標識プローブの、篩 分けしていないマトリックス中のキャピラリー電気泳動による、電気泳動図であ り； 図１２Ａ−１２Ｂは本発明の第２の具体例における工程を示し、二重ａ標識プロ ーブを生成するためプライマー開始増幅を用いる；図１３Ａおよび１．３Ｂは図 １２の方法において形成された増幅標的シーケンスに標識を付けるための代替方 法を示す；図１４Ａおよび１４Ｂは本発明の第３の一般的具体例の工程を示し、 標的結合プローブにレポーター標識ヌクレオチド付加を用いて、標識プローブ種 を形成する； 図１５Ａおよび１５Ｂは本発明の方法により、既知のシーケンスポリヌクレオチ ド断片を変更する他の方法を示す； 図１６Ａ−１６ｃは本発明の方法により、修飾された標識プローブを形成するた めの代替方法を示す；そして 図１７Ａおよび１７Ｂは、本発明の他の具体例により、修飾された標識プローブ を形成するための代替方法を示す； 図’１８Ａ−１８Ｂは、本発明によるプローブ連結方法の具体例を示す一図１９ Ａおよび１９Ｂは、本発明による修飾された標識プローブを形成するための他の 方法を示す； 図２０Ａ−２０Ｃは、本発明の他の具体例を示し、プローブは固体支持体に固定 化された標的ポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成される。

光皿Ω詳裡ム説呵 ■、定１ １標的ポリヌクレオチド”は、線状または環状−末鎖または二本鎖ＲＮＡまたは ＤＮＡ分子を含む、１個またはそれ以上の核酸分子を含むことができる。

“標的核酸シーケンス”または“標的シーケンス”は、標的ポリヌクレオチド中 のヌクレオチドの隣接するシーケンスを意味する。このようなシーケンスの“複 数”は１またはそれ以上のヌクレオチド部位につき塩基シーケンスが異なる２ま たはそれ以上の核酸シーケンスを含む。

“シーケンス特有結合ポリマー°は１個の標的核酸または塩基シーケンス特異性 をもつシーケンスサブセットシーケンスに結合するために有効なポリマーを意味 し、選択されたハイブリッド形成条件下に、試験試料中の所定の複数のシーケン スにおける任意の他の標的シーケンスまたはシーケンスサブセットに対して、実 質的に一層低い結合親和性を有する。

“異なるシーケンスのポリヌクレオチド”は異なる塩基シーケンスおよび／また は異なる数の塩基を含むポリヌクレオチドを意味する。

ポリマーの“電荷“は所定のｐｌ（でのポリマーの全体の正味の静電気電橋であ り； ポリマーの“並進摩擦抵抗”は限定された篩分けしていない液体媒体を通って電 気泳動により移動するときのポリマーの摩擦抵抗の測定値である。

“篩分けしていないマトリックス”は、相互に連結したポリマー分子のメツシュ または網目またはマトリックスを実質的に含まない液体媒体を意味する。

プローブの“電荷／並進摩擦抵抗の特有の割合°は、篩分けしていない媒体中の 特有の、すなわち、独特の、電気泳動移動によって証明される。

“キャピラリー電気泳動”はキャビラリイチュープまたはキャピラリイブレート における電気泳動を意味し、分離カラムの直径または分離プレートの厚さは約２ ５−５００μ請であり、分離媒体を通して有効な熱放散と共に結果的に媒体内の 熱対流を下げることができる。

“標識プローブは、シーケンス特異的方法で、結合ポリマーに電荷／並進摩擦抵 抗の特有の割合を分与するポリマー鎖を、選択された標的シーケンスに結合する ために有効な結合ポリマー、および検出できるレポーターまたは標識から成るプ ローブを意味する。

ルポーター゛または“標識”またはルポーター標識”は、レポーター標識抗体ま たはアビジンのような、検出できる抗リガンドに特異的に高い親和力で結合でき る、抗原またはビオチンのような、適当な検出器、またはリガンドによって標識 プローブを直接検出できる、蛍光団、発光団、ラジオアイソトープ、またはスピ ン標識を指す。

ここで用いられる語“鎖終始ヌクレオチド１は、核酸ポリメラーゼによって成長 するＤＮＡ鎖に組み込まれた後に、さらにポリヌクレオチド饋が伸長または拡大 することを妨げるヌクレオチドまたはそのＩＩ憤体を意味する０通常、このよう なヌクレオチドの饋終始の性質は糖部分の３°　ヒドロキシル基の不在または修 飾による、好ましくは鎖終始ヌクレオチドは２°、３°　−ジデオキシヌクレオ チドである。

ここで使用されるように、１組の染料に関して“スペクトルにより分解できる” の語は、染料の蛍光放出バンドが充分にはっきりしている、すなわち充分にオー バーランプしていないことを意味し、各染料が結合している標的物質、例えばポ リヌクレオチドが、標準光構出装置により各染料によって生じた蛍光信号を基礎 として識別でき、例えば、米国特許４，２３０，５５８．４，８１１，２１８等 、またはフィーレスら％　ｐｇｓ、２１−７６＋　ｉｎ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍ ｅｔｒｙ　：　Ｉｎ５ｔｒｕｓ＋ｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤａｔａＡｎａｌ 凾唐奄刀@（Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５）に記載されている装 置によって例示されるようなバンドパスフィルターおよび光電子増倍管の装置を 用いる。

ここで用いられる語“ヌクレオシドトリホスフェート前駆体゛は、デオキシアデ ノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ＣＴ Ｐ）　、デオキシグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）　、およびチミジント リホスフェート（ＴＴＰ）　、またはその類似体、例えばデオキシイノシントリ ホスフェ−）　（ＩＴＰ）　、？−デアザデオキシグアノシントリホスフェート 等を意味する。

比立ゴ１肋 このセクションでは本発明に使用するために設計されたプローブの幾つかの具体 例を述べる０代表的な場合は、プローブは、セクションＩＩＩに記載した方法に 従って、複数の標的シーケンスの１またはそれ以上を検出するために使用される 複数のプローブを含むプローブ構成物の１部である６図ＩＢおよび１ｃを参照し て記載したプローブは本発明に従ってプローブ構成物を作成するプローブまたは プローブエレメントを代表する。

Ａ、プ旦ニブ構】 ［ＥＩＩＡは本発明方法の１つの具体例で使用される複数のプローブの１つであ るプローブ２０を示す、以下に示すように、プローブの２０のようなプローブを 含むプローブ構成物は、図ＩＡの点線２６によって示される標的ポリヌクレオチ ドの領域２４のシーケンスのような、標的シーケンスを同定する“プローブ伸長 ”方法で、または、このような標的シーケンスを同定するための゛プローブ捕獲 ”方法で使用するために設計される０両方法は以下のセクションＩＶで述べる。

プローブ２０は、必須の塩基対特異性のために、好ましくは少なくと６１０−２ ０塩基を含むオリゴヌクレオチド結合ポリマー２２を含み、−末鎖形態と同様に 、標的ポリヌクレオチド２６において領域２４に相補的である塩基シーケンスを 有する。この構成物の他のプローブは標的ポリヌクレオチドにおいて既知のシー ケンスの他の標的領域に対してシーケンス特異性をもつ、好適例では、異なるシ ーケンスプローブ全部の結合ポリマーはほぼ同じ長さであり、実質的に同じハイ ブリッド形成反応の動態及び熱力学（Ｔ、）をもつ標的ポリヌクレオチドに異な るプローブのハイブリッド形成を可能にする。

チオホスホジエステル連鎖をもつデオキシヌクレオチドのようなポリヌクレオチ ドの類似体であり、そして−末鎖または二本鎖標的ポリヌクレオチドに塩基特異 的に結合できる他の結合ポリマーもまた予想される。荷電していないがデオキシ リボヌクレオシドサブユニット間の立体異性メチルホスホネート連鎖が報告され た（ミラー、１９７９．１９８０．１９９０、ムラカミ、ブレイク、１９８５ａ 、　１９８５ｂ）　、また種々のｍ４Ｄの荷電していないホスホルアミデート結 合オリゴヌクレオチドＩＩ（ＩＩＩ体も報告された（フレーシー）、また、アキ ラルな荷電していないインターサブユニット連鎖（スタチャク）をもつデオキシ リボヌクレオシド類似体およびアキラルなインターサブユニット連鎖をもつ荷電 していないモルホリノに基づくポリマーが報告された（米国特許第５，０３４， ５０６号）、このような結合ポリマーはワトソンークリック型塩基対によって一 本鎖標的分子にシーケンス特異的に結合するために、または二本鎖核酸の主要溝 中のフーグスティーン型結合部位によって二本ｇ４ａＩ的ポリヌクレオチドにシ ーケンス特異的に結合するために設計することができる（コンバーブ）。

プローブ中の結合ポリマーは、上記のように、所定の割合の電荷／並進摩擦抵抗 を有し、この割合はプローブ構成物を作る複数のプローブの異なるシーケンス結 合ポリマー全部に対して実質的に同じであることができる。これは篩分けしてい ない媒体において電気泳動によって異なる大きさくサブユニット数）およびシー ケンスを有するオリゴヌクレオチドの似ている移動速度によって証明される。

プローブ２０中のオリゴヌクレオチド結合ポリマーは、その５゛末端で、Ｎサブ ユニット２８から成るポリマー１に２７で誘導化される。このユニットはポリマ ーのサブユニットまたはサブユニット群であることができる０例示的なポリマー 鎮はポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリペプチド、オリ ゴ糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、お よびそれらのブロックコポリマーから形成され、荷電または非荷電連結基によっ て連結された多数のサブユニットのユニットから成るポリマーを含む。

本発明の重要な特徴によれば、ポリマー鎖は結合ポリマーのそれとは異なる電荷 ／並進摩擦抵抗の比を存する。以下のセクション■に詳述した本発明の方法にお いて、プローブを処理してシーフェンス特異的方法で標的ンークエンスに結合し たこれらのプローブを選択的に修飾し、以下のセクションｍに述べるように、篩 分けしていないマトリックス中特有の電気泳動の移動によって証拠となるように 、電荷／並進摩擦係数の特徴的な比をもつ修飾した標識プローブを生成する。

以下にのべるように、電荷／並進摩擦係数の特徴的な比はポリマー鎖の長さくサ ブユニットの数）の差によって概して達成される。しかし、ポリマー鎖電荷の差 はまた、結合するポリマー長の差であると考えられる。

さらに一般的に、ポリマー鎖を形成するポリマーはホモポリマー、ランダムポリ マー、またはブロックコポリマーであり、ポリマーは直線、くし状、分枝状また は樹枝状構造をもつことができる。さらに、本発明は単一点で会合した結合ポリ マーに付着した一末鎖ポリマーに関してここでは述べているが、本発明はまた１ 個以上のポリマ２鎖エレメントによって誘導される結合ポリマーを企図しており 、そこではエレメントはポリマー鎖を集合的に形成する。

好ましいポリマー鎖は親水性、またはオリゴヌクレオチド結合ポリマーに結合す るときプローブが容易に水性媒体に溶解することを保証するために少な（とも十 分に親水性であるものである。またポリマー鎖はハイブリッド形成反応の影響を 受けるべきではない、結合ポリマーが、オリゴヌクレオチドの場合のように、大 きく荷電している場合、ポリマー鎖は荷電せず、または結合ポリマーのそれより も実質的に小さい電荷／サブユニット密度を有する。

遺灰された長さのポリマー鎖を、単独にまたは単一プローブ固和合成方法の一部 として、合成する方法は、ポリマー鎖の好ましい性質と共に、以下に記載される 。

以下に述べる好ましい具体例のひとつでは、ポリマー鎮はへキサエチレンオキシ ド（ＨＥＯ）ユニットから形成され、ＨＥＯユニットは両端を突き合わせて結合 し、図２に示したように、エチレンオキシドサブユニットのこわれていない鎖を 形成するか、以下に述べるように、または荷電（図５）または荷電していない（ 図３）連鎖によって結合される。以下に例示する他の具体例はＮ１２量体ＰＥＯ ユニットから成る鎖、およびＮテトラペプチドユニットから成る鎖を含む。

Ｂ、プローブ構成物 −のプローブまたはプローブセットとして、本発明による構成物を形成する３個 の追加のプローブまたはプローブエレメント対を記載する。

図ＩＢは一本鎖標的ポリヌクレオチド２３の領域にシーケンス特異的に結合する ために設計されたポリマー２１を結合するシーケンス特異的オリゴヌクレオチド を有するプローブ２５を示す、これによって結合ポリマーは、一定のハイブリッ ド形成条件下に、それぞれ選ばれた一本鎖または二本鎖標的シーケンスと安定な 二重または三重ハイブリッドを形成するために有効なサブユニットのシーケンス を含むことを意味する。以下の図１７を参照して示されるように、結合ポリマー はＤＮＡとＲＮＡ断片の両方を含む、Ｎユニット３３から成るポリマー鎖３１は その５゛末端で結合ポリマーに結合し、下記のように、特有の電荷／並進摩擦抵 抗の比を結合ポリマーに与える。結合ポリマーの３゛末端はレポーターまたはタ グ３９を用いて誘導される。ある面では、本発明は複数のこのようなプローブを 含む構成物を含み、各々は関係する異なる標的領域に対して標的となる異なるシ ーケンス結合ポリマーを有し、各々は会合したポリマー鎖によって与えられる特 有の電？ｉｉｉ／並進摩擦抵抗の比を有する。

図ＩＣは、第１および第２のプローブエレメント３４．３６から成るプローブ３ ２を示し、特に点線４０によって示した標的ポリヌクレオチドの１またはそれ以 上の各領域、例えば領域３８において選択シーケンスを検出するために設計され る。

具体例で示すと、関係するシーケンスが突然変異、例えば点突然変異、または１ または少数の塩基を含む追加または削除型突然変異を含むことができる０代表的 な例では、突然変異の期待部位は既知のシーケンス標的領域の中心点付近であり 、その領域を２つの副領域に分ける０例示すると、突然変異が点突然変異であり 、突然変異の期待される部位が２個の隣接塩基Ｔ−Ｇの１個にあり、Ｔ塩基は副 領域３８ａの５゛末端を画定し、隣接Ｇ塩基は隣接副領域３８ｂの３°末端を画 定する。以下に示すように、プローブエレメントはまた種々の他のタイプの標的 シーケンス、例えば病原体に関連したシーケンスまたは特定のゲノム遺伝子シー ケンスを検出するためにを用である。

プローブ構成物において第１のプローブエレメントの代表であるプローブエレメ ント３２は、必須の塩基対特異性のため、好ましくは少なくとも１０−２０塩基 を含むポリマーエレメント４２を結合するオリゴヌクレオチドから成り、標的ポ リヌクレオチド中の副領域３８ａに相補的である塩基シーケンスを有する。特に 、３”末端ヌクレオチド塩基は対応する副領域、例えば図に示したＡＣＴマツチ ングの５゜末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩基に対して選択される。第 １のプローブエレメントのオリゴヌクレオチドは、その５°末端にて、ユニット ２日から形成された鎖２７に関して実質的に述べたように、好ましくはユニット ４５を繰り返すＮから成るポリマーＭ４４と共に、誘導される。プローブ２０に 関して述べたように、第１のプローブエレメントのポリマー鎖は、電荷／並進摩 擦抵抗の比を与え、これは構成物中の各シーケンス特異的プローブエレメントに 対して特有である。

プローブ構成物において第２のプローブエレメントの代表でもある第２のプロー ブエレメント３６は、必須の塩基対特異性のため、好ましくは少なくとも１０− ２０塩基を含むオリゴヌクレオチドポリマー結合エレメント４６から成り、標的 ポリヌクレオチド中の副領域３８ｂに相補的である塩基シーケンスを有する。特 に、５゜末端ヌクレオチド塩基は対応する副領域、例えば図に示したＣＯＧマツ チングの３°末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩基に対して選択される。

図ＩＣに示すよ・うに、２個のプローブエレメントがそれらの会合標的領域に対 し共にハイブリッド形成するとき、２個のプローブにおける対面する末端サブユ ニット、この実施例では対面するＡおよびＣの塩基は、隣接する塩基、例えば標 的ポリヌクレオチドにおける隣接するＴおよびＧ塩基とマツチする。この状態で は、２個のプローブエレメントはそれらの対面する末端で連結することができ、 以下に述べる本発明の１具体例に従って、両方のオリゴヌクレオチドエレメント を含む連結プローブを形成し、シーケンス特異的ポリマー鎖および結合オリゴヌ クレオチドの反対側末端に結合したレポーターを有する。この２個のプローブに おける隣接塩基の状態が、標的領域に対しプローブをハイブリ、ド形成した後、 エキソヌクレアーゼ処理によってオーバーラツプするデオキシリボヌクレオチド を除去することにより、生成されることもできることが認められるだろう。

第２のプローブエレメントは、好ましくは、例えばその３°末端にて、図ＩＣに おいて、４日にて示されるレポーターＦのような検出できるレポーターを用いて 標識を付ける。好ましくは、このレポーターは、光学レポーター、例えば光学横 条くの標準蛍光標識、例えばＦＡＭＳＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、およびＲＯＸ、およ びオリゴヌクレオチドにレポーターを取り付ける方法が報告されている（＾ｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｗｓ＋　Ｃｏｎｎｅｌｌ）　ｍｌつの具体例では、 各プローブは２個の第２のプローブエレメントを含み、１個のエレメントは標的 シーケンスにおいてワイルドタイプの塩基と塩基対になることができる末端サブ ユニット塩基シーケンスを有し、第２のエレメントはシーケンス中の予想される 突然変異と塩基対となる末端サブユニット塩基を有する。

この２個の代替エレメントは識別できるレポーターを用いて標識を付け、以下の セフシランＩＩＩに記載するように、各標的領域中の野生型または突然変異シー ケンスの明確な同定を可能にする。あるいは２個の第２のプローブエレメント（ 例えばオリゴヌクレオチド）は同じレポーターを有し、その第１のプローブエレ メントは２個の第２のプローブエレメントに対し異なる電荷／並進摩擦抵抗の比 を与えるポリマー鎖をもち、２個の標的領域を電気泳動の移動度に基づき識別す ることができる。

図ＩＤは本発明方法の他の具体例で使用するために設計された構成物中のプロー ブを代表するプローブ５０を示す、プローブは、第１と第２のブライマーエレメ ント５２．５４から成り、ブライマーエレメントシーケンスによって結合される 二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける領域の存在または不在を検出するために特 に設計されている０図ＩＤに示す例において、ブライマーシーケンスによって結 合したＱ域は５６で示され、二本鎖標的ポリヌクレオチドの二本の鎖は点線５８ ．６０で示される。

プローブ構成物において第１のブライマーエレメントを代表するブライマーエレ メント５２は、必須の塩基対特異性に対し、少なくとも７−１５塩基を好ましく は含むオリゴヌクレオチドブライマーエレメント６２から成り、そして２個の標 的鎖の１個、この場合は、鎖５８における領域５６の３°末端部位に相補的であ る塩基シーケンスをもつ。

オリゴヌクレオチドブライマーは、その５°末端で、ユニット２８から形成され る鎖２７に関して実質的に記載したように、好ましくはユニット６６を繰り返す Ｎから成るポリマー鎖６４を用いて誘導される。プローブ２０に関して述べたよ うに、第１のプローブエレメントのポリマー鎖は構成物中の各シーケンスに特異 的なブライマーエレメントに特有な電荷／並進摩擦抵抗の比を−与える。

第２のブライマーエレメント５４は、これもプローブ構成物中の第２のプローブ エレメントを代表し、必須の塩基対特異性に対し、やはり少なくとも７−１５塩 基対を好ましくは含むオリゴヌクレオチドブライマーエレメント６８から成り、 そして反対側の鎖−一この場合には、領域５６を形成する二重のＤＮＡの鎖６０ の５°末端部位に相補的である塩基シーケンスをもつ、第２のブライマーエレメ ントは、上述のように、検出できるレポーターを用いて標識を付ける。あるいは 、標識付けは、以下に述べるように、増幅した標的シーケンスを形成した後に行 うことができる。

０．１旦二ズ珂製 プローブにおけるポリマー鎖を調製する方法は一般に既知のポリマーサブユニッ ト合成方法に従う０選択された長さのＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）鎖の形成 方法は以下に示され、そして実施例１−４において詳述する。これらの方法は、 一定の大きさのマルチサブユニットポリマーユニットを直接または荷電したまた は荷電していない連結基を介して、互いにカップリングすることを含み、広範囲 のポリマー、例えばポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ ウレタンポリマー、オリゴ糟に一般に応用できる。

ポリマーユニットカップリング方法は、選択された長さのコポリマー、例えばポ リプロピレンユニットと交替するポリエチレンオキシドユニットのコポリマーを 合成するために適当である０選択された長さのポリペプチドとアミノ酸構成物ホ モポリマーまたは混合ポリマーのいずれかは、実施例５に略述したように、標準 の固相方法によって合成することができる。

図２は選択された数のＨＥＯユニットを有するＰＥＯ鎖を調製するためあ１方法 を示す０図に示すように、ＨＥＯ（ヘキサエチレンオキシド）はジメトキシトリ チル（ＤＭＴ）で一端が保護され、その他端でメタンスルホネートで活性化する 。活性化したＨＥＯは次にＤＭＴ−保１１ＨＥＯダイマーを形成するため、第２ のＤＭＴ保ｉｌｌ　ＨＥ　Ｏ基と反応することができる。このユニット付加は連 続して所望のＰＥＯ鎖長になる蛮行われる。この方法の詳細は実施例１に与えら れる。

実施例２は荷電していないビスウレタントリル基によってＨＥＯユニットを連続 してカップリングすることを記載する。簡単に述べると、図３に間して、ＨＥＯ は穏和な条件でトリレン−２，４−ジイソシアネートの２ユニツトと反応し、活 性化したＨＥＯは次にＨＥ　Ｏと両端でカップリングしてＨＥＯのビスウレタン トリル結合トリマーを形成する。

ポリマー頓とオリゴヌクレオチドのカップリングは従来のホスホルアミダイトオ リゴヌクレオチド合成方法の拡充によって、または他の標準カップリング方法に よって行うことができる０図４Ａは、ホスホルアミダイトカップリングによって 、固体支持体上に形成されたオリゴヌクレオチドの５°末端にＰＥＯポリマー鎖 をカップリングすることを示す０図４Ｂは、やはりホスホルアミダイトカップリ ングによって、上記ビスウレタントリル結合ポリマー鎖を固体支持体上でオリゴ ヌクレオチドにカンプリングすることを示す、２つのカップリング方法の詳細は 、それぞれ、実施例３Ｂおよび３Ｃに示される。

また、ポリマー頷は、標準固相合成方法を用いて、ポリマ２鎖ユニットをオリゴ ヌクレオチドに段階的に付加することによって、オリゴヌクレオチド（または他 のシーケンス特異的結合ポリマー）に作り上げることができる０図５は固体支持 体上に固相合成によって形成されたオリゴヌクレオチドにＨＥＯユニットを段階 的に付加することを示す０本質的に、この方法は、段階的ヌクレオチド付加を行 う際に使用される同じホスホルアミダイト活性化および脱保護工程に従う、詳細 は実施例４に示される。実施例５はオリゴヌクレオチドに選択された長さのポリ ペプチド鎖を形成するための同様の方法を記載している。

上記のように、ポリマー鎖はそのプローブに、各々異なるシーケンスプローブに 特有な１を荷／並進摩擦抵抗の比を与える。ポリマー鎖が誘導結合ポリマーの移 動を行う寄与は一般にポリマー鎖のサブユニット長に依存する。しかし、荷電基 をポリマー饋、例えば図５に示したＰＥ０４ｌ中の荷電した連結基、またはポリ ペプチド鎖中の荷電したアミノ酸に付加することも使用され、プローブにおける 選択された電荷／並進摩擦抵抗特性を達成することができる。

よ五分離 本発明の重要な特徴によれば、それ自体が篩分けしていない媒体中で電気泳動に よって分離することができない異なる長さおよび／または異なるシーケンス結合 のポリマーを有するプローブは、僅かに異なる大きさおよび／または１を荷の差 をもつポリマー鎖を用いる誘導化によって精細に分離することができる。

次の説明について、“プローブ”の語は、異なるシーケンスのポリヌクレオチド を含むと解釈できると理解される。

ひとつの好ましいアプローチでは、上記のように、プローブは篩分けしていない マトリックスにおいてキャピラリー電気泳動によって分別される。キャピラリー 電気泳動の利点は、十分な熱放散が媒体内の熱対流を減らしまたは実質的に除去 し、従って電気泳動によって得られる分解能を改善することである。

キャピラリー電気泳動（ＣＢ）のような電気泳動は標準方法によって行われ、電 気泳動媒体それ自体が篩分はマトリックスを含まないことを除いて、従来のＣＥ 装置を用いる。実施例６に記載したＣＢプロトコルは例示である。

図６は誘導化されていない（ピーク１）、または】、２．または４ホスホネート 連結）（ＥＯサブユニットをもつ５゛末端で誘導化されている（それぞれピーク ２．３．および４）螢光標識２４塩基オリゴヌクレオチドプローブの電気泳動図 である。プローブは実施例４に記載するように調製し、キャピラリー電気泳動は 実施例６に詳述した条件下に緩衝液媒体中で行った。

図に見られるように、プローブは、２０．３９７分、２０．６１２分、２０．９ ９４分、および２１゜５５８分の移動時間で、４本のピークに良く分解されてい る。ポリマー鎖の不在では、４個のオリゴヌクレオチドプローブは同じかまたは 実質的に同じ電気泳動移動度で移動する、すなわち、単一の分解しないピークで 動く傾向がある。（これはオリゴヌクレオチドが同じかまたは異なる大きさであ るか否がが判る（オリベラ、ヘルマンズ）、） 荷電した結合ポリマー、例えばオリゴヌクレオチドを、篩分はマトリックスの不 在で電気泳動によって分別する能力は、多くの利点を与える。ひとつの利点はす べてが殆ど同じ大きさの荷電したポリマーを分別する能力である。以下のセクシ ョン■において高く評価されるように、この特徴はプローブ構成物中のプローブ が似ている大きさ、従って標的ポリヌクレオチドと似たハイブリッド形成動力学 と熱力学（Ｔ、）をもつことを可能にする。他の利点は電気泳動、特にポリマー を篩分けするＣＥが非常に便利であり、特にキャピラリーチューブ中の架橋ゲル を形成し除去する問題が避けられる。

ＩＶ、ヱヱ皇土方法 １つの面では、本発明の方法は標的ポリヌクレオチドにおいて１またはそれ以上 の異なるシーケンス領域を検出するために設計される１本方法は、上記タイプの １またはそれ以上のシーケンス特異的プローブを、標的ポリヌクレオチドに最初 に添加することを含む、このプローブは、標的ポリヌクレオチドにおいて対応す るシーケンスにプローブのシーケンス特異的結合に有利である条件下に標的ポリ ヌクレオチドを用いて反応させる。上述のように、この結合は代表的にはワトソ ンークリック型塩基対による標的とプローブにおける相補的塩基シーケンスのハ イブリッド形成を含む。

あるいは、−末鎖プローブおよび二本鎖標的シーケンスとの間の塩基特異的水素 結合対は、フーグスティーン型塩基対を介して、代表的には重複分子の主な慣例 において（コーンバーブ）また予期される。

標的ポリヌクレオチドへのプローブ結合に続いて、プローブはシーケンス特異的 方法において標的シーケンスに結合したプローブを選択的に修飾し、修飾された 標識プローブを生成するように処理され、各々は特徴的な電荷／並進摩擦抵抗比 をもつ、この修飾工程は、以下のサブセクションＡ−Ｆに記載されるように、期 待される突然変異位置の全域で、酵素連結反応のような連結反応、選択された標 識シーケンスのプライマー開始増幅、ｔ！識を付けたヌクレオチドトリホスフェ ート分子の存在でのプローブ伸長、標的領域に結合したプローブの酵素分解、ま たは固定化標的上のプローブ捕獲によって、プローブエレメントを結合すること を含むことができる。標的結合プローブの選択的修飾によって生成された標識プ ローブは、上記セクションＩＩＴに述べたように、篩分けしていない媒体中の電 気泳動によって分別される。この修飾された標識プローブの移動速度を使用して 標識プローブと会合した特定のシーケンスを同定し、標的ポリヌクレオチドにお ける特定のシーケンスの存在を同定することができる。

Ａ、１旦ニブ這梧方法 この具体例は１またはそれ以上の領域の標的ポリヌクレオチドにおいて特定のシ ーケンスを特に検出するために設計される。標的ポリヌクレオチドは、二本鎖ま たは一本鎖のポリヌクレオチドの単一分子、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまた はＲＮＡを含むウィルスゲノム、またはポリヌクレオチドフラグメント、例えば ゲノムＤＮＡフラグメントまたは感染試料からのウィルスおよび体細胞のポリヌ クレオチドフラグメントの混合物であってもよい０代表的には、本具体例におい て、標的ポリヌクレオチドは例えば熱により変性してプローブ結合ポリマーとハ イブリッド形成できる一本ｕｉ檀的分子を形成する二本鎖ＤＮＡである。

図７Ａは一本鎖の標的ポリヌクレオチド７０の部分、例えば、図示した３°ない し５“配向をもつ二本鎖標的の“＋”鎖を示す、ポリヌクレオチドは、それぞれ ７２．７４．７６、および７８に示される複数の領域（標的シーケンスとも呼ば れる）ＲＩＲｔ−ＲｓないしＲ，、を含み、それぞれは異なる塩基シーケンスを 含む、各領域は、好ましくは約２０−８０の塩基対の間で、好ましくはほぼ同じ 長さ、すなわち、塩基対の数をもつ０本方法はまた僅かな異なるシーケンス領域 が検出される場所にも応用できるが、本方法でアッセイされるべき領域Ｒａの全 数は１００までまたはそれ以上であってもよい。

本方法は点突然変異に関して図７に示されるが、どのようにして小さい突然変異 の発生の他の型、例えば１またはそれ以上の塩基の除去または付加が本方法によ って検出できるかが正しく認識されるだろう、さらに一般的に、本方法を使用し て、同時に、標的シーケンス、例えば病原体標本の混合物と会合したシーケンス 、またはゲノムＤＮＡ断片混合物中の遺伝子シーケンスをアッセイすることがで きる。

図７Ｂは領域７４（Ｒ，）および７６（Ｒ３）を含む標的ポリヌクレオチド７ｏ の拡大部分を示す、領域７４は、隣接する塩基ＴおよびＣを含み、これら２つの 塩基で終わる２つの副領域７４ａ、７４ｂに領域を分けることを示している。Ｔ およびＣの塩基は野生型（突然変異していない）塩基であるが、これらの塩基の ひとつ、例えばＴ塩基は、関係する既知の点突然変異部位に相当する。同様に、 領域７６は、この領域をこれら２個の塩基で終わる２個の副領域７６ａ、７６ｂ に分ける隣接塩基ＧおよびＧを含む。−ＩｉＩ域７６ａのＧ塩基は野生型Ｔ塩基 から点突然変異を示し、隣接するＧ塩基は突然変異していない、このアッセイ方 法は、このような点突然変異を含む領域７４および／または７６のような標的の ｗｉ域を同定するように設計される。

このアッセイ方法に使用されるプローブ構成物は好ましくは複数のプローブエレ メント、例えば上記図ＩＢに関して記載されたものから成る。この構成物を、変 性した形で、標的ポリヌクレオチドに添加し、その成分をアニーリングしてプロ ーブエレメントを、図ＩＢに示すように、相補的シーケンス標的領域に対してハ イブリッド形成する。

構成物中のプローブのひとつは、８０で示され、一対のプローブエレメント８０ ａ、Ｂｏｂを含み、それらのシーケンスはそれぞれ標的ポリヌクレオチドの領域 ７４において対応する副領域７４ａ、７４ｂに相補的である、すなわち、プロー ブエレメントシーケンスが標的のＲｚＴｆｌ域の“−”鎖のそれらに対応してい る。特に、プローブエレメントは、エレメントが図に示すように領域７４の相補 的副領域にハイプリント形成されるとき、標的領域において隣接する塩基Ｔおよ びＣとワトソンークリック型塩基対を形成するために有効である末端サブユニッ トＡおよびＧ塩基を存する。

構成物中の他のプローブは、８２で示され、標的ポリヌクレオチドの領域７６で それぞれ対応する副領域７６ａ、７６ｂにシーケンスが相補的である一対のプロ ーブエレメント８２ａ、８２ｂを含む、この場合に、プローブエレメントは、図 に示すように、領域７６の相補的副領域に対してエレメントがハイブリッド形成 されるとき、野生型標的領域における隣接する塩基ＴおよびＣ塩基とワトソンー クリック型塩１＆灯を形成するために有効である末端サブユニッ）ＡおよびＣ塩 基を有する。しかし、示した実施例では、ＴないしＧの突然変異は会合した標的 塩基にへ末端サブユニットのワトソンークリック型塩基対を妨げる。

対応する標的シーケンスに対してプローブエレメントをアニーリングした後、反 応混合物を連結試薬、好ましくはりガーゼ酵素で処理して、封止する塩基が隣接 する標的塩基と塩基対となるプローブエレメントの対を連結する０代表的な連結 反応条件は実施例７Ａに示される。連結反応は末端サブユニットが標的塩基と塩 基対となっているプローブエレメントに対して選択的である。従って、図に示し た例では、プローブエレメント８０ａ、８０ｂは連結しているが、プローブエレ メント８２ａ、８２ｂは連結していない。

連結反応がシーケンス特異的ポリマー鎖を有するオリゴヌクレオチドを検出でき るレポーターを有するオリゴヌクレオチドに結合し、１端がプローブ特異的ポリ マー鎖を用いて、その他端で検出できる（蛍光）レポーターを用いて、１ｍを付 けたオリゴヌクレオチドから成る、連結したプローブ８４のような、標識を付け た修飾プローブを選択的に形成することは、高く評価できる。

図７Ｄに示されるように、標的プローブ複合体を変性すると、野生型の標的シー ケンスに対応する連結し標識を付けたプローブ、およびプローブエレメント末端 サブユニットにであるいはその近くで、点突然変異体に対応する連結していない プローブエレメントとの混合物を脱離する。各連結しＩＩ２を付けたプローブは ポリマー鎖を有し、これはプローブに対して、上記のように、特有のｔｉｔｉ／ ＠進摩擦抵抗比摩擦抵抗比 図７Ａ−７Ｄに示したアッセイ方法では、標的領域のひとつ（Ｒ３）は、相補的 ゛／−ケンスプローブエレメントの連結反応を妨げる突然変異体を含む、実施例 として、全体の標的ポリヌクレオチドは関心のある８個のシーケンス領域を含み 、その領域のＲ８とＲ７はプローブエレメント連結反応を妨げるタイプの突然変 異体を有し、他の６個の領域は連結し標識を付けたプローブに導く野生型シーケ ンスであると思われる８図８は連結反応アッセイ方法において期待される理想化 した電気泳動パターンを示す０図中のピーク１−８は、ＨＥＯユニットを連結し たｌ、２．３．４．５．６．７および８のような、段々長くなるポリマー鎖をも つ連結オリゴヌクレオチドプローブの予期される溶出時間である。観察された電 気泳動パターンは、図に示されるように、３と７のピーク位置でギャップを示し 、３と７の標的位置における突然変異体の証拠となる。全部の修飾されていない ＤＮＡは実質的にＮ−０のピークと共に溶出するだろう。

実施例７は本発明のこの特徴に従って、プローブ連結および分離の一般的な原理 を示す、この方法では、１または２　Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｐｈｅ−Ａｌａテトラペ プチドユニットを用いて誘導化された２５塩基オリゴヌクレオチドおよび螢光標 識２５塩基オリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成の条件下に、そのシーケン スがこの２つのオリゴヌクレオチドに広がった標的ポリヌクレオチドと混合した 。ハイブリッド形成したプローブエレメントはりガーゼを用いて処理し、１また は２のテトラペプチドユニットを有する螢光ｉｌ！プローブを形成させる。

篩分けしていない変性媒体におけるキャピラリー電気泳動は実質的に上述のよう に、また実施例７に詳述するように行われた。図９は連結反応前の螢光標識プロ ーブ（ピーク１２．６２］、）　、および４−または８−アミノ酸ポリマー鎖を 含む、プローブで連結したときの同じプローブ（それぞれ、ピーク１８．３２８ および１８．７８３）の電気泳動図を示す。図に見られるように、２つの連結プ ローブおよび非連結プローブ（ピーク１２．６２１）は篩分けしていない媒体中 でＣＢによって容易に分解される。

上記のＯＬＡ連結反応方法では、プローブの濃度は、必要ならば、繰り返される プローブエレメントハイブリッド形成と連結反応工程を用いて誘導されたプロー ブの増幅によって高めることができる。ＦＪ車な追加の（線状）増幅は標的とし て標的ポリヌクレオチドを用い、変性、アニーリング、およびプローブエレメン ト連結反応を誘導プローブが所望濃度に達するまで繰り返して達成することがで きる。

あるいは、標的ハイブリッド形成および連結反応によって形成された連結プロー ブを、公表された方法（ウィンーディーン）に従って、また実施例日に述べたよ うに、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）によって増幅することができる０図１０Ａ−１ ０Ｃに示したこの方法では、図ＩＢに関して述べたように２組のシーケンス特異 的プローブが二本鎖ＤＮＡの各標的領域に対して用いられ２、−の２本の鎖は図 １０Ａでは１７０と１７２で示されている。１７４で示した１組のプローブはプ ローブエレメント１７４ａ、１７４ｂを含み、これらは、図に示したように、鎖 １７０上の標的シーケンスの隣接する次の領域にてシーケンス特異的結合するた めに設計されており、そして１７６で示した第２の紐のプローブはプローブエレ メント１７６ａ、１７６ｂを含み、これらは、やはり図に示したように、反対側 の鎖１７２上の標的シーケンスの隣接する次の領域にシーケンス特異的に結合す るために設言１されている。

図に示されるように、図ＩＢに関し、Ｃ上述したプローブの＆１ｉ３２に＠伯し て、ブローブエし・メント１７４ａど１７６ａはポリマー鎖を用いて誘導され、 プローブエレメント１７４　ｂと１７６ｂは蛍光レポーターを用いて誘導される 。２紐のプローブを変性していない一末鎖標的シーケンスにハイブリッド形成し た後、各標的領域に結合したプローブエレメントを連結し、反応生成物を変性し て標的を付けたプローブ１７８．１８０を脱離する（図１０Ｂ）。これらの１ｍ を付けたプローブは、図１０Ｂに示すように、今は２本個の標識プローブを生成 する連結反応を用いてプローブの＆１Ｉ７４．１７６を結合するため標的基体と して供することができる。この工程を、Ｎ−２回繰り返して、図１０Ｃに示すよ うに、２Ｍ個の標識プローブ１７８．１８０を全部、理想的に生成する。

実施例８に記載した方法では２対のプローブエレメントを調製し、１ｍは、上述 のように、２または４ドデカエチレンオキシド（ＤＦ、Ｏ）のいずれかを含有す るポリマー鎮を用いて誘導化される第１のプローブ、および螢光レポーター（Ｊ ＯＢ）で標識化される第２のプローブを含む、プローブエレメントの対は嚢胞性 繊維症遺伝子のＦ５０８領域を標的とした。

３０ＬＣＲサイクルの後、２つの反応混合物からのＤＮＡは一緒にして、混合物 中に増幅し連結したプローブをＣＢによって篩分けしていない緩衝液中で変性条 件下に（８Ｍの尿素）分別した。を気泳動図を図１１に示す、ここで左側のピー ク（ピーク１９．０５８）は連結していないＪＯＢ標識プローブである。　２０ ．８４７と２２．１１８のピークは、それぞれ、２または４本のＤＥＯユニット 鎖を含む連結した増幅プローブである０図に示されるように、異なる長さのポリ マー鎮をもつ２個のプローブは、互いに、そして篩分けしていないマトリックス 中でポリマー鎖を欠いているプローブから良く分離される。

プローブ連結反応方法は複数の各標的領域で突然変異体を検出することについて 上述したが、この方法はまた、例えば異なる病原体シーケンスの存在または不在 に関係がある多重標的シーケンス、または高等生物の異なるゲノムシーダンスを 検出するためにも応用できることが理解される。

この一般的な方法の改良は図１８Ａと１８Ｂに示される。この方法では、各シー ケンス特異的プローブ、例えばプローブ２０４は一対のプローブエレメント、例 えばニレメンｌ−２０６，２０８を含み、これらは例えば標的ポリヌクレオチド ２１２のシーケンス２１０のような選択されたシーケンスの隣接する位置に結合 するために設計される。プローブ２０６は結合ポリマー２１４、プローブエレメ ントに特有の電荷／並進摩擦抵抗を与えるポリマー鎖２１６、およびポリマー鎖 または結合ポリマーに取り付けられるレポーター２１８を含む、第２のプローブ エレメントは、図７Ａ−７Ｄについて上述したように、２個のエレメントを会合 した標的シーケンスにハイブリッド形成させるとき、プローブエレメント２０６ と連結できるオリゴヌクレオチドである。

プローブは上述のように標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成し、連結し、 そして脱離され、修飾した標識プローブ２２０を生成する。このプローブの電荷 ／並進摩擦抵抗比は連結後にプローブに対して、異なる比のポリヌクレオチド／ ポリマー鎖の寄与によって変えられる９次に修飾プローブは、上述したように、 篩分けしていない媒体中で電気泳動によって分別し、関心のある異なる標的シー ケンスと会合したプローブを同定する。

プローブの電荷／並進摩擦抵抗は実質的にポリマー長によって実質的に影響を受 けないままなので、ポリマー鎖の不在で、２つのオリゴヌクレオチドの連結反応 が、篩分けしていないマトリックス中のプローブの電気泳動移動度を変えないで あろうことは高く評価されるだろう、この場合には、しかしながら、プローブの 結合したｔ荷と並進摩擦抵抗に対するポリマー鎖と結合ポリマーの貢献が異なり 、この割合は結合ポリマーの長さに敏感である。

図１６Ａ−１６Ｃは、本発明に従って、ポリヌクレオチドプローブを修飾するた めの関連した方法を示す、この方法を使用して、フラグメントＴｌないしＴい例 えばそれぞれ１５０および１５２で示した二本鎖フラグメントＴ１．ｔｌｊよび Ｔ、と会合した１個またはそれ以上のシーケンスＳ１ないしＳいの存在を検出す る。このフラグメントはこの方法では、関心のある各標的シーケンスに対して、 １対のプローブエレメント、例えば図ＩＢに記載したプローブエレメントの一般 的な構造をもつプロ・−ブエレメント１５２．１５４を含むプローブ構成物を用 いてハイブリッド形成によって修飾される。即ち、ニレメン目５２はフラグメン トＴ１の１の領域に塩基特異的に結合するために設計されたオリゴヌクレオチド １５６、および選択された長さのポリマー１１１５７を含み、エレメント１５４ はフラグメントの第２の領域に塩基特異的に結合するために設計されたレポータ ーｍｍオリゴヌクレオチド１５８である。

図１６Ａおよび１６Ｂに示されるように、プローブはポリマー鎖（ｔ、Ｌおよび ｋ）を含み、これらはポリマー鎖が取り付けられている結合ポリマーに対して特 有の電荷／並進摩擦抵抗比を与える。

この方法では、フラグメントは、−末鎖の状態で、選択された長さのポリマー鎖 をもつ１のプローブと第２のレポーター標識プローブを用いてハイブリッド形成 したフラグメント、例えばフラグメント１６０を形成するプローブ構成物中のプ ローブエレメントを用いて、ハイブリッド形成によって修飾される。標的フラグ メントはこの方法では、２個のプローブエレメントを結合するプローブ連結作用 に役立つと考えられる。フラグメントそれ自体は、結合したプローブエレメント の電気泳動の移動度をはっきりとは変化させないので、電気泳動によって分別す るとき、この方法は１個のプローブエレメントのポリマー鎖によって与えられる 特有の電荷／摩擦抵抗の比に従って標的シーケンスフラグメントを同定すること ができる０図１６０では、混合物中のフラグメントＴ１およびＴ、に相当する２ 個のピークが電気泳動図において観察される。フラグメントＴｔ（図１６Ｃの点 線）に相当するピークの不在は、Ｔ、が試料中に存在しないことを示している。

Ｂ、橿釣２ニゲｌ玉壇幅 図４２に示した本方法の第２の一般的な具体例では、プローブは二本鎖標的ポリ ヌクレオチドの１またはそれ最上の領域のプライマー開始増幅のために設計され る。増幅した標的領域の少なくとも１本の鎖は各増幅フラグメントに特有の電荷 ／並進摩擦抵抗の比を与えるポリマー鎖を有する。この増幅した領域は増幅中ま たは増幅後にレポーター標識を付けることができる。

図１２Ａおよび１２Ｂはこの方法をを示す６図は増幅されるための少なくとも１ 個の、そして代表的には複数の領域、例えば領域９６を有する通常は２本鎖の標 的ポリヌクレオチド９４０２本の分ｊｌ［ｔｌｊ９０．９２を示す。標的は、図 １Ｃについて上述したプローブ５０において、各プローブがプライマーエレメン ト５２．５４のような１対のブライマーエレメントから成るプローブ構成物と反 応させる。図１２Ａはプライマーエレメント１００．１０２から成るプローブ９ ８を示す、プライマーエレメント１００は、一本の鎖の領域９６の３゛末端にハ イブリッド形成のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー１０４から成 り、その５゛　−末端で、上記ブライマーエレメント５２に僚でいる選択された 長さのポリマー鎖１０６を有する。エレメント１０２は反対側の鎖領域９６の５ ゛末端にハイブリッド形成するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー であり、その５゛末端で蛍光レポーターを有する。

本方法のこの具体例を実施する際に、プローブ構成物は、図１２Ａに示したよう に、反対側の標的ポリマーヌクレオチド鎖の相補的領域に対してプローブ構成物 中のブライマーエレメントを容易にアニーリングするハイブリッド形成条件下に 標的ポリヌクレオチドと反応する。この反応混合物を次に数回、そして代表的に は約２０−４０回、よく知られたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）方法（ムリス、 サイキ）に従って、プライマー伸長、変性、プライマー／標的シーケンスアニー リングによって熱循環させる。プローブプライマー１００．１０２によって生じ る１個の増幅領域は図１２Ｂにおいて１００で示される。

図に示された実施例におけるように、プライマーの１つにレポーター標識を付け ると、領域１０３のような２末鎖増幅領域は１本の鏡上にあるポリマー鎖および 他の鏡上のレポーターを有する修飾した標識プローブを形成し、ポリマー鎖は２ 重構造に特有の電荷／並進摩擦抵抗比を与える。

あるいは、増幅したシーケンスに臭化エチジウムのような挿入または架橋染料を 添加して２本鎖形態で標識を付けてもよい、異なるシーケンスの増幅プローブは 、２本鎖種の異なる電荷／並進摩擦抵抗比に基づいて、上述のように電気泳動に よって２本鎖形態で分別することができる。

別のアプローチでは、２個のブライマーエレメントの１つはポリマー鎖とレポー ター標識を含むことができ、これによってプライマー開始ポリメラーゼ反応は修 飾した標識１本鎖プローブを生成する。

前記方法は、例えば、標的ポリヌクレオチド中の選択されたシーケンスの存在に 対してアッセイする際に有用である。１例として、標的ポリヌクレオチドは多数 の可能な連結した遺伝子シーケンスをもつゲノムＤＮＡであってもよい、構成物 中のプローブは関心のある連結シーケンスのＰＣＲ増幅において有効なプライマ 一対である。シーケンス増幅後に関心のあるシーケンスの存在または不在を、標 識プローブの電気泳動の移動位置から決定するこ六ができる。

別の応用では、多数の可能なブライマーシーケンス、例えば縮重シーケンスが関 心のある遺伝子シーケンスに対して相補的であることをアッセイすることを望む ことができる。この応用では、プローブ構成物を使用して特定のシーケンスを増 幅する。各プライマーシーケンスは特有のポリマー鎖をもつので、シーケンス末 ＠領域に相補的であるブライマーシーケンスは標識プローブの移動性から決定す ることができる。上記の他の応用に加えて、本方法は分別したプローブ混合物中 に既知の大きさのポリマー鎖を用いて誘導された一連のオリゴヌクレオチド、お よびテストプローブ上に有する［Ｉｌｉを付けた興なるレポーター基を含ませる ことを必要とし、電気泳動による分離に対して移動速度基準を与える。

さらに別の応用では、増幅標的フラグメントに、１本鎖形態におけるように、レ ポーター標識プローブを用いて、増幅シーケンスに対してハイブリッド形成する ことによって標識を付ける。この応用は図１３Ａおよび１３Ｂに示され、一本の 鎖の上にあるポリマーｔｌｉｎ４を有する増幅標的シーケンス１１２を示す、ア ッセイの目的は任意の、そしてどちらかの、プライマープローブによって生成し た１またはそれ以上のフラグメントがプローブシーケンスに対し相補的なシーケ ンスを含むかどうかを決定することである。この例では、フラグメント１１２は 塩基シーケンスが既知のシーケンスプローブ１１８のそれに対して相補的である 領域１１６を含む。

フラグメント、例えばフラグメント１１２は標準のハイブリッド形成条件下に１ 個またはそれ以上の標識プローブとハイブリッド形成され、ポリマー鎖を含むフ ラグメント１１６の鎖にプローブ１１８を結合し、従って、上記のように、電気 泳動方法によって分別することができる修飾した標識プローブを形成する。

図１５Ａと１５Ｂは、ＰＣＲ発生標的フラグメント、例えば鎖１３２．１３４か ら成る二本鎖フラグメント１３０を修飾するための別の方法を示す、この示され た具体例では、鎖１３２は増幅中にフラグメントの１端でレポーター１３６を用 いて蛍光標識を付けた。フラグメント鎖は種々の方法、例えば標１１ｉｄＮＴＰ の存在において二フクトランスレーションまたはホモポリマーティリングによっ て、またはレポーター１１ｆｆｉプライマーを用いるＰＣＲ増幅によってレポー ター標識を付けることができる。

増幅したフラグメントは複数のプローブ、例えば標的の１本の鎖の異なるシーケ ンス領域にシーケンス特異的に結合するために設計されたプローブ１３Ｂ、１４ ０．１４２を含むプローブ構成物と混合する０代表としてプローブ１３８は、所 望する領域に特異的な塩基シーケンスを有するオリゴヌクレオチド１４４、およ び各異なるシーケンスプローブに対して特有な電荷／摩擦抵抗の比を与えるポリ マーｔｉ１４６を含む。

この方法では、フラグメントはハイブリッド形成によってプローブ構成物中のプ ローブを用いて修飾され、プローブ結合に対応する１またはそれ以上の二本鎖領 域と、フラグメント１４９のようなフラグメントを形成する。修飾フラグメント は１本鎖に標識を付け、反対側の鎖プローブ中に１本またはそれ以上の選択され た長さのポリマー鎖を用いて誘導される０次に修飾フラグメントは電気泳動によ って二本鎖形態に分別され、各フラグメントを会合したポリマー鎖の数と大きさ に従ってフラグメントを分別する。

従って、例えば、図に示した方法では、フラグメント１３２はプローブ１３８． １４２を結合し、このようにして全部のｉ＋に個のポリマー鎖阜位を有するよう に修飾された。フラグメントは、電気泳動により、フラグメントに会合したポリ マー鎖単位の全数に依存する移動時間で移動するので、各フラグメントに会合し たプローブを同定することができる。この方法は、例えばゲノムＤＮＡ内の既知 のシーケンス間の距離を調べるため、または連結したシーケンスを同定するため に用いることができる。

Ｃ，ブＰニーＡ伸長 本発明の方法に従ってＭｊ識プローブを形成するための第３の一般的方法は、図 １４Ａと１４Ｂに示される。この方法では、図に１２０で示されるよ−）な−・ 重鎮標的ポリヌクレオチドは、標的の選択された領域に塩基特異的に結合するた めに設計されているプローブ１２２のような、複数のプローブを含むプローブ構 成物と反応する０代表として、プローブ１２２は図Ｉへのプローブ２ｏに伯でぃ て、フリーの３°末端０）（基を有するオリゴヌクレオチド、およびその５′末 端に有する選択された長さのポリマー鎖を含む。

プローブを標的に結合した後、プローブは、図に示したように、少なくとも１個 のレポーター標識ｄＮＴＰの存在で、ＤＮＡポリメラーシーを用いて処理される 。染籾標ｆｉｄＮＴＰｓは市販の原料がら合成することができる。例えば、アミ ノ７−ｄＵＴＰ　（クロンチク、パロアルト、ＣＡ）は標準のカップリング条件 下にフルオレセインＮ　ｆ（Ｓエステル（モレキュラープローブ、ニージン、Ｏ Ｒ）と反応することができ、フルオレセイン標＠ｄＵＴＰを形成する。ポリメラ ーゼは全部で４個のヌクレオシドトリホスフェートの存在で、１２８で示される ような１個またはそれ以上の標識ヌクレオチドを混入し、標的結合プローブの３ °末端を伸長し、各プローブシーケンスの特性を示している各異なるシヒヶンス プロープと会合した特有のポリマー鎖を有する所望の修飾した標識プローブを形 成するのに効果がある。あるいは、上記例においてプローブに混入した後、フル オレセインを修飾ヌクレオチド、例えばアミノ−７−ｄＬＪにカンプリングする ことができる。各々の異なるシーケンス修飾１ｉ！プローブはその特有のポリマ ーによって電荷／並進摩擦抵抗の明確な比をもつ。

プローブ伸長後、プローブは標的から脱離し上述のように電気泳動によって分別 し、標的ヌクレオチＦに含まれるシーケンスに対応する標識プローブの移動位置 を同定する。

Ｄ、フラグメント開裂 図１７Ａと１７Ｂは本発明の他の具体例を示す、この方法ではプローブ構成物は 、標的ポリヌクレオチド１８８の領域１８６のような、−末鎖標的ポリヌクレオ チドの領域にシーケンス特異的に結合するために設計された複数のシーケンス特 異的プローブ、例えばプローブ１８４を含む０代表として、プローブ１８４は、 第１の一本鎖ＤＮＡ切片１９２、および−重鎖ＲＮ　Ａ　ｅＪ［域１９６を含む 第２の切片１９４から成る結合ポリマー１９０のプローブを含む、結合ポリマー の第１の切片に取り付けられたポリマー鎖１９８は、上記のように、結合ポリマ ーに、特有の１！荷／並進摩擦抵抗比を与える。レポーター２００は結合ポリマ ーの第２の切片に取り付けられる。特に、ポリマー鎖およびレポーターはＲＮＡ 領域の反対側にあり、この領域の選択的開裂はプローブを第１の切片および取り 付けられたポリマー饋にレポーターがら分離するであろう。

この方法では、プローブ構成物は、上述のように、ハイブリッド形成条件下に標 的ポリヌクレオチドと反応し、シーケンス特異的方法でプローブを相補的標的領 域に結合する４図１８Ａに見られるように、これは各結合プローブにおいてＲＮ Ａ／ＤＮＡ二本鎖の領域を生成する０反応混合物は今は、ＲＮａｓａＨのような 、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡを選択的に切断することができる（Ｄｕｃｋ）ヌクレア ーゼで処理して、従って各プローブをそのＲＮＡ結合領域中で切断する。

ハイブリッド形成反応は、そのポリマー鎖を欠き、従って篩分けしていない媒体 中で電気泳動によって遊離オリゴヌクレオチドとして移動する修飾したｌｆｆ１ プローブを、各特異的に結合するプローブに対して変性し脱離する０代替の具体 例では（図示していない）、ポリマー鎖はプローブのレポーター側に取り付ける ことができ、従ってＲＮＡ５ｅ処理は一部の結合ポリマーを放出し、残りのプロ ーブ（ポリマー鎖とレポーターを含む）の合わさった電荷７合わさった並進ＷＩ Ｆ！ｉ砥抗を変えて、従って開裂していないプローブについて、篩分けしていな い媒体中のプローブの電気泳動による移動度をシフトさせる。

生成する８１ｍプローブの開裂モードを使用する他の具体例では、プローブ修飾 はアニーリングしたプローブから（その５゛末端を越えて）標的ポリヌクレオチ ド上流までアニーリングしたプライマーを伸長する間に行われる。この伸長はま た５゛ないし３゛エキソヌクレアーゼ活性（Ｈｏｌ　１ａｎｄ）を組み込むＤＮ Ａポリメラーゼによって生成される。本方法は、関心のあるシーケンス領域２２ ４をもつ標的ポリヌクレオチド２２２を示す図１９に示される。この方法でのプ ローブはポリマーの５゛末端付近にサブユニット２２９をもつ結合ポリマー２２ ８を含むプローブ２２６によって例示される。この塩基にポリマー鎖２３０およ び標識プローブ２３２（これはポリマー鎖のフリー末端に取り付けることができ る）が取り付けられている。

また図には、領域２２４の上流で、標的にシーケンス特異的に結合するために設 計されているプライマー２３４が示される。

本方法を実施する際に、シー−ケンス特異的プローブおよび１＆Ｉｌのプライマ ー、例えばプライマー２３４は、ハイブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチ ドと反応し、会合したプローブおよび上流プライマーを標的の異なるシーケンス 領域に結合する。標的および取り付けたプローブは全４個のヌクレオシドトリホ スフェートの存在で上記ポリメラーゼで処理し、図１９Ｂの複数のＸによって示 すように、５°ないし３“方向においてプライマーを重合する。ポリメラーゼが 隣接するプローブの５゛末端に達すると、それはプローブを標的領域から置換し 、また５′末端サブユニツトをプローブから開裂して取り去る０図１９Ｂに示す ように、プローブからのサブユニット２２９の開裂は塩基２２９、レポーター２ ３２、および特有の電荷／並進摩擦抵抗の比をプローブに与えるポリマー鎖２３ ０から成る標識プローブ２３４を脱離する。

分子生物学の分野において熟練した者によって、多くの種類の開裂法が実施され ることは認識されるだろう；ポリメラーゼ活性につながらないエキソヌクレアー ゼ活性を使用する（例えば、Ｅ、Ｃｏ１１ポリメラーゼ■からのＮ末端選択的開 裂フラグメントおよびバクテリオファージλのエキソヌクレアーゼ）、一定のＤ ＮＡポリメラーゼの３’−５’校正エキソヌクレアーゼ活性を使用する（この場 合ポリマー１！１９ＢとレポーターＦは好ましくはプローブの３゛末端に取り付 けられ、この３゛末端は図１．７Ａの鋳型ポリヌクレオチド１８８に不適正な１ 個またはそれ以上のヌクレオチドを含む）、または制限エンドヌクレアーゼのよ うな広範囲のシーケンス特異的エンドヌクレアーゼのいくつかを用いる。これら の場合のすべては、好適な具体例は、開裂部位の同し側にレポーターとポリマー 鎖を配置し、それらが開裂に続いて共有結合するようにする。退加のポリマー鎖 は標識を付けていないプローブから標識を付けたプローブを最適に分離するため 、レポーターから開裂部位の反対側のプローブに付加するかまたは付加しないこ とができる。

Ｅ、旦ＮΔ〜列火定方法 本発明の重要な具体例では、ＤＮＡ配列決定は篩分けしていない液体媒体中で電 気泳動により分離するＤＮＡ断片（即ち、異なるシーケンスのオリゴヌクレオチ ド）によって実行される０本来のＤＮＡは２つの線形ポリマー、またはヌクレオ チドの鎖から成る。各端はホスホジエステル結合によって連結したヌクレオシド の鎖である。２本の鎖は互いに、その２木の鎖：チミジン（Ｔ）と対のデオキシ アデノシン（Ａ）およびデオキシシヂジン（Ｃ）と対のデオキシグアノシン（Ｇ ）、のヌクレオチドの相補的塩基間に水素結合によって逆平行の配向で保持され ている。

最近ＤＮＡシーケンスの決定への２つの基本的゛アプローチがあるニジデオキシ 鎖末端方法、例えばサンガーら、Ｐｒｏｃ、　ＮａＬｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、、　Ｖｏｌ、　７４ｐ　Ｐｇｓ、　５４６３−５’４６７　（１９７７）　ｉ および化学分解方法、例えばマキサムら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　７４．　ｐｇｓ、　５６０−５６４　（１９７７）、 鎖末端方法はいくつがの方法で改良され、現在得られる自動化ＤＮＡ配列決定機 器全部に基礎として使われている、例えばランガーら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、、　Ｖｏｌ、　１４３．　ｐｇｓ、　１６１−１７８　（１９８０）　；シ ェライヤーら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、　１２９．　ｐｇｓ、 　１６９−１７２　（１９７９）　：ミルスら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　`ｃ ａｄ。

Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　７６、　ｐｇｓ、　２２３２−２２３５　（１９７９） 　；スミスら、Ｎｕｃｌｅｔｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒモ■B ｖｏｌ、　１３．　ｐｇｓ、　２３９９−２４１２　（１９８５）　；スミスら 、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３２１．　ｐｇｓ、　５６７S−６７ ９　（１９８７）　；プロパーら、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２３８．　ｐ ｇｓ、　３３６−３４１　（１９８７）、セクション■、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ ＋ｓｏ１．、　Ｖｏｗ、　１５５．　ｐｇｓ、　５１−３３４　（１９Ｂ？）　 ；チャーチら、５ｃｉｅｎｃｅ、@Ｖ ｏｌ　２４０．　ｐｇｓ、　１８５−１８８　（１９８８）　；タボ−ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　Ｍｏ１．８S＋ ｐｇｓ、　４７６７−４７７１　（１９Ｂ？）　；タボ−ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ−＋　Ｖｏｌ、　８６＋　ｐｇ刀B ４０７６−４０８０　（１９８９）　ｉインニスら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋　Ｖｏｌ、　８５＋　ｐｇｓ、　９４R６ −９４４０　（１９８Ｂ）　；およびコンネルら、旧ｏｔｅｃｈｎｊｑｕｅｓ、 　Ｖｏｌ、　５．　ｐｇｓ、　３４２−３４８　（１９８７）。

鎖末端方法と化学分解方法の両者は標識ＤＮＡ断片の１またはそれ以上の組、即 ちＤＮＡ断片を重ね入れた組の生成を必要とし、各々は共通の出所を有し、各々 は既知の塩基で終わっている。１組または複数の組の断片はシーケンス情報を与 えるように大きさによって分離する必要がある０両方の方法において、ＤＮＡ断 片は高分解ゲル電気泳動によって分離される。一般に、ＤＮＡ断片は放射性ヌク レオシドトリボスフエート前駆体によってまたは蛍光染料によって標識が付けら れる。

ＤＮＡ配列決定への鎖末端アプローチの基本的工程は、（１）オリゴヌクレオチ ドブライマーおよび、サブシーケンスとして、シーケンスが決定される標的核酸 を含む鋳型核酸を用意し、（２）オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型核酸にハ イブリッド形成し、（３）プライマーを核酸ポリメラーゼ、例えば、Ｔ７　ＤＮ Ａポリメラーゼ、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　（登録商４Ｉ）、逆転写酵素等を用いて 、ヌクレオシドトリホスフェート前駆体と少なくとも１本の鎖終止ヌクレすチド を含む反応混合物中で伸長し、より短い全てのＤＮＡ断片がより長い全てのＤＮ Ａ断片のサブシーケンスであり、同じ大きさの全てのＤＮＡ断片が同じ鎖終止ヌ クレオチドで終わるように、ＤＮＡ断片個体群の重ね入れた系列を形成し、（４ ）大きさによってＤＮＡ断片個体群を分離し、そして（５）各ＤＮＡ断片個体群 と会合した鎖終止ヌクレオチドを同定する。

と記工程の各々の詳細は、異なる鎖終止ヌクレオチドを同定するための標識手段 の性質、異なるＤＮＡ断片の個体群を分離するための手段、鋳型核酸をハイブリ ッド形成工程のために用意する方法等を含めて、当該分野で良く知られている幾 つかの要素に従って変わる０例えば、ＤＮＡ断片の個体群をプライマーに結合し た蛍光染料によって同定する場合、各々は異なる蛍光標識を有する４個の異なる プライマーを用意し、プライマーは４個の異なる鎖終止ヌクレオチドに対応する ４つの分離反応混合物中に伸長する。または、ＤＮＡ断片の個体群を、伸長工程 の間に放射活性でｌｊｌｌｍを付けたヌクレオチドトリホスフェートを組み込む ことによって同定する場合、伸長工程は通常４個の分離反応混合物を含み、各々 は異なる鎖終止ヌクレオチドを含み、分離工程は通常大きさに従って別々に各反 応混合物のＤＮＡ断片個体群を分離することを含む。一般に、本背景の第２のバ ラグラフに引用した参考文献は、ＤＮＡ配列決定の工程およびその重要な変更例 を開示する。従って、これらの参考文献が参照のために組み入れられる。

好ましくは、異なるＤＮＡ断片個体群を鎖終止ヌクレオチドに結合した蛍光染料 によって同定する。従って、本発明の方法では、プライマーはＤＮＡポリメラー ゼによって、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＴＴＰの４つの１−チオトリホス フェー−１−１ｒ（１体、および各々が異なるメンバーの１Ｍｉのスペクトルに より解像できる蛍光染料で標識を付けた４個の鎖終止ヌクレオチドを含む反応混 合物中で例えばフングら、米国特許４，８５５．２５５　；プロパーら（上記） 等によって開示されているように、伸長する。

鋳型は、当該分野の教示、例えば、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ 　Ｍｏｄｅｌ　３７０Ａ　ＤＮＡシーケンサ−（アプライド・バイオシステムズ ・インコーホレイテッド、フォスターシティ、ＣＡ）に従って用意される０例え ば、標的シーケンスを適当なりローニングベクターに、例えばＭ１３クローニン グベクターの復製の形で挿入し、次に標的シーケンスのコピー数を増幅するよう に増殖することができる。１本鎖形態のＭ１３は鋳型として使用するために単離 する。或いは、鋳型を当該分野で教示されているようなポリメラーゼ鎖反応（Ｐ ＣＲ）によって用意することができる；例えば、インニスら、（上記）；ウィル ソンら、Ｒｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｖｏｌ、　８＋　ｐｇｓ。

１８４−１８９　（１９９０）；ギレンステン、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 、　Ｖｏｌ、　７．　ｐｇｓ、　７００−７０８　（１９８X） 等、増幅後、鋳型は重合化反応で液体相でまたは固体相支持体に結合して、例え ばスターら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１ ６＋　ｐｇｓ、　３０２５−３０３８　（１９８８）　；ハ■ トマンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　１７ ．　ｐｇｓ、　４９３７−４９４６　（１９８９）等によって教示されているよ うに、使用することできる。

本発明の方法のためのプライマーは、市販のＤＮＡ合成器で合成することができ 、または単独でまたはＤＮＡ増幅および／または配列決定キットの成分として購 入することができる、例えば、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌ　Ｃｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ　（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｓ。

０）１）、　Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　（Ｐａｌｏ　Ａｉｔｏ、　ＣＡ）等、鋳型にプ ライマーをハイブリッド形成する工程は引用した参考文献に充分に開示されてお り、本発明の任意特定の具体例に応用するための詳細なガイダンスを提供する。

本発明のキットは一般にポリマー鎖に共役した１またはそれ以上のオリゴヌクレ オチドから成る１またはそれ以上のプライマーを含む、好ましくは、プライマー のオリゴヌクレオチドは長さで１６と２５個の間のヌクレオシドである。好まし くは、本発明のキットはさらに、緩衝液中に４個のヌクレオシドトリホスフェー ト前駆体から成るヌクレオシドトリホスフェート前駆体ミックスを含む、１の具 体例では、ヌクレオシドトリホスフェート前駆体ミックスはまた１またはそれ以 上の鎖終止ヌクレオチドを含むことができる。また、鎖終止ヌクレオチドはキッ トの分離成分であることができる。好ましくは、キットはさらに核酸ポリメラー ゼおよびポリメラーゼ反応を行うための反応緩衝液を含む、核酸ポリメラーゼは ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素等を含む、好まし くは、キットはＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ゲルファント、米国特許４，８８ ９，８１８によって開示されているようなタグポリメラーゼ；またはタボ−ら、 米国特許４゜９６２．０２０　；　４，７９５，６９９　；　４，９４２．１３ ０　；　４，９９４，３７２　、および４，９２１．７９４によって開示されて いるようなシーケナーゼを含む。

１具体例では、キットは単一プライマーおよび染料ターミネータ−ミックスを成 分として含む、染料ターミネータ−ミックスは４個の鎖終止ヌクレオチドを含み 、各々は好ましくはスペクトルにより解像できる異なる蛍光染料で標識を付けて いる。好ましくは、鎖終止ヌクレオチドはジデオキシヌクレオシドトリホスフェ ートである。この具体例の一面では、各ジデオキシヌクレオシドトリホスフェー トは別々に、５−および６−カルボキシフルオレセイン、５−および６−カルボ キシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’、７’　−ジメトキシ−５−およ び６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２“、７゛　−ジメトキ シ−４°、５゛−ジクロロ−５−および６−カルボキシフルオレセイン、２°、 ７゜−ジメトキシ−４゛、５°−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７ −ジクロロフルオレセイン、ｌｏ、２°、７’、８°　−ジベンゾ−５−および ６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１゛、２°、７°、８°　 −ジベンゾ−４°、５゛−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジク ロロフルオレセイン、２゛、７°−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４， ７−ジクロロフルオレセイン、および２°、４°、５’　、７’　−テトラクロ ロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインから成る組か ら選択された染料でｔ！識を付ける。上記染料は参考文献として組み入れられる 次の参考文献に開示されている；ホフブ　ジェニア、米国特許４，９９７．９２ ８　；フングら、米国特許４．８５５，２５５　、およびメンチェンら、ＰＣＴ 出１１Ｕｓ９０１０６６０８．あるいは、本発明のジデオキシヌクレオチドはベ ルゴツトら、ＰＣＴ出［ＵＳ９０１０５５６５によって教示されているようにス ペクトルにより解像できるローダミン染料で標識を付けることができる。

代わりの具体例では、キットは４個の別のプライマーを含み、各々は異なるスペ クトルにより解像できる蛍光染料で、例えば、フングら（上記）によって教示さ れているように、標識を付ける。

Ｆ、１旦ニズ皿１ 図２０Ａ−２０Ｃに示される他の一般的具体例は、固定化した標的ポリヌクレオ チドからのプローブ捕獲と脱離を含む０図２０Ａは複数のプローブ、例えばプロ ーブ２４−２４６を、Ｒ，、Ｒｊ、およびＲ，、のような、関係のある異なるシ ーケンス領域を含む標的ポリヌクレオチド２４８への付加を示す０代表として、 プローブ２４０は、結合ポリマー２５０、このプローブに特有の電荷／並進摩擦 抵抗の比を与えるポリマー鎖２５２、およびポリマー鎖に取り付けられたレポー ター２５４を含む。図に示した具体例では、各異なるシーケンスのプローブは特 有の電荷／並進摩擦抵抗の比を達成するため異なる長さのポリマー鎖をもつ。

プローブは、上記のように、ハイブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと 反応する０図２０Ａに示した方法では、プローブ２４０．２４２、および２４６ の各々はそれぞれ、標的ポリヌクレオチドの領域Ｒ，，Ｒ，、およびＲ，の相補 的シーケンスとハイブリッド形成する。この例では、標的ポリヌクレオチドはプ ローブ２４４に相補的な領域を含まず、このプローブは結合していないと仮定す る。

標的およびハイブリッド形成したプローブは次に標的ポリヌクレオチドを固定す るように処理される。これは本実施例では、標的ポリヌクレオチドの領域Ｒ１に 相補的であるオリゴヌクレオチドプローブ２６２を用いて誘導された固体支持体 ２６０を付加し、このようにして図２０Ｂに示したように、固体支持体に標的を 結合することによって行われる。支持体および取り付けた標的とプローブは洗浄 して、非特異的に結合したプローブ、例えばプローブ２４４を除去する。

最後の処理工程では、洗浄した固体支持体混合物を変性して、結合したプローブ 、例えばプローブ２４０．２４２、および２４６を脱離し、これらのプローブを 次に、篩分けしていない媒体中で電気泳動によって分別し、この分別した標識プ ローブの特有の電気泳動位置に基づいて、標的シーケンスを同定する。

前述のことから、本発明の種々の目的および特徴がどのように合致しているか高 く評価されるだろう０本方法は複数の標的シーケンスを単一のアッセイフォーマ ットでアッセイすることができ、シーケンス特異的標識プローブと会合した異な る長さのポリマー鎖の移動路Ｈ（移動割合）に従ってシーケンスを迅速に同定す る。

ポリマー鎖は、オリゴヌクレオチドのような荷電した結合分子を、篩分はマトリ ックスを必要としない簡単な電気泳動方法で、分離することができる。特に、こ のＣ８分別方法は、すべてが似ているかまたは同じ大きさの複数のオリゴヌクレ オチドを有効に分別することができる。この特徴の１つの利点は本方法で用いら れる複数のプローブ中がすべて債でいるがまたは同じ大きさをもっことができ、 従って殆ど同じハイブリッド形成動力学および熱力学（Ｔヨ）で標的シーケンス を用いてハイブリッド形成できることである。

本発明のプローブは従来の固相方法によって容易に合成することができる。一つ の方法では、選択された数のユニットのポリマー鎖を直接オリゴヌクレオチド上 で、従来の固相合成方法によって形成することができる。

次の実施例はポリマー鎖プローブの製造と使用の種々の例を記載するものである 。これらの実施例は例示であるが、本発明の範囲を制限するものではない。

原料 ヘキサエチレングリコール、４．４°−ジメトキシトリチルクロリド、トリエチ ルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、酢酸、ピリジン、メタンスルホニルク ロリド、水素化ナトリウム、２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’　− テトライソプロビルホスホロジアミダイトは、アルドリッチ、ミルウォーキイ、 Ｗ＋から入手した。ジイソプロピルアミンテトラゾール塩、ＦＡ？ｌ−ＮＨ３／ ＤＭＳＯ１ＪＯ［！−ＮＨＳ／［１Ｍ５ＯおよびＴＡＭＲＡ−ＮＩＩＳ／ＤＭＳ Ｏは、アプライド・バイオシステムズ（ＡＢＩ）、フォスターシティ、ＣＡから 入手した。ＬＡＮ　（リンカ−アームヌクレオチド）５゛−ジメトキシルートリ チル−５−（Ｎ−（７−）リフルオロアセチルアミノへブチル）−３−アクリル アミド）−２°−デオキシウリジン−３゛−ホスホルアミダイトはモレキュラー バイオシステムズ　インコーホレイテッド、サンジエゴ、ＣＡから入手した。

セファデックス（登録商標）Ｇ−２５Ｍ　ＰＤ−１０カラムはフォーマット、ラ ップサラ、スウェーデンから入手した。誘導オリゴヌクレオチドは１．５ｍｌ／ 分の流速と０．１Ｍ１−リエチルアンモニウムアセテート／水ｐＨ７，０および アセトニトリルのグラジェントを使用しＴＡＢ　Ｉ　ＲＰ−３００（Ｃ８）カラ ム（４，６Ｘ２２０１１１１）を用いてＬＣ精製した。ＤＮＡ合成器：３８０Ｂ 、ＡＢ　Ｉ、フォスターシティ、ＣＡ。

大施優上 」旦旦旦り萌■金底 この実施例に記載する反応は図２に示され、クロードおよびシエパルッのものと （以ている。

Ａ、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護へキサエチレンオキシド（ＨＥＯ）２７ ．０ｇ　（９５，６ミリモル）のＨＥＯを１０抛ｌのピリミジンに溶解した。こ の溶液に室温で１０時間かけて、２７．０グラム（７９，７ミリモル）のジメト キシトリチルクロリドの１５０■ｌピリミジン溶液を添加した０反応物を、室温 で終夜撹拌した（１５時間）、溶媒を減圧除去し残渣を１５０ｍ１ノＥ　ｔ　Ｏ Ａ　ｃと１００ｓ＋ｌｌ７１Ｈ１Ｏ１２Ｘ　１００ｍ１（７）塩水に入れ、有機 相をＮ　ａ　ｚ　Ｓ　Ｏａで乾燥させた。溶媒を除去して暗燈色の油（３８，３ ６ｇ）を与えた。粗物質を２００ｇのキーゼルゲル６０を用いて２％のメタノー ル−塩化メチレンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィによって精製した（シ リカゲルはトリエチルアミンで塩基性化した）、適当な百分を一緒にして２９． ５２ｇ　（５０，４９ミリモル）の化合物１を与えた。ＤＭＴ保護ＨＥＯ（図２ の化合物１）の分析を示す： ’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（３００ＭＨｚ　ＣＤ　ＣＩｓ）　δ７．５−６．８　（ｍ、 １３Ｈ芳香族）、３．７５　（Ｓ−６Ｈ，０ＣＨｚ）　、３．６　（２０Ｈ，ｍ 、０ＣＨｔ−ＣＨｚＯ）、３．５　（２Ｈ，ｍ、ＣＨｔ　ＯＨ）　、３．２　（ ２Ｈ１ｔ１ＣＨｔＯＤＭＴ）−Ｂ、ＤＭＴ保ｇｌＨ，Ｅｏホスホルアミダイト１ ｇ（１，７ミリモル）の上記実施例ＩＡからのＤＭＴ保護ＨＥＯおよび０．０２ ９ｇ（０，１７ミリモル）のテトラゾールジイソプロピルアンモニウム塩を不活 性雰囲気下に１０■ｌの塩化メチレンに溶解させた。これに０．５９グラムの２ −シアノエチルテトライソプロピルホスホルアミダイトを添加し、混合物を終夜 室温で撹拌した。

反応混合物をＮ　ａ　ＨＣＯｓの飽和溶液、塩水で洗浄しＮａ　ｚ　Ｓ　Ｏ４で 乾燥させた。

溶媒を除去して１．５８ｇの粗精油を与え、生成物をフランシュクロマトグラフ ィによってシリカゲルに通して５０％ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶出して精製した （シリカゲルはトリエチルアミンで塩基性化した）　、　０．８ｇ　（１，３ミ リモル）の精製ホスホルアミダイト（図２の化合物２）を回収した。

Ｃ，ＤＭＴ保慢ＨＥＯメタンスルホネート（メシレート）１００ｍｌの塩化メチ レンに上記実施例ＩＡからのＤＭＴ保護ＨＥＯを１０．４ｇ　（１７，８ミリモ ル）溶解した。溶液を水冷し、４．５９ｇ　（３５，６ミリモル）のジイソプロ ピルエチルアミンを添加し、次に２．０６ｇ　（２６，７ミリモル）の塩化メタ ンスルホニルを添加した０反応混合物を３０分間撹拌し次にＮ　ａ　ＨＣＯｓの 飽和溶液、塩水で洗浄し、Ｎ　ａ　！　Ｓ　Ｏａで乾燥させた。溶媒を減圧除去 し１１．９３ｇのメシレート（図２の化合物３）を与えた。

Ｄ、ＤＭＴ保護ＨＥＯ二量体 ０．６２ｇ　（２６，９ミリモル）の水素化ナトリウムと１５０ＩＩｌの新たに 蒸留したテトラヒト１コフランの懸濁液に１０℃で１分間かけて１０．１４ｇ　 （３６，０ミリモル）のへキサエチレングリコールを添加し、混合物を室温で３ ０分間撹拌した。これに、上記実施例１ｃからの１１．９３ｇ　（１７，９ミリ モル）のＨＥ　Ｏメンレートの５０１テトラヒドロフラン溶液を添加した０反応 混合物を４０−５０℃まで３時間暖めて、その後に溶媒を減圧除去して、残渣を １５０１の塩化メチレンに入れた。これを３Ｘ１００ｗｌの＋（！０、塩水で洗 浄し、Ｎａ　！　Ｓ　Ｏａで乾燥させた。溶媒を減圧除去して粗精油（１３，３ ７ｇ）を与えた。これを上記実施例ＩＡと同様にシリカゲルクロマトグラフィに よって精製した。　１０．０ｇのＤＭＴ保護！（Ｅ〇二量体（１１，８ミリモル ）を回収した。物質の分析（図２の化合物４）を示す：’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（３０ ０ＭＨｚ　ＣＤ　ＣＩ３）　６７．５−６．８　（ｍ、１３Ｈ芳香族）、３．７ ５　（Ｓ、６Ｈ，０ＣＩ−ｉｓ）　、３．６　（２０Ｈ，、ｍ、０ＣＨｚ−ＣＨ ｘＯ）、３．５（２Ｈ２ｍ、ＣＨｚ　ＯＨ）　、３．２　（２Ｈ２ｔ　ＳＣＨｇ ＯＤＭＴ）−Ｅ、ＤＭＴ−保ＩＨＥＯ二置体のホスホルアミダイト（図２の化合 物５）実施例ＩＤからの１　ｇ　（１，１７ミリモル）のＤＭＴ保護ＨＥＯ二量 体および２０ｍｇ（０，１２ミリモル）のテトラゾールジイソプロピルアンモニ ウム塩を不活性雰囲気下、１０−１の塩化メチレンに溶解した。これに室温で０ ．４０９ｇ　（１，３５抛ｌモル）の２−ソアノエチルテトライソプロピルホス ホルジアミダイトを添加した。１５時間後、反応物を飽和ＮａＨＣＯｓ、塩水で 洗浄しＮａｔＳ０４で乾燥させた。溶媒を減圧除去し粗油（１，４４ｇ　）を得 た、これを実施例ＩＢのようにフラッシュクロマトグラフィで精製した。　０． ７６ｇ　（０，７３ミリモル）の精製した生成物を回収した。

精製した物質（図２の化合物５）の分析を示す：”　’　Ｐ　Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ 　ｘ　ＣＮ　、　Ｈ分断）：６１５１　（Ｓ）　。

この実施例に記載した反応を図３に示す。

ヘキサエチレングリコール（１０，０＋＋Ｉ）をトリレン−２，４−ジイソシア ネート（ＴＤＣ）　（１７，０ｍ１）に３０−３５℃でアルゴン下に通下した。

水浴を使用して発熱反応をコントロールした。室温で終夜反応させ；熱いヘキサ ン（ＩＯＸ）で洗浄し過剰のジイソシアネートを除去し；そして減圧化に濃縮し て粗ビスイソシアネート生成物（化合物６、図３）を琥珀色の油（３０ｇ　＞と して生成した。

上記の粗ビスイソシアネート（２，３ｇ）とへキサエチレングリコール（７，０ ｍ１）のジクロロメタン（２５■ｌ）溶液を室温で１時間撹拌し次にジブチルチ ンジラウレート（０，１ｍｌ、アルドリッチ）を添加し、室温で２２時間撹拌し ；ジクロロメタンで希釈し水（４ｘ２０ｍｌ）で洗浄し；乾燥（Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ ４＞させ；そして減圧下に濃縮して粗ジオール生成物（化合物７、図３）を琥珀 色の油（４，６ｇ　）として得た。

ＤＭＴ塩化物（１，２ｇ　）のジクロロメタン（２０■ｌ）溶液を２時間かけて アルゴン下に室温で、上記粗ジオール（４，４ｇ　）とトリエチルアミン（０， ６曽ｌ、アルドリッチ）のジクロロメタン（２５■ｌ）撹拌溶液に添加した。反 応溶液を室温で２時間撹拌し水で洗浄し；乾燥させ（ＭｇＳＯａ）：そして減圧 下に濃縮して粗ＤＭＴアルコール生成物を琥珀色の油（５，１ｇ）として得た。

粗ＤＭＴアルコールのカラムクロマトグラフィ　（トリエチルアミン中和シリカ 、５％メタノール／ジクロロメタン）は精製したＤＭＴアルコール（化合物８、 図３）を粘性琥珀色の油（０，７２ｇ）として与えた。化合物の分析を示す：’ ＨＮＭＲ／ＣＤＣｌ、：δ６．７−７．５　（ｍ、　Ａ　ｒ　Ｈ，１９Ｈ）、６ ４．３　（ｍ、　Ｎ　Ｃ（０）ＯＣＨｔ、８Ｈ）、６３．７７　（ｓ、ＣＨｓＯ １６Ｈ）、δ３．５５　３．７５　（ｍ、ＣＨｚＯＣＨｔ−，６２Ｈ）　、６３ ．２　（ｔ、ＤＭＴＯＣＨｔ、２Ｈ）、６２．１５　（ｍ、ＣＨｓＡｒ、６Ｈ） 。

２−シアノエチル−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−テトライソプロピルホスホロジアミ ダイト（０，２０纏ｌ）をアルゴン下、室温で、上記精製したＤＭＴアルコール とテトラゾールジイソプロビルアミン塩（１２鰯ｇ）の乾燥ジクロロメタン（５ ■ｌ）撹拌溶液に添加した。室温で４時間撹拌した後、ＮａＨＣＯｉ溶液を添加 り、４０分間撹拌した。

ジクロロメタン層をさらにジクロロメタンで希釈し、塩水で洗浄し；乾燥させ（ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ）　ｉそして減圧下に濃縮して粗ホスホルアミダイト生成物（ 化合物９、図３）を琥珀色の油（０，８８ｇ　）として得た。

ネ’Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）　：１５１ｐｐ讃。

実施例１ 」組立Ｉ セフシランＢおよびＣに記載した反応を、それぞれ、図４Ａと４Ｂに示す。

Ａ、オリゴヌクレオチドの調製 シーゲンス５°　ＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧ ＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡカルボキシフルオレセイン−３”を もつ４日塩基オリゴヌクレオチド（図４Ａの構成物１０）を３゛連結カルボキシ フルオレセインポリスチレン支持体（アブライドバイオシステムズ　インコーホ レイテンド）を用いて調製し、または３°アミン−０Ｈ（オリゴヌクレオチド） ＣＰＧ（クロンチク、バロアルト、ＣＡ）および発表された方法（アプライド　 バイオシステムズ、カルサーズ、コンネル）によるＦＡＭ−ＮＨ５（ＡＢ　＋＞ 　、およびアブライドバイオシステムズ３８０Ｂ　ＤＮＡ合成器で標準のホスホ ルアミダイト化学を用いて調製することができる。

Ｂ、ｐＥｏｌｍを用いて誘導されたオリゴヌクレオチド上記実施例３Ａからの支 持体結合オリゴヌクレオチド（０，１Ｍモルオリゴヌクレオチド）をトリクロロ 酢酸と反応させて脱保護し、洗浄し、標準ＤＮＡ合成サイクルを用いて、次に実 施例１のようなホスホルアミダイト−ＰＥＯポリマーの１−′）と反応させた０ 図４Ａに示した具体例は１２個のエチレンオキシドサブユニットをもつポリマー 鎖を用いている。誘導化オリゴヌクレオチド（図４Ａの化合物１１）はトリデル でカラムから引き離され、集められた生成物（図４の化合物１２）は、ＡＢ　Ｔ 　ＲＰ　３００　（Ｃ８）　４．６Ｘ２２０ｍｍ　カラムおよび０．１Ｍ　ト＋ Ｊｘチルアンモニウムアセテート−水およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液 体クロマトグラフィによって精製された。誘導化したオリゴヌクレオチドは図４ Ａで化合物１２として示される。

Ｃ，ビスウレタントリル連結ＰＥＯ頷を用いて誘導されたオリゴヌクレオチド上 記の実施例３Ａからの支持体結合オリゴヌクレオチド（０，１Ｍモルオリゴヌク レオチド）（化合物１０、図４Ｂ）を、標準のＤＮＡ合成サイクルを用いる実施 例２のように調製されたホスホルアミダイト−ＰＥＯビスウレタントリル結合ポ リマーと反応させた。（図４Ｂでサブユニット構造ＤＭＴ−ＨＥＯ−Ｔｏ　Ｉ　 −ＨＥＯ−Ｔｏ　Ｉ−ＨＥＯによって示されるトリル連結ポリマーは図３の化合 物９に相当する）、誘導化オリゴヌクレオチドＣ図４Ｂの化合物１３）をカラム から引き離し、トリチルで脱保護し、ＡＢ　Ｉ　ＲＰ　３００　（Ｃ−８）　４ ．６Ｘ２２ｈ＋ｉカラムおよび０．１Ｍ）リエチルアンモニウムアセテートー水 およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液体クロマトグラフィで精製した。集め られた生成物は酢酸で脱保護した。誘導化オリゴヌクレオチドは図４Ｂで化合物 １４として示される。

大施斑土 オリゴヌクレオチドへのＰＥＯ゛　寸法この実施例に、記載した反応工程を図５ に示す。

Ａ、ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド シーケンス５°　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＴＡ ＴＡ−ＬＡＮ−７３’　をもつ２６塩基オリゴヌクレオチドを、標準ホスホルア ミダイト化学（図５の構成物１５）を用いるＡＢＩモデル３８０Ｂ　ＤＮＡ合成 器で作成した。ＬＡＮはＴＦＡ保護アミンを用いて塩基修飾したデオキシウリジ ンホスホルアミダイト　（モレキュラー　バイオシステムズ　インコーホレイテ ッド）である、この２６量体は１Ｍモルカラムから合成後トリチルオンマニエア ルプロトコルを用いて作成される。このカラム物質は１０個の分離した０、１Ｍ モルカラムに分けられた。

続くオリゴ全部をＮＨ，ＯＨを用いて支持体から切り離し、１．５ｍｌ／分の流 速および０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート−水ｐＨ７，０とアセトニ トリルの溶媒グラジエニ／トを用いるＡＢＩ　ＲＰ−３００（Ｃ−８）カラム（ ４，６Ｘ２２０顛−）を用いて最初ＨＰ　Ｌ　Ｃによって精製し、次いで以下に 述べる特定修飾の後、トリチル基を除去し、生成物を上記条件を用いるＨ　Ｐ　 Ｌ　Ｃによって単離した。

切離したオリゴヌクレオチドは、１５μＩのＦＡＭ−ＮＨ３のＤＭＳＯ溶液（Ａ Ｂ１）および４０．ｃ＋＋のＩＭ　ＮａＨＣＯｓ／ＮａｘｃＯｓ　ｐＨ９，０と 共にアミン標識２６量体の溶液を添加してＦＡＭを用いて標識を付けた。２時間 後、反応混合物はファーマシアＰＤ−１０セファデフクス（登録商標）Ｇ２５Ｍ カラム（ファーマシア）を通過させ、集められた試料は次にＨＰＬＣで生成した 。溶媒を除去した後、試料を８０％酢酸−水で脱トリチル化した０次に溶媒は減 圧で除去し、残渣は０．５１のＨｔＯに入れて液体クロマトグラフィによって精 製した。

Ｂ、ＦＡＭ標ｆｉＰＥＯｉｌ導化オリゴヌクレオチド実施例ＩＢからのＤＭＴｇ Ａ護ホスホル了ミダイトロＥＯユニットは実施例４Ａからのオリゴの５°末端に 、固体支持体の標準ホスホルアミダイト化学によって添加され、図５の構成物１ ６を生成した。４ユニ・７トに対し１ユニツトを分離反応に添加した。得られた ＨＥＯ修飾オリゴを上記のように固体支持体から切り離しく化合物】７、図５） ＦＡＭで標識を付け、上述したように精製した（化合物１８、図５）。

Ｃ，ＰＥＯ誘導化オリゴヌクレオチド シーゲンス５“　ＧＧＣＡＣＣＡＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＴＣＡＴＣ Ｔ　３’　をもつ２５塩基オリゴヌクレオチドを実施例４Ａに記載したように作 成した。ＤＭＴ保護ホスホルアミダイトＨＥＯユニットをこの２５量体の５゜末 端に添加し、実施例４Ｂに記載したように精製した。

叉施例エ オリゴヌクレオチドΣｌΣ７”−１−Ｆ（７）”役２５量体のオリゴヌクレオチ ドはＡＢＩ　ＤＮＡ合成器を用いてＣＰＧ固体支持体に合成した。ＣＰＧ支持オ リゴヌクレオチドの５°水酸基に標準のホスホルアミダイト化学を用いるＮ−Ｍ ＭＴ−Ｃ，アミノモディファイヤーを添加した。これはクロンチック　ラポラト リイズ、バロアルト、ＣＡから市販されているモノメトキシトリチル保護アミノ 結合ホスホルアミダイトである。このモノメトキシトリチル基はＤＮＡ合成器の 標準トリチル開裂プロトコルを用いて除去し、次いでＤＮＡ合成カラムを、ＦＭ ＯＣ化学を行うことができるＡＢＩペプチド合成器に置いた。標準ＦＭＯＣペプ チド合成プロトコルを用いて、４単位と８単位のアミノ酸ペプチドをＣＰＧ支持 オリゴヌクレオチドの５′末端アミンに共役させた。

合成完了後、ペプチドの末端アミンを標準ペプチドキャンピングプロトコルを用 いてアセチル化した。

次に合成カラムをＡＢＴ　ＤＮＡ合成器に置きペプチド−オリゴヌクレオチドを 支持体から開裂除去し上記のような条件を用いるＨＰＬＣによって精製し、ペプ チド−オリゴヌクレオチドＡ　ｃ　−（Ｐｈｅ−Ａｌａ）ｚまたは４　ＮＨ（Ｃ Ｈｘ）ａ−ホスフェート５°　ＧＧＣＡＣＣＡＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ−ＡＡＴ　 ＡＴＣＡＴＣＴ−３″を生成した。ペプチド−オリゴヌクレオチドをオリゴヌク レオチド標的の存在で実施例７Ａに記載したように蛍光標識オリゴヌクレオチド に結合させた。Ｃ８分析は図９に示した。

大旌欝且 １旦−ブのキャビーリー　ヌ泳動分離 キャピラリー電気泳動分ｊｉｌ（ＣＥ）はレーザー基礎検出器を含むＣＥブレッ ドボードを用いて行った。この装置は高圧電力供給器、手動真空ポンプ、および 検出光に５３０μｍ　ＲＤ　Ｆフィルターを備えたＰＭＴ検出器を含む、レーザ ーは４０１のＡｒイオンレーザ−であった、装置に使用したキャピラリーチュー ブは長さ５５ｃ−で５０μ−４，ｄ、および３５０μ−の溶融シリカキャピラリ ーチューフ″であった。

アースしたカソード受容器とアノード受容器は８Ｍの尿素を含む７５５Ｍ　）リ ス−ホスフェート、ｐ　Ｈ７，６で充填した。

実施例４と同様に調製した０、１．２、または４ホスフエート連結ＨＥＯユニツ トで誘導化した２６量体のオリゴヌクレオチドを含有するＤＮＡ混合物を、８９ −列トリスーボレート緩衝液、ｐ　Ｈ７，６で、約１０１Ｍの最終ＤＮＡ濃度ま で希釈した。

約２ナノリツトルのＤＮＡ溶液を、動電注入によってチューブのカソード末端に 引き入れた。

電気泳動装置を実験中は約１５ｋＶ　（約２７０　Ｖ／ｃｓ＋）の電圧にセント して実験した。

蛍光検出は５３０止であった。検出器の出力信号はＨＰモデル３３９６　Ａ積分 器／プロツターで積分しプロットした。

得られた電気泳動図を図６に示す、主ピークの上の数字は電気泳動時間を分で示 す、全実験時間は約２２分である。一番早い走行ピークは２０．３９７分の走行 時間であり、誘導化していないオリゴヌクレオチドに相当する。１．２、および ４ＨＥＯグループのオリゴヌクレオチドはそれぞれ、２０．６１２．２０．９９ ４、および２１．５５８の移動ピーク時間である。

実流貫ロー 級！誘導プ…ニブ支主グ１気詠動茎劣Ａ分層Ａ、プローブエレメントの連結反応 シーケンス５’　ＧＧＣＡＣＣＡＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＴＣＡＴＣ Ｔ−３’　をもつ第一のプローブはテトラペプチドＰｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａ ｌａ、または実施例５に示した方法に従ったオクタペプチドＰｈｅ−＾１ａ−Ｐ ｈｅ−＾１ａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−＾１Ｂのいずれかで誘導化した。シー ケンス５°　Ｐ−ＴＴＧ　ＧＴＣＴＴＴＣＣＴ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＡＴ Ａ　Ｇ　ＪｏＥ　３’をもつ第二のプローブは標準方法によって調製した。

プローブは嚢胞性繊維症遺伝子のＦ５０８ｅＪ域を示す４８−塩基オリゴヌクレ オチドに対して標的にする。標的へのプローブハイブリッド形成およびハイブリ ッド形成したプローブの連結反応は次のように実質的に行われた：ペプチド誘導 化オリゴヌクレオチド（５０μＭ、２０μｌ）、および蛍光標識オリゴヌクレオ チド（５０μＭ、２０μｍ）を標識オリゴヌクレオチド（５０μＭ、２０μ＋） ；鮭精子ＤＮＡ　（４回ｇ／１０＃Ｉ、２０／７１）　；　１０ｘ反応緩衝液（ ２００ｍＭ　トリス・ＨＣＩ　ｐＨ７，１；Ｉ　Ｍ　Ｋ　Ｃ１；　１００ｍＭ　 Ｍ　ｇ　ＣＩ！　ｉ　１００ｍＭジチオトレイトール；　１０ｍＭニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド）（２０μり；リガーゼ（３０ユニツト、１００ユニ ツト／μｌ、エビセントル　テクノロジイズ　アンプリガーゼ、マジソン、Ｗｌ ）および１００μｍの蒸留水と混合した。調製した試料は５０ｕ１の油を塗リバ ーキンエルマーセンスＤＮＡサーマルサイクラ−（ノーウオーク、ＣＴ）中で９ ４℃にて３分間加熱し、次に６２℃にて６０分間加熱した。

Ｂ、篩分けしていない媒体中のプローブのキャピラリー電気泳動分離上記からの 脱離し連結したおよび連結していないプローブをエタノール沈澱し、篩分けして いないマトリックス中でＣＥ電気泳動によって分析した。キャピラリーチューブ はＤＢ−５−被覆キャビラリ−（Ｊ　＆　Ｈ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｆｏｌｓ ｏｓ＋、　ＣＡ）、５５鵬−長さ、検出器に４０μ１ｍであった。このキャピラ リーを電気泳動の前に０．５％界面活性剤溶液で被覆し、キャピラリー壁をさら に親水性にした０種々の界面活性剤、例えばＢＲＩＪ（登録商標）およびＴＷＥ ＥＮ　（登録商標）　ｊｅｆｆａｓｉｎｅクラスの界面活性剤が、このために入 手できる。

１０μｌの試料を９５℃まで２分間加熱し、チューブに入れた。ｌｌｌ液液媒体 よび電気泳動媒体は７５ｍＭ　）リス−ホスフェート緩衝液、ｐＨ８，０，８Ｍ 尿素、１０％（Ｖ／ν）メタノールであった。電気泳動走行条件は、実施例６に 記載したように行った。電気泳動図の結果は上記の図９に示す。

実施斑■ したプローブのＬＣＲ点分離 次の４つのプローブを調製した： （１）この場合にはユニットは１２置体（２または４の１２量体）のエチレンオ キシドであること以外は、実施例４に記載した合成方法に従って、２または４ユ ニツトのＤＥＯ（ドデシルエチレンオキシド）ポリマー饋を用いて、５°末端に ５′ＧＧＣＡＣＣＡＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＴＣＡＴＣＴ−３’を誘 導した。

（２）５’　Ｐ−ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　 ＡＴＡ　Ｇ　３’　−ＪＯＢは実施例７のように調製した。

（３）５’　ＲＯＸ−ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＡ　ＴＡＧ　ＧＡＡ　ＡＣ ＡＣＣＡ　ＡＡ　３’　−ＯＨは公表された方法（アプライド　バイオシスレム ズ）に従って調製した；そして （４）５′　−Ｐ−ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＴＴ　ＡＡＴ　ＧＧＴＧ ＣＣ−３°ＴＡＭＲＡは：公表された方法（アプライド　バイオシステムズ、カ ルサース、コンネル）を用いる３°　−アミン−ＯＮ　ＣＰＧ、５’　−ホスフ ェート−ＯＮおよびＴＡＭＲＡ−ＮＨ３（ＡＢ　Ｉ）で調製した。

プローブ１と２は、実施例７のように、嚢胞繊維症遺伝子のＦ５０ｈＪ域の１本 鎖の部分をスパンするように設計する。プローブ３と４は、遺伝子の反対側の鎖 のＦ５０ｈＪ域の同し部分をスパンするように設計する。リガーゼ鎖反応は公表 された方法（ウィンーディーン）に従って行われた。簡単に述べると、ＬＣＲア フセイは、１リツトルにつき１００ｍｍｏ１のに０．１０ｍｗｏｌのＭｇ！＋、 １０ｍｍｏｌのジチオトレイトール、１ｍｌのトリトンＸ−１００、およびｌ　 ｖ＋＋ｏｌのＮＡＤ”を含む・２０＋＋ｎｏｌ／１のトリス弓（ＣＩＪＩ衝液中 、ｐ　Ｈ７，６で行われた。各１００μ１反応混合物は４個のオリゴヌクレオチ ドおよび１５Ｕの熱安定リガーゼ（エビセントル　チクノロシーズ、マジソン、 Ｗｌ）の各々を１ｐ糟０１含んでいた。ヒトゲノムの複雑さを模倣するため、４ μｇの錬精子ＤＮＡを各反応混合物に添加した０反応は７ｈｉｎ　Ｗａｌｌｅｄ Ｇｅｎｅ−Ａ陽ｐ（登録商標、パーキン−エルマー　セチェス、ノルウオーク、 ＣＴ）反応管で１００μｍの無機油でオーバーレイした１００μｌの部分標本で 行った。全ＬＣＲ反応はパーキン−エルマー　セチェス　モデル９６００熱循環 器中で３０サイクルの９４℃（１０秒）および６０℃（２分）で行った。循環プ ロトコルの終わりに、反応物を４℃まで冷却した。

試料をエタノール沈澱し篩分けしていないマトリックス中でＣＥｔ気泳動によっ て分析した。キャピラリーチューブは、実施例７のように被覆キャピラリーであ った。１０μｌの試料を９５℃まで２分間加熱し、チューブに入れた０ｗｉ衝液 媒体および電気泳動媒体は７５ｍＭ　）リス−ホスフェート緩衝液、ｐＨ８，０ ，８Ｍ尿素、１０％（ν／ｖ）メタノールであった。１１ｉ気泳動走行条件は、 実施例７に記載したように行った。電気泳動図の結果は」二記の図１１に示す。

人施拠■ 順ｊ月Ｊひソ紗１祁生東ｑ旦Ｎ人へ烈火定本発明によるＤＮＡ配列決定は、ＤＮ Ａ配列決定への標準額終止アプローチにおいて配列決定プライマーとして結合す るポリマー／ポリマー鎖共役体を用意して行った。好ましくは、同じポリマー鎖 を各結合ポリマーに結合させて配列決定用のプライマーを形成する。ＤＮＡの鋳 型鎖にアニーリングした後、プライマーはヌクレオシドトリホスフェート前駆体 および鎖終止ヌクレオチドの存在でポリメラーゼで伸長し、プライマーが標識を 付けているかまたは鎖ターミネータ−が標識を付けているかどうかによって、１ またはそれ以上の組の異なる大きさのＤＮＡ断片を形成する。ＤＮＡ断片は各々 共通の起源を有し、結合ポリマーは、既知の塩基で終り、同じポリマー鎖に同様 に共役させる０組の各々のＤＮＡ断片は次いで篩分けしていない液体媒体中で大 きさによって電気泳動により分離する。

この実施例では、次の４７量体の合成ポリヌクレオチドを配列決定鋳型として用 いる。

５’　−ＴＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣ；ＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡ ＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣ−３’ １１量体へキサエチレンオキシドボリマ一鎖をもつ次のプライマーを実施例１− ４に記載したように合成する： ５°　−（ＨＥＯ）１１−ＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴ−３ ’次のことを除いては、染料標ｍｌ終止ヌクレオチドを用いる配列決定反応用の 製造業者のプロトコルを用いて、アプライド　バイオシステムズ　モデル　３７ ３自動化ＤＮＡシーケンサ−で配列決定を行った。実施例７のキャピラリー分１ １１装置は４色蛍光測定には形成されていないので、分離した４回の反応を行っ た；４つの鎖終止ヌクレオチドの各々について１回、製造業者のプロトコルに従 って鋳型から伸長生成物を融解した後、４つの配列決定反応の伸長生成物を別々 に実施例７に記載したようにキャピラリー電気泳動によって分離する０期待され たように、２本のピークがジデオキシシチジン伸長生成物で観察され、７本のピ ークがジデオキシアデノシン伸長生成物で観察され、１０本のピークがジデオキ シチミジン伸長生成物で観察され、そして６本のピークがジデオキシグアノシン 伸長生成物で観察される。

本発明は種々の応用、方法、および構成物に関して記載したが、種々の変更およ び改変を本発明から逸脱することなく行うことができることは高く評価されるだ ろう。

Ｆｉｇ、：ＬＢ Ｆｉｇ、１−Ｃ Ｆｉｇ、１−Ｄ ＨｏＰ−，１０）／”ＯＨ＋　ＤＭＴ−Ｃ１工 ｔｌ　〜 Ｏ Ｆ、ｉｇ、４Ａ Ｆｉｇ、４Ｂ ＡＭ Ｆｉｇ、５ 連結していないプローブ　２（ＤＥＯ）　４（ＤＥＯ）Ｆｉｇ、１１ Ｆｉｇ、７Ｃ Ｆｉｇ、：ＬＯＢ ｐｉｇ、１ｏｃ Ｆｉｇ、１−３Ａ ＋酢！！？背 Ｆｉｇ、１４Ａ Ｆｉｇ、：Ｌ４Ｂ Ｆｉｇ、１５Ｂ Ｆｉｇ、１−６０ Ｆｉｇ、、：１８Ａ Ｆｉｇ、１．８Ｂ Ｆｉｇ、１９Ａ 束 Ｆｉｇ、２０Ｃ 国際調査報告　ＰＣＴ／ｕＳ　９３１０３０４！１フロントページの続き （３１）優先権主張番号　９７３，１１８（３２）優先臼　１９９２年１１月６ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、ＪＰ （７２）発明者　フング、ステイーブンアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４３０６　パロ　アルド、アドベ　ブレイス（７２）発明者　メンチェン、ス テイーブン、マイケルアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４５３６　フレモント、パンダ　ウェイ　７６８（７２）発明者　ウー、サム 、リイ アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９４０６１　レッドウッド　シティ、カーロスアベニュ　４５０ （７２）発明者　ウインーディーン、エミリイ、スーザンアメリカ合衆国　カリ フォルニア州 ９４４０４　フォスター　シティ、スチルトコート　２３９

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．１またはそれ以上の異なるシーケンスのポリヌクレオチドを形成し、各異な るシーケンスのポリヌクレオチドは（ｉ）検出できるレポーター標識および（ｉ ｉ）各異なるシーケンスのポリヌクレオチドに電荷／並進摩擦抵抗の特有の比を 分与する結合ポリマー鎖を含み、 前記ポリヌクレオチドを、篩分けしていないマトリックス中でキャピラリー電気 泳動によって分別し、そして 分別したポリヌクレオチドを検出する 工程から成る、篩分けしていない媒体中で電気泳動により異なるシーケンスのポ リヌクレオチドを識別する方法。
2. ２．ポリマー鎖が実質的に同じ長さであり、前記異なるシーケンスのポリヌクレ オチドが異なる長さである、請求項１の方法。
3. ３．ＤＮＡをジデオキシ鎖終結によって配列決定するため、前記ポリヌクレオチ ドを前記ポリマー鎖が共有結合している５′−プライマーを用いて形成する、請 求項２の方法。
4. ４．各異なるシーケンスのポリヌクレオチドの３′−末端ヌクレオチドを識別す るために有効なスペクトルにより解像できる染料で共役的に標識を付けるジデオ キシヌクレオチドで３′−末端にて、前記異なるシーケンスのポリヌクレオチド が終結する、請求項３の方法。
5. ５．試料中の１またはそれ以上の標的シーケンスを検出するために、前記形成す る工程が、 １またはそれ以上の異なるシーケンスプローブを用意し、各異なるシーケンスプ ローブが（ｉ）検出できるレポーター標識および（ｉｉ）各異なるシーケンスの ポリヌクレオチドに電荷／並進摩擦抵抗の特有の比を分与する結合ポリマー鎖を 含み、 前記プローブと標的ポリヌクレオチドとを、標的ポリヌクレオチドとシーケンス 相補的プローブとがハイブリッド形成するために有効な条件下に反応させ、そこ では標的ポリヌクレオチドは前記反応の前または後に固体支持体上に固定化され ており、 固定化した標的ポリヌクレオチドを洗浄してシーケンス特異的方法で標的ポリヌ クレオチドに結合していないプローブを除去し、そして標的ポリヌクレオチドを 変性して標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成した異なるシーケンスのプロ ーブを脱離し、電気泳動による分離のための異なるシーケンスのポリヌクレオチ ドを形成する各工程から成る、請求項１の方法。
6. ６．前記異なるシーケンスのプローブが実質的に同じ長さである、請求項５の方 法。
7. ７．試料中の１またはそれ以上の標的シーケンスを検出するために、前記形成す る工程が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドに１またはそれ以上のシーケンス特異的 プローブを付加し、各プローブが、標的シーケンス中の隣接領域に結合するため に有効である第１と第２のプローブオリゴヌクレオチドを有し、そして前記第１ と第２のプローブオリゴヌクレオチドは前記ポリマー鎖で誘導化され、（ｉｉ） プローブを標的ポリヌクレオチドと、各プローブ中で前記第１と第２のプローブ オリゴヌクレオチドをそれらの特異的標的シーケンスに結合するために有効な条 件下に反応させ、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドに結合した前記オリゴヌクレ オチドを、それらの末端サブユニットが隣接する標的塩基と塩基対になっている とき標的結合オリゴヌクレオチドの夫端サブユニットを連結するために有効な条 件下に連結させ、連結したプローブを形成し、そして（ｉｖ）連結したプローブ を標的ポリヌクレオチドから脱離して前記異なるシーケンスのポリヌクレオチド を形成する工程を含む、請求項１の方法。
8. ８．前記ポリマー鎖が前記第１のプローブオリゴヌクレオチドに共役結合してお り、そして各前記第２のプローブオリゴヌクレオチドがレポーター標識を付けて いる、請求項７の方法。
9. ９．前記脱離前に、前記連結したプローブをプローブ結合および連結反応の繰り 返しのサイクルによって増幅する、請求項７の方法。
10. １０．各プローブ中の第２のプローブオリゴヌクレオチドが、（ｉ）会合した標 的シーケンスの同じ位置において代替シーケンスに相補的であり、そして（ｉｉ ）異なる検出できるレポーターで誘導化される２つの代替シーケンスオリゴヌク レオチドを含み、そして前記検出工程が（ａ）プローブと会合した標的シーケン スを同定する各プローブのサイン電気泳動移動度、および（ｂ）標的シーケンス の突然変異状態を同定するサインレポーター部分に従って、各前記標的シーケン スの突然変異状態を決定することを含む、請求項７の方法。
11. １１．試料中の１またはそれ以上の標的シーケンスを検出するために、前記形成 する工程が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドに１またはそれ以上のシーケンス特異 的プローブを付加し、各プローブは、それぞれ、標的ポリヌクレオチド断片の相 補的鎖の向い合った末端領域でハイブリッド形成するために有効な第１と第２の シーケンス特異的プライマーオリゴヌクレオチドを有し、そこでは各プローブ中 の第１のプライマーオリゴヌクレオチドがプローブ特異的ポリマー鎖で誘導化さ れ、（ｉｉ）プローブを標的ポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチドの相補 的鎖の向い合った未婚領域に両方のプライマーオリゴヌクレオチドを結合するた めに有効な条件下に反応させ、そして（ｉｉｉ）プライマー開始ポリメラーゼ鎖 反応によって標的断片を増幅し、異なるシーケンスのポリヌクレオチドを形成す る工程を含む、請求項１の方法。
12. １２．各前記第２のプライマーオリゴヌクレオチドがレポーター標識を付け、そ して前記異なるシーケンスのポリヌクレオチドが２本鎖である、請求項１１の方 法。
13. １３．前記形成する工程が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドに１またはそれ以上の シーケンス特異的プローブを付加し、各プローブは、第１の１本鎖ＤＮＡ断片お よび１本鎖ＲＮＡを含む第２の断片を含み、ポリマー鎖は前記第１の断片に結合 し、そして検出できるレポーター標識は前記第２の断片に結合しており、（ｉｉ ）プローブを標的ポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド中のそれらの特異 的標的シーケンスに前記第１と第２の断片を結合するために有効な条件下に反応 させ、（ｉｉｉ）ハイブリッド形成したプローブをＲＮＡ／ＤＮＡ基体に対して 特異的なＲＮａｓｅ酵素と反応させて、ポリマー鎖を欠いている修飾した標識プ ローブを形成し、そして（ｉｖ）修飾していないまたは修飾した両方の標識プロ ーブを、標的ポリヌクレオチドから脱離して前記異なるシーケンスのポリヌクレ オチドを形成する工程を含む、請求項１の方法。
14. １４．複数のシーケンス特異的プローブを含み、各々は（ａ）選択された結合条 件下に、標的シーケンスの１つにポリマーを塩基特異的に結合するために設計さ れたサブユニットのプローブ特異的シーケンスをもつ結合ポリマー、および（ｂ ）結合ポリマーに結合し、結合ポリマーの電荷／並進摩擦抵抗の比とは異なる比 をもつポリマー鎖によって特徴づけられて成る、標的ポリヌクレオチドにおける 複数の異なるシーケンスの１またはそれ以上を検出する際に使用するためのプロ ーブ構成物。
15. １５．前記ポリマー鎖は、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸 、ポリペプチド、オリゴ糖、およびポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンア ミド、ポリスルホキシド、およびそれらのブロックコポリマー、荷電または非荷 電連結基によって連結された多数のサブユニットのユニットから成るポリマーを 含む、から成る群から選ばれる、請求項１４の方法。
16. １６．各シーケンス特異的プローブがさらにレポーターを有する第２の結合ポリ マーを含み、シーケンス特異的プローブ中の上記第１および第２の結合ポリマー は、選ばれた標的シーケンスの隣接し接触する領域に塩基特異的方法で結合する ために有効であり、シーケンス特異的方法で標的シーケンスに結合したとき２つ の結合ポリマーを連結させ、そして第１の結合ポリマーに結合したポリマー鎖が 各連結したプローブ対に、電荷／並進摩擦抵抗の合わさった特有の比を与える、 請求項１４記載の構成物。
17. １７．各シーケンス特異的プローブがさらに第２の結合ポリマーを含み、シーケ ンス特異的プローブ中の上記第１および第２の結合ポリマーは、選ばれた２本鎖 の標的シーケンスの向い合った鎖の向い合った末端領域に塩基特異的方法で結合 するために有効であり、各鎖中の標的領域の重合をプライマーに開始させ、そし て第１の結合ポリマーに結合したポリマー鎖が各重合した領域に、電荷／並進摩 擦抵抗の合わさった特有の比を与える、請求項１４記載の構成物。
18. １８．各シーケンス特異的プローブが、第１の１本鎖ＤＮＡ断片および１本鎖Ｒ ＮＡを含む第２の断片から成る結合ポリマーを含み、ポリマー鎖は前記第１の断 片に結合し、検出できるレポーターは前記第２の断片に結合し、そして各ポリマ ー鎖は前記ポリマー鎖が結合しているプローブに、電荷／並進摩擦抵抗の特有の 比を与える、請求項１４記載の構成物。