JPH07506245A

JPH07506245A - 脆弱ｘ染色体ｐｃｒ

Info

Publication number: JPH07506245A
Application number: JP5513403A
Authority: JP
Inventors: ペルゴリッツィ、ロバート・ジー; アースター、スーザン・エイチ; ブラウン、テッド・ダブリュ
Original assignee: ノース・ショアー・ユニバーシティー・ホスピタル・リサーチ・コーポレーション
Priority date: 1992-01-28
Filing date: 1993-01-27
Publication date: 1995-07-13
Also published as: EP0651823A1; US6200747B1; EP0651823A4; CA2117431A1; WO1993015225A1; US5658764A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】脆弱Ｘ染色体ＰＣＲ〔発明の分野〕本発明は、一般的には核酸配列の増幅、検出およびクローニングの方法に関し、就中ポリメラーゼψチェーンーリアクション（ＰＣＲ）に基づく方法に関する。

これは、供試サンプル中の核酸配列を増幅するためのプロセスに関するものである。本発明は、供試サンプル中に特殊な核酸配列が存在するか否かを見きわめるために使うこともできる。より明確に言うと、本発明は選択されたＧＣリッチな核酸配列を増幅し、該配列の検出および／またはクローニングを容易にするプロセスに関するものである。−態様において、本発明のプロセスでは、テンプレートに結合したプライマーの伸長を触媒するために耐熱性のポリメラーゼを用いている。本発明はまた、遺伝的または突発的な遺伝子欠損を検出する診断用試験の開発に関する。本発明の１つの応用によって、保因者、患者、妊娠３力月以降の胎児、妊娠８透口めまでの胎児について、脆弱Ｘ染色体症候群（ｆｒａｇｉｌｅ　Ｘ　ｓｉｎｄｒｏｍりを引き起こす遺伝子欠損の分析が提供される。

〔発明の背景〕

脆弱Ｘ染色体症候群（以下、脆弱Ｘという）は、精神薄弱または発育上の廃疾に関する最も一般的な遺伝的形態である。

この症状の発症率は、男性では約１２５０人に１人、女性では約２０００人に１人である。その名前が意味しているように、脆弱Ｘは、Ｘ染色体に関連した症状である。この脆弱Ｘの表現型は、Ｘ染色体の末端近傍の、ｑ　２７．３座における明かな収縮により特徴づけられ、組織培養のある条件下においてＸ染色体のチップ（ｌｉｐ）が破断する傾向がある。これらの組織培養の操作手順は、現在、脆弱Ｘのために用いられている最も一般的な試験の基礎を形成している。

この症状の遺伝パターンは、Ｘ染色体に関連した症状に付随する遺伝パターンとして典型的ではない。典型的には、Ｘ染色体に関連した遺伝子欠損をもつ女性の息子は、５０％の確率でこの欠損に悩まされる。また、異常遺伝子をもつ全男性は、典型的なパターンでＸ染色体に関連した症状に履患する。

更に、女性は２つのＸ染色体を持っているので、通常は損傷を受けた１つのＸ染色体の影響を受けない。

しかしながら、脆弱Ｘにおいて、何人かのキャリア男性は表現型において正常である。更に、脆弱Ｘ染色体を遺伝的に受け継いだ女性の約１７３は、この病気に悩まされている。家族内の異なる世代において、キャリア男性の発病率は異なる。

キャリアの男性の娘らは、一般に非発現型キャリアであるが、履患した息子をもつかもしれない。更に、キャリアの父をもつ子供よりも、キャリアの母をもつ子供において、履患した娘が一層高頻度で生じた（Ｂｒｏｗｎ　、脆弱Ｘ：その難問解決にむけての前進、　Ａｍ−Ｊ、　Ｉｌｕｍａｎ　ＧＣｎ！１．４７１７５ −８０．１９９０　）。

最近、研究者らはこの病気に関わるゲノム領域を同定した（Ｏｂｅｒｌ！ｅｔ　ｍｌ、　、ｒ脆弱Ｘ症候群における５５０塩基対のＤＮＡ切片における不安定性および異常なメチレーション」。

５ｃｉｅｎｃｅ　２５２１０９７−１１０２．　１９９１　；　Ｋｒｎｎｒ　ｅｌ　ａｔ、　、「脆弱Ｘにおいてトリヌクレオチド繰り返し配列ｐｆｃｃＧ）ｎに至る不安定なりＮＡのマツピングＪ　、　５ｃｉｅｎｃｅ２５２１７１１−１４．　１９９１　；及びＢｃｌｌ　ｔ＋　ａｌ、、ｒ脆弱Ｘハイパーメチレーションの全域にわたる物理的マツピングと、脆弱Ｘ症候群の臨床的発現」。

Ｃｅ１ｌ　６４．８６］−６６，１９９１）　、更に、研究者達は、ＦＭＲ−１と呼ばれるこの領域由来の部分的なｃＤＮＡクローンの配列を決定した（Ｖｅｒｋ＋ｒｋ　ｃｌ　ａｌ、　、ｒ脆弱Ｘ症候群において長さが変化するブレークポイント・クラスター領域に対応した、繰り返しＣＧＧ配列を含む遺伝子（ＦＭＲ −１）の同定、　Ｃｅ１ｌ。

６５、　９０５−１４．１９９１　）　、これら０ｂｅｒｌ＊、　Ｋｒ！ｍ＊ｒ、　Ｂｅ１ｌおよびＶｃｒｋｅｒｋの論文は、参照としてこの明細書に組み込まれる。

これらの研究によって、脆弱Ｘの遺伝パターンが典型的でないことに関する解釈が与えられる。最終的に脆弱Ｘ表現型をもたらす突然変異は、段階的に生じる。

初期の段階では、この遺伝子は完全に欠損しているわけではなく、むしろ該遺伝子は「プレミューチージョン（ｐｒｅ−ｍｕｔａｊｉｏｎ）Ｊの状態にある。このようなプレミューチージョンの状態あるキャリアは、正常な表現型を有している。更なる突然変異は、子供に当該表現型を生じさせる女性のキャリアにおいて起きる。

ＦＭＲ−Ｉをコードする配列は、多種の数のＣＯＯ繰り返し配列を含んでいる。

キャリアでない個体は、そのＦＭＲ−■中に約３０のＣＯＯ繰り返し配列を有する。しかし、キャリアは５０ら２００ものＣＯＯ繰り返し配列を有する。このＦＭＲ−１のＣＯＯ繰り返し配列の増幅が、プレミューチージョンである。履患した個体はより多くのＣＯＯ繰り返し配列を有する。履患した個体において、数千はどのＣＯＯ繰り返し配列が観察された（Ｏｂ！ｒｌｚら、１９９１）。

しかしながら、履患した個体の殆どは、ＦＭＲ−１・ｍＲＮＡを発現しない（Ｐｉｓｒ＊目ｉ　ｅｔ　＊１．、　「脆弱Ｘ症候群におけるＦＭＲ−１遺伝子発現の欠如Ｊ　、　Ｃ！ｌｌ　６６１−２０１９９１）。ＣＯＯ繰り返し配列の数が約２００コピーの閾値を越えると、ＣＯＯ繰り返し領域の上流に位置するＣｐＧアイランドがメチル化される（Ｏｂ！ｒｌｅ　ｅｔ　１１．、　１９９１　；　Ｋｒｚｍ＊ｒ　＜＋　！１．＋　１９９１；　Ｂｅ１ｌ　ｅｔ　ａｔ、、１９９１　）　ｏこのメチル化は、該遺伝子を不活化する。

今までは、組織培養で細胞を生育させ、処理した後、患者のクロモソームを顕微鏡学的に検査することが、脆弱Ｘ症候群を診断する唯一の方法であった。その様な検査において、研究室ではＸ染色体を検査し、Ｘ染色体が特徴的に収縮されているのか、それとも破断チップを有しているのかを確かめていた。この方法は高価であり、信頼性も低い。例えばこの方法は、脆弱Ｘ症候群の男性キャリアの殆どと、女性キャリアの半分が見落とされる（［脆弱Ｘ症候群Ｊ　、　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ。

ｐｒｓｓｓ　（Ｄｘｖｉｔｓ、ｓｄ、　１９８９））　ｏ脆弱Ｘのキャリアおよび遺伝子型を検出する別の方法では、サザーンプロットの方法論を用いる。しかし、この方法は感度および迅速性に欠ける欠点がある（Ｒｏｕｓｓ＜ｘｕ　＋Ｉ　ａｌ。、［精神薄弱に関する脆弱Ｘ症候群のＤＮＡ分析による直接的な診断法Ｊ　、　Ｎ、　Ｅ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　、　１６７３−８１（１９９１））。

本発明は、遺伝子欠損の分子構造に基づき、脆弱Ｘの遺伝子型をもつキャリアを確実に同定するための、迅速で且つ安価な遺伝学的試験を提供する。本発明の方法では、被検個体のＸ染色体におけるＣＯＯ繰り返し配列の数が、正常な人、キャリア及び患者の何れの特性を示しているかを決定する。

本発明の試験法は、ポリメラーゼ・チェーン争すアクション（ｐｏ１７ｍｓｒｘｓｅｃｈａｉｎ　ｒ！ｃ目ｏｎ）に基づいている。ＰＣＨに基づく分析は、全ＤＮＡ量に比べて低量しか存在しない特殊なりＮＡ配列を検出するための理想的なものである。簡単に言えば、ＰＣＲ法は特殊なりＮＡ配列を、例えば１００．０００倍〜１．０００．０００倍に増幅する。このレベルまで増幅されれば、特殊なりＮＡ配列（もし存在するならば）は、容易に検出される。

ゲノムレベルでＣＯＯ繰り返し配列を直接同定するためのＰＣＨに基づく方法を開発する以前の試みは、失敗に終わっているか（Ｋｒ＊ｍ＊ｔ　ｅｌ　ｍｌ、、１９９１　）　、或いは部分的に成功したにすぎない（Ｆｕ　ｃｌ　ａｔ、、　ｒ脆弱Ｘ部位におけるＣＯＯ繰り返し配列の変化は遺伝子的不安定性をもたらすニジヤーマン・パラドックス（Ｓｈ！ｒｌ！ｌａｎ　ｐａｒａｄｏｘ）の解明Ｊ　、　Ｃｅ１ｌ　６７：１０４７−５８　（１９９１））。この領域は不安定であり、クローン化したり、直接的に解析することは困難であるらしい。

ＧＣリッチな配列を検出するためのＰＣＲに基づく方法が有効でなかったため、別の病気に関する試験の開発が妨げられた。例えば、エプスタイン−パール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−１ａｔｒ）ウィルス感染、男性ホルモン受容体遺伝子、β−アドレナリン作用性受容体、あるいはＣＭＶゲノムのクローン性（ｃｌｏｎａ１口Ｙ）は、夫々、ＧＣリッチな核酸配列によって特徴づけられる。

従来のＰＣＲ法でエプスタイン−バール（Ｅｐｓｊ＊１ｎ−Ｂａｒｒ）ウィルスのクローン性（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）を同定することは不可能であった。更に、男性ホルモン受容体（遺伝子）はＣＡＧ繰り返し領域を有しており、β−アドレナリン作用性受容体は８０％ＧＣリッチな領域を有しており、またＣＭＶゲノムは７５％ＧＣより高い領域を有しているので、これらの核酸はどれも従来のＰＣＲ法によっては増幅され得ない。

我々は、ＧＣリッチな核酸配列についてＰＣＨに基づく方法を用いることに伴う上記の問題を解決した。我々の方法を用いることにより、我々は正常個体、キャリア個体および履患個体において、ＦＭＲ−１遺伝子のＧＣリッチ領域を増幅し、検出した。

〔発明の概要〕

本発明は、被検サンプルに存在する選択されたＧＣリッチな核酸配列を増幅した。本発明の一実施例においては、ｄＧＴＰが７−デアザｄＧＴＰに置換された。

本発明は、脆弱Ｘ症候群のキャリアやその患者に特徴的なＧＣリッチな核酸配列の分析に用いることができる。

〔図面の簡単な説明〕

図１は、３つの異なる割合の７−デアザｄＧＴＰおよびｄＧＴＰの存在下で合成されたＰＣＲ産物を、電気泳導とサザーン拳プロットφハイブリダイゼーションにより解析したオートラジオグラムの写真である。

図２は、脆弱Ｘ陽性の孫息子を含む家族の幾人かに由来するＰＣＲ産物を、電気泳導とサザーンφプロット・ハイブリダイゼーションにより解析した二つのオートラジオグラムの写真である。夫々の写真と共に、テストされた何人かのメンバーにおける親族関係を示すチャートが示されている。

図３は、脆弱Ｘ陽性の孫および陰性の孫を含む別の家族の何人かに由来するＰＣＲ産物を、電気泳導とサザーン・プロット・ハイブリダイゼーションにより解析したオートラジオグラムの能写真である。

〔発明の詳細な説明〕

米国特許第４．６８３．２０２号、第４．６８３．１９５号、第４．８００．１５９号および第４．９６５．１８８号（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）には、本発明による改良の対象とされたＰＣＲ法が更に詳しく記載されている。

二以上（好ましくは三超）のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなるようなオリゴヌクレオチドが、本発明の実施に有用である。オリゴヌクレオチドのサイズおよび配列により、その機能または使用が決まる。オリゴヌクレオチドは合成またはクローニングにより得られる。

本発明において有用なプライマーには、ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは、従来法による制限酵素消化分解産物から精製されてもよく、または合成的に製造されても良い。

典型的なＰＣＲでは、選択された核酸のテンプレートと結合する二つのプライマーが採用される。該プライマーは、プライマーの伸長を誘発する条件下において、適切な温度で他のＰＣＲ試薬、即ち、４つの異なるヌクレオシド三燐酸（またはその類似物）、適切なポリメラーゼ、および適切な緩衝液（緩衝液にはｐＨ１イオン強度、コツアクタ等が含まれる）と組み合わされる。ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼであるＰＣＲ法において、緩衝液は１．５−２ｄのマグネシウム塩（好ましくはＭｇＣ１２）　、１５０．＝　２００μＭの各ヌクレオシド三燐酸（またはその類似物）、１μＭの各プライマー、好ましくは５０ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８，４）　、および１００μｇ／ｍｌのゼラチンを含むのが好ましい。

プライマーは、最大効率で増幅を行うために一本鎖が好ましいが、二本鎖でもよい。二本鎖プライマーは、まず「変性」される。即ち、伸長生成物の調製に使用される前に、その鎖二本を分離するための処理が施される。二本鎖核酸を変性させる好ましい手段は、加熱によるものである。

本発明において、該プライマーは、適切なポリメラーゼおよび他の試薬の存在下において伸長生成物の合成を「プライム（ｐｒｉｍｅ）　Ｊするために充分に長くなければならない。プライマーの長さは、温度、プライマー供給源および該方法の使用の仕方等の多くの因子に依存する。本発明の実施において、プライマーは１５〜２５、またはそれ以上のヌクレオチド残基を含むのが典型的である。一般に、短いプライマー分子は、鎖伸長反応を維持するプライマー・テンプレート複合物を形成し且つ維持するために、より低い反応温度を必要とする。

本発明において使用されるプライマーは、増幅すべきものとして選択された配列を含む核酸に対して実質的に相補性である。即ち、プライマーは選択された配列（若しくはその相補物）を含む核酸に結合し、又はこれとハイブリダイズしなければならない。しかし、プライマー配列はそのテンプレートに対して完全に相補的である必要はない。例えば、相補的でないヌクレオチド断片がプライマーの５ −末端に付いていてもよく、この場合にもプライマー配列の残部は選択された配列を含む核酸に対して相補的であれる。或いは、プライマー配列が選択された配列を含む核酸配列に対して、（ｉ）該核酸とハイブリダイズし且つ（ｉ　ｉ）鎖伸長反応を維持するために充分に相補的であるならば、−以上の非相補的塩基がプライマーに散在していてもよい。上記の事情にかかわらず、最良の結果を得るためには、選択された配列を含む核酸配列に対して完全に相補的であるプライマーが好ましい。

如何なる核酸配列であっても、本発明の方法によって製造することができる。唯一必要なことは、当該配列の両末端における充分な数の塩基についての詳細が充分に知られていることであり、その結果、別々の鎖の所望の配列に対して当該配列に沿った関連部位でハイブリダイズする二つのオリゴヌクレオチド−プライマーを調製できることである。即ち、一方のプライマーから合成された伸長生成物が、テンプレート（相補物）から分離されたときに、他方のプライマーを伸長して規定の長さの核酸とするための伸長用テンプレートとして働くことができ二つのプライマーを調製できるように、当該配列の両末端における充分な数の塩基についての詳細が知られていることである。

配列の両末端における塩基についての知見が多ければ多いほど、目的とする核酸配列に対するプライマーの特異性が大きくなり、当該方法の効率も向上する。

本発明の好ましい態様では、二つのプライマーが使用される。これら二つのプライマーの一方は、（ｉ）選択された配列の３′末端における配列、（ｉｉ）選択された配列の３′末端に隣接するか又はその近傍にある配列、または（ｉｉｉ）選択された配列の３′末端における配列および選択された配列の３′末端に隣接する配列を含む配列の何れかに対して相補的である。この好ましい本態様において、他方のプライマーは、（ｉ）選択された配列の５′末端における配列、（ｉｉ）選択された配列の５′末端に隣接するか又はその近傍にある配列、または（ｉｉｉ）選択された配列の５−末端における配列及び選択された配列の５−末端に隣接する配列の何れかを含む。或いは、何れかのプライマーは、上述の好ましいプライマーの何れかの相補物に結合し、又はこれとハイブリダイズするプライマーによって置換されてもよい。

「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」の用語は、二本鎖ＤＮＡを特異的なヌクレオチド配列で又はその近傍で切断する、通常はバククチリア由来の酵素を言う。

「熱安定性酵素」の用語は、熱に対して安定かつ耐性であり、テンプレートに対して相補的なプライマー伸長生成物の形成を触媒するポリメラーゼを言う。一般に、合成は各プライマーの３−末端で開始され、合成が終了するまでテンプレートの鎖に沿って５゛から３′方向へ進行する。理論的には、この方法は、異なった長さのＤＮＡ複製物またはＲＮＡ複製物を生成する。上記の方法を使用することにより５′末端で合成を開始し、他の方向へ合成を進行させるような、本発明に有用な熱安定性酵素が存在し得る。

ここで述べる熱安定性酵素が本発明の増幅反応に有効であるためには、一つの基準を満足させなければならない。即ち、該酵素は、二本鎖の核酸を変性させるために必要な所定時間の温度上昇に晒されたときに、不可逆的な変性（失活）を起こしてはならない。

ここで述べる目的において、不可逆的変性とは酵素活性の永久的且つ完全な喪失を言う。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝液の塩濃度、並びに変性すべき核酸の長さおよびヌクレオチド組成等に依存する。典型的には、温度は約９０℃から約１０５℃の範囲であり、時間は主に温度と核酸の長さに依存し、典型的には約１／２分から４分である。緩衝液の塩濃度および／または核酸のＧＣ成分が増大するに伴って、より高温に耐え得るようになる。好ましくは、酵素は約９０〜約１００℃の温度でも不可逆的に変性しない。

ここでの熱安定性酵素は、約４０℃よりも高い至適温度（酵素が作用する温度）を有するのが好ましい。この約４０℃の温度は、それより低い温度ではプライマーのテンプレートへのハイブリダイゼーシヨンが促進される温度である。しかし、より高い温度（たとえば４５〜７０℃）においても、（１）緩衝液中のマグネシウムおよび他の塩類の濃度、および（２）プライマーの成分および長さに依存しはするが、ハイブリダイゼーションは起こり得る。酵素の至適温度が高くなるほど、プライマー先導による伸長はより特異的および／または選択的になる。しかし、４０℃より低い温度（例えば３７℃）で活性である酵素もまた、本発明の範躊にある。至適温度範囲は、好ましくは約５０から８０℃であり、より好ましくは約６０℃以上である。

耐熱性であるとして文献に報告されている酵素の例には、熱安定性バクテリアであるテルムス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｗａｓ）、テルムス・ルーバ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｒｕｂｅｒ）　、テルムス・テルモフイリス（Ｔｈｕａ＋ｕｓ　ｌｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフイリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｌｅｘｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　：　これは他の掲載物より幾分低い至適温度を有する）、テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｘｑｕａｌｉｃｕｉ）　、テルムスφラクテウス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　１ａｃｆｅｕｓ）　、テルムス・ルーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｒｕｂｅｎｓ）およびメタノテルムスψフエルビドゥス（Ｍｅｊｈａｎｏｊｈｓｒｍｕｓ　ｆｃｒｖｉｄＵＳ）等から抽出されたのポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼが含まれる。

他の有用なポリメラーゼ類は、熱変性以外の方法によってＤＮＡを変性させ、次いでプライマーとアニールさせるような繰り返しサイクルに耐え得るポリメラーゼ類である。しかし、各サイクルで追加の酵素を添加する場合には、不安定なポリメラーゼ類を用いることができる。

本発明は、選択された核酸配列を増幅する方法に向けられている。選択された配列が本方法によって大量に生成されるので、本発明はＤＮＡまたはメツセンジャーＲＮＡのクローニング効率を高めるために用いることができ、また選択された配列を増幅して選択された配列の検出を容易にするために用いることができる。

一般に、本発明の方法は、少なくとも一つの核酸配列を、反応ステップの数に関して指数関数的墓で製造する連鎖反応を含む。但し、（ａ）選択された配列の末端が、該末端とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成できるほど充分に詳細に知られており、また（ｂ）連鎖反応を開始するための少量の前記配列が入手可能であることを条件とする。

この連鎖反応の生成物は、使用したプライマー末端に対応する終端を持った個別の核酸二重鎖となる。

精製または未精製状態の何れの核酸も、開始原料として利用され得る。しかしながら、もしサンプルが選択された配列を欠いている場合には、この方法は如何なる配列も増幅することはない。こうして、本発明の方法では、例えばメツセンジャＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡを使用することができ、そのＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。更に、ＤＮＡおよびＲＮＡの夫々の一本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを使用してもよい。これら核酸の何れの混合物も使用され得るし、或いは同一もしくは異なるプライマーを用いて上記増幅反応で予め製造された核酸も使用され得る。増幅すべき選択された核酸配列は、大きな分子の単なる一部分であってもよく、また選択された配列が核酸全体を構成するような独立した分子として最初から存在していても良い。

選択された配列は精製物である必要はなく、ヒトゲノムＤＮＡに含まれるＦＭＲ −１遺伝子の一部のように、複合混合物のマイナー画分であってもよい。出発核酸は、同一もしくは異なる二つ以上の選択された核酸配列を含んでいてもよい。

従って、本発明の方法は、一つの特定の核酸配列を大量に生産するためだけでなく、同一または異なる核酸分子上に位置する二つ以上の選択された核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。核酸または核酸類は何れの供給源から得てもよい。例えば、プラスミドから、クローンされたＤＮＡもしくはＲＮＡから、または天然ＤＮＡもしくは天然ＲＮＡ　（バクテリア、酵母、ウィルス、オルガネラおよび植物もしくは動物等の高等生物を含む何れの供給源由来のものをも含む）から得られる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、Ｍａｎｉａ目ｓ　ｅｔ　！１．．ＭＯ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌ＋ｂｏｒｘｊｏｒ７　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２１，２８０−２８１に記載されているような種々の技術によって、血液、絨毛性柔突起または羊膜細胞等の組織材料のような何れの核酸含有サンプルからでも抽出することができる。

増幅物を検出するために配列特異的なプローブを使用する方法については、細胞を、核酸の精製をせずに直接使用しても良い。例えば、細胞サンプルを低張緩衝液中に懸濁し、細胞が溶解して細胞内構成物の分散が起こるまで、約９０℃〜１００℃に加熱すればよい。このような工程は、通常は約１分〜１５分かかる。この加熱工程の後、増幅試薬を溶解した細胞に直接添加すればよい。

核酸が二本鎖を含むならば、これをテンプレートとして使用する前に、該核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖の分離は、物理的、化学的または酵素学的手段を含む何れかの適切な変性方法によってなされる。核酸の鎖を分離する好ましい物理的方法の一つは、核酸が完全に（〉９９％）変性されるまで加熱することである。典型的な加熱変性は、約９０℃〜１０５℃の範囲の温度で、通常は０．５分〜５分の範囲で数回行なわれる。好ましくは、効果的な変性温度は約９０〜１００℃で、約０．　５〜３分間である。鎖の分離はまた、ヘリカーゼ類として知られているクラスの酵素類によって、またはヘリカーゼ活性を有し且つｒｉｂｏＡ　Ｔ　Ｐの存在下でＤＮＡを変性することが知られている酵素ＲｅｃＡによって誘発されてもよい。ヘリカーゼによる核酸鎖の分離に適する反応条件は、Ｋｕｈｎ　Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ、　Ｃ５Ｈ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇ７゜４３：６３　（１９７８）に記載されており、ＲｅｃＡを使用する技術は、Ｃ，Ｒａｄｄｉｎｇ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｇｓｎｅｌｉｃｓ、、１６：４０５−３７　（１９８２）に概説されている。この変性によって、同じか又は異なる長さの二つの分離された相補的な鎖が生成される。

二本鎖核酸が熱によって変性されたならば、反応混合液は、存在する各プライマーとこれに相補的なターゲット（テンプレート）配列とのハイブリダイゼーションが促進される温度まで冷却される。この温度は、試薬に応じて通常は約り５℃ 〜約６５℃またはそれ以上、好ましくは約り７℃〜約６０℃であり、二本鎖核酸を変性するに有効な時間だけ（通常は約０．５分〜５分間、好ましくは約１分〜３分間）保持される。

実用的には、温度は約９５℃から約６５℃若しくは約３７℃の低温（Ｔａｇポリメラーゼの場合、好ましくは約４５℃〜５８℃）にまで単純に低下され、この範囲の温度でハイブリダイゼーションが生じる。

核酸が一本鎖または二本鎖の何れである場合にも、熱安定性酵素は、変性工程か、または温度が１１イブリダイゼーシヨンを促進する温度まで下げられたとき、若しくはその温度範凹円にあるときに添加される。次に、反応混合液は酵素活性が促進されまたは至適化される温度、即ち、ハイブリダイズされるプライマー及びテンプレートからプライマー伸長生成物の合成を促進する酵素活性が増大されるに十分な温度にまで加熱される。この温度は、夫々の核酸テンプレートに対して相補的なプライマーの伸長生成物を合成するために現実に十分でなければならないが、各伸長生成物をその相補的テンプレートから変性させる程高くてはならない（即ち、この温度は一般的には約８０℃〜９０℃よりも低い）。

使用した酵素および核酸の種類に主に依存して、この合成反応に効果的な典型的温度は、一般に約４０°Ｃ〜８０℃、好ましくは約５０℃〜７５℃の範囲である。テルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒ＋ｎｕｓａｑｕａ＋１ｃｕｓ）由来のポリメラーゼを用イル場合は、約６５℃〜７５℃に亘る範囲がより好ましい。この合成に必要な時間は、主に温度、核酸の長さ、酵素および核酸混合物の複合度に応じて約０．５分〜４０分の範囲であり、好ましくは約１分〜３分である。核酸が長くなると、一般的にはより長い時間が必要である。

新規に合成された核酸鎖およびこれに対して相補的な核酸鎖は二本鎖分子を形成し、本方法の次の工程で使用される。

次の工程において、この二本鎖分子の鎖は、分子を変性するには有効であるが熱安定性酵素が完全な不可逆的変性で不活性化されるほどには高くない温度で、熱変性により分離される。主に酵素の種類および核酸の長さ応じて、該温度は一般に約９０から１００℃の範囲である。変性時間は、温度および核酸の長さに主に依存して、典型的には約３０秒から４分の範囲である。

上記の時間が経過した後、温度は、先の工程で生成した相補的な一本鎖分子（テンプレート）とプライマーとのハイブリダイゼーションが促進される温度まで下げられる。この温度は上記に記載した通りである。

該ハイブリダイゼーション工程の後、または該ハイブリダイゼーション工程の代わりに（または同時に）、温度は、熱安定性酵素の活性を促進し、前工程で新規に合成された鎖をテンプレートに用いてプライマー伸長生成物の合成が可能になる温度に調整される。このときの温度もまた、既述したように、テンプレートから伸長生成物を分離する（変性する）はど高くてはならない。通常は約４０℃〜８０℃で約０．５から４０分、好ましくは約５０℃〜７０℃で約１〜３分である。この工程の間にハイブリダイゼーションが起こり得るので、変性に先立つ前工程の冷却は必要とされない。同時工程を用いる場合には、好ましい温度範囲は約５０℃〜７０℃である。

鎖を分離する加熱および冷却工程、ハイブリダイゼーション工程、並びに伸長生成物の合成工程は、最終用途に応じて、所望量の特定の核酸配列を生成するために必要な頻度で繰り返すことができる。唯一の制限は、存在しているプライマー、熱安定性酵素およびヌクレオシド三燐酸の量である。上記工程は、少なくとも一回は繰り返されるのが好ましい。検出に使用するためのサイクル回数は、例えばサンプルの性質に依存する。サンプルが核酸の複合混合物であり、全核酸が一定に保持されているならば、検出に十分なシグナル増幅を得るためにより多くのサイクルが必要となるであろう。一般的な増幅および検出には、少なくとも約２０回だけ工程を繰り返すことが好ましい。

本発明の方法においては、グアノシンヌクレオチド類縁体が使用される。米国特許第４．８０４．７４８号には、本発明に有用な上記類縁体が開示されており、この開示は参考として本明細書に組み込まれる。該好ましい類縁体は、イノシン、７−デアザ・グアノシンおよび７−デアザφイノシンのヌクレオチド（リボおよびデオキシリボの両方を含む）である。２−デオキシ類縁体がより好ましく、７−ジアザ−２′−デオキシグアノシン（７−ジアザ−２−−ｄＧＴＰ）類縁体が更に好ましい。

グアノシン類縁体を使用することに加えて、本発明の方法は、ＧＴＰおよびｄＧＴＰを実質的に含まない反応混合物中で行われるのが更に好ましい。

好ましい態様では、ポリメラゼーシヨンまたは鎖伸長反応は標準ＰＣＲ緩衝液、即ち、５０ｍＭＫＣｌ、ＩＣｌｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液ｐＨ８，３，１５ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２および０．００１％（Ｗ／Ｍｌのゼラチンを含む緩衝液（Ｓｚｉｋｉ、　Ｉ’ｒｉｍｅ＋−ＤｉｒｅｃｔｅｄＥｎｘ７ｍａｌｉｃ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗＮｈ　ａ　Ｔｈｓｒｍｏｓｆａｂｌ！ＤＮＡ　ｆ’ｏｌｙｍｔｒａｓｔ、　Ｓｃｉ！ｎｃｅ　２３９：　４８７−９１　（１９ＢＢ））中において、０．５〜１μｇの変性ゲノムＤＮＡ、　５０　ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５単位のＴａｇポリメラーゼおよび１０％のＤＭＳＯを添加して行われる。該反応には夫々３２０μＭのｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰが含まれるが、ｄＧＴＰの変わりに３２０μＭの７− デアザ・２−−ｄＧＴＰを使用するように改変された。

以下の実施例では、脆弱Ｘ症候群に罹患した個体、該症状についてプレミューチージョンの状態にある男性キャリアおよび女性キャリア、並びに対照の５個体において、本発明を使用して増幅されたＧＣリッチな配列の存在を検出することに言及する。

これらの実施例で使用されているＧＴＰ類縁体は、７−ジアザ−２−−ｄＧＴＰである。しかし、これら実施例で採用した条件下において７−デアザ・２−−ｄＧＴＰをｄＧＴＰで希釈すると、高分子量の種は検出されなかった（図１）。

従って、ＰＣＲ反応混合物は実質的にＧＴＰおよびｄ　ＧＴＰを含まないのが好ましい。

本発明のもう一つの態様では、ＤＭＳＯおよびグリセロールのような、ＧＣリッチな核酸の複製および転写を高める別の成分が構成物が用いられる。

従来のクローニングおよび発現手法は、本発明のＰＣＲ法を採用するために適用することができる。例えば、ＧＣす・ソチな一以上の選択された核酸配列をクローニングするための従来の方法において、実質的にＧＴＰおよびｄＧＴＰを含まないが、ＧＴＰまたはｄＧＴＰの類縁体を含むＰＣＲ法を使用することによって、クローニングの前にＤＮＡ量を増幅することができる。このような方法は、（ｉ）増幅された核酸生成物に対して、選択されたＤＮＡ配列を含む切断物を得るのに効果的な仕方で制限酵素を添加すること；　（ｉｉ）選択されたＤＮＡ配列を含むこの切断物を、組換分子を作成するのに効果的な仕方でライゲートすること；　（ｉｉｉ）このような切断物を精製、脱塩および／または濃縮すること；　（ｉｖ）選択されたＤＮＡ配列を含む該組換分子の配列を決定すること；（Ｖ）この特定の核酸配列によってコードされる蛋白を発現させること；および（ｖｌ）このような切断物を、特異的な５配向で新しい核酸にライゲートすることを包含することになるであろう。

脆弱Ｘ症候群に罹患している数人の個体および彼等の家族構成員の何人かを、我々の改変ＰＣＲ分析を使用して分析した。幾つかのケースにおいて、罹患個体および彼等の家族構成員から得た末梢血液リンパ球または培養羊膜細胞がら、ゲノムＤＮＡが単離された。他のサンプルは、羊水がら培養なしで直接、または未精製細胞溶融物からＤＮＡ抽出なしで直接得られた。ゲノムＤＮＡの単離方法は、参考として本明細書に組み込まれるＫｕｎｋｅｌ、Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｙ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｔ　Ｓｐ！ｃｉｌｉｃ　Ｒｅ１ｔｅｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｉｎ　ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｃＶａｒｉａｎｔｓ、　Ｐｒ。

、　Ｎａｔ’　ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４：　１２４５−４９　（１９７７）に詳細に記載されている。

刊行物に記載のＦＭＲ−Ｉ−ｃＤＮＡ配列（Ｖｓｒｋｕｋ、ｅｔａｌ、、１９９］）の一部分に対して特異的なオリゴデオキシリボヌクレオチドのプライマーが、バイオサーチ／ミリケン・モデル８７００　ＤＮＡ合成機上において、シアノエチルホスフォロアミダイトの化学により合成され、ＨＰＬＣにより精製された。センスプライマーの配列は、５−−ＧＡＣＧＧＡＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧＣＣＡＧＧ−３−（ＦＭＲ−Ｉ　１１ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド番号１〜２１に対応する）であり、アンチセンスプライマーの配列は、５−−ＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＴ−３−（ＦＭＲ−Ｉ　ΦｃＤＮＡ配列のヌクレオチド番号２０３〜１８１に対応する）であった。

刊行物に記載の配列（Ｖｅｒｋｅｒｋ、ｅｔ　ａｌ、、１９９１）および我々のプライマー選択に基づいて、増幅生成物は長さが２０３ｂｐであり、また９０ｂｐのＣＧＧリッチ領域を含んでいることが推定された。Ｖ＋ｒｋｓｒｋの文献は、参考文献として本明細書中に組み込まれる。

ＰＣＨの増幅は、標準ＰＣＲ緩衝液中（５０ｍＭのＫＣ１゜１０ｍＭのＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩＳｐＨ８，３，１５ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．００１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチン）中において、０．５〜ｌμｇの変性ゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏ　１の各オリゴヌクレオチドブライマー、２．５単位のＴａｑポリメラーゼおよび１０％のＤＭＳＯを添加して行われた。この反応には各々３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰをを含んでいたが、ｄＧＴＰの変わりに３２０μＭの７−ジアザ−２”−ｄＧＴＰを使用するように改変された。この改変ヌクレオチドの使用によって、−組のプライマーにより生成される特定のＰＣＲ生成物の墓が著しく増大され、従来法では不可能とされていた罹患個体に存在する非常に大きな対立遺伝子の増幅および検出が可能になった。この反応液に対して、９７ ℃で３０秒の変性、５５℃で６０秒のアニーリング、および７２℃で６０秒の伸長からなる４０サイクルが施された。

各反応のアリコツトをアガロースゲル電気泳動で分析した。

ＰＣＲ生成物はエチジウム・ブロマイド染色で直接可視化することができないので、これら生成物の可視化を増長するために、サザンプロット分析を用いた。ＤＮＡをナイロン膜に移した。この膜を、０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｒ６Ｘ−Ｓ　Ｓ　Ｃｌ　）　、５Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ！の溶液、０．５％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）および１００μｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ中において４２℃で予備ハイブリダイズした（Ｍａｎｉａｌｉｓ　ｅｌ　ａｌ、、参照）。ハイブリダイゼーションは、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼを用い、ガンマ３２Ｐ−ＡＴＰで予め放射線活性標識したオリゴデオキシヌクレオチド・プローブを添加して行った。−晩ハイブリダイゼーションした後に、フィルターを６ＸＳＳＣ。

０．５％ＳＤＳ中において室温で１５分洗浄し、次いで２ＸＳＳＣＳ０．５％ＳＤＳ中において５６℃で３０分洗浄した後、オートラジオグラフィーにかけた。

一方のオリゴヌクレオチド・プローブ（Ａ）は、ＦＭＲ−１参ｃＤＮＡの１２７〜１５１のヌクレオチド（５−−ＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＡ−３＝）に対応し、他方の（Ｂ）は、ヌクレオチド３７〜１２６に対応するＣＯＯ繰り返し領域（５−−［ＣＯＯコ、−３−）と相同であった。

実施例１（１）正常個人（レーン１）；（２）脆弱Ｘ保持者男性（レーン２）；Ｄ）脆弱Ｘ症候群罹患男性（レーン３）；および（４）女性脆弱Ｘ保持者（レーン４）から単離された夫々のＤＮＡを、７−ジアザ−２−−ｄＧＴＰ　：　ｄＧＴＰの異なる比率（１００：０　；　７５：２５　；　５０：５０　）の下でＰＣＨに供した。ＰＣＲ生成物を、ＦＭＲ−１遺伝子座のＣＯＯ繰り返し領域に対して相補的な上記プローブＢを用いて、プロットハイブリダイゼーションにより分析した。図１はこの分析の結果を示している。高分子量のバンドは、１００％の７−ジアザ−２−−ｄＧＴＰおよび０％のｄＧＴＰの存在下でのみ検出された。

即ち、完全に突然変異した脆弱Ｘ遺伝子は、ＰＣＲ反応混合液が実質的にｄＧＴＰを含まないとににのみ検出された。

実施例２脆弱Ｘ家族Ｎ４ＢからＤＮＡサンプルを採集し、上記に述べたようにしてＰＣＲ，電気泳動、ハイブリダイゼーションに供した。これらの分析の結果は図２に示されている（プローブＡの結果は上部にあり、プローブＢの結果は下部にある）。露出時間は、夫々１６時間および４時間であった。レーン（−）は、ＤＮＡ無しの対照（プライマーのみ）；レーン（Ｃ）はランダム対照の女性ＤＮＡサンプルである。ＤＮＡサイズマーカー（ｂｐで）は左側に示されている。２００ｂｐの断片のみが非キャリアの配偶者、即ち罹患個体の父および祖母由来のＤＮＡ５中に検出された。約４００ｂｐのＰＣＲ生成物が、表現型上は正常キャリアである祖父に検出された。該配列は、サイズが明らかに大きくなって彼の娘に遺伝していた。脆弱Ｘ陽性の孫は約６４０ｂｐのＰＣＲ生成物を示し、この領域が著しく増大していることを示した。

プローブＡ（図２Ａ）およびプローブＢ（図２Ｂ）による系列的ハイブリダイゼーションでは、同様なパターンが示された。しかしながら、変異配列はＢプローブを用いたときに、より容易に検出された。このことは、変異がＣＧＧ配列の増幅を包含しており、従ってＣＧＧプローブ（プローブＢ）に対して相同なＰＣＲ生成物の配列量を増加させることを示唆している。

実施例３図３は、本発明の方法を使用して、プローブＢのみによる第二家族（脆弱Ｘ族Ｎ６）の分析を行った結果を示している。ＤＮＡマーカーによれば、この家族において、祖父は最大の可能性でキャリアであるらしいこと、また彼の娘たちは両方ともキャリアであると分かることが示された。この分析は、プローブＢのみを使用した点を除き、実施例２に記載したのと同様にして行われた。露出時間は３時間であった。キャリアである祖父は、約４００ｂｐのバンドに見られる彼の増幅領域を、キャリアである彼の娘の両方に遺伝させた。娘二人は、同様の複雑な増幅パターンを示した。即ち、両者共に、正常な２００ｂｐバンドに加エテ、約４００．５３ｏおよび６５０ｂｐのバンドを保持していた。

−人の娘には、２００ｂｐの正常バンドを有する罹患していない一人の息子がいた。二番目の妊娠は細胞遺伝学的に陽性の男性胎児であり、この妊娠は中絶された。この胎児から得たＤＮＡ検体には正常バンドがなかったが、４００ｂｐ〜約５００ｂｐの異種スメアを包含していた。

もう−人の娘には、２００ｂｐのバンド及び微かな約４００ｂｐのバンドを有する細胞遺伝学的に陽性の罹患した娘がいた。彼女の罹患した息子は、約１０００ｂｐの増幅バンドを示した。この息子、彼の女兄第および両親については、以前にも、プローブＯｘｌ、９を用いたゲノムサザンプロット分析、および細胞遺伝学によって研究されている（ｆａｍｉ１７５；ｆｉｇｕｒｅＳｄ；　Ｎａｋｘｈｏｒｉ　Ｎ　ａｌ、、　Ｍｏｌｅｃｕｌｇｒ　Ｂｅｊｅｒｏｇｅｎｅｉｔ７　。

ｆ　ｔｈｅＦｒａｇｉｌｅ　Ｘ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、１９４３５５−５９、　’１９９１）。この罹患した息子には興味がもたれる。何故なら、彼は幾つかの場合に細胞遺伝学的に陰性であったからである。

後者の研究のにおいて、キャリアである母親は異常なりＮＡパターンを示さなかった。しかるに、我々の研究では、明らかに変異したバンドの存在が示された。

我々の研究では、罹患した娘はその母親と同様のパターンを示したが、変異対立遺伝子の強度は弱かった。

我々は、３４の脆弱Ｘ家族から選択された、３８人の罹患男性、１２人のキャリア男性および６０人の罹患および不罹患のキャリア女性の研究においても同様な結果を首尾一貫して観察してきた。全ての罹患男性が、プローブＢを用いたときに、最高６ｋｂの長さの大きなバンドおよび／またはスメこれらの結果は、我々の改変ＰＣＲを使用して、脆弱Ｘ突然変異の存在および性質についての情報を速やかに提供することができることを示している。このようなアプローチによって、ＦＭＲ−１遺伝子座における変異を迅速に解明することが可能であろう。罹患した脆弱Ｘ個体の全員がキャリアである母親をもつと思われるので（Ｂｒｏｗｎ　１９９０）　、全てのキャリアを検出するためにＰＣＨに基づく方法を用いたスクリーニングテストを企画することが適切である。キャリアの妊娠は監視することができるから、脆弱Ｘ症候群の危険性は大きく減少するかまたは排除される。

実施例４エプスタイン・バールウィルス感染を有すると思われる個体から、末梢血液サンプルを採集する。エプスタイン・バール核酸配列のＧＣリッチな末端繰り返し領域に対するプライマーを、他のＰＣＲ試薬と共に添加する。次に、その結果を標準と比較し、当該サンプルを提供した個体における感染のクローン性を決定する。

要約すると、本発明はＰＣＲ分析を改良し、この方法をＧＣリッチな核酸配列への適用にまで拡大する。これによって、脆弱Ｘ症候群に存在する高分子ＧＣリッチ配列種のＰＣＲ法による検出が初めて可能になる。この方法は、当初に少量でのみ存在している核酸配列の検出において、また配列特異的オリゴヌクレオチドを用いたヌクレオチド変異の検出においてに特に有用である。また、ここに述べた増幅工程は、分子クローニングおよび配列決定にも使用できる。本発明の方法によれば、以前に開示されている方法を凌ぐ高い収量、高い特異性がもたらされ、また少ない工程で増幅法を実施することが可能となる。本発明による方法の従来技術を凌ぐ利点は、時間と組織培養の費用を必要とせずに、患者のサンプルを分析できることである。

分子生物学および関連専門分野の当業者に自明であるような、本発明の上記態様に関する他の改良も、後述する特許請求の範囲に含まれるものである。

配列表（１）一般情報（ｉ）　出願人：Ｐｅｒｇｏｌｉｏｉ、　ＩＬ　Ｇ。

Ｅｒ５ｍ、Ｓ、Ｈ。

ＢｒｏｗＩｌ、　Ｗ、Ｔ。

（１１）　発明の名称二ＧＣ−リッチＤＮＡ配列の増幅、検出及びクローニング方法（ｉｉｉ）配列の数：４（１ｖ）通信宛先：（Ａｌ宛先：　５ｌｕｘｒｌ　Ｊ、　５ｉｎｄｅｒ、　Ｋｕ７ｏｎ　＆　Ｋｓｎ７ｏｎ＋Ｂ＋　ストリート：Ｏｏｅ　Ｂ＋ｏｇｄｗｔ７（Ｃ）　シティ−：　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ（Ｄ）ステート：　Ｎｕ　Ｙｏｒｋ（Ｆ）　２１Ｐ　：　１０００４（Ｖ）　コンピュータ読取可能形態：（Ａ）メディアタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ１オペレーティング・システム：　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄｉ　ソフトウェア：　Ｐａ１ｔｎｌｌｎ　ＲｔｌＣａｓｔ　Ｉｌ、　０．　Ｖｔ＋５ｉｏｎ　Ｉｌ、　２５（ｖｌ）本願のデータ：（Ａ）出願番号：米国、未決定（Ｂ）出願日：　１９９２年１月２８日（Ｃ１分類：（ｖｉｉｉ）アト−ニー／エージェントの情報＝ｉＡ）名称：５ＣｏＨ，ｈｍｒ（Ｂｌ登録番号：　３０．５８８ＦＣ）参照／事件番号：　５２４９４−９（１ｘ）遠隔通信情報：（Ａｌ電話：　（２１２］　４２５−７２００（Ｂ）テレファックス：　（２＋２１４２５−５２８８（２）配列番号１の情報（１）　配列の特徴（Ａｌ長さ：２１塩基対ＣＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー：不明（ｉｉｌ　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（口Ｉ）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）　起源：（Ａｌ生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ１組織の種類：血液および羊水細胞（Ｇ）細胞の種類；リンパ球（マｉｉ）直接の起源：（Ｂ）　クローン名＋　Ｆｕｌｌ−１（ｖｉｉｉｌゲノム内での位置；（Ａ）染色体／セグメント名・Ｘ（８）染色体上の位置・１−２１＋ｌ）刊行物の情報（＾）著者：Ｖｕｋｕｋ、　Ａ、ＪＭＩＩ（Ｂ）名称：　Ｉｄ＊ｏｌｉｌｉＣａｌｉｏｎ　ｏｒ　ａ　Ｇｅｎｔ　（ＦＭＲ−１１Ｃｏｎｌｘｉｎｉｎｇ　ａ　ＣＧＧ　ＲｌｐｕｔＣｏｉｎｃｉｄｅｎｔ　ｗ＋Ｉｈ　ａ　Ｂ＋ｔｘｋｐｏｉｎｌ　ＣｌｕｓｔｅｒＲｓｇｉｏｎ　Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＬｅＢｌｂ　Ｖｏｉ■ ■奄盾■ ｉｎ　ｂａｇｉｌｅＸ　５ｙｎｄ＋ｏｍｅ（Ｃ）　ジャーナル：Ｃｅ１Ｉ（Ｄ）巻：６５（Ｆ）頁：　９０５−９１４ｔＧ）日付用９９１（Ｋｌ配列谷号１における関連残基・　１から（ｘｌ）配列　配列番号１１５　ＧＡＣＧＧＡＧＧＣＧ　ＣＣＣＧＴＧＣＣＡに　Ｇ（２）配列番号２の情報（１）　配列の特徴（＾）長さ　２３塩基λ・Ｉ＋Ｂｌ型　核酸ｔＣ）鎖の数・−重鎖（Ｉｌｌ）トポロジー、不明（１１）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（ｉｖｌ　アンチセンス：　ＹＥＳ（ｖｉ）　起源：（＾）生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ１組織の種類：血液および羊水細胞ｆＧ）細胞の種類：リンパ球（ｖｉｉ）　１１ｉ接の起源：（Ｂ）　クローン名：　ＦＭＩＩ−１（ｖｉｉ）ゲノム内での位置：（＾）染色体／セグメント名：Ｘ＋８）染色体上の位置：　１８１−２０３（ｘ）刊行物の情報（Ａｌ著者：Ｖｓ＋に！＋に、　ｋ、　ＪＭＩＩ（Ｂ）名称：　Ｉｄｅａｌ山ｃａｔｉｏｎ　ｏｌ　ｓ　Ｇｅｎｔ　（ＦＭＲ−１）　Ｃｏｎｌｘｉｎｉｎｇ　ｌ　ＣＧＧ　ＲｓｐｅｉｌＣｏｉｎｃｉｄｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ａ　Ｂｒｕｋｐｏｉｎｊ　ＣＩｕｓｌｅｔ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｅｒｈｉｂｉｊｉｉｇ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｖｕ奄■狽奄盾■ ｉｎＦｒａｇｉｌｅＸＳｙｎｄｒｏｍｓ（Ｃ）ジャーナル：Ｃｃｌｌ（Ｄ）巻＝６５（Ｆ）頁：　９０５−９１４（Ｇ）　８１寸：　＋９９１（Ｋ）配列番号２における関連残基；　１から（１１）翫ｊす：配列番号２ＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴ　ＴＣＴＣＴＴＯ’ｋＧＣＣＣＴ（２）配列番号３の情報（１）　配列の特徴ＦＡ）長さ：２５塩基対ｆＢｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖ＣＤ）トポロジー二不明（ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（■１）ハイポセテイカル配列二Ｎ０（１ｖ）　アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）　起源：（＾）生物名：ホモ・サピエンス（Ｆ）組織の種類：血液および羊水細胞ＣＧ）細胞の種類：リンパ球（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）　クローン名：　ＦＭＲ−１（ｖｉｉｉｌゲノム内での位置：（＾）染色体／セグメント名：Ｘ（Ｂｌ染色体上の位置・＋２７−１５１（ｘ）刊行物の情報（＾）著者：　Ｖ＊ｒｋｔｒｋ、＾、　ＪＭＨ（Ｂ１名称：　Ｉｄｅａｌ山ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉ　Ｇｏｅ（ＦＭＲ−１）　Ｃｏｎｌｓｉｎｉｎｇ　１　ｃｃｃ　ＲｓｐｕｊＣｏｉｎｃｉｄｕｌ　ｖ目ｈ　Ｉ　Ｂｒｕｋｐｏｉｎｌ　ＣＩｕ＋ｌｅｒ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｖ曲目０■ ｉｎ　Ｆｒａｇｉｌｅ　Ｘ　５７ｎｄｒｏ＋ｕ（Ｃ）　ジャーナル：Ｃ＊ＩＩ（Ｃ１巻：６５ｆＦ）頁：　９０５−９１４（Ｇ１　８１寸：　＋９９１ｆＫｌ配列番号３における関連残基：　１がら（工１）配列：酊ｊり番号３ＣＴＧＧＧＣＣＴＣＧ　ＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡ　ＧＣＣＣＡ（２）配列番号４の情報（１）　配列の特徴（Ａ）長さ＝９０塩基対（８１型：核酸（Ｃ１鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二不明（ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティヵル配列二Ｎ。

にＶ）　アンチセンス二Ｎ。

（ｖｌ）起源；（Ａ＋生物名：ホモφサピエンスｆＦ）組織の種類：血液および羊水細胞ｆＧ）細胞の種類：リンパ球（ｖｉｉ）直接の起源：（８）クローン名＋　ＦＭＲ−１ｂｉｉｉ）ゲノム内での位置：（Ａｌ染色体／セグメント名：Ｘ（Ｂ）染色体上の位置；３７−１２６（１＋刊行物の情報（Ａ）著者：Ｖｕｋｕｋ、　Ａ、ＩＭＥ（Ｂ）名称：　Ｉｄｔｎｌｉｌ：ｃｊＨｏｎ　０１１　Ｇｅｎｔ　（ＦＭＲ−１厄ｏａｆａｉｎｉＢ　Ｊ　ＣＧＧ　ＲｔｐｔｚｌＣｏｉｎｃｉｄｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｂ＋ｅａｋｐｏｉｎｌ　ＣＩｕ＋ｌｕ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｖａ{１ｚｌｉｏｎｉｎ　ｂｉｇｉｌＣＸ　５ｙｎｄｒｏ＋ｕ（Ｃ）　ツヤ−ナル：Ｃｒ１ｌ（Ｃ１巻：６５（Ｆ１頁：　９０５−９１４（Ｇ）口付：　＋９９１（Ｋｌ配列参号４における関連残基：　１から（ＸＩ）配列；配列８号４ α；ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧ　ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ　ＣＧＧＣＸ；ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ　６０ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ　ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧ　ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＦＩＧ、　２ＡＦＩＧ、　２８ＦＩＧ、　３フロントページの続き（７２）発明者　ブラウン、テッド・ダブリュアメリカ合衆国、ニューヨーク州　１１０５０、ポート・ワシントン、プランドーム・ロード　３３エヌ

Claims

【特許請求の範囲】

１．個体が正常であるか、または脆弱Ｘのキャリア若しくは履患者であるかを確認する方法であって、個体から得られた核酸サンプルを、プライマーを用い、ＧＴＰおよびｄＧＴＰからなる群の構成員の類縁体を用いて、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションにより増幅する工程を具備し、前記核酸サンプルはＤＮＡ，ＲＮＡおよびこれらの組み合わせから選択され、前記プライマーは、ＦＭＲ−１配列内にある配列、ＦＭＲ−１配列の近傍にある配列、ＦＭＲ−１配列にハイブリダイズできる少なくとも約１０ヌクレオチドの配列、ＦＭＲ−１配列の近傍にある配列にハイブリダイズできる少なくとも約１０ヌクレオチドの配列、およびこれらの組み合わせからなるオリゴヌクレオチド群から選択される方法。
２．請求項１に記載の方法であって、少なくとも５サイクルのＰＣＲを具備する方法。
３．請求項１に記載の方法であって、前記ＰＣＲ反応混合物が実質的にＧＴＰを含まない方法。
４．請求項２に記載の方法であって、更に，７−デアザー２′−ＧＴＰの使用を含む方法。
５．請求項２に記載の方法であって、更に、５０ｍＭＫＣ１，１０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌｐＨ８，３，１５ｍＭＭｇＣ１２，０．０００１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンを含有する緩衝液中に前記トリホスフェート及びプライマーを分散させると共に、０．５−１μｇの変性ゲノムＤＮＡ，５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ及び１０％ＤＭＳＯを添加する工程を具備した方法。
６．請求項１に記載の方法であって、ＤＮＡからなる群から選択される前記核酸がｃＤＮＡである方法。
７．請求項１に記載の方法であって、前記プライマーが、少なくとも約１０００：１（プライマー：相補鎖）のモル比で存在する方法。
８．請求項１に記載の方法であって、更に、（ａ）増幅された核酸のサイズを測定する工程と、（ｂ）前記測定の結果を標準と比較し、増幅された核酸が脆弱Ｘ遺伝子欠損に関連した構造に対応するか否かを確認する工程とを具備する方法。
９．請求項１に記載の方法であって、更に、前記選択されたＧＣリッチ配列を、複数のＣＧＧ繰り返し配列を有する核酸配列にハイブリダイズさせる工程を具備した方法。
１０．個体が脆弱Ｘのゲノムを有するか否かの測定に用いるキットであって、（ａ）ＦＭＲ−１配列内にある配列、Ｘ染色体中のＦＭＲ−１配列の近傍にある配列、ＦＭＲ−１配列にハイブリダイズできる少なくとも約１０ヌクレオチドの配列、Ｘ染色体中のＦＭＲ−１配列の近傍にある配列にハイブリダイズできる少なくとも約１０ヌクレオチドの配列、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｂ）ＧＴＰおよびｄＧＴＰからなる群の構成員の類縁体とを具備したキット。
１１．請求項１０に記載のキットであって、前記ＧＴＰおよびｄＧＴＰからなる群の構成員の類縁体が、実質的に７−デアザー２′−ＧＰＴからなるキット。
１２．請求項１１に記載のキットであって、更に、ＦＭＲ−１にハイブリダイズできるプローブを具備するキット。
１３．請求項１２に記載のキットであって、前記プローブがラベルを含むキット。
１４．請求項１１に記載のキットであって、更に、実質的に複数の５′［ＣＧＧ］３′繰り返し単位からなるプローブを具備するキット。
１５．請求項１４に記載のキットであって、前記プローブがラベルを含むキット。
１６．個体が脆弱Ｘ症候群を有しているか否かを決定する方法であって、（ａ）前記個体からゲノムＤＮＡサンプルを得る工程と、（ｂ）１）ＦＭＲ−１に存在するオリゴヌクレオチド，２）ＦＭＲ−１に隣接するオリゴヌクレオチド，ｃ）ＦＭＲ−１に存在し且つこれに隣接するオリゴヌクレオチド、およびｄ）これらの組み合わせからなる群から選択されるプライマーを、前記ＦＲＭ−１遺伝子配列のＧＣリッチ領域を増幅するのに有効な方法で使用して、前記ＤＮＡサンプルを増幅する工程と、（ｃ）前記増幅産物を分析し、塩基対の数を確認する工程と、（ｄ）前記分析の結果を標準と比較する工程とを具備した方法。